CN115819503B

CN115819503B - 具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽及其应用

Info

Publication number: CN115819503B
Application number: CN202211306840.1A
Authority: CN
Inventors: 李文; 杨焱; 陈万超; 吴迪; 张忠
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN115819503A

Abstract

本发明属于菌菇活性肽制备技术领域，具体涉及具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽及其应用。本发明提供了所述大球盖菇咸味活性肽包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述寡肽Ⅰ的氨基酸序列具体为KSWDDFFTR；所述多肽Ⅱ的氨基酸序列具体为GQEDYDRLRPL。本发明所述大球盖菇咸味活性肽能与味蕾咸味受体TRPV1及血管紧张素转化酶(Angiotensinconverting‑Ienzyme，ACE)受体有效结合；所述大球盖菇咸味活性肽咸味强度高且具有持续稳定的降血压效果，具有安全无毒副作用和水溶性良好等特点，可用于减盐增咸调味品、降血压药品以及保健品的制备，具有广泛的应用前景。

Description

具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽及其应用

技术领域

本发明属于菌菇活性肽制备技术领域，具体涉及具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽及其应用。

背景技术

随着世界范围内对低钠饮食的倡导以及国民健康意识的提高，消费者对于摄入过量的食盐会增加患高血压、冠心病等心血管疾病的风险认知已经形成，会主动控制膳食中食盐的摄入量并诉求更多低盐产品。与此同时，消费者并不会对减盐产品的口感和风味降低要求，“减盐不减咸”成为产品开发的重点。面对国家提倡全民减盐，在不影响食品风味品质与保质期等前提下减少食盐的添加量，将天然食源性咸味肽作为食盐的替代品，达到“减盐不减咸”目的，在国家倡导的减盐策略执行上，有着重要的研究意义。

大球盖菇含有的风味物质，不仅能带来愉悦的味觉感受，在保障人体健康中也发挥着重要的营养作用和生物活性。成熟的大球盖菇子实体中蛋白含量可达到40～50％干重，游离肽含量可达到11～14％干重，具有制备风味活性肽的独特优势。从大球盖菇中开发具有良好滋味活性及生物活性的肽，可提升大球盖菇产品附加值；开发的风味活性肽可作为食品、药品新资源进行应用，符合我国大健康产业的发展需求。

人体对咸味的感知受体包括细胞膜上瞬时受体电位(transientreceptorpotential，TRP)通道的受体成员。TRP受到刺激后促进钠离子进入味觉细胞，从而增加咸味感知强度。研究表明，TRPV1基因敲除的小鼠，对咸味物质未表现出味觉感知反应。TRPV1受体蛋白可以作为咸味感知的受体，来识别天然或合成的咸味化合物。因此，可采用风味肽结合TRPV1咸味受体能力进行肽呈味强度预测，再采用感官或电子舌评价对肽的呈味效果进行验证，进一步筛选及确认呈咸度高的风味肽。

现有研究表明，活性肽可通过与血管紧张素转化酶(Angiotensin converting-Ienzyme，ACE)活性位点结合形成复合物，影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统，实现机体调控降血压的作用。但是具备有降血压作用的大球盖菇活性肽在本领域中还较为稀有。

发明内容

本发明的目的在于提供具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽及其应用，所述大球盖菇咸味活性肽能与味蕾咸味受体TRPV1及血管紧张素转化酶ACE受体有效结合，兼具咸味和降血压功效。

本发明提供了具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述寡肽Ⅰ的氨基酸序列为KSWDDFFTR，所述多肽Ⅱ的氨基酸序列为GQEDYDRLRPL。

优选的，所述大球盖菇咸味活性肽为寡肽Ⅰ或多肽Ⅱ。

本发明还提供了上述技术方案所述大球盖菇咸味活性肽的制备方法，包括如下步骤：

以碱性蛋白酶酶解大球盖菇，对得到的酶解液离心，得到大球盖菇上清液；

以截留分子量为200～5000Da的滤膜对所述大球盖菇上清液进行超滤，将得到的透过液进行冷冻干燥和LC-MS/MS检测，得到所述大球盖菇咸味活性肽；

所述碱性蛋白酶的酶活为2×10⁵U/g，用量为大球盖菇质量的1％。

优选的，所述酶解为超声辅助酶解；所述超声的模式包括平板超声；

所述超声辅助酶解的功率密度为120W/L，频率为20kHz，超声辅助酶解的时间为40min。

本发明还提供了上述技术方案所述大球盖菇咸味活性肽在调味品中的应用。

优选的，所述调味品包括减盐增咸调味料。

本发明还提供了一种减盐增咸调味料，所述减盐增咸调味料包括上述技术方案所述的大球盖菇咸味活性肽。

本发明还提供了上述技术方案所述大球盖菇咸味活性肽在制备降血压药物中的应用。

优选的，所述降血压药物包括ACE抑制剂。

本发明还提供了一种降血压药物，所述降血压药物的有效成分包括上述技术方案所述的大球盖菇咸味活性肽。

有益效果：

本发明提供了具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述寡肽Ⅰ的氨基酸序列为KSWDDFFTR；所述多肽Ⅱ的氨基酸序列为GQEDYDRLRPL。本发明所述大球盖菇咸味活性肽能与味蕾咸味受体TRPV1及血管紧张素转化酶(Angiotensinconverting-I enzyme，ACE)受体有效结合；所述大球盖菇咸味活性肽咸味强度高且具有持续稳定的降血压效果，具有安全无毒副作用和水溶性良好等特点，可用于减盐增咸调味品、降血压药品以及保健品的制备，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1-1、1-3分别为大球盖菇咸味活性肽KSWDDFFTR与咸味受体TRPV1和血管紧张素转化酶ACE受体的对接结果；

图1-2、1-4分别为大球盖菇咸味活性肽GQEDYDRLRPL与咸味受体TRPV1和血管紧张素转化酶ACE受体的对接结果；

图2为大球盖菇咸味活性肽KSWDDFFTR和GQEDYDRLRPL的分子结构；

图3为大球盖菇咸味活性肽KSWDDFFTR和GQEDYDRLRPL的呈咸结果评价；

图4为大球盖菇咸味活性肽KSWDDFFTR和GQEDYDRLRPL对大鼠收缩压(SBP)的测定结果；

图5为大球盖菇咸味活性肽KSWDDFFTR和GQEDYDRLRPL对大鼠舒张压(DBP)的测定结果。

具体实施方式

本发明提供了具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，所述大球盖菇咸味活性肽包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述寡肽Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述多肽Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。

本发明所述大球盖菇咸味活性肽优选为寡肽Ⅰ或多肽Ⅱ，所述SEQ ID NO.7所示的序列具体为KSWDDFFTR；所述SEQ ID NO.26所示的序列具体为GQEDYDRLRPL。

本发明优选将大球盖菇粉与水混合制备所述大球盖菇菌菇液，所述大球盖菇菌菇液中大球盖菇粉的质量浓度优选为40～50g/L，更优选48g/L。本发明所述大球盖菇粉的粒径优选为60～80目，更优选为60目。本发明所述大球盖菇粉优选以大球盖菇子实体制备得到。

得到所述大球盖菇菌菇液后，本发明以碱性蛋白酶酶解大球盖菇，对得到的酶解液离心，得到大球盖菇上清液。本发明所述碱性蛋白酶的酶活为2×10⁵U/g，用量为大球盖菇质量的1％。本发明所述酶解的温度优选为42℃，pH值优选为8.5。本发明所述酶解优选为超声辅助酶解，所述超声的模式优选平板超声。本发明所述超声辅助酶解的功率密度优选为120W/L；所述频率优选20kHz；所述超声辅助酶解的时间优选为40min。本发明所述离心的转速优选为3500～4500r/min，更优选为4000r/min；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。得到所述大球盖菇上清液后，本发明以截留分子量为200～5000Da的滤膜对所述大球盖菇上清液进行超滤。本发明所述滤膜优选包括超滤膜或纳滤膜，所述滤膜的截留分子量优选为3000Da。

所述超滤后，本发明将得到的透过液进行冷冻干燥和LC-MS/MS检测，得到所述大球盖菇咸味活性肽。本发明所述冷冻干燥的温度优选为-50～-70℃，更优选为-70℃；所述冷冻干燥的时间优选为24～72h，更优选为48h。本发明对所述LC-MS/MS检测的具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规LC-MS/MS检测方法或委托第三方检测均可。

本发明所述大球盖菇咸味活性肽优选分离自大球盖菇子实体，后通过人工合成序列对得到的大球盖菇咸味活性肽验证其具备的呈味特性及其降血压活性。基于所述大球盖菇咸味活性肽的上述活性，将所述大球盖菇咸味活性肽用于调味品和降血压药物的制备。本发明用于制备调味品的大球盖菇咸味活性肽优选包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ，更优选为寡肽Ⅰ或多肽Ⅱ。本发明用于制备降血压药的大球盖菇咸味活性肽优选包括寡肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ，更优选包括寡肽Ⅰ。

当将所述大球盖菇咸味活性肽制备调味品时，所述调味品优选包括减盐增咸调味料。当将所述大球盖菇咸味活性肽制备降血压药物时，所述降血压药物优选包括ACE抑制剂。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

如无特殊限定，本发明所述的试验方法均为本领域中常规试验方法，所使用的试剂均可通过常规市售渠道获得。

实施例1

具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，制备步骤如下：

1、取大球盖菇子实体菌菇粉(粒径为60目～80目)，将大球盖菇子实体菌菇粉与水混合溶解制备得到浓度为48g/L的大球盖菇菌菇液；在大球盖菇菌菇液中加入酶活力为2×10⁵U/g碱性蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)，进行平板超声辅助酶解，加酶量为大球盖菇原料液中菌菇粉质量的1％，酶解温度为42℃，pH8.5；平板超声功率密度120W/L，超声频率20kHz，平板超声辅助酶解作用时间40min，得大球盖菇酶解液；

将得到的酶解液在4000r/min条件下，离心10min，得到酶解上清液。采用截留分子量为3000Da的超滤膜对酶解上清液进行超滤，将得到的透过液在-70℃下，冷冻干燥48h后，委托武汉研检检测科技有限公司进行LC-MS/MS检测，得到大球盖菇肽段；

2、大球盖菇肽段的筛选：

1)利用BIOPEP-UWM的Sensory peptide and amino acids模块，预测步骤1中LC-MS/MS鉴定得到的大球盖菇肽段的呈味活性特性，获得164种具有咸味或咸味提升呈味特性的肽段(咸味肽或咸味提升肽)。

2)利用Bioware肽数据库的Peptide Ranker模块(http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/)对164种咸味肽或咸味提升肽进行生物活性预测，筛选得到48种预测评分值大于0.5的肽段(评分大于0.5，可认为具有生物活性)。

3)利用BIOPEP-UWM的Bioactive peptide模块，预测发现48种肽段，均是潜在的ACE抑制剂。

4)采用Innovagen程序(http://www.innovagen.com/proteomics-tools)的Peptide property calculator模块工具，预测48种肽段的溶解度，其中40种肽段具有良好水溶性。

5)采用admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/)预测肽段的人体肠道吸收、血脑屏障穿透和急性口服毒性性质。在admetSAR肽组学网站Predict下，分别输入肽段的Smile信息，肽段均无毒，具有良好的小肠吸收性和血脑屏障透过性。

6)进一步结合肽段呈味特性、MS丰度值及预测评价打分，得到寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR，咸味肽，MS丰度值高)和多肽Ⅱ(GQEDYDRLRPL，咸味肽、咸味提升肽，MS丰度值高)，结果如表1-1和1-2所示：

表1-1大球盖菇肽段的生物活性、链长、呈味特性及MS丰度筛选结果

表1-2大球盖菇肽段的水溶性及毒性评价结果

本发明首先于表1-1中筛选咸味肽，在得到的咸味肽中筛选同时具备咸味肽和咸味提升肽的肽段，进而得到20种咸味肽和咸味提升肽(表1-1～1-2中标注*的肽段)，再依据寡肽(2～10个氨基酸)和多肽(11～50个氨基酸)的分类，筛选MS丰度最高的肽段，即得到本发明中的寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR)和多肽Ⅱ(GQEDYDRLRPL)。

实施例2

1、具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，为寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ，寡肽Ⅰ的序列为KSWDDFFTR，多肽Ⅱ的序列为GQEDYDRLRPL，寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ的二级结构如图2所示；

通过固相合成法(委托吉尔生化(上海)有限公司合成)获得大球盖菇咸味肽的合成肽纯品，并验证其功能。

2、大球盖菇咸味活性肽活性鉴定

利用分子对接软件，分析大球盖菇咸味活性肽与咸味受体、ACE受体结合程度。具体包括：从PDB数据库中获得咸味受体TRPV1(Q8NER1)和ACE(1O86)受体的晶体结构作为蛋白靶标。通过分子对接来筛选能与TRPV1和ACE受体紧密结合的大球盖菇肽。以受体结合打分值、成键数量及结合能为指标，验证大球盖菇咸味活性肽的呈咸度和降血压活性，结果如图1-1～1-4所示，其中图1-1为寡肽Ⅰ与TRPV1受体的对接结果；图1-2为多肽Ⅱ与TRPV1受体的对接结果；图1-3为寡肽Ⅰ与ACE受体的对接结果；图1-4为多肽Ⅱ与ACE受体的对接结果。

寡肽I与TRPV1受体对接得分为-9.0。寡肽I与TRPV1受体之间形成了5个氢键，R9与A链D510形成两个氢键，与A链Y512形成氢键相互作用；T8与B链Q562形成氢键相互作用，F6与B链M563形成氢键相互作用。此外，寡肽I的W3与TRPV1受体A链V509形成烷基-π相互作用，F6与B链F560形成π-π相互作用。

多肽Ⅱ与TRPV1受体对接得分为-7.3。多肽Ⅱ的D4与TRPV1受体B链M563、Q562形成氢键相互作用；D6与A链R576形成一个盐桥相互作用和两个氢键相互作用；R7与A链Y512形成氢键相互作用，与D510形成两个氢键相互作用，与S404形成氢键相互作用；L8与A链H411、D510、S405形成氢键相互作用；R9与A链S405形成两个氢键相互作用；L11与A链S405形成氢键相互作用。

寡肽I与ACE受体对接得分为-15.9。多肽Ⅱ与ACE受体之间形成13个氢键相互作用，5个离子键相互作用，1个金属受体相互作用。其中，K1与GLU376、GLU162、ASP377形成三个氢键和三个离子键相互作用；D4与HIS353、SER355、HIS383形成三个氢键相互作用；R9与ASN70、ASN66形成三个氢键相互作用；D5与ARG522、SER355形成两个氢键相互作用和2个离子键相互作用；S2与ASP415、T8与SER517分别形成两个氢键相互作用；D4的氧原子与Zn701形成金属受体相互作用。

多肽Ⅱ与ACE受体对接得分为-17.2。多肽Ⅱ与ACE受体之间形成14个氢键相互作用，2个离子键相互作用，1个金属受体相互作用。其中，Y5与ASP358、ASN66、ASN70形成三个氢键相互作用；R9与GLU123、THR92形成两个氢键相互作用；受体ARG55分别与L11、Q2形成三个氢键相互作用；E3与HIS383、HIS387、TYR523形成四个氢键相互作用；D4与SER355、L8与ARG124形成两个氢键相互作用。此外，L11的氧原子与ARG522形成离子键相互作用；E3的氧原子与Zn701形成离子键相互作用和金属受体相互作用。

从图1-1～1-4中可以看出：本发明所述寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ与咸味受体TRPV1以及ACE受体进行紧密结合，进而证明本发明所述寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ兼具咸味和降压的功效。

实施例3

采用电子舌验证大球盖菇咸味活性肽呈咸强度测定

分别准确称取0.1g实施例1中步骤1中获得的寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ合成肽纯品，分别加入100mL纯水溶解，逐级稀释为浓度为0.25，0.375，0.5，0.75和1.0mg/mL的大球盖菇咸味活性肽溶液，通过电子舌对不同浓度梯度的大球盖菇咸味活性肽溶液的呈咸强度进行测定。以同浓度梯度的氯化钠(NaCl)做标准曲线(y＝1.974x+0.0913，R²＝0.9913)。

电子舌的测定方法具体为：移取25mL溶液加入电子舌专用样品杯中，每个浓度梯度重复4次，传感器置于设备参比溶液中归零30s开始进行咸味呈味强度测定，测试时间30s。结果如表2和图3所示。

表2大球盖菇咸味活性肽的咸味评价值

由表2和图3可以得出：同浓度(1mg/mL)KSWDDFFTR的呈咸强度相当于NaCl的3.11倍，其呈咸阈值为600.47μmol/L；同浓度(1mg/mL)GQEDYDRLRPL的呈咸强度相当于NaCl的5.29倍，其呈咸阈值为383.58μmol/L，由此可以得出，两种大球盖菇咸味活性肽具有减盐增咸调味料的开发潜力，可以在饮食中部分替代食盐(NaCl)，降低因盐摄入过量而引起的血压升高的问题。

实施例4

大球盖菇咸味活性肽体外ACE抑制活性测定方法：

采用DOJINDO同仁化学ACE Kit-WST试剂盒对实施例1中制备得到的大球盖菇酶解液、超滤透过液、寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ的ACE抑制活性进行测定，具体步骤如下：

准确称取1.0g实施例1中制备得到的大球盖菇酶解液、超滤透过液的混合物冻干样品，分别加入100mL纯水溶解，逐级稀释为浓度为10，2，0.4，0.08和0.016mg/mL的样品溶液。取20μL样品溶液，加入20μL试剂盒基质缓冲液和20μL试剂盒酶工作液，37℃培养60min，加入200μL试剂盒指示液，室温下培养10min，于96孔板，450nm处测定吸光值。ACE抑制剂活性值(抑制率％)＝(无抑制全显色的吸光值-样品测定的吸光值)÷(无抑制全显色的吸光值-试剂的空白对照吸光值)×100。分别以样品浓度和抑制剂活性为轴横纵坐标制作抑制曲线，由抑制曲线得到抑制率50％时样品的浓度(IC₅₀)。

结果表明：实施例1中制备得到的大球盖菇酶解液、超滤透过液的体外ACE抑制活性的IC₅₀值分别为0.122mg/mL、0.074mg/mL。

将实施例1中制备得到的寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ进行稀释，即使稀释至浓度为5^-6mg/mL时，其ACE抑制率仍然为100％，因而，由于其体外ACE抑制活性过高，无法获得寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ的体外ACE抑制活性的IC₅₀值。

实施例5

大球盖菇咸味活性肽体内降血压活性测定

试验材料：雄性大鼠(周龄11周，体重200～250g)(购买于斯贝福(苏州)生物技术有限公司)，包括SHR高血压大鼠和Wistar正常大鼠。

试验分组：将雄性大鼠常规适应性喂养7d，自由进食饮水，将SHR高血压大鼠和Wistar正常大鼠分别随机分组，每组6只，共6组；

分别为饲喂寡肽Ⅰ的SHR高血压大鼠组，命名为SHR+K-R(9)；饲喂多肽Ⅱ的SHR高血压大鼠组，命名为SHR+G-L(11)；饲喂寡肽Ⅰ的Wistar正常大鼠组，命名为Wistar+K-R(9)；饲喂多肽Ⅱ的Wistar正常大鼠组，命名为Wistar+G-L(11)，饲喂商业化药物BenazeprilHydrochloride的SHR高血压大鼠组，作为阳性对照组，命名为Benazepril Hydrochloride；饲喂生理盐水的SHR高血压大鼠组，作为空白对照，命名为Control。

试验方法：实验当天按照10mg/kg BW的量进行一次灌胃给药，给药后的0、2、4、6、8、24h的6个时间点，使用大鼠无创血压计进行大鼠收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的测定，结果如表3～4和图4～5所示：

表3寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR)和多肽Ⅱ(GQEDYDRLRPL)对大鼠SBP的影响

表4寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR)和多肽Ⅱ(GQEDYDRLRPL)对大鼠DBP的影响

备注：在表3～4中每一组中SBP或DBP所对应的数值均为同一组6只小鼠SBP或DBP的平均值。

由表3～4和图4～5可以得出，寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR)和多肽Ⅱ(GQEDYDRLRPL)对正常大鼠血压影响不大，且对高血压大鼠均具有一定的降压效果，尤其在与商业降压药Benazepril Hydrochloride相同服用剂量下，寡肽Ⅰ(KSWDDFFTR)的降血压效果与Benazepril Hydrochloride效果相当，进而可以得出KSWDDFFTR更具有降血压药物开发潜力。

由以上实施例可以得出，本发明提供的两种大球盖菇咸味活性肽均具有呈咸风味，且均具有降血压的功效，尤其KSWDDFFTR降血压的效果更强。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.具有降血压功能的大球盖菇咸味活性肽，其特征在于，所述大球盖菇咸味活性肽为寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ；所述寡肽Ⅰ的氨基酸序列为KSWDDFFTR，所述多肽Ⅱ的氨基酸序列为GQEDYDRLRPL；

所述寡肽Ⅰ和多肽Ⅱ的结构式分别如式Ⅰ和式Ⅱ所示：

式Ⅰ；

式Ⅱ。

2.权利要求1所述大球盖菇咸味活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以截留分子量为200~5000Da的滤膜对所述大球盖菇上清液进行超滤，将得到的透过液进行冷冻干燥和LC-MS/MS检测，得到所述大球盖菇咸味活性肽；

所述碱性蛋白酶的酶活为2×10⁵U/g，用量为大球盖菇质量的1%。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解为超声辅助酶解；所述超声的模式为平板超声；

4.权利要求1所述大球盖菇咸味活性肽在调味品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调味品包括减盐增咸调味料。

6.一种减盐增咸调味料，其特征在于，所述减盐增咸调味料包括权利要求1所述的大球盖菇咸味活性肽。

7.权利要求1所述大球盖菇咸味活性肽在制备降血压药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述降血压药物包括ACE抑制剂。

9.一种降血压药物，其特征在于，所述降血压药物的有效成分包括权利要求1所述的大球盖菇咸味活性肽。