多联免疫粘附
技术领域
本发明涉及多联蛋白(concatameric proteins),更具体地涉及生物活性蛋白结构域的多联结构,其中生物活性蛋白的胞外可溶性结构域C末端与生物活性蛋白的相同或其它胞外可溶性结构域N末端相融合,以及两个多联体通过与免疫球蛋白Fc片段铰链区相偶联而形成二聚体,以及多联蛋白的糖基化形式。
背景技术
细胞因子的活性与针对各种抗原刺激的炎症和/或免疫应答的病理严重程度相关。目前,许多能够识别细胞因子的抗原特异性抗体和可溶性受体都被用于抑制细胞因子的功能,以达到治疗目的(WO93/016184,WO96/02576,WO96/023067,WO1997/03682,和US5,434,131,5,656,272,5,977,318,6,210,661,6,225,117)。抗体和可溶性受体是通过干扰细胞因子和细胞表面上细胞因子受体之间的相互作用而抑制细胞因子的信号转导。
Capon等人公开了将可溶性受体用作细胞因子的功能抑制剂,该可溶性受体与人免疫球蛋白的重链相融合(Nature 337:5254,1989),此后,公开许多专利,这些发明均涉及可溶性受体与免疫球蛋白的融合蛋白(US专利5,521,288,5,844,095,6,046,310,6,090,914,6,100,383,6,225,448)。
通常,可溶性受体和免疫球蛋白的融合蛋白具有下述优点(Capon等,Nature 337:5254,1989)
1.通过二聚化形成二价而增加对配体的总体亲合力
2.延长蛋白的血液半衰期,也就是提高了分子稳定性
3.通过免疫球蛋白重链Fc片段激活效应细胞
4.可利用亲和柱如利用蛋白A简便地纯化
多数受体胞外结构域和免疫球蛋白重链的融合蛋白由不含CH1结构域的重链组成,这样二聚体就不会与轻链结合。对于参与免疫应答的蛋白和受体的功能,更加期望利用该结构。例如,WO94/06476和US 5,447,851中公开的TNFR(WO92/16221,WO95/34326)-免疫球蛋白融合蛋白已被用于抑制TNF-介导的炎症。众所周知,TNFR-免疫球蛋白融合蛋白比原始的单体分子具有更高的亲合性(Lesslauer等,Eur.J.Immunol.21:2883,1991;Ashkenazi等,Proc.Natl.Acad.Sci.88:10535,1991;Peppe等,J.Exp.Med.174:1483,1991;Mohler等,J.Immunol.151:1548,1993)。
为增强对TNF介导的反应的抑制,可通过TNFR,CD2和CTLA-4的可溶性胞外结构域的多聚化来提高效力。例如,当将分别与免疫球蛋白重链(重链融合蛋白)及轻链(轻链融合蛋白)相结合的TNFR胞外结构域的融合蛋白在相同细胞内共表达时,通过重链与重链和轻链相连,我们可以得到四聚体形式的融合蛋白。如Scallon等所示,该四聚体显示出比单体或二聚体形式强得多的效力(Cytokine 7:759,1995)。
但是,该方法用于商业应用还存在许多困难,例如:在相同细胞系内同时表达两种不同的融合蛋白,多聚体形式的产量极低;难以纯化高分子量的多聚体形式。因此,目前所用的免疫球蛋白融合蛋白仅为重链融合形式。
所以,非常渴望发展产量高、纯化效力高的生产多聚蛋白治疗剂的方法。
发明内容
本发明人利用DNA重组技术,通过将生物活性蛋白可溶性结构域的C末端与相同或其它生物活性蛋白的可溶性结构域N末端相融合,从而制得了多联蛋白。另外,本发明人通过将其与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相连而使该多联体成为二聚体,并使用DNA诱变技术而加入更多糖基化。本发明人还发现多联蛋白二聚体及其糖基化形式比常规的单体融合蛋白显示出更高的效力和稳定性。
因此,本发明一方面提供多联蛋白,其中生物活性蛋白可溶性结构域的C末端与相同或其它生物活性蛋白可溶性结构域的N末端相融合。
另一方面,本发明还提供二聚体蛋白,其由两个单体蛋白通过铰链区的二硫键连接而成,所述单体蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供编码单体融合蛋白的DNA构建体,所述单体融合蛋白的多联结构域与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供含有编码单体融合蛋白的DNA构建体的DNA质粒,所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供由重组DNA质粒所转染或转化的宿主细胞,所述质粒包括编码单体融合蛋白的DNA构建体,所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区融合。
本发明还提供一种方法用于培养宿主细胞,该宿主细胞用重组DNA质粒转染或转化,所述质粒包括编码单体融合蛋白的DNA构建体,所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合,所述培养在适于表达DNA构建体的条件下进行,所述构建体编码与免疫球蛋白Fc片段的铰链区偶联的多联融合蛋白,并生产二聚多联体,所述二聚多联体是通过如上所述的两个单体多联体在铰链区的二硫键相连而形成,包括从细胞培养物中纯化上述蛋白的过程。
本发明还提供在适于表达DNA构建体的最佳条件下,所述DNA构建体编码单体融合蛋白,该单体融合蛋白的免疫功能的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合,培养宿主细胞的方法,该宿主细胞用重组DNA质粒转染或转化,所述质粒包含编码单体融合蛋白的DNA构建体,所述单体融合蛋白的免疫调节功能的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合,并且其中插入了糖基化基序,还提供生产糖基化二聚体的方法,该二聚体是通过如上所述的两个单体蛋白的铰链区的二硫键相连而成,包括从细胞培养物中纯化上述糖基化蛋白的过程。
本发明另一方面还提供用于将糖基化基序插入编码单体融合蛋白的DNA构建体中的DNA引物,所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供糖基化二聚体,该二聚体是通过两个单体蛋白在铰链区的二硫键相连而成,所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供含有药学有效量的二聚体以及药学可接受载体的药物组合物,所述二聚体通过两个单体融合蛋白在铰链区的二硫键而形成,所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
本发明还提供含有药学有效量的糖基化二聚体以及药学可接受载体的药物组合物,所述糖基化二聚体通过两个单体蛋白在铰链区的二硫键而形成,所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。
附图说明
通过以下具体的描述并结合附图,可更加清楚地理解本发明上述目的和其它目的,特征和其它优点,附图为:
图1显示利用聚合酶链式反应(PCR)制备DNA构建体的方法示意图,该构建体编码常规简单融合单体蛋白;
图2显示利用PCR制备DNA构建体的方法示意图,该构建体编码本发明的多联融合单体蛋白;
图3a显示[TNFR/Fc]2,[CD2/Fc]2或[CTLA4/Fc]2融合蛋白的结构,这些都是在细胞中利用TNFR/Fc,CD2/Fc或CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反应而形成的简单融合二聚蛋白,作为常规简单融合单体蛋白的实例。
图3b显示[TNFR-TNFR/Fc]2,[CD2-CD2/Fc]2或[CTLA4-CTLA4/Fc]2融合蛋白的结构,这些都是在细胞中利用TNFR-TNFR/Fc,CD2-CD2/Fc或CTLA4-CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反应而形成的多联融合二聚蛋白,作为本发明多联融合二聚蛋白的实施方案。
图4a显示[TNFR1-TNFR1/Fc]2的结构,作为本发明多联融合二聚蛋白的实施方案。
图4b显示[TNFR2-TNFR2/Fc]2的结构,作为本发明多联融合二聚蛋白的另一个实施方案。
图4c显示[CD2-CD2/Fc]2的结构,作为本发明多联融合二聚蛋白的另一个实施方案。
图4d显示[CTLA4-CTLA4/Fc]2的结构,作为本发明多联融合二聚蛋白的另一个实施方案。
图5显示重组表达质粒pTR11Ig-Top10′的构建过程图,该质粒表达本发明的TNFR1-TNFR1/Fc多联融合单体蛋白。
图6显示重组表达质粒pCD22Ig的构建过程图,该质粒表达本发明的CD2-CD2/Fc多联融合单体蛋白。
图7是重组表达质粒pTR11Ig-Top10′的图谱,该质粒表达本发明的TNFR1-TNFR1/Fc多联融合单体蛋白。
图8是重组表达质粒pTR22Ig-Top10′的图谱,该质粒表达本发明的TNFR1-TNFR1/Fc多联融合单体蛋白。
图9是重组表达质粒pCD22Ig的图谱,该质粒表达本发明的CD2-CD2/Fc多联融合单体蛋白。
图10是重组表达质粒pCT44Ig的图谱,该质粒表达本发明的CTLA4-CTLA4/Fc多联融合单体蛋白。
图11是重组表达质粒pTR11Ig-MG的图谱,该质粒表达本发明mgTNFR1-TNFR1/Fc多联融合单体蛋白,该蛋白含有四个糖基化基序肽。
图12是重组表达质粒pTR22Ig-MG的图谱,该质粒表达本发明mgTNFR2-TNFR2/Fc多联融合单体蛋白,该蛋白含有2个糖基化基序肽。
图13是重组表达质粒pCD22Ig-MG的图谱,该质粒表达本发明的mgCD2-CD2/Fc多联融合单体蛋白,该蛋白含有2个糖基化基序肽。
图14是重组表达质粒pCT44Ig-MG的图谱,该质粒表达本发明的mgCTLA4-CTLA4/Fc多联融合单体蛋白,该蛋白含有3个糖基化基序肽。
图15显示在还原或非还原条件下,纯化的多联融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2的SDS-PAGE结果;
图16显示常规的简单融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●)和[TNFR2/Fc]2(○)以及本发明的多联融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2()和[TNFR2-TNFR2/Fc]2()对TNF-α的细胞毒性的抑制效果。
图17显示常规的简单融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●)和[TNFR2/Fc]2(○)以及本发明的多联融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2()和[TNFR2-TNFR2/Fc]2()对TNF-β的细胞毒性的抑制效果。
图18显示常规的简单融合二聚蛋白[CD2/Fc]2(●),已知的免疫抑制剂环孢菌素A()和本发明的多联融合二聚蛋白[CD2-CD2/Fc]2(○)对活性T淋巴细胞增殖的抑制效果。
图19显示常规的简单融合二聚蛋白[CTLA4/Fc]2(●),已知的免疫抑制剂环孢菌素A()和本发明的多联融合二聚蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)对活性T淋巴细胞增殖的抑制效果。
图20显示常规的简单融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●),本发明的多联融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2(○)和糖基化多联融合二聚蛋白[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2()的血液半衰期。
图21显示常规的简单融合二聚蛋白[CD2/Fc]2(●),本发明的多联融合二聚蛋白[CD2-CD2/Fc]2(○)和糖基化多联融合二聚蛋白[mgCD2-CD2/Fc]2()的血液半衰期。
图22显示常规的简单融合二聚蛋白[CTLA4/Fc]2(●),本发明的多联融合二聚蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)和糖基化多联融合二聚蛋白[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2()的血液半衰期。
图23显示作为对照的PBS(●),常规的简单融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(■)和[TNFR2/Fc]2(▲),以及本发明的多联融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2(×)和[TNFR2-TNFR2/Fc]2(△)在DBA/1小鼠中对诱导产生胶原诱导的关节炎(CIA)的抑制效果。
本发明的最佳实施方式
本发明总地涉及多联蛋白,更具体地涉及免疫粘附分子。典型地,免疫粘附分子通过免疫球蛋白(Ig)的Fc片段与受体或粘附分子的配体结合区相融合而形成,这样就获得了一个类似于抗体的结构。本领域已知的典型粘附分子具有抗体的结构,其中可变区被受体的配体结合区所替代,而保留Fc片段。文献中已经提出了许多免疫粘附分子。但是,本发明的免疫粘附分子与常规的免疫粘附分子结构不同,而现有技术也没有预测或描述本发明免疫粘附分子的制备。
术语定义
为全面地理解本发明免疫粘附分子的特征性结构,下文给出了本发明所用术语的确切定义。一般来说,本发明中没有额外定义的所有技术和科学术语按本领域中通常的含义理解。尽管具有本发明通常的含义,但是仍如下定义以下各术语,以便能够更加清楚地理解其含义,明确地限定本发明的范围。
本文所用的术语“免疫球蛋白”指B细胞内产生的蛋白分子,作为抗原受体能够特异性地识别大量的抗原。该分子具有Y形结构,由两条相同的轻链(L链)和两条相同的重链(H链)构成,这四条链之间通过一些二硫键结合在一起,包括H链之间在铰链区的二硫键桥。L和H链含有可变区和恒定区。L链的可变区与H链的可变区相连,这样就产生了两个相同的抗原结合区。根据H链恒定区的特征,可将免疫球蛋白分为五种同种型:A(IgA),D(IgD),E(IgE),G(IgG)和M(IgM)。每种亚型都具有独特的结构和生物学特性。例如,与其它同种型相比,IgG的Fc结构略微有所不同。另外,IgG和IgA还具有一些亚型。例如,人IgG同种型具有四种亚型,IgG1,IgG2,IgG3和IgG4,其分别具有γ1,γ2,γ3和γ4H链。免疫球蛋白分子的生物学功能,如补体活化,Fc受体介导的吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性,都是通过H链的Fc区中的结构决定簇(互补性决定区)介导的。这种H链的Fc区被用于构建本发明的二聚蛋白,并可衍生自上述免疫球蛋白的所有同种型和亚型。
本文所用的术语“免疫球蛋白分子的Fc片段”指没有抗原结合活性且容易结晶的片段,其含有铰链区和CH2及CH3区,以及负责使抗体结合到效应物质和细胞上的部分。所以,本发明提及的Fc片段可与一些文献中描述的不同,但包括铰链区。这种关于Fc片段的描述为本发明的描述提供便利,参照本发明说明书及附图,本领域技术人员可以充分理解这种描述。
本文所用的术语“生物活性蛋白”指通常具有生理或药学活性的蛋白,肽或多肽,在形成了多联体或免疫粘附分子之后仍保留其部分天然活性。本文所用的术语“生物活性”含义不限于生理或药学活性。例如,一些多联体,如含有酶的多联体可以在有机溶剂内催化反应。类似地,一些含有伴刀豆球蛋白A或免疫球蛋白分子的高分子量融合分子可用作实验室诊断试剂。
所述蛋白,肽或多肽的非限定性实例包括:血红蛋白,血清蛋白(如血液因子包括因子VII,VIII和因子IX),免疫球蛋白,细胞因子(如白细胞介素),α-,β-和γ-干扰素,集落刺激剂(如G-CSF和GM-CSF),血小板衍生生长因子(PDGF),和磷脂酶激活蛋白(PLAPs)。其它典型的生物或治疗蛋白包括:胰岛素,植物蛋白(如凝集素和蓖麻毒蛋白),肿瘤坏死因子(TNF)以及其相关的等位基因,生长因子(如组织生长因子和内皮生长因子如TGFα或TGFβ),激素(如促卵泡激素,甲状腺刺激激素,抗利尿激素,色素沉着或分散激素和甲状旁腺激素,促黄体生成素释放激素及其衍生物,降钙素,降钙素基因相关多肽(CGRP),合成脑啡肽,生长调节素,促红细胞生成素,下丘脑释放因子,催乳素,慢性促性腺激素,组织纤溶酶原激活剂,生长激素释放肽(GHRP),胸腺体液因子(THF)。免疫球蛋白包括IgG,IgE,IgM,IgA,IgD及其片段。一些蛋白,如白细胞介素,干扰素或集落刺激因子可使用DNA重组技术以非糖基化形式产生。这种非糖基化的蛋白可用作本发明的生物活性材料。
另外,本发明所用生物活性材料包括任何在体内具有生物活性的多肽。生物活性材料的实例包括:肽或多肽,抗体的片段,单链结合蛋白(参见US Patent No.4,946,778),结合分子包括抗体或其片段,多克隆抗体,单克隆抗体,和催化抗体的融合多肽。生物活性材料的其它例子包括过敏原蛋白,如豚草,抗原E,蜜蜂毒液,或螨类过敏原。
另外,本发明所用生物活性材料包括酶。例举的酶可包括:糖类特异性酶,蛋白酶,氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂合酶,异构酶和连接酶。具体地说,非限制性地例举酶可包括:天冬酰胺酶,精氨酸酶,精氨酸脱氨酶,腺苷脱氨酶,过氧化物歧化酶,内毒素酶,过氧化氢酶,胰凝乳蛋白酶,脂酶,尿酸酶,腺苷脱磷酸酶(adenosinedephosphatase),酪氨酸酶,和胆红素氧化酶。糖类特异性酶的实例包括葡糖氧化酶,glucodase,半乳糖苷酶,葡糖脑苷脂酶,和葡糖醛酸酶。
本文所用的术语“参与免疫应答的蛋白”指所有在细胞或体液免疫应答期间介导细胞间信号转导从而激活或抑制免疫应答的蛋白。免疫是保护“自身”不受“非自身”如细菌或病毒侵害的过程。免疫应答大致可分为细胞和体液免疫应答,T和B淋巴细胞在其中起到最为重要的作用。T细胞,主要介导细胞免疫应答,直接攻击并杀死感染病毒的细胞或肿瘤细胞,或者通过分泌细胞因子来帮助其它免疫细胞,所述细胞因子发挥功能诱导或激活免疫应答或炎症反应。B细胞产生针对进入体内的非自身的外来物质(抗原)例如细菌或病毒的抗体,这种免疫应答被称为细胞免疫应答。细胞间的信号转导在细胞和体液免疫应答中都是必需的基本过程,在信号转导过程中,信号分子,也就是配体,与细胞表面受体之间发生相互作用,所述细胞表面受体可以将特异性信号转导入细胞内。
本发明的参与免疫应答的蛋白的代表性实例包括:细胞因子,细胞因子受体,粘附分子,肿瘤坏死因子受体(TNFR),酶,受体酪氨酸激酶,趋化因子受体,其它细胞表面蛋白和可溶性配体。非限制性地例举细胞因子可包括:IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12,IL-17,TNF,TGF,IFN,GM-CSF,G-CSF,EPO,TPO和M-CSF。细胞因子受体的实例包括,但不限于:生长激素受体(GHRs),IL-13R,IL-1R,IL-2R,IL-3R,IL-4R,IL-5R,IL-6R,IL-7R,IL-9R,IL-15R,TNFR,TGFR,IFNR(如IFN-γRα链和IFN-γRβ链),干扰素-αR,-βR,和-γR,GM-CSFR,G-CSFR,EPOR,cMpl,gp130和Fas(Apo 1)。非限制性例举的酶可包括:流行性感冒C血凝素酯酶和尿激酶。例举趋化因子受体可包括CCR1和CXCR1-4。受体酪氨酸激酶的实例包括,但不限于:TrkA,TrkB,TrkC,Htk,REK7,Rse/Tyro-3,肝细胞生长因子R,血小板衍生生长因子R,和Flt-1。其它细胞表面蛋白的实例包括CD2,CD4,CD5,CD6,CD22,CD27,CD28,CD30,CD31,CD40,CD44,CD100,CD137,CD150,LAG-3,B7,B61,β-neurexin,CTLA-4,ICOS,ICAM-1,补体R-2(CD21),IgER,溶酶体膜gp-1,α2-微球蛋白受体相关蛋白,和钠释放肽R。可溶性配体的非限定性实例包括:IL-10,heregulin,和角质形成细胞生长因子。
本发明参与免疫应答的蛋白的配体及其应用是本领域技术人员公知的,将其总结如下表1-7。
表1
参与免疫应答的蛋白:粘附分子
粘附分子 |
配体 |
用途 |
CD4 |
HIV gp120 |
抑制体内HIV感染;鉴定参与配体结合的CD4结构域 |
L-选择蛋白 |
GlyCAM-1,CD34 |
预防中性白细胞介导的肺损伤;通过组织化学染色确定组织中配体的位置;分离及克隆配体并测定其属性 |
E-选择蛋白 |
唾液酰Lewisx |
预防中性白细胞介导的肺损伤;测定配体结合中的热力学属性 |
P-选择蛋白 |
唾液酰Lewisx |
预防中性白细胞介导的肺损伤;研究与细胞表面结合中单个氨基酸残基的功能 |
ICAM-1 |
CD11a/CD18 |
疟疾中红细胞的吞噬作用;抑制鼻病毒的感染;在糖尿病中抗炎症 |
ICAM-2 |
CD11a/CD18 |
研究T细胞受体所介导的T细胞活化 |
ICAM-3 |
CD11a/CD18 |
鉴定与配体结合的受体结构域 |
VCAM-1 |
VLA-4 |
研究VLA-4在T淋巴细胞向皮肤炎症部位迁移中所起的作用 |
LFA-3 |
CD2 |
研究CD2在对T细胞的共刺激中的作用 |
L1糖蛋白 |
成纤维细胞生长因子受体 |
修复后刺激神经再生;与FGF功能比较 |
表2
参与免疫应答的蛋白:酶
酶 |
配体 |
用途 |
流行性感冒C血凝素酯酶 |
9-0-乙酰化唾液酸 |
在配体的组织特异性表达研究中使用的失活酶 |
尿激酶 |
尿激酶受体 |
开发的失活酶以通过干扰尿激酶活化而抑制癌转移 |
表3
参与免疫应答的蛋白:细胞因子受体
细胞因子受体 |
配体 |
用途 |
IFN-γRα链 |
IFN-γ |
抑制IFN介导的自身免疫 |
IFN-γRβ链 |
IFN-γ |
研究配体-受体复合体中亚基的结构 |
IL1R |
IL-1 |
抑制IL-1介导的自身免疫 |
IL4R |
IL-4 |
鉴定参与配体结合的受体结构域 |
促红细胞生成素R |
促红细胞生成素 |
抗配体抗体的表位的图谱设计 |
cMpl |
血小板生成素 |
分离及克隆配体 |
gp130 |
IL-6-IL6R复合体 |
研究配体-受体复合体中亚基的结构 |
表4
参与免疫应答的蛋白:肿瘤坏死因子受体
TNF受体 |
配体 |
用途 |
TNFR-1 |
TNF,淋巴毒素-α |
治疗脓毒性休克,类风湿性关节炎及其它炎症疾病;鉴定参与配体结合的结构域 |
TNFR-2 |
TNF,淋巴毒素-α |
抑制富集TNF的HIV复制;预防小鼠中胶原诱导的关节炎 |
淋巴毒素-βR |
淋巴毒素-β |
研究细胞表面淋巴毒素-β亚基的结构 |
Fas/Apo-1/CD95 |
Fas/Apo-1/CD95配体 |
治疗过度的细胞凋亡及相关疾病(如AIDS);抵抗淋巴细胞的凋亡及外周免疫耐受性;在T细胞介导的细胞毒性中Fas配体的作用;分离及克隆配体 |
CD27 |
CD27配体 |
分离及克隆配体 |
CD30 |
CD30配体 |
分离及克隆配体 |
CD40 |
gp39 |
分离及克隆配体 |
4-1BB |
4-1BB配体 |
通过组织化学染色鉴定含配体的组织;分离及克隆配体;研究潜在配体的结构决定子 |
OX40 |
gp34 |
分离及克隆配体 |
表5
参与免疫应答的蛋白:受体酪氨酸激酶
受体酪氨酸激酶 |
配体 |
用途 |
TrkA,B,C |
Neutropin |
测定Neutropin结合的属性 |
Htk |
Htk配体 |
分离及克隆配体 |
REK7 |
AL-1 |
分离及克隆配体 |
Rse/Tyro-3 |
蛋白S,Gas6 |
鉴定配体和测定其属性 |
肝细胞生长因子R |
肝细胞生长因子 |
鉴定参与配体结合的受体结构域 |
血小板衍生生长因子R |
血小板衍生生长因子 |
鉴定参与配体结合的受体结构域 |
Flt-1 |
血管内皮生长因子(VEGF) |
测定受体结合配体的属性 |
Flk-1/KDR |
VEGF |
评价受体对VEGF和胎盘生长因子的选择性 |
表6
参与免疫应答的蛋白:其它细胞表面蛋白
其它细胞表面蛋白 |
配体 |
用途 |
B7 |
CD28 |
研究B细胞引起的T细胞刺激 |
B61 |
Eck |
在炎症中Eck的作用 |
β-neurexin |
β-neurexin配体 |
测定来自β-neurexin的信号序列的属性 |
CD2 |
LFA-3,CD48 |
鉴定配体 |
CD5 |
CD5配体 |
研究B细胞引起的T细胞刺激 |
CD6 |
ALCAM |
研究克隆配体的结合活性 |
CD22 |
CD45,其它唾液酸糖蛋白 |
鉴定配体;研究T-B-细胞相互作用中CD22的作用;测定唾液酸-寡糖配体中结合决定子的属性 |
CD28 |
B7,B7-2 |
研究B细胞引起的T细胞刺激 |
CD31 |
CD31 |
鉴定与同型结合相关的CD31结构域 |
CD44 |
透明质酸盐 |
通过组织化学染色筛选含配体的组织;测定配体的结构决定子的属性 |
补体R-2(CD21) |
C3片段 |
抑制抗体对免疫抑制剂以及癌症治疗剂的反应性 |
CTLA-4 |
B7 |
鉴定CTLA-4作为B7的第二受体 |
IgER |
IgE |
抑制肥大细胞结合IgE作为过敏性疾病的治疗 |
溶酶体膜gp-1 |
LAMP-1配体 |
设计抗配体抗体的表位图谱 |
α2-微球蛋白受体-结合蛋白 |
gp330 |
通过组织化学染色测定细织中配体的位置 |
钠释放肽R |
钠释放肽 |
设计抗配体抗体的表位图谱;制备用于结构研究的重组受体 |
表7
参与免疫应答的蛋白:可溶性配体
可溶性配体 |
配体 |
用途 |
IL-2 |
IL-2R |
延长IL-2在循环系统中的半衰期 |
IL-10 |
IL-10R |
治疗脓毒性休克及移植排斥;延长IL-10在循环系统中的半衰期 |
Heregulin |
Her4/p180erbB4 |
研究Her4的信号转导 |
角质形成细胞生长因子 |
角质形成细胞生长因子R |
通过组织化学染色确定受体的位置 |
本文所用的术语“可溶性胞外结构域”指穿透含磷脂的细胞膜的膜内在蛋白中暴露于细胞外区域的部分,其中膜内在蛋白含有一个或多个跨膜区,该跨膜区主要由疏水氨基酸构成。这种胞外结构域主要含有亲水氨基酸,其通常位于蛋白折叠结构的表面,因而可溶于含水环境中。大多数细胞表面受体蛋白的胞外结构域作用为结合特异性配体,而胞内结构域则在信号转导中起重要作用。
本文所用的术语“多联体连接的”指生物活性蛋白的两个可溶性结构域相连从而形成长多肽的状态。
本文所用的术语“多联蛋白”指多联体连接的蛋白。例如,参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的N末端与该参与免疫应答的蛋白的相同可溶性胞外结构域C末端相连,其中前者可溶性胞外结构域的C末端与免疫球蛋白分子Fc片段的铰链区相连。这样,参与免疫应答的蛋白的两个相同的可溶性胞外结构域就形成了一个长的多肽。
本文所用的术语“简单融合单体蛋白”指具有单体结构的融合蛋白,该单体结构由参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域与免疫球蛋白分子Fc片段铰链区相连而形成的简单多肽构成,在本发明中为便于描述,可将简单融合单体蛋白命名为“蛋白名称/Fc”。例如,由参与免疫应答的蛋白TNFR1可溶性胞外结构域与免疫球蛋白分子Fc片段相连而形成的简单融合单体蛋白可命名为“TNFR1/Fc”。如果需要的话,Fc片段的来源也可在命名中指出。例如,如果Fc片段来源于IgG1,单体蛋白就称为TNFR1/IgG1Fc。
本文所用的术语“简单融合二聚蛋白”指具有二聚结构的融合蛋白,其中两个简单融合单体蛋白通过在铰链区形成分子间二硫键而连接到一起。在本发明中为便于描述,将这种简单融合二聚蛋白命名为“[蛋白名称/Fc]2”。例如,将TNFR1蛋白的可溶性胞外结构域与免疫球蛋白分子Fc片段相连而形成简单融合单体蛋白,当我们将两个这样的简单融合单体蛋白通过在铰链区形成分子间二硫键而融合到一起时,这样获得的融合蛋白具有二聚结构,将其称之为[TNFR1/Fc]2。另外,如果需要的话,还可在名称中指出Fc片段的来源。例如,如果Fc片段来自IgG1,该二聚蛋白就可称为[TNFR1/IgG1Fc]2。
本文所用的术语“多联融合单体蛋白”指具有单体结构的融合蛋白,该单体结构由单一多肽构成,该单一多肽中参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的N末端与该参与免疫应答的蛋白的相同可溶性胞外结构域的C末端相连,其中前者可溶性胞外结构域的C末端与免疫球蛋白分子Fc片段的铰链区相连。在本发明中,为便于描述,可将这种多联融合单体蛋白称为“蛋白名称-蛋白名称/Fc”。例如,参与免疫应答的蛋白TNFR1蛋白的可溶性胞外结构域与免疫球蛋白分子Fc片段相连形成了简单融合单体蛋白,将该简单融合单体蛋白的TNFR1可溶性胞外结构域与TNFR1的相同可溶性胞外结构域相连,获得的多联融合单体蛋白就称为TNFR1-TNFR1/Fc。如果需要,可以在命名中指出Fc片段的来源。例如,如果Fc片段是来自IgG1,那么该单体蛋白可称为TNFR1-TNFR1/IgG1Fc。
本文所用的术语“多联融合二聚蛋白”指具有二聚体结构的融合蛋白,其中两个多联融合单体蛋白通过在铰链区形成分子间二硫键而融合在一起。为便于本发明的描述,多联融合二聚蛋白可命名为“[蛋白名称-蛋白名称/Fc]2”。例如,通过连接简单融合单体蛋白的TNFR1可溶性胞外结构域与参与免疫应答的蛋白TNFR1的相同可溶性胞外结构域而形成多联融合单体蛋白,将两个这样的多联融合单体蛋白通过在铰链区形成分子间二硫键融合到一起,得到的具有二聚体结构的融合蛋白就命名为[TNFR1-TNFR1/Fc]2,其中简单融合单体蛋白是通过连接TNFR1可溶性胞外结构域与免疫球蛋白分子的Fc片段而形成的。如果需要的话,可以在命名中指出Fc片段的来源。例如,如果Fc片段是来自IgG1,那么该融合蛋白可称为[TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2。
本文所用的术语“载体”指作为一种载体能够稳定地将外源基因携带运送至宿主细胞内的DNA分子。为进行应用,载体应能够复制,具有将其自身导入宿主细胞的系统,并具有可选择标记。外源基因可包括例如编码多联融合单体蛋白的DNA构建体。
本发明所用的术语“重组表达质粒”指携带有待在宿主细胞内表达的外源基因的环状DNA分子,所述外源基因与其可操作连接。当导入宿主细胞内时,重组表达质粒能够不依赖宿主染色体DNA而进行复制,以高拷贝数复制其本身,并产生异源DNA。正如本领域公知的:为增加转染基因在宿主细胞中的表达水平,该基因应该与转录及翻译调节序列可操作连接,所述调节序列在被选作表达体系的宿主细胞中有功能。优选地,该表达调节序列和外源基因可由单一表达载体携带,该载体含有细菌-可选择标记和复制起点。如果使用真核细胞作为表达体系,该表达载体应该进一步含有在该真核宿主细胞中有用的表达标记。
本文所用的术语“可操作连接”指载体中元件的排列,其中每个元件都能够行使其先天的功能。所以,与编码序列可操作连接的调控序列能够影响编码序列的表达。作用于诱导编码序列表达的调控序列不必与编码序列相邻。例如,当启动子序列和编码序列之间存在间插序列时,启动子序列可仍与编码序列“可操作连接”。
本发明所用的宿主细胞可以是原核或真核细胞。另外,通常可使用能够高效导入外源DNA以及能够高水平表达导入基因的宿主细胞。可用于本发明的宿主细胞包括原核和真核细胞,如大肠杆菌(E.coli),假单胞菌属(Pseudomonas sp.),芽孢杆菌属(Bacillus sp.),链霉菌属(Streptomyces sp.),真菌或酵母,昆虫细胞如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9),动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠细胞,非洲绿猴细胞如COS1,COS7,人胚肾细胞,BSC1,BSC40或BMT10,以及组织培养的人类细胞。当克隆编码本发明融合蛋白的DNA构建体时,优选动物细胞作为宿主细胞。当使用COS细胞时,由于SV40大T抗原在COS细胞中表达,携带有SV40复制起点的质粒可作为多拷贝游离体存在,从而能够高表达外源基因。导入宿主细胞的DNA序列对于宿主细胞可以是同源或异源,或者是含有同源或异源DNA序列的杂交DNA序列。
为表达编码本发明多联融合蛋白的DNA序列,可使用作为表达体系的宿主细胞和载体的多种组合。可用于转化真核宿主细胞的表达载体含有表达调节序列,该调节序列可来自:例如SV40,牛乳头瘤病毒,腺病毒,腺伴随病毒,巨细胞病毒和逆转录病毒。可用于细菌宿主细胞的表达载体包括来自大肠杆菌的细菌质粒,例如pBluescript,pGEX2T,pUC,pCR1,pBR322,pMB9及其衍生物,可用于广泛宿主细胞的质粒,如RP4,噬菌体DNA,例如多种λ噬菌体衍生物,包括λgt10,λgt11和NM989,以及其它DNA噬菌体,例如丝状单链DNA噬菌体如M13。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL 941。
本文所用的术语“转化”指将DNA导入合适的宿主细胞,从而使该DNA可作为染色体外元件,或者通过染色体整合而复制。
本文所用的术语“转染”指合适的宿主细胞对表达载体的摄入,无论实际上是否表达任何编码序列。
本文所用的术语“信号序列”指介导将表达蛋白转运到细胞膜外的氨基酸序列,还称为“前导序列”。细胞表面蛋白或分泌蛋白,被转运到细胞膜外,其N末端序列通常被细胞膜中的信号肽酶切除。这样的N末端序列就称为信号序列或信号肽,或前导序列或前导肽。分泌(或转运的)蛋白或所有存在于细胞膜外的蛋白或所有存在于细胞外环境的蛋白都具有特定的信号序列。这些信号序列之间没有特异同源性,并且根据其来源不同,相同的蛋白具有不同的信号序列。二级结构或非极性和带电残基的分布对于信号序列的正确功能而言,比其初级结构更加重要。尽管没有特异同源性,但是信号序列还是具有如下的几个共同特征。信号序列在其N端含有N结构域,这是一个亲水性区域,包含一个或多个带正电的残基,N结构域后为H结构域,H结构域是一个稍长的疏水性区域。在大肠杆菌中,信号序列含有约18-30个氨基酸。其N结构域含有许多阳离子氨基酸,如Lys或Arg,这样就具有净正电荷。在H结构域中发现了许多疏水性氨基酸如Ala或Leu,而极性或带电荷的氨基酸如Pro,Lys,Arg,Asn或Glu在H结构域很少见。大量氨基酸如Ala和Leu残基形成了α螺旋结构,以促进膜穿透。C结构域位于H结构域和蛋白实际分泌部分之间。这个C结构域的疏水性较小,含有能够被信号肽酶如LebB或LspA识别的序列。没有关于信号肽酶切割的精确位点的报道,但是已知信号肽酶通常在C结构域中在Ala-X-Ala序列之后进行切割。含有上述信号序列的蛋白前体(preproteins)通过与几种蛋白相互作用而到达细胞膜,并通过切割信号肽的特定区域而折叠为其成熟形式。这样的信号序列对于在细胞表面或胞外环境中表达目的蛋白的策略十分重要。外源蛋白和融合蛋白应该被稳定高效地运送到胞外环境。典型地,具有优异分泌能力的细胞表面蛋白可用于在细胞表面表达外源蛋白或融合蛋白,其通常具有分泌信号序列,能够提供优秀的分泌效率。
制备本发明的多联融合二聚蛋白
本发明的多联融合二聚蛋白通常如下制备:(a)使用编码免疫球蛋白分子Fc片段的基因和编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的基因,制备编码简单融合单体蛋白的DNA构建体;(b)通过聚合酶链式反应,分别向制备的编码简单融合单体蛋白的DNA构建体以及与所述编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的基因相同的基因中插入限制性内切酶的识别序列;(c)利用识别该识别序列的限制性内切酶切割编码简单融合单体蛋白的DNA构建体以及编码参与免疫应答的蛋白可溶性胞外结构域的基因中限制性内切酶的识别序列;(d)使用连接酶连接被切割的DNA片段,以产生编码多联融合单体蛋白的DNA构建体(参见图2);(e)将制备的编码多联融合单体蛋白的DNA构建体与载体可操作连接以产生重组表达质粒;(f)用该重组质粒转化或转染宿主细胞;以及(g)在适于编码多联融合单体蛋白的DNA构建体表达的条件下,培养该转化体或转染子,并分离纯化所感兴趣的多联融合二聚蛋白。
可利用含有特定限制性内切酶识别序列以及编码前导序列的序列的引物,和含有编码可溶性胞外结构域3’端以及免疫球蛋白分子Fc片段特定区域5’端部分区域的反义序列的引物,通过PCR制备编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的DNA片段。
可利用具有编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域3’端部分区域的序列以及编码免疫球蛋白分子Fc片段特定区域5’端的序列的引物以及具有编码特定限制性内切酶识别序列及免疫球蛋白分子Fc片段特定区域3’段的反义序列的另一引物,通过PCR制备编码免疫球蛋白分子Fc片段特定区域的DNA片段。
将如上所述的编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的DNA片段、以及编码免疫球蛋白分子Fc片段特定区域的DNA片段混合在试管中。变性后,将DNA重退火。然后使用DNA聚合酶在各杂交DNA的3’段聚合,形成完整的双链DNA片段。利用获得的双链DNA片段,并使用具有编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的序列的引物,以及编码免疫球蛋白分子Fc片段特定区域3’端的引物,进行另一个聚合酶链式反应(PCR),以此扩增免疫球蛋白融合基因,该基因含有相应于编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的DNA片段的序列以及相应于编码免疫球蛋白分子Fc片段特定区域的DNA片段的序列。
通过PCR将限制性内切酶识别序列导入扩增的免疫球蛋白融合基因和具有编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的序列的DNA片段中。然后用限制性内切酶切割识别序列,切割的区域用连接酶相连接,这样就产生了多联免疫球蛋白融合基因。
免疫球蛋白融合基因还可进一步含有信号序列,以促进其编码的蛋白向细胞外分泌。例如,CTLA-4分子含有独特的前导序列,该序列在其N端具有高度亲水性的丰余序列,并且其异常地长,且具有高度水溶性(Harper,K等,J.Immunol.147:1037-1044;及Brunet,J.F.Nature 328:267-270,1987)。通常,大多数细胞表面蛋白或分泌蛋白具有前导序列,该序列在其N末端含有20-24个高疏水性的氨基酸。但是,本发明所用的CTLA-4分子含有总共37个残基:其N端16个亲水氨基酸,和通常在其跨膜区的21个高疏水性的氨基酸。在制备CTLA4Ig融合蛋白的常规方法中,CTLA-4分子的前导序列被制瘤素M的前导序列(Linsley,P.S.等,J.Exp.Med.174:561-569,1991)或IL-6的前导序列(Yamada,A等,Microbiol.Immunol.40:513-518,1996)所替代。本发明人证明了包含具有”MRTWPCTLLFFIPVFCKA”序列的前导序列的CTLA-4分子是优选的,而不是由”ACLGFQRHKAQKNLAA”这16个氨基酸构成的氨基酸序列,并可容易地实现将表达的蛋白分泌到细胞外环境,如国际专利公开号为WO98/31820中所公开的。
通过将免疫球蛋白融合基因插入载体来制备重组表达质粒,然后将其导入宿主细胞以产生转化体或转染子。可通过培养该转化或转染细胞并分离纯化多联融合蛋白而获得所感兴趣的多联融合二聚蛋白。
可用于制备本发明多联融合二聚蛋白的宿主细胞优先选自:骨髓细胞系,CHO细胞,猴COS细胞,人胚肾293细胞,以及杆状病毒感染的昆虫细胞。在这种表达体系中产生的目的多肽作为包含体被分泌到培养基中。然后可使用蛋白A或蛋白G柱,通过亲和层析纯化多联融合二聚蛋白。实际上,有效的哺乳动物表达体系及这种纯化系统非常适用于表达二聚形式的参与免疫应答的蛋白以及分离这种蛋白。
制备本发明的糖基化多联融合二聚蛋白
通过糖基化作用修饰以真核细胞作为宿主细胞所产生的分泌蛋白。已知糖基化作用可影响蛋白的体内稳定性、功能以及物理属性。所以,本发明优选的方面包括利用重组DNA技术以及上述动物细胞系作为宿主细胞,向参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域上连接额外的糖链,来促进目的多联融合二聚蛋白的产生。
已知两种糖基化作用模式。一种是O-连接的糖基化作用,其中寡糖连接到丝氨酸或苏氨酸残基上,另一种是N-连接的糖基化作用,其中寡糖连接到天冬酰胺残基上。N-连接的糖基化作用发生在特定氨基酸序列中,特别是Asn-X-Ser/Thr,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。N-连接的寡糖结构不同于O-连接的寡糖结构,并且在N-连接类型中发现的糖基化残基也不同于O-连接类型。例如,在O-连接的寡糖中,N-乙酰半乳糖胺总是连接到丝氨酸或苏氨酸上,而在所有N-连接的寡糖中,N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺相连。O-连接的寡糖通常只含有1-4个糖残基。相比之下,N-连接的寡糖含有5个或更多糖残基,本质上包括N-乙酰葡糖胺和甘露糖。
在本发明中,为实现额外的O-连接或N-连接的糖基化作用,编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的DNA序列中一个或多个核苷酸被改变,得到的DNA在合适的动物宿主细胞中表达,以使用宿主系统来诱导糖基化作用。另一方面,本发明的糖基化多联融合二聚蛋白可如下制备:改变编码参与免疫应答的蛋白的可溶性胞外结构域的DNA序列,通过加入Asn-X-Ser/Thr序列来诱导或增加N-连接的糖基化作用。
可根据本领域的常规方法来改变DNA序列,以引入糖基化作用。本发明优选的一方面在于:为保护多联融合蛋白特别是两个可溶性胞外结构域免受细胞间蛋白酶的攻击,以此延长其在血清中的半衰期,可使用PCR制备编码多糖基化多联融合单体蛋白的DNA构建体,该DNA构建体将多糖基化位点导入两个可溶性胞外结构域之间的相连区域。在本发明一特定方面中,按如下操作可将糖基化基序肽序列导入多联融合蛋白内。使用编码可溶性胞外结构域的前导序列和EcoRI限制酶切位点的引物以及反义引物进行PCR制备DNA片段,所述反义引物中编码第一个可溶性胞外结构域3’端部分区域以及第二个可溶性胞外结构域5’端部分区域的核苷酸序列的一部分被糖基化基序序列所替代。另一DNA片段可利用引物和反义引物通过PCR制备,所述引物中,编码第一个可溶性胞外结构域3’端部分区域以及第二个可溶性胞外结构域5’端部分区域的核苷酸序列的一部分被糖基化基序序列所替代,所述反义引物编码IgG1 Fc部分的3’端以及XbaI限制酶切位点。然后,使用这两种DNA片段在试管中进行第二次PCR。
在本发明实施方案中,可用于本发明的可溶性胞外结构域包括TNFR1,TNFR2,CD2和CTLA-4的可溶性胞外结构域。参照附图,序列表和实施例将更具体地描述它们的应用。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)已知为激素恶液质素,肿瘤坏死因子-β(TNF-β)也已知为淋巴毒素,这两种因子都是多功能细胞因子,诱导炎症、细胞免疫应答、败血症、细胞毒性、恶液质、类风湿性关节炎、炎症相关疾病(Tartaglia,L.A.等,Immunol.Today 13:151,1992),和抗病毒反应(Butler,P.,Peptide Growth Factor II,1990,Springer-Verlag,Berlin,39-70页)。TNF-α和TNF-β的这些作用,包括细胞毒性,都源自其与三聚体形式的TNF受体的结合(Eck,M.J等,J.Biol.Chem.267:2119,1992)。作为TNF受体,55kDa的I型(TNFR1或p55)以及约75kDa的II型(TNFR2或p75)是已知的(Smith,C.A.等,Science 248:1019,1990;Loetscher H等,Cell 61:351,1990;和Schall等,Cell 61:361,1990)。这两种受体对TNF-α和TNF-β的亲合性类似(Schall等,Cell 61:361,1990)。通过抑制TNF-α和TNF-β结合其在细胞表面上的受体(已知这可有效减轻TNF依赖性炎症),这两种可溶性受体的免疫球蛋白融合蛋白对TNF-α和TNF-β的作用有抑制效果。
在调节免疫应答的细胞表面抗原中,共刺激分子CD2和CTLA-4,诱导二级刺激以充分激活T细胞,当其为可溶性形式时,也可根据与TNF受体相同的方法,将其用于治疗各种免疫学疾病。免疫应答是通过抗原呈递细胞(APC)的细胞表面抗原分子与T淋巴细胞的特异性受体(也就是说,T淋巴细胞与APC的白细胞功能抗原分子)结合而完成的,当在抗原呈递期间不产生共刺激信号作为二级信号时,T淋巴细胞通过细胞凋亡或抑制克隆活化而被去除。CD2是T淋巴细胞上的白细胞功能抗原,与APC上的LFA-3结合,并参与白细胞的粘附和共刺激,以及通过与CD28的共刺激而促进T细胞活化。CTLA-4在T淋巴细胞活化后表达,其表达水平在静止期增加。CTLA-4对APC的B7分子的亲合性比CD28高20倍以上,并在结合B7后,转导信号抑制T淋巴细胞活化。
本发明一特定方面提供多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc,如SEQ ID NO:6所示;还提供多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc,如SEQ ID NO:8所示;还提供多联融合单体蛋白CD2-CD2/Fc,如SEQ ID NO:18所示;以及多联融合单体蛋白CTLA4-CTLA4/Fc,如SEQ ID NO:20所示。
本发明另一特定方面提供:编码多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体(TNFR1-TNFR1-IgG),如SEQ IDNO:5所示;编码多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体(TNFR2-TNFR2-IgG),如SEQ ID NO:7所示;编码多联融合单体蛋白CD2-CD2/Fc的DNA构建体(CD2-CD2-IgG),如SEQ ID NO:17所示;编码多联融合单体蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体(CTLA4-CTLA4-IgG),如SEQ ID NO:19所示。
本发明还提供:重组表达质粒pTR11Ig-Top10′,其与编码多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ IDNO:5所示;重组表达质粒pTR22Ig-Top10′,其与编码多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:7所示;重组表达质粒pCD22Ig,其与编码多联融合单体蛋白CD2-CD2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:17所示;以及重组表达质粒pCT44Ig,其与编码多联融合单体蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:19所示。所述重组表达质粒保藏在Korean Culture Center ofMicroorganisms(KCCM),保藏号分别为KCCM-10288,KCCM-10291,KCCM-10402,和KCCM-10400。根据布达佩斯条约(Budapest treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的条款,将维持KCCM保藏。
本发明还提供:用重组表达质粒pTR11Ig-Top10′转化或转染的哺乳动物宿主细胞(如TR11Ig-CHO),所述质粒与编码多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:5所示;用重组表达质粒pTR22Ig-Top10′转化或转染的哺乳动物宿主细胞(如TR22Ig-CHO),所述质粒与编码多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:7所示;用重组表达质粒pCD22Ig转化或转染的哺乳动物宿主细胞,所述质粒与编码多联融合单体蛋白CD2-CD2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:17所示;以及用重组表达质粒pCT44Ig转化或转染的哺乳动物宿主细胞,所述质粒与编码多联融合单体蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:19所示。用重组表达质粒pTR11Ig-Top10′转染的中国仓鼠卵巢细胞系TR11Ig-CHO以及用重组表达质粒pTR22Ig-Top10′转染的中国仓鼠卵巢细胞系TR22Ig-CHO被保藏在KCCM,其保藏号分别为KCLRF-BP-00046和KCLRF-BP-00049。根据布达佩斯条约(Budapesttreaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的条款,将维持KCCM保藏。
本发明还提供:含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc,如SEQ ID NO:10所示;含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc,如SEQ ID NO:12所示;含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCD2-CD2/Fc,如SEQ IDNO:22所示;含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc,如SEQ ID NO:24所示.
本发明还提供:编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体,如SEQ ID NO:9所示;编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体,如SEQ ID NO:11所示;编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA构建体,如SEQ ID NO:21所示;编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体,如SEQ ID NO:23所示。为产生糖基化基序肽,设计引物对(正向和反向引物):这些引物与相应于多联融合蛋白TNFR/Fc,CD2/Fc和CTLA4/Fc可溶性胞外结构域之间连接区的核苷酸序列互补,并含有编码天冬酰胺(N)的密码子(ATT和AAC)或者编码丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的密码子(分别为TCC;和ACC,ACG和ACA),多联融合蛋白基因中的任何密码子均可被其替代。当设计引物时,可根据允许核苷酸序列发生最小替代的条件和每条引物的解链温度(Tw),从多个氨基酸序列中选择其中一个。
本发明还提供:重组表达质粒pTR11Ig-MG,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:9所示;重组表达质粒pTR22Ig-MG,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:11所示;重组表达质粒pCD22Ig-MG,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:21所示;以及重组表达质粒pCT44Ig-MG,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:23所示。所述重组表达质粒保藏在Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM),保藏号分别为KCCM-10404,KCCM-10407,KCCM-10401,和KCCM-10399。根据布达佩斯条约(Budapest treaty on theInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurposes of Patent Procedure)的条款,将维持KCCM保藏。
本发明还提供由重组表达质粒pTR11Ig-MG转化或转染的哺乳动物宿主细胞,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:9所示;由重组表达质粒pTR22Ig-MG转化或转染的哺乳动物宿主细胞,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:11所示;由重组表达质粒pCD22Ig-MG转化或转染的哺乳动物宿主细胞,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:21所示;以及由重组表达质粒pCT44Ig-MG转化或转染的哺乳动物宿主细胞,该质粒与编码含有糖基化基序肽的多联融合单体蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA构建体可操作连接,如SEQ ID NO:23所示。
本发明的多联融合二聚蛋白可在培养本发明的转化体或转染子后从培养基中分离。所述多联融合二聚蛋白可参与免疫应答,如上表1所示,这样就可根据蛋白种类将其用作治疗剂,诊断试剂以及实验室工具,其应用是本领域技术人员公知的。特别地,当用作治疗剂时,可按本领域通常的治疗有效量应用所述多联融合二聚蛋白,可以理解:可以视多种不同的因素来改变该量,所述因素包括所用化合物的活性,患者的年龄,体重,健康状况,性别和饮食,给药时间、给药途径、药物的组合,以及所预防或治疗的特定疾病的致病状态。另外,当作为治疗剂使用时,应该理解:本发明多联融合二聚蛋白可按本领域技术人员公知的施用参与免疫应答的蛋白的常规方法和途径应用。
参照以下实施例并结合附图,将更详细地解释本发明。但是,以下实施例仅为说明本发明,本发明并不仅限于这些实施例。为便于描述本发明,根据下述实施例所制备的DNA构建体、重组表达质粒和转化细胞系的信息,以及所用引物和保藏号都总结在下面的表8和表9中。
表8
DNA构建体的信息和保藏号
DNA构建体名称 |
SEQ ID No. |
保藏基因 |
保藏细胞系 |
DNA |
蛋白质 |
命名 |
保藏号 |
命名 |
保藏号 |
TNFR1-IgG |
1 |
2 | | | | |
TNFR2-IgG |
3 |
4 | | | | |
TNFR1-TNFR1-IgG |
5 |
6 |
pTR11Ig-Top10’ |
KCCM 10288 |
TR11Ig-CHO |
KCLRF-BP-00046 |
TNFR2-TNFR2-IgG |
7 |
8 |
pTR22Ig-Top10’ |
KCCM 10291 |
TR22Ig-CHO |
KCLRF-BP-00049 |
mgTNFR1-TNFR1-IgG |
9 |
10 |
pTR11Ig-MG |
KCCM 10404 | | |
mgTNFR2-TNFR2-IgG |
11 |
12 |
pTR22Ig-MG |
KCCM 10407 | | |
CD2-IgG |
13 |
14 | | | | |
CTLA4-IgG |
15 |
16 | | | | |
CD2-CD2-IgG |
17 |
18 |
pCD22Ig |
KCCM 10402 | | |
CTLA4-CTLA4-IgG |
19 |
20 |
pCT44Ig |
KCCM 10400 | | |
mgCD2-CD2-IgG |
21 |
22 |
pCD22Ig-MG |
KCCM 10401 | | |
mgCTLA4-CTLA4-IgG |
23 |
24 |
pCT44Ig-MG |
KCCM 10399 | | |
表9
引物信息
引物名称 |
SEQ ID NO. |
说明 |
Oligo TNFR-EDF-EcoRI |
25 |
含有TNFR1胞外结构域5’端及EcoRI位点 |
Oligo TNFR-EDR-IgGh |
26 |
含有TNFR1胞外结构域3’端及IgG铰链区的反向引物 |
Oligo IgG1-T1F |
27 |
含有IgG铰链区5’端及TNFR1 3’端 |
Oligo IgG1-R-XbaI |
28 |
含有IgG铰链区3’端及XbaI位点的反向引物 |
Oligo TNFR2-EDF-EcoRI |
29 |
含TNFR2胞外结构域5’端及EcoRI位点 |
Oligo TNFR2-EDR-IgGh |
30 |
含有TNFR2胞外结构域3’端及IgG铰链区的反向引物 |
Oligo IgG1-T2F |
31 |
含有IgG铰链区5’端及TNFR23’端 |
Oligo TNFR1-CF-BamHI |
32 |
含有TNFR1胞外结构域5’端及BamHI位点,用于制备多联体 |
Oligo TNFR1-NR-BamHI |
33 |
含有TNFR1胞外结构域3’端及BamHI位点的反向引物,用于制备多联体 |
Oligo TNFR2-CF-BamHI |
34 |
含有TNFR2胞外结构域5’端及BamHI位点,用于制备多联体 |
Oligo TNFR2-NR-BamHI |
35 |
含有TNFR2胞外结构域3’端及BamHI位点的反向引物,用于制备多联体 |
Oligo mgTNFR1-TNFR1-IgG-F |
36 |
用于诱变的引物,含有能够将糖基化位点插入TNFR1-TNFR1连接区的序列,以及相应于TNFR13’端和5’端的序列;用于制备MG(多糖基化)形式 |
Oligo mgTNFR1-TNFR1-IgG-R |
37 |
用于诱变的反向引物,含有能够将糖基化位点插入TNFR1-TNFR1连接区的序列,以及相应于TNFR1 3’端和5’端的序列;用于制备MG形式 |
Oligo mgTNFR2-TNFR2-IgG-F |
38 |
用于诱变的引物,含有能够将糖基化位点插入TNFR2-TNFR2连接区的序列,以及相应于TNFR2 3’端和5’端的序列;用于制备MG形式 |
Oligo mgTNFR2-TNFR2-IgG-R |
39 |
用于诱变的反向引物,含有能够将糖基化位点插入TNFR2-TNFR2连接区的序列,以及相应于TNFR2 3’端和5’端的序列;用于制备MG形式 |
Oligo CD2F-EcoRI |
40 |
含有CD2胞外结构域5’端及EcoRI位点 |
Oligo CD2R-RstI |
41 |
含有CD2胞外结构域3’端及PstI位点 |
Oligo IgG-F-PstI |
42 |
含有IgG铰链区5’端及PstI位点 |
Oligo CTLA4F-EcoRI |
43 |
含有CTLA-4胞外结构域5’端及EcoRI位点 |
Oligo CTLA4R-PstI |
44 |
含有CTLA-4胞外结构域3’端及PstI位点 |
Oligo CD2-NT-F |
45 |
含有CD2胞外结构域5’端;用于制备多联体 |
Oligo CD2-CT-R |
46 |
含有CD2胞外结构域3’端的反向引物;用于制备多联体 |
Oligo CTLA4-NT-F |
47 |
含有CTLA-4胞外结构域5’端;用于制备多联体 |
Oligo CTLA4-CT-R |
48 |
含有CTLA-4胞外结构域3’端的反向引物;用于制备多联体 |
Oligo mgCD2-CD2-IgG-F |
49 |
用于制备MG(多糖基化)形式的CD2-CD2-IgG |
Oligo mgCD2-CD2-IgG-R |
50 |
用于制备MG(多糖基化)形式的CD2-CD2-IgG的反向引物 |
Oligo mgCTLA4-CTLA4-IgG-F |
51 |
用于制备MG(多糖基化)形式的CTLA4-CTLA4-IgG |
Oligo mgCTLA4-CTLA4-IgG-R |
52 |
用于制备MG(多糖基化)形式的CTLA4-CTLA4-IgG的反向引物 |
实施例1
人TNFR
A.制备编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体(图1和图5)
a.编码TNFR1可溶性胞外结构域的DNA片段
按现有技术所述聚合酶链式反应(PCR)方法(Holten等,Biotechniques 8:528,1990),构建编码I型人TNF受体(TNFR1,p55)可溶性胞外结构域和人免疫球蛋白G1 Fc片段的融合基因。
使用引物(SEQ ID NO:25的核苷酸序列)和反义引物(SEQ IDNO:26的核苷酸序列),通过PCR构建编码TNFR1可溶性胞外结构域的DNA片段,所述引物具有EcoRI限制酶切位点以及编码前导序列(SEQ ID NO:2的1-20位的氨基酸序列)的序列,所述反义引物具有编码所述TNFR1可溶性胞外结构域(TNFR1-ED)3’端部分区域以及免疫球蛋白G1(IgG1)铰链区5’端的序列。该反应所用模板cDNA用从健康成人单核细胞(T淋巴细胞)提取的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)来构建。
健康成人血液抽取后,用RPMI-1640(Gibco BRL,USA)稀释至1∶1,使用Ficoll-hypaque(Amersham,USA)进行密度梯度离心,获得在顶部形成的T淋巴细胞层。为得到5×105细胞/ml的细胞浓度,用RPMI-1640洗涤细胞3次,加入含10%胎牛血清(FBS,Gibco BRL,USA)的RPMI-1640培养基,然后加入白细胞凝集素(Pharmacia,USA),使其浓度为3.5ug/ml,再在37℃,5%CO2培养箱内培养2天。
使用Tri-Reagent(MRC,USA)mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。首先,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)洗涤2×107的人T淋巴细胞3次,然后与1ml Tri-Reagent混合几次,使RNA溶解。向该试管中加入0.2ml氯仿并彻底混合后,将该试管在室温下(RT)孵育15分钟,然后在4℃,15000rpm离心15分钟。将溶液的上部转到1.5ml试管中,加入0.5ml异丙醇,然后在4℃,15000rpm离心15分钟。弃去上清后,用1ml经75%乙醇-25%DEPC(Sigma,USA)处理过的三蒸水重悬沉淀,然后在4℃,15000rpm离心15分钟。彻底去除上清并在空气中干燥去除乙醇残余后,用50μl经DEPC处理的三蒸水重悬RNA。
将2μg纯化的mRNA与1μl的oligo dT(dT30,Promega,USA)引物在1.5ml试管中混合为10μM,在70℃加热2min,冰上冷却2min,合成初级cDNA。然后,向该混合物中加入200U M-MLV逆转录酶(Promeg,USA),10μl 5x反应缓冲液(250mM Tris-HCl,pH8.3,375mM KCl,15mM MgCl2,和50mM DTT),1μl dNTP(各10mM,Takara,Japan)和经DEPC处理的三蒸水,使总体积为50μl,然后在42℃反应1小时。
b.编码免疫球蛋白Fc片段的DNA片段
使用引物(SEQ ID NO:27的核苷酸序列)和反义引物(SEQ IDNO:28的核苷酸序列),通过PCR构建编码免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段,所述引物具有编码所述TNFR可溶性胞外结构域3’端部分区域以及免疫球蛋白G1(IgG1)铰链区5’端的序列,所述反义引物具有XbaI限制酶切位点以及编码IgG1 Fc 3’端的序列。该反应所用模板cDNA用从恢复期的未明原因发热患者的外周血液细胞(B淋巴细胞)抽提的mRNA进行RT-PCR来构建。
c.编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体
将如上制备的编码TNFR1可溶性胞外结构域的DNA片段和编码免疫球蛋白Fc片段的DNA片段混合在同一试管内,诱导共同序列(该序列包括TNFR1可溶性胞外结构域3’端和IgG1铰链区5’端)间的互补结合。将该混合物作为模板,使用具有编码TNFR1 5’端序列的引物(SEQ ID NO:25所示序列)和具有编码IgG1 Fc 3’端序列的另一条引物(SEQ ID NO:28所示序列),进行PCR,扩增包括编码TNFR1可溶性胞外结构域的DNA片段及编码IgG1 Fc片段的DNA片段的DNA构建体。构建的基因包括前导序列,以促进蛋白在表达后分泌。
d.克隆编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体
将上述的编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体用EcoRI和XbaI限制酶切,并将其插入到市售的克隆载体pBluescriptKS II(+)(Stratagene,USA)的EcoRI/XbaI位点进行克隆。通过DNA测序测定总编码区的序列(SEQ ID NO:1)。这样制备的融合蛋白为简单融合单体蛋白,命名为TNFR1/Fc,图1所示的椭圆形代表融合基因初级表达产物的结构。推定的该简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2。
B.制备编码简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的DNA构建体(图1和图5)
a.编码TNFR2可溶性胞外结构域的DNA片段
按构建TNFR1/Fc的相同方法,构建编码II型人TNF受体(TNFR2,p75)可溶性胞外结构域和人免疫球蛋白G1 Fc片段的融合基因。
使用引物(SEQ ID NO:29的核苷酸序列)和反义引物(SEQ IDNO:30的核苷酸序列),通过PCR构建编码TNFR2可溶性胞外结构域的DNA片段,所述引物具有EcoRI限制酶切位点以及编码前导序列的序列,所述反义引物具有编码TNFR2可溶性胞外结构域(TNFR2-ED)3’端部分区域以及免疫球蛋白G1(IgG1)铰链区5’端的序列。该反应所用模板cDNA用从健康成人单核细胞(T淋巴细胞)抽提的mRNA进行RT-PCR来构建。
b.编码简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的DNA构建体
将如上所述制备的编码TNFR2可溶性胞外结构域的DNA片段和编码免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段混合在同一试管内后,诱导共同序列(该序列包括TNFR2可溶性胞外结构域3’端和IgG1铰链区5’端)间的互补结合。将该混合物作为模板,使用具有编码TNFR2 5’端的序列的引物(SEQ ID NO:29所示核苷酸序列)和具有编码IgG1Fc 3’端的序列的另一条引物(SEQ ID NO:28所示核苷酸序列),进行PCR,扩增包括编码TNFR2可溶性胞外结构域的DNA片段及编码IgG1 Fc片段的DNA片段的DNA构建体。构建的基因包括前导序列,以促进蛋白在表达后分泌。
c.克隆编码简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的DNA构建体
将上述的编码简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的DNA构建体用EcoRI和XbaI限制酶切,并将其插入到市售的克隆载体pBluescriptKS II(+)(Stratagene,USA)的EcoRI/XbaI位点进行克隆。通过DNA测序测定总编码区的序列(SEQ ID NO:3)。这样制备的融合蛋白为简单融合单体蛋白,命名为TNFR2/Fc,图1所示的椭圆形代表融合基因初级表达产物的结构。推定的该简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:4。
C.制备编码多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体(图2和图5)
为制备含有多联形式的TNFR1可溶性胞外结构域的融合基因,即编码TNFR1-TNFR1/Fc多联融合单体蛋白的构建体,利用PCR,将BamHI限制酶切位点分别插入到TNFR1可溶性胞外结构域序列以及如上构建的编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体中,然后用连接酶连接BamHI限制酶切产生的每条片段区域。将如上制备的编码简单融合单体蛋白TNFR1/Fc的DNA构建体,用作本次反应的模板。
分别利用相应于SEQ ID NO:25核苷酸序列的引物和相应于SEQID NO:33核苷酸序列的另一条引物,通过PCR扩增3’端带有BamHI限制酶切位点的TNFR1可溶性胞外结构域的片段;利用相应于SEQID NO:28核苷酸序列的引物和相应于SEQ ID NO:32核苷酸序列的另一条引物,通过PCR扩增5’端带有BamHI限制酶切位点的TNFR1/Fc简单融合单体蛋白的另一片段。加入1μl初级cDNA,2U Pfu DNA聚合酶(Stratagene,USA),10μl 10X反应缓冲液[200mM Tris-HCl,pH8.75,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mM MgCl2],1%TritonTMX-100,1mg/ml BSA,3μl引物1(10μM),3μl引物2(10μM),2μl dNTP(每种10mM),补加三蒸水使总体积为100μl,进行PCR反应。反应条件如下:94℃ 5min;95℃ 1min;58℃ 1.5min;72℃ 1min,31个循环;并72℃ 15min,使PCR产物延伸完全末端补齐。
在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后,用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen,USA)纯化PCR产物。该纯化的PCR产物用BamHI限制酶切,并用苯酚-氯仿抽提方法抽提。然后,用连接酶连接BamHI限制酶切产生的两种DNA片段。
D.制备编码TNFR2-TNFR2/Fc多联融合单体蛋白的DNA构建体(图2和图5)
当利用PCR,将BamHI限制酶切位点分别插入到TNFR2可溶性胞外结构域序列及上述制备的编码简单融合单体蛋白TNFR2/Fc的DNA构建体中后,用连接酶连接BamHI限制酶切产生的每条片段区域,得到编码多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体。
利用相应于SEQ ID NO:34核苷酸序列的引物和相应于SEQ IDNO:35核苷酸序列的引物,扩增3’端带有BamHI限制酶切位点的TNFR2可溶性胞外结构域的片段。如同TNFR1一样进行PCR,只是将如上制备的、编码SEQ ID NO:3的简单融合单体蛋白的DNA构建体作为模板。PCR产物用如TNFR1相同的方法纯化。
E.编码带有糖基化基序的多联融合单体蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA构建体
使用反义引物(SEQ ID NO:37的核苷酸序列)和另一引物(SEQID NO:25的核苷酸序列),通过PCR制备DNA片段,所述反义引物具有编码第一个TNFR1可溶性胞外结构域3’端部分区域(SEQ ID NO:5的565-591位核苷酸序列)的序列,但除外TNFR1可溶性胞外结构域连接区的疏水性多肽区域的序列(SEQ ID NO:6的197-216位氨基酸序列),还具有编码第二个TNFR1可溶性胞外结构域5’端部分区域(SEQ ID NO:5的649-681位核苷酸序列)的序列,所述另一引物具有编码EcoRI限制酶切位点以及前导序列的序列。
另外,通过制备上述引物(SEQ ID NO:36和37的核苷酸序列),插入编码糖基化位点的总共四条氨基酸序列(SEQ ID NO:10的189-191,192-194,198-200和204-206位氨基酸序列),相应于SEQ IDNO:5的565-567位核苷酸(CTG,Leu),574-576(ACG,Thr),652-654(CTA,Leu)和670-672(AGA,Arg)被核苷酸AAC(Asn,N)替代;SEQ ID NO:5的571-573位(TGC,Cys)和580-582(TTG,Leu)位核苷酸被核苷酸ACC(Thr,T)替代;658-660位核苷酸(GAC,Asp)被TCC(Ser,S)替代。
在该反应中,编码多联形式的TNFR1-TNFR1/Fc的基因(SEQ IDNO:5的核苷酸)被用作模板。在一级PCR过程中,反义引物只有一半被诱导与用作模板的、编码多联形式TNFR1-TNFR1/Fc的基因结合,并且,随着链式反应进行,未与模板结合的部分在聚合酶的作用下,被诱导形成完整的双链DNA,这样就能够产生编码第二个可溶性胞外结构域的部分区域的5’端序列与编码TNFR1可溶性胞外结构域包括前导序列的3’端序列之间相连状态的DNA片段。所以,编码第二个可溶性胞外结构域的5’端序列部分区域就能够结合下述的第二个DNA片段。
第二个DNA片段是使用引物(SEQ ID NO:36的核苷酸序列)和反义引物(SEQ ID NO:28的核苷酸序列),通过PCR制备,所述引物具有编码第一个TNFR1可溶性胞外结构域3’端部分区域(SEQ IDNO:5的565-591位核苷酸序列)以及第二个TNFR1可溶性胞外结构域5’端部分区域(SEQ ID NO:5的649-681位核苷酸序列)的序列,所述反义引物具有编码XbaI限制酶切位点以及IgG1 Fc 3’端的序列。该反应也如上进行,即,反义引物仅有一半被诱导与模板结合,于是象上述一样DNA片段就具有了编码TNFR1胞外结构域的5’端包括第一个可溶性胞外结构域3’端部分区域的序列。
接下来,将上述PCR制备的两种DNA片段混合在同一试管内,使共同序列之间结合,并利用引物(SEQ ID NO:25和28的核苷酸序列)通过PCR进行融合,所述引物编码每个多联基因的5’和3’端,产物命名为mgTNFR1-TNFR1-IgG。
F.编码带有糖基化基序的多联融合单体蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA构建体
使用反义引物(SEQ ID NO:39的核苷酸序列)和另一引物(SEQID NO:29的核苷酸序列),通过PCR制备DNA片段,所述反义引物具有编码第一个TNFR2可溶性胞外结构域3’端部分区域(SEQ ID NO:7的586-606位核苷酸序列)的序列,但除外TNFR2可溶性胞外结构域连接区的疏水性多肽区域的序列(SEQ ID NO:8的203-263位氨基酸序列),还具有编码第二个TNFR2可溶性胞外结构域5’端部分区域(SEQ ID NO:7的790-807位核苷酸序列)的序列,所述另一引物具有编码EcoRI限制酶切位点以及前导序列的序列。
另外,通过制备上述引物(SEQ ID NO:38和39的核苷酸序列),插入编码糖基化位点的总共两条氨基酸序列(SEQ ID NO:12的199-201和206-208位氨基酸序列),相应于SEQ ID NO:7的595-597位核苷酸(GTC,Val)和799-801位核苷酸(GGG,Gly)被核苷酸AAC(Asn,N)替代。
在该反应中,编码多联形式的TNFR2-TNFR2/Fc的基因(SEQ IDNO:7的核苷酸)被用作模板。在一级PCR过程中,反义引物只有一半被诱导与用作模板的、编码多联形式TNFR2-TNFR2/Fc的基因结合,并且,随着链式反应进行,未与模板结合的部分在聚合酶的作用下,被诱导形成完整的双链DNA,这样就能够产生编码第二个可溶性胞外结构域部分区域的5’端序列与编码TNFR2可溶性胞外结构域包括前导序列的3’端序列之间相连状态的DNA片段。所以,编码第二个可溶性胞外结构域的5’端序列的部分区域就能够结合下述的第二个DNA片段。
第二个DNA片段是使用引物(SEQ ID NO:38的核苷酸序列)和反义引物(SEQ ID NO:28的核苷酸序列)通过PCR制备的,所述引物具有编码第一个TNFR2可溶性胞外结构域3’端部分区域(SEQ IDNO:7的586-606位核苷酸序列)以及第二个TNFR2可溶性胞外结构域5’端部分区域(SEQ ID NO:7的790-807位核苷酸序列)的序列,所述反义引物具有编码XbaI限制酶切位点以及IgG1 Fc 3’端的序列。该反应如上进行,即,反义引物仅有一半被诱导与模板结合,于是象上述一样的DNA片段就具有了编码TNFR2胞外结构域的5’端,包括第一个可溶性胞外结构域3’端部分区域的序列。
接下来,将上述PCR制备的两种DNA片段混合在同一试管内,使共同序列之间结合,并利用引物(SEQ ID NO:29和28的核苷酸序列)通过PCR进行融合,所述引物编码每个多联基因的5’和3’端,产物命名为mgTNFR2-TNFR2-IgG。
G.克隆编码多联融合单体蛋白TNFR-TNFR/Fc及其糖基化形式的DNA构建体
将如上所述的编码多联融合单体蛋白TNFR-TNFR/Fc及其糖基化形式的DNA构建体插入到pBluescript KS II(+)(Stratagen,USA)的EcoRI/XbaI位点而进行克隆。这样获得的融合蛋白中,多联融合单体蛋白被命名为TNFR1-TNFR1/Fc和TNFR2-TNFR2/Fc,其糖基化形式被命名为mgTNFR1-TNFR1/Fc和mgTNFR2-TNFR2/Fc。推定的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO:6,8,10和12。
将10μg用作载体的pBluescript KS II(+)(Stratagen,USA)与15UEcoRI,15U XbaI,5μl 10X反应缓冲液(100mM Tris-HCl,pH7.5,100mM MgCl2,10mM DTT,500nM NaCl),5μl 0.1%的BSA(Takara,Japan)混合,加入三蒸水补足体积到50μl,在37℃下孵育2小时,对DNA进行限制酶切。在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳后,用Qiaex II凝胶抽提试剂盒(Qiagen,USA)纯化PCR产物。
将100ng经过了EcoRI和XbaI限制酶切的pBluescript KS II(+)(Stratagen,USA)与20ng经过所述限制酶切的PCR产物,0.5U T4DNA连接酶(Amersham,USA),1μl 10X反应缓冲液(300mMTris-HCl,pH7.8,100mM MgCl2,100mM DTT,10mM ATP)混合,加入三蒸水补足体积到10μl,在16℃水浴孵育混合物16小时。用氯化铷(RbCl,Sigma,USA)方法将E.coli Top10(Novex,USA)制备成感受态细胞,并进行转化,然后涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素(Sigma,USA)的固体LB培养基上,并在37℃孵育16小时。将形成的菌落接种到4ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中,并在37℃孵育16小时。根据Sambrook等人(Molecular cloning,Cold SpringHarbor Laboratory出版,p1.25-1.31,p1.63-1.69,p7.26-7.29,1989)的碱裂解法,从1.5ml上述孵育培养液纯化质粒,用EcoRI和XbaI限制酶切证实克隆的存在。
如下所述,用双脱氧链终止DNA测序法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.,74:5483,1977)鉴定总编码区的序列。使用上述碱裂解法纯化的质粒和SequenaseTM ver 2.0(Amersham,USA),根据手册进行DNA测序反应。当上述的反应混合物被加样到6%的聚丙烯酰胺凝胶上后,以1800-2000V的恒定电压,在50℃电泳2小时,凝胶变干后,通过曝光于X-射线底片(Kodak,USA)鉴定DNA序列。
实施例2和3
CD2和CTLA4
通过PCR,使用引物[CD2(SEQ ID NO:40的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:43的核苷酸序列)]和反义引物[CD2(SEQ IDNO:41的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:44的核苷酸序列)],构建编码CD2和CTLA4可溶性胞外结构域的DNA片段,其中所述引物具有EcoRI限制酶切位点及编码前导序列[CD2(SEQ ID NO:14的1-24位氨基酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:16的1-21位氨基酸序列)]的编码序列[CD2(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ IDNO:15的核苷酸序列)],所述反义引物具有PstI限制酶切位点和编码上述蛋白可溶性胞外结构域3’端的序列[CD2(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:15的核苷酸序列)]。该反应的模板cDNA用从健康成人单核细胞(T淋巴细胞)抽提的mRNA通过逆转录PCR(RT-PCR)制备。
同样,使用带有PstI限制酶切位点以及IgG1恒定区5’端编码序列的引物(SEQ ID NO:42的核苷酸序列),和带有XbaI限制酶切位点以及IgG1 Fc 3’端编码序列的反义引物(SEQ ID NO:28的核苷酸序列),通过PCR来构建编码免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA构建体。该反应所用模板cDNA用从恢复期的未明原因发热患者的外周血液细胞(B淋巴细胞)抽提的mRNA进行RT-PCR来制备。
接下来,用PstI对如上述制备的编码CD2和CTLA4可溶性胞外结构域的DNA片段以及编码免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段进行限制酶切,然后使用T4 DNA连接酶进行连接,构建简单二聚形式的CD2/Fc和CTLA4/Fc基因。构建的基因含有前导序列以促进蛋白在表达后分泌。
上述的DNA构建体用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行限制酶切,并插入到市售克隆载体pBluescript KS II(+)(Stratagene,USA)的EcoRI/XbaI位点,进行克隆。进行DNA测序来鉴定整个编码区的序列(SEQ ID NO:13和15)。这些所产生的融合蛋白被命名为CD2/Fc和CTLA4/Fc,其推定的氨基酸序列相应于SEQ ID NO:14和16。
加入1μl初级cDNA,2U Pfu DNA聚合酶 (Stratagene,USA),10μl 10X反应缓冲液[200mM Tris-HCl,pH8.75,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mM MgCl2],1%TritonTMX-100,1mg/ml BSA,3μl引物1(10μM),3μl引物2(10μM),2μl dNTP(每种10mM),补加三蒸水使总体积为100μl,进行PCR反应。反应条件如下:94℃ 5min;95℃ 1min;58℃ 1.5min;72℃ 1min,31个循环;并72℃ 15min,使PCR产物延伸完全末端补齐。
多联形式的CD2-CD2/Fc和CTLA4-CTLA4/Fc融合基因如下构建。
为制备含有多联形式的CD2和CTLA4可溶性胞外结构域的融合基因,利用连接酶进行平头末端连接,使用PstI限制性内切酶和T4DNA连接酶,将CD2和CTLA4可溶性胞外结构域序列插入到带有平头末端的简单二聚体形式融合基因的细胞外结构域和免疫球蛋白之间的连接区。具体而言,通过PCR,使用引物[CD2(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:48的核苷酸序列)]和反义引物[CD2(SEQ ID NO:46)和CTLA4(SEQ ID NO:48)],构建DNA构建体,其中所述引物具有编码可溶性胞外结构域前导序列末端[CD2(SEQ ID NO:14的25位氨基酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:16的22位氨基酸序列)]的编码序列[CD2(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:15的核苷酸序列)],所述反义引物具有编码上述可溶性胞外结构域3’端的序列[CD2(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO:15的核苷酸序列)]。将上述的简单融合单体基因[CD2/Fc(SEQ ID NO:13的核苷酸序列)和CTLA4/Fc(SEQ ID NO:15的核苷酸序列)]用作该反应的模板。
此外,CD2/Fc和CTLA4/Fc,以简单单体形式被插入到pBluescript KS II(+)中,使用限制性内切酶PstI将其制备成具有3’突出端。用T4 DNA聚合酶处理,使3’突出端的切头端部分缺失,以形成平头末端。为制备可溶性胞外结构域多联体形式的融合基因,将上述PCR制备的CD2和CTLA4可溶性胞外结构域插入处理成平头末端的简单单体基因的切头中,进行克隆。这些所产生的融合蛋白被命名为CD2-CD2/Fc和CTLA4-CTLA4/Fc,为多联融合单体蛋白的形式,其推定的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO:18和20。
多糖基化形式的多联融合基因如下构建。
使用引物(该引物包括EcoRI限制酶切位点和带前导序列的可溶性胞外结构域),以及反义引物(该反义引物具有编码多联形式融合基因第一个可溶性胞外结构域3’端部分和带有糖基化基序替代核苷酸的第二个可溶性胞外结构域5’端部分的序列),通过PCR制备得到DNA片段;再使用引物(该引物具有编码多联形式融合基因第一个可溶性胞外结构域3’端部分和带有糖基化基序替代核苷酸的第二个可溶性胞外结构域5’端部分区域的序列),以及反义引物(该反义引物具有编码免疫球蛋白G1 Fc片段3’端的序列和XbaI限制酶切位点),通过PCR制备得到另一DNA片段,将上述得到的两种DNA片段混合在同一试管内,通过二级PCR插入糖基化基序。
至于多联融合基因CD2/Fc和CTLA4/Fc,是根据上述TNFR/Fc相同的方法,使用修饰的引物,通过PCR插入糖基化基序,但是其与TNFR/Fc的差别在于与CD2和CTLA4可溶性胞外结构域结合的氨基酸序列保持不变。
在CD2/Fc和CTLA4/Fc多联融合蛋白的多糖基化过程中,CD2/Fc是使用制备的引物,通过插入总共2个糖基化基序肽区域(SEQ ID NO:22的200-202和206-208位氨基酸序列)而完成,所述制备的引物中SEQ ID NO:17的598-600(CCT,Pro)和616-618(GAG,Glu)位核苷酸被AAT(Asn,N)替代,而CTLA4/Fc是使用制备的引物(SEQ IDNO:51和52),通过插入总共3个糖基化基序肽区域(SEQ ID NO:24的136-138,142-144,和147-149位氨基酸序列)而完成,所述制备的引物中SEQ ID NO:19的403-405(GTA,Val)和424-426(CCA,Pro)位核苷酸被AAT(Asn,N)替代;409-411(GAT,Asp)和445-447(GTG,Val)位核苷酸被ACA(Thr,T)和ACG(Thr,T)替代。这样产生的融合蛋白被命名为mgCD2-CD2/Fc和mgCTLA4-CTLA4/Fc,为多联融合单体蛋白,其推定的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO:22和24。
实施例4
TNFR/Fc简单/多联融合二聚蛋白的表达和纯化
为在CHO-K1细胞(ATCC CCL-61,卵巢,中国仓鼠,灰仓鼠(Cricetulus griseus))中表达融合蛋白,从转化的E.coli中纯化含有TNFR/Fc融合基因的pBluescript KS II(+)质粒DNA,将利用EcoRI和XbaI限制酶切作用产生的TNFR/Fc片段插入动物细胞表达载体pCRTM3(Invitrogen,USA)质粒的EcoRI/XbaI位点中,构建动物细胞表达载体。将其命名为质粒pTR11-Top 10’和质粒pTR22-Top 10’,并于2001年7月10日保藏在Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM),保藏号分别为KCCM 10288和KCCM 10291。
将含有上述TNFR/Fc融合基因的质粒pTR11-Top 10’或质粒pTR22-Top 10’DNA与LipofenctaminTM试剂(Gibco BRL,USA)混合,进行转染。1-3×105细胞/孔的CHO-K1细胞被接种在6孔组织培养板(Nunc,USA)上,在10%FBS-DMEM培养基中培养至50-80%,然后将DNA-脂质体复合体和2-25μl LipofenctaminTM试剂(GibcoBRL,USA)加入细胞培养板中不含血清的DMEM培养基内,所述复合体与1-2μg含有上述TNFR/Fc融合基因的质粒pTR11-Top 10’或质粒pTR22-Top 10’DNA反应了15-45min。培养5小时后,加入带有20%血清的DMEM培养基,继续培养细胞18-24小时。初次转染后,将细胞在含1.5mg/ml Geneticin(G418,Gibco BRL,USA)的10%FBS-DMEM培养基中培养3周,筛选形成的菌落,用于扩增培养。使用过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(KPL,USA),利用ELISA分析融合蛋白的表达。
ELISA如下进行。首先,用0.1M碳酸氢钠将1mg/ml过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(KPL,USA)稀释到1∶2000,然后向96孔柔性板(Falcon,USA)中等份加入100μl该稀释液,并用塑料膜密封,然后在4℃孵育超过16小时,使其包被到板的表面。然后,用洗涤缓冲液(0.1%Tween-20在1×PBS中)和稀释缓冲液(48.5ml1×PBS,1.5mlFBS,50ul Tween-20)洗涤3次,再将其等分为180l。向第一个孔中滴入20μl培养上清液后,使用微量移液管将其连续稀释,将0.01μg/μl的人免疫球蛋白G(Sigma,USA)作为阳性对照,未转染CHO K-1细胞的培养基作为阴性对照,将其同样稀释。稀释后,用铝箔包裹96孔ELISA板(Falcon,USA),并在37℃孵育1.5小时,用洗涤缓冲液洗涤三次。用稀释缓冲液以1∶5000稀释结合过氧化物酶的山羊抗人IgG(KPL,USA),等分100μl,用铝箔包裹,在37℃反应1小时。反应后,将板洗涤三次,使用TMB微孔过氧化物酶底物体系(KPL,USA)显色,使用微板读板器(Bio-Rad,Model 550,Japan)测定655nm波长下的吸光度,以检验是否存在表达。
上述制备的转染子被命名为TR11Ig-CHO和TR22Ig-CHO,并于2001年7月7日保藏在Korea Cell Line Research Foundation(KCLRF),保藏号分别为KCLRF-BP-00046和KCLRF-BP-00049。为纯化上述转染子所产生的蛋白,使这些转染子适应一种不含血清的培养基CHO-S-SFM II(Gibco BRL,USA),具体过程如下。将3×105细胞接种到6孔板上,在5%CO2,37℃下培养超过16小时,使其粘附,在显微镜下检查,约有30-50%的板面积被细胞覆盖,然后将细胞培养在培养基中,培养基由10%FBS DMEM和CHO-S-SFM II构成,比例为8∶2。当以该比例培养连续传代3次后,以6∶4的比例培养3次;以4∶6培养3次;3∶7培养3次,以2∶8培养3次;1∶9培养3次;最终在100%的CHO-S-SFM II培养基中培养。通过ELISA检测表达水平。
当在CHO-S-SFM II中大规模培养这些转染细胞时,200Xg离心含各种融合蛋白的上清液12分钟,以去除细胞碎屑,通过使用HiTrap蛋白A柱(Amersham,USA)的方法,如下所述纯化蛋白。将20mM磷酸钠(pH7.0,Sigma,USA)以1ml/min的速度过柱2min,将10ml上清以相同的速度过柱,使融合蛋白与蛋白A结合。将20mM磷酸钠(pH7.0)以相同的速度过柱2min,进行洗涤,然后将0.1M柠檬酸(pH3.0,Sigma,USA)以相同的速度过柱3min,将500μl提取物连续分部收集到1.5ml试管中。使用1M Tris(pH11.0,USB,USA)将其调节至pH7.0,按上述的ELISA检验试管中是否存在融合蛋白。用Centricon 30(Amicon,USA),以2000Xg在4℃离心30min,使纯化蛋白浓缩。
实施例5
纯化的TNFR1-TNFR1/Fc和TNFR2-TNFR2/Fc的SDS-PAGE(图
15)
利用SDS-PAGE方法,在加入还原剂(其破坏二硫键)DTT而形成的还原条件以及不含DTT的非还原条件下,将利用蛋白A柱纯化的蛋白进行电泳。表10中显示了SDS-PAGE上分子量的估算结果。可以证实TNFR/Fc蛋白是以二聚体的形式存在于细胞中。从TNFR1-TNFR1-Ig的氨基酸序列推导出的分子量为约70kDa,而在SDS-PAGE中估计为约102kDa。可将这种差异视为糖蛋白电泳所产生的普通现象,该特征似乎是糖基化位点降低了电泳迁移率而致。
表10.SDS-PAGE中TNFR-TNFR/Fc的分子量
蛋白 |
分子量(kDa) |
还原条件 |
非还原条件 |
TNFR1-TNFR1/Fc |
102 |
200 |
TNFR2-TNFR2/Fc |
115 |
220 |
实施例6
简单/多联融合二聚TNFR/Fc融合蛋白对TNFα和TNFβ细胞毒
性的中和作用实验
L929细胞[ATCC,Mus musculus(小鼠),NCTC克隆929(来自L株;L-929;L细胞)用于测试TNFR/Fc融合蛋白对TNFα和TNFβ诱导的细胞毒性的抑制作用。该分析是基于TNFR具有抑制TNF诱导的细胞毒性的活性(Scallon等,Cytokine 7:759,1995)。
将L929以3×104细胞/孔的量接种在96孔板内,并在CO2培养箱内37℃孵育24小时。然后加入放线菌素D(Sigma,USA)使其浓度为3μg/ml,将细胞与TNFα和TNFβ以及连续10次稀释的TNFR试样共同孵育16-18小时,其中TNFα和TNFβ的浓度为表达100%细胞毒性(0.5-2ng/ml)。然后,用染色试剂结晶紫(Wako Pure ChemicalIndustries,Japan)染色96孔板内的细胞,使用分光光度计(Bio-Rad,Model-550,Japan),利用在595nm波长下的吸光度来估算细胞活性。
表11显示了每种TNFR/Fc融合蛋白的IC50,多联融合蛋白(TNFR1-TNFR1/Ig和TNFR2-TNFR2/Ig)显示出对两种TNF诱导的细胞毒性的抑制作用比简单二聚融合蛋白(TNFR1/Ig和TNFR2/Ig)的抑制作用强。同样,比较现有的简单融合二聚体和本发明多联形式TNFR/Fc融合蛋白二聚体对TNFα(图16)和TNFβ(图17)细胞毒性的抑制作用,更清楚地显示出本发明多联形式TNFR/Fc融合蛋白二聚体显著地抑制TNFα和TNFβ的细胞毒性。
表11.对细胞毒性抑制作用的IC
50
融合蛋白 |
IC50(ug/ml) |
|
TNFα处理 |
TNFβ处理 |
简单二聚体 |
[TNFR1/Fc]2 |
63 |
129 |
[TNFR2/Fc]2 |
189 |
469 |
多联二聚体 |
[TNFR1-TNFR1/Fc]2 |
9 |
20 |
[TNFR2-TNFR2/Fc]2 |
15 |
15 |
实施例7
简单/多联融合二聚体CD2/Fc融合蛋白和CTLA4/Fc融合蛋白对
活性免疫细胞增殖的抑制作用实验
WT100B1S,一种B淋巴细胞系,是通过用Ebstein-Barr病毒转染不明原因发热患者B淋巴细胞而制备得到,将该细胞接种在补充10%FBS的RPMI 1640中,用作T淋巴细胞的抗原呈递细胞。2000rpm离心2min使其沉淀后,将该细胞重悬在补充10%FBS的RPMI 1640中,使浓度达到5.0×105细胞/ml,然后接受3000rd γ-射线照射。
使用Ficoll-hypaque(Amersham,USA)从健康成人血液中分离T淋巴细胞,然后培养在补充10%FBS的RPMI 1640中,使其浓度达到2.0×106细胞/ml。
为进行初次混合淋巴细胞反应(MLR),将各15ml的WT100B1S和T淋巴细胞混合到150mm细胞培养皿中,培养3天,然后加入15ml补充10%FBS的RPMI 1640继续培养3天。经过了总共6天的培养后,使用上述的Ficoll-hypaque(Amersham,USA)纯化活T淋巴细胞,用含有45%FBS,45%RPMI 1640和10%DMSO的培养基,将纯化的T淋巴细胞冷冻后保藏在液氮中。
初次MLR反应的T淋巴细胞被解冻以进行二次MLR,用RPMI1640培养基洗涤细胞2次,并用补充10%FBS的RPMI 1640将其制备成细胞浓度为3.0×105细胞/ml的悬液。
用上述方法重新培养用作为抗原呈递细胞的WT100B1S,然后接受3000rd γ-射线的照射,用补充10%FBS的RPMI 1640制备成7.5×104细胞/ml的悬液。向96孔平底细胞培养板中加入100μl制备的WT100B1S,并与CD2/Fc和CTLA4/Fc融合蛋白混合,所述蛋白终浓度为10,1,10-1,10-2,10-3和10-4μg/ml,加入100μl上述初次MLR反应的T淋巴细胞。在5%CO2,37℃培养箱内孵育2天后,加入100μl补充10%FBS的RPMI 1640并继续孵育2天。在总共6天孵育的最后6个小时内,加入1.2μCi/ml 3H-胸苷(Amersham,USA)与细胞共同孵育。
培养结束后,将96孔板在4℃,110Xg离心10min,沉淀T淋巴细胞,去除上清,并用200μl 1XPBS洗涤沉淀。在相同的条件下离心,去除PBS,然后加入200μl冰冷的三氯乙酸(TCA,Merck,USA),混合2min,然后在4℃下反应5min以去除3H-胸苷残余。
上述相同条件下离心后,去除上清,加入200μl冰冷的70%乙醇,在4℃孵育5min,使T淋巴细胞固定。离心后去除上清,用上述相同的10%TCA处理方法彻底去除3H-胸苷(Amersham,USA)残余。
与100μl 2% SDS(pH8.0)和0.5N NaOH在37℃反应30min,进行细胞溶解,在25℃,110Xg离心10min,沉淀T淋巴细胞,然后将50μl上清转移到96孔样品板(Wallac,USA)。向上清中加入1.5体积的OptiPhase SuperMix(Wallac,USA),并混合5min,使用1450MicroBeta TriLux微量板液体闪烁发光计数器(Wallac,USA),测定3H的cpm值,检验是否存在T淋巴细胞增殖。
实施例8
小鼠中糖基化多联融合二聚蛋白对延长血浆半衰期的作用实验
将5μg纯化的融合蛋白腹腔内注射到小鼠体内(ICR,Samtako,Korea),并以最大周期120小时(5天)的定时间隔抽取血液,通过ELISA测定蛋白的浓度,测定糖基化多联融合二聚蛋白[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2,[mgTNFR2-TNFR2/Fc]2,[mgCD2-CD2/Fc]2,和[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2的血浆半衰期。如图20,图21和图22所示,可以看出糖基化多联融合二聚蛋白的血浆半衰期高于相应的天然形式简单融合二聚蛋白,从而可预期持续的作用会提高其效力。
实施例9
简单/多联TNFR/Fc融合蛋白二聚体对DBA/1小鼠中胶原诱导的
关节炎的作用实验
给每只DBA/1小鼠尾部注射100μg以2mg/ml浓度溶解在0.05M醋酸中的II型胶原和Arthrogen-CIA佐剂(Chondrex,USA),使其形成胶原诱导的关节炎(CIA)。使用不完全弗氏佐剂(Difco,USA)在3周后进行加强。
用100μgII型胶原免疫DBA/1小鼠后3-4周形成关节炎。发病后3-5天观察到小鼠红肿脚爪,炎性关节炎持续超过3-4周。尽管最终炎症有所缓解,损伤的关节永久保持僵硬。在表12的基础上,每周测定2-3次关节炎的程度,表12显示关节炎严重程度的主观指数(每次实验测定平均5只小鼠)。为测定简单和多联融合二聚TNFR/Fc对CIA的作用,将TNFR/Fc或PBS腹腔内注射到小鼠体内。每次实验中,将TNFR/Fc以每2天10μg的量在19-45天注射5只小鼠(图23中的箭头)。向5只小鼠注射PBS作为对照。如图7所示,可看出,对小鼠注射现有的简单二聚形式TNFR/Fc融合蛋白的效果比作为对照的PBS注射的小鼠关节炎指数降低约26-38%,而注射了多联形式二聚体[TNFR1-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2的小鼠则降低了42-55%。所以,可以看出多联融合二聚TNFR/Fc融合蛋白相比于现有的简单融合二聚TNFR/Fc融合蛋白,显著地降低小鼠关节炎。
表12.关节炎严重程度评分
严重程度评分 |
疾病状况 |
0 |
无红斑和肿胀 |
1 |
仅限于踝和跗骨部的红斑以及轻度肿胀 |
2 |
红斑以及轻度肿胀从踝扩展到跗骨处 |
3 |
红斑以及轻度肿胀从踝扩展到跖骨关节 |
4 |
红斑以及严重肿胀扩展到踝,腿和趾 |
以上的结果显示多联形式的二聚TNFR/Fc融合蛋白对降低CIA的发展速度比现有的简单融合蛋白更加有效,所以,在应用于治疗关节炎方面,多联形式的蛋白组合物会比现有的蛋白组合物更加有效。
本发明的多联蛋白,多联融合二聚蛋白及其糖基化蛋白能够提高效力,并具有高稳定性,能够高产量地生产。
工业实用性
序列表
<110>MeDexGen Inc.
CHUNG,Yong Hoon
HAN,Ji Woong
LEE,Hye Ja
CHOI,Eun Yong
KIM,Jin Mi
YIM,Soo Bin
<120>通过多联体化制备Ig-融合蛋白的方法,由该方法制备的TNFR/Fc、CD2/Fc、CTLA4/Fc融合蛋白,编码所述蛋白的DNA,包括所述DNA的载体,和由载体TOR转化的细胞
<160>52
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>1335
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1332)
<223>TNFR1-IgG
<220>
<221>C_region
<222>(634)..(1335)
<223>铰链,CH2,CH3区
<220>
<221>misc_signal
<222>(160)..(168)
<223>N-连接的糖基化位点
<220>
<221>misc_signal
<222>(433)..(441)
<223>N-连接的糖基化位点
<220>
<221>misc_signal
<222>(451)..(459)
<223>N-连接的糖基化位点
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(15)
<223>PCR引物SEQ ID:25结合位点
<220>
<221>primer_bind
<222>(616)..(652)
<223>PCR引物SEQ ID:26(反义)结合位点
<220>
<221>primer_bind
<222>(616)..(651)
<223>PCR引物SEQ ID:27结合位点
<220>
<221>primer_bind
<222>(1312)..(1335)
<223>PCR引物SEQ ID:28(反义)结合位点
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(60)
<223>信号肽
<400>1
atg ggc ctc tcc acc gtg cct gac ctg ctg ctg ccg ctg gtg ctc ctg 48
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
gag ctg ttg gtg gga ata tac ccc tca ggg gtt att gga ctg gtc cct 96
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
cac cta ggg gac agg gag aag aga gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa 144
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa 192
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac 240
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc acc gct tca gaa aac cac ctc 288
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa atg ggt cag gtg 336
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg 384
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag 480
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa 528
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg 576
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc act gag gac tca 624
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca 672
Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc 720
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 768
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 816
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 864
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc 912
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 960
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc 1008
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1056
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 1104
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 1152
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1200
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1248
Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1296
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Mst His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210>2
<211>444
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Sar His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lye Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys
435 440
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<212>DNA
<213>智人
<220>
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
<221>misc_signal
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<220>
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<220>
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<222>(754)..(790)
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<220>
<221>primer_bind
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<220>
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<223>信号肽
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atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga ctg gag ctc 48
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag 144
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa 192
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc act ggc 768
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
gac gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 816
Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 864
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 912
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 960
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 1008
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1056
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1104
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1152
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1200
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1248
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1296
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tcc ttc 1344
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe
435 440 445
ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1392
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cactac acg 1440
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1473
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
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<211>490
<212>PRT
<213>智人
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Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
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<212>DNA
<213>智人
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<220>
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
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<222>(1864)..(1887)
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<220>
<221>sig_Peptide
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<223>信号肽
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atg ggc ctc tcc acc gtg cct gac ctg ctg ctg ccg ctg gtg ctc ctg 48
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
gag ctg ttg gtg gga ata tac ccc tca ggg gtt att gga ctg gtc cct 96
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
cac cta ggg gac agg gag aag aga gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa 144
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa 192
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac 240
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc acc gct tca gaa aac cac ctc 288
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa atg ggt cag gtg 336
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg 384
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag 480
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa 528
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg 576
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc act gag gac gga 624
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Gly
195 200 205
tcc ggg aac att tca ctg gtc cct cac cta ggg gac agg gag aag aga 672
Ser Gly Asn Ile Ser Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg
210 215 220
gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat aat tcg 720
Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser
225 230 235 240
att tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt 768
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
245 250 255
cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc 816
Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
260 265 270
ttc acc gct tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa 864
Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
275 280 285
tgc cga aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tct tct tgc aca gtg gac 912
Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp
290 295 300
cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat tat tgg 960
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
305 310 315 320
agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg 1008
Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
325 330 335
acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc 1056
Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys
340 345 350
cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac 1104
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
355 360 365
tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg aag ttg tgc cta ccc cag att gag 1152
Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu
370 375 380
aat gtt aag ggc act gag gac tca ggc acc aca gca gag ccc aaa tct 1200
Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser
385 390 395 400
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 1248
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
405 410 415
ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 1296
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
420 425 430
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 1344
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
435 440 445
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 1392
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
450 455 460
gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 1440
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
465 470 475 480
tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1488
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
485 490 495
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1536
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
500 505 510
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1584
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
515 520 525
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 1632
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
530 535 540
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1680
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
545 550 555 560
gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1728
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
565 570 575
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc 1776
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
580 585 590
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1824
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
595 600 605
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag ago ctc tcc ctg 1872
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
610 615 620
tct ccg ggt aaa tga 1887
Ser Pro Gly Lys
625
<210>6
<211>628
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Gly
195 200 205
Ser Gly Asn Ile Sar Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg
210 215 220
Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser
225 230 235 240
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
245 250 255
Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
275 280 285
Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp
290 295 300
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
305 310 315 320
Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
325 330 335
Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys
340 345 350
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
355 360 365
Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu
370 375 380
Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser
385 390 395 400
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
405 410 415
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
420 425 430
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
435 440 445
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
450 455 460
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
465 470 475 480
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
485 490 495
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
500 505 510
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
515 520 525
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
530 535 540
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
545 550 555 560
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
565 570 575
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
580 585 590
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
595 600 605
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
610 615 620
Ser Pro Gly Lys
625
<210>7
<211>2163
<212>DNA
<213>智人
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>信号肽
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atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gog ctg gcc gtc gga ctg gag ctc 48
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag 144
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa 192
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc gga tcc 768
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Gly Ser
245 250 255
aac gca act aca ccc tac gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc 816
Asn Ala Thr Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu
260 265 270
aga gaa tac tat gac cag aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg 864
Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser
275 280 285
ccg ggc caa cat gca aaa gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg 912
Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val
290 295 300
tgt gac tcc tgt gag gac agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt 960
Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val
305 310 315 320
ccc gag tgc ttg agc tgt ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa 1008
Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu
325 330 335
act caa gcc tgc act cgg gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc 1056
Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro
340 345 350
ggc tgg tac tgc gcg ctg agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg 1104
Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala
355 360 365
ccg ctg cgc aag tgc cgc ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act 1152
Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr
370 375 380
gaa aca tca gac gtg gtg tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc 1200
Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser
385 390 395 400
aac acg act tca tcc acg gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac 1248
Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn
405 410 415
gtg gtg gcc atc cct ggg aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc 1296
Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser
420 425 430
acg tcc ccc acc cgg agt atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag 1344
Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln
435 440 445
cca gtg tcc aca cga tcc caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc 1392
Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser
450 455 460
act gct cca agc acc tcc ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca 1440
Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro
465 470 475 480
gct gaa ggg agc act ggc gac gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act 1488
Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
485 490 495
cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 1536
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 1584
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 1632
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1680
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc 1728
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 1776
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1824
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1872
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1920
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1968
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 2016
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
tcc gac ggc tcc tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 2064
Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 2112
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 2160
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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tga 2163
<210>8
<211>720
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Gly Ser
245 250 255
Asn Ala Thr Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu
260 265 270
Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser
275 280 285
Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val
290 295 300
Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val
305 310 315 320
Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu
325 330 335
Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro
340 345 350
Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala
355 360 365
Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr
370 375 380
Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser
385 390 395 400
Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn
405 410 415
Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser
420 425 430
Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln
435 440 445
Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser
450 455 460
Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro
465 470 475 480
Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
gag ctg ttg gtg gga ata tac ccc tca ggg gtt att gga ctg gtc cct 96
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
cac cta ggg gac agg gag aag aga gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa 144
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa 192
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
gga acc tacttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac 240
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc acc gct tca gaa aac cac ctc 288
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa atg ggt cag gtg 336
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg 384
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag 480
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa 528
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc aac gag acc aac 576
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Asn Glu Thr Asn
180 185 190
aag acc tgc cta cac aac ggg tcc agg gag aag aac gat agt gtg tgt 624
Lys Thr Cys Leu His Asn Gly Ser Arg Glu Lys Asn Asp Ser Val Cys
195 200 205
ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc 672
Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr
210 215 220
aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg 720
Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly
225 230 235 240
cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc acc gct tca 768
Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser
245 250 255
gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa 816
Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu
260 265 270
atg ggt cag gtg gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg 864
Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val
275 280 285
tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt 912
Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu
290 295 300
ttc cag tgc ttc aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc 960
Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu
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tcc tgc cag gag aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc 1008
Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe
325 330 335
ttt cta aga gaa aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc 1056
Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser
340 345 350
ctg gag tgc acg aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc 1104
Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly
355 360 365
act gag gac tca ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act 1152
Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
370 375 380
cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 1200
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 1248
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 1296
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
420 425 430
gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1344
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
435 440 445
aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc 1392
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
450 455 460
agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 1440
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
465 470 475 480
aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1488
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
485 490 495
atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1536
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
500 505 510
ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1584
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
515 520 525
ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1632
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
530 535 540
aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 1680
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
545 550 555 560
tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1728
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
565 570 575
agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1776
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1824
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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tga 1827
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<212>PRT
<213>智人
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Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly
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Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser
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Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu
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Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val
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Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu
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Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu
305 310 315 320
Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe
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Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser
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Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly
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370 375 380
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
385 390 395 400
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
405 410 415
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
420 425 430
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tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96
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gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag 144
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
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Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
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Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
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Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
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Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
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Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
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Asn Ala Ser Met Asp Ala Asn Cys Thr Ser Pro Glu Pro Asn Ser Thr
195 200 205
tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag aca gct cag atg tgc tgc agc 672
Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser
210 215 220
aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa gtc ttc tgt acc aag acc tcg 720
Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser
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Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp
245 250 255
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Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp
260 265 270
cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg gaa cag aac cgc atc tgc acc 864
Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr
275 280 285
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Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg
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Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg
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cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg 1008
Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly
325 330 335
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Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln
340 345 350
atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg aat gca agc atg gat gca gtc 1104
Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val
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Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His
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tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc caa cac acg cag cca act cca 1200
Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 1440
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 1584
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1680
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1728
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1872
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<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(72)
<223>信号肽
<400>13
atg agc ttt cca tgt aaa ttt gta gcc agc ttc ctt ctg att ttc aat 48
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
gtt tct tcc aaa ggt gca gtc tcc aaa gag att acg aat gcc ttg gaa 96
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa aaa act tca gac 192
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag act ttc aag gaa 240
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg aaa att aag cat 288
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct gca gag ccc aaa 624
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Ala Glu Pro Lys
195 200 205
tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc 672
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
210 215 220
ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 720
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
225 230 235 240
ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 768
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
245 250 255
agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 816
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
260 265 270
gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 864
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
275 280 285
acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 912
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
290 295 300
aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 960
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
305 310 315 320
ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 1008
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
325 330 335
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 1056
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
340 345 350
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 1104
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
355 360 365
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 1152
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
370 375 380
cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 1200
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
385 390 395 400
acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1248
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
405 410 415
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1296
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
420 425 430
ctg tct ccg ggt aaa tga 1314
Leu Ser Pro Gly Lys
435
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<211>437
<212>PRT
<213>智人
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Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
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Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
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Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
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Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
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Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Ala Glu Pro Lys
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
260 265 270
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275 280 285
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
305 310 315 320
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
370 375 380
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
385 390 395 400
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Pro Gly Lys
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<220>
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<220>
<221>misc_signal
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<223>信号肽
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Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
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20 25 30
agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc 144
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag 192
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
50 55 60
gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
65 70 75 80
ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
85 90 95
aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
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tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
115 120 125
aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct 432
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
130 135 140
gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 480
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
145 150 155 160
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 720
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 768
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 864
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275 280 285
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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 960
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1008
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340 345 350
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290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340 345 350
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213>智人
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
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<220>
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<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(72)
<223>信号肽
<400>17
atg agc ttt cca tgt aaa ttt gta gcc agc ttc ctt ctg att ttc aat 48
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
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acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144
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Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
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aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag act ttc aag gaa 240
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Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct aaa gag att acg 624
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Lys Glu Ile Thr
195 200 205
aat gcc ttg gaa acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac 672
Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp
210 215 220
att cct agt ttt caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa 720
Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu
225 230 235 240
aaa act tca gac aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag 768
Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu
245 250 255
act ttc aag gaa aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg 816
Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu
260 265 270
aaa att aag cat ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca 864
Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser
275 280 285
ata tat gat aca aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg 912
Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu
290 295 300
aag att caa gag agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc 960
Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile
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aac aca acc ctg acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta 1008
Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu
325 330 335
aac ctg tat caa gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc 1056
Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile
340 345 350
aca cac aag tgg acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca 1104
Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala
355 360 365
ggg aac aaa gtc agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct 1152
Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro
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gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 1200
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 1296
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 1344
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 1392
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
450 455 460
cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac 1440
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His
465 470 475 480
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 1488
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
485 490 495
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 1536
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
500 505 510
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 1584
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
515 520 525
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 1632
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
530 535 540
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 1680
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
545 550 555 560
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1728
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
565 570 575
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1776
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
580 585 590
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1824
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
595 600 605
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1854
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210>18
<211>617
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Lys Glu Ile Thr
195 200 205
Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp
210 215 220
Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu
245 250 255
Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu
260 265 270
Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser
275 280 285
Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu
290 295 300
Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile
305 310 315 320
Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu
325 330 335
Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile
340 345 350
Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala
355 360 365
Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
450 455 460
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His
465 470 475 480
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
485 490 495
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
500 505 510
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
515 520 525
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
530 535 540
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
545 550 555 560
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
565 570 575
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
580 585 590
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
595 600 605
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
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agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc 144
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag 192
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
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gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
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ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
85 90 95
aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
100 105 110
tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
115 120 125
aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tcg 432
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130 135 140
gat aac atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc agc agc cga 480
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145 150 155 160
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Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
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210 215 220
atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg 720
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
225 230 235 240
gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc 768
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
245 250 255
cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct gca gag ccc 816
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260 265 270
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 864
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 960
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 1056
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340 345 350
agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac cag gac tgg 1104
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp
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ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1152
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1488
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1509
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210>20
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<400>20
Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
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Asp Asn Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
165 170 175
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
180 185 190
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
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Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
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Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
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Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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gtt tct tcc aaa ggt gca gtc tcc aaa gag att acg aat gcc ttg gaa 96
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aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag act ttc aag gaa 240
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aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg aaa att aag cat 288
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
agc aag gaa tcc agt gtc gag aat gtc agc tgt cct aaa aat att acg 624
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Asn Val Ser Cys Pro Lys Asn Ile Thr
195 200 205
aat gcc ttg gaa acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac 672
Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp
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att cct agt ttt caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa 720
Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu
225 230 235 240
aaa act tca gac aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag 768
Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu
245 250 255
act ttc aag gaa aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg 816
Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu
260 265 270
aaa att aag cat ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca 864
Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser
275 280 285
ata tat gat aca aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg 912
Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu
290 295 300
aag att caa gag agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc 960
Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile
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aac aca acc ctg acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta 1008
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aac ctg tat caa gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc 1056
Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile
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aca cac aag tgg acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca 1104
Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala
355 360 365
ggg aac aaa gtc agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct 1152
Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro
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gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 1200
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
385 390 395 400
gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 1248
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
405 410 415
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 1296
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
420 425 430
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 1344
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
435 440 445
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 1392
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
450 455 460
cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac 1440
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His
465 470 475 480
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 1488
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
485 490 495
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 1536
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
500 505 510
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 1584
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
515 520 525
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 1632
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
530 535 540
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 1680
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
545 550 555 560
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1728
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
565 570 575
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1776
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
580 585 590
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1824
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
595 600 605
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1854
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210>22
<211>617
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Asn Val Ser Cys Pro Lys Asn Ile Thr
195 200 205
Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp
210 215 220
Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu
245 250 255
Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu
260 265 270
Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser
275 280 285
Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu
290 295 300
Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile
305 310 315 320
Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu
325 330 335
Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile
340 345 350
Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala
355 360 365
Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro
370 375 380
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
385 390 395 400
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
405 410 415
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
420 425 430
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
435 440 445
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
450 455 460
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His
465 470 475 480
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
485 490 495
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
500 505 510
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
515 520 525
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
530 535 540
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
545 550 555 560
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
565 570 575
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
580 585 590
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
595 600 605
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210>23
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<212>DNA
<213>智人
<220>
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<220>
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<223>N-连接的糖基化位点
<220>
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<222>(1)..(15)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(63)
<223>信号肽
<400>23
atg agg acc tgg ccc tgc act ctc ctg ttt ttt ctt ctc ttc atc cct 48
Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
1 5 10 15
gtc ttc tgc aaa gca atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc 96
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
20 25 30
agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc 144
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag 192
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln A la Asp Ser Gln
50 55 60
gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
65 70 75 80
ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
85 90 95
aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
100 105 110
tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
115 120 125
aac gga acc cag att tat gta aat gat aca gaa ccg tgc aat gat tcg 432
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Asn Asp Thr Glu Pro Cys Asn Asp Ser
130 135 140
gat aac aat cac acg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc agc agc cga 480
Asp Asn Asn His Thr Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
145 150 155 160
ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc aaa gcc act 528
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
165 170 175
gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag gtg act gaa 576
Glu Val Arg Va1 Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
180 185 190
gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc ttc cta gat 624
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
195 200 205
gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg aac ctc act 672
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
210 215 220
atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg 720
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
225 230 235 240
gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc 768
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
245 250 255
cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct gca gag ccc 816
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro
260 265 270
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 864
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 912
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 960
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 1008
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 1056
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac cag gac tgg 1104
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp
355 360 365
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1152
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1200
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1248
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
405 410 415
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1296
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1344
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1392
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1440
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1488
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1509
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210>24
<211>502
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
1 5 10 15
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
20 25 30
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
50 55 60
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
65 70 75 80
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
85 90 95
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
100 105 110
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
115 120 125
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Asn Asp Thr Glu Pro Cys Asn Asp Ser
130 135 140
Asp Asn Asn His Thr Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
165 170 175
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
180 185 190
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
195 200 205
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
210 215 220
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
245 250 255
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
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<400>26
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<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>27
gaggactcag gcaccacagc agagcccaaa tcttgtg 37
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>28
gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>29
ccggaattcc gggcacccat ggcgcccgtc gcc 33
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸TNFR2-EDR-IgGh
<400>30
cacaagattt gggctctgcg tcgccagtgc tcccttc 37
<210>31
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸IgG-T2F
<400>31
gaagggagca ctggcgacgc agagcccaaa tcttgtg 37
<210>32
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>32
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<210>33
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸TNFR1-NR-BamHI
<400>33
cgcggatccg tcctcagtgc ccttaacatt ctcaatctg 39
<210>34
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸TNFR2-CF-BamHI
<400>34
cgcggatcca acgcaactac accctacgcc ccggag 36
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸TNFR2-NR-BamHI
<400>35
cgcggatccg ctcccttcag ctggggggct g 31
<210>36
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgTNFR1-TNFR1-IgG-F
<400>36
aaaagcaacg agaccaacaa gacctgccta cacaacgggt ccagggagaa gaacgatagt 60
gtg 63
<210>37
<211>62
<212>
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgTNFR1-TNFR1-IgG-R
<400>37
ctccctggac ccgttgtgta ggcaggtctt gttggtctcg ttgcttttct tacagttact 60
ac 62
<210>38
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgTNFR2-TNFR2-IgG-F
<400>38
atggatgcaa actgcacgtc cccggagccc aacagcacat gccgg 45
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgTNFR2-TNFR2-IgG-R
<400>39
gcatgtgctg ttgggctccg gggacgtgca gtttgcatcc at 42
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CD2F-EcoRI
<400>40
ccggaattca tgagctttcc atgtaaattt gtagcc 36
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CD2R-PstI
<400>41
ctctgcagga cagctgacag gctcgacact 30
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸IgG-F-PstI
<400>42
atctgcagag cccaaatctt gtgac 25
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CTLA4F-EcoRI
<400>43
ccggaattca tgaggacctg gccc 24
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CTLA4R-PstI
<400>44
ctctgcagaa tctgggcacg gttcaggatc 30
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CD2-NT-F
<400>45
taaagagatt acgaatgcc 19
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CD2-CT-R
<400>46
tgcaggacag ctgacagg 18
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CTLA4-NT-F
<400>47
ggataatcat gcacgtggcc cag 23
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸CTLA4-CT-R
<400>48
tgcagaatct gggcacgg 18
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<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>49
cagtgtcgag aatgtcagct gtcctaaaaa tattacgaat gcc 43
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<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>50
ggcattcgta atatttttag gacagctgac attctcgaca ctg 43
<210>51
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgCTLA4-CTLA4-IgG-F
<400>51
atttatgtaa acgatacaga accgtgcaat gattcggata acaaccacac agcccagcct 60
gctg 64
<210>52
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物,寡核苷酸mgCTLA4-CTLA4-IgG-R
<400>52
aggctgggct gtgtggttgt tatccgaatc attgcacggt tctgtatcgt ttacataaat 60
ctg 63