ES2239242T3

ES2239242T3 - Inmunoadhesion concatemerica.

Info

Publication number: ES2239242T3
Application number: ES02753273T
Authority: ES
Inventors: Yong-Hoon Chung; Ji-Woong Han; Hye-Ja Lee; Eun-Yong Choi; Jin-Mi Kim
Original assignee: Medexgen Inc
Current assignee: Medexgen Inc
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: EP1362062A4; DE60203996T2; DE60203996D1; EP1362062B1; AU2002313952B2; HK1062305A1; CN1293098C; KR20030010189A; US8372961B2; CN1524092A; EP1362062A1; KR100453877B1; US20030195338A1; JP2004521655A; CA2429384C; US7229962B2; US7670602B2; US20100278827A1; US20090011466A1; JP4288159B2

Abstract

Proteína dimérica de fusión concatemérica que comprende dos proteínas monoméricas formadas mediante la unión de un concatémero de dos dominios extracelulares solubles idénticos de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria, a una región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, en la que dichas proteínas monoméricas se unen mediante enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra, y que tiene una estabilidad y efectos terapéuticos mejorados.

Description

Inmunoadhesión concatemérica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas concateméricas y, más específicamente, a una estructura concatemerizada de dominios de proteína biológicamente activa, en la que el extremo C-terminal del dominio soluble extracelular de la proteína biológicamente activa se fusiona con el extremo N-terminal del mismo o de otro dominio soluble extracelular de proteína biológicamente activa, y a la dimerización de dos concatémeros mediante el acoplamiento a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas y a las formas glucosiladas de las proteínas concateméricas.

Técnica anterior

La actividad de la citocina está asociada con la gravedad patológica de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria a diversas estimulaciones antigénicas. En la actualidad se utilizan muchos anticuerpos específicos de antígeno y receptores solubles que podrían reconocer citocinas, para inhibir la función de las citocinas con fines terapéuticos (documentos WO 93/016184, WO 96/02576, WO 96/023067, WO 1997/03682, y US 5.434.131, 5.656.272, 5.977.318, 6.210.661, 6.225.117). Los anticuerpos y los receptores solubles inhiben la transducción de la señal de citocina alterando la interacción entre las citocinas y sus receptores en la superficie celular.

Los receptores solubles utilizados como inhibidores funcionales de citocinas que se fusionan a las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas humanas se dieron a conocer por Capon et al. (Nature 337:5254, 1989), y a partir de entonces, muchas patentes describieron invenciones relacionadas con las proteínas de fusión de los receptores solubles y las inmunoglobulinas (patentes de los EE.UU. 5.521.288, 5.844.095, 6.046.310, 6.090.914, 6.100.383, 6.225.448).

En general, las proteínas de fusión de los receptores solubles y las inmunoglobulinas tienen las siguientes ventajas (Capon et al., Nature 337:5254, 1989)

1.: Aumento en la avidez total por el ligando formando bivalencia a través de dimerización.

2.: Aumento de la semivida en sangre de las proteínas, es decir, aumento en la estabilidad molecular.

3.: Activación de las células efectoras mediante el fragmento Fc de la cadena pesada de las inmunoglobulinas.

4.: Comodidad en la purificación utilizando una columna de afinidad, por ejemplo, utilizando la proteína A.

La mayor parte de las proteínas de fusión del dominio extracelular del receptor y la cadena pesada de las inmunoglobulinas están compuestas por la cadena pesada sin el dominio CH1, lo que da como resultado dímeros que no se unen a las cadenas ligeras. Esta estructura es más deseable por la función de las proteínas y los receptores que participan en la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, las proteínas de fusión TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) (documentos W092/16221, W095/34326) - inmunoglobulina descritas en los documentos W094/06476 y US 5.447.851 se han utilizado para la inhibición de la inflamación mediada por TNF. Es bien conocido que las proteínas de fusión TNFR-inmunoglobulina tienen una mayor afinidad que las moléculas monoméricas originales (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883, 1991; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10535, 1991; Peppe et al., J. Exp. Med. 174:1483, 1991; Mohler et al., J. Immunol. 151:1548, 1993).

Para mejorar la inhibición de la respuesta mediada por TNF, puede aumentarse la eficacia mediante la multimerización de los dominios extracelulares solubles de TNFR, CD2, y CTLA-4. Por ejemplo, cuando las proteínas de fusión de los dominios extracelulares de TNFR unidos con la cadena pesada de la inmunoglobulina (proteína de fusión de cadena pesada) y con la cadena ligera (proteína de fusión de cadena ligera), respectivamente, se coexpresan en la misma célula, pueden producirse proteínas de fusión como una forma tetramérica mediante la unión de la cadena pesada a cadenas pesadas y ligeras. Este tetrámero demostró una eficacia mucho mayor que las formas monoméricas o diméricas, tal como presentaron Scallon et al. (Cytokine 7:759, 1995).

Sin embargo, este método tenía muchas dificultades para su comercialización, tales como la expresión simultánea de dos genes de fusión diferentes en la misma línea celular, los rendimientos de producción notablemente inferiores de la forma multimérica y la dificultad para purificar las formas multiméricas de elevado peso molecular. Por estos motivos, en la actualidad, las proteínas de fusión de inmunoglobulina en uso son sólo la forma fusionada a la cadena pesada.

Por tanto, hay una demanda considerable de desarrollo de métodos de producción de agentes terapéuticos proteicos multiméricos con alto rendimiento y procedimientos de purificación eficaces.

Referencias adicionales relacionadas con las proteínas multiméricas y vectores pertinentes para el campo de la invención son: documentos US 5073672, EP 464533, US 5861151, US 5239053, US 5428130, US 6165476, WO 01/77324 y Cornish et al., Journal of Cell Science 1995, 1213-1223.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han fabricado proteínas concateméricas mediante la fusión del extremo C-terminal del dominio soluble de una proteína biológicamente activa al extremo N-terminal del dominio soluble de la misma u otra proteína biológicamente activa, mediante la utilización de técnicas de recombinación de ADN. Además, los presentes inventores han dimerizado estos concatémeros mediante su unión a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina y han añadido más glucosilaciones mediante la utilización de técnicas de mutagénesis de ADN. Y los presentes inventores han encontrado que los dímeros de la proteína concatemerizada y sus formas glucosiladas muestran un aumento de la eficacia y la estabilidad, en comparación con las proteínas de fusión monomérica convencional.

Por tanto, la presente invención se refiere generalmente a proteínas concateméricas, en las que el extremo C-terminal de un dominio soluble de una proteína biológicamente activa se fusiona a un extremo N-terminal de un dominio soluble de la misma o de otras proteínas biológicamente activas.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína dimérica, de fusión concatemérica que comprende dos proteínas monoméricas formadas por la unión de un concatémero de dos dominios extracelulares solubles idénticos de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria a una región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, en la que dichas proteínas monoméricas están unidas mediante puentes disulfuro intermoleculares en la región bisagra y tienen una estabilidad y efectos terapéuticos mejorados.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona constructos de ADN que codifican para proteínas de fusión monoméricas, cuyo dominio concatemerizado se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona plásmidos de ADN que comprenden un constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión monomérica, cuya parte concatemerizada se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped transfectadas o transformadas con plásmidos de ADN recombinante que incluyen un constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión monomérica, cuya parte concatemerizada se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para cultivar las células huésped, que se transfectaron o transformaron con plásmidos de ADN recombinante que incluyen un constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión monomérica, cuya parte concatemerizada se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina, en condiciones de cultivo para la expresión de los constructos de ADN que codifican para una proteína de fusión concatemérica acoplada a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina, y para fabricar los concatémeros diméricos formados mediante un puente disulfuro en la región bisagra de los dos concatémeros monoméricos descritos como anteriormente, incluyendo el proceso de purificación de proteínas descritas como anteriormente a partir del cultivo celular.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para cultivar las células huésped que se transfectaron o transformaron con plásmidos de ADN recombinante que incluyen un constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión monomérica, cuya parte concatemerizada de la función inmunomoduladora se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina y se inserta con motivos de glucosilación, en la mejor condición que sea adecuada para la expresión de constructos de ADN que codifican para la proteína de fusión monomérica, cuya parte concatemerizada de la función inmunitaria se fusiona con la región bisagra del fragmento Fc de la inmunoglobulina, y para fabricar dímeros glucosilados formados mediante un puente disulfuro en la región bisagra de dos proteínas monoméricas descritas como anteriormente, incluyendo el proceso de purificación de las proteínas glucosiladas descritas como anteriormente a partir del cultivo celular.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona cebadores de ADN para insertar el motivo de glucosilación en los constructos de ADN que codifican para proteínas de fusión monoméricas, cuya parte concatemerizada se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona dímeros glucosilados formados por un puente disulfuro en la región bisagra de dos proteínas monoméricas, cuya parte concatemerizada que participa en la respuesta inmunitaria se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden dímeros formados por un puente disulfuro en la región bisagra de dos proteínas monoméricas, cuya parte concatemerizada que participa en la respuesta inmunitaria se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas en una cantidad farmacéuticamente eficaz y en una vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además en otro aspecto, la presente invención proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden dímeros glucosilados formados por un puente disulfuro en la región bisagra de dos proteínas monoméricas, cuya parte concatemerizada que participa en la respuesta inmunitaria se fusiona a la región bisagra del fragmento Fc de las inmunoglobulinas en una cantidad farmacéuticamente eficaz y en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es una vista esquemática que muestra un procedimiento de preparación de un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión simple convencional mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR);

la figura 2 es una vista esquemática que muestra un procedimiento de preparación de un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica, de fusión concatemérica según la presente invención mediante PCR;

la figura 3a muestra las estructuras de las proteínas de fusión [TNFR/Fc]_{2}, [CD2/Fc]_{2} o [CTLA4/Fc]_{2}, que son proteínas diméricas de fusión simple formadas mediante la homodimerización en células de las proteínas de fusión TNFR/Fc, CD2/Fc o CTLA4/Fc como ejemplos de proteínas monoméricas de fusión simple convencional;

la figura 3b muestra las estructuras de las proteínas de fusión [TNFR-TNFR/Fc]_{2}, [CD2-CD2/Fc]_{2} o [CTLA4-CTLA4/Fc]_{2}, que son proteínas diméricas, de fusión concatemérica formadas mediante la homodimerización en células de las proteínas de fusión TNFR-TNFR/Fc, CD2-CD2/Fc o CTLA4-CTLA4/Fc como realizaciones de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención;

la figura 4a muestra una estructura de [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2}, como una realización de una proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención;

la figura 4b muestra una estructura de [TNFR2-TNFR2/Fc]_{2}, como otra realización de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención;

la figura 4c muestra una estructura de [CD2-CD2/Fc]_{2}, como una realización adicional de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención;

la figura 4d muestra una estructura de [CTLA4-CTLA4/Fc]_{2}, como todavía una realización adicional de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención;

la figura 5 es un diagrama que muestra un procedimiento de construcción de un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-Top10' que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc según la presente invención;

la figura 6 es un diagrama que muestra un procedimiento de construcción de un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc según la presente invención;

la figura 7 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-Top10' que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc según la presente invención;

la figura 8 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-Top10' que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc según la presente invención;

la figura 9 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc según la presente invención;

la figura 10 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pCT44Ig que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica CTLA4-CTLA4/Fc según la presente invención;

la figura 11 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-MG que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR1-TNFR1/Fc que contiene péptidos con cuatro motivos de glucosilación según la presente invención;

la figura 12 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-MG que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR2-TNFR2/Fc que contiene péptidos con dos motivos de glucosilación según la presente invención;

la figura 13 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig-MG que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCD2-CD2/Fc que contiene péptidos con dos motivos de glucosilación según la presente invención;

la figura 14 es un mapa de un plásmido de expresión recombinante pCT44Ig-MG que expresa una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCTLA4-CTLA4/Fc que contiene péptidos con tres motivos de glucosilación según la presente invención;

la figura 15 muestra un resultado de SDS-PAGE de las proteínas diméricas de fusión concatemérica purificadas [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2} y [TNFR2-TNFR2/Fc]_{2} en condiciones reductoras o no reductoras;

la figura 16 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de las proteínas diméricas de fusión simple convencional [TNFR1/Fc]_{2} (\bullet) y [TNFR2/Fc]_{2} (\circ) y las proteínas diméricas de fusión concatemérica [TNFR1-RNFR1/Fc]_{2} (\blacktriangledown) y [TNFR2-TR2Fc]_{2} (\nabla) según la presente invención frente a la actividad citotóxica de TNF-alfa;

La figura 17 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de las proteínas diméricas de fusión simple convencional [TNFR1/Fc]_{2} (\bullet) y [TNFR2/Fc]_{2} (\circ) y las proteínas diméricas de fusión concatemérica [TNFR1-RNFR1/Fc]_{2} (\blacktriangledown) y [TNFR2-TR2Fc]_{2} (\nabla) según la presente invención frente a la actividad citotóxica de TNF-beta;

la figura 18 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de la proteína dimérica de fusión simple convencional [CD2/Fc]_{2} (\bullet), el conocido agente inmunosupresor ciclosporina A (\blacktriangledown) y la proteína dimérica de fusión concatemérica [CD2-CD2/Fc]_{2} (\circ) según la presente invención sobre la proliferación de los linfocitos T activos;

la figura 19 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de la proteína dimérica de fusión simple convencional [CTLA4/Fc]_{2} (\bullet),el conocido agente inmunosupresor ciclosporina A (\blacktriangledown) y la proteína dimérica de fusión concatemérica [CTLA4-CTLA4/Fc]_{2} (\circ) según la presente invención sobre la proliferación de los linfocitos T activos;

la figura 20 es un gráfico que muestra la semivida en sangre de la proteína dimérica de fusión simple convencional [TNFR1/Fc]_{2} (\bullet), la proteína dimérica concatemérica [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2} (\circ) y una proteína dimérica de fusión concatemérica glucosilada [mgTNFR1-TNFR1/Fc]_{2} (\nabla) según la presente invención;

la figura 21 es un gráfico que muestra la semivida en sangre de la proteína dimérica de fusión simple convencional [CD2/Fc]_{2} (\bullet), la proteína dimérica de fusión concatemérica [CD2-CD2/Fc]_{2} (\circ) y una proteína dimérica de fusión concatemérica glucosilada [mgCD2-CD2/Fc]_{2} (\nabla) según la presente invención;

la figura 22 es un gráfico que muestra la semivida en sangre de la proteína dimérica de fusión simple convencional [CTLA4/Fc]_{2} (\bullet), la proteína dimérica de fusión concatemérica [CTLA4-CTLA4/Fc]_{2} (\circ) y una proteína dimérica de fusión concatemérica glucosilada [mgCTLA4-CTLA4/Fc]_{2} (\nabla) según la presente invención; y

la figura 23 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de PBS (\bullet) como control, las proteínas diméricas de fusión simple convencional [TNFR1/Fc]_{2} (\blacksquare) y [TNFR2/Fc]_{2} (\blacktriangle), y las proteínas diméricas de fusión concatemérica [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2} (x) y [TNFR2-TNFR2/Fc]_{2} (\Delta) según la presente invención sobre la inducción de la artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones DBA/1.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se refiere generalmente a proteínas concateméricas y, más particularmente, a moléculas de inmunoadhesión. Las moléculas de inmunoadhesión se forman normalmente mediante la fusión del fragmento Fc de la inmunoglobulina (Ig) con una región de unión a ligando de un receptor o una molécula de adhesión y, por tanto, tienen una estructura similar a la de un anticuerpo. Las moléculas de inmunoadhesión habituales conocidas en la técnica tienen una estructura de un anticuerpo en el que la región variable se sustituye por una región de unión a ligando de un receptor, mientras se conserva el fragmento Fc. En la bibliografía, se sugiere una amplia variedad de moléculas de inmunoadhesión. Sin embargo, las moléculas de inmunoadhesión según la presente invención tienen una estructura diferente con respecto a las moléculas de inmunoadhesión convencionales y tampoco existe técnica anterior que prevea o describa la preparación de las moléculas de inmunoadhesión según la presente invención.

Definición de términos

Para la comprensión completa de la estructura característica de las moléculas de inmunoadhesión según la presente invención, a continuación se facilitan las definiciones exactas de los términos utilizados en la presente invención. En general, todos los términos técnicos y científicos que no se definen adicionalmente en la presente invención tienen los significados utilizados comúnmente en la técnica. Sin embargo, aunque tengan significados comúnmente utilizados en la técnica, los términos siguientes se definen para facilitar una comprensión más clara de sus significados y hacer que el alcance de la presente invención sea más claro, tal como sigue.

El término "inmunoglobulina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas proteicas que se producen en las células B y que sirven como receptores antigénicos que reconocen específicamente una amplia variedad de antígenos. Las moléculas tienen una estructura con forma de Y que consiste en dos cadena ligeras (cadenas L) idénticas y dos cadena pesadas (cadenas H) idénticas, en las que las cuatro cadenas se mantienen juntas mediante varios puentes disulfuro, incluyendo el puente disulfuro entre las cadenas H en la región bisagra. Las cadenas L y H comprenden regiones variables y constantes. La región variable de la cadena L se asocia con la región variable de la cadena H, produciendo así dos regiones idénticas de unión a antígeno. Según las características de las regiones constantes de las cadenas H, las inmunoglobulinas (Ig) se clasifican en cinco isotipos, A (IgA), D (IgD), E (IgE), G (IgG) y M (IgM). Cada subtipo posee propiedades estructurales y biológicas únicas. Por ejemplo, IgG tiene una estructura de Fc ligeramente diferente, en comparación con otros isotipos. Además, IgG e IgA tienen varios subtipos. Por ejemplo, el isotipo IgG humano tiene cuatro subtipos, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, que tienen cadenas H \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4, respectivamente. Las funciones biológicas de las moléculas de inmunoglobulina, tales como activación del complemento, fagocitosis mediada por el receptor de Fc y citotoxicidad dependiente de antígeno, están mediadas por los determinantes estructurales (regiones determinantes de la complementariedad) en la región Fc de las cadenas H. Tal región Fc de las cadenas H se utiliza para la construcción de las proteínas diméricas según la presente invención, y pueden derivarse de todos los isotipos y subtipos de inmunoglobulinas, tal como se describieron anteriormente.

El término "fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento que no tiene actividad de unión a antígeno y que se cristaliza fácilmente, que comprende una región bisagra y los dominios CH2 y CH3, y una parte responsable de la unión de un anticuerpo a células y materiales efectores. Por tanto, el fragmento Fc mencionado en la presente invención puede ser diferente del descrito en la bibliografía, pero incluye la región bisagra. Tal descripción del fragmento Fc se facilita por conveniencia para la descripción de la presente invención y se entenderá completamente por los expertos habituales en la técnica con referencia a la memoria descriptiva de la presente invención y los dibujos adjuntos.

El término "proteína biológicamente activa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína, péptido o polipéptido que tiene generalmente actividades fisiológicas o farmacéuticas, que conserva una parte de sus actividades nativas tras formar un concatémero o molécula de inmunoadhesión. El término "actividad biológica", tal como se usa en el presente documento, no está limitado en su significado a las actividades fisiológicas o farmacéuticas. Por ejemplo, algunos concatémeros, tales como los que contienen una enzima, pueden catalizar una reacción en un disolvente orgánico. De manera similar, algunas moléculas de fusión de alto peso molecular que contienen concanavalina A o una molécula de inmunoglobulina son útiles como agentes de diagnóstico en los laboratorios.

Los ejemplos no limitativos de la proteína, péptido o polipéptido incluyen hemoglobina, proteínas séricas (por ejemplo, factores sanguíneos incluyendo el factor VII, VIII y el factor IX), inmunoglobulina, citocinas (por ejemplo, interleucina), interferón \alpha, \beta y \gamma, agente estimulante de colonias (por ejemplo, G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos)), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF) y proteínas que activan la fosfolipasa (PLAP). Otras proteínas biológicas o terapéuticas típicas incluyen la insulina, proteínas vegetales (por ejemplo, lecitina y ricina), el factor de necrosis tumoral (TNF) y sus alelos relacionados, factores de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento tisular y factores de crecimiento endotelial tales como TGF\alpha o TGF\beta), hormonas (por ejemplo, folitropina, tirotropina, vasopresina, hormonas concentradoras o dispersantes de pigmento y hormona paratiroidea, hormona liberadora de hormona luteinizante y sus derivados, calcitonina, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), encefalina sintética, somatomedina, eritropoyetina, factores de liberación del hipotálamo, prolactina, gonadotrofina crónica, agentes activadores del plasminógeno tisular, péptido liberador de la hormona de crecimiento (GHRP) y factor tímico humoral (THF). Las inmunoglobulinas incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas. Algunas proteínas tales como interleucina, interferón o factor estimulante de colonias pueden producirse en una forma no glucosilada utilizando técnicas recombinantes de ADN. Las proteínas no glucosiladas pueden ser útiles como materiales biológicamente activos en la presente invención.

Además, los materiales biológicamente activos útiles en la presente invención incluyen cualquier polipéptido que tenga actividad biológica in vivo. Los ejemplos de los materiales biológicamente activos incluyen péptidos o polipéptidos, fragmentos de un anticuerpo, proteínas de unión de cadena sencilla (véase la patente de los EE.UU. número 4.946.778), moléculas de unión incluyendo polipéptidos de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y anticuerpos catalíticos. Otros ejemplos de los materiales biológicamente activos incluyen proteínas alérgenas, tales como ambrosía, antígeno E, veneno de abeja o alérgeno de ácaros.

Además, el material biológicamente activo útil en la presente invención incluye enzimas. Los ejemplos de las enzimas incluyen enzimas específicas para los hidratos de carbono, proteinasas, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. En detalle, los ejemplos no limitativos de las enzimas incluyen asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, peróxido dismutasa, endotoxinasa, catalasa, quimotripsina, lipasa, uricasa, adenosina desfosfatasa, tirosinasa y bilirrubina oxidasa. Los ejemplos de las enzimas específicas para hidratos de carbono incluyen glucosa oxidasa, glucosidasa, galactosidasa, glucocerebrosidasa y glucuronidasa.

El término "proteínas que participan en la respuesta inmunitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a todas las proteínas que median la transducción de la señal intercelular durante la respuesta inmunitaria humoral o celular y que activan o inhiben así la respuesta inmunitaria. La inmunidad es un proceso de "auto"-protección frente a lo "ajeno" tal como bacterias o virus. La respuesta inmunitaria se divide principalmente en respuesta inmunitaria celular y humoral, en las que los linfocitos B y T desempeñan el papel más importante. Las células T, que median principalmente la respuesta inmunitaria celular, atacan directamente y destruyen las células infectadas por virus o las células tumorales, o ayudan a otras células inmunitarias secretando citocinas que funcionan induciendo o activando la respuesta inmunitaria o la inflamación. Las células B producen anticuerpos frente a los materiales extraños ajenos (antígenos) que entran en un organismo, tales como bacterias o virus y tal respuesta inmunitaria se denomina respuesta inmunitaria celular. La transducción de la señal intercelular es un proceso esencial en las respuestas inmunitarias células y humoral, en las que una molécula señal, es decir un ligando, interacciona con un receptor de la superficie celular, actuando para transducir una señal específica en una célula.

Los ejemplos representativos de las proteínas que participan en la respuesta inmunitaria según la presente invención incluyen citocinas, receptores de las citocinas, moléculas de adhesión, receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), enzimas, tirosinas cinasas de receptores, receptores de quimiocinas, otras proteínas de la superficie celular y ligandos solubles. Los ejemplos no limitativos de las citocinas incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO y M-CSF. Los ejemplos de los receptores de las citocinas incluyen, pero sin limitarse a, receptores de la hormona de crecimiento (GHR), IL-13R (receptor de IL-13), IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR (por ejemplo, cadena \alpha del R (receptor) de IFN-\gamma y cadena \beta del R de IFN-\gamma), R del interferón \alpha, \beta y R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130 y Fas (Apo 1). Los ejemplos no limitativos de las enzimas incluyen hematoglutinina esterasa de influenza C y urocinasa. Se ponen como ejemplos de los receptores de las quimiocinas CCR1 y CXCR1-4. Los ejemplos de las tirosina cinasas de receptores incluyen, pero no se limitan a TrkA, TrkB, TrkC, Htk, REK7, Rse/Tyro-3, R del factor de crecimiento de hepatocitos, R del factor de crecimiento derivado de plaquetas y Flt-1. Los ejemplos de otras proteínas de la superficie celular incluyen CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61, \beta-neurexina, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, complemento R-2 (CD21), IgER, gp-1 de la membrana lisosomal, proteínas relacionadas con el receptor de \alpha2-microglobulina y R del péptido liberador de sodio. Los ejemplos no limitativos de los ligandos solubles incluyen IL-10, heregulina y factores de crecimiento de queratinocitos.

Los ligandos para las proteínas que participan en la respuesta inmunitaria según la presente invención y el uso de los mismos se conocen bien por los expertos habituales en la técnica, tal como se resume en las tablas 1 a 7, más adelante.

TABLA 1 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Moléculas de adhesión

1

TABLA 2 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Enzimas

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2

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TABLA 3 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Receptores de citocinas

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TABLA 4 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Receptores del factor de necrosis tumoral

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TABLA 5 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Tirosina cinasas de receptores

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TABLA 6 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Otras proteínas de la superficie celular

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TABLA 7 Proteínas que participan en la respuesta inmunitaria: Ligandos solubles

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El término "dominio extracelular soluble", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una parte expuesta a la región extracelular de una proteína integral de membrana, que penetra en la membrana celular, que comprende fosfolípidos, en la que la proteína integral de membrana contiene uno o más dominios transmembrana compuestos predominantemente por aminoácidos hidrófobos. Tal dominio extracelular comprende principalmente aminoácidos hidrófilos, que se sitúan normalmente en la superficie de una estructura plegada de una proteína y, por tanto, es soluble en un entorno acuoso. Para la mayoría de las proteínas receptoras de la superficie celular, los dominios extracelulares sirven para unir ligandos específicos, mientras que los dominios intracelulares desempeñan un importante papel en la transducción de la señal.

El término "unido a un concatémero", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un estado en el que dos dominios solubles de proteínas biológicamente activas se unen y forman así un polipéptido largo.

El término "proteína concatemérica", tal como se utiliza en el presente documento, significa una proteína unida a un concatémero. Por ejemplo, el extremo N-terminal de un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria se une al extremo C-terminal de un dominio extracelular soluble idéntico de la proteína que participa en la respuesta inmunitaria, en la que el extremo C-terminal del primer dominio extracelular soluble está unido a la región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina. Por tanto, dos dominios extracelulares solubles idénticos de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria forman un polipéptido largo.

El término "proteína monomérica de fusión simple", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que tiene una estructura monomérica que consiste en un único polipéptido formado por la unión de un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria a la región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina. Una proteína monomérica de fusión simple puede designarse por "nombre de la proteína/Fc" por conveniencia en la presente invención. Por ejemplo, una proteína monomérica de fusión simple producida por la unión de un dominio extracelular soluble de la proteína TNFR1 que participa en la respuesta inmunitaria a un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina se designa por TNFR1/Fc. Si se desea, también puede especificarse el origen del fragmento Fc en la designación. Por ejemplo, en el caso de que el fragmento Fc se derive de IgG1, la proteína monomérica se denomina TNFR1/IgG1Fc.

El término "proteína dimérica de fusión simple", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que tiene una estructura dimérica, en la que se unen dos proteínas monoméricas de fusión simple mediante la formación de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra. Tal proteína dimérica de fusión simple puede designarse por "[nombre de la proteína/Fc]_{2}" por conveniencia en la presente invención. Por ejemplo, cuando se fusionan mediante la formación de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra de dos proteínas monoméricas de fusión simple producidas mediante la unión de un dominio extracelular soluble de la proteína TNFR1 y un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, la proteína de fusión resultante que tiene estructura dimérica se designa por [TNFR1/Fc]_{2}. Además, puede especificarse el origen del fragmento Fc en la designación, si se desea. Por ejemplo, en el caso de que el fragmento Fc se derive de IgG1, la proteína dimérica se denomina

\hbox{[TNFR1/IgG1Fc] _{2} .}

El término "proteína monomérica de fusión concatemérica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que tiene una estructura monomérica que consiste en un único polipéptido, en la que el extremo N-terminal de un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria se une al extremo C-terminal de un dominio extracelular soluble idéntico de la proteína que participa en la respuesta inmunitaria, en la que el extremo C-terminal del primer dominio extracelular soluble está unido a la región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina. Una proteína monomérica de fusión concatemérica puede designarse por "nombre de la proteína-nombre de la proteína/Fc" por conveniencia en la presente invención. Por ejemplo, cuando se une un dominio extracelular soluble de TNFR1 de una proteína monomérica de fusión simple, producida por la unión del dominio extracelular soluble de la proteína TNFR1 que participa en la respuesta inmunitaria a un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, se une a un dominio extracelular soluble idéntico de TNFR1, la proteína monomérica de fusión concatemérica se designa por TNFR1-TNFR1/Fc. Si se desea, puede especificarse el origen del fragmento Fc en la designación. Por ejemplo, en el caso de que el fragmento Fc se derive de IgG1, la proteína monomérica se designa por TNFR1-TNFR1/IgG1Fc.

El término "proteína dimérica de fusión concatemérica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que tiene una estructura dimérica, en la que se fusionan dos proteínas monoméricas de fusión concatemérica mediante la formación de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra. Una proteína dimérica de fusión concatemérica puede designarse por "[nombre de la proteína-nombre de la proteína/Fc]_{2}" por conveniencia en la presente invención. Por ejemplo, cuando se fusionan dos proteínas monoméricas de fusión concatemérica, producida cada una de ellas mediante la unión de un dominio extracelular soluble de TNFR1 de una proteína monomérica de fusión simple a un dominio extracelular soluble idéntico de la proteína TNFR1 que participa en la respuesta inmunitaria, mediante la formación de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra, la proteína de fusión resultante que tiene estructura dimérica se designa por [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2}, en la que la proteína monomérica de fusión simple se forma mediante la unión del dominio extracelular soluble de la proteína TNFR1 a un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina. Si se desea, puede especificarse el origen del fragmento Fc en la designación. Por ejemplo, en el caso de que el fragmento Fc se derive de IgG1, la proteína dimérica se denomina [TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]_{2}.

El término "vector", tal como se utiliza en el presente documento, significa una molécula de ADN que sirve como vehículo que puede transportar de manera estable genes exógenos al interior de células huésped. Para una aplicación útil, el vector debe poder replicarse, tener un sistema para introducirse a sí mismo en una célula huésped y tener marcadores de selección. Por ejemplo, los genes exógenos incluyen un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica.

El término "plásmido de expresión recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN circular que lleva genes exógenos unidos operativamente al mismo para expresarlos en una célula huésped. Cuando se introduce en una célula huésped, el plásmido de expresión recombinante tiene la capacidad para replicarse, independientemente del ADN cromosómico del huésped, copiarse a sí mismo con un alto número de copias y producir ADN heterogéneo. Tal como se conoce generalmente en la técnica, con el fin de aumentar el nivel de expresión de un gen transfectado en una célula huésped, el gen debe estar operativamente unido a las secuencias reguladoras de transcripción y traducción funcionales en una célula huésped seleccionada como sistema de expresión. Preferiblemente, las secuencias reguladoras de la expresión y los genes exógenos pueden transportarse en un único vector de expresión que contiene marcadores de selección de bacterias y un origen de replicación. En el caso en que se utilizan células eucariotas como sistema de expresión, el vector de expresión debe comprender además marcadores de expresión útiles en las células huésped eucariotas.

El término "operativamente unido", tal como se utiliza en el presente documento, significa una disposición de los elementos de un vector, en la que cada elemento puede realizar su función innata. Por tanto, una secuencia de control unida operativamente a una secuencia codificante puede influir en la expresión de la secuencia codificante. Una secuencia de control que actúa para inducir la expresión de una secuencia codificante no tiene que estar adyacente a la secuencia codificante. Por ejemplo, cuando está presente una secuencia intermedia entre una secuencia promotora y una secuencia codificante, la secuencia promotora puede estar todavía "unida operativamente" a la secuencia codificante.

Las células huésped utilizadas en la presente invención pueden ser procariotas o eucariotas. Además, pueden utilizarse normalmente las células huésped que tienen una alta eficacia de introducción de ADN extraño y que tienen altos niveles de expresión de un gen introducido. Los ejemplos de las células huésped útiles en la presente invención incluyen células procariotas y eucariotas tales como células de E. coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., hongos o levaduras y de insectos tales como Spodoptera frugiperda (Sf9), células animales tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de ratón, células de mono verde africano tales como COS 1, COS 7, células de riñón embrionario humano, BSC 1, BSC 40 o BMT 10 y células humanas cultivadas en tejido. Cuando se clona un constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión según la presente invención, las células huésped son preferiblemente células animales. Cuando se utilizan células COS, dado que se expresa el antígeno T grande de SV40 en las células COS, puede estar presente un plásmido que lleva un origen de replicación de SV40 como un episoma de múltiples copias y permite así una elevada expresión de un gen exógeno. Una secuencia de ADN introducida en una célula huésped puede ser homogénea o heterogénea con respecto a la célula huésped, o una secuencia de ADN híbrido que contiene una secuencia de ADN homogéneo o heterogéneo.

Con el fin de expresar una secuencia de ADN que codifica para la proteína de fusión concatemérica según la presente invención, puede utilizarse una amplia variedad de combinaciones de células huésped como sistema de expresión y vectores. Los vectores de expresión útiles para transformar células huésped eucariotas que contienen secuencias de regulación de la expresión de, por ejemplo, SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus, virus adenoasociados, citomegalovirus y retrovirus. Los vectores de expresión útiles en células huésped bacterianas incluyen plásmidos bacterianos procedentes de E. coli, de los que se ponen como ejemplo pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 y derivados de los mismos, plásmidos que tienen una amplia gama de células huésped, tales como RP4, ADN de fago, de los que se ponen como ejemplo una amplia variedad de derivados del fago \lambda incluyendo \lambda gt10, \lambda gt11 y NM989, y otros fagos con ADN, de los que se ponen como ejemplo fagos de ADN monocatenario filamentoso tales como MC13. Los vectores de expresión útiles en células de levaduras incluyen el plásmido 2 \mu y derivados del mismo. Los vectores de expresión útiles en células de insecto incluyen pVL 941.

El término "transformación", tal como se utiliza en el presente documento, significa introducir ADN en una célula huésped adecuada, de modo que el ADN pueda replicarse, o bien como elemento extracromosómico o bien mediante integración cromosómica.

El término "transfección", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula huésped adecuada, exprese de hecho o no alguna secuencia codificante.

El término "secuencia señal", tal como se utiliza en el presente documento, significa una secuencia de aminoácidos que media el transporte de una proteína expresada al exterior de la membrana celular y también se denomina "secuencia líder". Las proteínas de la superficie celular o proteínas secretoras, que se transportan al exterior de la membrana celular, tienen una secuencia del extremo N-terminal normalmente cortada por una peptidasa señal en la membrana celular. Tal secuencia del extremo N-terminal se denomina una secuencia señal o péptido señal, o una secuencia líder o péptido líder. Las proteínas secretoras (o transportadas) o todas las proteínas presentes en el exterior de la membrana celular o en el entorno extracelular tienen una secuencia señal específica. No hay una homología específica entre tales secuencias señal y las mismas proteínas tienen diferentes secuencias señal según su origen. La estructura o distribución secundaria de los residuos apolares y cargados es más importante para la propia función de las secuencias señal que las estructuras primarias de las mismas. Aunque no tengan una homología específica, las secuencias señal comparten varias características comunes, tal como sigue. Las secuencias señal contienen un dominio N en sus extremos N-terminal, que es una región hidrófila que comprende uno o más residuos cargados positivamente, y un dominio H que sigue al dominio N, que es una región hidrófoba algo más larga. En el caso de E. coli, la secuencia señal comprende aproximadamente 18-30 aminoácidos. El dominio N contiene muchos aminoácidos catiónicos, tales como Lys o Arg, y por tanto, tiene una carga neta positiva. En el dominio H, se encuentran muchos aminoácidos hidrófobos, tales como Ala o Leu, y son muy poco comunes los aminoácidos polares o cargados, tales como Pro, Lys, Arg, Asn o Glu, en el dominio H. Un gran número de aminoácidos, tales como residuos de Ala o Leu, forman una estructura de hélice \alpha para facilitar la penetración de la membrana. Un dominio C se sitúa entre el dominio H y una parte realmente secretada de una proteína. El dominio C es menos hidrófobo y contiene una secuencia que una peptidasa señal tal como LebB o LspA puede reconocer. No ha habido informes sobre un sitio exacto escindido por la peptidasa señal, normalmente se sabe que la peptidasa señal escinde principalmente detrás de la secuencia Ala-X-Ala en el dominio C. Las preproteínas que contienen la secuencia señal anterior llegan a la membrana celular a través de la interacción con varias proteínas, y se pliegan para dar sus formas maduras a través de la escisión de una región específica del péptido señal. Tal secuencia señal es muy importante en estrategias para expresar una proteína deseada en la superficie celular o en el entorno extracelular. Las proteínas extrañas y las proteínas de fusión deben transportarse de manera estable hasta el entorno extracelular con una alta eficacia. Normalmente, las proteínas de la superficie celular que tienen una excelente capacidad secretora son útiles para la expresión en la superficie celular de proteínas extrañas o proteínas de fusión, que normalmente tienen secuencias señal secretoras que pueden ofrecer una excelente eficacia de
secreción.

Preparación de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención

La proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención se prepara generalmente (a) preparando un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión simple, utilizando un gen que codifica para un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina y un gen que codifica para el dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria; (b) insertando mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción en el constructo de ADN preparado que codifica para una proteína monomérica de fusión simple y un gen idéntico al gen que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, respectivamente; (c) escindiendo la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción en el constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión simple y el gen que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, utilizando la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento; (d) ligando los fragmentos de ADN escindidos, utilizando una ligasa, para producir un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica (véase la figura 2); (e) uniendo operativamente el constructo de ADN preparado que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica a un vector para producir un plásmido de expresión recombinante; (f) transformando o transfectando una célula huésped con el plásmido de expresión recombinante; y (g) cultivando el transformante o transfectante en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica y luego aislando y purificando una proteína dimérica de fusión concatemérica de interés.

Se produce mediante PCR un fragmento de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, utilizando un cebador que contiene una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción específica y una secuencia que codifica para una secuencia líder, y un cebador que contiene una secuencia antisentido que codifica para el extremo 3' de un dominio extracelular soluble y una parte del extremo 5' de una región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina.

Se produce mediante PCR un fragmento de ADN que codifica para una región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, utilizando un cebador que contiene una secuencia que codifica para una parte del extremo 3' de un dominio extracelular soluble de la proteína que participa en la respuesta inmunitaria y una secuencia que codifica para el extremo 5' de la región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, y otro cebador que tiene una secuencia antisentido que codifica para una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción específica y el extremo 3' de una región específica del fragmento Fc de una molécula de
inmunoglobulina.

El fragmento de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria y el fragmento de ADN que codifica para una región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, tal como se describieron anteriormente, se mezclan en un tubo de ensayo. Tras la desnaturalización, el ADN se vuelve a hibridar. Luego, se produce un fragmento de ADN bicatenario completo mediante polimerización utilizando ADN polimerasa en el extremo 3' de cada híbrido de ADN. Utilizando el fragmento de ADN bicatenario resultante, se lleva a cabo otra reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el cebador que tiene una secuencia que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria y el cebador que codifica para el extremo 3' de una región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, con el fin de amplificar un gen de fusión de inmunoglobulina que comprende una secuencia correspondiente al fragmento de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria y una secuencia correspondiente al fragmento de ADN que codifica para una región específica del fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina.

Se introduce una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción mediante PCR en el gen de fusión de inmunoglobulina amplificado y el fragmento de ADN que tiene una secuencia que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria. La secuencia de reconocimiento se escinde entonces con una enzima de restricción y las regiones escindidas se ligan utilizando una ligasa, produciéndose así un gen de fusión de inmunoglobulina concatemérica.

El gen de fusión de inmunoglobulina puede incluir además una secuencia señal para estimular la secreción extracelular de una proteína codificada por el mismo. Por ejemplo, la molécula de CTLA-4 contiene una secuencia líder única que tiene una redundancia sumamente hidrófila en su extremo N-terminal y que es anómalamente larga y sumamente soluble en agua (Harper, K. et al., J. Immunol. 147:1037-1044; y Brunet, J.F. Nature 328:267-270, 1987). Generalmente, la mayoría de las proteínas de la superficie celular o proteínas secretoras tienen una secuencia líder que comprende 20-24 aminoácidos sumamente hidrófobos en sus extremos N-terminal. Sin embargo, la molécula de CTLA-4 utilizada en la presente invención comprende un total de 37 residuos: 16 aminoácidos hidrófilos en su extremo N-terminal y 21 aminoácidos sumamente hidrófobos típicos en sus regiones transmembrana. En el método convencional de preparación de proteínas de fusión CTLA4Ig, la secuencia líder de la molécula de CTLA-4 se sustituyó por una secuencia líder de oncostatina M (Linsley, P.S. et al., J. Exp. Med. 174:561-569, 1991) o IL-6 (Yamada, A, et al., Microbiol. Immunol. 40:513-518, 1996). Los presentes inventores demostraron que es preferible una molécula de CTLA-4 que contiene una secuencia líder que tiene una secuencia "MRTWPCTLLFFIPVFCKA" en lugar de la secuencia de aminoácidos que consiste en 16 aminoácidos,"ACLGFQRHKAQKNLAA", y se consigue fácilmente la secreción de una proteína expresada en el entorno extracelular, tal como se describe en la publicación de patente internacional número WO98/31820.

Se prepara un plásmido de expresión recombinante insertando el gen de fusión de inmunoglobulina en un vector y luego introduciéndolo en una célula huésped para producir un transformante o transfectante. Puede obtenerse una proteína dimérica de fusión concatemérica de interés cultivando la célula transformante o transfectante y aislando y purificando una proteína de fusión concatemérica.

Una célula huésped útil para la preparación de la proteína dimérica de fusión concatemérica según la presente invención se selecciona preferiblemente entre líneas celulares de médula ósea, células CHO, células COS de mono, células 293 de riñón embrionario humano y células de insecto infectadas con baculovirus. Un polipéptido de interés, producido en tal sistema de expresión, se secreta a un medio de cultivo como un cuerpo de inclusión. Luego, puede purificarse la proteína dimérica de fusión concatemérica mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A o proteína G. De hecho, los sistemas eficaces de expresión de mamíferos y tales sistemas de purificación son muy útiles en la expresión de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria en una forma dimérica, y el aislamiento de tales proteínas.

Preparación de la proteína dimérica de fusión concatemérica glucosilada según la presente invención

Las proteínas secretoras producidas en células eucariotas como células huésped se modifican mediante glucosilación. La glucosilación se sabe que influye en la estabilidad y la funcionalidad in vivo, así como en las propiedades físicas de una proteína. Por tanto, un aspecto preferido de la presente invención incluye facilitar la producción de una proteína dimérica de fusión concatemérica de interés utilizando técnicas de ADN recombinante y las líneas celulares animales mencionadas anteriormente como células huésped, y unir cadenas de azúcar adicionales a un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria.

Se conocen dos modelos de glucosilación. Uno es la glucosilación de unión a O, en la que un oligosacárido se une a un residuo de serina o treonina, y el otro es la glucosilación de unión a N, en la que el oligosacárido se une a un residuo de asparagina. La glucosilación de unión a N se produce en una secuencia de aminoácidos específica, particularmente, Asn-X-Ser/Thr, en la que X es cualquier aminoácido excluyendo la prolina. El oligosacárido de unión a N tiene una estructura distinta del oligosacárido de unión a O, y los residuos glucosilados hallados en el tipo de unión a N también difieren de los del tipo de unión a O. Por ejemplo, la N-acetilgalactosamina se une invariablemente a serina o treonina en el oligosacárido de unión a O, mientras que la N-acetilgalactosamina se une a asparaginas en todos los oligosacáridos de unión a N. Los oligosacáridos de unión a O contienen generalmente sólo 1-4 residuos de azúcar. Por el contrario, los oligosacáridos de unión a N comprenden 5 o más residuos de azúcar, que incluyen esencialmente N-acetilglucosamina y manosa.

Según la presente invención, para permitir la glucosilación de unión a O o de unión a N adicional, se alteran uno o más nucleótidos en una secuencia de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, y el ADN resultante se expresa en una célula huésped animal adecuada para inducir la glucosilación utilizando el sistema del huésped. Según un aspecto de la presente invención, la proteína dimérica de fusión concatemérica glucosilada según la presente invención puede prepararse alterando una secuencia de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, para inducir o aumentar la glucosilación de unión a N añadiendo la secuencia Asn-X-Ser/Thr.

La alteración de una secuencia de ADN para introducir glucosilación puede realizarse según el método convencional común en la técnica. En un aspecto preferido de la presente invención, para proteger la proteína de fusión concatemérica, especialmente los dos dominios extracelulares solubles, del ataque de proteinasas intercelulares y aumentar así su semivida en el suero, puede prepararse un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica multiglucosilada utilizando PCR, que introduce sitios de multiglucosilación en la región de unión entre los dos dominios extracelulares solubles. En un aspecto específico de la presente invención, pueden introducirse secuencias peptídicas con motivos de glucosilación en la proteína de fusión concatemérica, tal como sigue. Se prepara un fragmento de ADN realizando una PCR, utilizando un cebador que codifica para una secuencia líder de un dominio extracelular soluble y un sitio de restricción de EcoRI, y un cebador antisentido en el que una parte de una secuencia de nucleótidos que codifica para una parte del extremo 3' de un primer dominio extracelular soluble y una parte del extremo 5' de un segundo dominio extracelular soluble se sustituye por secuencias con motivos de glucosilación. Se prepara otro fragmento de ADN realizando una PCR, utilizando un cebador en el que una parte de una secuencia de nucleótidos que codifica para una parte del extremo 3' de un primer dominio extracelular soluble y una parte del extremo 5' de un segundo dominio extracelular soluble se sustituye por secuencias con motivos de glucosilación, y un cebador antisentido que codifica para el extremo 3' de una parte Fc de IgG1 y un sitio de restricción de XbaI. Luego, se lleva a cabo una PCR secundaria en un tubo de ensayo utilizando los dos fragmentos de ADN.

Según una realización de la presente invención, los dominios extracelulares solubles útiles en la presente invención incluyen dominios extracelulares solubles de TNFR1, TNFR2, CD2 y CTLA-4. Su aplicación se describirá en detalle con referencia a las figuras, lista de secuencias y ejemplos adjuntos.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), que se conoce como la hormona caquectina, y el factor de necrosis tumoral beta (TNF-\beta), que también se conoce como linfotoxina, son citocinas multifuncionales, que inducen inflamación, respuesta inmunitaria celular, septicemia, citotoxicidad, caquexia, artritis reumatoide, enfermedades relacionadas con la inflamación (Tartaglia, L.A. et al., Immunol. Today 13:151, 1992) y reacción antivírica (Butler, P., Peptide Growth Factor II, 1990, editorial Springer, Berlín, págs. 39-70). Tales acciones de TNF-\alpha y TNF-\beta, incluyendo la actividad citotóxica, se originan de su unión a los receptores de TNF en una forma trimérica (Eck, M.J. et al., J. Biol. Chem. 267:2119, 1992). Como receptores de TNF, se conocen un tipo I de 55 kDa (TNFR1 o p55) y un tipo II de aproximadamente 75 kDa (TNFR2 o p75) (Smith, C.A. et al., Science 248:1019, 1990; Loetscher, H. et al., Cell 61:351, 1990; y Schall et al., Cell 61:361, 1990). Los dos receptores tienen una afinidad similar por TNF-\alpha y TNF-\beta (Schall et al., Cell 61:361, 1990). Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de tales receptores solubles tienen efectos de inhibición de la acción de TNF-\alpha y TNF-\beta, inhibiendo la unión de TNF-\alpha y TNF-\beta a sus receptores en la superficie celular, lo que se sabe que es eficaz para reducir la inflamación dependiente de TNF.

Entre los antígenos de la superficie celular que regulan la respuesta inmunitaria, las moléculas coestimuladoras CD2 y CTLA-4, que inducen la estimulación secundaria para proporcionar una activación suficiente de las células T, cuando están en una forma soluble, también pueden utilizarse para el tratamiento de diversas enfermedades inmunológicas según el mismo método que para los receptores de TNF. La respuesta inmunitaria se alcanza mediante la unión de las moléculas antigénicas de la superficie celular de las células presentadoras de antígeno (APC) a receptores específicos de los linfocitos T, es decir, moléculas antigénicas de APC de función leucocitaria y de linfocitos T, y cuando no se produce una señal coestimuladora tal como una señal secundaria durante la presentación de antígeno, los linfocitos T se eliminan mediante apoptosis o inhibición de la activación clonal. CD2 es un antígeno de función leucocitaria en los linfocitos T, que se une a LFA-3 en APC y participa en la adhesión y coestimulación de los leucocitos, así como en estimular la activación de las células T mediante la coestimulación con CD28. CTLA-4 se expresa tras la activación de los linfocitos T, y su nivel de expresión aumenta en la fase de reposo. CTLA-4 tiene una afinidad de unión a la molécula de B7 de APC más de 20 veces superior a la de CD28, y transduce señales que inhiben la activación de los linfocitos T tras la unión a B7.

En un aspecto específico de la presente invención, se proporcionan una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc, designada por la secuencia SEQ ID NO: 6; una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR2-TNFR2/Fc, designada por la secuencia SEQ ID NO: 8; una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc, designada por la secuencia SEQ ID NO: 18; y una proteína monomérica de fusión concatemérica CTLA4-CTLA4/Fc, designada por la secuencia SEQ ID NO: 20.

En otro aspecto específico de la presente invención, se proporcionan un constructo de ADN (TNFR1-TNFR1-IgG) que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 5; un constructo de ADN (TNFR2-TNFR2-IgG) que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR2-TNFR2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 7; un constructo de ADN (CD2-CD2-IgG) que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 17; y un constructo de ADN (CTLA4-CTLA4-IgG) que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CTLA4-CTLA4/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 19.

En otro aspecto específico de la presente invención, se proporcionan un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-Top10' operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 5; un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-Top10' operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR2-TNFR2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 7; un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 17; y un plásmido de expresión recombinante pCT44Ig operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CTLA4-CTLA4/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 19. Los plásmidos de expresión recombinantes se depositan en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) y se les asignaron los números de registro KCCM-10288, KCCM-10291, KCCM-10402 y KCCM-10400, respectivamente. El depósito en KCCM se mantendrá en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.

En un aspecto específico adicional de la presente invención, se proporcionan una célula huésped de mamífero (por ejemplo, TR11Ig-CHO) transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-Top10' a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR1-TNFR1/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 5; una célula huésped de mamífero (por ejemplo, TR22Ig-CHO) transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-Top10' operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica TNFR2-TNFR2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 7; una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CD2-CD2/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 17; y una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pCT44Ig operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica CTLA4-CTLA4/Fc, designado por la secuencia SEQ ID NO: 19. Se depositan en KCCM, una línea celular de ovario de hámster chino TR11Ig-CHO transfectada con el plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-Top10' y una línea celular de ovario de hámster chino TR22Ig-CHO transfectada con el plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-Top10', habiéndosele asignado a la primera línea celular el número de registro KCLRF-BP-0046. El depósito en KCCM se mantendrá en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.

En un aspecto específico todavía adicional de la presente invención, se proporcionan una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR1-TNFR1/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designada por la secuencia SEQ ID NO: 10; una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR2-TNFR2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designada por la secuencia SEQ ID NO: 12; una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCD2-CD2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designada por la secuencia SEQ ID NO: 22; y una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCTLA4-CTLA4/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designada por la secuencia SEQ ID NO: 24.

En un aspecto específico todavía adicional de la presente invención, se proporcionan un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR1-TNFR1/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 9; un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR2-TNFR2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 11; un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCD2-CD2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 21; y un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCTLA4-CTLA4/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 23. Con el fin de producir un péptido con motivos de glucosilación, se diseña un conjunto de cebadores (cebadores directos e inversos), que son complementarios a una secuencia de nucleótidos correspondiente a la región de unión entre los dominios extracelulares solubles de las proteínas de fusión concatemérica de TNFR/Fc, CD2/Fc y CTLA4/Fc, además de contener codones que codifican para asparagina (N) (ATT y AAC) o codones que codifican para serina (S) y treonina (T) (TCC; y ACC, ACG y ACA, respectivamente) con los que puede sustituirse cualquier codón en el gen de la proteína de fusión concatemérica. Cuando se diseña el cebador, puede determinarse la selección de una entre una pluralidad de secuencias de aminoácidos dependiendo de una condición que permita la mínima sustitución de la secuencia de nucleótidos y la temperatura de fusión (T_{f}) de cada cebador.

En un aspecto específico todavía adicional de la presente invención, se proporcionan un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR1-TNFR1/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 9; un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR2-TNFR2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 11; un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCD2-CD2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 21; y un plásmido de expresión recombinante Pct44Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCTLA4-CTLA4/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 23. Los plásmidos de expresión recombinantes se depositan en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) y se les asignaron los números de registro KCCM-10404, KCCM-10407, KCCM-10401 y KCCM-10399, respectivamente. El depósito en KCCM se mantendrá en las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.

En un aspecto específico todavía adicional de la presente invención, se proporcionan una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pTR11Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR1-TNFR1/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 9; una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pTR22Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgTNFR2-TNFR2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 11; una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pCD22Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCD2-CD2/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia SEQ ID NO: 21; y una célula huésped de mamífero transformada o transfectada con un plásmido de expresión recombinante pCT44Ig-MG operativamente unido a un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica mgCTLA4-CTLA4/Fc que contiene péptidos con motivos de glucosilación, designado por la secuencia
SEQ ID NO: 23.

Las proteínas diméricas de fusión concatemérica de la presente invención pueden aislarse de un medio de cultivo, tras cultivar los transformantes o transfectantes según la presente invención. Las proteínas diméricas de fusión concatemérica pueden participar en la respuesta inmunitaria, tal como se describe en la tabla 1, anteriormente, y así son útiles como agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y herramientas de laboratorio según los tipos de la proteína y los expertos habituales en la técnica conocen bien su uso. En particular, cuando se utilizan como agentes terapéuticos, las proteínas diméricas de fusión concatemérica pueden aplicarse en una cantidad terapéuticamente eficaz común en la técnica y se entenderá que tal cantidad puede variar dependiendo de diversos factores incluyendo la actividad del compuesto utilizado, la edad, peso corporal, estado de salud, sexo y dieta del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la combinación de fármacos y el estado patogénico de una enfermedad específica que va a prevenirse o tratarse. Además, cuando se utilizan como agentes terapéuticos, se entenderá que las proteínas diméricas de fusión concatemérica según la presente invención pueden aplicarse mediante los métodos y las vías normales para la administración de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria, que los expertos habituales en la técnica conocen.

La presente invención se explicará con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos, junto con los dibujos adjuntos. Sin embargo, los siguientes ejemplos se facilitan sólo para ilustrar la presente invención y la presente invención no se limita a ellos. Por conveniencia en la descripción de la presente invención, se resume la información sobre los constructos de ADN, plásmidos de expresión recombinantes y las líneas celulares transformadas, que se preparan según los ejemplos, más adelante, y los cebadores utilizados y sus números de registro, en las tablas 8 y 9, de a continuación.

TABLA 8 Información sobre los constructos de ADN y sus números de registro

8

TABLA 9 Información sobre los cebadores

9

10

Ejemplo 1 TNFR humano A. Fabricación de un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc (figura 1 y figura 5) a. Fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR1

Se construyó un gen de fusión que codifica para el dominio extracelular soluble del receptor de TNF humano de tipo I (TNFR1, p55) y un fragmento Fc de inmunoglobulina humana G1 mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito en la técnica anterior (Holten et al., Biotechniques 8:528, 1990).

Se construyó un fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR1 mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25) con un sitio de restricción de EcoRI y la secuencia que codifica para la secuencia líder (la secuencia de aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 2), y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26) con la secuencia que codifica para una parte de los extremos 3' de dicho dominio extracelular soluble de TNFR1 (TNFR1-ED) y los extremos 5' de la región bisagra de la inmunoglobulina G1 (IgG1). El ADNc molde para esta reacción se construyó mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y ARNm extraído de los monocitos (linfocitos T) de adultos sanos.

Tras extraerse sangre a los adultos sanos y diluirse 1:1 con RPMI-1640 (Gibco BRL, EE.UU.), se obtuvo la capa de linfocitos T que se formó en la parte superior mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Hypaque (Amersham, EE.UU.). Con el fin de llevar la concentración de las células hasta 5 X 10^{5} células/ml, las células se lavaron con RPMI-1640 3 veces y se añadió medio de cultivo RPMI-1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco BRL, EE.UU.) y se cultivó a 37ºC durante dos días en el incubador con 5% de CO_{2} tras añadir leucoaglutinina hasta 3,5 \mug/ml (Pharmacia, EE.UU.).

Se purificaron los ARNm utilizando el kit de purificación de ARNm Tri-Reagent (MRC, EE.UU.). En primer lugar, se lavaron 2 X 10^{7} linfocitos T humanos con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) 3 veces y luego se mezcló 1 ml de Tri-Reagent varias veces para disolver el ARN. Tras añadir 0,2 ml de cloroformo a este tubo y mezclar meticulosamente, este tubo se incubó a temperatura ambiente (TA) durante 15 min., luego se centrifugó a 15.000 rpm, a 4ºC, durante 15 min. La parte superior de esta disolución se transfirió a un tubo de 1,5 ml y se añadieron 0,5 ml de isopropanol, y después se centrifugó a 15.000 rpm, a 4ºC, durante 15 min. Tras desechar el sobrenadante, el sedimento se resuspendió con 1 ml de agua tridestilada tratada con 75% de etanol - 25% de DEPC (pirocarbonato de dietilo) (Sigma, EE.UU.) y luego se centrifugó a 15.000 rpm, a 4ºC, durante 15 min. Tras retirar completamente el sobrenadante y secar al aire para eliminar el residuo de etanol, el ARN se resuspendió en 50 \mul de agua tridestilada tratada con DEPC.

Se sintetizó el ADNc primario mezclando 2 \mug de ARNm purificado y 1 \mul de cebador oligo dT (dT30, Promega, EE.UU.) hasta 10 \muM en un tubo de 1,5 ml, calentando a 70ºC durante 2 min. y enfriando en hielo durante 2 min. Después de esto, la mezcla se añadió con 200 U de transcriptasa inversa de M-MLV (virus de la leucemia murina de Moloney) (Promega, EE.UU.), 10 \mul de 5 x tampón de reacción (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM y DTT 50 mM), 1 \mul de dNTP (10 mM cada uno, Takara, Japón) y agua tridestilada tratada con DEPC hasta 50 \mul, luego se hicieron reaccionar, a 42ºC, durante 1 hora.

b. Fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de inmunoglobulina

Se construyó un fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de inmunoglobulina G1 mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27) con la secuencia que codifica para una parte de los extremos 3' de dicho dominio extracelular soluble de TNFR y el extremo 5' de la región bisagra de la inmunoglobulina G1 (IgG1) y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con un sitio de restricción de XbaI y la secuencia que codifica para los extremos 3' de Fc de IgG1. El ADNc molde para esta reacción se construyó mediante RT-PCR y ARNm extraído de células de sangre periférica (linfocitos B) de pacientes convalecientes con pirexia de origen desconocido.

c. Constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc

Tras mezclarse en el mismo tubo un fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR1 y un fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de una inmunoglobulina, producidos tal como se describió anteriormente, se indujo la unión complementaria entre la secuencia común (la secuencia que incluye el extremo 3' del dominio extracelular soluble de TNFR1 y el extremo 5' de la región bisagra de IgG1). Utilizando esta mezcla como molde, se amplificó el constructo de ADN que incluye el fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR1 y el fragmento de ADN que codifica para el fragmento Fc de IgG1, mediante PCR utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25) con la secuencia que codifica para el extremo 5' de TNFR1 y otro cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con la secuencia que codifica para el extremo 3' de Fc de IgG1. El gen construido incluía una secuencia líder para facilitar la secreción de la proteína tras la expresión.

d. Clonación del constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc

Se sometió a restricción el constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc, tal como se describió anteriormente, con EcoRI y XbaI, y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible comercialmente, pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.), en el sitio de EcoRI/XbaI. Se identificó la secuencia de una región codificante total mediante la secuenciación del ADN (SEQ ID NO: 1). Esta proteína de fusión producida se designó por TNFR1/Fc, como proteína monomérica de fusión simple y la forma elíptica mostrada en la figura 1 representa la estructura de un producto de expresión primario del gen de fusión. La secuencia deducida de aminoácidos de la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc correspondió a la SEQ ID NO: 2.

B. Fabricación de un constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc (figura 1 y figura 5) a. Fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR2

Se construyó un gen de fusión que codifica para el dominio extracelular soluble del receptor de TNF humano de tipo II (TNFR2, p75) y un fragmento Fc de inmunoglobulina humana G1 mediante el mismo método que el de TNFR1/Fc.

Se construyó un fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR2 mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29) con un sitio de restricción de EcoRI y la secuencia que codifica para la secuencia líder (la secuencia de aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 4), y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30) con la secuencia que codifica para una parte de los extremos 3' de dicho dominio extracelular soluble de TNFR2 (TNFR2-ED) y los extremos 5' de la región bisagra de la inmunoglobulina G1 (IgG1). El ADNc molde para esta reacción se construyó mediante RT-PCR de ARNm extraído de los monocitos (linfocitos T) de adultos sanos.

b. Constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc

Tras mezclarse en el mismo tubo un fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR2 y un fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de una inmunoglobulina G1, producidos tal como se describió anteriormente, se indujo la unión complementaria entre la secuencia común (la secuencia que incluye el extremo 3' del dominio extracelular soluble de TNFR2 y el extremo 5' de la región bisagra de IgG1). Utilizando esta mezcla como molde, se amplificó el constructo de ADN que incluye el fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR2 y que codifica y el fragmento de ADN que codifica para el fragmento Fc de IgG1, mediante PCR utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29) con la secuencia que codifica para el extremo 5' de TNFR2 y otro cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con la secuencia que codifica para el extremo 3' de Fc de IgG1. El gen construido incluye una secuencia líder para facilitar la secreción de la proteína tras la expresión.

c. Clonación del constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc

Se sometió a restricción el constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc, tal como se describió anteriormente, con EcoRI y XbaI, y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible comercialmente, pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.), en el sitio de EcoRI/XbaI. Se identificó la secuencia de una región codificante total mediante la secuenciación del ADN (SEQ ID NO: 3). Esta proteína de fusión producida se designó por TNFR2/Fc, como proteína monomérica de fusión simple y la forma elíptica mostrada en la figura 1 representa la estructura de un producto de expresión primario del gen de fusión. La secuencia deducida de aminoácidos de la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc correspondió a la SEQ ID NO: 4.

C. Fabricación de un constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR1-TNFR1/Fc (figura 2 y figura 5)

Con el fin de fabricar un gen de fusión que comprende la forma concatemérica en el dominio extracelular soluble de TNFR1, es decir, el constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR1-TNFR1/Fc, se insertó el sitio de restricción de BamHI respectivamente en la secuencia del dominio extracelular soluble de TNFR1 y el constructo de ADN, producido como anteriormente, que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc mediante PCR, y luego se unieron mediante una ligasa las regiones de cada fragmento sometidas a restricción con BamHI. El constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc, producido como anteriormente, se utilizó como el molde de esta reacción.

Se amplificó el fragmento del dominio extracelular soluble de TNFR1 con el sitio de restricción de BamHI en el extremo 3' mediante PCR, utilizando un cebador correspondiente a los nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y otro cebador correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33, y el otro fragmento de la proteína monomérica de fusión simple de TNFR1/Fc con el sitio de restricción de BamHI en el extremo 5' se amplificó mediante PCR, utilizando un cebador correspondiente a los nucleótidos de SEQ ID NO: 28 y otro cebador correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 32, respectivamente. Se realizó una PCR añadiendo 1 \mul de ADNc primario, 2 U de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, EE.UU.), 10 \mul de 10X tampón de reacción [Tris-HCl 200 mM, pH 8,75, (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, KCl 100 mM, MgCl_{2} 20 mM], 1% de Triton^{MR} X-100, BSA 1 mg/ml, 3 \mul de cebador 1 (10 \muM), 3 \mul de cebador 2 (10 \muM), 2 \mul de dNTP (10 mM cada uno) y agua tridestilada hasta 100 \mul. La condición de reacción fue la siguiente; 94ºC, 5 min.; 95ºC, 1 min.; 58ºC, 1 min. 30 seg.; 72ºC, 1 min. durante 31 ciclos; y 72ºC, 15 min. para hacer que el producto de PCR fuese de extremos completamente romos.

Tras someter a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8%, se purificó el producto de PCR mediante el kit de extracción de gel Qiaex II (Qiagen, EE.UU.). El producto de PCR purificado se sometió a restricción con BamHI y se extrajo mediante métodos de extracción con fenol-cloroformo. Posteriormente, se unieron mediante una ligasa dos clases de fragmentos de ADN sometidos a restricción con BamHI.

D. Fabricación de un constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR2-TNFR2/Fc (figura 2 y figura 5)

Tras insertarse un sitio de restricción de BamHI, respectivamente, en la secuencia del dominio extracelular soluble de TNFR21 y el constructo de ADN, producido tal como se describió anteriormente, que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de TNFR2/Fc mediante PCR, se fabricó un constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR2-TNFR2/Fc uniendo las regiones de cada fragmento sometido a restricción con BamHI, mediante una ligasa.

Se amplificó un fragmento del dominio extracelular soluble de TNFR2 con el sitio de restricción de BamHI en el extremo 3', utilizando un cebador correspondiente a la secuencia de SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35. Se realizó una PCR como la de TNFR1, excepto en que se utilizó como molde un constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión simple de SEQ ID NO: 3, producido como anteriormente. El producto de PCR se purificó mediante el método para TNFR1.

E. Constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR1-TNFR1/Fc con motivo de glucosilación

Se fabricó un fragmento de ADN mediante PCR, utilizando un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37) con la secuencia que codifica para la parte (la secuencia de nucleótidos 565-591 de SEQ ID NO: 5) del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de TNFR1, excepto la secuencia de la región peptídica hidrófoba (la secuencia de aminoácidos 197-216 de SEQ ID NO: 6) en la región de unión del dominio extracelular soluble de TNFR1 y la parte (la secuencia de nucleótidos 649-681 de SEQ ID NO: 5) del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble de TNFR1, y otro cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25) con la secuencia que codifica para el sitio de restricción de EcoRI y la secuencia líder.

Además, se insertaron las cuatro secuencias de aminoácidos totales que codifican para un sitio de glucosilación (la secuencia de aminoácidos 189-191, 192-194, 198-200 y 204-206 de SEQ ID NO: 10) mediante la fabricación del cebador como anteriormente (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 36 y 37) correspondiente a la sustitución del nucleótido 565-567 (CTG, Leu) 574-576 (ACG, Thr), 652-654 (CTA, Leu) y 670-672 (AGA, Arg) de SEQ ID NO: 5, por el nucleótido de AAC (Asn, N); el nucleótido de 571-573 (TGC, Cys) y 580-582 (TTG, Leu) de SEQ ID NO: 5 por el nucleótido de ACC (Thr, T); el nucleótido de 658-660 (GAC, Asp) por el nucleótido de TCC (Ser, S).

En esta reacción, se utilizó como molde el gen (los nucleótidos de SEQ ID NO: 5) que codifica para la forma concatemérica de TNFR1-TNFR1/Fc. Durante la PCR primaria, sólo se indujo a la mitad del cebador antisentido a unirse al gen que codifica para la forma concatemérica de TNFR1-TNFR1/Fc utilizado como molde y, como la reacción en cadena avanzaba, se indujo a la parte no unida del molde a formar un ADN bicatenario completo mediante una polimerasa, y luego esto pudo producir el fragmento de ADN con el estado de unión de la secuencia del extremo 5' que codifica para la parte del segundo dominio extracelular soluble y la secuencia del extremo 3' que codifica para el dominio extracelular soluble de TNFR1 que incluye la secuencia líder. Por tanto, una parte de la secuencia del extremo 5' que codifica para el segundo dominio extracelular soluble tiene la función de que puede unirse al segundo fragmento de ADN, tal como sigue.

Se fabricó el segundo fragmento de ADN mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 36) con la secuencia que codifica para la parte (la secuencia de nucleótidos 565-591 de SEQ ID NO: 5) del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de TNFR1 y la parte (la secuencia de nucleótidos 649-681 de SEQ ID NO: 5) del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble de TNFR1, y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con la secuencia que codifica para un sitio de restricción de XbaI y el extremo 3' de Fc de IgG1. Esta reacción también se realizó tal como se describió anteriormente, es decir, sólo se indujo a la mitad del cebador antisentido a unirse al molde y, en consecuencia, el fragmento de ADN como el descrito anteriormente tenía la secuencia que codifica para el extremo 5' de TNFR1 extracelular que incluye la parte del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble.

Posteriormente, se mezclaron en el mismo tubo las dos clases de fragmentos de ADN resultantes de PCR tal como se describieron anteriormente, se les indujo a unirse entre secuencias comunes y se fusionaron mediante PCR utilizando cebadores (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y 28) que codifican para los extremos 5' y 3' de cada gen concatemérico, y el producto se designó por mgTNFR1-TNFR1-IgG.

F. Constructo de ADN que codifica para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR2-TNFR2/Fc con motivo de glucosilación

Se fabricó un fragmento de ADN mediante PCR, utilizando un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39) con la secuencia que codifica para la parte (la secuencia de nucleótidos 586-606 de SEQ ID NO: 7) del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de TNFR2, excepto la secuencia de la región peptídica hidrófoba (la secuencia de aminoácidos 203-263 de SEQ ID NO: 8) en la región de unión del dominio extracelular soluble de TNFR2 y la parte (la secuencia de nucleótidos 790-807 de SEQ ID NO: 7) del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble de TNFR2, y otro cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29) con la secuencia que codifica para el sitio de restricción de EcoRI y la secuencia líder.

Además, se insertaron las dos secuencias de aminoácidos totales que codifican para un sitio de glucosilación (la secuencia de aminoácidos 199-201 y 206-208 de SEQ ID NO: 12) mediante la fabricación del cebador tal como se describió anteriormente (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y 39) correspondiente a la sustitución del nucleótido 595-597 (GTC, Val) y 799-801 (GGG, Gly) de SEQ ID NO: 7, por el nucleótido de AAC (Asn, N).

En esta reacción, se utilizó como molde el gen (los nucleótidos de SEQ ID NO: 7) que codifica para la forma concatemérica de TNFR2-TNFR2/Fc. Durante la PCR primaria, sólo se indujo a la mitad del cebador antisentido a unirse al gen que codifica para la forma concatemérica de TNFR2-TNFR2/Fc utilizado como molde y, como la reacción en cadena avanzaba, se indujo a la parte no unida del molde a formar un ADN bicatenario completo mediante una polimerasa, y luego esto pudo producir el fragmento de ADN con el estado de unión de la secuencia del extremo 5' que codifica para la parte del segundo dominio extracelular soluble y la secuencia del extremo 3' que codifica para el dominio extracelular de TNFR2 que incluye la secuencia líder. Por tanto, una parte de la secuencia del extremo 5' que codifica para el segundo dominio extracelular soluble tiene la función de que puede unirse al segundo fragmento de ADN, tal como sigue.

Se fabricó el segundo fragmento de ADN mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 38) con la secuencia que codifica para la parte (la secuencia de nucleótidos 586-606 de SEQ ID NO: 7) del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de TNFR2 y la parte (la secuencia de nucleótidos 790-807 de SEQ ID NO: 7) del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble de TNFR2, y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con la secuencia que codifica para un sitio de restricción de XbaI y el extremo 3' de Fc de IgG1. Esta reacción también se realizó, es decir, sólo se indujo a la mitad del cebador antisentido a unirse al molde y, en consecuencia, el fragmento de ADN como el descrito anteriormente tenía la secuencia que codifica para el extremo 5' de TNFR2 extracelular que incluye la parte del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble.

Posteriormente, se mezclaron en el mismo tubo las dos clases de fragmentos de ADN resultantes de PCR, producidas como anteriormente, se les indujo a unirse entre secuencias comunes y se fusionaron mediante PCR utilizando cebadores (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y 28) que codifican para los extremos 5' y 3' de cada gen concatemérico, y el producto se designó por mgTNFR2-TNFR2-IgG.

G. Clonación de los constructos de ADN que codifican para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR-TNFR/Fc y sus formas glucosiladas

Se clonaron los constructos de ADN que codifican para la proteína monomérica de fusión concatemérica de TNFR-TNFR/Fc y sus formas glucosiladas como anteriormente, insertándolos en pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.) en el sitio de EcoRI/XbaI. Estas proteínas de fusión producidas se designaron por TNFR1-TNFR1/Fc y TNFR2-TNFR2/Fc, como proteínas monoméricas de fusión concatemérica, y se designaron por mgTNFR1-TNFR1/Fc y mgTNFR2-TNFR2/Fc, como sus formas glucosiladas. Las secuencias deducidas de aminoácidos correspondieron a SEQ ID NO: 6, 8, 10 y 12.

Tras mezclar 10 \mug de pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.), utilizado como vector, con 15 U de EcoRI, 15 U de XbaI, 5 \mul de 10X tampón de reacción (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM, DTT 10 mM, NaCl 500 nM), 5 \mul de BSA al 0,1% (Takara, Japón) y agua tridestilada hasta 50 \mul, se sometió a restricción el ADN mediante incubación a 37ºC durante 2 horas. Tras someter a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8%, se purificó el producto de PCR mediante el kit de extracción de gel Qiaex II (Qiagen, EE.UU.).

Tras mezclar 100 ng de pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.), sometido a restricción con EcoRI y XbaI, con 20 ng del producto de PCR sometido a restricción con la enzima de restricción, se añadieron 0,5 U de ADN ligasa de T4 (Amersham, EE.UU.), 1 \mul de 10X tampón de reacción (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 100 mM, DTT 100 mM, ATP 10 mM) y agua tridestilada hasta 10 \mul, y la mezcla se incubó en un baño de agua, a 16ºC, durante 16 horas. Se preparó E. coli Top10 (Novex, EE.UU.) para células competentes mediante el método de cloruro de rubidio (RbCl, Sigma, EE.UU.) y se transformó y luego se extendió sobre medios LB sólidos que incluían 50 \mug/ml de ampicilina (Sigma, EE.UU.) y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Las colonias formadas se inocularon en 4 ml de medios LB líquidos que incluían 50 \mum/ml de ampicilina y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Se purificó el plásmido mediante el método de lisis alcalina según Sambrook et al. (Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 1.25-1.31, págs. 1.63-1.69, págs. 7.26-7.29, 1989) a partir de 1,5 ml de aquello, y se confirmó la existencia de clonación mediante la restricción de EcoRI y XbaI.

Se identificó la secuencia de una región codificante total mediante el método de secuenciación de ADN del método de terminación de cadena, didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5483, 1977) tal como sigue. La reacción de secuenciación de ADN se realizó según el manual que utiliza un plásmido purificado mediante el método de lisis alcalina, tal como se describió anteriormente, y Sequenase^{MR} ver 2.0 (Amersham, EE.UU.). Tras cargarse la mezcla de reacción como anteriormente sobre el gel de poliacrilamida al 6% y someterse a electroforesis durante 2 horas a una tensión constante de 1.800-2.000 V y 50ºC, se identificó la secuencia de ADN exponiéndolo a una placa de rayos X (Kodak, EE.UU.) después de secarse el gel.

Ejemplos 2 y 3

CD2 y CTLA4

Se construyeron los fragmentos de ADN que codifican para el dominio extracelular soluble de CD2 y CTLA4 mediante PCR, utilizando un cebador [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 43)] con un sitio de restricción de EcoRI y la secuencia codificante [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15)] que codifica para la secuencia líder [CD2 (la secuencia de aminoácidos 1-24 de SEQ ID NO: 14) y CTLA4 (la secuencia de aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 16)] y un cebador antisentido [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 44)] con un sitio de restricción de PstI y la secuencia [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15)] que codifica para el extremo 3' del dominio extracelular soluble de las proteínas tal como se describió anteriormente. El ADNc molde para esta reacción se construyó mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) de ARNm extraído de los monocitos (linfocitos T) de adultos sanos.

También, se construyó un fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de inmunoglobulina G1 mediante PCR, utilizando un cebador (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 42) con un sitio de restricción de PstI y la secuencia que codifica para los extremos 5' de la región constante de IgG1 y un cebador antisentido (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 28) con un sitio de restricción de XbaI y la secuencia que codifica para los extremos 3' de Fc de IgG1. El ADNc molde para esta reacción se construyó mediante RT-PCR y ARNm extraído de células de sangre periférica (linfocitos B) de pacientes convalecientes con fiebre de origen desconocido.

Posteriormente, se sometieron a restricción tanto el fragmento de ADN que codifica para el dominio extracelular soluble de CD2 y CTLA4 como el fragmento de ADN que codifica para el fragmento Fc de inmunoglobulina G1, producidos como se describió anteriormente, con PstI y luego se construyó la forma dimérica simple de los genes CD2/Fc y CTLA4/Fc mediante uniones utilizando ADN ligasa de T4. Los genes construidos incluían una secuencia líder para facilitar la secreción de la proteína después de la expresión.

Los constructos de ADN, tal como se describieron anteriormente, se sometieron a restricción mediante la enzima de restricción de EcoRI y XbaI, y se clonaron insertándolos en un vector de clonación disponible comercialmente, pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.) en el sitio de EcoRI/XbaI. Se identificó la secuencia de una región codificante total mediante secuenciación del ADN (SEQ ID NO: 13 y 15). Estas proteínas de fusión producidas se designaron por CD2/Fc y CTLA4/Fc y las secuencias deducidas de aminoácidos de éstas correspondieron a SEQ ID NO: 14 y 16.

Se realizó una PCR añadiendo 1 \mul de ADNc primario, 2 U de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, EE.UU.), 10 \mul de 10X tampón de reacción [Tris-HCl 200 mM, pH 8,75, (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, KCl 100 mM, MgCl_{2} 20 mM], 1% de Triton^{MR} X-100, BSA 1 mg/ml, 3 \mul de cebador 1 (10 \muM), 3 \mul de cebador 2 (10 \muM), 2 \mul de dNTP (10 mM cada uno) y agua tridestilada hasta 100 \mul. La condición de reacción fue la siguiente; 94ºC, 5 min.; 95ºC, 1 min.; 58ºC, 1 min. 30 seg.; 72ºC, 1 min. durante 31 ciclos; y 72ºC, 15 min. para hacer que el producto de PCR fuese de extremos completamente romos.

Los genes de fusión con forma concatemérica de CD2-CD2/Fc y CTLA4-CTLA4/Fc se construyeron tal como sigue.

Con el fin de fabricar el gen de fusión que comprende la forma concatemérica en el dominio extracelular soluble de CD2 y CTLA4, se insertaron las secuencias del dominio extracelular soluble de CD2 y CTLA4 mediante ligamiento de extremos romos, utilizando una ligasa en la unión entre el dominio extracelular y la inmunoglobulina de los genes de fusión en la forma de dímero simple con extremos romos, utilizando la enzima de restricción PstI y ADN polimerasa de T4. Específicamente, se construyeron constructos de ADN mediante PCR, utilizando un cebador [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 48)] con la secuencia codificante [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15)] que codifica para el extremo de la secuencia líder [CD2 (la secuencia de aminoácido 25 de SEQ ID NO: 14) y CTLA4 (la secuencia de aminoácido 22 de SEQ ID NO: 16)] del dominio extracelular soluble y un cebador antisentido [CD2 (SEQ ID NO: 46) y CTLA4 (SEQ ID NO: 48)] con la secuencia [CD2 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15)] que codifica para el extremo 3' del dominio extracelular soluble como anteriormente. Los genes monoméricos de fusión simple [CD2/Fc (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13) y CTLA4/Fc (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15)] descritos como anteriormente se utilizaron como molde de esta reacción.

También se prepararon CD2/Fc y CTLA4/Fc, que se insertaron en pBluescript KS II (+) en la forma del tipo monomérico simple, para tener un extremo 3' sobresaliente utilizando la enzima de restricción de PstI. El extremo cortado de 3' sobresaliente se sometió a deleción parcial para formar un extremo romo, tratándolo con ADN polimerasa de T4. Con el fin de fabricar genes de fusión en forma de concatémero en el dominio extracelular soluble, se clonaron los dominios extracelulares solubles de CD2 y CTLA4 producidos mediante PCR tal como se describió anteriormente, insertándolos en los extremos cortados del gen monomérico simple preparado con extremos romos. Estas proteínas de fusión producidas se designaron por CD2-CD2/Fc y CTLA4-CTLA4/Fc como proteínas monoméricas de fusión concatemérica y sus secuencias deducidas de aminoácidos correspondieron a SEQ ID NO: 18 y 20, respectivamente.

Los genes de fusión concatemérica en la conformación de la forma multiglucosilada se construyeron tal como sigue.

Se insertó el motivo de glucosilación mediante PCR secundaria con el mezclado en el mismo tubo de un fragmento de ADN producido mediante una PCR que utilizó un cebador que incluye un sitio de restricción de EcoRI y el dominio extracelular soluble con la secuencia líder, y un cebador antisentido con la secuencia que codifica para la parte del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de la forma concatemérica del gen de fusión y la parte del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble con el nucleótido del motivo de glucosilación sustituido; y otro fragmento de ADN producido mediante una PCR que utilizó un cebador con la secuencia que codifica para la parte del extremo 3' del primer dominio extracelular soluble de la forma concatemérica del gen de fusión y la parte del extremo 5' del segundo dominio extracelular soluble con el nucleótido del motivo de glucosilación sustituido, y un cebador antisentido con la secuencia que codifica para el extremo 3' de un fragmento Fc de inmunoglobulina G1 y un sitio de restricción de XbaI.

En el caso del gen de fusión concatemérica de CD2/Fc y CTLA4/Fc, se insertó el motivo de glucosilación mediante PCR utilizando cebadores modificados con los mismos métodos que los de TNFR/Fc, descritos como anteriormente, pero se diferenció del caso de TNFR/Fc en que la secuencia de aminoácidos de unión al dominio extracelular soluble de CD2 y CTL4 se mantuvo igual.

En el proceso de multiglucosilación de la proteína de fusión concatemérica de CD2/Fc y CTLA4/Fc, el caso de CD2/Fc se completó insertando la región peptídica total de dos motivos de glucosilación (la secuencia de aminoácidos de 200-202 y 206-208 de SEQ ID NO: 22) utilizando un cebador fabricado que incluye la sustitución de los nucleótidos de 598-600 (CCT, Pro) y 616-618 (GAG, Glu) de SEQ ID NO: 17 por AAT (Asn, N), y el caso de CTLA4/Fc se completó insertando la región peptídica total de tres motivos de glucosilación (la secuencia de aminoácidos de 136-138, 142-144 y 147-149 de SEQ ID NO: 24) utilizando un cebador fabricado (SEQ ID NO: 51 y 52) que incluye la sustitución de los nucleótidos de 403-405 (GTA, Val) y 424-426 (CCA, Pro) de SEQ ID NO: 19 por AAT (Asn, N); los nucleótidos de 409-411 (GAT, Asp) y 445-447 (GTG, Val) por ACA (Thr, T) y ACG (Thr, T), respectivamente. Estas proteínas de fusión producidas se designaron por mgCD2-CD2/Fc y mgCTLA4-CTLA4/Fc como proteínas monoméricas de fusión concatemérica y sus secuencias deducidas de aminoácidos correspondieron a SEQ ID NO: 22 y 24, respectivamente.

Ejemplo 4 Expresión y purificación de la proteína dimérica de fusión simple / concatemérica de TNFR/Fc

Con el fin de expresar las proteínas de fusión en células CHO-K1 (ATCC CCL-61, ovario, hámster chino, Cricetulus griseus) tras purificarse el ADN del plásmido pBluescript KS II (+) que contiene el gen de fusión de TNFR/Fc a partir de E. coli transformado, se construyeron vectores de expresión de célula animal como un fragmento de TNFR/Fc producido mediante restricción utilizando EcoRI y XbaI que se insertó en el sitio de EcoRI/XbaI de un vector de expresión de célula animal, el plásmido pCR^{TM}3 (Invitrogen, EE.UU.). Y éstos se designaron por plásmido pTR11-Top10' y plásmido pTR22-Top10' y se depositaron como números de registro KCCM 10288 y KCCM 10291, respectivamente, en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 10 de julio de 2001.

Se realizó la transfección mezclando el ADN de, o bien el plásmido pTR11-Top10' o bien el plásmido pTR22-Top10', que incluía los genes de fusión TNFR/Fc, tal como se describieron anteriormente, con el reactivo de Lipofecta-
mina^{MR} (Gibco RBL, EE.UU.). Se inocularon las células CHO-K1 con una concentración de 1 \sim 3 X 10^{5} células/pocillo en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Nunc, EE.UU.) y se incubaron al 50 \sim 80% en medios de 10% de FBS - DMEM, y luego el complejo de ADN-liposoma, que se hizo reaccionar durante 15 \sim 45 minutos con 1 \sim 2 \mug de ADN de, o bien el plásmido pTR11-Top10' o bien el plásmido pTR22-Top10', que incluía los genes de fusión de TNFR/Fc, tal como se describieron anteriormente y 2 \sim 25 \mul de Lipofectamina^{MR} (Gibco BRL, EE.UU.), se añadió a la placa de cultivo tisular en los medios DMEM libres de suero. Tras incubación durante 5 horas, se añadieron medios DMEM con un 20% de suero y las células se incubaron adicionalmente durante 18 \sim 24 horas. Tras la transfección primaria, las células se incubaron durante 3 semanas en medios de 10% de FBS - DMEM con 1,5 mg/ml de geneticina (G418, Gibco BRL, EE.UU.) y se seleccionaron las colonias formadas para la incubación ampliada. La expresión de las proteínas de fusión se analizó mediante ELISA utilizando una IgG de cabra anti-humana marcada con peroxidasa (KPL, EE.UU.).

El ELISA se realizó tal como sigue. En primer lugar, se diluyó 1 mg/ml de una IgG de cabra anti-humana marcada con peroxidasa (KPL, EE.UU.) hasta 1:2.000 con bicarbonato de sodio 0,1 M, de lo cual se añadió una alícuota de 100 \mul a una placa flexible de 96 pocillos (Falcon, EE.UU.) y se selló con una envoltura de plástico, luego se incubó a 4ºC durante 16 horas para que recubriese la superficie de la placa. Después de esto, se lavó 3 veces con tampón de lavado (Tween-20 al 0,1% en 1X PBS) y tampón de dilución (48,5 ml de 1X PBS, 1,5 ml de FBS, 50 \mul de Tween-20) y después se tomó una alícuota de 180 l. Después de añadir por goteo 20 \mul del sobrenadante de cultivo al primer pocillo, se diluyó entonces en serie utilizando una micropipeta y se diluyeron igualmente 0,01 \mug/\mul de inmunoglobulina G humana (Sigma, EE.UU.) como el control positivo y los medios de cultivo de células CHO-K1 no transfectadas como el negativo. Tras la dilución, la placa de ELISA de 96 pocillos (Falcon, EE.UU.) se envolvió con lámina de aluminio y se incubó a 37ºC durante 1 h 30 min., se lavó 3 veces con tampón de lavado. Se diluyó IgG de cabra anti-humana conjugada con peroxidasa (KPL, EE.UU.) hasta 1:5.000 con tampón de dilución, se tomó una alícuota de 100 \mul, se envolvió con lámina de aluminio y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 h. Tras la reacción, esta placa se lavó 3 veces, se coloreó utilizando el sistema de sustrato de peroxidasa en micropocillos TMB (tetrametilbencidina) (KPL, EE.UU.) y se confirmó la existencia de expresión mediante la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 655 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, modelo 550, Japón).

Los transfectantes fabricados como anteriormente se designaron por TR11Ig-CHO y TR22Ig-CHO, el primero de los cuales se depositó como número de registro de KCLRF-BP-00046 en la Fundación Coreana de Investigación en Líneas Celulares (KCLRF) el 7 de julio de 2001. Y se continuó con la adaptación de los transfectantes, tal como se describió anteriormente, a uno de los medios libres de suero, CHO-S-SFM II (Gibco BRL, EE.UU.) para purificar las proteínas producidas por estos transfectantes, tal como sigue. Tras inocularse aproximadamente 3 X 10^{5} células en una placa de 6 pocillos, las células se cultivaron con un 5% de CO_{2}, a 37ºC, durante más de 16 horas para que se adhirieran y se comprobó bajo un microscopio que las células estaban adheridas a aproximadamente el 30 \sim 50% del área de la placa, luego se cultivaron las células en un medio que consistía en 10% de FBS - DMEM y CHO-S-SFM II en una razón de 8:2. Tras cultivar 3 veces el paso en serie a esta razón, se cultivó 3 veces a la razón de 6:4; 3 veces a 4:6; 3 veces a 3:7; 3 veces a 2:8; 3 veces a 1:9 y finalmente se cultivó en medio CHO-S-SFM II al 100%. Y se midió el nivel de expresión mediante ELISA.

Tras cultivarse estas células transfectantes a gran escala en CHO-S-SFM II, se centrifugaron los sobrenadantes que incluían cada proteína de fusión a 200X g durante 12 min. para eliminar los restos celulares y se purificaron las proteínas mediante el método que utiliza la columna de proteína A HiTrap (Amersham, EE.UU.) tal como sigue. Tras pasar 20 mM de fosfato de sodio (pH 7,0, Sigma, EE.UU.) a la velocidad de 1 ml/min durante 2 minutos, se pasaron 10 ml de sobrenadante a la misma velocidad para unir la proteína de fusión a la proteína A. Tras pasar 20 mM de fosfato de sodio (pH 7,0) a la misma velocidad durante 2 minutos para lavar, se fraccionaron en serie 500 \mul de los extractos en un tubo de 1,5 ml a medida que se pasó 0,1 M de ácido cítrico (pH 3,0, Sigma, EE.UU.) a la misma velocidad durante 3 minutos. Esto se ajustó a pH 7,0 utilizando 1 M de Tris (pH 11,0, USB, EE.UU.), se confirmó la presencia de las proteínas de fusión en un tubo mediante ELISA, tal como se describió anteriormente. Las proteínas purificadas se concentraron mediante centrifugación a 2000Xg, a 4ºC, durante 30 minutos utilizando Centricon 30 (Amicon, EE.UU.).

Ejemplo 5 SDS-PAGE de TNFR1-TNFR1/Fc y TNFR2-TNFR2/Fc purificadas (figura 15)

Se sometieron a electroforesis las proteínas purificadas utilizando la columna de proteína A mediante el método de SDS-PAGE en condiciones reductoras añadidas mediante DTT, agente reductor (que destruye el enlace disulfuro) y en condiciones no reductoras excluyendo el DTT. El resultado de la estimación del peso molecular en SDS-PAGE se muestra en la tabla 10. Fue posible confirmar que las proteínas de TNFR/Fc estaban en la forma de un dímero en la célula. El peso molecular deducido a partir de la secuencia de aminoácidos de TNFR1-TNFR1-Ig fue de aproximadamente 70 kDa y se estimó como de aproximadamente 102 kDa en SDS-PAGE. Como esta diferencia podría considerarse como un fenómeno general que se genera en la electroforesis de glucoproteínas, esta característica pareció producirse como resultado de la disminución de la movilidad en la electroforesis por el sitio de glucosilación.

TABLA 10 Peso molecular de TNFR-TNFR/Fc en la SDS-PAGE

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Ejemplo 6 Experimento del efecto de neutralización de las proteínas de fusión TNFR/Fc diméricas de fusión simple / concatemérica sobre la citotoxicidad de TNF\alpha y TNF\beta

Se utilizó una célula L929 [ATCC, Mus musculus (ratón), NCTC clon 929 (derivado de la cepa L; L-929; célula L) para probar el efecto de la proteína de fusión TNFR/Fc sobre la inhibición de la citotoxicidad inducida por TNF\alpha y TNF\beta. Este análisis se basó en la actividad de TNFR de inhibir la citotoxicidad inducida por TNF (Scallon et al., Cytokine 7:759, 1995).

Las células L929 se inocularon para ser 3 X 10^{4} células/pocillo en placas de 96 pocillos, y se incubaron a 37ºC, durante 24 horas, en un incubador de CO_{2}. Posteriormente, se añadió actinomicina D (Sigma, EE.UU.) hasta 3 \mug/ml y las células se incubaron durante 16 \sim 18 horas con TNF\alpha y TNF\beta en la concentración en que se expresa el 100% de citotoxicidad (0,5 \sim 2 ng/ml) y con la muestra de TNFR diluida 10 veces en serie. Luego, las células en la placa de 96 pocillos se tiñeron mediante el reactivo de tinción, violeta cristal (Wako Pure Chemical Industries, Japón) y se estimó la actividad de las células mediante el grado de absorbancia a una longitud de onda de 595 nm utilizando un espectrofotómetro (Bio-Rad, modelo 550, Japón).

Tal como se muestra en la tabla 11 representado por la CI_{50} de cada proteína de fusión TNFR/Fc, las proteínas de fusión concatemérica (TNFR1-TNFR1/Ig y TNFR2-TNFR2/Ig) han mostrado un efecto inhibidor mayor sobre la citotoxicidad inducida por dos clases de TNF que las proteínas de fusión dimérica simple (TNFR1/Ig y TNFR2/Ig). Además, comparado con los efectos del dímero de fusión simple existente y el dímero de proteína de fusión TNFR/Fc de forma concatemérica de la presente invención sobre la inhibición de la citotoxicidad de TNF\alpha (figura 16) y TNF\beta (figura 17), resultó más claro que los dímeros de proteína de fusión TNFR/Fc de forma concatemérica de la presente invención inhibían notablemente la citotoxicidad de TNF\alpha y TNF\beta.

TABLA 11 CI_{50} de la inhibición de la citotoxicidad

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Ejemplo 7 Experimento del efecto supresor de la proteína de fusión CD2/Fc y la proteína de fusión CTLA4/Fc diméricas de fusión simple / concatemérica sobre la proliferación de células inmunitarias activas

Se incubó WT100B1S, una línea celular de linfocitos B que se preparó mediante la transfección de los linfocitos B de un paciente con pirexia con el virus de Ebstein-Barr, en RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS para utilizarlos como células presentadoras de antígeno de los linfocitos T. Tras centrifugar a 2.000 rpm durante 2 min. para precipitarlas, estas células se resuspendieron en RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS para preparar 5,0 X 10^{5} células/ml, luego se irradiaron con 3.000 rd de rayos \gamma.

Se aislaron los linfocitos T de la sangre de un adulto sano utilizando Ficoll-Hypaque (Amersham, EE.UU.), luego se incubaron en RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS hasta 2,0 X 10^{6} células/ml.

Para realizar una reacción mixta de linfocitos (MLR) primaria, se mezclaron 15 ml de cada uno de WT100B1S y linfocitos T en una placa de cultivo celular de 150 mm, y se incubaron durante 3 días, luego se añadieron 15 ml de RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS y se incubaron durante 3 días más. Tras incubar durante 6 días en total, se purificaron los linfocitos T vivos utilizando Ficoll-Hypaque (Amersham, EE.UU.) tal como se describió anteriormente, y los linfocitos T purificados se almacenaron en nitrógeno líquido tras congelarlos utilizando medios que comprenden el 45% de FBS, el 45% de RPMI 1640 y el 10% de DMSO.

Tras descongelarse los linfocitos T que reaccionaron mediante MLR primaria, para realizar una MLR secundaria, las células se lavaron con medio RPMI 1640 2 veces y se hizo que fuesen 3,0 X 10^{5} células/ml en RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS.

Se preparó nuevamente WT100B1S como célula presentadora de antígeno mediante el método tal como se describió anteriormente, luego se preparó mediante irradiación de 3.000 rd de rayos \gamma y para ser 7,5 X 10^{4} células/ml en medio RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS. Tras añadirse 100 \mul de WT100B1S preparado a una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano y mezclarse con las proteínas de fusión CD2/Fc y CTLA4/Fc a una concentración final de 10, 1, 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} \mug/ml, se añadieron 100 \mul de linfocitos T que reaccionaron en la MLR primaria como anteriormente. Tras incubarse durante 2 días en un incubador con 5% de CO_{2}, a 37ºC, se añadieron 100 \mul de RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS y se incubaron durante 2 días más. En las últimas 6 h del cultivo de 6 días en total, las células se incubaron con adición de 1,2 \muCi/ml de ^{3}H-timidina (Amersham, EE.UU.).

Al final del cultivo, se eliminaron los sobrenadantes después de que se realizara una centrifugación de la placa de 96 pocillos a 4ºC, 110 X g durante 10 min., para precipitar los linfocitos T y los sedimentos se lavaron con 200 \mul de 1 X PBS. Se realizó una centrifugación en las mismas condiciones y se eliminó el PBS, luego se añadieron 200 \mul de ácido tricloroacético (TCA, Merck, EE.UU.) enfriado en hielo y se mezclaron durante 2 min., luego se hicieron reaccionar a 4ºC, durante 5 min., para eliminar el residuo de ^{3}H-timidina.

Tras centrifugar en las mismas condiciones que se describieron anteriormente, se eliminaron los sobrenadantes y los linfocitos T se fijaron mediante incubación a 4ºC, durante 5 min., tras añadir 200 \mul de etanol al 70% enfriado en hielo. Se eliminaron los sobrenadantes tras centrifugación, y se eliminó completamente el residuo de ^{3}H-timidina (Amersham, EE.UU.) mediante tratamiento con TCA al 10% con el mismo método que se describió anteriormente.

Se realizó la lisis celular mediante reacción con 100 \mul del 2% de SDS (pH 8,0) y 0,5 N de NaOH a 37ºC, durante 30 min. y los linfocitos T se precipitaron mediante centrifugación a 25ºC, 110 X g durante 10 min., y después se transfirieron 50 \mul de los sobrenadantes a una placa de muestra de 96 pocillos (Wallac, EE.UU.). Tras añadirse 1,5 volúmenes de Optiphase Supermix (Walac, EE.UU.) a los sobrenadantes, se mezclaron durante 5 min., se confirmó la existencia de proliferación de linfocitos T mediante la medición del valor de cpm (cuentas por minuto) de ^{3}H utilizando un contador luminiscencia y de centelleo líquido para microplacas MicroBeta Trilux 1450 (Wallac, EE.UU.).

Ejemplo 8 Experimento del efecto sobre el aumento de la semivida plasmática de las proteínas diméricas de fusión concatemérica glucosiladas en ratón

Se realizó la medición de la semivida plasmática de las proteínas diméricas de fusión concatemérica glucosiladas, [mgTNFR1-TNFR1/Fc]_{2}, [mgTNFR2-TNFR2/Fc]_{2}, [mgCD2-CD2/Fc]_{2} y [mgCTLA4-CTLA4/Fc]_{2} midiendo la concentración de proteínas, utilizando ELISA tras inyectarse por vía i.p. 5 \mug de proteínas de fusión purificadas a ratón (ICR, Samtako, Corea) y se les extrajo sangre a intervalos regulares durante 120 h (5 días) como máximo. Tal como se muestra en la figura 20, figura 21 y figura 22, pudo observarse que la semivida plasmática de las proteínas diméricas de fusión concatemérica glucosiladas ha aumentado en comparación con las correspondientes proteínas diméricas de fusión simple de forma nativa, y podría esperarse el aumento en la eficacia a través del efecto continuo.

Ejemplo 9 Experimento de los efectos de los dímeros de proteína de fusión TNFR/Fc simple / concatemérica sobre la artritis inducida por colágeno en ratón DBA/1

Se desarrolló artritis inducida por colágeno (CIA) mediante inyección de 100 \mug por ratón DBA/1 de colágeno de tipo II disuelto en una concentración de 2 mg/ml en ácido acético 0,05 M y adyuvante Arthrogen-CIA (Chondrex, EE.UU.) en la cola. Se administró una dosis de refuerzo tras 3 semanas, y se utilizó adyuvante incompleto de Freund (Difco, EE.UU.).

Se desarrolló artritis a las 3 \sim 4 semanas después de la inmunización con 100 \mug de colágeno de tipo II en los ratones DBA/1. Se habían observado patas enrojecidas e inflamadas en los ratones a los 3 \sim 5 días tras el inicio, y la artritis inflamatoria duró más de 3 \sim 4 semanas. Aunque la inflamación se alivió finalmente, las articulaciones afectadas permanecieron rígidas de manera permanente. Se midió el grado de artritis 2 \sim 3 veces a la semana, basándose en la tabla 12 que representaba el índice subjetivo de gravedad de la artritis (medida promedio de cinco ratones en cada experimento). Para medir los efectos de TNFR/Fc dimérica de fusión simple y concatemérica sobre CIA; se inyectó por vía i.p. TNFR/Fc o PBS a los ratones. Se inyectaron 10 \mug de TNFR/Fc cada 2 días, durante 19 \sim 45 días en 5 ratones por experimento (flechas en la figura 23). Se inyectó PBS en 5 ratones como control. Tal como se muestra en la figura 7, en el caso de los ratones a los que se les inyectó la proteína de fusión TNFR/Fc de forma dimérica simple existente, pudo observarse que el efecto disminuyó hasta aproximadamente el 26-38% en comparación con las figuras del índice de artritis en los ratones a los que se les inyectó PBS como control, pero disminuyó un 42-55% en el caso en que se inyectaron los dímeros de forma concatemérica, [TNFR1-TNFR1/Fc]_{2} y [TNFR2-TNFR2/Fc]_{2}. Por tanto, pudo demostrarse que las proteínas de fusión TNFR/Fc diméricas de fusión concatemérica han disminuido notablemente la artritis del ratón con respecto a las proteínas de fusión TNFR/Fc diméricas de fusión simple existentes.

TABLA 12 Puntuación de la gravedad de la artritis

13

Los resultados anteriores representaron que las proteínas de fusión TNFR/Fc diméricas de forma concatemérica fueron más eficaces en la disminución de la tasa de desarrollo de CIA que las proteínas diméricas de fusión simple existentes, por tanto, como uso en el tratamiento de la artritis, las composiciones de proteína de forma concatemérica podrían ser tratamientos más eficaces que las composiciones de proteína existentes.

Las proteínas concateméricas, proteínas diméricas de fusión concatemérica y sus proteínas glucosiladas de la presente invención pudieron expresarse con un aumento de la eficacia y estabilidad alta, y producirse con alto rendimiento.

Aplicabilidad industrial

15

16

17

18

19

20

21

22

23

<110> MeDexGen Inc.

\hskip1cm

CHUNG, Yong Hoon

\hskip1cm

HAN, Ji Woong

\hskip1cm

LEE, Hye Ja

\hskip1cm

CHOI, Eun Yong

\hskip1cm

KIM, Jin Mi

\hskip1cm

YIM, Soo Bin

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Método de fabricación de proteínas de fusión a Ig mediante concatemerización, proteínas de fusión TNFR/Fc, CD2/Fc, CTLA4/Fc fabricadas mediante el método, ADN que codifica para las proteínas, vectores que incluyen el ADN y células transformadas mediante el vector TOR

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<170> KopatentIn 1.71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS (secuencia codificante)

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1332)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TNFR1-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (634)..(1335)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (160)..(168)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (433)..(441)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (451)..(459)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión a cebador de PCR de SEQ ID: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (616)..(652)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión a cebador de PCR de SEQ ID: 26 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (616)..(651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión a cebador de PCR de SEQ ID: 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1312)..(1335)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión a cebador de PCR de SEQ ID: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(60)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

24

25

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 444

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1470)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TNFR2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (772)..(1473)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (511)..(519)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (577)..(585)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (754)..(790)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 30 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (754)..(790)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1451)..(1473)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

30

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 490

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

34

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1887

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1884)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TNFR1-TNFR1-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1716)..(1887)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (160)..(168)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (433)..(441)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (451)..(459)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (631)..(639)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (712)..(720)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (985)..(993)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1003)..(1011)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (592)..(628)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 33 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (622)..(655)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1168)..(1204)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 26 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1168)..(1204)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1864)..(1887)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(60)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

37

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 628

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

42

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2160)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TNFR2-TNFR2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1462)..(2163)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (511)..(519)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (577)..(585)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (769)..(777)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1201)..(1209)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1267)..(1275)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (761)..(795)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 35 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (741)..(768)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1444)..(1480)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 30 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1444)..(1480)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2141)..(2163)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

45

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

50

51

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1827

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1824)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mgTNFR1-TNFR1-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1126)..(1827)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (160)..(168)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (433)..(441)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (451)..(459)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (565)..(573)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (574)..(582)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (592)..(600)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (610)..(618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (925)..(933)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (943)..(951)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (545)..(606)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 37 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (559)..(621)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1108)..(1144)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 26 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1108)..(1144)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1804)..(1827)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(60)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

54

55

56

57

58

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 608

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

59

60

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1980

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1977)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mgTNFR2-TNFR2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1279)..(1980)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (511)..(519)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (577)..(585)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (595)..(603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (616)..(624)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1018)..(1026)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1084)..(1092)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (586)..(627)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 39 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (586)..(630)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1261)..(1296)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 30 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1261)..(1296)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1957)..(1980)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

63

64

65

66

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 659

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

68

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1314

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1311)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CD2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (613)..(1314)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (265)..(273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (421)..(429)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (448)..(456)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (589)..(618)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 41 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (611)..(633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1292)..(1314)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(72)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

73

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1131)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CTLA4-IgG

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (433)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(297)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (385)..(393)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (409)..(438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 44 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (430)..(453)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1111)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

83

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1854

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1851)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CD2-CD2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1153)..(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (265)..(273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (421)..(429)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (448)..(456)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (805)..(813)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (961)..(969)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (988)..(996)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (598)..(612)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 46 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (612)..(630)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1128)..(1158)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 41 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1151)..(1173)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1832)..(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(72)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

86

87

88

89

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

90

91

92

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1509

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1506)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CTLA4-CTLA4-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (808)..(1509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(297)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (385)..(393)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (664)..(672)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (760)..(768)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 43

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (418)..(431)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 48 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (432)..(453)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (784)..(813)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 44 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (805)..(826)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1486)..(1509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

94

940

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 502

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

99

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1854

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1851)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mgCD2-CD2-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1153)..(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (265)..(273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (421)..(429)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (448)..(456)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (598)..(606)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (616)..(624)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (805)..(813)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (961)..(969)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (988)..(996)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (588)..(630)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 50 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (588)..(630)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1228)..(1158)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 41 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1151)..(1173)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1832)..(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(72)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

100

101

102

103

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

107

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1509

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1506)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mgCTLA4-CTLA4-IgG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> C_region

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (808)..(1509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región bisagra, CH2, CH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(297)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (385)..(393)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (403)..(411)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)..(432)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (439)..(447)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (664)..(672)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_signal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (760)..(768)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de glucosilación de unión a N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (394)..(456)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 52 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (397)..(460)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (784)..(813)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 44 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (805)..(826)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> primer_bind

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1986)..(1509)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de unión al cebador de PCR de SEQ ID NO: 28 (antisentido)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

109

110

111

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 502

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

115

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR1-EDF-EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattcc ggtctggcat gggcctctcc acc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR1-EDR-IgGh

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaagattt gggctctcgct gtggtgcctg agtcctc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido IgG1-T1F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggactcag gcaccacagc agagcccaaa tcttgtg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido IgG1-R-XbaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR2-EDF-EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattcc gggcacccat ggcgcccgtc gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR2-EDR-IgGh

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaagattt gggctctgcg tcgccagtgc tcccttc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido IgG-T2F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagggagca ctggcgacgc agagcccaaa tcttgtg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR1-CF-BamHI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg ggaacatttc actggtccct cacctag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR1-NR-BamHI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg tcctcagtgc ccttaacatt ctcaatctg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR2-CF-BamHI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcca acgcaactac accctacgcc ccggag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido TNFR2-NR-BamHI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg ctcccttcag ctggggggct g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgTNFR1-TNFR1-IgG-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaagcaacg agaccaacaa gacctgccta cacaacgggt ccagggagaa gaacgatagt

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtg

\hfill

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgTNFR1-TNFR1-IgG-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccctggac ccgttgtgta ggcaggtctt gttggtctcg ttgcttttct tacagttact

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ac

\hfill

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgTNFR2-TNFR2-IgG-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggatgcaa actgcacgtc cccggagccc aacagcacat gccgg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgTNFR2-TNFR2-IgG-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatgtgctg ttgggctccg gggacgtgca gtttgcatcc at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CD2F-EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattca tgagctttcc atgtaaattt gtagcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CD2R-PstI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctctgcagga cagctgacag gctcgacact

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido IgG-F-PstI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctgcagag cccaaatctt gtgac

\hfill

25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CTLA4F-EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattca tgaggacctg gccc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CTLA4R-PstI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctctgcagaa tctgggcacg gttcaggatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CD2-NT-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaagagatt acgaatgcc

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CD2-CT-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaggacag ctgacagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CTLA4-NT-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggataatcat gcacgtggcc cag

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido CTLA4-CT-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagaatct gggcacgg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgCD2-CD2-IgG-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgtcgag aatgtcagct gtcctaaaaa tattacgaat gcc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgCD2-CD2-IgG-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcattcgta atatttttag gacagctgac attctcgaca ctg

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgCTLA4-CTLA4-IgG-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttatgtaa acgatacaga accgtgcaat gattcggata acaaccacac agcccagcct

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctg

\hfill

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR, oligonucleótido mgCTLA4-CTLA4-IgG-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctgggct gtgtggttgt tatccgaatc attgcacggt tctgtatcgt ttacataaat

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctg

\hfill

63

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Claims

1. Proteína dimérica de fusión concatemérica que comprende dos proteínas monoméricas formadas mediante la unión de un concatémero de dos dominios extracelulares solubles idénticos de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria, a una región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina, en la que dichas proteínas monoméricas se unen mediante enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra, y que tiene una estabilidad y efectos terapéuticos mejorados.

2. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 1, en la que la molécula de inmunoglobulina es IgG.

3. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 1, en la que la proteína que participa en la respuesta inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en citocinas, receptores de las citocinas, moléculas de adhesión, receptores del factor de necrosis tumoral, tirosina cinasas de receptores, receptores de quimiocinas y otras proteínas de la superficie celular que contienen un dominio extracelular soluble.

4. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 3, en la que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF, GHR, IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR, R (receptor) del interferón \alpha, R del interferón \beta y R del interferón \gamma, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130, Fas (Apo 1), CCR1, CXCR1-4, TrkA, TrkB, TrkC, Htk, REK7, Rse/Tyro-3, R del factor de crecimiento de hepatocitos, R del factor de crecimiento derivado de plaquetas, Flt-1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61, \beta-neurexina, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, complemento R-2 (CD21), IgER, gp-1 de la membrana lisosomal, proteínas relacionadas con el receptor de \alpha2-microglobulina y R del péptido liberador de sodio.

5. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 1, en la que la proteína monomérica contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20.

6. Constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica formada mediante la unión de un concatémero de dos dominios extracelulares solubles idénticos de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria, a una región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina.

7. Constructo de ADN según la reivindicación 6, en el que la molécula de inmunoglobulina es IgG.

8. Constructo de ADN según la reivindicación 6, en el que la proteína que participa en la respuesta inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en citocinas, receptores de las citocinas, moléculas de adhesión, receptores del factor de necrosis tumoral, tirosina cinasas de receptores, receptores de quimiocinas y otras proteínas de la superficie celular que contienen un dominio extracelular soluble.

9. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF, GHR, IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR, R (receptor) del interferón \alpha, R del interferón \beta y R del interferón \gamma, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130, Fas (Apo 1), CCR1, CXCR1-4, TrkA, TrkB, TrkC, Htk, REK7, Rse/Tyro-3, R del factor de crecimiento de hepatocitos, R del factor de crecimiento derivado de plaquetas, Flt-1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61, \beta-neurexina, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, complemento R-2 (CD21), IgER, gp-1 de la membrana lisosomal, proteínas relacionadas con el receptor de \alpha2-microglobulina y R del péptido liberador de sodio.

10. Constructo de ADN según la reivindicación 6, en el que el constructo de ADN contiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19.

11. Plásmido de expresión recombinante, que comprende el constructo de ADN según la reivindicación 6 operativamente unido al mismo.

12. Plásmido de expresión recombinante según la reivindicación 11, en el que el plásmido de expresión recombinante es un plásmido pTR11-Top10' (nº de registro: KCCM 10288), un plásmido pTR22-Top10' (nº de registro: KCCM 10291), un plásmido pCD22Ig (nº de registro: KCCM 10402) o un plásmido pCT44Ig (nº de registro: KCCM 10400).

13. Célula huésped transformada o transfectada con el plásmido de expresión recombinante según la reivindicación 11.

14. Célula huésped según la reivindicación 13, en la que la célula huésped es una célula de mamífero.

15. Célula huésped según la reivindicación 13 ó 14, en la que el plásmido de expresión recombinante es un plásmido pTR11-Top10' (nº de registro: KCCM 10288), un plásmido pTR22-Top10' (nº de registro: KCCM 10291), un plásmido pCD22Ig (nº de registro: KCCM 10402) o un plásmido pCT44Ig (nº de registro: KCCM 10400).

16. Célula huésped según la reivindicación 13, en la que la célula huésped es una línea celular TR11Ig-CHO (nº de registro: KCLRF-BP-00046).

17. Método de preparación de una proteína dimérica de fusión concatemérica, en el que los enlaces disulfuro se forman entre las regiones bisagra de dos proteínas monoméricas, que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada o transfectada según la reivindicación 13, en condiciones adecuadas para la expresión de un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica, en la que un concatémero de dos dominios extracelulares solubles idénticos de proteínas que participan en la respuesta inmunitaria se une a una región bisagra de un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina; y aislar y purificar una proteína dimérica formada mediante la dimerización de las proteínas monoméricas producidas, del medio de cultivo.

18. Método según la reivindicación 17, en el que el constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica se prepara mediante la preparación de un constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión simple, formado mediante la unión de un fragmento de ADN que codifica para un fragmento Fc de una molécula de inmunoglobulina y un fragmento de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria; y la unión del constructo de ADN preparado y un segundo fragmento de ADN idéntico al fragmento de ADN que codifica para un dominio extracelular soluble de una proteína que participa en la respuesta inmunitaria.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el constructo de ADN que codifica para una proteína monomérica de fusión concatemérica contiene una secuencia con motivos de glucosilación.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la secuencia con motivos de glucosilación se inserta en una región en la que se unen dos dominios extracelulares solubles.

21. Método según la reivindicación 18, en el que la proteína monomérica de fusión concatemérica contiene una secuencia líder.

22. Método según la reivindicación 21, en el que la proteína monomérica de fusión concatemérica es CTLA-4, y la secuencia líder tiene la secuencia de aminoácidos de MACLGFQRHKAQKNLAARTWPCTLLFFIPVFCKA.

23. Método según la reivindicación 22, en el que la secuencia líder tiene una secuencia de aminoácidos de MRTWPCTLLFFIPVFCKA, excluyendo ACLGFQRHKAQKNLAA.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que la célula huésped es una célula de mamífero.

25. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 1, en la que dichas proteínas monoméricas están glucosiladas.

26. Proteína dimérica de fusión concatemérica según la reivindicación 25, en la que la proteína monomérica contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 24.

27. Constructo de ADN según la reivindicación 6, que contiene secuencias con motivos de glucosilación.

28. Constructo de ADN según la reivindicación 27, en el que el constructo de ADN contiene una secuencia de aminoácidos de de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

29. Plásmido de expresión recombinante operativamente unido al constructo de ADN según la reivindicación 27.

30. Plásmido de expresión recombinante según la reivindicación 29, en el que el plásmido de expresión recombinante es un plásmido pTR11Ig-MG (nº de registro: KCCM 10404), un plásmido pTR22Ig-MG (nº de registro: KCCM 10407), un plásmido pCD22Ig-MG (nº de registro: KCCM 10401) o un plásmido pCT44Ig-MG (nº de registro: KCCM 10399).

31. Célula huésped transformada o transfectada con el plásmido de expresión recombinante según la reivindicación 29.

32. Célula huésped según la reivindicación 31, en la que la célula huésped es una célula de mamífero.

33. Composición farmacéutica o de diagnóstico, que comprende la proteína dimérica según la reivindicación 1.

34. Composición farmacéutica o de diagnóstico, que comprende la proteína dimérica glucosilada según la reivindicación 25.