CN113248567B

CN113248567B - 一种苦味受体阻滞肽及其应用

Info

Publication number: CN113248567B
Application number: CN202110215369.4A
Authority: CN
Inventors: 于志鹏; 王莹雪; 赵文竹; 阚若彤
Original assignee: Bohai University
Current assignee: Bohai University
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2021-02-10
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-02-10
Also published as: CN113248567A

Abstract

本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种苦味受体阻滞肽，其氨基酸序列为Gly‑Val‑Asp‑Thr‑Lys。本发明所提供的一种苦味受体阻滞肽能与苦味受体T2R14有效结合，对苦味物质具有持续稳定的抑制效果，且具有安全无毒副作用、水溶性良好等特点，可用于抑制食品、药品以及保健品中的苦味，具有广泛的应用前景和十分重要的意义。

Description

一种苦味受体阻滞肽及其应用

技术领域

本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种苦味受体阻滞肽及其应用。

背景技术

苦味通常是一种令人不愉快的味觉感受。食物中的天然苦味化合物，主要包括植物来源的生物碱、萜类、糖苷类和动物来源的胆汁。另外，在食物蛋白水解和药品加工的过程中也会产生苦味，这是食品和制药行业长期存在的一个挑战。人们通常不喜欢吃发苦的食物，即使其营养丰富，以及对疾病有益的药物。因此，抑制苦味在食品和制药行业中具有很大的商业价值。传统的脱苦方法主要是添加甜味剂、芳香剂等来混淆苦味分子产生的递送到大脑的神经冲动。中国发明专利公布一种新型复配甜味剂的制作方法(公开号CN104705618A，申请日期2015.04.09)，其特征是将甜菊糖甙类甜味剂与二氢查耳酮糖甙类甜味增强和苦味抑制剂按一定配方比例混合均匀，或按配方比例溶于水，然后浓缩结晶或喷雾干燥制成。但是，随着人们对食品补充营养的要求越来越高，这些附加成分并不符合健康天然的新型饮食观念。而食源性生物活性肽以其安全无毒副作用、功能多样和容易修饰等优点，受到食品科学、化学以及生物学等领域的广泛关注。因此，食源性苦味受体阻滞肽成为抑制食品、保健品及药品苦味的一个新的候选因子。

苦味感知由苦味受体TAS2Rs介导，这些受体主要在人类舌头上表达，属于G蛋白偶联受体家族。迄今为止，几乎所有25种人类苦味受体已经被鉴定出来。它们具有7次跨膜螺旋结构，有3个细胞内环和3个细胞外环，其中跨膜区和细胞内区高度保守，而胞外区可以结合不同的苦味物质。一种苦味受体可以识别多种苦味物质，一种苦味物质也可以被多种苦味受体识别。当采用不同的苦味物质刺激苦味受体时，苦味细胞可以通过苦味信号传导通路提高细胞内第二信使钙离子的浓度，促使其他离子通道的开放，从而实现味觉细胞膜的去极化，随后经过神经传导以及神经中枢的整合最终实现苦味的感知。TAS2Rs具有单个配体结合口袋，这种结合口袋能够在保持高选择性的同时识别许多结构不同的苦味物质。苦味物质的识别与苦味受体的分子调谐范围有关。TAS2R14(T2R14)是对各种苦味化合物调谐范围最广的苦味受体之一，它能识别多种多样的天然或合成的苦味化合物，包括许多药物。因此，T2R14可作为抑制苦味的有效靶点。

鸡蛋中含有丰富的优质蛋白质，其氨基酸比例非常适合人体的生理需要，易为机体充分吸收，利用率高达98％以上，营养价值丰富，市场需求量大。卵清蛋白、卵转铁蛋白和卵类粘蛋白是鸡蛋蛋白的主要成分，分别占总蛋白的54％、12％和11％。有研究表明，鸡蛋白源肽GDDAPR、LELNQ、LEGSLE和PIGNIN被鉴定为可能的苦味受体T2R14的阻滞剂，它们具有5-6个氨基酸残基。因此，酶解上述三种鸡蛋蛋白获得五肽和六肽，从中筛选出水溶性良好、具有生物活性、无毒且能与苦味受体T2R14结合的苦味受体阻滞肽，不仅可以抑制食品、药品以及保健品的不良苦味，还提高了鸡蛋的附加价值。

本发明旨在提供一种苦味受体阻滞肽，并将其应用于抑制食品、药品和保健品中的苦味，同时不损害食品本身的风味和营养价值，还可提高药品和保健品的适口性。

发明内容

本发明公开了一种苦味受体阻滞肽，其氨基酸序列为Gly-Val-Asp-Thr-Lys(GVDTK)。

本发明能够提供可抑制苦味而不损害食物本来所具有的风味的一种苦味受体阻滞肽。活性肽GVDTK作用于苦味受体T2R14这个靶点，能竞争性抑制苦味物质与苦味受体T2R14的结合，对苦味物质具有持续稳定的抑制效果，且具有安全无毒副作用、水溶性良好等特点。进而，本发明能够提供苦味得以抑制而不损害食物本来所具有的风味的苦味减少食品。

本发明的一种苦味受体阻滞肽，对苦味物质具有显著的抑制作用。作为具有苦味的食材，例如苦瓜、杏仁、咖啡、茶、可可、啤酒花等；作为具有苦味的药材，例如黄连、黄柏、当药、苍术、大黄等，添加苦味受体阻滞肽后均能显示苦味抑制效果。其中，当肽GVDTK的浓度为0.225mg/mL时，肽对奎宁的苦味抑制率可以达到70.92％。

本发明的一种苦味受体阻滞肽，可以应用于食品、药品以及保健品领域。对于本发明的一个实施方式的苦味受体阻滞肽作为对象的苦味，可列举出源自食材的苦味或源自药材的苦味。作为具有苦味的食材，例如可列举出苦瓜、杏仁、咖啡、茶、可可、啤酒花等；作为具有苦味的药材，例如可列举出黄连、黄柏、当药、苍术、大黄等。但是，并不限定于此。

在本发明的实施例2中，一种苦味受体阻滞肽GVDTK抑制奎宁苦味的半抑制浓度(IC₅₀)为0.1596mg/mL。

本发明的一种苦味受体阻滞肽，其获得可利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对鸡蛋的卵清蛋白和卵转铁蛋白进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。

本发明的一种苦味受体阻滞肽，其形态没有特别限定。例如，通过溶于水制成液剂，通过喷雾干燥制成粉末状或颗粒状，通过冷冻干燥或加热干燥制成固形剂来使用。优选的，相对于100mL的液体食品、药品或保健品，活性肽的添加量为7.5-25mg。苦味受体阻滞肽的添加量根据食品、药品或保健品中所含的食材或苦味成分的种类和含量来具体确定。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

(1)活性肽的筛选

本发明借助ExPASy PeptideCutter这一在线酶切工具对鸡蛋卵清蛋白、卵转铁蛋白和卵类粘蛋白序列进行虚拟酶切获得多肽。通过peptide property calculator在线工具和Discovery Studio(DS)2017 R2软件的ADMET程序对五肽和六肽进行水溶性和毒性的预测，筛选得到水溶性良好且无毒的肽。从BitterDB数据库中获得苦味受体T2R14的晶体结构，并将其作为蛋白靶标。通过DS中的CDOCKER程序进行分子对接来筛选能与苦味受体T2R14紧密结合的五肽和六肽。以“-CDOCKER_ENERGY”得分为指标，得分越高表示多肽与T2R14结合的亲和力和稳定性越高。

(2)体外苦味抑制活性的测定

通过电子舌对具有潜在苦味抑制活性的五肽和六肽进行活性测定。分别取30mL不同浓度的肽水溶液，加入50mL奎宁(1mM)配制成待测溶液，以80mL奎宁(1mM)作为空白对照，以具有苦味抑制活性的肽LEGSLE和LELNQ作为阳性对照。设置好循环次数、数据文件名称、样品数量、样品名称和测试方法后，安装好电极，开始测量。

测量过程如下：(1)在正负极溶液中清洗传感器90s，然后在两种基准液中清洗传感器120s；(2)在调节溶液中平衡传感器30s；(3)测量每个样品30s；(4)两次各清洗传感器3s后，将其浸入基准液中30s以测量回味值。每个样品重复测量四次。测量完成后，处理数据。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明从鸡蛋卵清蛋白、卵转铁蛋白和卵类粘蛋白的酶解物中筛选得到了一种苦味受体阻滞肽GVDTK。这种食源性活性肽具有安全无毒、水溶性良好等特点，具有苦味抑制活性，能竞争性抑制苦味物质与苦味受体T2R14的结合，对苦味物质具有持续稳定的抑制效果，同时不损害食品本身的风味和营养价值。相比于其他糖类、盐类等苦味掩盖剂，肽的添加更加符合低糖低盐、健康天然的新型饮食观念，因此可用于抑制食品、药品以及保健品中的不良苦味，具有广泛的应用前景。

附图说明

本发明附图2幅，其中：

图1肽GVDTK与苦味受体T2R14的对接结果2D图；

图2肽GVDTK与苦味受体T2R14的对接结果3D图；

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。

实施例1.苦味受体阻滞肽的筛选

本发明借助ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)这一在线酶切工具，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶三种商业酶对鸡蛋卵清蛋白、卵转铁蛋白和卵类粘蛋白序列进行虚拟酶切，得到219个多肽。通过peptide propertycalculator(http：//www.innovagen.com/proteomics-tools)在线工具和DiscoveryStudio(DS)2017R2软件的ADMET程序对其中的五肽和六肽进行水溶性和毒性的预测，毒性预测包括Ames致突变性、发育毒性潜力和皮肤过敏性三项指标，筛选得到26个水溶性好且无毒的五肽和六肽。从BitterDB数据库(http：//bitterdb.agri.huji.ac.il/dbbitter.php)中获得苦味受体T2R14的晶体结构，并将其作为蛋白靶标。通过DS中的CDOCKER程序进行分子对接，筛选得到25个能与苦味受体T2R14紧密结合的五肽和六肽，分子对接能量值如表1所示。肽CGSDNK和GVDTK的“-CDOCKER_ENERGY”得分最高，依次为110.53和104.26kcal/mol，这说明肽CGSDNK和GVDTK最容易与苦味受体T2R14结合且复合物的稳定性最高。

表1 肽与T2R14的分子对接能量值

实施例2.活性肽对苦味物质的抑制效果

取30mL不同浓度的肽水溶液，加入50mL奎宁(1mM)配制成待测溶液，以奎宁作为空白对照，以肽LEGSLE和LELNQ作为阳性对照。设置好循环次数、数据文件名称、样品数量、样品名称和测试方法后，安装好电极，开始测量。

结果显示，肽CGSDNK和GVDTK具有苦味抑制活性，可有效抑制奎宁的苦味，其IC₅₀值分别为0.1790和0.1596mg/mL；而阳性对照肽LEGSLE和LELNQ的IC₅₀值分别为0.198和0.1750mg/mL。由此可知，肽GVDTK的苦味抑制效果优于阳性对照LELNQ，而肽CGSDNK的苦味抑制效果不如阳性对照LELNQ。肽对奎宁的苦味抑制率如表2所示，当肽的添加量为0.150mg/mL时，肽GVDTK对奎宁的苦味抑制率可达到51.82％，而肽CGSDNK对奎宁的苦味抑制率仅有24.64％。当肽的添加量为0.225mg/mL时，肽GVDTK对奎宁的苦味抑制率可以达到70.92％。因此，肽GVDTK可被鉴定为最具潜力的苦味受体阻滞肽。该肽来源于卵清蛋白和卵转铁蛋白酶解物。

表2 肽对奎宁的苦味抑制率

实施例3.苦味受体阻滞肽GVDTK的作用机制

分子对接结果显示，肽GVDTK可以与T2R14的残基Ser265和Ile262形成传统的氢键相互作用，与残基Glu259形成盐桥相互作用，与残基Phe186和Phe243形成π-阴离子相互作用，与残基Asn157形成碳氢键相互作用，与残基Trp89形成π-供体氢键相互作用，与残基Phe175形成π-烷基相互作用，与残基Ile148形成烷基相互作用(图1、图2)。肽GVDTK、LEGSLE和LELNQ与T2R14对接的氨基酸残基和相互作用如表3、表4所示。由表可知，残基Trp89、Ile148和Asn157可能是苦味受体阻滞肽GVDTK与苦味受体T2R14结合的关键氨基酸，氢键相互作用和疏水相互作用在阻断苦味受体T2R14与奎宁的结合中起着至关重要的作用。

表3 肽与T2R14对接的氨基酸残基

表4 肽与T2R14对接的相互作用

肽	氢键相互作用	疏水相互作用	静电相互作用
				GVDTK	5	2	3
LEGSLE	4	7	2
				LELNQ	8	7	0

实施例4.苦味受体阻滞肽GVDTK的应用

在实际生产中，苦味受体阻滞肽GVDTK可通过酶解法或固相化学合成法制成，以粉末状、颗粒状或溶于水的液体状添加到具有苦味的食品、药品以及保健品中。例如，将活性肽制成料包加入茶、咖啡中以抑制饮品中的苦味，同时保留饮品中的独特风味；将活性肽添加到苦瓜中抑制其苦味从而制成苦瓜干、苦瓜茶等苦瓜加工品，消除人们对苦瓜的抵触感，提高苦瓜清热解毒、养血滋肝、降血糖等食用和药用价值；将活性肽添加到药品尤其是中草药中，黄连、黄柏、当药、苍术等药品成分的苦味得以抑制，有助于人们更加愉快地服下药物；将活性肽添加到阿胶糕等保健品中，在抑制其自身苦味的同时又能提高保健品的营养价值，为保健品行业提供了一个解决苦味难题的新思路。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所还仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种苦味受体阻滞肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为Gly-Val-Asp-Thr-Lys。

2.权利要求1所述的苦味受体阻滞肽在抑制食品、药品和保健品的苦味中的应用。