CN115850149B - 一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物及其制备方法。所述氨基酸衍生物为乳酸酰色氨酸，制备方法包括以下步骤：以色氨酸和乳酸为底物，以食品级酶制剂为催化剂，以缓冲液为反应介质进行反应，反应完全后，获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过液相柱分离纯化，收集乳酸酰色氨酸。本发明提供的制备方法反应条件为常温、常压、水相无有机溶剂、安全环保。本发明提供的乳酸酰色氨酸能够与多种苦味受体有效结合，对苦味物质具有持续稳定的抑制效果，可用于具有苦味的食品、药品以及保健品中，具有广泛的应用前景和十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸衍生物及生物合成技术领域，具体涉及一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物及其制备方法。
背景技术
苦味是人类最敏锐的味觉之一，被形容为一种令人无法入口、不愉快的味觉感受。苦味物质在食品风味和生理调节方面具有重要作用，但是苦味的高感知力是消费者拒食苦味物质的主要原因。因此适当地降低食品苦味对促进食品风味和功能食品、药品等产业发展具有重要意义。
苦味感知由苦味受体TAS2Rs介导。苦味化合物通过与苦味受体TAS2Rs的特定位点结合，激活G蛋白介导的下游信号通路，将化学信号转化为电信号最终传递到大脑产生苦味感知。苦味受体的种类繁多，目前已有25种人类苦味受体被鉴定出来。苦味的激活方式具有多样性，即同一苦味受体可以识别不同苦味化合物，同一苦味化合物可以激活不同的苦味受体。这些性质增加了寻找有效的苦味抑制剂的难度。
分子对接已经广泛地用以发现苦味抑制剂领域，其本质是两个分子或多个分子之间的识别过程。苦味受体TAS2Rs具有单一的配体结合口袋。苦味抑制剂通过与苦味化合物竞争结合位点或者与受体结合引起变构现象以达到抑制苦味的目的。有研究表明，肠二醇通过与TAS2R10结合发挥苦味抑制作用；γ-氨基的丁酸和N-N-二羧甲基-l-赖氨酸通过与奎宁竞争TAS2R4的结合位点从而起到抑制苦味的作用；4-(2,2,3-三甲基环戊基)丁酸通过与TAS2R31结合发挥在抑制苦味方面起到关键作用。因此通过分子对接是判断物质是否是苦味抑制剂的有效手段。
传统的脱苦方法主要包括掩盖法、酶法、分离法等。这些方法具有明显的缺点：掩盖法会引入异味；酶法应用范围小；分离法通过吸附或者有机溶剂进行苦味脱除，不环保且步骤繁琐。例如，中国发明专利CN115260355A《一种阴离子交换树脂、其制备方法、该树脂与药物的复合物和其掩味制剂》涉及一种阴离子交换树脂，该制备过程使用了大量有机试剂进行了聚合、分离和交联反应，且苦味化合物局限于具有羧基、多羟基、氨基活性基团的药物。而苦味抑制剂通过与苦味化合物竞争活性位点发挥苦味抑制作用，具有方便，应用范围广等优点，受到食品科学、化学以及生物学等领域的广泛关注。中国发明专利CN113248566A《一种具有苦味阻滞作用的活性肽》涉及一种具有苦味阻滞作用的活性肽，其氨基酸序列为Asp-Asp-Asn-Lys，该活性肽能与苦味受体T2R14有效结合，产生持续稳定的掩蔽苦味效果。然而，迄今为止，未见乳酸酰色氨酸抑制苦味的相关报道。
目前合成氨基酸衍生物主要有有机合成、发酵合成、酶促合成等方法。例如，中国专利CN113943259A《一种氨基酸衍生物、其制备方法及应用》公开了一种可用于凝血因子(Factor)XIa抑制作用的氨基酸衍生物，但是制备过程使用了基团保护后的原料，基团保护往往使用有毒物质如三氟乙酸酐、乙酰氯、吡啶，以及该过程用到了大量的有机试剂如甲醇，这些有机、有毒物质会构成食品安全问题。中国专利CN114957034A《一种氨基酸衍生物及其制备方法和应用》，利用肉色霉菌发酵提取得到一种氨基酸衍生物，但是发酵时间长，原料多，设备复杂，制备工艺繁琐。中国专利CN114540455A《手性β-氨基酸衍生物的制备方法》公开了一种利用生物酶制备手性β-氨基酸衍生物的方法。该专利提供的生物酶催化制备方法具有加简洁、方便，原料更易得，可重复性更好等优点，该专利利用的生物酶为试剂级酶制剂，虽然该种酶制剂具有高的专一性，但是试剂级酶制剂价格昂贵，且不允许在食品工业中使用，只可作为实验研究。食品级酶制剂是目前仅可用于食品工业中使用的酶制剂，价格低廉，具有更佳的工业化生产前景。但是食品级酶制剂的专一性较低，其确切的催化途径是未知的，需要进行大量实验确定。目前未见利用食品级酶制剂制备乳酸酰色氨酸的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物及其制备方法，所述氨基酸衍生物为乳酸酰色氨酸。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物，所述具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物为乳酸酰色氨酸，结构式为：
所述具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
以色氨酸和乳酸为底物，以食品级酶制剂为催化剂，以缓冲液为反应介质进行酶促合成反应，反应完全后，获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过液相柱分离纯化，收集乳酸酰色氨酸。
进一步地，色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：(0.5～30)。
进一步地，食品级酶制剂包括但不局限于丹尼斯克公司的HYW 20、FoodPro 51FP、Multifect PR50G和天野公司的prote AXH、Protease M。
进一步地，食品级酶制剂的质量分数为0.1％-1％(w/w)。
进一步地，缓冲液为柠檬酸缓冲液，磷酸盐缓冲液，巴比妥酸盐缓冲液中的一种。
进一步地，酶促合成反应的条件为：pH为5-7，温度为37-45℃，反应时间为3-24h。
进一步地，所述液相柱为C18反向分离柱。
本发明采用食品级酶抑制剂作为催化剂，利用酶的底物特异性，色氨酸和乳酸通过酶促反应合成乳酸酰色氨酸，合成的乳酸酰色氨酸具有抑制苦味的作用，且能够直接应用在食品中，因此在掩蔽苦味食品、保健食品、以及药品苦味物质的苦味中具有良好的应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明的反应条件常温、常压、水相无有机溶剂、安全环保。
(2)本发明使用的酶为食品级酶，价格低廉，成本低，符合食品应用要求。
(3)本发明提供的乳酸酰色氨酸能够与多种苦味受体有效结合，对苦味物质具有持续稳定的抑制效果，可用于具有苦味的食品、药品以及保健食品中，具有广泛的应用前景和十分重要的意义。
附图说明
图1为乳酸酰色氨酸的化学结构图。
图2为乳酸酰色氨酸抑制苦味物质的苦味的效果图。
图3为酶法制备乳酸酰色氨酸的反应流程图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例涉及的相关检测评价方法：
利用C18反相液相柱分离纯化获得乳酸酰色氨酸：流动相A液为0.1％(v/v)三氯乙酸-水溶液；流动相B液为0.1％(v/v)三氟乙酸-乙腈溶液。检测波长：220nm，柱温：30℃，流速：10ml/mim,进样量：50μl。所使用的柱子为C18的反相色谱柱。
感官评价方法：参照GB/T16291-2012进行感官评价分析。感官评价小组包括6男5女，年龄在22～43岁，在温度为(25±2)℃的感官评价室内进行评价。感官评定员均经过基本滋味培训，其中用2g/L咖啡因作为标准溶液对感官评价人员进行苦味培训。感官评定员将3mL样品溶液倒入口中，在口腔中保持25s左右，随后将其吐出。采用10分制进行感官评分。
苦味抑制效果根据以下公式计算：
实施例1乳酸酰色氨酸的酶法合成
按照图3的流程，将色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：0.5进行混合，以质量分数为0.1％丹尼斯克公司的HYW 20酶为催化剂，以柠檬酸缓冲液为反应介质进行反应，反应条件为pH＝5，温度37℃，反应时间3h，获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过C18反向分离柱分离纯化，收集纯化后的乳酸酰色氨酸。实施例1制备得到的乳酸酰色氨酸的结构如图1所示，乳酸酰色氨酸的纯度为98.5％，收率约84％。
实施例2乳酸酰色氨酸的酶法合成
按照图3的流程，将色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：15进行混合，以质量分数为0.5％丹尼斯克公司的FoodPro 51FP蛋白酶为催化剂，以磷酸盐缓冲液为反应介质进行反应，反应条件为pH6，温度40℃，反应时间15h。获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过C18反向分离柱分离纯化，收集纯化后的乳酸酰色氨酸。实施例2制备得到的乳酸酰色氨酸的结构如图1所示，乳酸酰色氨酸的的纯度为99.4％，收率约89％。
实施例3乳酸酰色氨酸的酶法合成
按照图3的流程，将色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：15进行混合，以质量分数为0.4％丹尼斯克公司的Multifect PR50G酶为催化剂，以磷酸盐缓冲液为反应介质进行反应，反应条件为pH＝6，温度45℃，反应时间24h。获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过C18反向分离柱分离纯化，收集纯化后的乳酸酰色氨酸。实施例3制备得到的乳酸酰色氨酸的结构如图1所示，乳酸酰色氨酸的的纯度为96.7％，收率约90％。
实施例4乳酸酰色氨酸的酶法合成
按照图3的流程，将色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：30进行混合，以质量分数为0.9％天野公司的prote AXH酶为催化剂，以磷酸盐缓冲液为反应介质进行反应，反应条件为pH＝6，温度45℃，反应时间24h。获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过C18反向分离柱分离纯化，收集纯化后的乳酸酰色氨酸。实施例3制备得到的乳酸酰色氨酸的结构如图1所示，乳酸酰色氨酸的的纯度为97.9％，收率约89％。
实施例5乳酸酰色氨酸的酶法合成
按照图3的流程，将色氨酸和乳酸摩尔投量比为1：30进行混合，以质量分数为1％(w/w)天野公司的Protease M酶为催化剂，以巴比妥酸盐为反应介质进行反应，反应条件为pH＝7，温度45℃，反应时间24h。获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过C18反向分离柱分离纯化，收集纯化后的乳酸酰色氨酸。实施例5制备得到的乳酸酰色氨酸的结构如图1所示，乳酸酰色氨酸的的纯度为99.8％，收率约86％。
实施例6
该实施例的乳酸酰色氨酸由实施例5制备获得，分别配置含有100mg/L乳酸酰色氨酸的咖啡因(500mg/L)、奎宁(5mg/L)、水杨苷(250mg/L)和色氨酸(1g/L)溶液，按照前述方法进行感官评价测试。
对照实施例6
分别配置咖啡因(500mg/L)、奎宁(5mg/L)、水杨苷(250mg/L)和色氨酸(1g/L)溶液，按照前述方法进行感官评价测试。
研究乳酸酰色氨酸对苦味化合物苦味的抑制效果，选择咖啡因、奎宁、水杨酸和色氨酸作为苦味化合物，选择这几种苦味化合物的理由如下：咖啡因是茶叶、咖啡豆、可可中存在的主要生物碱，是一种中枢神经兴奋类药物，是世界上普遍被使用的精神药品之一。同时，咖啡因也还被广泛用于食品中，日常生活中的很多食品、饮料中都含有咖啡因，它起到振奋精神、减缓疲劳的作用。奎宁是类抗疟疾药，在青蒿素没有研究出来之前，奎宁作为最重要的抗疟疾药，其也具有抗心律失常的作用，对心脏传导有较大影响。水杨苷是大多数植物性来源食物的苦味化合物，它具有解热、镇痛及抗炎、抗风湿等作用。此外还具有健胃及局部麻醉作用。色氨酸是最苦的氨基酸之一，是造成酶解产物苦味的重要苦味化合物。咖啡因、奎宁、水杨酸和色氨酸是研究苦味抑制剂的典型苦味化合物。因此本发明研究了乳酸酰色氨酸对这四种苦味化合物苦味的抑制效，对食品、药品以及保健品产业发展具有重要意义。
根据实施例6和对照实施例6的感官评价测试结果，按照前述方法计算得出苦味值下降比，如图2所示，添加了乳酸酰色氨酸溶液的苦味值均显著下降，咖啡因、奎宁、水杨甘、色氨酸苦味值下降比分别为14％、6％、15％和26％。结果表明乳酸酰色氨酸的苦味抑制作用具有广泛性。
实施例7乳酸酰色氨酸与苦味受体的对接结合能测试
本发明借助分子对接软件(Autodock vina)对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5制备的乳酸酰色氨酸结构(如图1)与21种苦味受体进行分子对接，得到对接结合能。由于已知的25种苦味受体只有21种具有苦味化合物配体，因此仅对这21种苦味受体进行对接。从BitterDB数据库(http://bitterdb.agri.huji.ac.il/dbbitter.php)获得21种苦味受体的晶体结构作为对接受体。通过Chemdraw 3D软件获得最小能量化后的乳酸酰色氨酸3D结构。
通常，对接结合能大于4(-kj/mol)说明配体与蛋白受体之间具有良好的亲和力。如表1所示，乳酸酰色氨酸与21种苦味受体的对接结合能在6.8到8.3(-kj/mol)之间，对接结合能均大于4(-kj/mol)。该结果表明乳酸酰色氨酸与21种苦味受体都具有良好的亲和力，能够有效地与苦味化合物竞争结合位点或者与苦味受体结合引起变构现象以达到抑制苦味的目的。因此本发明的乳酸色氨酸对苦味物质具有广泛的苦味抑制效果。
表1乳酸酰色氨酸与21种苦味受体的对接结合能(-kj/mol)
实施例8苦味抑制衍生物乳酸酰色氨酸的应用
在实际生产中，本发明的苦味抑制活性衍生物乳酸酰色氨酸可以以粉末状、颗粒状或溶于水的液体状添加到具有苦味的食品、药品以及保健食品中。例如，将乳酸酰色氨酸制成料包加入茶、咖啡中以抑制饮品中的苦味，同时保留饮品中的独特风味；将乳酸酰色氨酸添加到苦瓜中抑制其苦味从而制成苦瓜干、苦瓜茶等苦瓜加工品，消除人们对苦瓜的抵触感，提高苦瓜清热解毒、养血滋肝、降血糖等食用和药用价值；将乳酸酰色氨酸添加到药品尤其是中草药中，黄连、黄柏、当药、苍术等药品成分的苦味得以抑制，有助于人们更容易接受和更加愉快地服下药物；将乳酸酰色氨酸添加到阿胶糕等保健食品中，在抑制其自身苦味的同时又能提高保健食品的营养价值，为保健品行业提供了一个解决苦味难题的新思路。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述具有苦味抑制作用的氨基酸衍生物为乳酸酰色氨酸，结构式为：
制备方法包括以下步骤：
以色氨酸和乳酸为底物，以食品级酶制剂为催化剂，以缓冲液为反应介质进行酶促合成反应，反应完全后，获得含乳酸酰色氨酸的反应液，将反应液过液相柱分离纯化，收集得到乳酸酰色氨酸；食品级酶制剂来源为丹尼斯克公司的DEBITRASE® HYW 20、FoodPro51FP、Multifect PR50G，或者来源为天野公司的prote AXH和Protease M；酶促合成反应的条件为：pH为5-7，温度为37-45℃，反应时间为3-24h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，色氨酸和乳酸的摩尔比为1：(0.5~30)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，食品级酶制剂的质量分数为0.1%-1%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，缓冲液为柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥酸盐缓冲液中的一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，液相柱为C18反向分离柱。
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| Jing Wu等.Discovery of N‑L‑Lactoyl‑L‑Trp as a Bitterness Masker via Structure- Based Virtual Screening and a Sensory Approach.J. Agric. Food Chem..2023,第71卷2082-2093. * |
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