JP4288159B2 - 直列連鎖体を有する免疫接合体 - Google Patents
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Description
〔技術分野〕
本発明は、一般的に連鎖体の蛋白質に関する。更に具体的には、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体の蛋白質、及び免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性蛋白質の直列連鎖体(concatamer)が免疫グロブリンFc片のヒンジ(hinge)に結合されて融合された単量体(monomer)蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により形成された二量体(dimer)蛋白質、並びにこの糖化された二量体蛋白質に関する。
【０００１】
〔背景記述〕
サイトカイン(cytokine)は、ヒトの自家抗原(autoantigen)のように不適切な 刺激により病理学的に悪化した炎症反応が誘発するとき作用し、サイトカインの作用抑制剤である可溶性物質は、サイトカインを認識することができる抗体と可溶性受容体(soluble receptor)が使用されており、この物質に対する多くの特許がある(国際特許出願公開第WO93/016184号、第WO96/02576号、第WO96/023067号及び第WO1997/03682号、及び米国特許第6,225,117号、第5,656,272号、第6,210,661号、第5,977,318号、第5,789,192号及び第5,434,131号)。前記の抗体と可溶性受容体の物質はサイトカインと予め結合し、サイトカインが細胞膜に存在する受容体と結合することを妨害したり、受容体と直接結合することによりサイトカインによる信号の伝達を抑制する共通的な機作を有している。
【０００２】
サイトカインの作用抑制剤として使用される可溶性受容体は、ヒト免疫グロブリン(hIg、human immunoglobulin)の重鎖部位(heavy chain)と連結して使用できるものとして、カポン(Capon DJ)らの文献(Nature 337：525, 1989)に開示されており、以後、可溶性受容体と抗体の融合蛋白質が多くの特許を通じて教示された(米国特許第5,844,095号、第6,225,448号、第6,090,914号、第6,100,383号、第6,046,310号及び第5,521,288号)。
【０００３】
一般的に、サイトカインの可溶性受容体と免疫グロブリンの融合体は、元来分子の単量体(monomer)または免疫グロブリンと融合されていない分子に比べ、以下のような長所を有している(カポンらの前記文献)：
１)二量体(dimer)の形態で融合蛋白質は二価化(bivalency)されるため、リガンド(ligand)に対する総親和力(avidity)が増加；
２)血清内で破壊されずに存在することができる期間の増加、すなわち、分子の安定性の増加；
３)免疫グロブリン重鎖のFc(fragment crystallizable)片を通じた効果細胞(effector cell)の活性化；及び
４)蛋白質の分離精製の簡便性(例、プロテインAを利用した分離精製)。
【０００４】
殆どの受容体の細胞外域(extracellular domain)と免疫グロブリン上鎖間の融合体は、重鎖部位のCH1ドメインを除いた形態で製作されているが、その結果、免疫グロブリンの軽鎖(light chain)と結合されていない二量体として製造される。このように、免疫反応を媒介するのに関与する蛋白質または前記蛋白質の受容体の場合、元来分子の単量体よりは、免疫グロブリンと連結して使用することが好ましいということが知られている。更に具体的に詳察してみれば、サイトカインの一種類である腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor、以下「TNF」と略する)の場合、TNF-依存性の炎症反応を抑制するため国際特許出願公開第WO92/16221号及び第WO95/34326号のように腫瘍壊死因子の受容体(tumor necrosis factor receptor、以下「TNFR」と略する)を使用したり、米国特許第5,447,851号及び国際特許出願公開第WO94/06476号のようにTNFR-免疫グロブリンの融合蛋白質が使用されている。多くの文献によれば、TNFR-免疫グロブリンの融合蛋白質は、元来分子の単量体または免疫グロブリンと融合されていない分子よりも、TNFに対してより高い親和力(affinity)を有すると報告されている[レスラウア(Lesslauer W)らの文献(Eur. J. Immunol. 21: 2883, 1991)、アシケナージ(Ashkenazi A)らの文献(PNAS USA 88: 10535, 1991)、ペペル(Peppel K)らの文献(J. Exp. Med. 174: 1483, 1991)、モラー(Mohler KM)らの文献(J. Immunol. 151: 1548，1993)]。
【０００５】
腫瘍壊死因子の作用を抑制したり、免疫反応を調節するにおいて、有効作用部位である腫瘍壊死因子の受容体、CD2及びCTLA4の細胞外域の部位を多価化あるいは多量体化すれば、その効能の増加を予想することができるが、このような目的で腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの重鎖と連結して融合させた単量体蛋白質(重鎖融合の蛋白質)と、腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの軽鎖と連結して融合させた単量体蛋白質(軽鎖融合の蛋白質)を同時に一つの細胞株内で発現させれば、重鎖と軽鎖間の結合により二量体の構造の融合蛋白質を製造することができる。この際、二量体は、有効部位が生体内のように並列に配列された形態で製造され、その効能は従来の単量体に比べて顕著に増加されることが提示されたことがある[スケロン(Scallon BJ)らの文献(Cytokine 7: 759, 1995)]。
【０００６】
しかし、前記のような免疫グロブリン融合蛋白質の製造方法は、融合蛋白質を製造するとき、重鎖と軽鎖のそれぞれに融合させた二つの遺伝子を同時に生産細胞株に注入しなければならず、細胞が二種類の融合蛋白質を生産するとき二つの蛋白質の生産歩留まりが顕著に落ち、生産された重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が100％結合されないため、単量体である重鎖融合蛋白質または軽鎖融合蛋白質から、重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が融合された二量体を純粋分離する工程などの技術的な困難により実用化するのが難しいという問題点がある。このような理由などで、これまでは免疫グロブリン融合蛋白質の製剤は、二つの融合蛋白質が互いに単純に並列配列された二量体の形態で製造されて使用されていた。
【０００７】
したがって、免疫反応に関与する蛋白質の効果を改善するため、単一の遺伝子を発現させて単一分子の形態の効能が改善された多価化あるいは多量体化された蛋白質の製剤を生産する方法に対する要求が多数存在していた。
【０００８】
〔発明の要約〕
本発明者らは、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体(concatamer)の形態の蛋白質をDNA組換え技術により製造した。更に、本発明者らは、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジ(hinge)部位に結合された単量体(monomer)蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合(disulfide bond)された二量体(dimer)蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造した後、これを土台にDNA組換え技術を通じて直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質を生成し、更に本発明者らは、そのように生成された直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質が、単純融合された二量体蛋白質に比べて向上した効能を示し、特に連鎖融合された二量体蛋白質が糖化される場合、安定性が顕著に向上するということを見出した。
【０００９】
したがって、一つの観点として、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体の蛋白質を提供する。
【００１０】
他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合された二量体蛋白質を提供する。
【００１１】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を提供する。
【００１２】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドを提供する。
【００１３】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を提供する。
【００１４】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１５】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングし、糖化モーティブが挿入されたDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から糖質化された前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖質化された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１６】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物に糖化モーティブを挿入するために使用されるDNAプライマーを提供する。
【００１７】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を提供する。
【００１８】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００１９】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
一般的に、本発明は連鎖体の蛋白質に関し、より特定的には免疫接合体(Immunoadhesin)に関する。免疫接合体の典型は、免疫グロブリンFc領域と受容体または吸着分子のリガンド-結合領域を融合させた抗体-類似分子である。公知された典型的な免疫接合体は、抗原認知を担当する抗体分子の可変領域が受容体のリガンド-結合領域により置換され、抗体のFc領域は保有される形態である。多くの文献を通じて構造的に多様な形態の免疫接合体が提示されてきた。しかし、本発明による免疫接合体の構造は、これまで公知された免疫接合体の構造とは異なり、また本発明による構造の免疫接合体を仮想的に、または推定的に製造することができるということを暗示した文献はない。
【００２１】
〔用語の定義〕
本発明による免疫接合体の構造的な特徴により、このような構造の特性上、本願明細書に使用される用語の定義を明確にする必要がある。一般的には、本発明において別に定義していない限り、全ての技術的及び科学的な関連用語は、この発明が属する技術分野で通常的に通用される意味を有する。しかし、以下の用語は通常的な意味を表すが、その意味を明確にし、かつ本発明の範囲を明確にするために以下のように定義する。
【００２２】
本願の明細書に使用された用語である「免疫グロブリン」は、多様な種類の抗原を特異的に認識するようにB細胞により生成され、B細胞の抗原受容体の役割を果たす蛋白質の分子を指す。この分子はYの模様で、二つの同一な軽鎖と二つの同一な重鎖で構成される。軽鎖と重鎖は全て可変及び固定領域を含む。四つの鎖は、ヒンジ領域という重鎖のフレキシブル領域(flexible region)に位置したジスルフィド結合により全て固定されている。重鎖と軽鎖の全ての可変領域は、結合して二つの同一な抗原-結合部位を形成する。重鎖の固定領域により免疫グロブリンA(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)及びM(IgM)の五つの部類に分けられる。それぞれの部類はイソタイプと言い、独特な構造的な特徴及び相異する生物学的な特性を有している。例えば、IgGはFc構造において、他のイソタイプと若干相異する。更に、IgG及びIgAは多くのサブ部類がある。例えば、ヒトIgGイソタイプ内に四つのサブ部類のIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4があり、それぞれはγ1、γ2、γ3及びγ4の重鎖を有する。補体活性化、食細胞-Fc受容体への結合、抗原-依存の細胞毒性のような免疫グロブリン分子の機能は、重鎖のFc領域に存在する構造的な決定因子により媒介される。このような重鎖のFc領域は、本発明による二量体蛋白質の構成要素として使用され、前記全ての部類またはサブ部類の免疫グロブリンから由来することができる。
【００２３】
本願の明細書に使用された用語でる「免疫グロブリンFc片」というのは、免疫グロブリン分子は、機能的に区分される片に分けられるが、この中に抗原結合力はないものの、容易に結晶体を形成する片としてヒンジ部位(hinge region)、CH2とCH3ドメインが結合してなされ、抗体で効果物質及び細胞との結合に関与する部分を指す。したがって、本発明に関連して言及されるFc片は、一部の文献に記述されたものとは異なる場合もあるが、ヒンジ領域を含み、これは単純に本発明を説明するにおいて便利を図るためのものとして、当業者は本願の明細書及び図面を参考して充分理解することができる。
【００２４】
本願の明細書に使用された用語である「生物学的な活性蛋白質」は、一般的に生理学的または薬物学的な活性を表す蛋白質、ペプチド及びポリペプチドを指し、連鎖体または免疫接合体を形成した後、固有活性のうち少なくとも一部分は維持される。本願において、「生物学的な活性」という用語は、生理学的または薬物学的な活性として限定されるものではない。例えば、酵素を含有したような一部の連鎖体は、有機溶媒として反応を触媒することができる。同様に、コンカナバリンA、免疫グロブリンなどのような蛋白質を含有した一部の高分子結合体は、また実験室の診断剤として有用である。
【００２５】
蛋白質、ペプチド及びポリペプチドとしてはこれらに限定されるものではないが、ヘモグロビン、血清蛋白質(例、因子VII、VIII及びIXを含んだ血液因子)、免疫グロブリン、サイトカイン(例、インターロイキン)、α-、β-及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子(G-CSF及びGM-CSFを含む)、血小板誘導の成長因子(PDGF)及びホスホリパーゼ-活性化の蛋白質(PLAP)が含まれる。他の一般的な生物学的または治療学的な蛋白質としては、インシュリン、植物蛋白質(例、レクチン及びリシン)、腫瘍壊死因子(TNF)及び連関の対立形質体、成長因子(例、TGFαまたはTGFβのような組織成長因子及び内皮成長因子)、ホルモン(例、小嚢-刺激ホルモン、甲状腺-刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン及び副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン分泌ホルモン及びその誘導体)、カルシトニン(calcitonin)、カルシトニン遺伝子関連のペプチド(calcitonin gene related peptide、CGRP)、合成エンケファリン(enkephalin)、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部の分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド(growth hormone releasing peptide、GHRP)、胸腺体液性の因子(thymic humoral factor、THF)などが含まれる。免疫グロブリンとしては、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、及びこれらの断片が含まれる。インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子のような一部の蛋白質は、また普通の組換え技術を利用した結果として非糖化の形態で存在することができる。非糖化の形態もまた本発明の生物学的な活性物質に含まれる。
【００２６】
更に、本発明の生物学的な活性物質は、生体内の生活性(bioactivity)を証明するポリペプチド中、一部分を含む。この例としては、アミノ酸配列、抗体断片、単一鎖の結合抗原(参照：米国特許第4,946,778号)、抗体または断片の融合体を含んだ結合分子、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、触媒性の抗体などが含まれる。その他の蛋白質としては、ブタクサ、抗原E、蜜蜂の毒液、ダニアレルゲンなどのようなアレルゲン蛋白質が含まれる。
【００２７】
更に、本発明の生物学的な活性物質は酵素を含む。酵素の例としては、炭水和物-特異的な酵素、蛋白質分解の酵素、酸化還元の酵素、トランスフェラーゼ剤、ヒドロラーゼ剤、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが含まれる。具体的な酵素としてはこれらに限定されるものではないが、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ及びビリルビンオキシダーゼが挙げられる。炭水化合物-特異的な酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼなどが含まれる。
【００２８】
本願の明細書に使用された用語である「免疫反応に関与する蛋白質」は、細胞性及び体液性の免疫反応で細胞間の信号伝達の過程を担当し、免疫反応を活性化または抑制させる蛋白質を総称する。免疫というのは、細菌またはウイルスなどの自分でないものから自分を保護する過程である。免疫反応は、細胞性及び体液性の免疫反応に分けられるが、T細胞とB細胞などのリンパ球が最も重要な役割を果たす。T細胞は、主に細胞性の免疫反応を主管し、ウイルスに感染された細胞や癌細胞などを直接的に攻撃して殺したり、免疫または炎症反応を活性化させるサイトカインという物質を分泌して他の免疫細胞の作用を助けたりもする。B細胞は、細菌とウイルスなどの自分でない外部の物質(抗原)が体内に入る場合、抗体を作ってこれを追い出しており、これを体液性の免疫反応という。細胞性の免疫と体液性の免疫は全て細胞間の信号伝達が非常に必須な過程であり、この過程で細胞内の信号伝達を担当する細胞表面の受容体蛋白質と、この受容体に結合される信号物質であるリガンド蛋白質が作用する。
【００２９】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質の代表的な例としては、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子(adhesion molecules)、腫瘍壊死因子(TNF)の受容体、酵素、受容体のチロシンキナーゼ、ケモカイン受容体、その他の細胞表面の蛋白質、可溶性リガンドなどが含まれる。サイトカインはこれらに限定されるものではないが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、TNF、TGF、IFN、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO、M-CSFなどを含む。サイトカイン受容体はこれらに限定されるものではないが、成長ホルモンの受容体(GHR)、IL-13R、IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-9R、IL-15R、TNFR、TGFR、IFNR(例、IFN-γRα-鎖、IFN-γRβ-鎖)、インターフェロン-αR、-βR及び-γR、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl、gp130、Fas(Apo1)を含む。酵素はこれらに限定されるものではないが、インフルエンザCヘマグルチニンエステラーゼ、ウロキナーゼなどを含む。ケモカイン受容体の例としては、CCR1、CXCR1-4が挙げられる。受容体のチロシンキナーゼの例としては、TrkA、TrkB、TrkC、Htk、REK7、Rse/Tyro-3、肝細胞の成長因子、血小板-由来の成長因子R、Flt-1が含まれる。他の細胞表面の蛋白質の例としては、CD2、CD4、CD5、CD6、CD22、CD27、CD28、CD30、CD31、CD40、CD44、CD100、CD137、CD150、LAG-3、B7、B61、β-ニューレキシン、CTLA-4、ICOS、ICAM-1、補体R-2(CD21)、IgER、リソソーム膜gp-1、α2-マイクログロブリン受容体-連関の蛋白質、ナトリウム排泄ペプチドRが挙げられる。可溶性リガンドとしてはこれらに限定されるものではないが、IL-10、ヘレグリン、角化細胞の成長因子が含まれる。
【００３０】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質に対するリガンド及び用途は、下記表１乃至７に要約した通り当業者によく知られている。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
【表７】
【００３８】
本願の明細書に使用された用語である「細胞外域の可溶性部位(soluble extracellular domain)」は、リン脂質で構成された細胞膜を貫通する蛋白質(integral protein)において、疎水性のアミノ酸で構成されていて細胞膜を通過する部分(transmembrane domain)を基準に細胞外部に露出されている部分を指す。この部位は、殆ど親水性のアミノ酸が蛋白質の表面に向かう構造(folding)を取っていて水溶液上で可溶性(soluble)を表す。殆どの細胞表面の受容体蛋白質においてリガンドに結合する機能を担当することは細胞外域の部位であり、細胞内域の部位(intracellular domain)は細胞内の信号伝達の機能を担当している。
【００３９】
本願の明細書に使用された用語である「直列連鎖融合された」というのは、二つの生物学的な活性蛋白質の可溶性の部位が連結されて一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４０】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖体の蛋白質」は、直列連鎖融合された蛋白質を指す。例えば、免疫グロブリンFc片のヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位C-末端(C-terminal)に、これと同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位N-末端(N-terminal)がペプチド結合されて同一な二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４１】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された単量体蛋白質」は、免疫グロブリンFc片のヒンジ部位に免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が結合されて一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称/Fc」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質は、TNFR1/Fcと表記される。更に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、TNFR1/IgG1Fcと表記される。
【００４２】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された二量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された二量体蛋白質は、便宜上“[蛋白質の名称/Fc]2”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、[TNFR1/Fc]2と表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、[TNFR1/IgG1Fc]2と表記される。
【００４３】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された単量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質において、ヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位N-末端に、これと同一な一つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位C-末端が直列の連鎖体の形態で結合され、一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称-蛋白質の名称/Fc」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位に、同一なTNFR1の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質は、TNFR1-TNFR1/Fcと表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、TNFR1-TNFR1/IgG1Fcと表記される。
【００４４】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された二量体蛋白質」は、連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された二量体蛋白質は、便宜上“[蛋白質の名称-蛋白質の名称/Fc]2”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位に、同一なTNFR1の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、[TNFR1-TNFR1/Fc]2と表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、[TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2と表記される。
【００４５】
本願の明細書に使用された「ベクタ」という用語は、外来の遺伝子を宿主細胞内に安定的に運搬することができる運搬体としてのDNA分子を言う。有用なベクタになるためには複製が可能であるべきであり、宿主細胞内に流入することができる法案を備えなければならず、自分の存在を検出することができる手段を具備しなければならない。ここで、外来の遺伝子としては、例えば、連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物がそれに該当される。
【００４６】
本願の明細書に使用された「組換え発現プラスミド」という用語は、一般的に外来の遺伝子が宿主細胞で発現されるようにベクタに作動的に連結されて形成された環状のDNA分子を言う。組換え発現ベクタは、一旦宿主細胞内にあれば宿主の染色体DNAに拘わらず複製が可能であり、ベクタの数個のコピー及びそれの挿入された異種DNAを生成することができる。当業界で公知されている通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解毒発現の調節配列に作動的に連結されなければならない。好ましくは、発現調節の配列及び該当遺伝子は、細菌の選択マーカー及び複製開始点(replication origin)を共に含んでいる、一つの発現ベクタ内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクタは 真核発現の宿主内で有用な発現マーカーを更に含まなければならない。
【００４７】
本願の明細書に使用された「作動的に連結された(operably linked)」という用語は、ベクタの各構成成分が固有な作用ができるように形成された成分の配列を意味する。したがって、コーディング配列に作動的に連結された調節配列(control sequence)は、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。調節配列がコーディング配列の発現を指示するように作用する限り、調節配列がコーディング配列と隣接している必要はない。例えば、介在配列(intervening sequence)がプロモーター配列とコーディング配列間に存在することができるが、この場合、プロモーター配列はコーディング配列に「作動的に連結」されたと言える。
【００４８】
本願の明細書に使用される宿主細胞は、原核または真核生物の細胞であってもよい。更に、DNAの導入効率が高く、導入されたDNAの発現効率が高い宿主が通常的に使用される。E.コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、ハスモンヨトウ近似種(SF9)のような昆虫細胞、チャイニズハムスター卵巣細胞(CHO)及びマウス細胞のような動物細胞、COS1、COS7、ヒト胎児腎臓293細胞(human embryonic kidney cells)、BSC 1、BSC 40及びBMT 10のようなアフリカグリーン猿細胞、及び組織培養されたヒト細胞は、使用可能である宿主細胞の例である。本発明の融合蛋白質をコーディングするDNA作製物をクローニングするときには、動物細胞を宿主とすることが好ましい。COS細胞を利用する場合には、COS細胞でSV40ラージTアンチゲン(large T antigen)が発現しているため、SV40の複製開始点を有するプラスミドは細胞中で多数のコピー(copy)のエピソーム(episome)として存在するようになり、通常より高発現を期待することができる。導入されたDNA配列は、宿主細胞と同一な種から得られるか、宿主細胞と異なる種であるか、またはそれはいずれの異種または相同性DNAを含むハイブリッドDNA配列であっても構わない。
【００４９】
本発明による直列連鎖体の形態の融合蛋白質をコーディングするDNA配列を発現させるため、非常に多様な発現宿主/ベクタの組合が利用され得る。真核宿主に適合したベクタには、例えば、SV40、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス(adeno-associated virus)、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節の配列を含む。細菌宿主に使用することができる発現ベクタには、pBluescript、pGEX2T、pUC、pCR1、pBR322、pMB9及びこれらの誘導体のように、E.コリから得ることを例示することができる細菌性のプラスミド、RP4のようにより広い宿主の範囲を有するプラスミド、λgt10とλgt11、NM989のような非常に多様なファージラムダ(phage lambda)誘導体として例示することができるファージDNA、及びM13とフィラメント性単一鎖のDNAファージのようなその他のDNAファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクタは、2μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクタはpVL941である。
【００５０】
本願の明細書に使用された用語である「形質転換」は、DNAを宿主として導入し、DNAが染色体外の因子として、または染色体の統合完成により複製可能になることを意味する。
【００５１】
本願の明細書に使用された用語である「形質感染」は、任意のコーディング配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、発現ベクタが宿主細胞により受容されることを意味する。
本願の明細書に使用された用語である「モーティブ配列」は、発現された蛋白質が細胞膜外に輸送されるように誘導するアミノ酸配列として、リーダ配列とも言う。細胞膜外に輸送される表面の蛋白質あるいは分泌蛋白質は、一般的に細胞膜からモーティブペプチダーゼ(signal peptidase)により切断されるN-末端の配列を有している。この特定のN-末端の配列をモーティブ配列またはペプチド(signal sequence or peptide)、あるいはリーダ配列またはペプチド(leader sequence or peptide)と言う。分泌(輸送)が可能な蛋白質あるいは細胞外膜や周辺の細胞質に存在する全ての蛋白質は、全て自分のみのための特定のモーティブ配列を有している。このようなそれぞれの蛋白質が有しているモーティブ配列間には、特別な相同性(homology)を有しておらず、同じ蛋白質であっても由来した宿主(host)によりそのモーティブ配列が異なることが分かる。モーティブ配列が作用するためには、その1次の構造、すなわちアミノ酸配列からそれらが有している２次の構造あるいは非極性、電荷残基(apolar、charged residue)の分布が更に重要である。このような特徴を有するモーティブ配列間には、特別な相同性はないが、いくつかの共通の特徴はある。モーティブ配列は、まずN-末端の方に一つあるいはいくつかの非常に短い正電荷を帯びた親水性の領域(hydrophilic region)であるNドメインがあり、このドメインに次いで多少長い疎水性の領域であるH-ドメインが繋がっている。大腸菌である場合、モーティブ配列の長さは約18〜30個のアミノ酸で構成されている。N-ドメインは極性を示し(polar)、Lys、Argのような正電荷を帯びたアミノ酸が多く存在する。H-ドメインには、主に疎水性の残基と、Ala、Leuのようなアミノ酸が多く存在し、Pro、Lys、Arg、Asn、Gluのように極性を示したり、電荷を帯びたアミノ酸は稀である。代わりに多量のAla、Leuは、モーティブペプチドα-螺旋構造を成して膜転移がより容易に起きるように助ける。H-ドメインと実際に分泌しようとする蛋白質の間にはC-ドメインが存在する。この領域は、一般的に疎水性が小さく、LebB、LspAのようなモーティブペプチダーゼにより認識が可能な配列がある。今までこのモーティブペプチダーゼが正確にどの部位を切断しているのかは正確に予測できないが、一般的にC-領域にあるAla-X-Ala配列の次の部分を大部分切断している。前記で言及したモーティブ配列を有している前蛋白質(preprotein)は、種々の蛋白質と相互作用をし、細胞膜に到達した後、モーティブペプチダーゼにより特定の部位が切断された後、成熟した形態の蛋白質に変わる。このような特徴を有するモーティブ配列は、細胞表面の発現母体を選択するのにおいて非常に重要な役割を果たす。外来の蛋白質と融合された蛋白質は、安定的に細胞の表面外に非常に高効率で移動しなければならない。一般的に、表面発現の母体を選択するのにおいて、優れた分泌能を有した表面の蛋白質を選択しなければならず、通常的に分泌能に優れた分泌モーティブ配列を有している表面の蛋白質を利用する。
【００５２】
〔本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
本発明による連鎖融合された二量体蛋白質は、一般的に、(a) 免疫グロブリンFc片をコーディングする遺伝子と、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子から単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造し、(b) 製造された単純融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応により挿入し、(c) 前記制限酵素の認識配列と一致する制限酵素を使用し、前記単純融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子の制限酵素の認識配列の部位を切断し、(d) 両方のDNA配列の切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造し(図２)、(e) 製造された連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物をベクタに作動的に連結して組換え発現プラスミドを作製し、(f) 作製された組換え発現プラスミドで宿主細胞を形質転換または形質感染させ、(g) 形成された形質転換体または形質感染体を連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物が発現されるのに適切した条件下で培養し、培養物から目的する連鎖融合された二量体蛋白質を分離精製することにより製造される。
【００５３】
免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片は、特定の制限酵素の認識配列とリーダ配列のコーディング配列を有する一つのプライマーと、前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列と免疫グロブリンFcの特定の部位5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応により生成する。
【００５４】
免疫グロブリンFcの特定の部位をコーディングするDNA断片は、前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部配列を含み、前記免疫グロブリンFcの特定の部位5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマーと、特定の制限酵素の認識配列と免疫グロブリンFcの特定の部位3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応を利用して生成する。
【００５５】
このように生成された前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と、免疫グロブリンFcの特定の部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合し、DNA鎖を分離した後、共通の配列間で相補的な結合が起きるように誘導する。以後、重合酵素を利用して各DNA鎖の3'末端から重合反応を起こし、完全な二鎖のDNA断片を生成する。これを鋳型とし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする配列を有するプライマーと、前記免疫グロブリンFcの特定の部位3'末端をコーディングするプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位のDNA断片と前記免疫グロブリンFcの特定の部位DNA断片の配列を含む免疫グロブリンの融合遺伝子を増幅させる。
【００５６】
このように生成された免疫グロブリンの融合遺伝子と前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位の配列を有するDNA断片に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、制限酵素を使用して前記制限酵素の認識配列の部位を切断し、切断された部分をリガーゼで連結して連鎖体の形態の免疫グロブリンの融合遺伝子を製造する。
【００５７】
このような免疫グロブリンの融合遺伝子は、蛋白質の細胞外の分泌を促進するため、蛋白質にモーティブ配列が含まれるように製作することができる。例えば、CTLA-4分子は非正常的に長く、水溶性の高いN-末端に親水性の高い余裕分(redundancy)を有する非常に特異なリーダ配列を有している(Harper K, et al., J Immunol 147: 1037-1044, 1991; and Brunet JF, Nature 328: 267-270, 1987)。通常的に殆どの膜表面の蛋白質や分泌型の蛋白質は、そのN-末端に疎水性が高い20〜24個のアミノ酸で構成されるリーダ配列を有する。しかし、本CTLA-4分子は、16個の親水性が高いN-末端の16個のアミノ酸と、疎水性が高い典型的な膜領域に該当する2１個のアミノ酸など、総37個のアミノ酸で構成されている。したがって、従来にはCTLA4Ig融合蛋白質を製造するとき、分子のリーダ配列をオンコスタチンM(Linsley PS et al., J Exp Med 174: 561-569, 1991)あるいはIL-6(Yamada A, et al., Microbiol Immunol 40: 513-518, 1996)のリーダ配列で全て交替して発現していた。本発明者らに至って、CTLA4の場合、ACLGFQRHKAQKNLAAの16個のアミノ酸が除外された「MRTWPCTLLFFIPVFCKA」配列をリーダ配列に利用することが好ましく、この場合が発現細胞外に分泌が最も容易になされるということが確認された(国際特許出願公開第WO98/31820号)。
【００５８】
前記製造された免疫グロブリン融合遺伝子をベクタに挿入して組換え発現プラスミドを製造した後、このプラスミドを宿主細胞に導入して形質感染体または形質転換体を製造し、これらの細胞を増幅培養して生成された連鎖体の形態の融合蛋白質を精製することにより、目的する連鎖融合された二量体蛋白質を得ることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造のため使用される宿主細胞は、骨髄腫細胞株、CHO細胞、猿COS細胞、ヒト胎児腎臓293細胞及びバキュロウイルス-感染の昆虫細胞である。これらのシステムで形成された目的のポリペプチドは、集合して細胞の培養培地に分泌される。その後、本発明の連鎖融合された二量体蛋白質は免疫グロブリンと相当な部分で同一な方式によりプロテインAまたはプロテインGの親和性クロマトグラフィーにより実質的に精製することができる。事実に、効率的な哺乳動物の細胞発現及びこのような類型の精製は、免疫反応に関与する蛋白質を二量体蛋白質として発現するのに相当な利点になる。
【００６０】
〔本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
宿主細胞として真核細胞により生成される分泌蛋白質は、糖鎖の修飾により変形される。糖鎖の修飾は、蛋白質の物理的な性質はもちろん、蛋白質の生体内における安定性及び機能にも影響を及ぼすことと知られている。したがって、本発明の一つの好ましい様態は、宿主細胞として前記の動物細胞株を利用した遺伝子の組換え技術を利用して目的する連鎖融合された二量体蛋白質の生産を容易にし、更に体内の安定性を増加させるため免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位に付加的な糖鎖を添加することを含む。
【００６１】
糖鎖の修飾には二つの類型がある。一つは、O-型糖鎖修飾としてアミノ酸セリンやスレオニンの残基にオリゴ糖が結合することであり、もう一つは、N-型糖鎖修飾としてアスパラギンの残基にオリゴ糖が結合する形態である。特に、N-型糖鎖修飾は、特定のアミノ酸の配列を有するとき起こり、その配列はAsn-X-Ser/Thrと知られている(ここで、Xはプロリンを除いたいずれのアミノ酸でもよい)。N-連結のオリゴ糖とO-連結のオリゴ糖の構造は互いに異なり、一般的に各タイプから発見される糖残基もまた相異する。例えば、O-連結の糖残基では、N-アセチルガラクトサミンが変わりなくセリンやスレオニンに連結されている。全てのN-連結のオリゴ糖では、N-アセチルグルコサミンがアスパラギンに連結されている。O-連結のオリゴ糖は、一般的に1〜4個の糖残基のみを含んでいる反面、N-連結のオリゴ糖はN-アセチルグルコサミンとマンノースを常に含み、少なくとも5個以上の糖残基からなっている。
【００６２】
本発明は、付加的な糖鎖の結合部位を有するように免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA配列上に、前記のO-型またはN-型の糖鎖修飾が発生するように一つ以上のヌクレオチドを変異させ、そのDNAを動物の宿主細胞を通じて発現しながら自然的に糖鎖修飾が起きるようにすることである。一つの様態として、本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質は、N-型の糖鎖修飾を起きることができるAsn-X-Ser/Thr配列が付加及び/または増加するように、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA配列を変異させることにより達成される。
【００６３】
糖化のためのDNA配列の変異は、通常的な方法により実施することができる。一つの好ましい様態として、連鎖体の結合部位、すなわち二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が細胞内の蛋白分解酵素の攻撃から保護されるようにし、血中における半減期を増加させる効果を得るため、互いに結合される部位に重合酵素の連鎖反応を利用して多糖化(multiglycosylation)で修飾される連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製作することができる。特定的な様態として、糖化モーティブペプチド配列は、制限酵素EcoRIと細胞外域可溶性の部位のリーダ配列を含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したDNA断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと免疫グロブリンG1のFc部位の3'末端と制限酵素XbaIをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応で製作されたDNA断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【００６４】
本発明の具体的な様態は、免疫反応に関与する蛋白質であるTNFR1、TNFR2、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位を含む。これらの様態に関する添付の図面、配列目録及び実施例を参考とし、本発明を具体化する。
【００６５】
腫瘍壊死因子-α[TNF-α、カケクチン(cachectin)としても知られている。]と腫瘍壊死因子-β[TNF-β、リンホトキシン(lymphotoxin)としても知られている。]は、多面的なサイトカインとして炎症、細胞免疫反応、敗血症、細胞毒性、悪液質、リューマチ性関節炎、炎症関連疾患[タルタグリア(Tartaglia LA)らの文献(Immunol. Today 13: 151, 1992)]と抗ウイルス性反応[ブトラー(Butler P)の文献(Peptide Growth FactorII, 1990, Springer-Verlag, Berlin, pp.39-70)]を誘発する。細胞毒性を含んだ殆どのTNF-αとTNF-βの作用は、これらのそれぞれが三重体の形態でTNF受容体に結合することに起因する[エック(Eck MJ)らの文献(J. Biol. Chem. 267: 2119, 1992)]。TNF受容体には、分子量55キロダルトン(KDa)のタイプI(TNFR1、p55)と分子量約75キロダルトン(KDa)のタイプII(TNFR2、p75)の２種類が存在する[スミス(Smith CA)らの文献(Science 248: 1019，1990)、ロウチャー(Loetscher H)らの文献(Cell 61: 351, 1990)、シャル(Schall)らの文献(Cell 61: 361, 1990)]。この二つの受容体は、全てTNF-αとTNF-βに対して殆ど類似する親和力を表すと報告されている(シャルらの前記文献)。これらの可溶性受容体の免疫グロブリンとの融合蛋白質は、TNF-αとTNF-βを結合することにより細胞膜に存在する受容体との結合を妨害し、その作用を抑制する効果を示し、TNF-依存性の炎症を緩和させることができる効果的な物質として使用されている。
【００６６】
免疫反応を調節する細胞表面の抗原中にTリンパ球の充分の活性反応を得るための２次刺激を提供する空調刺激系の抗原であるCD2及びCTLA4の場合も、腫瘍壊死因子の受容体と同様な方法で可溶性の形態の場合、各種の免疫疾患を治療することができる治療剤として使用され得る。体内の免疫反応は、Tリンパ球の特定の受容体と結合する抗原提示細胞の表面抗原の分子、すなわち、Tリンパ球と抗原提示細胞の白血球の抗原分子により構成され、抗原提示過程中に２次信号である空調信号がなければ、Tリンパ球は細胞死滅またはクローン活性の無力化の誘導により消滅される。CD2の場合は、抗原提示細胞のLFA-3と結合するTリンパ球の白血球の抗原として白血球の細胞付着及び同調刺激に関与し、CD28による同調刺激に並行してTリンパ球の活性化を促進する。CTLA4の場合は、T-リンパ球が活性化した後に発現され、休息期になれば発現量が増加する様相を表す。CTLA4は抗原提示細胞のB7との結合力がCD28の20倍以上であり、B7と結合した後、T-リンパ球の活性を抑制する信号を伝達する。
【００６７】
一つの部類の特定の様態として、本発明は、配列番号6の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fc、配列番号8の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/Fc、配列番号18の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fc及び配列番号20の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/Fcを提供する。
【００６８】
他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物(TNFR1-TNFR1-IgG)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物(TNFR2-TNFR2-IgG)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物(CD2-CD2-IgG)及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物(CTLA4-CTLA4-IgG)を提供する。
【００６９】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR11Ig-CHO)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR22Ig-CHO)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞を提供する。前記組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR11Ig-CHO及び前記組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR22Ig-CHOは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00047が付与された。
【００７０】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR11Ig-CHO)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR22Ig-CHO)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞を提供する。前記組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR11Ig-CHO及び前記組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR22Ig-CHOは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00049が付与された。
【００７１】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号10の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/Fc、配列番号12の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/Fc、配列番号22の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/Fc及び配列番号24の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/Fcを提供する。
【００７２】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物を提供する。糖化モーティブペプチドを生成することができるようにするため、TNFR/Fc、CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体の形態の融合遺伝子の細胞外域可溶性の部位の結合部位をコーディングする塩基配列に該当する両方向のプライマーを製作した。このプライマーは、連鎖体の形態の融合遺伝子の任意のアミノ酸をコーディングする塩基配列がアスパラギン(asparagin、N)をコーディングする塩基配列(AAT、AAC)で置換され得る塩基配列と、セリン(serine、S)あるいはスレオニン(threonine、T)をコーディングする塩基配列(セリン:TCC、スレオニン:ACC、ACG、ACA)で置換され得る塩基配列を有するようにした。プライマーの製作時、複数のアミノ酸のコード配列中から一つの配列を選択することは、重合酵素の連鎖反応の効率を最大化するため塩基配列が最小に置換され得る条件及びプライマー結合温度(melting temperature、Tm)を考慮して決定された。
【００７３】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-MG、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-MG、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Ig-MG及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGを提供する。これらの組換え発現プラスミドは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCCM 10404、KCCM 10407、KCCM 10401及びKCCM 10399が付与された。
【００７４】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞を提供する。
【００７５】
本発明により製造された形質転換体または形質感染体を培養し、培養物から分離された本発明の直列連鎖融合された二量体蛋白質は、前記表１に記載した通り免疫グロブリンに結合された連鎖体の形態の免疫反応に関与し、蛋白質の種類によって治療剤、診断剤及び研究用のツールとして多様に、かつ有用に使用することができ、これらの用法は当業者によく知られている。特に治療剤として使用する場合には、通常的に知られている有効量を適用することができるが、特定の患者に対する特定の有効量は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物の配合及び予防または治療される特定の疾患の重症を含んだ、種々の要因により変わるということは理解できるだろう。更に、当業者は、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質が治療剤として使用される場合、これらの投与方式及び経路も免疫反応に関与する蛋白質の通常的な投与方式及び経路が適用できるということを理解しているだろう。
【００７６】
本発明は、下記の実施例により、更に具体的に説明されるだろう。しかし、これらの実施例は単純に本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業者において自明であろう。説明の便宜のため、本発明に関連し、下記の実施例により製造されたDNA作製物、組換え発現プラスミド、形質転換の細胞株、使用されたプライマーに関する配列目録及び寄託情報を下記表８及び９に要約する。
【００７７】
【表８】
【００７８】
【表９】
【００７９】
〔実施例１〕
人体TNFR
A．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図１及び図５)
a．TNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片
人体TNFの受容体タイプI(TNFR1、p55)の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンG1のFc部位が連結された融合遺伝子を製造するため、文献[ホルトンらのBiotechniques 8: 528, 1990]に記述されている方法と同様な方法で重合酵素の連鎖反応の方法(PCR)を行った。
【００８０】
制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列(配列番号2のペプチド1-20)のコーディング配列を有する一つのプライマー(配列番号25のヌクレオチド)と、前記細胞外域可溶性の部位(TNFR1-ED)3'末端の配列と免疫グロブリンG1(IgG1)のヒンジ部位(hinge region:H)の5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列(配列番号26のヌクレオチド)を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりTNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片を生成した。この反応のための鋳型cDNAは、健康な成人の単核球細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８１】
健康な成人の血液を採取し、RPMI-1640(Gibco BRL, USA)培地と1:1で希釈し、これをFicoll-hypaque(Amersham, USA)を使用して密度勾配の遠心分離(density-gradient centrifugation)して上部に形成されたTリンパ球の細胞層を得た。そして、RPMI-1640培地で3回洗浄し、ここに10％牛胎児血清(FBS, GibcoBRL, 5USA)含有RPMI-1640培地を加えてTリンパ球の細胞を5×105個/mlとし、leukoagglutinin(Pharmacia, USA)を3.5μｇ/mlになるように添加した後、5％CO2の培養基で、37℃、2日間培養した。
【００８２】
mRNAは、Tri-Reagent(MRC, USA)mRNAの分離キットを利用して純粋分離した。まず、ヒトTリンパ球の2×107個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水溶液(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.2)で3回洗浄した後、1 mlのTri-Reagentで数回混合してRNAを溶解させた。このチューブに0.2 mlのクロロホルム(chloroform)を添加して激しく揺らした後、室温で15分間放置した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を1.5 mlのチューブに移し、0.5 mlのイソプロパノール(isopropanol)を添加した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を捨てた後、沈殿物に、75％エタノール(Ethanol)-25％DEPC(Sigma, USA)を処理した3次の蒸留水を1 ml添加し、2〜3回混合した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を完全に除去し、空気中から乾燥させて残りのエタノールを除去した後、RNAをDEPCを処理した3次の蒸留水50μlに溶解した。
【００８３】
cDNAの合成は、1.5 mlのチューブに精製された2μｇのmRNAと1μlのオリゴdT [oligo dT(dT30, Promega, USA)]プライマーを10μMの濃度で混合し、70℃で2分間加熱した後、氷に入れて2分間冷やした。この混合物に200UのM-MLVの逆転写酵素[reverse transcriptase(Promega, USA)]、10μlの5X反応緩衝溶液(reaction buffer)[250mMのTris-HCl(Tris-HCl), pH 8.3, 375mMの塩化カリウム(KCl), 15 mMの塩化マグネシウム(MgCl2), 50mMのDTT]、1μlのdNTP(それぞれ10mMの濃度, Takara, Japan)を入れてDEPCを処理した3次の蒸留水で50μlになるように添加した後、42℃で１時間反応させて1次のcDNAを合成した。
【００８４】
b．免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片
TNFRの細胞外域可溶性の部位3'末端の一部配列を含み、IgG1のヒンジ部位の5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー(配列番号27のヌクレオチド)と、XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用し、重合酵素の連鎖反応により免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を生成させた。この反応のための鋳型cDNAは、回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液の細胞(Bリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８５】
c．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物
前記生成されたTNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列(TNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端とIgG1のヒンジ部位の5'末端を含む配列)間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、TNFR1の5'末端をコーディングする配列を有するプライマー(配列番号25のヌクレオチド)とIgG1のFcの3'末端をコーディングするプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記TNFR1の細胞外域可溶性の部位のDNA断片とIgG1のFc部位のDNA断片の配列を含む目的するTNFR1/FcコーディングDNA作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００８６】
d．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescript KSII(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号1)。このとき、生成された融合蛋白質は単純融合された単量体蛋白質としてTNFR1/Fcと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質TNFR1/Fcの推定アミノ酸配列は配列番号2に該当される。
【００８７】
B．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図１及び図５)
a．TNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片
人体TNFの受容体タイプII(TNFR2, p75)の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンG1のFc部位が連結された融合遺伝子を、前記TNFR1の製造過程と同様な 手続により製造した。
【００８８】
制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列(配列番号4のペプチド1-22)のコーディング配列を有する一つのプライマー(配列番号29のヌクレオチド)と、前記細胞外域可溶性の部位(TNFR2-ED)3'末端の配列と免疫グロブリンG1(IgG1)のヒンジ部位(hinge region:H)の5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列(配列番号30のヌクレオチド)を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりTNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片を生成した。この反応のための鋳型cDNAは、TNFR1と同様に健康な成人の単核球の細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８９】
b．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物
前記生成されたTNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と前記TNFR1に記述されているように製造された免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列(TNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端とIgG1のヒンジ部位の5'末端を含む配列)間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、TNFR2の5'末端をコーディングする配列を有するプライマー(配列番号29のヌクレオチド)とIgG1のFcの3'末端をコーディングするプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記TNFR2の細胞外域可溶性の部位のDNA断片とIgG1のFc部位のDNA断片の配列を含む、目的するTNFR2/FcコーディングDNA作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００９０】
c．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescriptKSII(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号3)。このとき、生成された融合蛋白質は、単純融合された単量体蛋白質としてTNFR2/Fcと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質TNFR2/Fcの推定アミノ酸の配列は配列番号4に該当される。
【００９１】
C．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図２及び図５)
TNFR1の細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子、すなわち連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物を作るため、TNFR1の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物に、同一な制限酵素(BamHI)の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、BamHIで切断された部分をリガーゼ(ligase)で連結した。この反応は、前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物(配列番号1のヌクレオチド)を鋳型として使用した。
【００９２】
配列番号25のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号33のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、3'末端にBamHI認識配列を有するTNFR1の細胞外域可溶性の部位の断片を増幅し、更に配列番号28のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号32のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、5'末端にBamHIの認識配列を有する他の単純融合された単量体蛋白質TNFR1/Fcをコーディングする断片をそれぞれ増幅した。重合酵素の連鎖反応は、1μlの１次のcDNA、2UのPfu DNAの重合酵素[polymerase(Stratagene, USA)]、10μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer)[200mMトリス-HCl, pH 8.75, 100mMの硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4], 100mMの塩化カリウム(KCl), 20mMの塩化マグネシウム(MgCl2)]、1％のTriton(登録商標)X-100、1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)、3μlのプライマー1(10μM)、3μlのプライマー2(10μM)、2μlのdNTP(それぞれ10mM)を入れて3次の蒸留水で100μlになるように添加した後、実施した。反応条件は、94℃で5分間処理した後、95℃で1分、58℃で1分30秒、72℃で1分30秒ずつ31回反応させ、72℃で15分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端(blunt end)になるようにした。
【００９３】
重合酵素の連鎖反応産物を0.8％アガロースゲル(agarose gel)に電気泳動した後、Qiaex II gel extraction kit(Qiagen, USA)を利用して純粋分離した。純粋分離された重合酵素の連鎖反応産物を制限酵素BamHIで処理した後、フェノール/クロロホルムの抽出方法で純粋分離した。次いで、BamHIで処理した２つの種類のDNA断片をリガーゼを利用して結合させた。
【００９４】
D．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図２及び図５)
TNFR2の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物に、同一な制限酵素(BamHI)の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、BamHIで切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物を製造した。
3'末端にBamHIの認識配列を有するTNFR2の細胞外域可溶性の部位の断片は、配列番号34のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号35のヌクレオチドに該当するプライマーを使用して増幅した。重合酵素の連鎖反応は、TNFR1の場合と同様に実施した。但し、配列番号3の前記製造された単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を鋳型として使用した。重合酵素の連鎖反応産物はTNFR1の場合と同様に分離した。
【００９５】
E．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物
TNFR1の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位(配列番号6 197-216のペプチド)を除き、一番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号5 565-591のヌクレオチド)と２番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号5 649-681のヌクレオチド)を含んだアンチセンスプライマー(配列番号37のヌクレオチド)と制限酵素EcoRIを有し、リーダ配列を含んだプライマー(配列番号25のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してDNA断片を製作した。
【００９６】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号5の565-567(CTG、Leu)、574-576(ACG、Thr)、652-654(CTA、Leu)及び670-672(AGA、Arg)に該当するヌクレオチドをAAC(Asn、N)に、配列番号5の571-573(TGC、Cys)及び580-582(TTG、Leu)に該当するヌクレオチドをACC(Thr、T)に、配列番号5の658-660(GAC、Asp)をTCC(Ser、S)に代置した塩基配列を含むように製作(配列番号36及び37のヌクレオチド)し、総４個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号10 189-191、192-194、198-200、204-206のペプチド)を挿入した。
【００９７】
この反応において、連鎖体の形態のTNFR1-TNFR1/Fc遺伝子(配列番号5のヌクレオチド)を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のTNFR1-TNFR1/Fc遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のDNAを成すようにし、リーダ配列を含んだTNFR1の細胞外域の部位3'末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする5'末端の塩基配列が結合された状態のDNA断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の5'末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、以下に説明する２番目のDNA断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【００９８】
２番目のDNA断片は、一番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号5 565-591のヌクレオチド)と２番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号5 649-681のヌクレオチド)を含んだ一つのプライマー(配列番号36のヌクレオチド)と、制限酵素XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のDNA断片と同様にTNFR1の細胞外域の部位5'末端に一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【００９９】
次いで、前記の二種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるDNA断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各5'及び3'末端に該当するプライマー(配列番号25と28)を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより２つのDNA断片を結合させ、これをmgTNFR1-TNFR1-IgGと名づけた。
【０１００】
F．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物
TNFR2の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位(配列番号8 203-263のペプチド)を除き、一番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号7 586-606のヌクレオチド)と２番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号7 790-807のヌクレオチド)を含んだアンチセンスプライマー(配列番号39のヌクレオチド)と制限酵素EcoRIを有し、リーダシーケンスを含んだプライマー(配列番号29のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してDNA断片を製作した。
【０１０１】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号7の595-597(GTC、Val)及び799-801(GGG、Gly)に該当するヌクレオチドをAAC(Asn、N)に代置した塩基配列を含むように製作(配列番号38及び39のヌクレオチド)したプライマーを利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号12 199-201、206-208のペプチド)を挿入した。
【０１０２】
この反応において、連鎖体の形態のTNFR2-TNFR2/Fc遺伝子(配列番号7のヌクレオチド)を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のTNFR2-TNFR2/Fc遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のDNAを成すようにし、リーダシーケンスを含んだTNFR2の細胞外域の部位3'末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする5'末端の塩基配列が結合された状態のDNA断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の5'末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、下記に説明する２番目のDNA断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【０１０３】
２番目のDNA断片は、一番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号7 586-606のヌクレオチド)と２番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号7 790-807のヌクレオチド)を含んだ一つのプライマー(配列番号38のヌクレオチド)と、制限酵素XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のDNA断片と同様にTNFR2の細胞外域の部位5'末端に一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【０１０４】
次いで、前記の２種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるDNA断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各5'及び3'末端に該当するプライマー(配列番号29と28)を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより二つのDNA断片を結合させ、これをmgTNFR2-TNFR2-IgGと名づけた。
【０１０５】
G．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR-TNFR/Fc及びこの糖化蛋白質をコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された連鎖融合された単量体蛋白質TNFR-TNFR/Fc及びこの糖化蛋白質をコーディングするDNA作製物をpBluescript KSII(+)(Stratagene, USA)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてTNFR1-TNFR1/FcとTNFR2-TNFR2/Fc、この糖化蛋白質としてmgTNFR1-TNFR1/FcとmgTNFR2-TNFR2/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号6、8、10及び12に該当される。
【０１０６】
ベクタとして使用する10μlのpBluescript KSII(+)（Stratagene, USA）を15UのEcoRIと15UのXbaI、5μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer)[100mMのトリス-HCl、pH 7.5、100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)、10mMのDTT、500nMの塩化ナトリウム(NaCl)]、5μlの0.1％牛血清アルブミン[BSA(Takara, Japan)]を混合した 後、3次の蒸留水で50μlになるように添加した後、37℃で2時間反応させてDNAを消化させた。反応物を0.8％アガロースゲルに電気泳動した後、QiaexIIgel extraction kit(Qiagen, USA)で純粋分離した。
【０１０７】
EcoRIとXbaIで消化されたpBluescript KS II(+)(Stratagene, USA)100ngと制限酵素で消化させた20ngの重合酵素の連鎖反応産物を混合し、0.5UのT4 DNAリガーゼ[ligase(Amersham, USA)]、1μlの10X反応緩衝溶液(reactionbuffer)[300mMのトリス-HCl(Tris-HCl)、pH7.8、100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)、100mMのDTT、10mMのATP]を入れた後、3次の蒸留水で10μlになるように添加した後、16℃の水槽(water bath)で16時間反応させた。大腸菌[E.coli Top10(Novex, USA)]をリビジウムクロリド(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)法でコンピテント細胞 (competent cell)を作った後、形質転換させてアンピシリン(ampicillin, Sigma, USA)を50μl/ml含有したLB固体培地に塗抹し、37℃で16時間培養した。生成されたコロニーをアンピシリンが50μl/ml含有されたLB液体の培地4 mlに接種した後、37℃で16時間振とう培養した。この中、1.5 mlをSambrook J.らの文献(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1. 25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)に記述されたアルカリ分解(alkaline lysis)法でプラスミドを少量抽出した後、EcoRIとXbaIで消化させてクローニングの有無を確認した。
【０１０８】
全体のコーディング領域の配列はダイデオキシチェーンターミネーション[Dideoxy chain termination(Sanger Fらの文献, PNAS USA, 74: 5483, 1977)法を利用した以下のようなDNA配列化の方法により確認した。前記のアルカリ分解法で抽出したプラスミドとSequenase(登録商標 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA)及び35S dATP（Amersham, USA）を使用して製品の使用法に準する方法でDNA配列化の反応を進行させた。6％ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)に前記の試料をローディング(loading)し、電圧を1800〜2000Vの間に維持し、ゲルの温度を50℃に維持しながら2時間電気泳動を行った後、乾燥させてからＸ線フィルム(Kodak, USA)に２日間露出させた後、DNA塩基配列を判読した。
【０１０９】
〔実施例２及び３〕
CD2及びCTLA4
CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片は、制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列[CD2(配列番号14のペプチド1-24)、CTLA4(配列番号16のペプチド1-21)]のコーディング配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド))を有する一つのプライマー[CD2(配列番号40のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号43のヌクレオチド)]と、制限酵素PstIの認識配列と前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列をコーディングするアンチセンス配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する他のプライマー[CD2(配列番号41)、CTLA4(配列番号44)]を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型cDNAは健康な成人の単核球の細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１０】
更に、免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片は、制限酵素PstIの認識配列とIgG1の上鎖部位の5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー(配列番号42のヌクレオチド)と、XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28)を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型cDNAは回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液細胞(Bリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１１】
次いで、前記生成されたCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を制限酵素PstIで消化させ、T4 DNA リガーゼを利用して結合させることにより単純二量体の形態のCD2/Fc及びCTLA4/Fc遺伝子を製作した。製造された遺伝子は、発現後蛋白質の分泌を容易にするためのリーダ配列を含む。
【０１１２】
前記生成された融合遺伝子の断片を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescript KS II(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号13及び15)。このとき、生成された融合蛋白質をそれぞれCD2/Fc、CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号14及び16に該当される。
【０１１３】
重合酵素の連鎖反応は、1μlの1次のcDNA、2UのPfu DNA重合酵素[polymerase(Stratagene, USA)]、10μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer) [200mMのトリス-HCL、pH 8.75、100mMの硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]、100mMの塩化カリウム(KCl)、20mMの塩化マグネシウム(MgCl2)]、1％のTriton(登録商標)X-100、1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)、3μlのプライマー1(10uM)、3μl のプライマー2(10uM)、2μlのdNTP(それぞれ10mM)を入れて3次の蒸留水で100μlになるように添加した後実施した。反応条件は、94℃で5分間処理した後、95℃で1分、58℃で1分30秒、72℃で1分30秒ずつ31回反応させ、72℃で15分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端になるようにした。
【０１１４】
連鎖体の形態のCD2-CD2/Fc及びCTLA4-CTLA4/Fcの融合遺伝子は、以下のように製造した。
【０１１５】
CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子を作るため、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位の配列を、前述した制限酵素PstIとT4 DNA ポリメラーゼを利用して平滑末端を有するようにした単純二量体の形態の融合遺伝子において、細胞の外域と免疫グロブリンの結合部位にリガーゼを利用して平滑末端接合(blunt end ligation)させることにより挿入した。具体的に、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位のリーダ配列が終了される部位[CD2(配列番号14のペプチド25)、CTLA4(配列番号16のペプチド22)]をコーディングするコーディング配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する一つのプライマー[CD2(配列番号45のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号47のヌクレオチド)]と、前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列をコーディングするアンチセンス配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する他のプライマー[CD2(配列番号46)、CTLA4(配列番号48)]を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応は、前記の単純二量体の融合遺伝子[CD2/Fc(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4/Fc(配列番号15のヌクレオチド)]を鋳型として使用した。
【０１１６】
更に、pBluescript KSII(+)に挿入された単純二量体の形態のCD2/Fc及びCTLA4/Fcを制限酵素PstIで消化させ、3'末端が突出された形態(3'overhang)の切断面を生成するようにした。切断面の3'突出の末端をT4 DNA ポリメラーゼで処理し、部分的に除去(partial deletion)させて平滑末端になるようにした。細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子を作るため、前記の重合酵素の連鎖反応により製作したCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位を平滑末端として製作された単純二量体の遺伝子の切断面に、リガーゼを利用して平滑末端接合(blunt end ligation)させることにより挿入し、クローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれCD2-CD2/FcとCTLA4-CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号18及び20に該当される。
【０１１７】
多糖化(multiglycosylation)の形態の連鎖体融合遺伝子は以下のように製作した。
【０１１８】
糖化モーティブペプチドの配列は、制限酵素EcoRIと細胞外域可溶性の部位のリーダシーケンスを含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したDNA断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと、免疫グロブリンG1のFc部位の3'末端と制限酵素XbaIをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応により製作されたDNA断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【０１１９】
CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体の融合遺伝子の場合も、前記のTNFR/Fcの方法と同様な方法で変形されたプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を利用して糖化モーティブペプチドを挿入させ、TNFR/Fcの場合とは異なりCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位が結合されるペプチド配列はそのまま維持した。
【０１２０】
CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体融合蛋白質の多糖化の過程は、CD2/Fcの場合、配列番号17の598-600(CCT、Pro)及び616-618(GAG、Glu)に該当するヌクレオチドをAAT(Asn、N)に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー(配列番号49及び50のヌクレオチド)を利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号200-202、206-208のペプチド)を挿入して完成し、CTLA4/Fcの場合は、配列番号19の403-405(GTA、Val)、424-426(CCA、Pro)に該当するヌクレオチドをAAT(Asn、N)に、配列番号19の409-411(GAT、Asp)、445-407(GTG、Val)に該当するヌクレオチドをそれぞれACA(Thr、T)及びACG(Thr、T)に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー(配列番号51及び52のヌクレオチド)を利用し、総３個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号24 136-138、142-144、147-149のペプチド)を挿入して完成した。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれmgCD2-CD2/Fc及びmgCTLA4-CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号22及び24に該当される。
【０１２１】
〔実施例４〕
単純/連鎖融合された二量体のTNFR/Fc融合蛋白質の発現及び精製
チャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ1(CHO-K1、ATCC CCL-61、Ovary、Chinese hamster、Cricetulus griseus)で融合蛋白質を発現させるため、TNFR/Fc融合遺伝子を含んだpBluescript KSIIプラスミドDNAを形質転換された大腸菌から抽出した後、制限酵素EcoRIとXbaIで消化させて得たTNFR/Fcの断片を、動物細胞の発現ベクタであるpCRTM3(Invitrogen, USA)プラスミドEcoRI/XbaI部位に挿入し、発現ベクタを製造した後、これをそれぞれのプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'と名づけ、2001年7月10日付で韓国微生物保存センター(KCCM)にそれぞれKCCM 10288及びKCCM 10291の受託番号で寄託した。
【０１２２】
形質感染は、前記TNFR/Fc融合遺伝子を含んだプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'DNAのいずれか一つをGibco BRL(USA)社の LipofectamineTM試薬と混合することにより行った。1〜3×105cells/wellの濃度のチャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ1(CHO-K1)細胞を6穴の組織培養板(six-well tissue culture plate, Nunc, USA)に接種し、10％牛胎児血清(FBS)を含有したDMEM培地で細胞が50〜80％になるように培養した後、血清のないDMEM培地から前記TNFR/Fc融合遺伝子を含んだプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'DNAのいずれか一つを1〜2μl取り、LipofectamineTM(Gibco BRL, USA)を2〜25μl取って常温で15〜45分間反応させたDNA-リポソーム混合体(Liposome complex)を細胞培養板に添加させた。5時間培養した後、血清が20％含有されたDMEM培地を添加し、18〜24時間培養した。最初の形質感染後に細胞を1.5mg/mlのGeneticin(G418, GibcoBRL, USA)が添加された10％牛胎児血清DMEM培地で3週間培養し、形成された集落を分離して増幅培養した。融合遺伝子の発現可否はペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を使用した酵素免疫の検査法(ELISA)を通じて検査した。
【０１２３】
酵素免疫の検査法(ELISA)は、以下のような方法で行った。まず、1mg/mlのヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を0.1Mの中炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)に1:2000で希釈した後、96穴の酵素免疫の検査板(96-well flexible plate, Falcon, USA)に100μlずつ分注し、ラップで包んだ後、4℃で16時間以上放置して抗体が検査板の表面にコーティングされるようにした。これを洗浄緩衝溶液(washing buffer)[0.1％ツイン-20(Tween-20)を含有、1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Phosphate buffered saline)]で3回洗浄した後、希釈溶液[diluent buffer(1Xリン酸緩衝生理食塩水の48.5 ml、牛胎児血清の1.5 ml、ツイン-20の50μl)]を180μlずつ分注した。一番目の穴(well)に培養した上層液20μlを入れた後、マイクロピペット(micropipette)を利用して連続的に希釈し、陽性の対照群として0.01μg/μlのヒト免疫グロブリン(human IgG, Sigma, USA)を、陰性の対照群として形質感染されていないチャイニズハムスターの卵巣Ｋ1(CHO-K1)細胞の培養液を使用して同様に希釈した。希釈が終わった96穴の酵素免疫の検査板(Falcon, USA)をホイルで包んで37℃で1時30分間反応させた後、洗浄溶液で3回洗浄した。ペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を希釈溶液で1:5000希釈した後、これを100μlずつ分注してホイルで包んだ後、37℃で1時間反応させた。反応が終わった後、洗浄溶液で3回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼシステム(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)を利用して発色させ、吸光器(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)で波長630nmに対する吸光度を測定し、発現の可否を確認した。
【０１２４】
このように製造された形質転換体(transfectant)をそれぞれTR11Ig-CHO及びTR22Ig-CHOと名づけ、2001年7月7日付で韓国細胞株研究財団(KCLRF)にそれぞれKCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00047の受託番号で寄託し、前記形質転換体が生成した融合蛋白質を精製する目的で無血清培地(serum free media)中、CHO-S-SFMII(Gibco BRL, USA)に適応させるため、以下の過程を進行した。約3×105個の細胞を6穴板(6-well plate)に接種した後、16時間、5％のCO2、37℃培養基で培養して定着させた後、顕微鏡下で約30〜50％の面積にcellが付着されたことを確認し、10％牛胎児血清含有DMEMとCHO-S-SFMIIの比率を8:2になるように培地を交替して培養した。この割合で3回継代培養した後、それぞれ6:4の割合で3回、4:6の割合で3回、3:7の割合で3回、2:8の割合で3回、及び1:9の割合で3回継代培養した後、最終的に100％のCHO-S-SFMII培地で継代培養し、この発現量を酵素免疫の検査法を利用して測定した。
【０１２５】
この細胞を牛血清培地のないCHO-S-SFMII(Gibco BRL, USA)培地で大量培養した後、それぞれの融合蛋白質を含有した培養液を200×g、12分間遠心分離して細胞カスを完全に除去し、プロテインＡカラム(HiTrap protein A column, Amersham, USA)を利用した以下の方法で純粋分離した。20mMのリン酸化ナトリウム(Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)を1 ml/minの速度で2分間通過させた後、10 mlの培養液を同一な速度でカラムに通過させ、プロテインＡに融合蛋白質が結合するようにした。20mMのリン酸化ナトリウム(pH7.0)を2分間同一な速度で通過させて洗浄した後、0.1Mのクエン酸(C6H8O7. H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)を3分間同一な速度で通過させながら500μlずつ1.5 mlのチューブに順次的に抽出物を分注した。これを1Mのトリス(Tris, pH 11.0, USA, Sigma)を利用してpH 7.0で滴定し、各チューブの融合蛋白質の存在有無は前記に記述した酵素免疫の検査法(ELISA)を通じて確認した。純粋分離した融合蛋白質はセトリコン30(Centricon30, Amicon, USA)を使用し、4℃で2000×g、30分間遠心分離して濃縮した。
【０１２６】
〔実施例５〕
精製されたTNFR1-TNFR1/Fc及びTNFR2-TNFR2/FcのSDS-PAGE(図15)
プロテインAカラムを利用して純水精製された蛋白質を還元剤(ジスルフィド結合破壊)であるDTTを添加した還元条件と、DTTが含まれていない非還元条件でSDS-PAGEを行った。それぞれのSDS-PAGE上における分子量の測定結果は、以下の表の通りである。TNFR/Fcの蛋白質は細胞内で二量体として存在することを確認することができた。TNFR1-TNFR1-Igのアミノ酸配列で推定した分子量は約70kDaであり、SDS-PAGE上で約102kDaと推定された。この差は、糖蛋白質の電気泳動上で表れる一般的な現象として、糖化された部分により電気泳動上における移動速度が遅れるため起きる特徴である。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】
〔実施例６〕
単純/連鎖融合された二量体TNFR/Fc融合蛋白質のTNFα(α)とTNF(β)の細胞毒性の中和効果の実験
TNFR/Fc融合蛋白質の、TNFα(α)とTNFβ(β)から誘導される細胞毒性を抑制する効果を検査するため、L929細胞[ATCC, Musmusculus(mouse), NCTC clone 929(derivative of StrainL; L-929; Lcell)を利用した。この分析は、TNFにより誘導される細胞毒性を抑制するTNFRの活性[スケロン(ScallonBJ)ら, Cytokine 7: 759, 1995]に基づいている。
【０１２９】
L929細胞を96穴板(96-well plate)に3×104cells/wellになるように接種し、37℃、CO2培養基で24時間培養した。次いで、アクチノマイシン(Actinomycin D, Sigma, USA)を3μg/mlになるように添加し、100％細胞毒性を表す濃度(0.5〜2ng/ml)のTNFα及びβ(R&D, USA)を、10倍ずつ連続的に希釈したTNFR標本と共に16〜18時間培養した。次いで、96穴板にある細胞を染色試薬であるクリスタルバイオレット(crystal violet, Wako pure chemical industries, Japan)で染色し、細胞の活性度は吸光度595nmで吸光器(spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan)を利用して測定した。
下記の表11は、各TNFR/Fc融合蛋白質の抑制濃度の中間値(IC50)として、単純二量体の形態の融合蛋白質(TNFR1-Ig、TNFR2-Ig)より連鎖体の形態の融合蛋白質(TNFR1-TNFR1-Ig、TNFR1-TNFR2-Ig、TNFR2-TNFR1-Ig、TNFR2-TNFR2-Ig)が、二種類のTNFに対する細胞毒性を抑制する効果が全て顕著に高いことが分かった。更に、既存の単純二量体の形態と、本発明の連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質の、TNFα(図16)とβ(図17)に対する細胞毒性の抑制効果を対比すれば、本発明の連鎖体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質がTNFαとβの細胞毒性を顕著に抑制することがより明白に表れる。
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】
〔実施例７〕
単純/連鎖融合された二量体CD2/Fc融合蛋白質とCTLA4/Fc融合蛋白質の活性免疫細胞の増殖抑制の効果実験
発熱患者のBリンパ球にエプスタイン-バーウイルス(Ebstein-Barr virus)を形質感染させて作ったBリンパ球の細胞株であるWT100B1SをTリンパ球の抗原提示細胞として使用するため、10％牛胎児血清含有 RPMI 1640に培養した。これを2,000rpmで2分間沈殿させた後、5.0×105/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640に再び溶いた後、3,000rdのγ線(γ-ray)で照射(irradiation)させた。
【０１３２】
Tリンパ球は、健康なヒトの血液からFicoll-hypaque(Amersham, USA)を利用して分離した後、2.0×106/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640で培養した。
【０１３３】
一次の混合リンパ球の反応[Primary Mixed Lymphocyte Reaction(MLR)]を実行するため、WT100B1SとTリンパ球を150mmの細胞培養皿にそれぞれ15mlずつ混合して3日間培養した後、15mlの10％牛胎児血清含有RPMI 1640を添加して3日間更に培養した。総6日間培養した後、前記の方法通りFicoll-hypaque(Amersham, USA)を利用して生きているTリンパ球を純粋分離した。分離したリンパ球は45％牛胎児血清、45％RPMI 1640、10％DMSOで作った培地を利用して冷やした後、液体窒素に保管した。
【０１３４】
一次の混合リンパ球反応させたTリンパ球を、２次の混合リンパ球反応を実施するために溶解した後、RPMI 1640培地を利用して2回洗浄し、10％牛胎児血清含有RPMI 1640に3.0×105cells/mlになるようにした。
【０１３５】
抗原提示細胞として使用するWT100B1Sは、新たに培養して前記の方法通り培養した後、3,000rdのγ線(γ-ray)で照射(irradiation)させて準備し、7.5×104cells/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640に準備した。準備されたWT100B1Sを100μlずつ96穴の平板細胞培養板に入れ、CD2/Fc及びCTLA4/Fc融合蛋白質を最終の濃度が10、1、10-1、10-2、10-3、10-4μl/mlになるように混合した後、前記の一次の混合リンパ球反応させたTリンパ球を100μlずつ添加した。これを、5％CO2、37℃の培養基で2日間培養した後、10％牛胎児血清含有RPMI 1640を100μl添加し、2日間更に培養した。総4日間の培養中、最後の6時間は3H-チミジン [thymidine(Amersham)]を1.2μCi/mlになるように添加して培養した。
【０１３６】
培養が終了された後、96穴の細胞培養板を4℃、110×g、10分間遠心分離してT-リンパ球を沈殿させて上層液を除去し、200μlの1Xリン酸緩衝溶液で洗浄した。同一な条件で遠心分離した後、リン酸緩衝溶液を除去し、残っている3H-チミジン[thymidine(Amersham)]を除去するため、冷たい200μlの10％TCA [trichloridic acid(TCA、Merck)]を添加して2分間揺らした後、5分間4℃で反応させた。
【０１３７】
前記と同様な条件で遠心分離した後、上層液を除去し、冷たい200μlの70％エタノールを添加した後、4℃で5分間放置してTリンパ球を固定した。遠心分離した後、上層液を除去し、前記の方法と同様な条件で10％TCAを処理し、残っていた3H-チミジン[thymidine(Amersham)]を完全に除去した。
【０１３８】
ここに、100μlの2％SDS[SDS(pH8.0)]/0.5Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を添加し、37℃で30分間反応させて細胞溶解を実施し、25℃、110×gで10分間遠心分離してTリンパ球を沈殿させ、上層液中50μlを96穴のサンプル板(Wallac)に移した。上層液に1.5倍のOptiPhase SuperMix(Wallac)を入れて5分間揺らした後、液体吸光器[1450 MicroBetaTriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter(Wallac)]を利用して3Hに対するcpm値を測定し、Tリンパ球の増殖可否を確認した。図18及び図19でのように、連鎖融合された二量体CD2/Fc及びCTLA4/Fcが、単純融合された二量体に比べて卓越に活性免疫細胞の増殖を抑制することが分かった。
【０１３９】
〔実施例８〕
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質のマウス血中における濃度半減期の増加効果の実験
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2、[mgTNFR2-TNFR2/Fc]2、[mgCD2-CD2/Fc]2及び[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2の血中における半減期の測定は、マウス(ICR、シャムタコ)の腹腔に精製された各融合蛋白質5μgを注射した後、最高120時間(5日)一定の間隔で血液を採取した後、蛋白質の濃度を酵素免疫の検査法(ELISA)を利用して確認することにより行った。図20、21、22でのように、糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質が、自然形態の同一な直列連鎖融合された二量体蛋白質に比べて、血中における半減期が増加されたことが分かった。これは持続的な効果を通じて効能の増大を期待することができる結果であると言える。
【０１４０】
〔実施例９〕
DBA/1マウスのコラーゲン誘導の関節炎に対する単純/連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質の効果実験
アトロゲン-CIA補助剤(Arthrogen-CIA ajuvant, Chondrex, USA)中の0.05Mの酢酸に2mg/mlの濃度で溶解した、タイプIIのコラーゲンをDBA/1マウス一匹当たり尻尾に100μgずつ注入し、コラーゲン誘導の関節炎(CIA; Collagen Induced Arthritis)を発病させた。ブースティング(Boosting)は3週後に行い、不完全なフロイント補助剤(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)を利用した。
DBA/1マウスに、タイプIIのコラーゲン100μgで免疫化させた後、3〜4週後に関節炎の症状が表れた。症状が表れた後、3〜5日が過ぎればマウスの足が赤く腫れ上がり、炎症性の関節炎(inflammatory arthritis)は3〜4週以上持続され、炎症が弱化されても関節は永久に硬直される。関節炎の深度の主観的な尺度を表す表12に基づいて1週間に2〜3回測定した(各実験群から5匹のマウスにおける平均値を求める)。コラーゲン誘導の関節炎に対する単純及び連鎖体の形態の二量体TNFR/Fcの効果を測定するため、マウスにTNFR/Fcまたはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を腹腔内に注射した。TNFR/Fcは、実験群当たり5匹のマウスに19日〜45日間、2日おきに10μgを注射した(図23の矢印)。5匹の対照群のマウスにはPBSを注射した。前記の測定結果を表した図7のように、既存の単純二量体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質を注入したマウスの場合を、対照群であるリン酸緩衝生理食塩水を注射したマウスで発病した関節炎の指標数値と比較するとき、約26〜38％減少した効果を表したが(45日の測定値を基準)、連鎖体の形態の二量体である[TNFR1-TNFR1/Fc]2、[TNFR2-TNFR2/Fc]2を注入した場合は、42〜55％減少した効果を表した。このように、従来の単純融合された二量体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質に比べ、直列連鎖融合された二量体のTNFR/Fc融合蛋白質がマウスの関節炎を顕著に減少させることが分かった。
【０１４１】
【表１２】
【０１４２】
前記結果は、連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質が、マウスのCIAの発病率を低下させるのに既存の単純二量体の形態の融合蛋白質に比べて効果的であり、したがって関節炎の治療に使用することにおいて連鎖体の形態の蛋白質の製剤が、既存の蛋白質の製剤に比べて効果的な治療剤として使用され得るということを表す。
【０１４３】
本発明の連鎖体の蛋白質、直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化修飾蛋白質は、増加した効能及び高度の安定性を表し、高い歩留まりで生成することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、従来の単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図２】 図２は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図３ａ】 図３ａは、従来の単純融合された単量体蛋白質を例示するTNFR/Fc、CD2/FcまたはCTLA4/Fcの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、単純融合された二量体蛋白質[TNFR/Fc]2、[CD2/Fc]2または[CTLA4/Fc]2の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図３ｂ】 図３ｂは、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質を例示するTNFR-TNFR/Fc、CD2-CD2/FcまたはCTLA4-CTLA4/Fcの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR-TNFR/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2または[CTLA4-CTLA4/Fc]2の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図４ａ】 図４ａは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の一例として[TNFR1-TNFR1/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｂ】 図４ｂは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の他の例として[TNFR2-TNFR2/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｃ】 図４ｃは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として[CD2-CD2/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｄ】 図４ｄは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として[CTLA4-CTLA4/Fc]2の構造を示したものである。
【図５】 図５は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質の他の例としてTNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'を作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図６】 図６は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Igを作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図７】 図７は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'の図である。
【図８】 図８は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'の図である。
【図９】 図９は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Igの図である。
【図１０】 図１０は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCT44Igの図である。
【図１１】 図１１は、本発明によって四つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-MGの図である。
【図１２】 図１２は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR22Ig-MGの図である。
【図１３】 図１３は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Ig-MGの図である。
【図１４】 図１４は、本発明によって三つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGの図である。
【図１５】 図１５は、本発明によって純粋精製された直列連鎖融合された二量体蛋白質 [TNFR1-TNFR1/Fc]2及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2を還元条件及び非還元条件下でSDS-PAGEを実施した結果を示す。
【図１６】 図１６は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)及び[TNFR2/Fc]2(○)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)が、TNFαの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１７】 図１７は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)及び[TNFR2/Fc]2(○)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)が、TNFβの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１８】 図１８は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CD2/Fc]2(●)、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンA(▼)及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CD2-CD2/Fc]2(○)が、活性Tリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図１９】 図１９は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(●)、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンA(▼)及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(○)が、活性Tリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図２０】 図２０は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２１】 図２１は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CD2/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CD2-CD2/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgCD2-CD2/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２２】 図２２は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２３】 図２３は、PBS(●)、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質 [TNFR1/Fc]2(■)及び[TNFR1/Fc]2(▲)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(×)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(△)によるDBA/1マウスにおけるコラーゲン誘導の関節炎(CIA)の抑制効果を示したグラフである。
本発明は、一般的に連鎖体の蛋白質に関する。更に具体的には、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体の蛋白質、及び免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性蛋白質の直列連鎖体(concatamer)が免疫グロブリンFc片のヒンジ(hinge)に結合されて融合された単量体(monomer)蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により形成された二量体(dimer)蛋白質、並びにこの糖化された二量体蛋白質に関する。
【０００１】
〔背景記述〕
サイトカイン(cytokine)は、ヒトの自家抗原(autoantigen)のように不適切な 刺激により病理学的に悪化した炎症反応が誘発するとき作用し、サイトカインの作用抑制剤である可溶性物質は、サイトカインを認識することができる抗体と可溶性受容体(soluble receptor)が使用されており、この物質に対する多くの特許がある(国際特許出願公開第WO93/016184号、第WO96/02576号、第WO96/023067号及び第WO1997/03682号、及び米国特許第6,225,117号、第5,656,272号、第6,210,661号、第5,977,318号、第5,789,192号及び第5,434,131号)。前記の抗体と可溶性受容体の物質はサイトカインと予め結合し、サイトカインが細胞膜に存在する受容体と結合することを妨害したり、受容体と直接結合することによりサイトカインによる信号の伝達を抑制する共通的な機作を有している。
【０００２】
サイトカインの作用抑制剤として使用される可溶性受容体は、ヒト免疫グロブリン(hIg、human immunoglobulin)の重鎖部位(heavy chain)と連結して使用できるものとして、カポン(Capon DJ)らの文献(Nature 337：525, 1989)に開示されており、以後、可溶性受容体と抗体の融合蛋白質が多くの特許を通じて教示された(米国特許第5,844,095号、第6,225,448号、第6,090,914号、第6,100,383号、第6,046,310号及び第5,521,288号)。
【０００３】
一般的に、サイトカインの可溶性受容体と免疫グロブリンの融合体は、元来分子の単量体(monomer)または免疫グロブリンと融合されていない分子に比べ、以下のような長所を有している(カポンらの前記文献)：
１)二量体(dimer)の形態で融合蛋白質は二価化(bivalency)されるため、リガンド(ligand)に対する総親和力(avidity)が増加；
２)血清内で破壊されずに存在することができる期間の増加、すなわち、分子の安定性の増加；
３)免疫グロブリン重鎖のFc(fragment crystallizable)片を通じた効果細胞(effector cell)の活性化；及び
４)蛋白質の分離精製の簡便性(例、プロテインAを利用した分離精製)。
【０００４】
殆どの受容体の細胞外域(extracellular domain)と免疫グロブリン上鎖間の融合体は、重鎖部位のCH1ドメインを除いた形態で製作されているが、その結果、免疫グロブリンの軽鎖(light chain)と結合されていない二量体として製造される。このように、免疫反応を媒介するのに関与する蛋白質または前記蛋白質の受容体の場合、元来分子の単量体よりは、免疫グロブリンと連結して使用することが好ましいということが知られている。更に具体的に詳察してみれば、サイトカインの一種類である腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor、以下「TNF」と略する)の場合、TNF-依存性の炎症反応を抑制するため国際特許出願公開第WO92/16221号及び第WO95/34326号のように腫瘍壊死因子の受容体(tumor necrosis factor receptor、以下「TNFR」と略する)を使用したり、米国特許第5,447,851号及び国際特許出願公開第WO94/06476号のようにTNFR-免疫グロブリンの融合蛋白質が使用されている。多くの文献によれば、TNFR-免疫グロブリンの融合蛋白質は、元来分子の単量体または免疫グロブリンと融合されていない分子よりも、TNFに対してより高い親和力(affinity)を有すると報告されている[レスラウア(Lesslauer W)らの文献(Eur. J. Immunol. 21: 2883, 1991)、アシケナージ(Ashkenazi A)らの文献(PNAS USA 88: 10535, 1991)、ペペル(Peppel K)らの文献(J. Exp. Med. 174: 1483, 1991)、モラー(Mohler KM)らの文献(J. Immunol. 151: 1548，1993)]。
【０００５】
腫瘍壊死因子の作用を抑制したり、免疫反応を調節するにおいて、有効作用部位である腫瘍壊死因子の受容体、CD2及びCTLA4の細胞外域の部位を多価化あるいは多量体化すれば、その効能の増加を予想することができるが、このような目的で腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの重鎖と連結して融合させた単量体蛋白質(重鎖融合の蛋白質)と、腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの軽鎖と連結して融合させた単量体蛋白質(軽鎖融合の蛋白質)を同時に一つの細胞株内で発現させれば、重鎖と軽鎖間の結合により二量体の構造の融合蛋白質を製造することができる。この際、二量体は、有効部位が生体内のように並列に配列された形態で製造され、その効能は従来の単量体に比べて顕著に増加されることが提示されたことがある[スケロン(Scallon BJ)らの文献(Cytokine 7: 759, 1995)]。
【０００６】
しかし、前記のような免疫グロブリン融合蛋白質の製造方法は、融合蛋白質を製造するとき、重鎖と軽鎖のそれぞれに融合させた二つの遺伝子を同時に生産細胞株に注入しなければならず、細胞が二種類の融合蛋白質を生産するとき二つの蛋白質の生産歩留まりが顕著に落ち、生産された重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が100％結合されないため、単量体である重鎖融合蛋白質または軽鎖融合蛋白質から、重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が融合された二量体を純粋分離する工程などの技術的な困難により実用化するのが難しいという問題点がある。このような理由などで、これまでは免疫グロブリン融合蛋白質の製剤は、二つの融合蛋白質が互いに単純に並列配列された二量体の形態で製造されて使用されていた。
【０００７】
したがって、免疫反応に関与する蛋白質の効果を改善するため、単一の遺伝子を発現させて単一分子の形態の効能が改善された多価化あるいは多量体化された蛋白質の製剤を生産する方法に対する要求が多数存在していた。
【０００８】
〔発明の要約〕
本発明者らは、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体(concatamer)の形態の蛋白質をDNA組換え技術により製造した。更に、本発明者らは、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジ(hinge)部位に結合された単量体(monomer)蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合(disulfide bond)された二量体(dimer)蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造した後、これを土台にDNA組換え技術を通じて直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質を生成し、更に本発明者らは、そのように生成された直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質が、単純融合された二量体蛋白質に比べて向上した効能を示し、特に連鎖融合された二量体蛋白質が糖化される場合、安定性が顕著に向上するということを見出した。
【０００９】
したがって、一つの観点として、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位C-末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位N-末端が結合された連鎖体の蛋白質を提供する。
【００１０】
他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合された二量体蛋白質を提供する。
【００１１】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を提供する。
【００１２】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドを提供する。
【００１３】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を提供する。
【００１４】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１５】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングし、糖化モーティブが挿入されたDNA作製物を含んだ組換えDNAプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から糖質化された前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖質化された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１６】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物に糖化モーティブを挿入するために使用されるDNAプライマーを提供する。
【００１７】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を提供する。
【００１８】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００１９】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンFc片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
一般的に、本発明は連鎖体の蛋白質に関し、より特定的には免疫接合体(Immunoadhesin)に関する。免疫接合体の典型は、免疫グロブリンFc領域と受容体または吸着分子のリガンド-結合領域を融合させた抗体-類似分子である。公知された典型的な免疫接合体は、抗原認知を担当する抗体分子の可変領域が受容体のリガンド-結合領域により置換され、抗体のFc領域は保有される形態である。多くの文献を通じて構造的に多様な形態の免疫接合体が提示されてきた。しかし、本発明による免疫接合体の構造は、これまで公知された免疫接合体の構造とは異なり、また本発明による構造の免疫接合体を仮想的に、または推定的に製造することができるということを暗示した文献はない。
【００２１】
〔用語の定義〕
本発明による免疫接合体の構造的な特徴により、このような構造の特性上、本願明細書に使用される用語の定義を明確にする必要がある。一般的には、本発明において別に定義していない限り、全ての技術的及び科学的な関連用語は、この発明が属する技術分野で通常的に通用される意味を有する。しかし、以下の用語は通常的な意味を表すが、その意味を明確にし、かつ本発明の範囲を明確にするために以下のように定義する。
【００２２】
本願の明細書に使用された用語である「免疫グロブリン」は、多様な種類の抗原を特異的に認識するようにB細胞により生成され、B細胞の抗原受容体の役割を果たす蛋白質の分子を指す。この分子はYの模様で、二つの同一な軽鎖と二つの同一な重鎖で構成される。軽鎖と重鎖は全て可変及び固定領域を含む。四つの鎖は、ヒンジ領域という重鎖のフレキシブル領域(flexible region)に位置したジスルフィド結合により全て固定されている。重鎖と軽鎖の全ての可変領域は、結合して二つの同一な抗原-結合部位を形成する。重鎖の固定領域により免疫グロブリンA(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)及びM(IgM)の五つの部類に分けられる。それぞれの部類はイソタイプと言い、独特な構造的な特徴及び相異する生物学的な特性を有している。例えば、IgGはFc構造において、他のイソタイプと若干相異する。更に、IgG及びIgAは多くのサブ部類がある。例えば、ヒトIgGイソタイプ内に四つのサブ部類のIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4があり、それぞれはγ1、γ2、γ3及びγ4の重鎖を有する。補体活性化、食細胞-Fc受容体への結合、抗原-依存の細胞毒性のような免疫グロブリン分子の機能は、重鎖のFc領域に存在する構造的な決定因子により媒介される。このような重鎖のFc領域は、本発明による二量体蛋白質の構成要素として使用され、前記全ての部類またはサブ部類の免疫グロブリンから由来することができる。
【００２３】
本願の明細書に使用された用語でる「免疫グロブリンFc片」というのは、免疫グロブリン分子は、機能的に区分される片に分けられるが、この中に抗原結合力はないものの、容易に結晶体を形成する片としてヒンジ部位(hinge region)、CH2とCH3ドメインが結合してなされ、抗体で効果物質及び細胞との結合に関与する部分を指す。したがって、本発明に関連して言及されるFc片は、一部の文献に記述されたものとは異なる場合もあるが、ヒンジ領域を含み、これは単純に本発明を説明するにおいて便利を図るためのものとして、当業者は本願の明細書及び図面を参考して充分理解することができる。
【００２４】
本願の明細書に使用された用語である「生物学的な活性蛋白質」は、一般的に生理学的または薬物学的な活性を表す蛋白質、ペプチド及びポリペプチドを指し、連鎖体または免疫接合体を形成した後、固有活性のうち少なくとも一部分は維持される。本願において、「生物学的な活性」という用語は、生理学的または薬物学的な活性として限定されるものではない。例えば、酵素を含有したような一部の連鎖体は、有機溶媒として反応を触媒することができる。同様に、コンカナバリンA、免疫グロブリンなどのような蛋白質を含有した一部の高分子結合体は、また実験室の診断剤として有用である。
【００２５】
蛋白質、ペプチド及びポリペプチドとしてはこれらに限定されるものではないが、ヘモグロビン、血清蛋白質(例、因子VII、VIII及びIXを含んだ血液因子)、免疫グロブリン、サイトカイン(例、インターロイキン)、α-、β-及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子(G-CSF及びGM-CSFを含む)、血小板誘導の成長因子(PDGF)及びホスホリパーゼ-活性化の蛋白質(PLAP)が含まれる。他の一般的な生物学的または治療学的な蛋白質としては、インシュリン、植物蛋白質(例、レクチン及びリシン)、腫瘍壊死因子(TNF)及び連関の対立形質体、成長因子(例、TGFαまたはTGFβのような組織成長因子及び内皮成長因子)、ホルモン(例、小嚢-刺激ホルモン、甲状腺-刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン及び副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン分泌ホルモン及びその誘導体)、カルシトニン(calcitonin)、カルシトニン遺伝子関連のペプチド(calcitonin gene related peptide、CGRP)、合成エンケファリン(enkephalin)、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部の分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド(growth hormone releasing peptide、GHRP)、胸腺体液性の因子(thymic humoral factor、THF)などが含まれる。免疫グロブリンとしては、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、及びこれらの断片が含まれる。インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子のような一部の蛋白質は、また普通の組換え技術を利用した結果として非糖化の形態で存在することができる。非糖化の形態もまた本発明の生物学的な活性物質に含まれる。
【００２６】
更に、本発明の生物学的な活性物質は、生体内の生活性(bioactivity)を証明するポリペプチド中、一部分を含む。この例としては、アミノ酸配列、抗体断片、単一鎖の結合抗原(参照：米国特許第4,946,778号)、抗体または断片の融合体を含んだ結合分子、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、触媒性の抗体などが含まれる。その他の蛋白質としては、ブタクサ、抗原E、蜜蜂の毒液、ダニアレルゲンなどのようなアレルゲン蛋白質が含まれる。
【００２７】
更に、本発明の生物学的な活性物質は酵素を含む。酵素の例としては、炭水和物-特異的な酵素、蛋白質分解の酵素、酸化還元の酵素、トランスフェラーゼ剤、ヒドロラーゼ剤、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが含まれる。具体的な酵素としてはこれらに限定されるものではないが、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ及びビリルビンオキシダーゼが挙げられる。炭水化合物-特異的な酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼなどが含まれる。
【００２８】
本願の明細書に使用された用語である「免疫反応に関与する蛋白質」は、細胞性及び体液性の免疫反応で細胞間の信号伝達の過程を担当し、免疫反応を活性化または抑制させる蛋白質を総称する。免疫というのは、細菌またはウイルスなどの自分でないものから自分を保護する過程である。免疫反応は、細胞性及び体液性の免疫反応に分けられるが、T細胞とB細胞などのリンパ球が最も重要な役割を果たす。T細胞は、主に細胞性の免疫反応を主管し、ウイルスに感染された細胞や癌細胞などを直接的に攻撃して殺したり、免疫または炎症反応を活性化させるサイトカインという物質を分泌して他の免疫細胞の作用を助けたりもする。B細胞は、細菌とウイルスなどの自分でない外部の物質(抗原)が体内に入る場合、抗体を作ってこれを追い出しており、これを体液性の免疫反応という。細胞性の免疫と体液性の免疫は全て細胞間の信号伝達が非常に必須な過程であり、この過程で細胞内の信号伝達を担当する細胞表面の受容体蛋白質と、この受容体に結合される信号物質であるリガンド蛋白質が作用する。
【００２９】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質の代表的な例としては、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子(adhesion molecules)、腫瘍壊死因子(TNF)の受容体、酵素、受容体のチロシンキナーゼ、ケモカイン受容体、その他の細胞表面の蛋白質、可溶性リガンドなどが含まれる。サイトカインはこれらに限定されるものではないが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、TNF、TGF、IFN、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO、M-CSFなどを含む。サイトカイン受容体はこれらに限定されるものではないが、成長ホルモンの受容体(GHR)、IL-13R、IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-9R、IL-15R、TNFR、TGFR、IFNR(例、IFN-γRα-鎖、IFN-γRβ-鎖)、インターフェロン-αR、-βR及び-γR、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl、gp130、Fas(Apo1)を含む。酵素はこれらに限定されるものではないが、インフルエンザCヘマグルチニンエステラーゼ、ウロキナーゼなどを含む。ケモカイン受容体の例としては、CCR1、CXCR1-4が挙げられる。受容体のチロシンキナーゼの例としては、TrkA、TrkB、TrkC、Htk、REK7、Rse/Tyro-3、肝細胞の成長因子、血小板-由来の成長因子R、Flt-1が含まれる。他の細胞表面の蛋白質の例としては、CD2、CD4、CD5、CD6、CD22、CD27、CD28、CD30、CD31、CD40、CD44、CD100、CD137、CD150、LAG-3、B7、B61、β-ニューレキシン、CTLA-4、ICOS、ICAM-1、補体R-2(CD21)、IgER、リソソーム膜gp-1、α2-マイクログロブリン受容体-連関の蛋白質、ナトリウム排泄ペプチドRが挙げられる。可溶性リガンドとしてはこれらに限定されるものではないが、IL-10、ヘレグリン、角化細胞の成長因子が含まれる。
【００３０】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質に対するリガンド及び用途は、下記表１乃至７に要約した通り当業者によく知られている。
【００３１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
本願の明細書に使用された用語である「細胞外域の可溶性部位(soluble extracellular domain)」は、リン脂質で構成された細胞膜を貫通する蛋白質(integral protein)において、疎水性のアミノ酸で構成されていて細胞膜を通過する部分(transmembrane domain)を基準に細胞外部に露出されている部分を指す。この部位は、殆ど親水性のアミノ酸が蛋白質の表面に向かう構造(folding)を取っていて水溶液上で可溶性(soluble)を表す。殆どの細胞表面の受容体蛋白質においてリガンドに結合する機能を担当することは細胞外域の部位であり、細胞内域の部位(intracellular domain)は細胞内の信号伝達の機能を担当している。
【００３９】
本願の明細書に使用された用語である「直列連鎖融合された」というのは、二つの生物学的な活性蛋白質の可溶性の部位が連結されて一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４０】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖体の蛋白質」は、直列連鎖融合された蛋白質を指す。例えば、免疫グロブリンFc片のヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位C-末端(C-terminal)に、これと同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位N-末端(N-terminal)がペプチド結合されて同一な二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４１】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された単量体蛋白質」は、免疫グロブリンFc片のヒンジ部位に免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が結合されて一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称/Fc」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質は、TNFR1/Fcと表記される。更に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、TNFR1/IgG1Fcと表記される。
【００４２】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された二量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された二量体蛋白質は、便宜上“[蛋白質の名称/Fc]2”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、[TNFR1/Fc]2と表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、[TNFR1/IgG1Fc]2と表記される。
【００４３】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された単量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質において、ヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位N-末端に、これと同一な一つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位C-末端が直列の連鎖体の形態で結合され、一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称-蛋白質の名称/Fc」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位に、同一なTNFR1の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質は、TNFR1-TNFR1/Fcと表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、TNFR1-TNFR1/IgG1Fcと表記される。
【００４４】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された二量体蛋白質」は、連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された二量体蛋白質は、便宜上“[蛋白質の名称-蛋白質の名称/Fc]2”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンFc片が結合された単純融合された単量体蛋白質TNFR1の細胞外域可溶性の部位に、同一なTNFR1の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、[TNFR1-TNFR1/Fc]2と表記される。同様に、免疫グロブリンFc片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンFc片がIgG1から由来した場合には、[TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2と表記される。
【００４５】
本願の明細書に使用された「ベクタ」という用語は、外来の遺伝子を宿主細胞内に安定的に運搬することができる運搬体としてのDNA分子を言う。有用なベクタになるためには複製が可能であるべきであり、宿主細胞内に流入することができる法案を備えなければならず、自分の存在を検出することができる手段を具備しなければならない。ここで、外来の遺伝子としては、例えば、連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物がそれに該当される。
【００４６】
本願の明細書に使用された「組換え発現プラスミド」という用語は、一般的に外来の遺伝子が宿主細胞で発現されるようにベクタに作動的に連結されて形成された環状のDNA分子を言う。組換え発現ベクタは、一旦宿主細胞内にあれば宿主の染色体DNAに拘わらず複製が可能であり、ベクタの数個のコピー及びそれの挿入された異種DNAを生成することができる。当業界で公知されている通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解毒発現の調節配列に作動的に連結されなければならない。好ましくは、発現調節の配列及び該当遺伝子は、細菌の選択マーカー及び複製開始点(replication origin)を共に含んでいる、一つの発現ベクタ内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクタは 真核発現の宿主内で有用な発現マーカーを更に含まなければならない。
【００４７】
本願の明細書に使用された「作動的に連結された(operably linked)」という用語は、ベクタの各構成成分が固有な作用ができるように形成された成分の配列を意味する。したがって、コーディング配列に作動的に連結された調節配列(control sequence)は、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。調節配列がコーディング配列の発現を指示するように作用する限り、調節配列がコーディング配列と隣接している必要はない。例えば、介在配列(intervening sequence)がプロモーター配列とコーディング配列間に存在することができるが、この場合、プロモーター配列はコーディング配列に「作動的に連結」されたと言える。
【００４８】
本願の明細書に使用される宿主細胞は、原核または真核生物の細胞であってもよい。更に、DNAの導入効率が高く、導入されたDNAの発現効率が高い宿主が通常的に使用される。E.コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、ハスモンヨトウ近似種(SF9)のような昆虫細胞、チャイニズハムスター卵巣細胞(CHO)及びマウス細胞のような動物細胞、COS1、COS7、ヒト胎児腎臓293細胞(human embryonic kidney cells)、BSC 1、BSC 40及びBMT 10のようなアフリカグリーン猿細胞、及び組織培養されたヒト細胞は、使用可能である宿主細胞の例である。本発明の融合蛋白質をコーディングするDNA作製物をクローニングするときには、動物細胞を宿主とすることが好ましい。COS細胞を利用する場合には、COS細胞でSV40ラージTアンチゲン(large T antigen)が発現しているため、SV40の複製開始点を有するプラスミドは細胞中で多数のコピー(copy)のエピソーム(episome)として存在するようになり、通常より高発現を期待することができる。導入されたDNA配列は、宿主細胞と同一な種から得られるか、宿主細胞と異なる種であるか、またはそれはいずれの異種または相同性DNAを含むハイブリッドDNA配列であっても構わない。
【００４９】
本発明による直列連鎖体の形態の融合蛋白質をコーディングするDNA配列を発現させるため、非常に多様な発現宿主/ベクタの組合が利用され得る。真核宿主に適合したベクタには、例えば、SV40、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス(adeno-associated virus)、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節の配列を含む。細菌宿主に使用することができる発現ベクタには、pBluescript、pGEX2T、pUC、pCR1、pBR322、pMB9及びこれらの誘導体のように、E.コリから得ることを例示することができる細菌性のプラスミド、RP4のようにより広い宿主の範囲を有するプラスミド、λgt10とλgt11、NM989のような非常に多様なファージラムダ(phage lambda)誘導体として例示することができるファージDNA、及びM13とフィラメント性単一鎖のDNAファージのようなその他のDNAファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクタは、2μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクタはpVL941である。
【００５０】
本願の明細書に使用された用語である「形質転換」は、DNAを宿主として導入し、DNAが染色体外の因子として、または染色体の統合完成により複製可能になることを意味する。
【００５１】
本願の明細書に使用された用語である「形質感染」は、任意のコーディング配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、発現ベクタが宿主細胞により受容されることを意味する。
本願の明細書に使用された用語である「モーティブ配列」は、発現された蛋白質が細胞膜外に輸送されるように誘導するアミノ酸配列として、リーダ配列とも言う。細胞膜外に輸送される表面の蛋白質あるいは分泌蛋白質は、一般的に細胞膜からモーティブペプチダーゼ(signal peptidase)により切断されるN-末端の配列を有している。この特定のN-末端の配列をモーティブ配列またはペプチド(signal sequence or peptide)、あるいはリーダ配列またはペプチド(leader sequence or peptide)と言う。分泌(輸送)が可能な蛋白質あるいは細胞外膜や周辺の細胞質に存在する全ての蛋白質は、全て自分のみのための特定のモーティブ配列を有している。このようなそれぞれの蛋白質が有しているモーティブ配列間には、特別な相同性(homology)を有しておらず、同じ蛋白質であっても由来した宿主(host)によりそのモーティブ配列が異なることが分かる。モーティブ配列が作用するためには、その1次の構造、すなわちアミノ酸配列からそれらが有している２次の構造あるいは非極性、電荷残基(apolar、charged residue)の分布が更に重要である。このような特徴を有するモーティブ配列間には、特別な相同性はないが、いくつかの共通の特徴はある。モーティブ配列は、まずN-末端の方に一つあるいはいくつかの非常に短い正電荷を帯びた親水性の領域(hydrophilic region)であるNドメインがあり、このドメインに次いで多少長い疎水性の領域であるH-ドメインが繋がっている。大腸菌である場合、モーティブ配列の長さは約18〜30個のアミノ酸で構成されている。N-ドメインは極性を示し(polar)、Lys、Argのような正電荷を帯びたアミノ酸が多く存在する。H-ドメインには、主に疎水性の残基と、Ala、Leuのようなアミノ酸が多く存在し、Pro、Lys、Arg、Asn、Gluのように極性を示したり、電荷を帯びたアミノ酸は稀である。代わりに多量のAla、Leuは、モーティブペプチドα-螺旋構造を成して膜転移がより容易に起きるように助ける。H-ドメインと実際に分泌しようとする蛋白質の間にはC-ドメインが存在する。この領域は、一般的に疎水性が小さく、LebB、LspAのようなモーティブペプチダーゼにより認識が可能な配列がある。今までこのモーティブペプチダーゼが正確にどの部位を切断しているのかは正確に予測できないが、一般的にC-領域にあるAla-X-Ala配列の次の部分を大部分切断している。前記で言及したモーティブ配列を有している前蛋白質(preprotein)は、種々の蛋白質と相互作用をし、細胞膜に到達した後、モーティブペプチダーゼにより特定の部位が切断された後、成熟した形態の蛋白質に変わる。このような特徴を有するモーティブ配列は、細胞表面の発現母体を選択するのにおいて非常に重要な役割を果たす。外来の蛋白質と融合された蛋白質は、安定的に細胞の表面外に非常に高効率で移動しなければならない。一般的に、表面発現の母体を選択するのにおいて、優れた分泌能を有した表面の蛋白質を選択しなければならず、通常的に分泌能に優れた分泌モーティブ配列を有している表面の蛋白質を利用する。
【００５２】
〔本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
本発明による連鎖融合された二量体蛋白質は、一般的に、(a) 免疫グロブリンFc片をコーディングする遺伝子と、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子から単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造し、(b) 製造された単純融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応により挿入し、(c) 前記制限酵素の認識配列と一致する制限酵素を使用し、前記単純融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子の制限酵素の認識配列の部位を切断し、(d) 両方のDNA配列の切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製造し(図２)、(e) 製造された連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物をベクタに作動的に連結して組換え発現プラスミドを作製し、(f) 作製された組換え発現プラスミドで宿主細胞を形質転換または形質感染させ、(g) 形成された形質転換体または形質感染体を連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングDNA作製物が発現されるのに適切した条件下で培養し、培養物から目的する連鎖融合された二量体蛋白質を分離精製することにより製造される。
【００５３】
免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片は、特定の制限酵素の認識配列とリーダ配列のコーディング配列を有する一つのプライマーと、前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列と免疫グロブリンFcの特定の部位5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応により生成する。
【００５４】
免疫グロブリンFcの特定の部位をコーディングするDNA断片は、前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部配列を含み、前記免疫グロブリンFcの特定の部位5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマーと、特定の制限酵素の認識配列と免疫グロブリンFcの特定の部位3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応を利用して生成する。
【００５５】
このように生成された前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と、免疫グロブリンFcの特定の部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合し、DNA鎖を分離した後、共通の配列間で相補的な結合が起きるように誘導する。以後、重合酵素を利用して各DNA鎖の3'末端から重合反応を起こし、完全な二鎖のDNA断片を生成する。これを鋳型とし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする配列を有するプライマーと、前記免疫グロブリンFcの特定の部位3'末端をコーディングするプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位のDNA断片と前記免疫グロブリンFcの特定の部位DNA断片の配列を含む免疫グロブリンの融合遺伝子を増幅させる。
【００５６】
このように生成された免疫グロブリンの融合遺伝子と前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位の配列を有するDNA断片に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、制限酵素を使用して前記制限酵素の認識配列の部位を切断し、切断された部分をリガーゼで連結して連鎖体の形態の免疫グロブリンの融合遺伝子を製造する。
【００５７】
このような免疫グロブリンの融合遺伝子は、蛋白質の細胞外の分泌を促進するため、蛋白質にモーティブ配列が含まれるように製作することができる。例えば、CTLA-4分子は非正常的に長く、水溶性の高いN-末端に親水性の高い余裕分(redundancy)を有する非常に特異なリーダ配列を有している(Harper K, et al., J Immunol 147: 1037-1044, 1991; and Brunet JF, Nature 328: 267-270, 1987)。通常的に殆どの膜表面の蛋白質や分泌型の蛋白質は、そのN-末端に疎水性が高い20〜24個のアミノ酸で構成されるリーダ配列を有する。しかし、本CTLA-4分子は、16個の親水性が高いN-末端の16個のアミノ酸と、疎水性が高い典型的な膜領域に該当する2１個のアミノ酸など、総37個のアミノ酸で構成されている。したがって、従来にはCTLA4Ig融合蛋白質を製造するとき、分子のリーダ配列をオンコスタチンM(Linsley PS et al., J Exp Med 174: 561-569, 1991)あるいはIL-6(Yamada A, et al., Microbiol Immunol 40: 513-518, 1996)のリーダ配列で全て交替して発現していた。本発明者らに至って、CTLA4の場合、ACLGFQRHKAQKNLAAの16個のアミノ酸が除外された「MRTWPCTLLFFIPVFCKA」配列をリーダ配列に利用することが好ましく、この場合が発現細胞外に分泌が最も容易になされるということが確認された(国際特許出願公開第WO98/31820号)。
【００５８】
前記製造された免疫グロブリン融合遺伝子をベクタに挿入して組換え発現プラスミドを製造した後、このプラスミドを宿主細胞に導入して形質感染体または形質転換体を製造し、これらの細胞を増幅培養して生成された連鎖体の形態の融合蛋白質を精製することにより、目的する連鎖融合された二量体蛋白質を得ることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造のため使用される宿主細胞は、骨髄腫細胞株、CHO細胞、猿COS細胞、ヒト胎児腎臓293細胞及びバキュロウイルス-感染の昆虫細胞である。これらのシステムで形成された目的のポリペプチドは、集合して細胞の培養培地に分泌される。その後、本発明の連鎖融合された二量体蛋白質は免疫グロブリンと相当な部分で同一な方式によりプロテインAまたはプロテインGの親和性クロマトグラフィーにより実質的に精製することができる。事実に、効率的な哺乳動物の細胞発現及びこのような類型の精製は、免疫反応に関与する蛋白質を二量体蛋白質として発現するのに相当な利点になる。
【００６０】
〔本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
宿主細胞として真核細胞により生成される分泌蛋白質は、糖鎖の修飾により変形される。糖鎖の修飾は、蛋白質の物理的な性質はもちろん、蛋白質の生体内における安定性及び機能にも影響を及ぼすことと知られている。したがって、本発明の一つの好ましい様態は、宿主細胞として前記の動物細胞株を利用した遺伝子の組換え技術を利用して目的する連鎖融合された二量体蛋白質の生産を容易にし、更に体内の安定性を増加させるため免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位に付加的な糖鎖を添加することを含む。
【００６１】
糖鎖の修飾には二つの類型がある。一つは、O-型糖鎖修飾としてアミノ酸セリンやスレオニンの残基にオリゴ糖が結合することであり、もう一つは、N-型糖鎖修飾としてアスパラギンの残基にオリゴ糖が結合する形態である。特に、N-型糖鎖修飾は、特定のアミノ酸の配列を有するとき起こり、その配列はAsn-X-Ser/Thrと知られている(ここで、Xはプロリンを除いたいずれのアミノ酸でもよい)。N-連結のオリゴ糖とO-連結のオリゴ糖の構造は互いに異なり、一般的に各タイプから発見される糖残基もまた相異する。例えば、O-連結の糖残基では、N-アセチルガラクトサミンが変わりなくセリンやスレオニンに連結されている。全てのN-連結のオリゴ糖では、N-アセチルグルコサミンがアスパラギンに連結されている。O-連結のオリゴ糖は、一般的に1〜4個の糖残基のみを含んでいる反面、N-連結のオリゴ糖はN-アセチルグルコサミンとマンノースを常に含み、少なくとも5個以上の糖残基からなっている。
【００６２】
本発明は、付加的な糖鎖の結合部位を有するように免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA配列上に、前記のO-型またはN-型の糖鎖修飾が発生するように一つ以上のヌクレオチドを変異させ、そのDNAを動物の宿主細胞を通じて発現しながら自然的に糖鎖修飾が起きるようにすることである。一つの様態として、本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質は、N-型の糖鎖修飾を起きることができるAsn-X-Ser/Thr配列が付加及び/または増加するように、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA配列を変異させることにより達成される。
【００６３】
糖化のためのDNA配列の変異は、通常的な方法により実施することができる。一つの好ましい様態として、連鎖体の結合部位、すなわち二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が細胞内の蛋白分解酵素の攻撃から保護されるようにし、血中における半減期を増加させる効果を得るため、互いに結合される部位に重合酵素の連鎖反応を利用して多糖化(multiglycosylation)で修飾される連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を製作することができる。特定的な様態として、糖化モーティブペプチド配列は、制限酵素EcoRIと細胞外域可溶性の部位のリーダ配列を含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したDNA断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと免疫グロブリンG1のFc部位の3'末端と制限酵素XbaIをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応で製作されたDNA断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【００６４】
本発明の具体的な様態は、免疫反応に関与する蛋白質であるTNFR1、TNFR2、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位を含む。これらの様態に関する添付の図面、配列目録及び実施例を参考とし、本発明を具体化する。
【００６５】
腫瘍壊死因子-α[TNF-α、カケクチン(cachectin)としても知られている。]と腫瘍壊死因子-β[TNF-β、リンホトキシン(lymphotoxin)としても知られている。]は、多面的なサイトカインとして炎症、細胞免疫反応、敗血症、細胞毒性、悪液質、リューマチ性関節炎、炎症関連疾患[タルタグリア(Tartaglia LA)らの文献(Immunol. Today 13: 151, 1992)]と抗ウイルス性反応[ブトラー(Butler P)の文献(Peptide Growth FactorII, 1990, Springer-Verlag, Berlin, pp.39-70)]を誘発する。細胞毒性を含んだ殆どのTNF-αとTNF-βの作用は、これらのそれぞれが三重体の形態でTNF受容体に結合することに起因する[エック(Eck MJ)らの文献(J. Biol. Chem. 267: 2119, 1992)]。TNF受容体には、分子量55キロダルトン(KDa)のタイプI(TNFR1、p55)と分子量約75キロダルトン(KDa)のタイプII(TNFR2、p75)の２種類が存在する[スミス(Smith CA)らの文献(Science 248: 1019，1990)、ロウチャー(Loetscher H)らの文献(Cell 61: 351, 1990)、シャル(Schall)らの文献(Cell 61: 361, 1990)]。この二つの受容体は、全てTNF-αとTNF-βに対して殆ど類似する親和力を表すと報告されている(シャルらの前記文献)。これらの可溶性受容体の免疫グロブリンとの融合蛋白質は、TNF-αとTNF-βを結合することにより細胞膜に存在する受容体との結合を妨害し、その作用を抑制する効果を示し、TNF-依存性の炎症を緩和させることができる効果的な物質として使用されている。
【００６６】
免疫反応を調節する細胞表面の抗原中にTリンパ球の充分の活性反応を得るための２次刺激を提供する空調刺激系の抗原であるCD2及びCTLA4の場合も、腫瘍壊死因子の受容体と同様な方法で可溶性の形態の場合、各種の免疫疾患を治療することができる治療剤として使用され得る。体内の免疫反応は、Tリンパ球の特定の受容体と結合する抗原提示細胞の表面抗原の分子、すなわち、Tリンパ球と抗原提示細胞の白血球の抗原分子により構成され、抗原提示過程中に２次信号である空調信号がなければ、Tリンパ球は細胞死滅またはクローン活性の無力化の誘導により消滅される。CD2の場合は、抗原提示細胞のLFA-3と結合するTリンパ球の白血球の抗原として白血球の細胞付着及び同調刺激に関与し、CD28による同調刺激に並行してTリンパ球の活性化を促進する。CTLA4の場合は、T-リンパ球が活性化した後に発現され、休息期になれば発現量が増加する様相を表す。CTLA4は抗原提示細胞のB7との結合力がCD28の20倍以上であり、B7と結合した後、T-リンパ球の活性を抑制する信号を伝達する。
【００６７】
一つの部類の特定の様態として、本発明は、配列番号6の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fc、配列番号8の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/Fc、配列番号18の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fc及び配列番号20の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/Fcを提供する。
【００６８】
他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物(TNFR1-TNFR1-IgG)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物(TNFR2-TNFR2-IgG)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物(CD2-CD2-IgG)及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物(CTLA4-CTLA4-IgG)を提供する。
【００６９】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR11Ig-CHO)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR22Ig-CHO)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞を提供する。前記組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR11Ig-CHO及び前記組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR22Ig-CHOは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00047が付与された。
【００７０】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号5の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR11Ig-CHO)、配列番号7の直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞(例、TR22Ig-CHO)、配列番号17の直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号19の直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Igで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞を提供する。前記組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR11Ig-CHO及び前記組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株TR22Ig-CHOは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00049が付与された。
【００７１】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号10の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/Fc、配列番号12の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/Fc、配列番号22の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/Fc及び配列番号24の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/Fcを提供する。
【００７２】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物を提供する。糖化モーティブペプチドを生成することができるようにするため、TNFR/Fc、CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体の形態の融合遺伝子の細胞外域可溶性の部位の結合部位をコーディングする塩基配列に該当する両方向のプライマーを製作した。このプライマーは、連鎖体の形態の融合遺伝子の任意のアミノ酸をコーディングする塩基配列がアスパラギン(asparagin、N)をコーディングする塩基配列(AAT、AAC)で置換され得る塩基配列と、セリン(serine、S)あるいはスレオニン(threonine、T)をコーディングする塩基配列(セリン:TCC、スレオニン:ACC、ACG、ACA)で置換され得る塩基配列を有するようにした。プライマーの製作時、複数のアミノ酸のコード配列中から一つの配列を選択することは、重合酵素の連鎖反応の効率を最大化するため塩基配列が最小に置換され得る条件及びプライマー結合温度(melting temperature、Tm)を考慮して決定された。
【００７３】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-MG、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-MG、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Ig-MG及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGを提供する。これらの組換え発現プラスミドは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるKCCMに寄託し、それぞれ受託番号KCCM 10404、KCCM 10407、KCCM 10401及びKCCM 10399が付与された。
【００７４】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号9の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR11Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号11の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpTR22Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号21の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCD22Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号23の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/FcをコーディングするDNA作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞を提供する。
【００７５】
本発明により製造された形質転換体または形質感染体を培養し、培養物から分離された本発明の直列連鎖融合された二量体蛋白質は、前記表１に記載した通り免疫グロブリンに結合された連鎖体の形態の免疫反応に関与し、蛋白質の種類によって治療剤、診断剤及び研究用のツールとして多様に、かつ有用に使用することができ、これらの用法は当業者によく知られている。特に治療剤として使用する場合には、通常的に知られている有効量を適用することができるが、特定の患者に対する特定の有効量は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物の配合及び予防または治療される特定の疾患の重症を含んだ、種々の要因により変わるということは理解できるだろう。更に、当業者は、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質が治療剤として使用される場合、これらの投与方式及び経路も免疫反応に関与する蛋白質の通常的な投与方式及び経路が適用できるということを理解しているだろう。
【００７６】
本発明は、下記の実施例により、更に具体的に説明されるだろう。しかし、これらの実施例は単純に本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業者において自明であろう。説明の便宜のため、本発明に関連し、下記の実施例により製造されたDNA作製物、組換え発現プラスミド、形質転換の細胞株、使用されたプライマーに関する配列目録及び寄託情報を下記表８及び９に要約する。
【００７７】
【表８】
【表９】
〔実施例１〕
人体TNFR
A．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図１及び図５)
a．TNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片
人体TNFの受容体タイプI(TNFR1、p55)の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンG1のFc部位が連結された融合遺伝子を製造するため、文献[ホルトンらのBiotechniques 8: 528, 1990]に記述されている方法と同様な方法で重合酵素の連鎖反応の方法(PCR)を行った。
【００８０】
制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列(配列番号2のペプチド1-20)のコーディング配列を有する一つのプライマー(配列番号25のヌクレオチド)と、前記細胞外域可溶性の部位(TNFR1-ED)3'末端の配列と免疫グロブリンG1(IgG1)のヒンジ部位(hinge region:H)の5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列(配列番号26のヌクレオチド)を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりTNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片を生成した。この反応のための鋳型cDNAは、健康な成人の単核球細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８１】
健康な成人の血液を採取し、RPMI-1640(Gibco BRL, USA)培地と1:1で希釈し、これをFicoll-hypaque(Amersham, USA)を使用して密度勾配の遠心分離(density-gradient centrifugation)して上部に形成されたTリンパ球の細胞層を得た。そして、RPMI-1640培地で3回洗浄し、ここに10％牛胎児血清(FBS, GibcoBRL, 5USA)含有RPMI-1640培地を加えてTリンパ球の細胞を5×105個/mlとし、leukoagglutinin(Pharmacia, USA)を3.5μｇ/mlになるように添加した後、5％CO2の培養基で、37℃、2日間培養した。
【００８２】
mRNAは、Tri-Reagent(MRC, USA)mRNAの分離キットを利用して純粋分離した。まず、ヒトTリンパ球の2×107個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水溶液(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.2)で3回洗浄した後、1 mlのTri-Reagentで数回混合してRNAを溶解させた。このチューブに0.2 mlのクロロホルム(chloroform)を添加して激しく揺らした後、室温で15分間放置した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を1.5 mlのチューブに移し、0.5 mlのイソプロパノール(isopropanol)を添加した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を捨てた後、沈殿物に、75％エタノール(Ethanol)-25％DEPC(Sigma, USA)を処理した3次の蒸留水を1 ml添加し、2〜3回混合した後、4℃で15,000rpmで15分間遠心分離した。上層液を完全に除去し、空気中から乾燥させて残りのエタノールを除去した後、RNAをDEPCを処理した3次の蒸留水50μlに溶解した。
【００８３】
cDNAの合成は、1.5 mlのチューブに精製された2μｇのmRNAと1μlのオリゴdT [oligo dT(dT30, Promega, USA)]プライマーを10μMの濃度で混合し、70℃で2分間加熱した後、氷に入れて2分間冷やした。この混合物に200UのM-MLVの逆転写酵素[reverse transcriptase(Promega, USA)]、10μlの5X反応緩衝溶液(reaction buffer)[250mMのTris-HCl(Tris-HCl), pH 8.3, 375mMの塩化カリウム(KCl), 15 mMの塩化マグネシウム(MgCl2), 50mMのDTT]、1μlのdNTP(それぞれ10mMの濃度, Takara, Japan)を入れてDEPCを処理した3次の蒸留水で50μlになるように添加した後、42℃で１時間反応させて1次のcDNAを合成した。
【００８４】
b．免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片
TNFRの細胞外域可溶性の部位3'末端の一部配列を含み、IgG1のヒンジ部位の5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー(配列番号27のヌクレオチド)と、XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用し、重合酵素の連鎖反応により免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を生成させた。この反応のための鋳型cDNAは、回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液の細胞(Bリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８５】
c．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物
前記生成されたTNFR1の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列(TNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端とIgG1のヒンジ部位の5'末端を含む配列)間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、TNFR1の5'末端をコーディングする配列を有するプライマー(配列番号25のヌクレオチド)とIgG1のFcの3'末端をコーディングするプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記TNFR1の細胞外域可溶性の部位のDNA断片とIgG1のFc部位のDNA断片の配列を含む目的するTNFR1/FcコーディングDNA作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００８６】
d．単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescript KSII(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号1)。このとき、生成された融合蛋白質は単純融合された単量体蛋白質としてTNFR1/Fcと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質TNFR1/Fcの推定アミノ酸配列は配列番号2に該当される。
【００８７】
B．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図１及び図５)
a．TNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片
人体TNFの受容体タイプII(TNFR2, p75)の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンG1のFc部位が連結された融合遺伝子を、前記TNFR1の製造過程と同様な 手続により製造した。
【００８８】
制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列(配列番号4のペプチド1-22)のコーディング配列を有する一つのプライマー(配列番号29のヌクレオチド)と、前記細胞外域可溶性の部位(TNFR2-ED)3'末端の配列と免疫グロブリンG1(IgG1)のヒンジ部位(hinge region:H)の5'末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列(配列番号30のヌクレオチド)を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりTNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片を生成した。この反応のための鋳型cDNAは、TNFR1と同様に健康な成人の単核球の細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８９】
b．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物
前記生成されたTNFR2の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と前記TNFR1に記述されているように製造された免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列(TNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端とIgG1のヒンジ部位の5'末端を含む配列)間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、TNFR2の5'末端をコーディングする配列を有するプライマー(配列番号29のヌクレオチド)とIgG1のFcの3'末端をコーディングするプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記TNFR2の細胞外域可溶性の部位のDNA断片とIgG1のFc部位のDNA断片の配列を含む、目的するTNFR2/FcコーディングDNA作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００９０】
c．単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescriptKSII(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号3)。このとき、生成された融合蛋白質は、単純融合された単量体蛋白質としてTNFR2/Fcと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質TNFR2/Fcの推定アミノ酸の配列は配列番号4に該当される。
【００９１】
C．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図２及び図５)
TNFR1の細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子、すなわち連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物を作るため、TNFR1の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物に、同一な制限酵素(BamHI)の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、BamHIで切断された部分をリガーゼ(ligase)で連結した。この反応は、前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物(配列番号1のヌクレオチド)を鋳型として使用した。
【００９２】
配列番号25のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号33のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、3'末端にBamHI認識配列を有するTNFR1の細胞外域可溶性の部位の断片を増幅し、更に配列番号28のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号32のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、5'末端にBamHIの認識配列を有する他の単純融合された単量体蛋白質TNFR1/Fcをコーディングする断片をそれぞれ増幅した。重合酵素の連鎖反応は、1μlの１次のcDNA、2UのPfu DNAの重合酵素[polymerase(Stratagene, USA)]、10μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer)[200mMトリス-HCl, pH 8.75, 100mMの硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4], 100mMの塩化カリウム(KCl), 20mMの塩化マグネシウム(MgCl2)]、1％のTriton(登録商標)X-100、1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)、3μlのプライマー1(10μM)、3μlのプライマー2(10μM)、2μlのdNTP(それぞれ10mM)を入れて3次の蒸留水で100μlになるように添加した後、実施した。反応条件は、94℃で5分間処理した後、95℃で1分、58℃で1分30秒、72℃で1分30秒ずつ31回反応させ、72℃で15分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端(blunt end)になるようにした。
【００９３】
重合酵素の連鎖反応産物を0.8％アガロースゲル(agarose gel)に電気泳動した後、Qiaex II gel extraction kit(Qiagen, USA)を利用して純粋分離した。純粋分離された重合酵素の連鎖反応産物を制限酵素BamHIで処理した後、フェノール/クロロホルムの抽出方法で純粋分離した。次いで、BamHIで処理した２つの種類のDNA断片をリガーゼを利用して結合させた。
【００９４】
D．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物の製造(図２及び図５)
TNFR2の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物に、同一な制限酵素(BamHI)の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、BamHIで切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物を製造した。
3'末端にBamHIの認識配列を有するTNFR2の細胞外域可溶性の部位の断片は、配列番号34のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号35のヌクレオチドに該当するプライマーを使用して増幅した。重合酵素の連鎖反応は、TNFR1の場合と同様に実施した。但し、配列番号3の前記製造された単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を鋳型として使用した。重合酵素の連鎖反応産物はTNFR1の場合と同様に分離した。
【００９５】
E．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/FcをコーディングするDNA作製物
TNFR1の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位(配列番号6 197-216のペプチド)を除き、一番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号5 565-591のヌクレオチド)と２番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号5 649-681のヌクレオチド)を含んだアンチセンスプライマー(配列番号37のヌクレオチド)と制限酵素EcoRIを有し、リーダ配列を含んだプライマー(配列番号25のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してDNA断片を製作した。
【００９６】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号5の565-567(CTG、Leu)、574-576(ACG、Thr)、652-654(CTA、Leu)及び670-672(AGA、Arg)に該当するヌクレオチドをAAC(Asn、N)に、配列番号5の571-573(TGC、Cys)及び580-582(TTG、Leu)に該当するヌクレオチドをACC(Thr、T)に、配列番号5の658-660(GAC、Asp)をTCC(Ser、S)に代置した塩基配列を含むように製作(配列番号36及び37のヌクレオチド)し、総４個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号10 189-191、192-194、198-200、204-206のペプチド)を挿入した。
【００９７】
この反応において、連鎖体の形態のTNFR1-TNFR1/Fc遺伝子(配列番号5のヌクレオチド)を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のTNFR1-TNFR1/Fc遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のDNAを成すようにし、リーダ配列を含んだTNFR1の細胞外域の部位3'末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする5'末端の塩基配列が結合された状態のDNA断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の5'末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、以下に説明する２番目のDNA断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【００９８】
２番目のDNA断片は、一番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号5 565-591のヌクレオチド)と２番目のTNFR1の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号5 649-681のヌクレオチド)を含んだ一つのプライマー(配列番号36のヌクレオチド)と、制限酵素XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のDNA断片と同様にTNFR1の細胞外域の部位5'末端に一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【００９９】
次いで、前記の二種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるDNA断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各5'及び3'末端に該当するプライマー(配列番号25と28)を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより２つのDNA断片を結合させ、これをmgTNFR1-TNFR1-IgGと名づけた。
【０１００】
F．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質TNFR2-TNFR2/FcをコーディングするDNA作製物
TNFR2の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位(配列番号8 203-263のペプチド)を除き、一番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号7 586-606のヌクレオチド)と２番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号7 790-807のヌクレオチド)を含んだアンチセンスプライマー(配列番号39のヌクレオチド)と制限酵素EcoRIを有し、リーダシーケンスを含んだプライマー(配列番号29のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してDNA断片を製作した。
【０１０１】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号7の595-597(GTC、Val)及び799-801(GGG、Gly)に該当するヌクレオチドをAAC(Asn、N)に代置した塩基配列を含むように製作(配列番号38及び39のヌクレオチド)したプライマーを利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号12 199-201、206-208のペプチド)を挿入した。
【０１０２】
この反応において、連鎖体の形態のTNFR2-TNFR2/Fc遺伝子(配列番号7のヌクレオチド)を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のTNFR2-TNFR2/Fc遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のDNAを成すようにし、リーダシーケンスを含んだTNFR2の細胞外域の部位3'末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする5'末端の塩基配列が結合された状態のDNA断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の5'末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、下記に説明する２番目のDNA断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【０１０３】
２番目のDNA断片は、一番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部(配列番号7 586-606のヌクレオチド)と２番目のTNFR2の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部(配列番号7 790-807のヌクレオチド)を含んだ一つのプライマー(配列番号38のヌクレオチド)と、制限酵素XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28のヌクレオチド)を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のDNA断片と同様にTNFR2の細胞外域の部位5'末端に一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【０１０４】
次いで、前記の２種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるDNA断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各5'及び3'末端に該当するプライマー(配列番号29と28)を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより二つのDNA断片を結合させ、これをmgTNFR2-TNFR2-IgGと名づけた。
【０１０５】
G．連鎖融合された単量体蛋白質TNFR-TNFR/Fc及びこの糖化蛋白質をコーディングするDNA作製物のクローニング
前記製造された連鎖融合された単量体蛋白質TNFR-TNFR/Fc及びこの糖化蛋白質をコーディングするDNA作製物をpBluescript KSII(+)(Stratagene, USA)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてTNFR1-TNFR1/FcとTNFR2-TNFR2/Fc、この糖化蛋白質としてmgTNFR1-TNFR1/FcとmgTNFR2-TNFR2/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号6、8、10及び12に該当される。
【０１０６】
ベクタとして使用する10μlのpBluescript KSII(+)（Stratagene, USA）を15UのEcoRIと15UのXbaI、5μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer)[100mMのトリス-HCl、pH 7.5、100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)、10mMのDTT、500nMの塩化ナトリウム(NaCl)]、5μlの0.1％牛血清アルブミン[BSA(Takara, Japan)]を混合した 後、3次の蒸留水で50μlになるように添加した後、37℃で2時間反応させてDNAを消化させた。反応物を0.8％アガロースゲルに電気泳動した後、QiaexIIgel extraction kit(Qiagen, USA)で純粋分離した。
【０１０７】
EcoRIとXbaIで消化されたpBluescript KS II(+)(Stratagene, USA)100ngと制限酵素で消化させた20ngの重合酵素の連鎖反応産物を混合し、0.5UのT4 DNAリガーゼ[ligase(Amersham, USA)]、1μlの10X反応緩衝溶液(reactionbuffer)[300mMのトリス-HCl(Tris-HCl)、pH7.8、100mMの塩化マグネシウム(MgCl2)、100mMのDTT、10mMのATP]を入れた後、3次の蒸留水で10μlになるように添加した後、16℃の水槽(water bath)で16時間反応させた。大腸菌[E.coli Top10(Novex, USA)]をリビジウムクロリド(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)法でコンピテント細胞 (competent cell)を作った後、形質転換させてアンピシリン(ampicillin, Sigma, USA)を50μl/ml含有したLB固体培地に塗抹し、37℃で16時間培養した。生成されたコロニーをアンピシリンが50μl/ml含有されたLB液体の培地4 mlに接種した後、37℃で16時間振とう培養した。この中、1.5 mlをSambrook J.らの文献(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1. 25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)に記述されたアルカリ分解(alkaline lysis)法でプラスミドを少量抽出した後、EcoRIとXbaIで消化させてクローニングの有無を確認した。
【０１０８】
全体のコーディング領域の配列はダイデオキシチェーンターミネーション[Dideoxy chain termination(Sanger Fらの文献, PNAS USA, 74: 5483, 1977)法を利用した以下のようなDNA配列化の方法により確認した。前記のアルカリ分解法で抽出したプラスミドとSequenase(登録商標 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA)及び35S dATP（Amersham, USA）を使用して製品の使用法に準する方法でDNA配列化の反応を進行させた。6％ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)に前記の試料をローディング(loading)し、電圧を1800〜2000Vの間に維持し、ゲルの温度を50℃に維持しながら2時間電気泳動を行った後、乾燥させてからＸ線フィルム(Kodak, USA)に２日間露出させた後、DNA塩基配列を判読した。
【０１０９】
〔実施例２及び３〕
CD2及びCTLA4
CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片は、制限酵素EcoRIの認識配列とリーダ配列[CD2(配列番号14のペプチド1-24)、CTLA4(配列番号16のペプチド1-21)]のコーディング配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド))を有する一つのプライマー[CD2(配列番号40のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号43のヌクレオチド)]と、制限酵素PstIの認識配列と前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列をコーディングするアンチセンス配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する他のプライマー[CD2(配列番号41)、CTLA4(配列番号44)]を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型cDNAは健康な成人の単核球の細胞(Tリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１０】
更に、免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片は、制限酵素PstIの認識配列とIgG1の上鎖部位の5'末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー(配列番号42のヌクレオチド)と、XbaIの認識配列とIgG1のFcの3'末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー(配列番号28)を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型cDNAは回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液細胞(Bリンパ球)から抽出したmRNAを逆転写-重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１１】
次いで、前記生成されたCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位をコーディングするDNA断片と免疫グロブリンG1のFc部位をコーディングするDNA断片を制限酵素PstIで消化させ、T4 DNA リガーゼを利用して結合させることにより単純二量体の形態のCD2/Fc及びCTLA4/Fc遺伝子を製作した。製造された遺伝子は、発現後蛋白質の分泌を容易にするためのリーダ配列を含む。
【０１１２】
前記生成された融合遺伝子の断片を制限酵素EcoRIとXbaIで消化させ、市販のクローニングベクタ(stratagene社の製品)のpBluescript KS II(+)のEcoRI/XbaI部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をDNA配列化により確認した(配列番号13及び15)。このとき、生成された融合蛋白質をそれぞれCD2/Fc、CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号14及び16に該当される。
【０１１３】
重合酵素の連鎖反応は、1μlの1次のcDNA、2UのPfu DNA重合酵素[polymerase(Stratagene, USA)]、10μlの10X反応緩衝溶液(reaction buffer) [200mMのトリス-HCL、pH 8.75、100mMの硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]、100mMの塩化カリウム(KCl)、20mMの塩化マグネシウム(MgCl2)]、1％のTriton(登録商標)X-100、1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)、3μlのプライマー1(10uM)、3μl のプライマー2(10uM)、2μlのdNTP(それぞれ10mM)を入れて3次の蒸留水で100μlになるように添加した後実施した。反応条件は、94℃で5分間処理した後、95℃で1分、58℃で1分30秒、72℃で1分30秒ずつ31回反応させ、72℃で15分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端になるようにした。
【０１１４】
連鎖体の形態のCD2-CD2/Fc及びCTLA4-CTLA4/Fcの融合遺伝子は、以下のように製造した。
【０１１５】
CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子を作るため、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位の配列を、前述した制限酵素PstIとT4 DNA ポリメラーゼを利用して平滑末端を有するようにした単純二量体の形態の融合遺伝子において、細胞の外域と免疫グロブリンの結合部位にリガーゼを利用して平滑末端接合(blunt end ligation)させることにより挿入した。具体的に、CD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位のリーダ配列が終了される部位[CD2(配列番号14のペプチド25)、CTLA4(配列番号16のペプチド22)]をコーディングするコーディング配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する一つのプライマー[CD2(配列番号45のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号47のヌクレオチド)]と、前記細胞外域可溶性の部位3'末端の配列をコーディングするアンチセンス配列[CD2(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4(配列番号15のヌクレオチド)]を有する他のプライマー[CD2(配列番号46)、CTLA4(配列番号48)]を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応は、前記の単純二量体の融合遺伝子[CD2/Fc(配列番号13のヌクレオチド)、CTLA4/Fc(配列番号15のヌクレオチド)]を鋳型として使用した。
【０１１６】
更に、pBluescript KSII(+)に挿入された単純二量体の形態のCD2/Fc及びCTLA4/Fcを制限酵素PstIで消化させ、3'末端が突出された形態(3'overhang)の切断面を生成するようにした。切断面の3'突出の末端をT4 DNA ポリメラーゼで処理し、部分的に除去(partial deletion)させて平滑末端になるようにした。細胞外域可溶性の部位が連鎖体(concatamer)の形態を有する融合遺伝子を作るため、前記の重合酵素の連鎖反応により製作したCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位を平滑末端として製作された単純二量体の遺伝子の切断面に、リガーゼを利用して平滑末端接合(blunt end ligation)させることにより挿入し、クローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれCD2-CD2/FcとCTLA4-CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号18及び20に該当される。
【０１１７】
多糖化(multiglycosylation)の形態の連鎖体融合遺伝子は以下のように製作した。
【０１１８】
糖化モーティブペプチドの配列は、制限酵素EcoRIと細胞外域可溶性の部位のリーダシーケンスを含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したDNA断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位3'末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位5'末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと、免疫グロブリンG1のFc部位の3'末端と制限酵素XbaIをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応により製作されたDNA断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【０１１９】
CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体の融合遺伝子の場合も、前記のTNFR/Fcの方法と同様な方法で変形されたプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を利用して糖化モーティブペプチドを挿入させ、TNFR/Fcの場合とは異なりCD2及びCTLA4の細胞外域可溶性の部位が結合されるペプチド配列はそのまま維持した。
【０１２０】
CD2/Fc及びCTLA4/Fcの連鎖体融合蛋白質の多糖化の過程は、CD2/Fcの場合、配列番号17の598-600(CCT、Pro)及び616-618(GAG、Glu)に該当するヌクレオチドをAAT(Asn、N)に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー(配列番号49及び50のヌクレオチド)を利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号200-202、206-208のペプチド)を挿入して完成し、CTLA4/Fcの場合は、配列番号19の403-405(GTA、Val)、424-426(CCA、Pro)に該当するヌクレオチドをAAT(Asn、N)に、配列番号19の409-411(GAT、Asp)、445-407(GTG、Val)に該当するヌクレオチドをそれぞれACA(Thr、T)及びACG(Thr、T)に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー(配列番号51及び52のヌクレオチド)を利用し、総３個の糖化モーティブペプチド部位(配列番号24 136-138、142-144、147-149のペプチド)を挿入して完成した。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれmgCD2-CD2/Fc及びmgCTLA4-CTLA4/Fcと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号22及び24に該当される。
【０１２１】
〔実施例４〕
単純/連鎖融合された二量体のTNFR/Fc融合蛋白質の発現及び精製
チャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ1(CHO-K1、ATCC CCL-61、Ovary、Chinese hamster、Cricetulus griseus)で融合蛋白質を発現させるため、TNFR/Fc融合遺伝子を含んだpBluescript KSIIプラスミドDNAを形質転換された大腸菌から抽出した後、制限酵素EcoRIとXbaIで消化させて得たTNFR/Fcの断片を、動物細胞の発現ベクタであるpCRTM3(Invitrogen, USA)プラスミドEcoRI/XbaI部位に挿入し、発現ベクタを製造した後、これをそれぞれのプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'と名づけ、2001年7月10日付で韓国微生物保存センター(KCCM)にそれぞれKCCM 10288及びKCCM 10291の受託番号で寄託した。
【０１２２】
形質感染は、前記TNFR/Fc融合遺伝子を含んだプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'DNAのいずれか一つをGibco BRL(USA)社の LipofectamineTM試薬と混合することにより行った。1〜3×105cells/wellの濃度のチャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ1(CHO-K1)細胞を6穴の組織培養板(six-well tissue culture plate, Nunc, USA)に接種し、10％牛胎児血清(FBS)を含有したDMEM培地で細胞が50〜80％になるように培養した後、血清のないDMEM培地から前記TNFR/Fc融合遺伝子を含んだプラスミドpTR11-Top10'及びプラスミドpTR22-Top10'DNAのいずれか一つを1〜2μl取り、LipofectamineTM(Gibco BRL, USA)を2〜25μl取って常温で15〜45分間反応させたDNA-リポソーム混合体(Liposome complex)を細胞培養板に添加させた。5時間培養した後、血清が20％含有されたDMEM培地を添加し、18〜24時間培養した。最初の形質感染後に細胞を1.5mg/mlのGeneticin(G418, GibcoBRL, USA)が添加された10％牛胎児血清DMEM培地で3週間培養し、形成された集落を分離して増幅培養した。融合遺伝子の発現可否はペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を使用した酵素免疫の検査法(ELISA)を通じて検査した。
【０１２３】
酵素免疫の検査法(ELISA)は、以下のような方法で行った。まず、1mg/mlのヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を0.1Mの中炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)に1:2000で希釈した後、96穴の酵素免疫の検査板(96-well flexible plate, Falcon, USA)に100μlずつ分注し、ラップで包んだ後、4℃で16時間以上放置して抗体が検査板の表面にコーティングされるようにした。これを洗浄緩衝溶液(washing buffer)[0.1％ツイン-20(Tween-20)を含有、1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Phosphate buffered saline)]で3回洗浄した後、希釈溶液[diluent buffer(1Xリン酸緩衝生理食塩水の48.5 ml、牛胎児血清の1.5 ml、ツイン-20の50μl)]を180μlずつ分注した。一番目の穴(well)に培養した上層液20μlを入れた後、マイクロピペット(micropipette)を利用して連続的に希釈し、陽性の対照群として0.01μg/μlのヒト免疫グロブリン(human IgG, Sigma, USA)を、陰性の対照群として形質感染されていないチャイニズハムスターの卵巣Ｋ1(CHO-K1)細胞の培養液を使用して同様に希釈した。希釈が終わった96穴の酵素免疫の検査板(Falcon, USA)をホイルで包んで37℃で1時30分間反応させた後、洗浄溶液で3回洗浄した。ペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)を希釈溶液で1:5000希釈した後、これを100μlずつ分注してホイルで包んだ後、37℃で1時間反応させた。反応が終わった後、洗浄溶液で3回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼシステム(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)を利用して発色させ、吸光器(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)で波長630nmに対する吸光度を測定し、発現の可否を確認した。
【０１２４】
このように製造された形質転換体(transfectant)をそれぞれTR11Ig-CHO及びTR22Ig-CHOと名づけ、2001年7月7日付で韓国細胞株研究財団(KCLRF)にそれぞれKCLRF-BP-00046及びKCLRF-BP-00047の受託番号で寄託し、前記形質転換体が生成した融合蛋白質を精製する目的で無血清培地(serum free media)中、CHO-S-SFMII(Gibco BRL, USA)に適応させるため、以下の過程を進行した。約3×105個の細胞を6穴板(6-well plate)に接種した後、16時間、5％のCO2、37℃培養基で培養して定着させた後、顕微鏡下で約30〜50％の面積にcellが付着されたことを確認し、10％牛胎児血清含有DMEMとCHO-S-SFMIIの比率を8:2になるように培地を交替して培養した。この割合で3回継代培養した後、それぞれ6:4の割合で3回、4:6の割合で3回、3:7の割合で3回、2:8の割合で3回、及び1:9の割合で3回継代培養した後、最終的に100％のCHO-S-SFMII培地で継代培養し、この発現量を酵素免疫の検査法を利用して測定した。
【０１２５】
この細胞を牛血清培地のないCHO-S-SFMII(Gibco BRL, USA)培地で大量培養した後、それぞれの融合蛋白質を含有した培養液を200×g、12分間遠心分離して細胞カスを完全に除去し、プロテインＡカラム(HiTrap protein A column, Amersham, USA)を利用した以下の方法で純粋分離した。20mMのリン酸化ナトリウム(Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)を1 ml/minの速度で2分間通過させた後、10 mlの培養液を同一な速度でカラムに通過させ、プロテインＡに融合蛋白質が結合するようにした。20mMのリン酸化ナトリウム(pH7.0)を2分間同一な速度で通過させて洗浄した後、0.1Mのクエン酸(C6H8O7. H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)を3分間同一な速度で通過させながら500μlずつ1.5 mlのチューブに順次的に抽出物を分注した。これを1Mのトリス(Tris, pH 11.0, USA, Sigma)を利用してpH 7.0で滴定し、各チューブの融合蛋白質の存在有無は前記に記述した酵素免疫の検査法(ELISA)を通じて確認した。純粋分離した融合蛋白質はセトリコン30(Centricon30, Amicon, USA)を使用し、4℃で2000×g、30分間遠心分離して濃縮した。
【０１２６】
〔実施例５〕
精製されたTNFR1-TNFR1/Fc及びTNFR2-TNFR2/FcのSDS-PAGE(図15)
プロテインAカラムを利用して純水精製された蛋白質を還元剤(ジスルフィド結合破壊)であるDTTを添加した還元条件と、DTTが含まれていない非還元条件でSDS-PAGEを行った。それぞれのSDS-PAGE上における分子量の測定結果は、以下の表の通りである。TNFR/Fcの蛋白質は細胞内で二量体として存在することを確認することができた。TNFR1-TNFR1-Igのアミノ酸配列で推定した分子量は約70kDaであり、SDS-PAGE上で約102kDaと推定された。この差は、糖蛋白質の電気泳動上で表れる一般的な現象として、糖化された部分により電気泳動上における移動速度が遅れるため起きる特徴である。
【０１２７】
【表１０】
〔実施例６〕
単純/連鎖融合された二量体TNFR/Fc融合蛋白質のTNFα(α)とTNF(β)の細胞毒性の中和効果の実験
TNFR/Fc融合蛋白質の、TNFα(α)とTNFβ(β)から誘導される細胞毒性を抑制する効果を検査するため、L929細胞[ATCC, Musmusculus(mouse), NCTC clone 929(derivative of StrainL; L-929; Lcell)を利用した。この分析は、TNFにより誘導される細胞毒性を抑制するTNFRの活性[スケロン(ScallonBJ)ら, Cytokine 7: 759, 1995]に基づいている。
【０１２９】
L929細胞を96穴板(96-well plate)に3×104cells/wellになるように接種し、37℃、CO2培養基で24時間培養した。次いで、アクチノマイシン(Actinomycin D, Sigma, USA)を3μg/mlになるように添加し、100％細胞毒性を表す濃度(0.5〜2ng/ml)のTNFα及びβ(R&D, USA)を、10倍ずつ連続的に希釈したTNFR標本と共に16〜18時間培養した。次いで、96穴板にある細胞を染色試薬であるクリスタルバイオレット(crystal violet, Wako pure chemical industries, Japan)で染色し、細胞の活性度は吸光度595nmで吸光器(spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan)を利用して測定した。
下記の表11は、各TNFR/Fc融合蛋白質の抑制濃度の中間値(IC50)として、単純二量体の形態の融合蛋白質(TNFR1-Ig、TNFR2-Ig)より連鎖体の形態の融合蛋白質(TNFR1-TNFR1-Ig、TNFR1-TNFR2-Ig、TNFR2-TNFR1-Ig、TNFR2-TNFR2-Ig)が、二種類のTNFに対する細胞毒性を抑制する効果が全て顕著に高いことが分かった。更に、既存の単純二量体の形態と、本発明の連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質の、TNFα(図16)とβ(図17)に対する細胞毒性の抑制効果を対比すれば、本発明の連鎖体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質がTNFαとβの細胞毒性を顕著に抑制することがより明白に表れる。
【０１３０】
【表１１】
〔実施例７〕
単純/連鎖融合された二量体CD2/Fc融合蛋白質とCTLA4/Fc融合蛋白質の活性免疫細胞の増殖抑制の効果実験
発熱患者のBリンパ球にエプスタイン-バーウイルス(Ebstein-Barr virus)を形質感染させて作ったBリンパ球の細胞株であるWT100B1SをTリンパ球の抗原提示細胞として使用するため、10％牛胎児血清含有 RPMI 1640に培養した。これを2,000rpmで2分間沈殿させた後、5.0×105/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640に再び溶いた後、3,000rdのγ線(γ-ray)で照射(irradiation)させた。
【０１３２】
Tリンパ球は、健康なヒトの血液からFicoll-hypaque(Amersham, USA)を利用して分離した後、2.0×106/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640で培養した。
【０１３３】
一次の混合リンパ球の反応[Primary Mixed Lymphocyte Reaction(MLR)]を実行するため、WT100B1SとTリンパ球を150mmの細胞培養皿にそれぞれ15mlずつ混合して3日間培養した後、15mlの10％牛胎児血清含有RPMI 1640を添加して3日間更に培養した。総6日間培養した後、前記の方法通りFicoll-hypaque(Amersham, USA)を利用して生きているTリンパ球を純粋分離した。分離したリンパ球は45％牛胎児血清、45％RPMI 1640、10％DMSOで作った培地を利用して冷やした後、液体窒素に保管した。
【０１３４】
一次の混合リンパ球反応させたTリンパ球を、２次の混合リンパ球反応を実施するために溶解した後、RPMI 1640培地を利用して2回洗浄し、10％牛胎児血清含有RPMI 1640に3.0×105cells/mlになるようにした。
【０１３５】
抗原提示細胞として使用するWT100B1Sは、新たに培養して前記の方法通り培養した後、3,000rdのγ線(γ-ray)で照射(irradiation)させて準備し、7.5×104cells/mlになるように10％牛胎児血清含有RPMI 1640に準備した。準備されたWT100B1Sを100μlずつ96穴の平板細胞培養板に入れ、CD2/Fc及びCTLA4/Fc融合蛋白質を最終の濃度が10、1、10-1、10-2、10-3、10-4μl/mlになるように混合した後、前記の一次の混合リンパ球反応させたTリンパ球を100μlずつ添加した。これを、5％CO2、37℃の培養基で2日間培養した後、10％牛胎児血清含有RPMI 1640を100μl添加し、2日間更に培養した。総4日間の培養中、最後の6時間は3H-チミジン [thymidine(Amersham)]を1.2μCi/mlになるように添加して培養した。
【０１３６】
培養が終了された後、96穴の細胞培養板を4℃、110×g、10分間遠心分離してT-リンパ球を沈殿させて上層液を除去し、200μlの1Xリン酸緩衝溶液で洗浄した。同一な条件で遠心分離した後、リン酸緩衝溶液を除去し、残っている3H-チミジン[thymidine(Amersham)]を除去するため、冷たい200μlの10％TCA [trichloridic acid(TCA、Merck)]を添加して2分間揺らした後、5分間4℃で反応させた。
【０１３７】
前記と同様な条件で遠心分離した後、上層液を除去し、冷たい200μlの70％エタノールを添加した後、4℃で5分間放置してTリンパ球を固定した。遠心分離した後、上層液を除去し、前記の方法と同様な条件で10％TCAを処理し、残っていた3H-チミジン[thymidine(Amersham)]を完全に除去した。
【０１３８】
ここに、100μlの2％SDS[SDS(pH8.0)]/0.5Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を添加し、37℃で30分間反応させて細胞溶解を実施し、25℃、110×gで10分間遠心分離してTリンパ球を沈殿させ、上層液中50μlを96穴のサンプル板(Wallac)に移した。上層液に1.5倍のOptiPhase SuperMix(Wallac)を入れて5分間揺らした後、液体吸光器[1450 MicroBetaTriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter(Wallac)]を利用して3Hに対するcpm値を測定し、Tリンパ球の増殖可否を確認した。図18及び図19でのように、連鎖融合された二量体CD2/Fc及びCTLA4/Fcが、単純融合された二量体に比べて卓越に活性免疫細胞の増殖を抑制することが分かった。
【０１３９】
〔実施例８〕
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質のマウス血中における濃度半減期の増加効果の実験
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2、[mgTNFR2-TNFR2/Fc]2、[mgCD2-CD2/Fc]2及び[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2の血中における半減期の測定は、マウス(ICR、シャムタコ)の腹腔に精製された各融合蛋白質5μgを注射した後、最高120時間(5日)一定の間隔で血液を採取した後、蛋白質の濃度を酵素免疫の検査法(ELISA)を利用して確認することにより行った。図20、21、22でのように、糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質が、自然形態の同一な直列連鎖融合された二量体蛋白質に比べて、血中における半減期が増加されたことが分かった。これは持続的な効果を通じて効能の増大を期待することができる結果であると言える。
【０１４０】
〔実施例９〕
DBA/1マウスのコラーゲン誘導の関節炎に対する単純/連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質の効果実験
アトロゲン-CIA補助剤(Arthrogen-CIA ajuvant, Chondrex, USA)中の0.05Mの酢酸に2mg/mlの濃度で溶解した、タイプIIのコラーゲンをDBA/1マウス一匹当たり尻尾に100μgずつ注入し、コラーゲン誘導の関節炎(CIA; Collagen Induced Arthritis)を発病させた。ブースティング(Boosting)は3週後に行い、不完全なフロイント補助剤(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)を利用した。
DBA/1マウスに、タイプIIのコラーゲン100μgで免疫化させた後、3〜4週後に関節炎の症状が表れた。症状が表れた後、3〜5日が過ぎればマウスの足が赤く腫れ上がり、炎症性の関節炎(inflammatory arthritis)は3〜4週以上持続され、炎症が弱化されても関節は永久に硬直される。関節炎の深度の主観的な尺度を表す表12に基づいて1週間に2〜3回測定した(各実験群から5匹のマウスにおける平均値を求める)。コラーゲン誘導の関節炎に対する単純及び連鎖体の形態の二量体TNFR/Fcの効果を測定するため、マウスにTNFR/Fcまたはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を腹腔内に注射した。TNFR/Fcは、実験群当たり5匹のマウスに19日〜45日間、2日おきに10μgを注射した(図23の矢印)。5匹の対照群のマウスにはPBSを注射した。前記の測定結果を表した図7のように、既存の単純二量体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質を注入したマウスの場合を、対照群であるリン酸緩衝生理食塩水を注射したマウスで発病した関節炎の指標数値と比較するとき、約26〜38％減少した効果を表したが(45日の測定値を基準)、連鎖体の形態の二量体である[TNFR1-TNFR1/Fc]2、[TNFR2-TNFR2/Fc]2を注入した場合は、42〜55％減少した効果を表した。このように、従来の単純融合された二量体の形態のTNFR/Fc融合蛋白質に比べ、直列連鎖融合された二量体のTNFR/Fc融合蛋白質がマウスの関節炎を顕著に減少させることが分かった。
【０１４１】
【表１２】
前記結果は、連鎖体の形態の二量体TNFR/Fc融合蛋白質が、マウスのCIAの発病率を低下させるのに既存の単純二量体の形態の融合蛋白質に比べて効果的であり、したがって関節炎の治療に使用することにおいて連鎖体の形態の蛋白質の製剤が、既存の蛋白質の製剤に比べて効果的な治療剤として使用され得るということを表す。
【０１４３】
本発明の連鎖体の蛋白質、直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化修飾蛋白質は、増加した効能及び高度の安定性を表し、高い歩留まりで生成することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、従来の単純融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図２】 図２は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするDNA作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図３ａ】 図３ａは、従来の単純融合された単量体蛋白質を例示するTNFR/Fc、CD2/FcまたはCTLA4/Fcの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、単純融合された二量体蛋白質[TNFR/Fc]2、[CD2/Fc]2または[CTLA4/Fc]2の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図３ｂ】 図３ｂは、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質を例示するTNFR-TNFR/Fc、CD2-CD2/FcまたはCTLA4-CTLA4/Fcの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR-TNFR/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2または[CTLA4-CTLA4/Fc]2の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図４ａ】 図４ａは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の一例として[TNFR1-TNFR1/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｂ】 図４ｂは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の他の例として[TNFR2-TNFR2/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｃ】 図４ｃは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として[CD2-CD2/Fc]2の構造を示したものである。
【図４ｄ】 図４ｄは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として[CTLA4-CTLA4/Fc]2の構造を示したものである。
【図５】 図５は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質の他の例としてTNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'を作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図６】 図６は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Igを作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図７】 図７は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-Top10'の図である。
【図８】 図８は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質TNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR22Ig-Top10'の図である。
【図９】 図９は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Igの図である。
【図１０】 図１０は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質CTLA4-CTLA4/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCT44Igの図である。
【図１１】 図１１は、本発明によって四つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR1-TNFR1/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR11Ig-MGの図である。
【図１２】 図１２は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgTNFR2-TNFR2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpTR22Ig-MGの図である。
【図１３】 図１３は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCD2-CD2/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCD22Ig-MGの図である。
【図１４】 図１４は、本発明によって三つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質mgCTLA4-CTLA4/Fcを発現する、本発明の組換え発現プラスミドpCT44Ig-MGの図である。
【図１５】 図１５は、本発明によって純粋精製された直列連鎖融合された二量体蛋白質 [TNFR1-TNFR1/Fc]2及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2を還元条件及び非還元条件下でSDS-PAGEを実施した結果を示す。
【図１６】 図１６は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)及び[TNFR2/Fc]2(○)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)が、TNFαの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１７】 図１７は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)及び[TNFR2/Fc]2(○)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)が、TNFβの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１８】 図１８は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CD2/Fc]2(●)、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンA(▼)及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CD2-CD2/Fc]2(○)が、活性Tリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図１９】 図１９は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(●)、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンA(▼)及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(○)が、活性Tリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図２０】 図２０は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[TNFR1/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２１】 図２１は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CD2/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CD2-CD2/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgCD2-CD2/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２２】 図２２は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質[CTLA4/Fc]2(●)、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2(▽)の血中における半減期を示すグラフである。
【図２３】 図２３は、PBS(●)、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質 [TNFR1/Fc]2(■)及び[TNFR1/Fc]2(▲)、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質[TNFR1-TNFR1/Fc]2(×)及び[TNFR2-TNFR2/Fc]2(△)によるDBA/1マウスにおけるコラーゲン誘導の関節炎(CIA)の抑制効果を示したグラフである。
Claims (28)
- サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体または細胞表面の受容体からなるグループから選択された蛋白質の２つの同一な細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合され、増加した効能及び高度の安定性を有する直列連鎖融合された二量体蛋白質。
- 免疫グロブリンがＩｇＧである請求項１に記載の二量体蛋白質。
- ＧＨＲ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ、インターフェロン−αＲ、−βＲ及び−γＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＰＯＲ、ｃＭｐｌ、ｇｐ１３０、Ｆａｓ（Ａｐｏ１）、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ１−４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｔｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ／Ｔｙｒｏ−３、肝細胞成長因子Ｒ、血小板−由来の成長因子Ｒ、Ｆｌｔ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ−３、Ｂ７、Ｂ６１、β−ニューレキシン、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ−１、補体Ｒ−２（ＣＤ２１）、ＩｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ−１、α２−マクログロブリン受容体−連関の蛋白質及びナトリウム排泄ペプチドＲからなるグループから選択される請求項１に記載の二量体蛋白質。
- 前記単量体蛋白質が、配列番号６、配列番号８、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の二量体蛋白質。
- サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体または細胞表面の受容体からなるグループから選択された蛋白質の２つの同一な細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物。
- 免疫グロブリンが、ＩｇＧである請求項５に記載のＤＮＡ作製物。
- ＧＨＲ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ、インターフェロン−αＲ、−βＲ及び−γＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＰＯＲ、ｃＭｐｌ、ｇｐ１３０、Ｆａｓ（Ａｐｏ１）、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ１−４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｔｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ／Ｔｙｒｏ−３、肝細胞成長因子Ｒ、血小板−由来の成長因子Ｒ、Ｆｌｔ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ−３、Ｂ７、Ｂ６１、β−ニューレキシン、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ−１、補体Ｒ−２（ＣＤ２１）、ＩｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ−１、α２−マクログロブリン受容体−連関の蛋白質及びナトリウム排泄ペプチドＲからなるグループから選択される請求項５に記載のＤＮＡ作製物。
- 配列番号５、配列番号７、配列番号１７または配列番号１９の核酸配列を有する請求項５に記載のＤＮＡ作製物。
- 請求項５に記載のＤＮＡ作製物が、ベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミド。
- プラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８８）、プラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２９１）、プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４０２）またはプラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４００）である、請求項９に記載の組換え発現プラスミド。
- 請求項９に記載の組換え発現プラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞。
- 哺乳動物の細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
- 組換え発現プラスミドが、プラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８８）、プラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２９１）、プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４０２）またはプラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４００）である、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
- 細胞株ＴＲ１１Ｉｇ−ＣＨＯ（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４６）またはＴＲ２２Ｉｇ−ＣＨＯ（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４７）である、請求項１３に記載の宿主細胞。
- 請求項１１に記載の形質転換または形質感染された宿主細胞を、同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ部位に結合された連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が発現されるのに適合した条件下で培養し、培養物から前記単量体蛋白質から形成された二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合された直列連鎖融合された二量体蛋白質を製造する方法。
- 連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が、免疫グロブリンＦｃ片をコーディングする断片と免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片を結合させて単純融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製造し、製造されたＤＮＡ作製物を前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と同一な第２のＤＮＡ断片と結合させて製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
- 前記連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物に、糖化モーティブを挿入させることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
- 糖化モーティブが、細胞外域可溶性の部位の二つが互いに結合される部位近くに挿入される、請求項１７に記載の方法。
- サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体または細胞表面の受容体からなるグループから選択された蛋白質の２つの同一な細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合されて糖化され、増加した効能及び高度の安定性を有する直列連鎖融合された二量体蛋白質。
- 前記単量体蛋白質が、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有する請求項１９に記載の二量体蛋白質。
- サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体または細胞表面の受容体からなるグループから選択された蛋白質の２つの同一な細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて糖化モーティブペプチドが挿入された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物。
- 配列番号９、配列番号１１、配列番号２１または配列番号２３である、請求項２１に記載のＤＮＡ作製物。
- 請求項２１に記載のＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミド。
- プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０４）、ｐＴＲ２２Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０７）、ｐＣＤ２２Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０１）またはｐＣＴ４４Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０３９９）である、請求項２３に記載の組換え発現プラスミド。
- 請求項２３に記載の組換え発現プラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞。
- 哺乳動物の細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
- 請求項１に記載の二量体蛋白質を含む薬剤学的または診断学的な組成物。
- 請求項１９に記載の糖化された二量体蛋白質を含む薬剤学的または診断学的な組成物。
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