JP2019163234A - キサンチンオキシダーゼ阻害剤及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】天然物に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤及びその製造方法、並びに当該キサンチンオキシダーゼ阻害剤を有効成分とする医薬品及び機能性食品の提供。【解決手段】カフェ酸加熱物を有効成分とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、カフェ酸重合体を有効成分とする、前記記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤、及び、固体のカフェ酸を110〜290℃で加熱する、カフェ酸加熱物の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、飲食品に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤、及び当該阻害剤を含有する組成物の製造方法に関する。
生活習慣病の一つとして知られている痛風は、プリン体の代謝異常による高尿酸血症を原因として、足の親指等の関節に激しい痛みを伴う疾患である。このような痛みは、液中で増加した尿酸が結晶化し、関節に沈着するために起こる。近年、食生活が急速に変化し、高カロリー、高タンパク、高脂肪の食事を摂る人が増加している。この食生活の変化に伴って痛風の患者も年々増加しており、痛風及び高尿酸血症の予防及び治療に関する関心が高まっている。
痛風は、血液中の尿酸の増加によっておこる病気であり、血液中の尿酸を正常値内にコントロールすることが、痛風や高尿酸血症等の病気に対する予防及び治療の基本である。キサンチンオキシダーゼは、生体内尿酸合成において重要な役割をはたしている酵素であり、このキサンチンオキシダーゼを阻害する薬剤は、痛風や高尿酸血症等の予防薬及び治療薬として有用である。
しかしながら、血中尿酸値調整用薬剤として従来から使用されている尿酸合成抑制剤「アロプリノール」等は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が一過性であること、副作用を伴うこと等の問題点がある。そこで、副作用のないあるいは少ない天然物由来であり、かつ日常摂取している飲食品由来の尿酸値低減剤が求められている。例えば、特許文献1には、ウイスキー又はその製造に用いられるブナ科コナラ植物から抽出された成分を有効成分とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤が開示されており、特許文献2には、大麦の発酵物由来の成分を有効成分とする血清尿酸値低減剤が記載されている。また、特許文献3には、アスコフィラム抽出物及びタマリンド抽出物が、血清中尿酸値低減に有効であることが記載されており、特許文献4には、バラ抽出物を有効成分とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤が開示されている。さらに、非特許文献1には、焙煎したコーヒー豆の熱水抽出物中に含まれているクロロゲン酸ラクトンにキサンチンオキシダーゼ阻害活性があることが報告されている。
Honda, et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2014, vol.78(12), p.2110-2116.
特許文献1〜4に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害活性成分は、原料となる天然物からの精製や単離が困難であるとともに、活性は十分ではない。一方で、非特許文献1には、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物中に含まれているキサンチンオキシダーゼ阻害活性がある物質として、クロロゲン酸ラクトン以外については記載がない。
本発明は、天然物に由来するキサンチンオキシダーゼ阻害剤及びその製造方法、並びに当該キサンチンオキシダーゼ阻害剤を有効成分とする医薬品及び機能性食品を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、カフェ酸の加熱物が強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有することを見出し、さらに当該加熱物からキサンチンオキシダーゼ阻害活性の活性成分を単離精製することにより、強力なキサンチンオキシダーゼ阻害作用のある化合物を同定し、本発明を完成させた。
[1] 本発明の第一の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、カフェ酸加熱物を有効成分とする。
[2] 前記[1]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、カフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[3] 前記[2]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、2〜10分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[4] 前記[2]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、2〜6分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[5] 前記[2]〜[4]のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、多環構造を備えるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[6] 前記[1]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、下記式(3)〜(19)で表されるカフェ酸加熱物を有効成分とすることが好ましい。
[2] 前記[1]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、カフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[3] 前記[2]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、2〜10分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[4] 前記[2]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、2〜6分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[5] 前記[2]〜[4]のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、多環構造を備えるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。
[6] 前記[1]のキサンチンオキシダーゼ阻害剤としては、下記式(3)〜(19)で表されるカフェ酸加熱物を有効成分とすることが好ましい。
[7] 本発明の第二の態様に係るカフェ酸加熱物の製造方法は、固体のカフェ酸を、110〜290℃で加熱する。
[8] 前記[7]のカフェ酸加熱物の製造方法としては、加熱温度が、140℃〜280℃であることが好ましい。
[9] 本発明の第三の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法は、カフェ酸を加熱することにより得られたカフェ酸加熱物含有組成物を有効成分としてキサンチンオキシダーゼ阻害剤を製造する。
[10] 本発明の第四の態様に係るカフェ酸重合体は、下記式(5)、(6)、(11)、(12)、(13)、(16)、(17)、(18)、又は(19)で表される。
[8] 前記[7]のカフェ酸加熱物の製造方法としては、加熱温度が、140℃〜280℃であることが好ましい。
[9] 本発明の第三の態様に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法は、カフェ酸を加熱することにより得られたカフェ酸加熱物含有組成物を有効成分としてキサンチンオキシダーゼ阻害剤を製造する。
[10] 本発明の第四の態様に係るカフェ酸重合体は、下記式(5)、(6)、(11)、(12)、(13)、(16)、(17)、(18)、又は(19)で表される。
[11] 本発明の第五の態様に係る医薬品は、前記[1]〜[6]のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有する。
[12] 前記[11]の医薬品としては、痛風の治療又は再発予防に用いられるものが好ましい。
[13] 本発明の第五の態様に係る機能性食品は、前記[1]〜[6]のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有し、血清中の尿酸値を低減する。
[12] 前記[11]の医薬品としては、痛風の治療又は再発予防に用いられるものが好ましい。
[13] 本発明の第五の態様に係る機能性食品は、前記[1]〜[6]のいずれかのキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有し、血清中の尿酸値を低減する。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、天然にはコーヒーに含まれている成分であるカフェ酸加熱物を有効成分とする。このため、当該キサンチンオキシダーゼ阻害剤は、高い尿酸値低減効果を備えることに加えて、比較的安全に投与可能であるため、サプリメント等の機能性食品の有効成分や医薬品等の有効成分として好適であり、特に、痛風及び高尿酸血症の予防及び治療のための医薬品の有効成分や、血清中の尿酸値を低減するための機能性食品の有効成分として好適である。
本発明及び本願明細書において、キサンチンオキシダーゼ阻害作用とは、血中の尿酸値が高まることにより引き起こされる各種生理機能を抑制する作用を意味し、キサンチンオキシダーゼ阻害剤は尿酸値低減作用を有する剤である。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、カフェ酸加熱物を有効成分とする。本発明及び本願明細書において、「カフェ酸加熱物」とは、カフェ酸を加熱してカフェ酸に由来する物質のみから得られる化合物の総称である。カフェ酸は、下記式(1)及び(2)に示すように、ビニルカテコールに1個のカルボン酸基が導入された化合物であり、1個のビニル基と1個のベンゼン環と1個のカルボン酸基を含む。このため、カフェ酸を加熱すると、これらの不飽和結合が、同一のカフェ酸分子内で、又は他のカフェ酸分子若しくはカフェ酸の高温加熱によって生成された分子との間で重合反応を行って連結する(熱重合反応)。
カフェ酸加熱物の大部分は、高温加熱によってカフェ酸が脱炭酸して生成されたビニルカテコールが、反応系内に存在するカフェ酸やカフェ酸の高温加熱によって生成された物質(ビニルカテコール、カテコール等)と重合反応することで得られるカフェ酸重合体である。すなわち、カフェ酸重合体は、カフェ酸の高温加熱によって生成するビニルカテコールが重合反応することによって生成された、カフェ酸を起源とし、エチルカテコール構造をコアに有する物質である。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分としては、カフェ酸の分子内縮合により得られるカフェ酸縮合体であってもよいが、2分子以上のカフェ酸が熱重合して得られるカフェ酸重合体を有効成分とすることが好ましい。中でも、キサンチンオキシダーゼ阻害活性と安定性の両方が優れていることから、2〜10分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体(オリゴマー)を有効成分とすることがより好ましく、2〜6分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体がさらに好ましい。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分としては、単環構造のみからなるカフェ酸加熱物であってもよいが、多環構造を備えるカフェ酸加熱物の方が好ましい。分子内環化反応によって形成された多環構造を備えるカフェ酸加熱物のほうが、単環のみが連結されているカフェ酸加熱物よりも、キサンチンオキシダーゼ阻害活性がより強い。特に、多環構造を備えるカフェ酸重合体が好ましく、2〜10分子のカフェ酸からなる多環構造を備えるカフェ酸重合体を有効成分とすることがより好ましく、2〜6分子のカフェ酸からなる多環構造を備えるカフェ酸重合体がさらに好ましい。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分となるカフェ酸加熱物としては、例えば、下記式(3)〜(19)の化合物が挙げられる。本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分としては、よりキサンチンオキシダーゼ阻害活性が強いことから、特に、式(5)、(6)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(16)、及び(17)からなる群より選択される1種以上のカフェ酸重合体が好ましく、式(5)、(6)、(9)、(10)、(11)、(12)、(16)、及び(17)からなる群より選択される1種以上のカフェ酸重合体がより好ましく、式(5)、(6)、(9)、(10)、(11)、及び(12)からなる群より選択される1種以上のカフェ酸重合体がさらに好ましい。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分は、1種類のカフェ酸加熱物のみであってもよく、2種類以上のカフェ酸加熱物であってもよい。例えば、カフェ酸を加熱して得られる組成物には、一般的に2種類以上のカフェ酸加熱物が含まれているが、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、カフェ酸を加熱して得られたカフェ酸加熱物含有組成物をそのまま有効成分とすることができる。
また、このカフェ酸加熱物含有組成物からそれぞれのカフェ酸加熱物を単離精製したものを、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分とすることもできる。なお、カフェ酸加熱物含有組成物からの、特定のカフェ酸加熱物の単離精製や未反応のカフェ酸の除去は、目的の化合物を精製する場合に使用される方法の中から適宜選択して使用することができる。当該方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィー法が挙げられる。目的の化合物を含む画分は、当該化合物の化学合成品(標品)の保持時間を指標として回収することができる。例えば、脂溶性有機溶媒抽出物から、ODSカラム(C18カラム)等の逆相系カラムを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー(HPLC)法や中圧液体クロマトグラフィー(MPLC)法により、カフェ酸加熱物をまとめて精製する、又は各カフェ酸加熱物をそれぞれ単離精製することができる。
カフェ酸加熱物は、カフェ酸を加熱することで製造できる。カフェ酸の加熱条件は特に限定されるものではないが、カフェ酸の熱重合反応が進行しやすいことから、110〜290℃で加熱することが好ましく、140℃〜280℃で加熱することがより好ましい。
カフェ酸の加熱時に水が多く存在していると、脱水縮合が進み難い。このため、カフェ酸の加熱処理は、カフェ酸が固体の状態で行うことが好ましい。例えば、カフェ酸を含む固体組成物をそのまま加熱処理する。カフェ酸を含む固体組成物は、精製したカフェ酸の固体(例えば、粉末)のみからなる組成物であってもよく、リン酸緩衝塩等のカフェ酸以外の成分を含んでいてもよい。カフェ酸を、水を添加していない反応系で加熱することにより、多環構造を備えるカフェ酸加熱物を効率よく得ることができる。
カフェ酸加熱物の原料とするカフェ酸は、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物のように、カフェ酸以外の成分を含む組成物であってもよいが、単離精製品や化学合成品のような純度の高いもののほうが好ましい。純度の高いカフェ酸を加熱することにより、カフェ酸同士の熱重合が効率よく行われ、カフェ酸加熱物を効率よく得られるためである。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、有効成分であるカフェ酸加熱物のみからなるものであってもよく、他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分としては、カフェ酸加熱物によるキサンチンオキシダーゼ阻害作用を損なわないものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、流動性改良剤(固結防止剤)、安定剤、保存剤、pH調整剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤、矯味剤、甘味料、酸味料、香料、着色料等として用いられている各種物質を、所望の製品品質に応じて適宜含有させてもよい。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の剤型は、特に限定されるものではなく、各種の剤型を適用できる。当該剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、スプレー剤、注射剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。服用が容易であることから、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口投与に適したものが好ましい。
本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分であるカフェ酸加熱物は、焙煎コーヒー豆に含まれている物質であり、比較的安全に服用できる。そこで、これらは、飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の原料として好適であり、特に、体内における尿酸の産生又は蓄積による影響を抑制するために摂取される飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の有効成分として好適である。具体的には、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、尿酸の産生又は蓄積によって引き起こされる各種疾患の予防又は治療に用いられる医薬品やサプリメント等の機能性食品の有効成分として有用である。
また、例えば、本発明に係るキサンチンオキシダーゼ阻害剤はそのまま、液体コーヒー、インスタントコーヒー等に添加して使用することもできる。ここで、液体コーヒーとしては、缶又はいわゆるペットボトル容器に入れられて市販されているコーヒー飲料(若しくはコーヒー入り飲料と呼ばれるもの)が挙げられる。また、インスタントコーヒーとしては、焙煎粉砕コーヒーを熱湯で抽出した抽出液を噴霧又は凍結乾燥方法により水分を除去した可溶性粉末コーヒーと呼ばれるものが挙げられる。コーヒーミックス飲料としては、可溶性粉末コーヒーに砂糖、クリーミングパウダーなどを添加して混合した飲料などが挙げられる。
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
<キサンチンオキシダーゼ阻害活性測定>
以下の実施例等において、特に記載のない限り、サンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、次のようにして測定した。
まず、1mmol/Lのキサンチン水溶液10μLと、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解させたサンプル10μLと、12.5mmol/Lのリン酸バッファー(pH7.8)160μLを混合した反応液を、37℃で5分間、プレインキュベーションした。サンプルに代えてDMSOを用いたものをコントロールの反応液とした。次いで、当該反応液に、XOバッファー(0.027unit/mLとなるようにキサンチンオキシダーゼをバッファーに溶解したもの)20μLを添加し、37℃で10分間インキュベートして反応させた後、3%のHClO4水溶液25μLを添加して反応を停止させた。その後、20μLの反応液を、以下の条件でHPLCシステムにインジェクトし、尿酸濃度を決定した。
以下の実施例等において、特に記載のない限り、サンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、次のようにして測定した。
まず、1mmol/Lのキサンチン水溶液10μLと、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解させたサンプル10μLと、12.5mmol/Lのリン酸バッファー(pH7.8)160μLを混合した反応液を、37℃で5分間、プレインキュベーションした。サンプルに代えてDMSOを用いたものをコントロールの反応液とした。次いで、当該反応液に、XOバッファー(0.027unit/mLとなるようにキサンチンオキシダーゼをバッファーに溶解したもの)20μLを添加し、37℃で10分間インキュベートして反応させた後、3%のHClO4水溶液25μLを添加して反応を停止させた。その後、20μLの反応液を、以下の条件でHPLCシステムにインジェクトし、尿酸濃度を決定した。
HPLC条件;
カラム:Mightysil RP-18 GP Aqua(250×4.6mm(内径))(関東化学社製)、
溶媒:CH3OH−0.1%リン酸水溶液(2.5:97.5(v/v))、
流速:0.5mL/分、
温度:35℃、
検出波長:290nm及び270nm。
カラム:Mightysil RP-18 GP Aqua(250×4.6mm(内径))(関東化学社製)、
溶媒:CH3OH−0.1%リン酸水溶液(2.5:97.5(v/v))、
流速:0.5mL/分、
温度:35℃、
検出波長:290nm及び270nm。
キサンチンオキシダーゼ阻害率は、下記式により算出した。
[阻害率(%)]=([コントロールの尿酸のピーク面積]−[サンプルの尿酸のピーク面積])×100/[コントロールの尿酸のピーク面積]
[阻害率(%)]=([コントロールの尿酸のピーク面積]−[サンプルの尿酸のピーク面積])×100/[コントロールの尿酸のピーク面積]
[実施例1]
クロロゲン酸、カフェ酸、及びキナ酸の加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
クロロゲン酸、カフェ酸、及びキナ酸の加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
<クロロゲン酸類の加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定>
クロロゲン酸、カフェ酸、及びキナ酸の各10mgに、0.2mLのメタノールと0.4mLの500mmol/L リン酸緩衝液(pH 6.0)を加えて混合した後、減圧下でメタノールと水を除去して、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を作成した。この混合物を試験管に入れて、アルミバスを用いて、200℃で0.5時間又は1時間加熱した。次いで、冷却した後、得られた加熱物に対して1mLのメタノールを用いた溶出を2回行った。加熱物のメタノール溶出液の濃度を物質相当量1mg/mLに調製したメタノール溶液を、フィルターろ過を行った後、以下の条件でHPLC分析し、加熱物を含む画分を分取して精製した。
クロロゲン酸、カフェ酸、及びキナ酸の各10mgに、0.2mLのメタノールと0.4mLの500mmol/L リン酸緩衝液(pH 6.0)を加えて混合した後、減圧下でメタノールと水を除去して、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を作成した。この混合物を試験管に入れて、アルミバスを用いて、200℃で0.5時間又は1時間加熱した。次いで、冷却した後、得られた加熱物に対して1mLのメタノールを用いた溶出を2回行った。加熱物のメタノール溶出液の濃度を物質相当量1mg/mLに調製したメタノール溶液を、フィルターろ過を行った後、以下の条件でHPLC分析し、加熱物を含む画分を分取して精製した。
<HPLC分析条件(成分分析)>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸/H2O、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280、320nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸/H2O、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280、320nm
分取された加熱物を含む画分に対して、キサンチンオキシダーゼ阻害率(%)を求めた。結果を図1に示す。この結果、カフェ酸加熱物が最も高いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していた。
<カフェ酸の加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に対する加熱温度の影響>
カフェ酸について、加熱温度を110〜290℃の間に設定し、得られたカフェ酸加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。具体的には、前記と同様にして、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物を、110、140、170、200、230、260、又は290℃でそれぞれ30分間加熱した後、前記と同様にして、メタノール溶出を行い、溶出液をHPLC機器で分析し、さらに溶媒を除去した溶出物をカフェ酸相当量で0.3mg/mLに調製したカフェ酸加熱物溶液を用いて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。
カフェ酸について、加熱温度を110〜290℃の間に設定し、得られたカフェ酸加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。具体的には、前記と同様にして、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物を、110、140、170、200、230、260、又は290℃でそれぞれ30分間加熱した後、前記と同様にして、メタノール溶出を行い、溶出液をHPLC機器で分析し、さらに溶媒を除去した溶出物をカフェ酸相当量で0.3mg/mLに調製したカフェ酸加熱物溶液を用いて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。
測定結果を表1に示す。カフェ酸と比較すると、110℃で加熱した時点でキサンチンオキシダーゼ阻害率(%、表中「XO阻害率(%)」)はやや上昇し、140℃加熱時点で大きく上昇した。そして、170℃時点でキサンチンオキシダーゼ阻害活性は最高値を示し、さらに加熱温度が高くなるに従って、活性は徐々に減少していく傾向が見られた。
<カフェ酸の加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に対する加熱時間の影響>
カフェ酸について、加熱温度を140℃、170℃、又は200℃とし、加熱時間を15〜80分間までの範囲内で設定し、得られたカフェ酸加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。具体的には、前記と同様に、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物を、140℃、170℃、又は200℃でそれぞれ30分間加熱した後、前記と同様に、メタノール溶出を行い、溶出液をHPLCで分析した。さらに溶媒を除去した溶出物からカフェ酸相当量で0.3mg/mLに調製したカフェ酸加熱物溶液を用いて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。
カフェ酸について、加熱温度を140℃、170℃、又は200℃とし、加熱時間を15〜80分間までの範囲内で設定し、得られたカフェ酸加熱物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。具体的には、前記と同様に、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物を、140℃、170℃、又は200℃でそれぞれ30分間加熱した後、前記と同様に、メタノール溶出を行い、溶出液をHPLCで分析した。さらに溶媒を除去した溶出物からカフェ酸相当量で0.3mg/mLに調製したカフェ酸加熱物溶液を用いて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。
測定結果を表2及び図2に示す。カフェ酸(表中、加熱条件が「0℃、0min」)と比較すると、加熱温度が170℃と200℃では、加熱開始から30分間程度でキサンチンオキシダーゼ阻害率(%、表中「XO阻害率(%)」)は最大値に達し、以降は加熱時間が長くなるにつれてキサンチンオキシダーゼ阻害率は低下した。140℃では、加熱開始から60分間程度でキサンチンオキシダーゼ阻害率はほぼ一定値に達した。
[実施例2]
各カフェ酸加熱物を精製単離し、それらのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
各カフェ酸加熱物を精製単離し、それらのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を調べた。
(1)化合物(2)〜(11)の分離
実施例1と同様にして、カフェ酸100gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をステンレス容器に敷きつめて窒素を充填した後、密閉して、オイルバスで140℃、90分間程度加熱した。この加熱物に対してメタノール(計1.5L)を用いて溶出を複数回行い、溶出物84.3gを得た。得られた溶出物を、XAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:67×6.2cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約1Lずつ回収して、8フラクションに分離した。各フラクション液10μLをHPLCで成分分析を行った。なお、フラクション2、3、4、5、6、7、8の収量は、それぞれ31.4g、6.5g、5.0g、7.2g、14.5g、8.8g、6.5gであった。フラクション1は、HPLC分析結果よりピーク化合物が検出されなかったため、収量は計測しなかった。
実施例1と同様にして、カフェ酸100gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をステンレス容器に敷きつめて窒素を充填した後、密閉して、オイルバスで140℃、90分間程度加熱した。この加熱物に対してメタノール(計1.5L)を用いて溶出を複数回行い、溶出物84.3gを得た。得られた溶出物を、XAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:67×6.2cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約1Lずつ回収して、8フラクションに分離した。各フラクション液10μLをHPLCで成分分析を行った。なお、フラクション2、3、4、5、6、7、8の収量は、それぞれ31.4g、6.5g、5.0g、7.2g、14.5g、8.8g、6.5gであった。フラクション1は、HPLC分析結果よりピーク化合物が検出されなかったため、収量は計測しなかった。
<HPLC分析条件(成分分析)>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280、320nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280、320nm
<XAD−7カラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):67×6.2cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)50%(Fr.1,2)、60%(Fr.3,4)、75%(Fr.5,6)、90%(Fr.7,8)
充填剤:Amberlite XAD−7(2000cc)
フラクション容量:1L
カラム(サイズ):67×6.2cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)50%(Fr.1,2)、60%(Fr.3,4)、75%(Fr.5,6)、90%(Fr.7,8)
充填剤:Amberlite XAD−7(2000cc)
フラクション容量:1L
フラクション3から化合物(2)〜(6)を単離した。
<フラクション3におけるHPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=85:15(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=85:15(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
また、Sephadex LH−20カラム(63×5.5cm(内径))を用いてCH3OH溶出により、フラクション6を精製した。その後、分取HPLCを用いてフラクション6から化合物(7)〜(11)を単離した。
<Sephadex LH−20カラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):63×5.5cm(内径)
溶媒:CH3OH
充填剤:Sephadex LH−20(1500cc)
フラクション容量:150mL
カラム(サイズ):63×5.5cm(内径)
溶媒:CH3OH
充填剤:Sephadex LH−20(1500cc)
フラクション容量:150mL
<フラクション6におけるHPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)25%(0〜48分)、30%(48.1〜120分)
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)25%(0〜48分)、30%(48.1〜120分)
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
(2)化合物(12)の分離
実施例1と同様にして、カフェ酸5gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をアルミトレイに敷きつめて乾熱機で140℃、積算180分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(計270mL)を用いて溶出を複数回行った。得られた溶出物をTOYOPEARL HW40Fカラム(38×5.0cm(内径))に供して、CH3OHを用いて溶出を行った。溶出液は約75mLずつ回収して、25フラクションに分離した。フラクション17〜20を一つにまとめて、減圧下で濃縮を行った。得られた濃縮物(743mg)をCosmosil 140C18−OPNカラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約100mLずつ回収して、12フラクションに分離した。分取HPLCを用いてフラクション5(61mg)から化合物(12)を単離した。
実施例1と同様にして、カフェ酸5gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をアルミトレイに敷きつめて乾熱機で140℃、積算180分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(計270mL)を用いて溶出を複数回行った。得られた溶出物をTOYOPEARL HW40Fカラム(38×5.0cm(内径))に供して、CH3OHを用いて溶出を行った。溶出液は約75mLずつ回収して、25フラクションに分離した。フラクション17〜20を一つにまとめて、減圧下で濃縮を行った。得られた濃縮物(743mg)をCosmosil 140C18−OPNカラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約100mLずつ回収して、12フラクションに分離した。分取HPLCを用いてフラクション5(61mg)から化合物(12)を単離した。
<TOYOPEARL HW40Fカラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):38×5.0cm(内径)
溶媒:CH3OH
充填剤:TOYOPEARL HW40F(750cc)
フラクション容量:75mL
カラム(サイズ):38×5.0cm(内径)
溶媒:CH3OH
充填剤:TOYOPEARL HW40F(750cc)
フラクション容量:75mL
<Cosmosil 140C18−OPNカラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)10%(Fr.1,2)、20%(Fr.3,4)、30%(Fr.5,6)、40%(Fr.7,8)、60%(Fr.9,10)、80%(Fr.11,12)
充填剤:Cosmosil 140C18−OPN(100cc)
フラクション容量:100mL
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)10%(Fr.1,2)、20%(Fr.3,4)、30%(Fr.5,6)、40%(Fr.7,8)、60%(Fr.9,10)、80%(Fr.11,12)
充填剤:Cosmosil 140C18−OPN(100cc)
フラクション容量:100mL
<HPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
(3)化合物(7)〜(10)の分離
実施例1と同様にして、カフェ酸1gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をビーカーの底面に敷きつめて、オイルバスで200℃、積算30分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(50mL)を用いて溶出を2回行った。得られた溶出物(755g)をXAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約75mLずつ回収して、16フラクションに分離した。フラクション12、13を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション12及び13の混合物(86mg)から化合物(7)及び(8)を単離した。また、フラクション14、15を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション14及び15の混合物(264mg)から化合物(9)及び(10)を単離した。
実施例1と同様にして、カフェ酸1gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をビーカーの底面に敷きつめて、オイルバスで200℃、積算30分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(50mL)を用いて溶出を2回行った。得られた溶出物(755g)をXAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約75mLずつ回収して、16フラクションに分離した。フラクション12、13を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション12及び13の混合物(86mg)から化合物(7)及び(8)を単離した。また、フラクション14、15を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション14及び15の混合物(264mg)から化合物(9)及び(10)を単離した。
<XAD−7カラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)10%(Fr.1,2)、20%(Fr.3,4)、30%(Fr.5,6)、40%(Fr.7,8)、50%(Fr.9,10)、60%(Fr.11,12)、75%(Fr.13,14)、90%(Fr.15,16)
充填剤:Amberlite XAD−7(100cc)
フラクション容量:100mL
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)10%(Fr.1,2)、20%(Fr.3,4)、30%(Fr.5,6)、40%(Fr.7,8)、50%(Fr.9,10)、60%(Fr.11,12)、75%(Fr.13,14)、90%(Fr.15,16)
充填剤:Amberlite XAD−7(100cc)
フラクション容量:100mL
<フラクション12及び13におけるHPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=70:30(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=70:30(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
<フラクション14及び15におけるHPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
(4)アセチル化された化合物(13)〜(17)の分離
実施例1と同様にして、カフェ酸1gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をビーカーの底面に敷きつめて、オイルバスで200℃、積算210分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(50mL)を用いて溶出を2回行った。得られた溶出物(570g)をXAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約100mLずつ回収して、8フラクションに分離した。フラクション6、7を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション12及び13の混合物(86mg)から化合物(7)及び(8)を単離した。また、フラクション14、15を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション14及び15の混合物(264mg)から化合物(9)及び(10)を単離した。
実施例1と同様にして、カフェ酸1gを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物を調製した。次いで、当該混合物をビーカーの底面に敷きつめて、オイルバスで200℃、積算210分間加熱した。この加熱物に対してメタノール(50mL)を用いて溶出を2回行った。得られた溶出物(570g)をXAD−7カラムクロマトグラフィー(カラムサイズ:39×1.8cm(内径))に供して、CH3OH−H2O混合溶媒を用いて溶出を行った。溶出液は約100mLずつ回収して、8フラクションに分離した。フラクション6、7を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション12及び13の混合物(86mg)から化合物(7)及び(8)を単離した。また、フラクション14、15を一つにまとめて、分取HPLCを用いてフラクション14及び15の混合物(264mg)から化合物(9)及び(10)を単離した。
以下の条件に従って分取HPLCを用いてフラクション6.7(195mg)から化合物(13)を単離した。さらに、得られた分取物それぞれに無水酢酸 0.5mL、ピリジン0.5mLを添加、混合してアセチル化を行った。その後、TLC分取を行い精製することで、アセチル化された化合物(14)〜(17)を得た。
<XAD−7カラムクロマトグラフィー条件>
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)40%(Fr.1,2)、55%(Fr.3,4)、70%(Fr.5,6)、90%(Fr.7,8)
充填剤:Amberlite XAD−7(100cc)
フラクション容量:100mL
カラム(サイズ):39×1.8cm(内径)
溶媒:(A)水、(B)CH3OH
グラジエント条件(ステップワイズグラジエント法):(B)40%(Fr.1,2)、55%(Fr.3,4)、70%(Fr.5,6)、90%(Fr.7,8)
充填剤:Amberlite XAD−7(100cc)
フラクション容量:100mL
<HPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=75:25(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
図3に、カフェ酸を140℃で60分間加熱して得られた組成物(pH=6.0相当、1mg/mL)を、以下の条件でHPLC分析したクロマトグラムを示し、図4に、カフェ酸を200℃で30分間加熱して得られた組成物(pH=6.0相当、1mg/mL)を、以下の条件でHPLC分析したクロマトグラムを示す。図3及び図4中、各ピークは各番号の化合物のピークを示す。
<HPLC分取条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280nm
(5)化合物(18)及び(19)の分離
図3のクロマトグラムの化合物11のピーク及びその付近を分画し、更に以下の条件のリサイクル分取HPLCに供して分離精製したところ、化合物(18)及び(19)をそれぞれ5mg分取した。
図3のクロマトグラムの化合物11のピーク及びその付近を分画し、更に以下の条件のリサイクル分取HPLCに供して分離精製したところ、化合物(18)及び(19)をそれぞれ5mg分取した。
<リサイクル分取HPLC条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=45:55(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×20mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液と(B)CH3CNの混合溶媒[(A):(B)=45:55(容量比)]
流速:9.6mL/分
検出波長:280nm
化合物(3)〜(19)の構造を以下に示す。化合物(5)、(6)、(11)、(12)、(13)、(16)、(17)、(18)、及び(19)は新規化合物であった。化合物(9)、(10)及び(14)は、焙煎コーヒー豆に含まれる苦味物質として報告があり、化合物(3)及び(4)は、コーヒー抽出物の気泡促進剤としての報告がある。また、これらの化合物のNMR分析及びTOFMS(ESI又はDARTイオン化法)による質量分析結果を以下に示す。
(6)キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定−1
化合物(3)〜(13)のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、その結果を表21にまとめた。なお、化合物(14)〜(17)は、アセチル化して構造解析したため、活性測定は行わなかった。ネガティブコントロールとしてカフェ酸を、ポジティブコントロールとしてアロプリノールを用いた。
化合物(3)〜(13)のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、その結果を表21にまとめた。なお、化合物(14)〜(17)は、アセチル化して構造解析したため、活性測定は行わなかった。ネガティブコントロールとしてカフェ酸を、ポジティブコントロールとしてアロプリノールを用いた。
Dunnett検定を行ったところ、いずれの化合物も有意差があった(p<0.05)。
化合物(5)、(6)、(10)、(11)、及び(12)は、痛風治療薬アロプリノールには及ばないものの、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が認められており、加熱原料であるカフェ酸より強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示した。特に、化合物(6)及び(11)は、阻害率が50%を超える強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していた。カフェ酸二量体である化合物(7)、(9)、(10)と六量体である化合物(11)を比較すると、明らかに化合物(11)の方が強い阻害活性を示した。このことから、カフェ酸加熱により、4−ビニルカテコールが生じ、その多量化が進行することにより、より強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す物質が生成することで、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有するカフェ酸加熱物に変化したものと考えられた。
化合物(5)、(6)、(10)、(11)、及び(12)は、痛風治療薬アロプリノールには及ばないものの、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が認められており、加熱原料であるカフェ酸より強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示した。特に、化合物(6)及び(11)は、阻害率が50%を超える強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していた。カフェ酸二量体である化合物(7)、(9)、(10)と六量体である化合物(11)を比較すると、明らかに化合物(11)の方が強い阻害活性を示した。このことから、カフェ酸加熱により、4−ビニルカテコールが生じ、その多量化が進行することにより、より強力なキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す物質が生成することで、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を有するカフェ酸加熱物に変化したものと考えられた。
(7)キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定−2
化合物(14)〜(19)のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、その結果を表22にまとめた。ネガティブコントロールとしてカフェ酸を、ポジティブコントロールとしてアロプリノールを用いた。カフェ酸の実験データに対して、Dunnett検定を行ったところ、化合物(17)以外の全ての化合物で有意差があった(p<0.05:表中「*」)。ただし、アロプリノールについては、濃度が異なったためにDunnett検定は行わなかった。なお、本実施例においては、SD=SQRT(3)×SEの関係が成り立つ。
化合物(14)〜(19)のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し、その結果を表22にまとめた。ネガティブコントロールとしてカフェ酸を、ポジティブコントロールとしてアロプリノールを用いた。カフェ酸の実験データに対して、Dunnett検定を行ったところ、化合物(17)以外の全ての化合物で有意差があった(p<0.05:表中「*」)。ただし、アロプリノールについては、濃度が異なったためにDunnett検定は行わなかった。なお、本実施例においては、SD=SQRT(3)×SEの関係が成り立つ。
[実施例3]
カフェ酸の熱重合反応時の水の影響を調べた。
カフェ酸の熱重合反応時の水の影響を調べた。
<カフェ酸の固体加熱処理>
実施例1と同様にして、カフェ酸10mgを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物(pH6.0)を調製した。次いで、当該混合物(38mg)を試験管に入れて、アルミバスを用いて120℃、30分間加熱した。冷却した後、この加熱物に対してメタノール(1mL)を用いた溶出を2回行い、溶出物を得た。得られた溶出物を、カフェ酸相当量1mg/mLのメタノール溶液に調製した後、0.2μmのフィルターで濾過し、以下の条件でHPLC分析した。クロマトグラムを図5に示す。
実施例1と同様にして、カフェ酸10mgを用いて、カフェ酸とリン酸緩衝塩の混合物(pH6.0)を調製した。次いで、当該混合物(38mg)を試験管に入れて、アルミバスを用いて120℃、30分間加熱した。冷却した後、この加熱物に対してメタノール(1mL)を用いた溶出を2回行い、溶出物を得た。得られた溶出物を、カフェ酸相当量1mg/mLのメタノール溶液に調製した後、0.2μmのフィルターで濾過し、以下の条件でHPLC分析した。クロマトグラムを図5に示す。
<HPLC分析条件>
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280nm
カラム:Cosmosil 5C18−AR−II(250×4.6mm(内径))
溶媒:(A)1% 酢酸水溶液、(B)CH3CN
グラジエント条件(リニアグラジエント法):(B)5%(0分)、45%(40分)、100%(50−55分)
流速:1.0mL/分
検出波長:280nm
<カフェ酸の液体加熱処理>
40mgのカフェ酸と0.5 mLのH2Oとを耐圧管に入れて、溶液を軽く混合した後、蓋を閉めて、オイルバスで120℃、60分間加熱した。冷却した後、この加熱した溶液にメタノールを加えて10mLに希釈して、カフェ酸相当量1mg/mL溶液を作成した。当該溶液を、固体加熱処理で得られたサンプルと同様にしてHPLC分析した。クロマトグラムを図6に示す。
40mgのカフェ酸と0.5 mLのH2Oとを耐圧管に入れて、溶液を軽く混合した後、蓋を閉めて、オイルバスで120℃、60分間加熱した。冷却した後、この加熱した溶液にメタノールを加えて10mLに希釈して、カフェ酸相当量1mg/mL溶液を作成した。当該溶液を、固体加熱処理で得られたサンプルと同様にしてHPLC分析した。クロマトグラムを図6に示す。
図5及び図6のクロマトグラム中、各ピークは各番号の化合物のピークを示す。固体加熱処理を行ったサンプルでは、化合物(9)及び(10)を含むビニルカテコール類のピークが観測された。一方で、液体加熱処理を行ったサンプルでは、化合物(9)及び(10)のピークは確認できたものの、固体加熱処理のサンプルと比較するとピーク強度はかなり小さかった。逆に、カフェ酸の脱炭酸反応により得られる4−ビニルカテコールのピークは、固体加熱処理サンプルでは非常に低いピークであったのに対して、液体加熱処理サンプルではかなり強いピークであった。これらの結果から、カフェ酸加熱物は、カフェ酸を水を添加した反応系で加熱した場合でも得られるが、その熱重合の反応効率は非常に低いこと、カフェ酸を水を添加していない反応系で加熱することにより、熱重合が進行してカフェ酸重合体を効率よく合成できること、が確認された。
Claims (13)
- カフェ酸加熱物を有効成分とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤。
- カフェ酸重合体を有効成分とする、請求項1に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
- 2〜10分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とする、請求項2に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
- 2〜6分子のカフェ酸からなるカフェ酸重合体を有効成分とする、請求項2に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
- 多環構造を備えるカフェ酸重合体を有効成分とする、請求項2〜4のいずれか一項に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
- 固体のカフェ酸を、110〜290℃で加熱する、カフェ酸加熱物の製造方法。
- 加熱温度が、140℃〜280℃である、請求項7に記載のカフェ酸加熱物の製造方法。
- カフェ酸を加熱することにより得られたカフェ酸加熱物含有組成物を有効成分としてキサンチンオキシダーゼ阻害剤を製造する、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする、医薬品。
- 痛風の治療又は再発予防に用いられる、請求項11に記載の医薬品。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤を含有し、血清中の尿酸値を低減する機能性食品。
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JP (1) | JP2019163234A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113144169A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-07-23 | 渤海大学 | 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用 |
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2019
- 2019-01-11 JP JP2019003853A patent/JP2019163234A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113144169A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-07-23 | 渤海大学 | 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用 |
CN113144169B (zh) * | 2021-02-10 | 2023-05-30 | 渤海大学 | 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用 |
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