CN113555060A - 具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法 - Google Patents
具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及蛋白领域，尤其涉及一种具有降血糖、降血压活性的山羊乳酪蛋白肽的制备。本发明的制备方法包括：先将山羊奶处理得到山羊乳酪蛋白。利用计算机虚拟酶切山羊奶酪蛋白，并预测不同蛋白酶切割山羊乳酪蛋白得到的多肽活性，筛选出最佳抑制DPP‑IV酶和ACE酶的蛋白酶种类，之后利用不同蛋白酶对山羊乳酪蛋白进行水解，并验证水解产物的活性，最后对水解产物进行纯化即为山羊乳酪蛋白肽。本发明方法利用生物信息学作为山羊乳酪蛋白活性预测的工具，可节省大量时间、科研成本、准确度高且具有靶向指导作用。利用本发明可制备获得具有DPP‑IV抑制活性和ACE抑制活性，蛋白回收率高、分子量较低且具有较好的胃肠消化稳定性的山羊乳酪蛋白肽。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其涉及一种具有降血糖、降血压活性的山羊乳酪蛋白肽的制备方法。
背景技术
糖尿病和高血压是世界上主要慢性死亡疾病。据统计，全世界一半以上的患者死于由心血管疾病引起的心血管并发症高血压或糖尿病。目前，有多种可用于治疗和/或控制高血压和糖尿病的市售药物，如DPP-IV抑制剂格列苯脲、西格列汀、维格列汀和沙格列汀等，ACE抑制类药物卡托普利福辛普利贝那普利等；这些药物对一种疾病显示出良好的治疗效果，同时身体也产生了较多副作用。因此，如何研发出天然食物来源具有良好治疗效果，并使副作用降至最小成为当前研究的挑战和前景。
羊乳富含蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素、矿物质和其他微量营养素。有研究表明羊奶具有脂肪粒小，低致过敏性，易消化吸收，所以可以成为婴儿配方奶生产中的一种潜在替代品。此外，有报道称羊乳比牛乳具有更大的生物价值。近来的研究表明由多个氨基酸结合而成的短肽比氨基酸具有更好的消化吸收性能，并且营养效果和生理效果更为优越。食物源蛋白肽是利用含蛋白质较高的食物通过酶或微生物的降解，得到的具有生物活性的功能短肽。酪蛋白是山羊乳中含量最多的蛋白质，其氨基酸组成平衡，是优质的动物蛋白质资源。酪蛋白包含有多种生物活性序列，用适当的蛋白酶水解，从酪蛋白中释放出来，成为具有某种生理活性的肽段。
目前酶解法为蛋白肽的主要提取方法，酶解法的酶种类选择对于制备出的肽的功能活性有至关重要的作用，除此之外，由于原材料的生物活性不明确，需要进行大量的体内和体外活性的测定，这样不仅会花费大量的时间且会增加实验成本；微生物法时间周期过长，因此有必要寻求一种时间成本低、靶向作用强的制备蛋白肽的方法。
发明内容
本发明对蛋白质的一级结构进行分析，针对不同蛋白酶对蛋白质的酶切位点进行针对性的切割，以利用蛋白酶的酶解作用的发挥，提高蛋白回收率以及生物活性，节省大量时间成本和科研经费的同时又具有较好的靶向指导作用。
目前，国内外未见利用生物信息学筛选蛋白酶种类制备山羊乳酪蛋白具有DPP-IV(二肽基肽酶)酶抑制和ACE(血管紧张素转换酶)酶抑制功能肽的相关报道。
针对上述技术问题，本发明的目的在于公开了一种山羊乳酪蛋白肽的制备方法及应用，通过本发明可节省大量时间和科研成本，得到功效作用好、毒副作用小、工艺简单的较高DPP-IV酶、ACE酶抑制活性的山羊乳酪蛋白肽产品，该制备方法及产品可广泛应用于高血压和糖尿病的保健品和药物的制备中。
本发明的第一目的在于提供一种具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)基于生物信息学预测不同蛋白酶处理山羊奶酪蛋白得到山羊奶酪蛋白肽的降血糖、降血压活性，并利用生物信息学计算机虚拟筛选出较高降血糖、降血压活性的多种酶；
(2)将计算机模拟筛选出的多种酶中的任一种或者组合分别应用于酶解山羊奶酪蛋白，得到对应的酶解产物；
(3)试验测试并比较不同酶解产物的降血糖、降血压活性，验证计算机虚拟筛选的准确性，并得到更高降血糖、降血压活性的酶的种类，由更高降血糖、降血压活性的酶酶解处理得到的酶解产物即为具有更高降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)具体为：
从蛋白质三维结构数据库RCSB PDB(https://www1.rcsb.org/)中下载山羊乳酪蛋白的各种蛋白类型(αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白)的一级结构；
利用BIOPEP数据库(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/biopep/start_biopep.php)中的“ENZYME(S)ACTION”功能对不同类型的山羊乳酪蛋白进行的虚拟蛋白酶切割，并根据蛋白酶切割后的具有DPP-IV酶、ACE酶的抑制活性的肽片段数量a和氨基酸链长度N的比率预测蛋白酶切割后的肽序列的降血糖、降血压活性，筛选出较高降血糖、降血压活性的多种酶。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)筛选出的较高降血糖、降血压活性的多种酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶+蛋白酶K。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的山羊奶酪蛋白由山羊奶预处理得到。
作为本发明的一种实施方式，山羊奶预处理具体包括：将山羊奶脱脂、凝乳酶沉淀酪蛋白、收集沉淀物步骤，其中收集的沉淀物即为山羊奶酪蛋白。
作为本发明的一种具体实施方式，所述收集沉淀物步骤之后还包括冻干和粉碎步骤，制备得到山羊奶酪蛋白粉。
作为本发明的一种实施方式，山羊奶脱脂的条件：5000r/min脱脂10-60min。
作为本发明的一种实施方式，凝乳酶沉淀酪蛋白中采用0.2-0.8％的凝乳酶。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中酶解山羊乳酪蛋白的具体操作为：将山羊奶酪蛋白加入蒸馏水，配制成质量浓度为2-10％的反应底物，之后加入所述步骤(1)筛选出的多种酶中的任一种或者组合，使蛋白酶与底物的最终比例E/S为3000-15000U/g，按照不同酶种类的最佳酶解条件进行反应，酶解过程中保持恒定的pH值，反应结束后灭酶，离心收集沉淀冻干，粉碎即为酶解产物山羊乳酪蛋白肽。其中，离心条件：3000-9000r/min离心10-50min。
作为本发明的一种实施方式，所述菠萝蛋白酶的添加量为3000-15000U/g，所述菠萝蛋白酶的酶解条件为于pH 5-8条件下在50-60℃进行酶解反应1-6h,酶解过程中保证pH恒定。
作为本发明的一种实施方式，所述胰蛋白酶的添加量为3000-15000U/g，所述菠萝蛋白酶的酶解条件为于pH 7.8-8.5条件下在35-60℃进行酶解反应1-6h,酶解过程中保证pH恒定。
作为本发明的一种实施方式，所述木瓜蛋白酶的添加量为3000-15000U/g，所述菠萝蛋白酶的酶解条件为于pH 5.5-7.5条件下在37-60℃进行酶解反应1-6h,酶解过程中保证pH恒定。
作为本发明的一种实施方式，所述蛋白酶K的添加量为3000-15000U/g，所述菠萝蛋白酶的酶解条件为于pH 4-12.5条件下在50-65℃进行酶解反应1-6h,酶解过程中保证pH恒定。
作为本发明的一种实施方式，本发明还包括将上述制备得到的蛋白肽进行体外模拟胃肠道消化稳定性试验：将上述制备的山羊乳酪蛋白肽溶于去离子水中，用0.1mol/L盐酸溶液调整溶液pH至2.0，加入胃蛋白酶(E/S＝1-3:100,w/w)后置于37℃条件下水解1.5h,之后利用0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至7.0,加入胰蛋白酶(E/S＝1-3:100,w/w)继续于37℃恒温摇床中水解2-5h，反应结束后于沸水浴中灭酶，结束后于8000r/min下离心15min，收集上清液冻干后测定模拟消化后山羊乳酪蛋白DPP-IV和ACE抑制率。
作为本发明的一种实施方式，在所述步骤(3)之后还包括山羊乳酪蛋白肽的纯化步骤；
所述纯化步骤具体为：将冷冻干燥后的山羊乳酪蛋白肽用蒸馏水溶解，然后超滤膜进行分离纯化，取滤液冷冻干燥即为纯化后的山羊乳酪蛋白肽。其中超滤膜的截留分子量包括但不限于1～1000Da。
作为本发明的一种实施方式，采用前述的制备方法，所述步骤(4)中测试酶解产物的生物活性具体是山羊乳酪蛋白DPP-IV酶抑制活性；所述步骤(4)得到的更高DPP-IV酶抑制活性的酶为菠萝蛋白酶，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率为86％，蛋白回收率为84％。
作为本发明的一种实施方式，采用前述的制备方法，所述步骤(4)中测试酶解产物的生物活性具体是血管紧张素转换酶ACE的抑制活性；所述步骤(4)得到的更高ACE酶抑制活性为蛋白酶K，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率为83％，蛋白回收率为83％。
作为本发明的一种实施方式，采用前述的制备方法，所述步骤(2)得到的更高降血糖、降血压活性的酶为木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶，其中，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1～2:1～2，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率不低于86％，山羊乳酪蛋白肽ACE抑制率不低于82％，蛋白回收率不低于85％。
作为本发明的一种实施方式，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1.5：1.0，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率为91％。
作为本发明的一种实施方式，酶解时间为4～5h。
作为本发明的一种实施方式，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1.0：2.0，得到的山羊乳酪蛋白肽ACE抑制率为86％。
本发明的第二目的在于提供一种由前述方法制备的山羊乳酪蛋白肽在辅助治疗高血压和/或糖尿病的保健食品和药品的制备中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的制备方法包括：先将山羊奶处理得到山羊乳酪蛋白。利用计算机虚拟酶切山羊奶酪蛋白，并预测不同蛋白酶切割山羊乳酪蛋白得到的多肽活性，筛选出最佳抑制DPP-IV酶和ACE酶的蛋白酶种类，之后利用不同蛋白酶对山羊乳酪蛋白进行水解，并验证水解产物的活性，最后对水解产物进行纯化即为山羊乳酪蛋白肽。本发明方法利用生物信息学作为山羊乳酪蛋白活性预测的工具预测山羊乳酪蛋白的生物活性，针对性进行酶切，在节省大量时间和科研成本的同时制备得到具有更好效果的蛋白肽，准确度高且具有靶向指导作用。
利用本发明可制备获得具有DPP-IV抑制活性和/或ACE抑制活性，蛋白回收率高、分子量较低且具有较好的胃肠消化稳定性的山羊乳酪蛋白肽。本发明通过加工山羊乳酪蛋白制备降血糖和/或降血压酪蛋白肽，具有优质蛋白来源，无毒副作用、无药物依赖性等优点。
具体实施方式
实施例1
一种具有降血糖活性的山羊乳酪蛋白肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，利用生物信息学模拟筛选出抑制DPP-IV酶较高的酶种类：
首先从RCSB PDB(https://www1.rcsb.org/)里下载得到山羊乳酪蛋白各个蛋白类型(αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白)的一级结构，之后在BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/biopep/start_biopep.php)中利用“ENZYME(S)ACTION”功能对前述不同蛋白类型(αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白)进行虚拟蛋白酶切割，并根据虚拟蛋白酶切割后得到的DPP-IV酶抑制活性肽片段数量(a)和氨基酸链长度(N)的比率预测蛋白酶切割后的肽序列的功能活性：根据预测评分筛选出抑制DPP-IV酶较高的酶种类为木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K。
步骤2，为验证上述5种酶(木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K)的DPP-IV酶的抑制活性，分别对制备得到的山羊乳酪蛋白进行酶解：
预处理：将山羊乳进行离心脱脂，之后用凝乳酶沉淀酪蛋白，收集得到的沉淀物冻干，粉碎后即为山羊乳酪蛋白粉，密封，保存备用。向前述山羊乳酪蛋白粉加入适量蒸馏水制备得到质量浓度为2mg/mL的样品，调pH 7.0后，分别添加9000U/g的菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K以及木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶(质量比为1.5:1)，在50℃条件下酶解时间5h，反应结束后，于8000r/min离心15min,收集沉淀冻干。利用凯式定氮法测定冻干物的蛋白含量以获得蛋白回收率，蛋白回收率即为酶解物中的蛋白含量与酶解前原料中的总蛋白含量之比。
步骤3，纯化：
取步骤2制得的酶解物冻干加入蒸馏水溶解，然后用截留分子量为1000Da的超滤膜进行分离纯化，将超滤获得的1000Da以下的组分冷冻干燥即为山羊乳酪蛋白肽粉，其山羊乳酪蛋白肽粉与酶解物的比重即为分子量＜1000Da的肽的百分比。
步骤4，山羊乳酪蛋白DPP-IV酶抑制活性的测定：
将25μL山羊乳酪蛋白肽水溶液(蛋白浓度为1.6mmol/L)与25μL 100mmol/L Tris-Hcl(pH8.0)缓冲液稀释混合(稀释液应在可测定浓度内)，之后将其混合液加入96孔板中，于37℃条件下孵育10min,加入50μL DPP-IV酶液(酶活8U/L)，充分混匀后继续在37℃条件下孵育60min,结束后加入100μL醋酸-醋酸钠(pH 4.0,1mol/L)缓冲液终止反应，静置5min后于405nm处测吸光值，根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率/％＝[1-(D1-D0)/(D2-D3)]×100
式中D1为样品溶液于405nm处的吸光值；D0为空白对照(Tris-Hcl缓冲液代替DPP-IV酶液)；D2为阴性对照(Tris-Hcl缓冲液代替样品溶液)；D3为阴性空白(Tris-Hcl缓冲液代替样品溶液和DPP-IV酶液)。
表1
根据表1可知，在样品浓度为2mg/mL时，不同蛋白酶酶解得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率之间存在差异。具体地，木瓜蛋白酶+蛋白酶K酶解产物的DPP-IV酶抑制活性＞菠萝蛋白酶酶解产物的DPP-IV酶抑制活性＞胰蛋白酶酶解产物的DPP-IV酶抑制活性＞木瓜蛋白酶酶解产物的DPP-IV抑制活性＞蛋白酶K的DPP-IV酶抑制活性，这与利用生物信息学做虚拟酶切预测的山羊乳酪蛋白对DPP-IV酶抑制率一致，由此可说明利用生物信息学筛选酶种类的方法有效可靠。因此，优选木瓜蛋白酶+蛋白酶K和菠萝蛋白酶为具有降血糖活性山羊乳酪蛋白的最佳复合蛋白酶和单酶种类。
步骤5，降血糖山羊乳酪蛋白肽胃肠稳定性实验：
将最佳蛋白酶制备的山羊乳酪蛋白肽进行体外模拟胃肠道消化稳定性实验，具体操作如下：
将山羊乳酪蛋白肽溶于去离子水中，用0.1mol/L盐酸溶液调整溶液pH至2.0，加入胃蛋白酶(E/S＝3:100,w/w)后置于37℃条件下水解1.5h，之后利用0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至7.0，加入最佳蛋白酶(E/S＝3:100,w/w)继续于37℃恒温摇床中水解4h，反应结束后于沸水浴中灭酶，结束后于8000r/min下离心15min，收集上清液冻干后测定模拟消化后山羊乳酪蛋白DPP-IV抑制率。
DPP-IV酶抑制率的测定方法同实施例1中所述。
选择菠萝蛋白酶解后蛋白肽进行体外模拟消化稳定性试验，结果表明：经体外模拟胃肠消化后，山羊乳酪蛋白肽的DPP-IV酶抑制率为83.91±0.09％。经体外模拟胃肠消化前后DPP-IV酶的IC50值(DPP-IV的IC50值为50％的DPP-IV酶活性抑制对应的肽浓度)从0.37mg/mL升至0.41mg/mL。
选择木瓜蛋白酶+蛋白酶K酶解后蛋白肽进行体外模拟消化稳定性试验，结果表明：经体外模拟胃肠消化后，山羊乳酪蛋白肽的DPP-IV酶抑制率为88.34±0.11％。经体外模拟胃肠消化前后DPP-IV酶的IC50值(DPP-IV的IC50值为50％的DPP-IV酶活性抑制对应的肽浓度)从0.34mg/mL升至0.37mg/mL。
实施例2
一种具有降血压活性的山羊乳酪蛋白肽的制备方法，具体步骤参照实施例1，区别在于：
步骤1，利用生物信息学模拟筛选出抑制ACE酶较高的酶种类：
首先从RCSB PDB(https://www1.rcsb.org/)里下载得到山羊乳酪蛋白各个蛋白类型(αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白)的一级结构，之后在BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/biopep/start_biopep.php)中利用“ENZYME(S)ACTION”功能对前述不同蛋白类型(αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白)进行虚拟蛋白酶切割，并根据虚拟蛋白酶切割后得到的ACE酶抑制活性肽片段数量(a)和氨基酸链长度(N)的比率预测蛋白酶切割后的肽序列的功能活性：根据预测评分筛选出抑制ACE酶较高的酶种类为木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。
步骤2，为验证上述5种酶的ACE酶的抑制活性，分别对制备得到的山羊乳酪蛋白进行酶解：具体方法参照实施例1的步骤2，其中木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶的组合比例为1.5:1(m/m)。
将实施例1的步骤4中二肽基肽酶(DPP-IV酶)抑制活性替换为血管紧张素转换酶(ACE酶)抑制活性的测定。
步骤4，血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的测定：
准确吸取20μL山羊乳酪蛋白肽水溶液(蛋白浓度为1.6mmol/L)加入10μL ACE酶液(0.1U/mL)混合后于37℃条件下孵育8min，之后加入100μL马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL，6.5mmol/L)溶液，混合后于37℃条件下孵育30min,结束后加入170μL Hcl(1mol/L)终止反应。反应液经0.45μm滤膜后利用高效液相测定溶液里马尿酸的含量。液相条件为：C18柱(4.6×250mm,5um)，流动相：水：乙腈＝75：25，进样量：20μL，检测波长：228nm。根据下列公式计算样品的ACE抑制率:
ACE抑制率(％)＝(m0-m1)/m0×100
式中：m0为空白组中马尿酸含量，m1为样品组中马尿酸含量。
ACE的IC50值为50％的ACE酶活性抑制对应的肽浓度。
将实施例1的步骤5替换为：步骤5，降血压山羊乳酪蛋白肽胃肠稳定性实验，且二肽基肽酶(DPP-IV酶)抑制活性替换为血管紧张素转换酶(ACE酶)抑制活性的测定。
表2
由表2知，木瓜蛋白酶+蛋白酶K酶解产物的DPP-IV酶抑制活性＞蛋白酶K酶解产物的ACE酶抑制活性＞胰蛋白酶酶解产物的ACE酶抑制活性＞木瓜蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性＞菠萝蛋白酶酶解产物的ACE酶抑制活性。这与利用生物信息学做虚拟酶切预测的山羊乳酪蛋白对ACE酶抑制率一致，由此可说明利用生物信息学筛选酶种类的方法有效可靠。
本实施例的实施方式，选择蛋白酶K酶解后蛋白肽进行体外模拟消化稳定性试验，结果表明经体外模拟胃肠消化后，山羊乳酪蛋白肽的ACE酶抑制率为78.34±0.12％。经体外模拟胃肠消化前后ACE酶的IC50值(ACE酶的IC50值为50％的ACE酶活性抑制对应的肽浓度)从0.42mg/mL升至0.45mg/mL。
本实施例的实施方式，选择木瓜蛋白酶+蛋白酶K酶解后蛋白肽进行体外模拟消化稳定性试验，结果表明经体外模拟胃肠消化后，山羊乳酪蛋白肽的ACE酶抑制率为84.36±0.15％。经体外模拟胃肠消化前后ACE酶的IC50值(ACE酶的IC50值为50％的ACE酶活性抑制对应的肽浓度)从0.36mg/mL升至0.40mg/mL。
实施例3
一种降血糖和降血压活性的山羊乳酪蛋白肽的制备方法，具体包括以下步骤：
由实施例1～2的步骤1筛选得到抑制DPP-IV酶、ACE酶较高的酶种类之一为木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶。
步骤1，预处理：首先对于5000r/min脱脂40min、之后用0.6％的凝乳酶沉淀酪蛋白、收集沉淀物于8000r/min下离心20min，收集的沉淀物冻干后即为山羊乳酪蛋白。
步骤2，山羊乳酪蛋白粉加入适量蒸馏水制备得到质量浓度为2mg/mL的样品，调pH7.0后，添加9000U/g的木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶(质量比为1～2：1～2)，在50℃条件下酶解时间5h,反应结束后，于8000r/min离心15min，收集沉淀物冻干。利用凯式定氮法测定冻干物的蛋白含量以获得蛋白回收率，蛋白回收率即为酶解物中的蛋白含量与酶解前原料中的总蛋白含量之比。
步骤3，取上述酶解物加入蒸馏水溶解，然后用截留分子量为1000Da的超滤膜进行分离纯化，将超滤获得的1000Da以下的组分冷冻干燥即为所需的山羊乳酪蛋白粉，其蛋白肽粉与酶解物的比重即为分子量＜1000Da的肽的百分比，其蛋白肽粉与酶解物的比重即为分子量＜1000Da的肽的百分比。
步骤4，山羊乳酪蛋白DPP-IV酶和ACE酶抑制活性的测定同实施例1，测试结果如表3所示。
表3
根据表3可知，不同质量比的木瓜蛋白酶和蛋白酶K得到的酶解物的DPP-IV酶和ACE酶抑制活性不同，这说明复合酶之间的质量比对山羊奶酪蛋白的DPP-IV和ACE抑制活性起到了较为重要的作用；其中当木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比为1.5：1.0时，山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率最强，当木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比为1.0：2.0时，山羊乳酪蛋白肽ACE抑制率最强。综合DPP-IV酶和ACE酶的抑制率、蛋白回收率考虑，优选木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比为1.5：1.0的山羊乳酪蛋白肽。
实施例4
一种高降血糖和高降血压活性的山羊乳酪蛋白肽的制备方法，参照实施例3，并在实施例3的基础上，限定木瓜蛋白酶+蛋白酶K(质量比为1.5:1)，调整酶解时间0.5-5h。
测试结果如表4所示。
表4
由表4数据知，随着酶解时间的延长，山羊乳酪蛋白肽的DPP-IV和ACE酶抑制率逐渐增加，同时，分子量＜1000Da的肽的占比也随之升高，在酶解时间为4和5h时，山羊乳酪蛋白肽DPP-IV和ACE酶抑制率增加缓慢，从节能的角度考虑，优选蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白的时间为4h。
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
Claims (10)
1.一种具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基于生物信息学预测不同蛋白酶处理山羊奶酪蛋白得到山羊奶酪蛋白肽的降血糖、降血压活性，并利用生物信息学计算机虚拟筛选出较高降血糖、降血压活性的多种酶；
(2)将计算机模拟筛选出的多种酶中的任一种或者组合分别应用于酶解山羊奶酪蛋白，得到对应的酶解产物；
(3)试验测试并比较不同酶解产物的降血糖、降血压活性，验证计算机虚拟筛选的准确性，并得到更高降血糖、降血压活性的酶的种类，由更高降血糖、降血压活性的酶酶解处理得到的酶解产物即为具有更高降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：
从蛋白质三维结构数据库RCSB PDB(https://www1.rcsb.org/)中下载山羊乳酪蛋白的各种蛋白类型的一级结构；利用BIOPEP数据库(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/biopep/start_biopep.php)中的“ENZYME(S)ACTION”功能对不同类型的山羊乳酪蛋白进行的虚拟蛋白酶切割，并根据蛋白酶切割后的具有DPP-IV酶、ACE酶的抑制活性的肽片段数量a和氨基酸链长度N的比率预测蛋白酶切割后的肽序列的降血糖、降血压活性，筛选出较高降血糖、降血压活性的多种酶。
3.根据权利要求2所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)筛选出的较高降血糖、降血压活性的多种酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶。
4.根据权利要求1所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的山羊奶酪蛋白由山羊奶预处理得到。
5.根据权利要求4所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，山羊奶预处理具体包括：将山羊奶脱脂、凝乳酶沉淀酪蛋白、收集沉淀物步骤，其中收集的沉淀物即为山羊奶酪蛋白。
6.根据权利要求1所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解山羊乳酪蛋白的具体操作为：将山羊奶酪蛋白加入蒸馏水，配制成质量浓度为2-10％的反应底物，之后加入所述步骤(1)筛选出的多种酶中的任一种或者组合，使蛋白酶与底物的最终比例E/S为3000-15000U/g，按照不同酶种类的最佳酶解条件进行反应，酶解过程中保持恒定的pH值，反应结束后灭酶，离心收集沉淀冻干，粉碎即为酶解产物山羊乳酪蛋白肽。
7.根据权利要求1所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)之后还包括山羊乳酪蛋白肽的纯化步骤：将冷冻干燥后的山羊乳酪蛋白肽用蒸馏水溶解，然后用超滤膜进行分离纯化，取滤液冷冻干燥即为纯化后的山羊乳酪蛋白肽。
8.根据权利要求1所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)得到的更高降血糖、降血压活性的酶为木瓜蛋白酶+蛋白酶K组合酶，其中，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1～2:1～2，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率不低于86％，山羊乳酪蛋白肽ACE抑制率不低于82％，蛋白回收率不低于85％。
9.根据权利要求8所述的具有降血糖、降血压活性的山羊奶酪蛋白肽的制备方法，其特征在于，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1.5：1.0，得到的山羊乳酪蛋白肽DPP-IV抑制率为91％；
或，木瓜蛋白酶：蛋白酶K的复合质量比为1.0：2.0，得到的山羊乳酪蛋白肽ACE抑制率为86％。
10.权利要求1-9中任一项所述方法制备的山羊乳酪蛋白肽在辅助治疗高血压和/或糖尿病的保健食品和药品的制备中的应用。
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