ES2289825T3 - Nuevo procedimiento para la identificacion de un compuesto que modula la interaccion entre un ligando de tnf y su receptor en celulas b. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto que modula la interacción entre una proteína ligando de TNF que comprende el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 1 y su receptor expresado en células B, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de poner en contacto dicha proteína y dicho receptor en presencia de un compuesto de ensayo y controlar la modulación de la interacción.

Description

Nuevo procedimiento para la identificación de un compuesto que modula la interacción entre un ligando de TNF y su receptor en células B.

La presente invención pone a disposición una nueva proteína de la superfamilia de los ligandos de TNF, los nucleótidos que la codifican, vectores y células hospedadoras que la contienen y se refiere a procedimientos relacionados de selección de moduladores de la interacción entre dicha proteína y su receptor, estando dichos moduladores destinados para su uso en el tratamiento de diversos trastornos incluyendo, pero sin restricciones, cáncer, inflamación, infección y enfermedades autoinmunes. También se pone a disposición el uso directo de dicho ligando en terapia, por ejemplo, frente a enfermedades virales o como un posible adyuvante para vacunas.

Actualmente se han clonado y publicado otros quince miembros de la familia de ligandos de TNF y se ha demostrado que la mayoría se une a receptores de la superficie celular de la familia de receptores de TNF. La interacción entre un ligando de TNF y su receptor es la señal clave para iniciar una cadena de acontecimientos que conducen a una gama de respuestas tan diversa como la proliferación de células T, apoptosis e inducción de producción de citocinas. Algunas actividades, tales como la inducción de proliferación de células T, son comunes para muchos miembros de la familia, mientras que otras son compartidas sólo por unos pocos y otras son exclusivas. La interacción entre estos ligandos y sus receptores proporciona una diana atractiva para el desarrollo de nuevas terapias.

El documento WO98/18921 describe un miembro de la familia de proteínas del TNF.

La presente invención pone a disposición una proteína aislada que comprende i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 1. La invención además pone a disposición una proteína aislada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en la figura 2. La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en la figura 2 puede obtenerse a partir de humanos y es una proteína de membrana de tipo II con un único dominio transmembrana próximo al extremo N-terminal, que contiene dos posibles sitios de N glucosilación y un sitio de escisión para proteasas entre los aminoácidos arginina 133 y alanina 134. El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la figura 1 es soluble y forma parte de la región extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionado en la figura 2. Preferiblemente la proteína puede obtenerse a partir de mamíferos, más preferiblemente a partir de ratones o humanos, y de la forma más preferible, a partir de humanos.

La presente invención además pone a disposición una proteína que comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 2 desde el aminoácido 134 en adelante, o la secuencia que se proporciona en la figura 6 desde el aminoácido 127 en adelante.

La presente invención además pone a disposición una proteína que comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 2 desde el aminoácido 122 en adelante.

La presente invención además pone a disposición una proteína que comprende un polipéptido que tiene la secuencia que se proporciona en la figura 6 desde el aminoácido 115 en adelante.

La presente invención además pone a disposición una proteína aislada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en la figura 5. Además, la invención pone a disposición una proteína aislada que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en la figura 6. La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en la figura 6 puede aislarse a partir de ratón y es una proteína de membrana de tipo II con un único dominio transmembrana próximo al extremo N-terminal, esta proteína contiene un posible sitio de N glucosilación y un sitio de escisión para proteasas entre los aminoácidos arginina 126 y alanina 127. El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la figura 5 es soluble y forma parte de la región extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la
figura 6.

La presente invención proporciona un procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto que modula la interacción entre una proteína ligando de TNF que comprende el polipéptido de la ID SEC Nº 1 y su receptor expresado en células B, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto dicha proteína y dicho receptor en presencia de un compuesto de ensayo y controlar la modulación de la interacción.

Las proteínas de la invención que pueden aislarse a partir de humanos y las proteínas de la invención que pueden aislarse a partir de ratones tienen gran homología, mostrando una identidad de aminoácidos del 67% sobre su secuencia completa. En la región C-terminal implicada en la unión al receptor, la identidad de aminoácidos es mucho mayor (87%). Una diferencia significativa entre las proteínas de la invención que pueden aislarse a partir de humanos o de ratones es la presencia de un exón adicional en la secuencia de ratón que codifica 31 aminoácidos extras, lo que reduce la homología total entre las dos proteínas.

Los fragmentos incluyen porciones de la proteína que conservan una identidad suficiente con la proteína original como para ser eficaz, por ejemplo, en una selección.

Los derivados incluyen formas sustitutivas de la secuencia de la proteína que pueden presentar deleciones, adiciones o sustituciones de uno o más aminoácidos. Un experto en la materia entenderá que pueden hacerse determinadas sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, o de hecho pueden aparecer de forma natural, sin alterar sustancialmente la función de la proteína.

Los análogos incluyen, pero sin limitaciones, proteínas precursoras que pueden activarse mediante escisión de la proteína precursora para producir una proteína madura activa o una fusión con una secuencia líder o secretora que ayude a su purificación.

La proteína puede ser una proteína recombinante, una proteína natural o una proteína sintética.

Las proteínas pueden estar presentes en todas las realizaciones en forma trimérica y estos trímeros constituyen una realización de la invención como se define en la reivindicación 1. Típicamente, las proteínas se unirán a su receptor como un trímero, permitiendo así que dos o tres moléculas de receptor estén próximas. Un trímero puede ser un heterotrímero en el que se presentan más de un tipo de subunidad o un homotrímero en el que todas las subunidades son idénticas.

La presente invención también pone a disposición anticuerpos específicos de la proteína de la invención. El término anticuerpo según se usa en este documento incluye todas las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que contienen sitios de reconocimiento para determinantes antigénicos de proteínas de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, puede ser moléculas de anticuerpo intactas o fragmentos que contienen la región de unión activa del anticuerpo, por ejemplo, Fab o F(ab)_{2}. La presente invención también pone a disposición anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, y fusiones con moléculas que no son inmunoglobulinas. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de estos anticuerpos y fragmentos.

Las proteínas o células que las expresan pueden usarse como un inmunógeno para producir anticuerpos frente a ellas. Los anticuerpos generados frente a la proteína pueden obtenerse mediante inyección directa del polipéptido a un animal, preferiblemente, no humano. El anticuerpo obtenido de este modo se unirá a continuación a la proteína misma. De este modo, incluso puede usarse un fragmento de la proteína de la invención para generar anticuerpos que se unan a la proteína nativa completa.

Los anticuerpos pueden usarse para localizar la proteína de la invención en el tejido que expresa esta proteína. También son útiles, por ejemplo, para la purificación de una proteína de la invención y, por consiguiente, se pone a disposición un procedimiento de purificación de una proteína de la invención, comprendiendo dicho procedimiento el uso de un anticuerpo de la presente invención. Los anticuerpos también pueden usarse como agentes terapéuticos por sí mismo.

Un aspecto adicional de la invención pone a disposición un polinucleótido aislado que codifica una proteína de la invención. También la invención pone a disposición nucleótidos complementarios o cadenas complementarias. Preferiblemente, el nucleótido codifica una proteína que puede aislarse a partir de un ratón o de un humano. Más preferiblemente, el polinucleótido aislado comprende la porción del polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 3, que codifica el polipéptido mostrado en la figura 1 o una cadena complementaria. La presente invención además pone a disposición un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 4, que codifica el polipéptido de la figura 2.

La secuencia de nucleótidos puede aislarse a partir de una célula (preferiblemente una célula humana), mediante selección con una sonda derivada de la proteína, o mediante otras metodologías conocidas en la técnica, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por ejemplo, sobre ADN genómico con cebadores oligonucleotídicos apropiados derivados o diseñados basándose en la proteína de la invención. Puede generarse una biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos usando ADN de ratón o humano con el propósito de la selección.

Las secuencias de nucleótidos pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, por ejemplo ADNc, ADN genómico y ADN sintético. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la invención es ADNc. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena sencilla y, si es de cadena sencilla, puede ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora (complementaria). La secuencia codificadora que codifica la proteína de la invención puede ser idéntica a una de las secuencias codificadoras mostradas en las figuras, o puede ser una secuencia codificadora diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma proteína que las secuencias mostradas en éstas.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína puede incluir: una secuencia que codifica la proteína; una secuencia que codifica la proteína y una secuencia codificadora adicional, como una secuencia líder o secretora, o una secuencia proproteína; una secuencia que codifica la proteína (y, opcionalmente, una secuencia codificadora adicional) y secuencias no codificadoras, como intrones o secuencias no codificadoras 5' y/o 3' de la secuencia codificadora de la proteína de longitud completa.

La invención también proporciona variantes, análogos, derivados y fragmentos de nucleótidos que codifican una proteína. Se incluyen nucleótidos que preferiblemente tienen al menos el 65% de identidad a lo largo de su longitud completa con el nucleótido que tiene la secuencia de la figura 3. Son más preferidas aquellas secuencias que tienen al menos el 75% de identidad a lo largo de su longitud completa con el nucleótido que tiene la secuencia de la figura 3. Son incluso más preferidos los polinucleótidos que muestran al menos el 90%, por ejemplo el 95%, 97%, 98% o 99% de identidad a lo largo de su longitud completa con el nucleótido que tiene la secuencia de la figura 3.

Las secuencias de nucleótidos también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en fase con una o más secuencias marcadoras que permiten la purificación de la proteína de la presente invención, como un epítopo FLAG; una secuencia myc o una señal secretora.

Las secuencias de nucleótidos pueden emplearse para producir la proteína mediante técnicas recombinantes. Por tanto, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede incluirse en uno cualquiera de los diversos vehículos de expresión o vehículos de clonación, en particular vectores o plásmidos para la expresión de una proteína. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Ejemplos de estos vectores adecuados incluyen derivados de plásmidos bacterianos; ADN de fago, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos; ADN de fago y ADN viral. Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que pueda replicarse y ser viable en el hospedador.

Más en particular, la presente invención también pone a disposición un vector que comprende una o más de las secuencias de nucleótidos que se describen anteriormente. Los vectores son, por ejemplo, un vector de expresión, tales como un plásmido o vector viral dentro del cual se ha insertado un polinucleótido aislado, en orientación sentido o complementaria. En un aspecto preferido de esta realización, el vector además comprende una o más secuencias reguladores para dirigir la síntesis de ARNm, que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Los promotores adecuados incluyen: promotores de CMV, LTR o SV40 y otros promotores conocidos porque controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector puede contener un potenciador o un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción.

Los expertos en la materia conocerán numerosos vectores y promotores o potenciadores adecuados, pero puede utilizarse cualquier plásmido o vector, promotor o potenciador siempre que puedan replicarse y ser funcionales en el hospedador.

Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con hospedadores procariotas y eucariotas incluyen vectores de expresión de mamíferos, vectores de expresión de insectos, vectores de expresión de levaduras, vectores de expresión de bacterias y vectores de expresión de virus, y se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY., (1989). Los vectores preferidos son pFLAG-CMV-1 o pcDNA3.

El vector también puede incluir secuencias apropiadas para la selección y/o amplificación de la expresión. Por esto, el vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos que puedan seleccionarse o amplificarse. Estos marcadores también son bien conocidos por los expertos en la materia.

En una realización adicional, la presente invención pone a disposición células hospedadores que comprenden un vector y son capaces de expresar una secuencia de nucleótidos descrita en este documento. Las células hospedadores pueden ser, por ejemplo, una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli. Los hospedadores eucariotas adecuados incluyen células HEK293T y células HeLa.

También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir estas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN descritas anteriormente.

Pueden emplearse procedimientos rutinarios para purificar la proteína a partir de cultivos celulares recombinantes. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Las secuencias de proteínas y nucleótidos se ponen a disposición en su forma aislada. El término "aislado" pretende dar a entender que el material no está en su estado nativo. De este modo, la secuencia de nucleótidos o la proteína que aparece de forma natural, presente en un animal vivo está en su estado nativo y no está aislada, pero la misma secuencia de nucleótidos o proteína, separada de parte o todos los materiales con los que se encuentra en el sistema natural, está aislada. De forma similar, una proteína que ha sido producida mediante procedimientos sintéticos, por ejemplo, mediante procedimientos recombinantes, está "aislada". Esta secuencia de nucleótidos podría ser parte de un vector. Esta secuencia de nucleótidos o proteína podría ser parte de una composición y seguir estando aislada en este vector o composición, ya que no es parte de su entorno natural. Preferiblemente, las proteínas y secuencias de nucleótidos también se proporcionan en su forma purificada, y preferiblemente están purificadas al menos al 50% de pureza, más preferiblemente a aproximadamente al 75% de pureza, de la forma más preferible al 90% de pureza o más, tal como el 95% o el 98% pura.

Un aspecto de la presente invención es el uso de las proteínas en procedimientos de selección. Estos procedimientos identifican compuestos que actúan como moduladores de la interacción entre las proteínas y sus receptores. En términos generales, estas selecciones comprenderán poner en contacto una proteína, preferiblemente en forma trimérica, y su receptor en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, y medir el aumento o disminución del nivel de unión, o el aumento o disminución de la respuesta, por ejemplo, la activación de NF-\kappaB o la activación de CD40, cuando el compuesto de ensayo esté presente. Las proteínas descritas en este documento pueden utilizarse en selecciones de alto rendimiento permitiendo, de este modo, el estudio de gran cantidad de compuestos. Los procedimientos de selección de la invención generalmente son bien conocidos por los expertos en la materia. La presente invención también incluye dentro de su alcance aquellos compuestos que, mediante los procedimientos de selección de la invención se identifica que poseen actividad útil.

La presente invención además proporciona compuestos que son moduladores de la interacción entre una proteína de la invención y su receptor para su uso en terapia, por ejemplo, en inmunoterapia. Los compuestos se proporcionan para su uso en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, inflamación y otras enfermedades asociadas con la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, por ejemplo, artritis reumatoide, inflamación neuronal, asma, en el tratamiento de cánceres, en el tratamiento de infecciones, tales como choque septicémico y en el tratamiento de la aterosclerosis. Los compuestos pueden ser agonistas o antagonistas del receptor al cual se unen las proteínas de la invención pero, preferiblemente, son antagonistas. Los compuestos incluyen, por ejemplo, aptámeros, polipéptidos y moléculas pequeñas.

La invención además proporciona el uso de los compuestos que se han identificado mediante las técnicas de selección de la invención, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento o profilaxis de trastornos que responde a la modulación de la interacción entre la proteína de la invención y su receptor.

Adicionalmente, la presente invención pone a disposición un procedimiento de tratamiento de un trastorno que responde a la modulación de la interacción entre la proteína de la invención y su receptor, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un compuesto que puede identificarse mediante las técnicas de selección de la invención, o una cantidad eficaz de la proteína de la invención. La presente invención además pone a disposición la proteína de la invención para su uso en terapia, por ejemplo, para su uso en inmunoterapia, especialmente durante infecciones virales, como vacuna o como adyuvante de una vacuna.

La presente invención también pone a disposición el uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en inmunoterapia, por ejemplo, durante infecciones virales o como adyuvante de una vacuna.

La presente invención adicionalmente pone a disposición un procedimiento de tratamiento de un trastorno que responde a un aumento de la cantidad de la proteína de la invención, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de la proteína de la invención.

La invención también pone a disposición una secuencia de nucleótidos según se define en este documento, para su uso en terapia génica o como vacuna, por ejemplo, para aumentar la producción de la proteína de la invención en trastornos que responden a un aumento del nivel de la proteína de la secuencia de la figura 1 o la figura 2. Puede proporcionarse a un paciente dicho nucleótido como polinucleótido desnudo en forma de vector de expresión, como un plásmido, o con un vector viral que comprende dicho nucleótido o una célula que comprende dicho nucleótido o vector.

Las cadenas complementarias o antisentido de las secuencias nucleotídicas de la invención también pueden usarse en terapia génica. Por ejemplo, podría usarse una secuencia de ADNc o fragmentos de la misma en estrategias de terapia génica para regular por disminución la expresión de la proteína. La tecnología complementaria puede usarse para controlar la expresión génica a través de la formación de una triple hélice de ADN o ARN antisentido, estando ambos procedimientos basados en la unión de una secuencia de nucleótidos a ADN o ARN.

Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido desnudo o el vector en un paciente incluyen la aplicación tópica con un vehículo apropiado. El polinucleótido desnudo o el vector pueden presentarse junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una técnica implica el bombardeo de partículas (que también se conoce como tecnología de "pistola de genes" y se describe en la patente de EE.UU. Nº 5371015). En ésta, se recubren partículas inertes (tales como perlas de oro) con un ácido nucleico y se aceleran a una velocidad suficiente como para permitir que penetren la superficie del individuo receptor (por ejemplo, la piel), mediante la descarga por ejemplo a alta presión a partir de un dispositivo de proyección. Otros procedimientos para administrar directamente el ácido nucleico a un receptor incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsembrado que se describe en el documento US-5.697.901.

Las moléculas de ácido nucleico también pueden administrarse mediante vectores de administración especializada útiles en terapia génica. Las terapias génicas se describen por ejemplo en Verme y col., Nature 1997, 389:239-242. Pueden utilizarse tanto sistemas virales como no virales. Los sistemas basados en virus incluyen sistemas retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales asociados a adenovirus, basados en herpes virus y en el virus de la variolovacuna. Los sistemas no basados en virus incluyen la administración directa de ácidos nucleicos y sistemas basados en liposomas.

Una secuencia de ácido nucleico puede administrarse mediante la transformación de células. Estas células incluyen células recogidas de un sujeto. El polinucleótido desnudo o el vector pueden introducirse en estas células in vitro y las células transformadas pueden devolverse después al sujeto. El polinucleótido puede integrarse en el ácido nucleico ya presente en la célula mediante acontecimientos de recombinación homóloga. Una célula transformada puede, si se desea, cultivarse in vitro y pueden usarse en la presente invención una o más de las células resultantes. Las células pueden proporcionarse en un lugar apropiado a un paciente mediante técnicas quirúrgicas o microquirúrgicas conocidas (por ejemplo, mediante injerto, microinyección, etc.).

La invención además pone a disposición composiciones que comprenden el polipéptido, polinucleótido, vector o célula transfectada de la invención además de aquellos que pueden administrarse mediante una pistola de genes. Por tanto, los polipéptidos pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tal como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Estas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos pueden incluir, pero sin limitaciones, una solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

La invención además pone a disposición envases y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Adjunto a este recipiente(s) puede haber un aviso en la forma establecida por una agencia gubernamental para la regulación de la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta de los productos para la administración a humanos.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención, tales como aquellos que pueden identificarse mediante los procedimientos de selección descritos anteriormente, solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier forma conveniente y eficaz, que incluyen, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

Generalmente, las composiciones farmacéuticas se administran a una cantidad eficaz para el tratamiento o profilaxis de una indicación o indicaciones específicas. En general, las composiciones se administran a una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal. En la mayoría de los casos, se administrará a una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. Preferiblemente, en la mayoría de los casos, la dosis es de aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, diariamente. Se apreciará que la dosis óptima se determinará mediante procedimientos convencionales para cada modalidad de tratamiento e indicación, teniendo en cuenta la indicación, su gravedad, vía de administración, afecciones que la compliquen y similares.

En terapia o como profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Alternativamente, la composición puede formularse para su aplicación tópica, por ejemplo, en forma de pomadas, cremas, lociones, pomadas oculares, colirios, gotas para los oídos, colutorios, vendajes y suturas impregnadas y aerosoles, y puede contener aditivos convencionales apropiados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes que ayudan a la penetración del fármaco y emolientes en pomadas y cremas. Estas formulaciones tópicas también pueden contener vehículos convencionales compatibles, por ejemplo, bases para cremas o pomadas, y etanol o alcohol oléico para lociones. Estos vehículos pueden estar constituidos de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 98% en peso de la formulación; más normalmente estarán constituidos de hasta aproximadamente el 80% en peso de la formulación.

Para la administración a mamíferos y, especialmente a humanos, se espera que el nivel de dosis diaria del agente activo sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico determinará en cualquier caso la dosis real que sea la más adecuada para un individuo y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo en particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplos de un caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales que merezcan intervalos de dosificación superiores o inferiores, y estos están dentro del alcance de la invención.

La presente invención además pone a disposición un procedimiento para producir una proteína de la invención, comprendiendo este procedimiento introducir en una línea celular apropiada un vector que comprenda un polinucleótido como se define en este documento, en condiciones adecuadas para obtener la expresión de la proteína.

La presente invención además pone a disposición un procedimiento para producir trímeros, comprendiendo este procedimiento introducir en una línea celular apropiada un vector que comprende un polinucleótido según se define en este documento, en condiciones adecuadas para obtener la expresión de la proteína y permitiendo que la proteína producida forme trímeros.

Como se muestra en el ejemplo 6, la proteína de la invención se une a líneas celulares B, tales como la línea celular de linfoma de Burkitt Raji, y las líneas celulares de linfoma B ROMI 8866 y PRM18826. Como se muestra en el ejemplo 7, en preparaciones de sangre completa, la proteína de la invención se une sólo a las células B, no a las células T. Estos ejemplos confirman la presencia del receptor para la proteína de la invención en células B, y apoya la función de la proteína de la invención en la regulación del sistema inmune y en enfermedades como las descritas anteriormente. Esto también está apoyado por el hecho de que la proteína de la invención se expresa mucho en las células y tejidos del sistema inmune, como se muestra en el ejemplo 5.

Uno de los primeros acontecimientos inducidos por la mayoría de los miembros de la familia de ligandos de TNF es la activación del NF-\kappaB. Mukhopadhyay y col. (Journal of Biological Chemistry Vol. 274 número 23, 4 de junio de 1999, pág. 15.978-15.981) han demostrado que la proteína de la invención puede activar el NF-\kappaB de manera dependiente de la dosis y del tiempo. El intervalo de dosis utilizado era de 1 pM a 1.000 pM. El tratamiento de las células con una concentración tan pequeña como 1 pM de la proteína de la invención producía un aumento de la activación de NF-\kappaB comparable al de las células no tratadas. La activación de este importante factor de activación sugiere que la proteína de la invención puede estar implicada en la activación de las rutas inflamatorias. Las moléculas que modulan la interacción de la proteína de la invención con su receptor será, por tanto, capaces de modular la activación de NF-\kappaB y, por eso, serán útiles en cualquier enfermedad que responda a la modulación del nivel de actividad del NF-\kappaB, por ejemplo, enfermedades del sistema inmune, como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide, inflamación neuronal y asma, y las enfermedades proliferativas, como el cáncer. Mukhophadhyay y col. demuestran además que la activación del NF-\kappaB en el mismo sistema puede inhibirse mediante anticuerpos específicas de la proteína de la invención. Según Mukhophadhyay y col., la proteína de la invención se incubó con los anticuerpos específicos antes de ser utilizada para tratar las células. Al contrario que en el experimento previo, se observó una reducción de la activación de NF-\kappaB.

Se postula que la presencia del anticuerpo afecta a la unión de la proteína de la invención a su receptor, previniendo así la generación de una señal y, por consiguiente, reduciendo la activación del NF-\kappaB. Estos resultados indican que en una selección pueden identificarse otros compuestos, por ejemplo, moléculas pequeñas, que modulen la interacción entre la proteína de la invención y su receptor, y pueden usarse para modular la activación de NF-\kappaB y otros efectos posteriores.

En el ejemplo 9, los experimentos de localización cromosómica muestran que el gen que codifica la proteína de la invención se localiza en la región q33 del cromosoma humano 13. No se ha localizado ningún otro miembro de la familia de ligandos de TNF en esta región. Las anomalías en este locus se han caracterizado como el segundo defecto más frecuente en los linfomas de Burkitt (Berger y col., Genes Chromosomes Cancer. 1:115-118). También, como se muestra en el ejemplo 6, la proteína de la invención se une fuertemente a la línea celular de linfoma de Burkitt Raji, y Schneider y col. (según se hace referencia anteriormente) han demostrado que la forma soluble de la proteína de la invención se une fuertemente a otras líneas celulares de linfoma de Burkitt, tales como BJAB, Namalawa, Ramos y JIYOYE.

Mukhophadhyay y col. (según se hace referencia anteriormente) han demostrado que la proteína de la invención es capaz de inhibir el crecimiento de líneas celulares tumorales humanas. La activación del NF-\kappaB es una respuesta celular temprana que generalmente va seguida de efectos citotóxicos sobre las células tumorales. Tratando diversas líneas celulares con la proteína de la invención y examinando la viabilidad de las mismas, los autores fueron capaces de demostrar que se observa una disminución dependiente de dosis de la viabilidad de las células en presencia de la proteína de la invención. Esto se demostró en una línea celular de linfoma histocítico humano, una línea celular de cáncer de próstata, una línea celular de cáncer de colon, una línea celular de carcinoma de cuello de útero y una línea celular de carcinoma de mama.

Estos hechos sugieren que la proteína de la invención puede tener una función importante en la regulación del desarrollo tumoral y que las moléculas que pueden modular la interacción de la proteína de la invención con su receptor, pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer. Además, la proteína de la invención en sí, en sus formas unida a la membrana o soluble, puede ser útil para el tratamiento del cáncer.

Schneider y col (Journal of Experimental Medicine, volumen 189, número 11, 7 de junio de 1999, pág. 1.747-1.756) han demostrado que el crecimiento de las células B puede coestimularse mediante la proteína de longitud completa de la invención (por ejemplo, la forma unida a la membrana) así como mediante la forma soluble de la proteína de la invención. Por tanto, ambas formas pueden utilizarse en terapia, o para constituir la base de una selección de moléculas pequeñas que pueden modular la interacción entre la proteína de la invención y su receptor.

Breve descripción de las figuras

La figura muestra la ID de secuencia Nº 1: la secuencia de aminoácidos de la forma humana soluble de la proteína de la invención. Los sitios de unión al receptor se muestran en negrita y los posibles sitios de N glucosilación se marcan con un punto.

La figura 2 muestra la ID de secuencia Nº 2: la secuencia de aminoácidos de la forma humana unida a la membrana de la proteína de la invención, que incluye la forma soluble de la ID SEC Nº 1. Las anotaciones son similares a las de la figura 1. La secuencia transmembrana aparece subrayada.

La figura 3 muestra la ID de secuencia Nº 3: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 1, alineada con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 1. Se enmarcan las regiones de unión al receptor y se marcan con un punto los posibles sitios de N-glucosilación.

La figura 4 muestra la ID de secuencia Nº 4: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, alineada con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. Las anotaciones son similares a las de la figura 3. La secuencia transmembrana aparece subrayada.

La figura 5 muestra la ID de secuencia Nº 5: la secuencia de aminoácidos de la forma soluble de ratón de la proteína de la invención. Se marca con un punto el sitio de N glucosilación.

La figura 6 muestra la ID de secuencia Nº 6: la secuencia de aminoácidos de la forma de ratón unida a la membrana de la proteína de la invención. Las anotaciones son similares a las de la figura 5. La región transmembrana aparece subrayada.

La figura 7 muestra la ID de secuencia Nº 7: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 5, alineada con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 5. Las anotaciones son similares a las de la figura 5.

La figura 8 muestra la ID de secuencia Nº 8: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 6, alineada con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 6. Las anotaciones son similares a las de la figura 6.

La figura 9 muestra un alineamiento entre las formas de ratón y humana de la forma de longitud completa de la proteína de la invención (ID SEC Nº 2 y ID SEC Nº 6)

La figura 10 muestra el análisis de la inducción de CD40 en presencia (sombreado) o ausencia (sin sombrear) de la forma humana soluble recombinante de la proteína de la invención (A) o de IL-4 (B).

La figura 11 muestra el análisis de la transferencia de ARN total de la expresión específica de tejido de la proteína de la invención en tejidos normales de ratón (A) y líneas celulares tumorales humanas (B). (B) tejidos.

La figura 12 muestra el análisis de la transferencia de ARN total de la expresión específica de tejido de la proteína de la invención en tejidos relacionados con el sistema inmune (A) y líneas celulares tumorales humanas (B).

La figura 13 muestra los datos de unión a la célula de FLAG-sD7 (como se define a continuación en el ejemplo 3). El área sombreada indica la unión a la línea celular de linfoma de células B RMPI 8866. No se observa unión en ausencia de FLAG-sD7 (línea de puntos).

La figura 14 muestra la unión de FLAG-sD7 a células B CD19^{+} (A) y a células T CD3^{+} (B) en sangre completa, lo que demuestra la especificidad de unión sólo a células B.

La figura 15 muestra la filtración en gel de FLAG-sD7 recombinante y el análisis en PAGE-SDS posterior de las fracciones que mostraron un contenido de proteína. Estos resultados indican que la forma soluble de la proteína de la invención es capaz de trimerizarse.

En los ejemplos:

la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1, se denominará ligando D7 soluble y la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 se denominada ligando D7.

Ejemplo 1 Uso del ligando D7 soluble en una selección para identificar compuestos que modulan la interacción entre el ligando D7 y su receptor

Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente.

Placas de alta avidez RIA/EIA de Costar se recubrieron con IgG de cabra anti-humano (Sigma 13382) a 2 \mug/ml en PBS durante toda la noche. El anticuerpo de recubrimiento se elimina y las placas se bloquean durante al menos 2 horas en PBS/BSA al 2% (p/v). A continuación, las placas se lavan tres veces con PBS/Tween 20 al 0,1% (v/v).

Se añaden 100 \mul de receptor-Fc (1 \mug/ml) en PBS/BSA al 1% (p/v/)/Tween 20 al 0,1% (v/v) y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/Tween20 al 0,1% (v/v).

Se añaden diluciones de Biotina-ligando D7 soluble en PBS/BSA al 1%/Tween 20 al 0,1%, y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/Tween 20 al 0,1% (v/v).

Se añade fosfatasa alcalina unida a estreptavidina (1:1000) (Amersham PRN1234) y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan cinco veces con PBS/Tween 20 al 0,1% (v/v).

La unión se detecta usando soluciones amplificadoras de Life Technologies (19589-019).

Ejemplo 2 Una selección basada en células para identificar compuestos que modulan la interacción entre el ligando D7 soluble y su receptor

El protocolo general para su uso en una selección basada en células para identificar compuestos que modulan la interacción entre el ligando D7 soluble y su receptor es el siguiente:

Una línea de células B que se sabe se une y responde al ligando D7, se trata con el ligando D7 humano soluble recombinante del ejemplo (por ejemplo, FLAG-shD7 como se explica a continuación) durante un tiempo definido.

Las células se recogen y se comprueba la respuesta (posiblemente la respuesta puede ser proliferación, apoptosis, activación del NF-\kappaB o producción de citocinas). La prueba permite determinar si la adición de compuestos inhibe la inducción de una respuesta en las células diana.

Un ejemplo específico es el siguiente:

El ligando D7 soluble regula la expresión de CD40 por incremento

La línea celular de linfoma de Burkitt L3055 se cultivó sobre una capa nodriza de fibroblastos fetales humanos (HFF515) en medio L3 (RPMI 1640 + suero Supreme al 10% + antibióticos). Las células HEK293T se hicieron crecer en DMEM suplementado con suero fetal de ternera al 10% y antibióticos. Las células L3055 se trataron con medio de control (cuatro partes de medio L3 más una parte del sobrenadante de las células HEK 293T) o con medio sD7 (cuatro partes de medio L3 más una parte del sobrenadante de las células HEK293T recogido 24 horas después de la transfección transitoria con sD7) o con IL-4 (medio de control más 200 U/ml de IL-4 humana recombinante) y se incubaron a 37ºC durante 72 horas. Las células se recogieron y lavaron una vez con tampón de unión, tiñéndose a continuación con anti CD40 de ratón anti-humano conjugado con FITC (Transduction Laboratories) a temperatura ambiente. Las células se lavaron después dos veces en tampón de unión antes del análisis por citometría de flujo. Se observó la inducción de CD40 tras el tratamiento con sD7 durante 72 horas en comparación con el control. Este ensayo se repite en presencia de una molécula que inhibe o aumente la inducción de la respuesta en las células diana y se compararon los resultados. La inhibición o aumento de la respuesta puede demostrarse claramente. El resultado final de la regulación por incremento de CD40 es que las células B reciben señalización para su crecimiento y diferenciación. Por tanto, este experimento apoya una función del ligando D7 en el control de las respuestas inmunes y en enfermedades del sistema inmune, tales como la inflamación.

Ejemplo 3 Síntesis y purificación del ligando D7 soluble

El ácido nucleido que codifica el ligando D7 humano soluble (aminoácidos 133 a 285) se generó mediante PCR usando como molde la fase de lectura abierta de longitud completa clonada.

El ácido nucleico que codifica el ligando D7 humano soluble se clonó en el vector pFLAG-CMV-1 (Kodak) (que contiene un promotor CMV, una secuencia líder de preprotripsina, un epítopo FLAG amino terminal y una secuencia de adición de poliA de la hormona de crecimiento humana) para obtener la construcción pFLAG-CMV-1-hsD7. Se resuspendieron 5 x 10^{6} células HEK 293T en 250 \mul de cytomix (KCl 120 mM; CaCl_{2} 0,15 mM; K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,6; Hepes 25 mM, pH 7,6, EGTA 2 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 5 mM; ATP 2 mM, glutatión 5 mM, pH ajustado con KOH) que contenía 25 \mug de pFLAG-CMV-1-hsD7. La transfección se realizó usando un electroporador de BioRad (960 \muF, 270V).

Tras la transfección, las células se dejaron en hielo durante 10 min, a continuación, se transfirieron a un matraz de cultivo tisular de 75 cm^{2} con 15 ml de medio (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina (5 \mug/ml) y estreptomicina (5 \mug/ml)). Los medios que contienen el ligando secretado se recogieron después de 48 h y se aplicaron a una columna de cromatografía de afinidad que contenía un anticuerpo anti-FLAG M2 conjugado a agarosa (Kodak). Ésta se lavó con solución salina tamponada con Tris (pH 7,4) y las fracciones se eluyeron en tampón citrato 0,1 M (pH 2,5). Las fracciones se neutralizaron inmediatamente con 0,2 volúmenes de Tris-HCl 1 M (pH 7,6).

Las fracciones que contenían el ligando D7 humano soluble unido al epítopo FLAG (FLAG-hsD7) se identificaron mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-FLAG M2. Estas fracciones se agruparon y concentraron usando una columna Centricon Plus-20 (NWML 5000) (Millipore). El ligando FLAG-hsD7 se conservó a -70ºC.

Ejemplo 4 Síntesis y purificación del ligando D7

La fase de lectura abierta del ligando D7 humano se clona en el vector pcDNA3 (que contiene un promotor CMV y una señal de adición de poliA de la hormona de crecimiento bovino) para obtener la construcción pcDNA3-hD7.

El plásmido pcDNA3-hD7 se transfecta de forma transitoria mediante electroporación en células HEK 293T (protocolo igual al del ejemplo 3).

Las células se recogen después de 48 h y se homogeneizan usando un homogeneizador Dounce en tres volúmenes de tampón de extracción de proteínas (Hepes 25 mM, pH 7,4, Tritón X-100 al 0,5%, comprimido de mezcla "completa" de inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim) por 50 ml de tampón.

El ligando D7 se purifica mediante cromatografía de afinidad usando un anticuerpo anti D-7 conjugado con agarosa.

Ejemplo 5 Análisis de transferencia de ARN total de la distribución en tejidos del ligando D7

El ADNc que codifica el ligando D7 humano se escindió de pCDNA3-hD7 (véase el ejemplo 4) con las enzimas de restricción BamH1 y Xba1. Este fragmento de ADNc se marcó con ^{32}P dCTP usando el sistema ready-prime de Amersham según el protocolo del fabricante. Una alícuota de 5 \mul de esta mezcla se mezcló con 10 ml de solución Expresshyb (Clontech 8015-1) y la mezcla resultante se incubó con una de las siguientes transferencias de Clontech: Ratón (7762-1), Humano-1 (Nº 7760), línea celular de cáncer humano (Nº 7757) o sistema inmune humano II (Nº 7768-1), durante 2 horas a 65ºC con agitación. A continuación, se eliminó la solución de la sonda y la transferencia se lavó sucesivamente con SSCx2 (citrato sódico salino), SDS al 0,05% a temperatura ambiente durante tres periodos de 20 minutos. Esto fue seguido de un lavado con SSC al 0,1%, SDS al 0,1% a temperatura ambiente. Después, la transferencia se expuso a una película XAR-5 de Kodak a -70ºC durante 48 horas.

Los resultados del análisis de transferencia de ARN total muestran que el ARN del ligando D7 se expresa en corazón, pulmón, bazo, riñón y músculo esquelético pero no en encéfalo, tanto en ratones (figura 111A) como en humanos (figura 11 B). Una transferencia de tejidos relacionados con el sistema inmune muestra una fuerte expresión del ARN del ligando D7 en bazo, ganglio linfático, timo, apéndice, médula ósea y leucocitos de sangre periférica (figura 12A), lo que apoya su posible papel como regulador de las funciones del sistema inmune. El análisis del ARN de una variedad de líneas celulares tumorales humanas muestra la expresión del ARN del ligando D7 en las células leucémicas promielocíticas HL-60 pero no en una gama de otras diversas líneas celulares tumorales (figura 12B). La presencia del ligando D7 en una línea celular de leucemia apoya el hecho de que el ligando D7 está implicado en la regulación y trastornos del sistema inmune.

Ejemplo 6 Detección de la unión de FLAG-sD7 a la superficie celular

Se incubaron 10^{6} células con 50 ng de ligando FLAG-hsD7 (véase el ejemplo 3) en tampón de unión (PBS/FCS al 2,5%/azida sódica al 0,1%) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar una vez en tampón de unión, las células se incubaron con 1 \mug de anticuerpo anti-FLAG M2 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez en tampón de unión, a continuación, las células se incubaron con 150 \mug de anticuerpos anti-ratón conjugado con ficoeritrina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados adicionales en tampón de unión, se realizó una citometría de flujo usando un citómetro de flujo de mesa Coulter XL y se recogieron los datos de 10^{4} células viables.

Los resultados de uno de estos experimentos se muestran en la figura 13. No se detectaba ninguna señal significativa cuando cualquiera de las líneas ensayadas se trataba con anticuerpo anti-FLAG M2 y sólo con el anticuerpo secundario conjugado con R-ficoeritrina pero, tras el tratamiento previo con FLAG-sD7, la señal mostraba claramente que FLAG-hsD7 se unía a la línea celular de linfoma B RPMI 8866. Los experimentos con otras líneas celulares han mostrado que FLAG-hsD7 se une a otras dos líneas de células B (RPMI 8226 y Raji) pero no se une a las líneas de células T H9 y Jurkat ni a las líneas de estirpe mielomonocítico HL-60, U937 o THP-1. Estos resultados muestran que el dominio extracelular de ligando D7 humano se une a las células B, lo que apoya su posible función en la regulación del sistema inmune y también sugiere que la expresión del receptor D7 se restringe a las células B.

Ejemplo 7 Detección de unión a la superficie celular de FLAG-sD7 en sangre completa

La sangre completa de voluntarios sanos se diluyó 1:10 con citrato sódico al 3,8% (p/v). Se usaron 100 \mul en cada ensayo de unión. La unión a la superficie celular de FLAG-sD7 se detectó como en el ejemplo 6, excepto porque el anticuerpo secundario era una IgG anti-ratón conjugada Alexa 488 (Molecular Probes) y, después del lavado, las células se incubaron con 1 \mug de anticuerpo de ratón anti CD3 humano conjugado con PE (Becton Dickinson) o anticuerpo de ratón anti-CD19 humano conjugado con PE (Coulter-Immunotech). Este experimento confirma la especificidad de unión de FLAG-sD7 mostrada en el Ejemplo 6. En la figura 13 puede verse que, aunque estaban presentes tanto células B como células T, FLAG-sD7 se une sólo a las células B CD19^{+} (figura 14 A) y no a las células T CD3^{+} (figura 14 B). Esto confirma la especificidad de unión a las células B observada con las líneas celulares y una vez más sugiere que la expresión del receptor D7 se restringe a células B.

Ejemplo 8 FLAG-sD7 es capaz de trimerizarse

FLAG-sD7 recombinante purificada se fraccionó en una columna de Superosa 12 (Pharmacia). Las proteínas se eluyeron en PBS y las fracciones (1 ml) se analizaron mediante inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma). La columna se calibró con patrones proteicos: apoferritina (443 kDa), b-amilasa (200 kDa), ADH (150 kDa), BSA (66 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa) y citocromo C (12,5 kDa). La figura 15 A muestra la elución de la columna. La figura 15 B muestra las fracciones de los picos observados en la Figura 15 A, aplicados en un PAGE-SDS. Los marcadores del PAGE-SDS están en el lado derecho e indican que la proteína desnaturalizada se mueve hasta aproximadamente los 22 kDa. Los marcadores en la parte superior del gel son los patrones proteicos utilizados para calibrar la columna y muestran que FLAG-sD7 eluye en las fracciones de filtración en gel correspondientes a un peso molecular de aproximadamente 70 a 25 kDa. Estos experimentos demuestran que FLAG-sD7 es capaz de ensamblarse correctamente como un homotrímero, con un peso molecular de aproximadamente 3 x 22 kDa.

Ejemplo 9 Mapeo FISH del ligando D7

Los linfocitos aislados de sangre humana se cultivaron en medio esencial a-mínimo (a-MEM) suplementado con suero fetal de ternera al 10% y fitohemaglutinina a 37ºC durante 68-72 horas. Los cultivos de linfocitos se trataron con BrdU (0,18 mg/ml, Sigma) para sincronizar la población celular. Las células sincronizadas se lavaron tres veces con medio sin suero para liberar el bloqueo y se cultivaron de nuevo a 37ºC durante 6 horas en a-MEM con timidina (2,5 \mug/ml Sigma).Las células se recogieron y se prepararon portaobjetos para su uso en procedimientos convencionales, que incluyen tratamiento hipotónico, fijación y secado.

Los portaobjetos se pusieron en el horno a 55ºC durante 1 hora. Tras el tratamiento con RNasa, los portaobjetos se desnaturalizaron en formamida al 70% en SSCx2 durante 2 min al 70ºC seguido de la deshidratación con etanol. La sonda de ADN D7-27 que es el ADNc del D7 de longitud completa como se muestra en la figura 4, más 150 nucleótidos de la región 5' no traducida y 50 nt de la región no traducida 3') se biotiniló con dATP y las sondas se desnaturalizaron a 75ºC durante 5 min. En una mezcla de hibridación compuesta de formamida al 50% y sulfato de dextrano al 10%. Las sondas se cargaron en los portaobjetos cromosómicos desnaturalizados. Después de hibridar durante toda la noche, los portaobjetos se lavaron, se detectó y se amplificó. Las señales FISH y el bandeo DAPI se registraron por separado tomando fotografías y la asignación de los datos del mapeo FISH con bandas cromosómicas se lograron superponiendo las señales DISH con los bandeos cromosómicos DAPI. El bandeo DAPI mostraba que la señal se localiza en el cromosoma 13 humano y los resultados FISH además se localizan en la región q33.

Claims (5)

1. Un procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto que modula la interacción entre una proteína ligando de TNF que comprende el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 1 y su receptor expresado en células B, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de poner en contacto dicha proteína y dicho receptor en presencia de un compuesto de ensayo y controlar la modulación de la interacción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la proteína está en forma trimérica.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que dicha proteína está en forma homotrimérica.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que dicho receptor se expresa en una célula B seleccionada entre el grupo constituido por RPMI 8866, RPMI 8226 y Raji.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, aptámero o polipéptido.