RU2815388C2 - Многофункциональные слитые белки и их применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению противоопухолевых слитых белков, и может быть использовано в медицине для лечения меланомы. Предложен трехкомпонентный слитый белок, который способен связывать i) PD-L1, ii) CXCR4 и iii) Fc-рецептор и в котором компонент A связан с компонентом B и компонент B связан с компонентом C через дисульфидные связи. Изобретение обеспечивает получение слитого белка с возможностью многоточечного молекулярного прикрепления для приведения к гибели, иммобилизации и выведения опухолевой клетки. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 27 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

Ссылка на родственную заявку

В соответствии с настоящей заявкой испрашивается приоритет согласно 35 USC. § 119(e) согласно предварительной заявке на выдачу патента США №62/789212, поданной 7 января 2019 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Множественные пути регулируют выживаемость инфицированных клеток и раковых клеток, а также активацию или подавление клеток иммунной системы, таких как Т-клетки и клетки - естественные киллеры (NK). Один путь, который обеспечивает костимулирующие и ингибирующие вторичные сигналы к Т-клеткам, представлен рецептором 1 запрограммированной смерти (PD-1; также известный как CD279) и его лигандами, PD-L1 (В7-Н1; CD274) и PD-L2 (B7-DC; CD273). PD-1 является представителем семейства CD28/CTL4, который экспрессируется на активированных, но не покоящихся Т-клетках (Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8:773). Связывание PD-1 его лигандами опосредует ингибирующий сигнал, который приводит к снижению продукции цитокинов и снижению выживаемости Т-клеток (Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141; Nishimura et al. (2001) Science 291:319; Chemitz et al. (2004) J. Immunol. 173:945).

Вирусный воспалительный белок макрофагов II (vMIP-II) представляет собой хемокин, кодируемый вирусом герпеса человека 8 типа(HHV-8), который взаимодействует с хемокиновыми рецепторами СС и СХС, включая в себя хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR4. Ингибирование vMIP-II проникновения HIV-1 опосредуется через CCR3, CCR5 и CXCR4, которые являются рецепторами HIV-1 для проникновения HIV-1 в клетку-мишень.

Сложное взаимодействие положительных и отрицательных сигналов регулирует активацию Т-клеток и поддержание эффекторной функции Т-клеток. Представители суперсемейства лиганд TNF/рецептор TNF занимают видное место в этой матрице сигналов, связывая клетки иммунной системы, а также клетки других систем органов. При этом представители суперсемейства TNF вносят вклад как в гомеостаз, так и в патогенез, воздействуя на выживаемость и гибель клеток, клеточную дифференцировку и воспаление.

Остается потребность в улучшенных терапевтических средствах для лечения таких заболеваний, как рак. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение относится к слитому белку с возможностью многоточечного молекулярного прикрепления и способам его применения.

Один аспект настоящего изобретения предусматривает слитый белок, содержащий компонент А и/или компонент В. Компонент А содержит компонент Y, компонент Z₂ и компонент Z₃. Компонент В содержит компонент X', компонент Z₂' и компонент Z₃'.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает слитый белок, содержащий компонент А, компонент В и компонент С. Компонент А содержит компонент Y, компонент Z₂ и компонент Z₃. Компонент В содержит компонент X', компонент Z₂' и компонент Z₃'. Компонент С содержит компонент X и компонент C'L. Компонент Y содержит по меньшей мере часть PD-1, компонент Z₂ и компонент Z₂' содержат домены СН2 Fc человека, и компонент Z₃ и компонент Z₃' содержат домены СН3 Fc человека. Компонент X' и компонент X содержат по меньшей мере часть vMIP-II, и компонент CL' содержит по меньшей мере один домен CHI IgG1 каппа человека.

Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения слитого белка. Способ предусматривает введение в клетку первой нуклеиновой кислоты, кодирующей PD-1-hFcA человека, второй нуклеиновой кислоты, кодирующей vMIPII-CH'-hFcB, и третьей нуклеиновой кислоты, кодирующей vMIPII-CL'.

Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает слитый белок, содержащий аминокислотные последовательности согласно SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 57.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и любой из слитых белков, раскрытых в настоящем документе.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает способ лечения пролиферативного нарушения у пациента. Способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества любого из слитых белков, раскрытых в настоящем документе, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Согласно различным вариантам осуществления вышеупомянутых аспектов или любого другого аспекта настоящего изобретения, описанного в настоящем документе, компонент В дополнительно содержит компонент Z₁'. Согласно определенным вариантам осуществления компонент А дополнительно содержит компонент Z₁.

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент С, причем компонент С содержит компонент X и компонент C_L'.

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент D, причем компонент D содержит компонент Q и компонент C_L.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Y содержит домен лиганда, домен рецептора, домен scFv или домен липокалина. Согласно определенным вариантам осуществления компонент Y содержит по меньшей мере часть PD-1, CD112R, CD113 или последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA).

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок связывает PD-L1 или PD-L2.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью HTS пептид.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть vMIP-II. Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' содержит VI или VI дельта.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью HTS пептид. Согласно определенным вариантам осуществления компонент X содержит V1 или V1дeльтa.

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок связывает CXCR4.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Y и компонент Z₂ соединены посредством шарнира. Согласно определенным вариантам осуществления компонент Z₁' и компонент Z₂' соединены посредством шарнира.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' и компонент соединены посредством линкера. Согласно определенным вариантам осуществления компонент X и компонент C_L соединены посредством линкера. Согласно определенным вариантам осуществления компонент Q и компонент C_L соединены посредством линкера.

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок связывает рецептор или лиганд на иммунной клетке. Согласно определенным вариантам осуществления рецептор представляет собой рецептор Fc.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Y содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Q содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент А содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 14-22.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 32-35. Согласно определенным вариантам осуществления компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 49-55.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент А содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 14-22, и компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 32-35.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент С содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 57-63.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 49-55, и компонент С содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 57-63.

Согласно определенным вариантам осуществления слитый белок способен связывать i) PD-L1 или PD-L2, ii) CXCR4, и iii) рецептор Fc или лиганд на иммунной клетке.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент А содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 29, и компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 30.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Y содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Z₂ содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 12 и/или компонент Z₃ содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 13.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент А содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 49.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент X' содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 37. Согласно определенным вариантам осуществления компонент X содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 37.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент Z₂' содержит SEQ ID NO: 12 и/или компонент Z₃' содержит SEQ ID NO: 48.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент C_L' содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 64.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 53.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент С содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 61.

Согласно определенным вариантам осуществления компонент А содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14, компонент В содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 53, и компонент С содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 61.

Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает введение в клетку, причем первая нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14, и/или вторая нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 49, и/или третья нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 57.

Согласно определенным вариантам осуществления пролиферативное нарушение представляет собой рак. Согласно определенным вариантам осуществления рак представляет собой солидную опухоль. Согласно определенным вариантам осуществления рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, меланому, глиобластому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), множественную миелому или рак толстой кишки.

Краткое описание графических материалов

Следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будет лучше понято при чтении вместе с прилагаемыми графическими материалами. В целях иллюстрации настоящего изобретения на графических материалах показаны варианты осуществления, которые в настоящее время являются предпочтительными. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается точными компоновками и инструментами вариантов осуществления показанных на графических материалах.

Фигуры 1А и 1В представляют собой схематические изображения некоторых вариантов осуществления платформы слитого белка.

Фигура 2 представляет собой схематическое изображение некоторых вариантов осуществления платформы слитого белка. На фигуре показан слитый белок, нацеленный на границу контакта опухолевых клеток и клеток- естественных киллеров (NK).

Фигура 3 представляет собой схематическое изображение слитого белка, который связывает CXCR4, PD-L1 и FcγRIIIa.

Фигура 4 представляет собой схематическое изображение взаимодействия с раковой клеткой и с NK-клеткой слитого белка, который связывает CXCR4, PD-L1 и FcγRIIIa.

Фигура 5 представляет собой схематическое изображение возможного(ых) взаимодействия(ий) с различными типами клеток слитого белка, который связывает CXCR4, PD-L1 и FcγRIIIa.

Фигура 6 представляет собой схематическое изображение возможного(ых) взаимодействия(ий) с различными типами клеток различных слитых белков.

Фигура 7 представляет собой схематическое изображение возможного(ых) взаимодействия(ий) с различными типами клеток различных слитых белков.

Фигура 8 представляет собой схематическое изображение возможного(ых) взаимодействия(ий) с опухолеассоциированными макрофагами (M1) различных слитых белков.

Фигура 9 представляет собой окрашенный кумасси синим (восстановленный) гель SDS-PAGE hPD-1-FcA/hFcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 36).

Фигура 10 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hFcA/hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 36).

Фигура 11 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hMICA-FcA/hFcB (SEQ ID NO: 22 вместе с SEQ ID NO: 36).

Фигура 12 представляет собой окрашенный кумасси синим (восстановленный) гель SDS-PAGE hFcA/hTIGIT-FcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 36), hFcA/hCD155-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 32), hFcA/hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 36) и hMICA-FcA/hTIGIT-FcB (SEQ ID NO: 22 вместе с SEQ ID NO: 33).

Фигура 13 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hCD112R-FcA/hFcB (SEQ ID NO: 16 вместе с SEQ ID NO: 36).

Фигура 14 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE HA-PD-1-FcA/hCD113-FcB (SEQ ID NO: 15 вместе с SEQ ID NO: 35).

Фигура 15 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hFcA/hCD113-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 33) и PD-1-hFcA/hCD113-FcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 35).

Фигура 16 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hFcA/hCD155-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 32).

Фигура 17 представляет собой окрашенный кумасси синим гель SDS-PAGE hFcA/TIM-3-hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 34) и PD-1-hFcA/TIM-3-hFcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 34).

На фигуре 18 показано, что hFcA/hTIGIT-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 33) связывается с клетками, экспрессирующими CD155 человека.

На фигуре 19 показано, что hFcA/hTIGIT-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 33) связывается с клетками, экспрессирующими CD112 человека.

На фигуре 20 показано, что hFcA/hCD155-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 32) связывается с клетками, экспрессирующими TIGIT человека.

На фигуре 21 показано, что hFcA/hTIGIT-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 33) и hFcA/hCD155-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 32) связываются с клетками, экспрессирующими CD16 (FcγRIIIa).

На фигуре 22 показаны слитые белки разделенные и восстановленные (R) на SDS-PAGE, окрашивании геля кумасси. Как изображено, 'А' относится к hFcA/hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 36), В' относится к PD-1-hFcA/FcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 36), 'С' относится к hFcA/VpI-CH'-FcB/VpI-CL (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 61) и 'D' относится к PD-1-hFcA/VpI-CH'-FcB/VpI-CL (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 61).

Фигуры 23A-23D представляют собой серию вестерн-блотов. Вестерн-блоттинг проводили на слитых белках, очищенных протеином А, из кондиционированной среды клеток Expi-CHO, трансфицированных экспрессионными конструктами, как показано на фигуре 22. Наблюдаемые полосы соответствовали ожидаемым размерам PD-1-hFcA (SEQ ID NO: 14) и vMIPII-CL' (SEQ ID NO: 57); 125 кДа для невосстановленных (NR) образцов и 60 кДа и 20 кДа соответственно для восстановленных (R) образцов. В вестерн-блоттинге использовали зондирование антителом к PD1 (фиг. 23А), антителом к легкой каппа-цепи IgG (фиг. 23В), антителом к тяжелой цепи IgG (фиг. 23С) и антителом к vMIP-II (фиг. 23D).

На фигуре 24 показано связывание слитого белка с линиями клеток меланомы В16, которые экспрессируют PD-L1 и CXCR4 или CXCR7 на своей клеточной поверхности. Испытанные слитые белки (в порядке сверху вниз): hFcA/hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 36), PD-1-hFcA/FcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 36), hFcA/V1Δmut-CH'-FcB/ V1Δmut-CL' (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 60), hFcA/V1Δ-CH'-FcB/ V1Δ-CL' (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 59), PD-1-hFcA/V1Δmut-CH'-FcB/ V1Δmut-CL' (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 60) и PD-1-hFcA/V1Δ-CH'-FcB/ V1Δ-CL' (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 59).

На фигуре 25 показан анализ Transwell, в котором измеряют ингибирующие эффекты слитых белков на миграцию клеток меланомы. Показаны репрезентативные изображения из одного анализа миграции Transwell мигрировавших клеток B16-F10, обработанных 100 нг/мл CXCL12 и слитых белков. Испытанные слитые белки (в порядке сверху вниз): hFcA/hFcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 36), PD-1-hFcA/FcB (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 36), hFcA/V1Δmut-CH-FcB/ V1Δmut-CL' (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 60), hFcA/V1Δ-CH-FcB/ V1Δ-CL' (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 59), PD-1-hFcA/V1Δmut-CFF-FcB/V1Δmut-CL' (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 60) и PD-1-hFcA/V1Δ-CH'-FcB/ V1Δ-CL' (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 59). Анализы окрашивали 2% кристаллическим фиолетовым.

На фигурах 26А-26В показано ингибирование роста опухоли, опосредованное слитым белком (FP) PD1-hFcA/v1Δ-CFFΔhFcB/v1Δ-CL' (SEQ ID NO: 14 вместе с SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 59) в подкожной модели меланомы B16F10. Мышам C57BL/6 вводили 100 мкл (10 мкг/мл) FP в PBS (мыши R, 2L и 2R) или только PBS (мыши X или L) в дни 13, 14, 15, 16 и 21 после подкожной инокуляции 1×10⁵ опухолевых клеток B16F10. Размер опухоли с течением времени измеряли и наносили на график для каждой мыши на фигуре 26А. На фигуре 26В показаны репрезентативные изображения одной мыши из группы, получавшей только PBS (вверху) и группы лечения PD1-hFcA/v1Δ-CH'-hFcB/v1Δ-CL' (FP) (внизу).

На фигуре 27 показано, что опосредованная NK-клетками ADCC увеличивается за счет добавления многофункциональных слитых белков. Линию клеток яичника SKOV-3 [клетка-мишень (Т)] помещали в 96-луночный планшет из расчета 3000 клеток/лунку, давали прилипнуть и метили реагентом CellTracker Red СМТРХ. Затем клетки SKOV-3 метили зеленым флуоресцентным реагентом для определения каспазы-3. Клеточная линия CD16.NK-92 [вариант V158, т.е. эффекторную клетку (Е)] добавляли в лунки при Е:Т 5:1 с различными слитыми белками в концентрации 25 мг/мл или без белка и анализировали с использованием системы анализа живых клеток Incucyte, измеряющей количество флуоресцентных двойных положительных (красный + зеленый) клеток. Показанные результаты относятся к 20-часовой временной точке. Испытанные слитые белки: высокоаффинный (HA)-PD-1-hFcA/FcB (SEQ ID NO: 15 вместе с SEQ ID NO: 36), hFcA/hCD113-FcB (SEQ ID NO: 23 вместе с SEQ ID NO: 35) и высокоаффинный (HA)-PD-1-hFcA/hCD113-FcB (SEQ ID NO: 15 вместе с SEQ ID NO: 35).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике для тестирования настоящего изобретения, предпочтительные материалы и способы описаны в настоящем документе. В описании и формуле настоящего изобретения будет использоваться следующая терминология.

Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Форма единственного числа используется в настоящем документе для обозначения одного или более чем одного (то есть по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера «элемент» означает один или несколько элементов.

Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» при ссылке на измеряемую величину, такую как количество, временная продолжительность и т.п., означает, что он охватывает отклонения в ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, даже более предпочтительно ±1% и еще более предпочтительно ±0,1% от указанного значения, поскольку такие отклонения подходят для реализации раскрытых способов.

Используемый в настоящем документе термин «активация» относится к состоянию Т-клетки, которая была достаточно стимулирована, чтобы вызвать продукцию одного или нескольких цитокинов, детектируемые эффекторные функции и клеточную пролиферацию. Термин «активированные Т-клетки» относится, среди прочего, к Т-клеткам, которые проявляют одну или несколько из этих характеристик активации.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, происходящими из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела, как правило, представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов, а также могут существовать как мультимеры более высокого порядка таких тетрамеров. Антитела согласно настоящему изобретению могут существовать в различных формах, включая в себя, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)₂, а также одноцепочечные антитела (scFv) и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, В: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, B: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к определяющим антиген вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, линейные антитела, антитела scFv и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Используемый в настоящем документе термин «тяжелая цепь антитела» относится к большей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Гамма (γ), мю (μ), дельта (δ), альфа (α) и эпсилон (ε) тяжелые цепи относятся к пяти основным изотипам тяжелой цепи антитела.

Используемый в настоящем документе термин «легкая цепь антитела» относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) относятся к двум основным изотипам легкой цепи антитела.

Под используемым в настоящем документе термином «синтетическое антитело» подразумевается антитело, которое образовано с использованием технологии рекомбинантной ДНК, такое как, например, антитело, экспрессируемое бактериофагом, как описано в настоящем документе. Термин также следует толковать как обозначение антитела, которое было образовано путем синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, и эта молекула ДНК экспрессирует РНК, кодирующую белок антитела, или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где ДНК, РНК или аминокислотная последовательность была получена с использованием технологии синтетических нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, которая доступна и хорошо известна в настоящей области техники.

Используемый в настоящем документе термин «антиген» или «Ag» определяется как молекула, которая вызывает иммунный ответ или связывается с фрагментом иммунного распознавания, таким как антитело и рецептор Т-клеток. Этот иммунный ответ может включать в себя либо продукцию антител, либо активацию специфических иммунологически компетентных клеток, либо и то, и другое. Квалифицированный специалист поймет, что любая макромолекула, включая в себя практически все белки или пептиды, может служить антигеном. Кроме того, антигены могут происходить из рекомбинантной или геномной ДНК. Квалифицированный специалист поймет, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидные последовательности или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, вызывающий иммунный ответ, поэтому кодирует «антиген», как этот термин используется в настоящем документе. Кроме того, специалисту в настоящей области техники будет понятно, что антиген не обязательно должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Совершенно очевидно, что настоящее изобретение предусматривает без ограничения применение частичных нуклеотидных последовательностей более чем одного гена и что эти нуклеотидные последовательности расположены в различных комбинациях, чтобы вызвать требуемый иммунный ответ. Более того, квалифицированный специалист поймет, что антиген вовсе не обязательно должен кодироваться «геном». Совершенно очевидно, что антиген может быть получен, синтезирован или может происходить из биологического образца. Такой биологический образец может включать в себя без ограничения образец ткани, образец опухоли, клетку или биологическую жидкость.

Используемый в настоящем документе термин «противоопухолевый эффект» относится к биологическому эффекту, который может проявляться уменьшением объема опухоли, уменьшением количества опухолевых клеток, уменьшением количества метастазов, увеличением ожидаемой продолжительности жизни или улучшением различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. «Противоопухолевый эффект» также может проявляться способностью пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител согласно настоящему изобретению в первую очередь предотвращать возникновение опухоли.

Термин «аутоантиген» означает в соответствии с настоящим изобретением любой аутоантиген, который распознается иммунной системой как чужеродный. Аутоантигены включают в себя без ограничения клеточные белки, фосфопротеины, белки клеточной поверхности, клеточные липиды, нуклеиновые кислоты, гликопротеины, включая в себя рецепторы клеточной поверхности.

Используемый в настоящем документе термин «аутоиммунное заболевание» определяется как нарушение, возникающее в результате аутоиммунного ответа. Аутоиммунное заболевание является результатом неправильного и чрезмерного ответа на аутоантиген. Примеры аутоиммунных заболеваний включают в себя без ограничения следующее: болезнь Аддисиона, очаговая алопеция, анкилозирующий спондилит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный паротит, болезнь Крона, сахарный диабет (тип I), дистрофический буллезный эпидермолиз, эпидидимит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гемолитическая анемия, системная красная волчанка, рассеянный склероз, тяжелая миастения, обыкновенная пузырчатка, псориаз, ревматическая лихорадка, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидит, васкулит, витилиго, микседема, пернициозная анемия, язвенный колит и другие.

Используемый в настоящем документе термин «аутологичный» предназначен для обозначения любого материала, полученного от того же индивидуума, которому он позже будет введен повторно.

«Аллогенный» относится к трансплантату, полученному от другого животного того же вида.

«Ксеногенный» относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.

Используемый в настоящем документе термин «рак» определяется как заболевание, характеризующееся быстрой и неконтролируемой пролиферацией и/или накоплением аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части тела. Примеры различных форм рака включают в себя без ограничения рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, рак толстой и прямой кишки, рак почек, рак печени, рак мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и тому подобное. Согласно определенным вариантам осуществления рак представляет собой медуллярную карциному щитовидной железы.

Термин «расщепление» относится к разрыву ковалентных связей, например, в основной цепи молекулы нуклеиновой кислоты. Расщепление может быть инициировано различными способами, включая в себя без ограничения ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможно как одноцепочечное расщепление, так и двухцепочечное расщепление. Двухцепочечное расщепление может происходить в результате двух различных событий одноцепочечного расщепления. Расщепление ДНК может привести к образованию либо тупых, либо выступающих концов. Согласно определенным вариантам осуществления слитые полипептиды можно использовать для нацеливания на расщепленную двухцепочечную ДНК.

Используемый в настоящем документе термин «консервативные модификации последовательности» предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают в себя аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации можно вводить в антитело согласно настоящему изобретению стандартными методами, известными в настоящей области техники, такими как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, определены в настоящей области техники. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в пределах областей CDR антитела могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть протестировано на способность связывать антигены с использованием функциональных анализов, описанных в настоящем документе.

«Заболевание» представляет собой состояние здоровья животного, при котором животное не может поддерживать гомеостаз и при котором, если состояние заболевания не улучшается, здоровье животного продолжает ухудшаться. Напротив, «нарушение» у животного представляет собой состояние здоровья, при котором животное способно поддерживать гомеостаз, но при котором состояние здоровья животного менее благоприятно, чем было бы при отсутствии нарушения. При отсутствии лечения заболевание не обязательно приводит к дальнейшему ухудшению состояния здоровья животного.

«Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, как описано в настоящем документе, эффективных для достижения определенного биологического результата или обеспечения благоприятного терапевтического или профилактического воздействия. Такие результаты могут включать в себя без ограничения противоопухолевую активность, определяемую любыми способами, подходящими в настоящей области техники.

«Кодирующий» относится к неотъемлемому свойству конкретных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК чтобы служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот и вытекающие из этого биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция в мРНК и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, производит белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и, как правило, приводится в перечнях последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, может называться кодирующей белок или другой продукт этого гена или кДНК.

Используемый в настоящем документе термин «эндогенный» относится к любому материалу из организма, клетки, ткани или системы или произведенном внутри них.

Используемый в настоящем документе термин «экзогенный» относится к любому материалу, введенному или произведенному вне организма, клетки, ткани или системы.

Используемый в настоящем документе термин «размножать» относится к увеличению количества, как в увеличении количества Т-клеток. Согласно одному варианту осуществления Т-клетки, которые размножаются ex vivo, увеличиваются в количестве по сравнению с количеством, изначально присутствующим в культуре. Согласно другому варианту осуществления Т-клетки, которые размножаются ex vivo, увеличиваются в количестве по сравнению с другими типами клеток в культуре. Используемый в настоящем документе термин «ех vivo» относится к клеткам, которые были удалены из живого организма (например, человека) и размножены за пределами организма (например, в культуральной чашке, пробирке или биореакторе).

Используемый в настоящем документе термин «экспрессия» определяется как транскрипция и/или трансляция конкретной нуклеотидной последовательности, управляемой ее регуляторным элементом, таким как промотор.

«Экспрессионный вектор» относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая должна быть экспрессирована. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут поставляться клеткой-хозяином или в экспрессионной системе in vitro. Экспрессионные векторы включают в себя все известные в настоящей области техники, такие как космиды, плазмиды (например, голые или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, вирусы Сендай, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают в себя рекомбинантный полинуклеотид.

Используемый в настоящем документе «гомологичный» относится к идентичности последовательности субъединицы между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя молекулами полипептида. Когда положение субъединицы в обеих из двух молекул занято одной и той же мономерной субъединицей; например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они гомологичны в этом положении. Гомология между двумя последовательностями является прямой функцией количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, эти две последовательности гомологичны на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) совпадают или гомологичны, две последовательности гомологичны на 90%.

«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR не относящегося к человеку вида (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, обладающие требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасных последовательностях. Эти модификации сделаны для дальнейшего уточнения и оптимизации характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного, и, как правило, из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют таковым областям иммуноглобулина нечеловеческого происхождения и все или по существу все области FR представляют собой области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, Fc иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации см. Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op.Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

«Полностью человеческий» относится к иммуноглобулину, такому как антитело, где вся молекула происходит от человека или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела.

Используемый в настоящем документе термин «идентичность» относится к идентичности последовательности субъединиц между двумя полимерными молекулами, в частности, между двумя молекулами аминокислот, например, между двумя молекулами полипептида. Когда две аминокислотные последовательности имеют одинаковые остатки в одинаковых положениях; например, если положение в каждой из двух молекул полипептида занято аргинином, то они идентичны в этом положении. Идентичность или степень, в которой две аминокислотные последовательности имеют одинаковые остатки в одних и тех же положениях при выравнивании, часто выражается в процентах. Идентичность двух аминокислотных последовательностей является прямой функцией количества совпадающих или идентичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять аминокислот) положений в двух последовательностях идентичны, две последовательности идентичны на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) совпадают или идентичны, две аминокислотные последовательности идентичны на 90%

Используемый в настоящем документе термин «иммуноглобулин» или «Ig» определяется как класс белков, которые функционируют как антитела. Антитела, экспрессируемые В-клетками, иногда называют BCR (В-клеточный рецептор) или антигенным рецептором. В этот класс белков входят пять представителей: IgG, IgM, IgD, IgA и IgE. IgG представляет собой наиболее распространенные циркулирующие антитела. IgM является основным иммуноглобулином, вырабатываемым при первичном иммунном ответе у большинства субъектов. Это наиболее эффективный иммуноглобулин в агглютинации, фиксации комплемента и других ответах антител, и он важен для защиты от бактерий и вирусов. IgD представляет собой иммуноглобулин, который не имеет известной функции антител, но может служить рецептором антигена. IgA представляет собой первичное антитело, которое присутствует в секретах организма, таких как слюна, слезы, грудное молоко, желудочно-кишечные выделения и выделения слизи дыхательных и мочеполовых путей. IgE представляет собой иммуноглобулин, который опосредует гиперчувствительность немедленного типа, вызывая высвобождение медиаторов из тучных клеток и базофилов при воздействии аллергена.

Используемый в настоящем документе термин «иммунный ответ» определяется как клеточный ответ на антиген, который возникает, когда лимфоциты идентифицируют антигенные молекулы как чужеродные и вызывают образование антител и/или активируют лимфоциты для удаления антигена.

Используемый в настоящем документе термин «липокалин» определяется как класс белков, которые в своей естественной среде функционируют для переноса небольших гидрофобных молекул, таких как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. У них общие ограниченные области гомологии последовательностей и общая архитектура третичной структуры, содержащая восьмицепочечный антипараллельный бета-ствол с повторяющейся топологией + 1, включающей внутренний сайт связывания лиганда. Липокалины обнаружены в грамотрицательных бактериях, клетках позвоночных, клетках беспозвоночных и в растениях и ассоциированы со многими биологическими процессами, среди которых иммунный ответ, транспорт феромонов, биологический синтез простагландина, связывание ретиноидов и взаимодействия раковых клеток. Липокалины можно модифицировать многими из способов, описанных для модификации антител, чтобы изменить или усилить их связывающие свойства, например, свойства связываться с молекулой клеточной поверхности и, таким образом, блокировать, усиливать или иным образом изменять ее функциональные свойства.

Используемый в настоящем документе «инструктивный материал» включает в себя публикацию, запись, схему или любое другое средство выражения, которое можно использовать для сообщения о полезности композиций и способов согласно настоящему изобретению. Инструктивный материал набора согласно настоящему изобретению, например, может быть прикреплен к контейнеру, который содержит нуклеиновую кислоту, пептид и/или композицию согласно настоящему изобретению, или может транспортироваться вместе с контейнером, который содержит нуклеиновую кислоту, пептид и/или композицию. В качестве альтернативы, инструктивный материал может быть доставлен отдельно от контейнера с намерением, чтобы инструктивный материал и соединение использовались реципиентом совместно.

«Выделенный» означает измененное или удаленное из естественного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, естественно присутствующие в живом животном, не «выделены», но та же самая нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих материалов в их естественном состоянии, являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме или могут существовать в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.

Используемый в настоящем документе термин «лентивирус» относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы уникальны среди ретровирусов тем, что способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительный объем генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они являются одним из наиболее эффективных методов вектора доставки генов. HIV, SIV и FIV - все это примеры лентивирусов. Векторы, полученные из лентивирусов, предлагают средства для достижения значительных уровней переноса генов in vivo.

Под используемым в настоящем документе термином «модифицированный» подразумевается измененное состояние или структура молекулы или клетки согласно настоящему изобретению. Молекулы могут быть изменены разными способами, в том числе химически, структурно и функционально. Клетки можно модифицировать путем введения нуклеиновых кислот.

Под используемым в настоящем документе термином «модуляция» подразумевается опосредование обнаруживаемого увеличения или уменьшения уровня ответа у субъекта по сравнению с уровнем ответа у субъекта в отсутствие лечения или соединения, и/или по сравнению с уровнем ответа у идентичного в остальном, но не получившего лечение субъекта. Термин включает в себя возмущение и/или влияние на нативный сигнал или ответ, тем самым опосредуя благоприятный терапевтический ответ у субъекта, предпочтительно человека.

В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для обычно встречающихся оснований нуклеиновых кислот.«А» относится к аденозину, «С» относится к цитозину, «G» относится к гуанозину, «Т» относится к тимидину, a «U» относится к уридину.

Если не указано иное, «нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность» включает в себя все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза «нуклеотидная последовательность, кодирующая белок или РНК» может также включать в себя интроны в той степени, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторой версии содержать интрон(ы).

Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональном отношении со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, если необходимо соединить две области, кодирующие белок, в одной и той же рамке считывания.

Термин «избыточно экспрессированный» опухолевый антиген или «избыточная экспрессия» опухолевого антигена предназначен для обозначения аномального уровня экспрессии опухолевого антигена в клетке из области заболевания, такой как солидная опухоль, в конкретной ткани или органе пациента относительно уровень экспрессии в нормальной клетке этой ткани или органа. Пациенты с солидными опухолями или гематологическими злокачественными новообразованиями, характеризующимися избыточной экспрессией опухолевого антигена, могут быть определены стандартными анализами, известными в настоящей области техники.

«Парентеральное» введение иммуногенной композиции включает в себя, например, подкожные (п/к), внутривенные (в/в), внутримышечные (в/м) или интрастемальные инъекции или методы инфузии.

Используемый в настоящем документе термин «полинуклеотид» определяется как цепь нуклеотидов.

Кроме того, нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры нуклеотидов. Таким образом, нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды, используемые в настоящем документе, являются взаимозаменяемыми. Специалисту в настоящей области техники известно, что нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотиды, которые можно гидролизовать до мономерных «нуклеотидов». Мономерные нуклеотиды можно гидролизовать до нуклеозидов. Как используется в настоящем документе, полинуклеотиды включают в себя без ограничения все последовательности нуклеиновых кислот, которые получены любыми доступными способами в настоящей области техники, включая в себя без ограничения рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновых кислот из рекомбинантной библиотеки или клеточного генома с использованием обычной технологии клонирования и ПЦР™ и т.п., а также синтетические способы.

В настоящем документе термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и нет ограничений на максимальное количество аминокислот, которые могут составлять последовательность белка или пептида. Полипептиды включают в себя любой пептид или белок, состоящий из двух или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Используемый в настоящем документе термин относится как к коротким цепям, которые в настоящей области техники также обычно называют пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, так и к более длинным цепям, которые, как правило, называются в настоящей области техники белками, которых существует множество типов. «Полипептиды» включают в себя, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки, среди прочего. Полипептиды включают в себя природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинации.

В настоящем документе термины «слитый белок» и «химерный белок» используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из двух или более полипептидов. Согласно некоторым вариантам осуществления два или более полипептидов ковалентно связаны. Согласно дополнительным вариантам осуществления два или более полипептида ковалентно связаны пептидными связями, линкерами или дисульфидными связями. Слитые белки могут быть получены рядом способов, которые хорошо известны специалистам в настоящей области техники, чаще всего путем введения в клетку вектора(ов), содержащего(их) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует или определяет аминокислотную последовательность слитого белка.

Дополнительные аминокислоты или полипептиды могут быть включены в слитый белок для проявления дополнительных функциональных свойств, например стабильности, периода полужизни, мультимеризации, простоты очистки. Примером такого элемента является полипептидный линкер.

Используемый в настоящем документе термин «промотор» определяется как последовательность ДНК, распознаваемая синтетическим аппаратом клетки или введенная синтетическим аппаратом, необходимая для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Используемый в настоящем документе термин «промоторная/регуляторная последовательность» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая требуется для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может быть последовательностью корового промотора, а в других случаях эта последовательность может также включать в себя энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Промоторная/регуляторная последовательность может, например, быть последовательностью, которая экспрессирует продукт гена тканеспецифическим образом.

«Конститутивный» промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, когда она функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает образование продукта гена в клетке в большинстве или во всех физиологических условиях клетки.

«Индуцибельный» промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, когда она функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает образование продукта гена в клетке, по существу, только тогда, когда в клетке присутствует индуктор, который соответствует промотору.

«Тканеспецифический» промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, когда она функционально связана с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает образование генного продукта в клетке, по существу, только если клетка является клеткой типа ткани, соответствующего промотору.

«Путь передачи сигнала» относится к биохимическим отношениям между множеством молекул передачи сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Фраза «рецептор клеточной поверхности» включает в себя молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через плазматическую мембрану клетки.

Под термином «специфически связывается», используемым в настоящем документе в отношении антитела, подразумевается антитело, которое распознает конкретный антиген, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце. Например, антитело, которое специфически связывается с антигеном одного вида, может также связываться с этим антигеном одного или нескольких видов. Но такая межвидовая реактивность сама по себе не меняет классификации антитела как специфического. В другом примере антитело, которое специфически связывается с антигеном, может также связываться с различными аллельными формами антигена. Однако такая перекрестная реактивность сама по себе не меняет классификации антитела как специфического. В некоторых случаях термины «специфическое связывание» или «специфически связывающий» могут использоваться в отношении взаимодействия антитела, белка или пептида со вторым химическим соединением, что означает, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) химического соединения; например, антитело распознает и связывается с конкретной структурой белка, а не с белками в целом. Если антитело специфично к эпитопу «А», присутствие молекулы, содержащей эпитоп А (или свободного немеченого А), в реакции, содержащей меченый «А» и антитело, снизит количество меченого А, связанного с антителом.

Термин «субъект» предназначен для обозначения живых организмов, у которых может быть вызван иммунный ответ (например, млекопитающие). Используемый в настоящем документе «субъект» или «пациент» может представлять собой человека или млекопитающего, не являющегося человеком. К млекопитающим, не являющимся человеком, относятся, например, домашний скот и домашние животные, такие как овцы, коровы, свиньи, собаки, кошачьи и мышиные млекопитающие. Предпочтительно субъектом является человек.

В настоящем документе «по существу очищенная» клетка представляет собой клетку, которая практически не содержит других типов клеток. По существу очищенная клетка также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток, в других случаях этот термин относится просто к клеткам, которые были отделены от клеток, с которыми они естественным образом связаны в своем естественном состоянии. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки культивируют in vitro. Согласно другим вариантам осуществления клетки не культивируют in vitro.

«Целевой сайт» или «целевая последовательность» относится к последовательности геномной нуклеиновой кислоты, которая определяет часть нуклеиновой кислоты для захвата связывающей молекулы, которая может специфически связываться в условиях, достаточных, чтобы произошло связывание.

Используемый в настоящем документе термин «терапевтический» означает лечение и/или профилактику. Терапевтический эффект достигается путем подавления, ремиссии или устранения болезненного состояния.

Используемый в настоящем документе термин «трансфицированный», или «трансформированный», или «трансдуцированный» относится к процессу, посредством которого экзогенная нуклеиновая кислота переносится или вводится в клетку-хозяин. «Трансфицированная», или «трансформированная», или «трансдуцированная» клетка представляет собой клетку, которая была трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает в себя первичную клетку субъекта и ее потомство.

Термин «трансген» относится к генетическому материалу, который был или будет искусственно вставлен в геном животного, особенно млекопитающего и, более конкретно, клетки млекопитающего живого животного.

«Лечить» заболевание, как этот термин используется в настоящем документе, означает снизить частоту или серьезность по меньшей мере одного признака или симптома заболевания или нарушения, испытываемого субъектом.

Используемые в настоящем документе фразы «под контролем на уровне транскрипции» или «функционально связанный» означают, что промотор находится в правильном положении и ориентации по отношению к полинуклеотиду, чтобы контролировать инициацию транскрипции РНК-полимеразой и экспрессию полинуклеотида.

«Вектор» представляет собой смесь веществ, химически или механически связанных между собой, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которая может использоваться для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Известно множество векторов в настоящей области техники, включая в себя без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы.

Таким образом, термин «вектор» включает в себя автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Термин также следует понимать как включающий в себя неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, соединения полилизина, липосомы и т.п. Примером плазмидного вектора является эписомный вектор, в котором саморепликация управляется или усиливается регуляторными элементами, происходящими от вируса, например вируса Эпштейна-Барра и вируса ВК. Примеры вирусных векторов включают в себя без ограничения векторы вируса Сендай, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п.

Диапазоны: в настоящем раскрытии различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона дано просто для удобства и краткости и не должно толковаться как строгое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Если любая аминокислотная последовательность конкретно обозначена идентификационным номером GENBANK®, последовательность включена в настоящий документ в качестве ссылки, частично и/или полностью. Информация, связанная с идентификационным номером, такая как идентификация сигнального пептида, внеклеточного домена, трансмембранного домена, промоторной последовательности и начала трансляции, также включена в настоящий документ посредством ссылки, частично и/или полностью.

Как предусмотрено в настоящем изобретении в отношении раскрытых смесей химически связанных веществ и способов, согласно одному аспекту варианты осуществления настоящего изобретения содержат компоненты и/или стадии, раскрытые в настоящем документе. Согласно другому аспекту варианты осуществления настоящего изобретения состоят по существу из компонентов и/или стадий, раскрытых в настоящем документе. Согласно еще одному аспекту варианты осуществления настоящего изобретения состоят из компонентов и/или стадий, раскрытых в настоящем документе.

Описание

Предусмотрен слитый белок. Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления указанный первый компонент слитого белка блокирует хемокиновый рецептор, например, CXCR4 и/или CXCR7 (посредством связывания пептида vMIPII или V1 или его производных в слитом белке), и эта блокада служит для иммобилизации опухолевых клеток и чтобы препятствовать его миграционным, инвазивным, метастатическим и другим онкогенным свойствам; указанный второй компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на указанной опухолевой клетке, например, PD-L1 и/или PD-L2 (посредством связывания PD1 или его производных в слитом белке), и эта блокада служит для того, чтобы препятствовать ингибированию направленной на опухоль иммунной эффекторной клетки, например NK-клетки; и указанный третий компонент слитого белка запускает активирующий рецептор на той же иммунной эффекторной клетке, например, рецептор FcγRIIIa (посредством связывания Fey или его производных в слитом белке), который управляет активацией NK-клеток и способствует ADCC и ADCP.

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на опухоли или другой клетке, а два других компонента запускают различный активирующий рецептор на иммунной эффекторной клетке. Согласно некоторым вариантам осуществления, когда ингибитор контрольной точки находится на опухолевой клетке, слитый белок образует молекулярный мостик между иммунной эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью. Кроме того, три взаимодействия слитого белка, комбинация блокады пути ингибирования контрольной точки и запуск активирующего рецептора, служат для функционального усиления друг друга, все три совместно управляют активацией указанной иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки. Согласно предпочтительному варианту осуществления ингибитор контрольной точки, блокируемый слитым белком, состоит из PD-L1, PD-L2, CD113, CD112, CD155 или CD111, и два активирующих рецептора, совместно запускаемых слитым белком, представляют собой рецептор FcγRIIIa и 4-1 ВВ на NK-клетке.

Слитые белки

Предусмотрен слитый белок, содержащий компонент А и/или компонент В; причем компонент А содержит компонент Y, компонент Z₂ и компонент Z₃; и причем компонент В содержит компонент X', компонент Z₂' и компонент Z₃'. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В дополнительно содержит компонент Z1'. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления компонент В содержит компонент X', компонент Z₁', компонент Z₂' и компонент Z₃'.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А дополнительно содержит компонент Z₁. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит компонент Y, компонент Z₁, компонент Z₂ и компонент Z₃.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент С, причем компонент С содержит компонент X и компонент C_L'. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент C_L' содержит по меньшей мере часть легкой цепи иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент D, причем компонент D содержит компонент Q и компонент C_L. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент C_L содержит по меньшей мере часть легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А дополнительно содержит лидерную последовательность. Согласно дополнительным вариантам осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность альбумина человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В дополнительно содержит лидерную последовательность. Согласно дополнительным вариантам осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность альбумина человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Y содержит домен лиганда, домен рецептора, домен scFv или домен липокалина. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент Y содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48. Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок связывает PD-L1 или PD-L2.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₃ содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен СН1. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₂ содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен СН2. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₃ содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен СН3. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₁' содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен CH₁. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₂' содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой СН2 домен. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₃' содержит домен иммуноглобулина, представителя суперсемейства TNF, представителя суперсемейства TNF-L, трансферрина, рецептора трансферрина, сывороточного альбумина человека или липокалина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен СН3. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgG. Согласно дополнительным вариантам осуществления иммуноглобулин представляет собой IgE.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью скрининга высокой производительности (HTS) пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит пептидную последовательность, которая связывает хемокиновый рецептор, цитокиновый рецептор, контррецептор для функционального лиганда, интегрин, лиганд или часть мембрано-сигнального комплекса. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRT AM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть vMIP-II. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент X' содержит полипептиды V1 или V1дельта. Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок связывает CXCR4.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Q содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда пептид, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью HTS пептид. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент X содержит полипептиды V1 или V1дeльтa. Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок связывает CXCR4.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Y и компонент Z₂ соединены посредством шарнира, например шарнира IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z₁' и компонент Z₂' соединены посредством шарнира, например шарнира IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' и компонент Z₁' соединены посредством линкера. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X и компонент C_L соединены посредством линкера.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент А и Fc. Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок содержит компонент А и FcB человека (hFcB).

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент В и Fc. Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок содержит компонент В и FcA человека (hFcA).

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В связаны ковалентно. Согласно некоторым вариантам осуществления ковалентная связь осуществляется через дисульфидную связь или через линкер.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В не связаны ковалентно. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В удерживаются вместе посредством взаимодействия «выступы-во-впадины». Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В содержат мутации «выступы-во-впадины» и ковалентное связывание через дисульфидную связь. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит мутации Y349C и T366W, а компонент В содержит мутации D356C, T366S, L368A и Y407V (мутации «выступы-во-впадины»). Положения мутаций и изменений в этих цепочках компонентов определены соглашением о нумерации Kabat (Johnson, G and Wu, TT, (2001) Nucleic Acids Res., 28(1), 214-18).

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент А и домен иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен Fc.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент В и домен иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления домен иммуноглобулина представляет собой домен Fc.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В и компонент С связаны ковалентно. Согласно некоторым вариантам осуществления ковалентная связь осуществляется через дисульфидную связь.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В и компонент С не связаны ковалентно.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент D связаны ковалентно. Согласно некоторым вариантам осуществления ковалентная связь осуществляется через дисульфидную связь.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент D не связаны ковалентно.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок связывает рецептор или лиганд на иммунной клетке.

Согласно некоторым вариантам осуществления рецептор представляет собой рецептор Fc.

Кроме того, предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и слитый белок согласно любому из предыдущих вариантов осуществления.

Кроме того, предусмотрен способ лечения пролиферативного нарушения у пациента, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества слитого белка согласно любому из предыдущих вариантов осуществления пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Согласно некоторым вариантам осуществления пролиферативное нарушение представляет собой рак. Согласно дополнительным вариантам осуществления рак представляет собой солидную опухоль. Согласно дополнительным вариантам осуществления рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, меланому, глиобластому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML) множественную миелому, рак толстой кишки, рак легких, рак печени или любой тип солидной опухоли или гемобластоза

Настоящее изобретение относится к новым слитым белкам, применимым для лечения пролиферативных нарушений, таких как рак. На клетке, экспрессирующей рецептор или лиганд для компонента Y и рецептор или лиганд для компонента X', слитый белок согласно настоящему изобретению может блокировать один или оба рецептора или лиганда. Таким образом, на клетке, коэкспрессирующей рецептор или лиганд для компонента Y и рецептор или лиганд для компонента X', слитый белок согласно настоящему изобретению может приводить к гибели, иммобилизации и выведению опухолевой клетки. Кроме того, на клетке, экспрессирующей рецептор или лиганд для компонента Из или компонента Z₃', например, на клетке - естественном киллере (NK), слитый белок согласно настоящему изобретению может запускать рецептор или лиганд и может приводить к активации клетки. Таким образом, слитый белок согласно настоящему изобретению может опосредовать свою активность, охватывая две со седине клетки. Кроме того, слитый белок согласно настоящему изобретению может связывать три или более отдельных молекул на указанных клетках. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок может действовать для лечения такого заболевания, как рак, вызывая ингибирование или уменьшение количества определенных клеток, или активацию или увеличение количества определенных клеток.

Компонент А

Компонент А содержит компонент Y, компонент и компонент Z₃.

Компонент Y

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Y содержит домен лиганда, домен рецептора, домен верили домен липокалина. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент Y содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A(CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRT AM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CMS.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или со стоит из:

(SEQ ID NO: 1) внеклеточный домен PD-1 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_005018.3.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 2) высокоаффинный внеклеточный домен PD-1 человека.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 3) внеклеточный домен TIGIT человека, идентификационный номер GENBANK® NM_173799.4.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 4) внеклеточный домен CD96 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_198196.2.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 5) внеклеточныйдомен CD 112R человека, идентификационный номер GENBANK® NM_024070.3.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ IN NO: 6) внеклеточный домен CD226 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_006566.3.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 7) внеклеточный домен NECL2 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_014333.3.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 8) внеклеточный домен CD113 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_015430.3.

Иллюстративная последовательность для компонента Y содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 9) внеклеточный домен MICA (последовательность А, родственная полипептиду МНС-I) человека, идентификационный номер GENBANK® NM_000247.3.

Лидерная последовательность

Иллюстративная последовательность для лидерной последовательности содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 10) лидерная последовательность альбумина человека.

Шарнир

Иллюстративная последовательность для шарнира содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 11)шарнир IgG человека.

Компонент Z₂

Иллюстративная последовательность для компонента Z₂ содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 12) IgG1.

Компонент Z₃

Иллюстративная последовательность для компонента Z₃ содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 13) IgG1.

Иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

PD-1-hFcA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен PD-1 человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание-домен Z₃ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

Высокоаффинный человека PD-1-hFcA

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой пинией - высокоаффинный внеклеточный домен PD-1 человека, домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание-домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

GD112R-hF сА человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD112R человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

TIGIT-hFcA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - высокоаффинный внеклеточный домен TIGIT человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

CD96-hFcA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD96 человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

CD226-hF cA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD226 человека, домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

NECL2-hF cA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен NECL2 человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

CD 113-hF cA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD113 человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента А содержит или состоит из следующего:

MICA-hF сА человека (последовательность А, родственная полипептиду МНС-I)

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен MICA человека; домен Y

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

FcA человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Компонент В

Компонент В содержит компонент X', компонент Z₂' и компонент Z₃'. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда пептид, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью HTS пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду MHC-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRT AM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Компонент X'

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 24) внеклеточный домен CD155 (рецептор полиовируса, PVR) человека, идентификационный номер GENBANK® NM_006505.5.

Иллюстративная последовательность для компонентах' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 25) внеклеточный домен TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM) человека, идентификационный номер GENBANK® NM_173799.4.

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 26) Внеклеточный домен Tim-3 мыши, идентификационный номер GENBANK® NM_134250.2. TIM-3 мыши обладает хорошим связыванием с галактином-9 человека.

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 27) внеклеточный домен CD113 человека, идентификационный номер GENBANK® NM_0154S0.3.

Лидерная последовательность

Иллюстративная последовательность для лидерной последовательности содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 10) лидерная последовательность альбумина человека.

Шарнир

Иллюстративная последовательность для шарнира содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 11) шарнир IgG человека.

Компонент Z₂

Иллюстративная последовательность для компонента Z₂ содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 12) IgG1.

Компонент Z₃'

Иллюстративная последовательность для компонента Z₃ содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 13) IgG1.

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

CD155-hFcB человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD155 (рецептор полиовируса, PVR) человека; домен X'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

TIGIT-hF cB человека

(SEQ ID NO: 33)

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM) человека; домен X'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG 1

Другая иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

TIM-3-hFcB мыши

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен TIM-3 мыши; домен X'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен I Z'₂ gG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Другая иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

CD113-hFcB человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - внеклеточный домен CD113 человека; домен X'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

FcB человека

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Компонент В, содержащий компонент Z₁'

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В дополнительно содержит компонент Z₁'. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления компонент В содержит компонент X', компонент Z₁', компонент Z₂' и компонент Z₃'.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит производный от вируса пептид, производный от лиганда пептид, производный от рецептора пептид или выбранный с помощью HTS пептид. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент X' содержит по меньшей мере часть CD155, TIGIT, TIM-3 или CD113.

Компонент X'

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 37) vMIPII, идентификационный номер GENBAMK® YP_001129362.

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 33) V1

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 39) V1Δ

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 40) V1Δmut

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 41) Vp1

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 42) Vp1Δ

Иллюстративная последовательность для компонента X' содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 43) Vp1Δmut

Лидерная последовательность

Иллюстративная последовательность для лидерной последовательности содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 10) лидерная последовательность альбумина человека.

Компонент Z₁'

Иллюстративная последовательность для компонента содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 45)

Шарнир

Иллюстративная последовательность для шарнира содержит или состоит из:

Компонент Z₂'

Иллюстративная последовательность для компонента Z₂' содержит или состоит из:

Компонент Z₃'

Иллюстративная последовательность для компонента Z₃' содержит или состоит из:

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из: vMIPII-CH'-hFcB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека Подчеркивание волнистой линией - vMIPII

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между VI, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

V1-CH'-hFcB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1 (V1 представляет собой первые 21 аминокислоту VMIPII)

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между VI, V1Δ V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

V1Δ-CH'-hF cB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1Δ(V1Δ представляет собой V1 с мутацией С на А в аминокислоте 11, которая увеличивает димериззцию двух пептидов V1)

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

V1Δmut-CH'-hF cB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1Δmut (V1Δmut имеет туже мутацию С на А в аминокислоте 11, что и V1, но была добавлена мутация K на А в аминокислоте 9, которая предотвращает связывание с рецептором)

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из:

Vn1-CH'-hFcB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1 (Vp1 - это первые 34 аминокислоты vMIPII)

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Иллюстративная последовательность для компонента В содержит или состоит из: Vp1Δ-CH'-hFcB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1Δ

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Vp1Δmut-CH'-hFcB

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1Δmut

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией, жирный шрифт - СН'

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z'₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z'₃ IgG1

Компонент С

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент С, причем компонент С содержит компонент X и компонент C_L'.

Компонент X

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 37) vMIPII, идентификационный номер GENBANK® YP_001129362.

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 38) V1

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 39)V1Δ

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 40) V1Δmut

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 41) Vp1

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 40) Vp1Δ

Иллюстративная последовательность для компонента X содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 43) Vp1Δmut

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент X и компонент X' являются одинаковыми. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент X и компонент X' являются различными.

Лидерная последовательность

Иллюстративная последовательность для лидерной последовательности содержит или состоит из:

(SEQ ID NO: 10) лидерная последовательность альбумина человека

Компонент C_L'

Иллюстративная последовательность для компонента C_L' содержит или состоит из:

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

vMIPII-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - vMIPII

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между VI, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

V1-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

V1Δ-CL'

(SEQ ID NO: 59)

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1Δ

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

V1Δmut-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - V1Δmut

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

Vp1-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

Vn1Δ-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1Δ

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1Δ и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Иллюстративная последовательность для компонента С содержит или состоит из:

Vn1Δmut-CL'

Курсив - лидерная последовательность альбумина человека

Подчеркивание волнистой линией - Vp1Δmut

Подчеркивание волнистой линией, жирный шрифт - Аминокислотные различия между V1, V1A и V1Δmut

Подчеркивание жирной линией - CL'

Компонент D

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок дополнительно содержит компонент D, причем компонент D содержит компонент Q и компонент C_L. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Q содержит по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду MHC-I (MICA), NKG2A(CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD4S.

Иллюстративная последовательность для компонента Q содержит или состоит из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Q и компонент Y являются одинаковыми. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент Q и компонент Y являются различными.

Компонент C_L

Иллюстративная последовательность для компонента C_L содержит или состоит из:

Конфигурация слитого белка

Согласно некоторым вариантам осуществления слитого белка согласно настоящему изобретению, когда он получен рекомбинантными способами, описанными в другом месте в настоящем документе, кодирующие последовательности компонентов компонента А слиты вместе внутри рамки, либо напрямую, либо через линкер. Используемый в настоящем документе термин «напрямую» относится к слиянию двух компонентов без промежуточного пептидного линкера (т.е. в экспрессионном конструкте кодоны, кодирующие компонент Y, компонент Z₂ и компонент Z₃, являются смежными). Используемый в настоящем документе термин «слитый внутри рамки» означает, что экспрессия слитых кодирующих последовательностей дает в результате слитый белок, содержащий все полипептидные компоненты, например, согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит все из полипептидных компонентов компонента Y, компонента Z₂ и компонент Z₃ внутри рамки.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитого белка согласно настоящему изобретению, когда он получен рекомбинантными способами, описанными в другом месте в настоящем документе, кодирующие последовательности компонентов компонента В слиты вместе внутри рамки, либо напрямую, либо через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления в экспрессионном конструкте для компонента В, кодоны, кодирующие компонент X', компонент Z₂ и компонент Z₃', являются смежными. Согласно дополнительным вариантам осуществления в экспрессионном конструкте для компонента В, кодоны, кодирующие компонент X', компонент Z₁', компонент Z₂ и компонент Z₃', являются смежными. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В содержит все из полипептидных компонентов компонента X', компонента Z₂ и компонента Z₃' внутри рамки. Согласно дополнительным вариантам осуществления компонент В содержит все из полипептидных компонентов компонента X', компонента Z₁', компонента Z₂' и компонента Z₃' внутри рамки.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитого белка согласно настоящему изобретению, когда он получен рекомбинантными способами, описанными в другом месте в настоящем документе, кодирующие последовательности компонентов компонента С слиты вместе внутри рамки, либо напрямую, либо через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления в экспрессионном конструкте для компонента С, кодоны, кодирующие компонент X и компонент C_L', являются смежными. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент С содержит все из полипептидных компонентов компонента X и компонента C_L' внутри рамки.

Согласно некоторым вариантам осуществления любой компонент А и любой компонент В можно смешивать и сочетать друг с другом. Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления слитого белка согласно настоящему изобретению компонент А и компонент В являются такими, как показано в таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В из таблицы 1 можно смешивать и сочетать друг с другом и с дополнительными вариантами компонента А и компонента В. Указанные дополнительные варианты также можно смешивать и сочетать друг с другом. Дополнительные варианты компонента А или компонента В могут содержать по меньшей мере часть PD-1, TIGIT, CD96, CD112R, CD113, CD155, CD111, CD112, последовательности А, родственной полипептиду МНС-I (MICA), NKG2A (CD94), MICB, ULBP1-5, TIM-3, CD226, NECL2, CRTAM, CD80, CTLA-4, KIR2DL1/2/3 или CD48.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент А и hFcB. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок содержит компонент В и hFcA.

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует ингибирующий рецептор, а каждый из двух других компонента слитого белка запускает различные активирующие рецепторы. Согласно предпочтительному варианту осуществления эти три рецептора совместно расположены на поверхности одной и той же иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки, и три взаимодействия слитого белка, состоящие из комбинации блокады ингибирующего рецептора и запуска активирующего рецептора, служат для усиления друг друга, при этом все три совместно управляют активацией NK-клетки.

Согласно другим иллюстративным вариантам осуществления каждый из двух компонентов слитого белка блокирует различные ингибирующие рецепторы, а один другой компонент слитого белка запускает активирующий рецептор. Согласно предпочтительному варианту осуществления эти три рецептора совместно расположены на поверхности одной и той же иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки, и три взаимодействия слитого белка, состоящие из комбинации блокады ингибирующего рецептора и запуска активирующего рецептора, служат для функционального усиления друг друга, при этом все три совместно управляют активацией NK-клетки.

Согласно другим иллюстративным вариантам осуществления каждый из трех компонентов слитого белка запускает активирующий рецептор. Согласно предпочтительному варианту осуществления эти три рецептора совместно расположены на поверхности одной и той же иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки, и три взаимодействия слитого белка, все из которых состоят из запуска активирующего рецептора, служат для функционального усиления друг друга, при этом все три совместно управляют активацией NK-клетки.

Для NK-клеток активирующий рецептор согласно вышеупомянутым вариантам осуществления может представлять собой рецептор FcγRIIIa, который управляет активацией NK-клеток и способствует антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и антителозависимому клеточному фагоцитозу (ADCP).

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления слитый белок содержит компонент В и компонент С. Согласно некоторым вариантам осуществления любой компонент В и любой компонент С можно смешивать и сочетать друг с другом. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В и компонент С являются такими, как показано в таблице 2. Согласно некоторым вариантам осуществления каждая строка таблицы 2 показывает образование пары компонента В и компонента С в слитом белке.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В удерживаются вместе посредством стабилизированных дисульфидной связью взаимодействий «выступы-во-впадины)) (KiHs-s). Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит мутации Y349C и T366W (например, SEQ ID NO: 29), а компонент В содержит мутации D356C, T366S, L36SA и Y407V (например, SEQ ID NO: 30) (мутации «выступы-во-впадиный), что делает возможной принудительную димеризацию компонента А и компонента В. Компоненты Z₁, Z₂ и Z₃ основаны на полипептидном аминокислотном каркасе доменов CH1, СН2 и СН3 IgG1 человека соответственно. Положения мутаций и изменений в этих цепях компонентов определены соглашением о нумерации Kabat (Johnson, G and Wu, TT (2011) Nucleic Acids Res., 28(1), 214-18) и основаны на последовательность человеческого IgG1 дикого типа.

Человеческий IgG1 дикого типа (домены СН1, СН2 и СН3) (начиная с аминокислоты номер 118)

Подчеркивание волнистой линией - домен Z₁ IgG1

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит или состоит из следующей последовательности (Y349C и T366W):

Подчеркивание волнистой линией - домен Z₁ IgG1 (SEQ ID NO: 67) (см, например, фигуру 1а)

Жирный шрифт - шарнирная область IgG1 (SEQ ID NO: 63)

S* - По сравнению с диким типом, эта мутация была добавлена в шарнирную область для устранения неспаренного цистеина (С), который мог аберрантно связываться с другим цистеином

Двойное подчеркивание - домен Z₂ IgG1 (SEQ ID NO: 69)

А** - Добавлена мутация для уменьшения связывания C1q (см, например, фигуру 1а)

Подчеркивание жирной линией - домен Z₃ IgG1 (SEQ ID NO: 44)

L*** и S*** - Добавлена мутация для увеличения связывания FcRn (см., например, фигуру 1а)

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент В содержит или состоит из следующей последовательности (D356C, T366S, L36SA и Y407V):

Подчеркивание волнистой линией - домен Z₁' IgG1

Компоненты, показанные в таблицах 1 и 2, предназначены для использования в качестве примера и не являются ограничивающими.

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует рецептор опухолевой клетки, который способствует онкогенности и/или метастатическому потенциалу указанной опухолевой клетки; второй компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на указанной опухолевой клетке; и третий компонент слитого белка запускает активирующий рецептор на иммунной эффекторной клетке. Без ограничения какой-либо теорией, слитый белок служит молекулярным мостиком между иммунной эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью, а второй и третий компоненты слитого белка служат для усиления друг друга посредством комбинации блокирования ингибитора контрольной точки и запуска активирующего рецептора на иммунной эффекторной клетке, например, NK-клетке, совместно управляющих активацией указанной иммунной эффекторной клетки.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный первый компонент слитого белка блокирует хемокиновый рецептор, например, CXCR4 и/или CXCR7 (посредством связывания пептида vMIPII или V1 или его производных в слитом белке), и эта блокада служит для иммобилизации опухолевых клеток и чтобы препятствовать его миграционным, инвазивным, метастатическим и другим онкогенным свойствам; указанный второй компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на указанной опухолевой клетке, например, PD-L1 и/или PD-L2 (посредством связывания PD1 или его производных в слитом белке), и эта блокада служит, чтобы препятствовать ингибированию направленной на опухоль иммунной эффекторной клетки, например NK-клетки; и указанный третий компонент слитого белка запускает активирующий рецептор на той же иммунной эффекторной клетке, например, рецептор FcγRIIIa (посредством связывания Fey или его производных в слитом белке), который управляет активацией NK-клеток и способствует ADCC и ADCP. Благоприятный признак указанного варианта осуществления заключается в том, что тот же слитый белок также скоординированно модулирует другие иммунные клетки, помимо NK-клеток, с суммарным противоопухолевым эффектом (см. фиг. 5).

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на опухоли или другой клетке, а каждый из двух других компонентов запускает различный активирующий рецептор на иммунной эффекторной клетке. Когда ингибитор контрольной точки находится на опухолевой клетке, слитый белок в действительности служит молекулярным мостиком между иммунной эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью. Кроме того, три взаимодействия слитого белка, комбинация блокады пути ингибирования контрольной точки и запуска активирующего рецептора, служат для функционального усиления друг друга, все три совместно управляют активацией указанной иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки. Согласно предпочтительному варианту осуществления ингибитор контрольной точки, блокируемый слитым белком, состоит из PD-L1, PD-L2, CD113, CD112, CD155 или CD111, и два активирующих рецептора, совместно запускаемых слитым белком, являются рецептором FcγRIIIa и 4-1 ВВ на NK-клетке (см. фиг. 6).

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует ингибитор контрольной точки на опухоли или другой клетке; второй компонент слитого белка блокирует коингибирующий рецептор для того же или другого ингибитора контрольной точки на иммунной эффекторной клетке; и третий компонент слитого белка запускает активирующий рецептор на иммунной эффекторной клетке. Когда ингибитор контрольной точки находится на опухолевой клетке, слитый белок в действительности служит молекулярным мостиком между иммунной эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью, а три взаимодействия слитого белка, комбинация блокады пути ингибирования контрольной точки и запуска активирующего рецептора, служат, чтобы функционально усиливать друг друга, при этом все три совместно управляют активацией указанной иммунной эффекторной клетки, например, NK-клетки. Согласно предпочтительному варианту осуществления ингибитор контрольной точки, блокируемый первым компонентом слитого белка, состоит из PD-L1, PD-L2, CD113, CD112, CD155 или CD111; коингибирующий рецептор HaNK-клетке, блокируемой слитым белком, состоит из PD-1, TIGIT, CD96 или CD112R; и активирующий рецептор, запускаемый слитым белком, представляет собой рецептор FcγRIIIa той же самой NK-клетки (см. фиг. 7).

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует рецептор, ингибирующий сигнал «не ешь меня», на ассоциированном с опухолью макрофаге типа Ml, тем самым высвобождая его противоопухолевую фагоцитарную и другие активности; каждый из двух других компонентов слитого белка запускает отдельный активирующий рецептор на указанном ассоциированном с опухолью макрофаге. Три взаимодействия слитого белка, комбинация блокирования пути ингибирования макрофагов и запуска отдельных активирующих рецепторов на макрофаге, служат для функционального усиления друг друга, все три совместно управляют активацией ассоциированного с опухолью макрофага и способствуют его противоопухолевым функциям. Согласно предпочтительному варианту осуществления рецептор «не ешь меня», блокируемый первым компонентом слитого белка, представляет собой SIRPa; активирующими рецепторами, запускаемыми слитым белком, являются CD40 и рецептор FcγRIIIa на одном и том же макрофаге (см. фиг. 8, левая панель).

Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления один компонент слитого белка блокирует рецептор, ингибирующий «не ешь меня», на ассоциированном с опухолью макрофаге типа M1, тем самым высвобождая его противоопухолевую фагоцитарную и другие активности; второй компонент слитого белка блокирует отдельный ингибирующий рецептор на указанном макрофаге; и третий компонент слитого белка запускает активирующий рецептор на указанном ассоциированном с опухолью макрофаге. Три взаимодействия слитого белка, комбинация блокирования двух путей ингибирования макрофагов и запуска активирующего рецептора на макрофаге, служат для функционального усиления друг друга, все три совместно управляют активацией и/или противоопухолевыми эффекторными функциями ассоциированного с опухолью макрофага. Согласно предпочтительному варианту осуществления рецептор «не ешь меня», блокируемый первым компонентом слитого белка, представляет собой SIRPa; ингибирующий рецептор, блокируемый вторым компонентом слитого белка, представляет собой PD-1; и активирующий рецептор, запускаемый слитым белком, представляет собой рецептор FcγRIIIa (см. фиг. 8, правая панель).

Предпочтительные варианты слитого белка согласно настоящему изобретению предусматривают цитокин или его часть или производное, которые могут быть включены в компонент А, компонент В, компонент С и/или компонент D. Он включает в себя широкий спектр цитокинов, хорошо известных в настоящей области техники, которые подразделяются на ряд различных классов, например интерлейкины, факторы некроза опухоли, интерфероны, колониестимулирующие факторы и другие; им были приписаны различные функции с рядом активирующих или ингибирующих свойств, например, адаптивный иммунитет, передача провоспалительных сигналов, передача противовоспалительных сигналов, модуляция и дифференцировка стволовых клеток, хемотаксис, фагоцитоз, цитотоксичность и противовирусные эффекты; и они были ассоциированы с рядом иммунных и неиммунных клеток-мишеней, например, с В-клетками, Т-клетками, NK-клетками, макрофагами/моноцитами, дендритными клетками, стромальными клетками костного мозга, стволовыми клетками, фибробластами, эндотелиальными клетками и эпителиальными клетками. Предпочтительные варианты осуществления предусматривают цитокины, связанные с адаптивным иммунитетом (например, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21, GM-CSF); передачей провоспалительных сигналов [например, семейство IL-1 (IL-1, FL-18, IL-33, IL-36); семейство IL-6 (IL-6, IL-11, IL-31, CNTF, СТ-1, LIF, OPN, OSM); семейство TNF-альфа (TNFα, TNFβ, BAFF, APRIL); семейство IL-17 (IL-17A-F, IL-25); семейство IFN типа I (IFNα, IFNβ, IFNK, лимитин); семейство IFN типа II (IFNγ); и семейство IFN типа III (IFN-лямбда 1/IL-29), IFN-лямбда 2/IL-28A, IFN-лямбда 3/IL-28B)]; и передачей противовоспалительных сигналов [семейство IL-12 (IL-12, IL-23, IL-27, IL-35); и семейство IL-10 (IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28, IL-29)]. См. Turner, Mark D., et al.: "Cytokines and Chemokines: At the Crossroads of Cell Signaling and Inflammatory Disease", Biochimica et Biophysica Acta 1843 (2014) 2563-2582.

vMIP-II

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать vMIP-II или его вариант. Вирусный воспалительный белок макрофагов II ( vMIP-II) представляет собой хемокин, который взаимодействует с хемокиновыми рецепторами СС и CXC, включая в себя хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR4. CCR5 и CXCR4 являются основными корецепторами, необходимыми для проникновения в клетки вируса иммунодефицита человека (HIV-1). CXCR4 также может быть обнаружен на раковых клетках, например опухолевых клетках. vMIP-II, хемокин, кодируемый вирусом герпеса человека 8 типа (HHV-8) (Moore, P.S., et al., Science, 274: 1739-1744, 1996) демонстрирует разнообразные взаимодействия с хемокиновыми рецепторами как СС, так и CXC и ингибирует проникновение HIV-1, опосредованное через CCR3, CCR5 и CXCR4. См. патентную публикацию США №2003/0220482, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. vMIP-II также связывает CXCR7, который, как и CXCR4, участвует в онкогенезе. VI (аа 1-21 vMIP-II) и родственный ему DV1 (D-аминокислотный изомер) проявляют антагонистическую активность против CXCR4 и CXCR7, но не против CCR5.

vMIP ингибирует связывание CXCL12, природного лиганда. Согласно некоторым вариантам осуществления А означает мутацию в 12-й аминокислоте, которая вызывает димеризацию между двумя пептидами компонента В и С. Согласно некоторым вариантам осуществления Amut означает мутацию 10-й аминокислоты, которая предотвращает связывание пептида, действуя как отрицательный контроль.

PD-1

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать PD-1 или его вариант. PD-1 (белок 1 запрограммированной гибели клеток), также известный как CD279, представляет собой белок на поверхности клеток, который играет роль в регулировании реакции иммунной системы на клетки. PD-1 отрицательно регулирует иммунную систему и способствует аутотолерантности, подавляя воспалительную активность Т-клеток. Без ограничения какой-либо теорией, PD-1 действует как иммунная контрольная точка посредством по меньшей мере двух механизмов. PD-1 способствует апоптозу антиген-специфических Т-клеток в лимфатических узлах. PD-1 также снижает апоптоз в регуляторных Т-клетках. PD-1 связывает лиганды PD-L1 и PD-L2, которые являются представителями семейства В7. PD-L1 и PD-L2 экспрессируются на поверхности некоторых опухолевых клеток. PD-L1, экспрессируемый на опухолевых клетках, взаимодействует с PD-1 на эффекторных Т-клетках и NK-клетках и ингибирует их функцию. Таким образом, PD-L1, экспрессируемый на опухолевых клетках, ингибирует противоопухолевую активность эффекторных Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления PD-1 - вариант слитого белка согласно настоящему изобретению представляет собой PD-1 с высокой аффинностью. Нативный PD-1 характеризуется относительно низкой аффинностью к своим лигандам PD-L1 и PD-L2. Варианты эктодомена PD-1 с более высокой аффинностью могут служить более конкурентными антагонистами для его лигандов. Контактные остатки PD-1 между человеческим PD-1 и PD-L1 мутировали и затем оценивали в отношении связывания. PD-1 с высокой аффинностью, описанный в настоящем документе, содержит десять мутировавших аминокислот, которые приводят к увеличенной аффинности к PD-L1 более чем в 10000 раз. Для получения дополнительной информации см. Maute et al., PNAS, 112(47): 6506-6514, 2015.

CD112R

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD112R или его вариант.CD112R экспрессируется на Т-клетках и NK-клетках и ингибирует активирующие ответы. CD112, широко экспрессируемый на антигенпрезентирующих клетках и опухолевых клетках, является лигандом для CD112R. CD112R конкурирует с CD226, коингибирующий рецептором, за связывание с CD112. Без ограничения какой-либо теорией, нарушение взаимодействия CD112R-CD112 может увеличить ответ Т-клеток. CD112R человека содержит единственный внеклеточный домен IgV. Описанный в настоящем документе вариант слитого белка CD112R состоит из полного эктодомена CD112R человека, связанного с шарнирным, СН2- и СН3-доменами IgG1 человека. CD112R и его варианты могут связываться с его лигандом CD112 и служить конкурентным антагонистом нативного CD112R на NK-клетках и Т-клетках, предотвращая передачу ингибирующего сигнала.

CD113

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD 113 или его вариант.CD 113, также известный как рецептор полиовируса 3 (PVRL3) или нектин-3, является представителем суперсемейства иммуноглобулинов, который образует часть адгезивных соединений. Было показано, что CD113 взаимодействует без ограничения с MLLT4, PARD3 и PTPRM. Кроме того, CD113 задействует TIGIT, CD111, CD112, CD155 и сам себя. Описанный в настоящем документе вариант слитого белка CD113 состоит из полного внеклеточного домена нативного человеческого CD113, связанного с шарнирным, СН2- и СН3-доменами IgG1 человека. Слитые белки, содержащие CD113, могут служить в качестве конкурентного антагониста нативного TIGIT на NK-клетках и Т-клетках, предотвращая передачу ингибирующих сигналов. Альтернативно, слитые белки CD113 могут связываться с CD112, CD 155 и/или CD111 и блокировать их взаимодействие с ингибирующими рецепторами CD112R, TIGIT и CD96 соответственно, восстанавливая цитотоксичность NK-клеток и Т-клеток и продукцию цитокинов.

MICA

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать последовательность А, родственную полипептиду МНС класса I (MICA), или ее вариант. MICA представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, кодируемый геном MICA, расположенным в локусе МНС.MICA не ассоциирован с β2-микроглобулином и не связывает пептиды, как обычные молекулы МНС класса I. Без ограничения какой-либо теорией, MICA может действовать как индуцированный стрессом лиганд для рецептора NKG2D. MICA широко распознается NK-клетками, γδ-Т-клетками и CD8+ αβ-Т-клетками, которые экспрессируют NKG2D на своей клеточной поверхности. Эффекторные цитолитические ответы Т-клеток и NK-клеток против опухолевых клеток, экспрессирующих MICA, инициируются в результате связывания NKG2D-MICA. Согласно некоторым вариантам осуществления вариант MICA состоит из полного эктодомена MICA, связанного с шарнирным, СН2- и СН3-доменами IgG1 человека. Запуск MICA передачи сигналов NKG2D на NK-клетках и цитотоксических Т-клетках является важным медиатором противоопухолевой активности.

CD155

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD155 или его вариант.CD155 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I в суперсемействе иммуноглобулинов. У человека CD155 кодируется геном рецептора полиовируса (PVR). CD155 участвует в создании межклеточных адгезионных контактов между эпителиальными клетками. Внешний домен CD155 опосредует прикрепление клетки к молекуле внеклеточного матрикса витронектину, в то время как его внутриклеточный домен взаимодействует с легкой цепью динеина Tctex-1/DYNLT1. Кроме того, CD 155 задействует ингибирующие NK-клетки рецепторы, TIGIT и CD96, ограничивая цитотоксичность NK-клеток, и активирующий рецептор CD226 (DNAM-1). Слитые белки, содержащие внеклеточный домен CD155, могут связываться с TIGIT или CD96 на NK- и Т-клетках и служить конкурентным антагонистом эндогенного CD155, экспрессируемого опухолевыми клетками или антигенпрезентирующими клетками (АРС). Слитые белки, содержащие CD 15 5, также могут связываться с костимулирующим рецептором, CD226, и индуцировать опосредованный NK-клетками лизис опухолевых мишеней.

TIGIT

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать TIGIT или его вариант.Согласно некоторым вариантам осуществления TIGIT представляет собой TIGIT мыши. Согласно дополнительным вариантах осуществления TIGIT представляет собой TIGIT человека. Согласно некоторым вариантам осуществления вариант TIGIT содержит полный внеклеточный IgV-подобный домен TIGIT, связанный с шарнирным, СН2- и СН3-доменами IgG1 человека.

TIGIT, также известный как Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и 1Т1М, представляет собой иммунный рецептор, присутствующий на некоторых Т-клетках и NK-клетках. TIGIT также известен как WUCAM или Vstm3. TIGIT связывается с CD155(PVR) на клетках, таких как дендритные клетки (DC) и макрофаги, с высокой аффинностью, а также с CD112(PVRL2) с более низкой аффинностью. TIGIT является ингибитором контрольной точки и избыточно экспрессируется на опухолевых антиген-специфических (ТА-специфических) CD8+ Т-клетках и CD8+ инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL) от индивидуумов с раком, например меланомой. Без ограничения какой-либо теорией, блокада TIGIT может приводить к усилению пролиферации клеток, продукции цитокинов и дегрануляции опухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток и TIL CD8+ Т-клеток. Слитые белки, содержащие TIGIT, могут связываться с его рецепторами CD155(PVR) и CD112(PVRL2) и блокировать их взаимодействие с TIGIT на NK-клетках. Нарушение взаимодействия TIGIT с его лигандами на раковых клетках восстановит цитотоксическую активность NK-клеток и продукцию цитокинов.

TIM-3

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать TIM-3 или его вариант. Т-клеточный иммуноглобулин и белок, содержащий домен муцина 3 (TIM-3), также известный как клеточный рецептор 2 вируса гепатита A (HAVCR2), представляет собой белок, который у человека кодируется геном HAVCR2. HAVCR2 представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессирующуюся на IFNγ, продуцирующую клетки CD4+ Th1 и CD8+ Tel. Экспрессия TIM-3 также была обнаружена в клетках Thl7, регуляторных Т-клетках и клетках врожденного иммунитета (дендритные клетки, NK-клетки, моноциты). TIM-3 является иммунной контрольной точкой и опосредует истощение Т-клеток. Без ограничения какой-либо теорией, TIM-3 положительно регулируется в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL), при некоторых формах рака, включая в себя без ограничения рак легкого, желудка, рак головы и шеи, шванному, меланому и фолликулярную В-клеточную неходжкинскую лимфому. Согласно некоторым вариантам осуществления вариант TIM-3 содержит полный эктодомен TIM-3, включая в себя N-концевой IgV-подобный домен, связанный с шарнирным, СН2- и СН3-доменами IgG1 человека. Слитые белки, содержащие TIM-3, могут связываться с его естественными лигандами, галектином-9, Ceacam-1 и фосфатидилсерином, и блокировать их взаимодействие с эндогенным TIM-3, экспрессируемый на NK-клетках, Т-клетках и АРС, обращая вспять истощение Т-клеток и восстанавливая цитотоксичность NK-клеток и продукцию цитокинов.

Мишени - рецепторы опухолевых клеток

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов связывается с мишенью - рецептором опухолевых клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов предотвращают связывание лиганда с мишенью - рецептором опухолевых клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления мишени - рецепторы опухолевых клеток включают в себя без ограничения хемокиновые рецепторы, рецепторы notch, ингибиторы иммунных контрольных точек и лиганды и рецепторы сосудистой сети опухоли. Согласно некоторым вариантам осуществления хемокиновый рецептор включает в себя CXCR4, CCR10 или CCR7. Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор иммунной контрольной точки включает в себя PD-L1 или PD-L2. Согласно некоторым вариантам осуществления мишень сосудистой сети опухоли включает в себя ανβ3, ανβ5, CD13 (аминопептидазу N), мишень пептида с мотивом NGF или Tie2 (рецептор для ангиопоэтина-2).

Мишени - рецепторы иммунных клеток

Согласно некоторым вариантам осуществления мишенью - рецептором иммунной клетки является CD40. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов содержат агонист scFv CD40. Согласно дополнительным вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой SIRPa. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов содержат пептид - антагонист SIRPa. Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунных клеток представляет собой 4-1ВВ. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов содержат пептид - агонист scFv 4-1ВВ или пептид - агонист 4-1ВВ.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишенью - рецептором иммунной клетки является CD96. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка по изобретению может содержать CD96 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD96.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD226 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD226.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать TIM-3 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист TIM-3.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой CD111. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD111 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD111.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой CD 112. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD112 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD112.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой CD113. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD113 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD113.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой CD115. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать CD115 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD115.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой TIGIT. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать TIGIT или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист TIGIT.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой KIR2DL1/2/или 3 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать KIR2DL1/2/или 3 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист KIR2DL1/2/или 3.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой HLA-C. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист HLA-C. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист HLA-C.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой NKG2A (CD94) или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать NKG2A (CD94) или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист NKG2A (CD94) или его варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой HLA-E. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист HLA-E. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист HLA-E.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой 2В4 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать 2В4 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист 2 В4 или его варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой CD48 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD48. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист CD48 или его варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой NKG2D или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать NKG2D или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист NKG2D или его варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления мишень - рецептор иммунной клетки представляет собой MICA/В или ULBP1 или его вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист MICA/В или ULBP1. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент слитого белка согласно настоящему изобретению может содержать антагонист или агонист MICA/В или ULBP1 или его варианта.

Согласно любому из предыдущих вариантов осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку, Т-клетку, дендритную клетку (DC), антигенпрезентирующую клетку (АРС), макрофаг или ассоциированный с опухолью макрофаг (M1).

Рецептор или лиганд иммунных клеток

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или один или несколько его компонентов связывается с рецептором или лигандом иммунных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления связывание с рецептором или лигандом иммунных клеток приводит к активации NK-клеток (продукции цитокинов (IFNy и TNF), антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и антителозависимому клеточному фагоцитозу (ADCP)). Согласно некоторым вариантам осуществления рецептор представляет собой рецептор Fc. Согласно некоторым вариантам осуществления связывание с рецептором Fc приводит к активации NK-клеток (ADCC и ADCP). Согласно некоторым вариантам осуществления рецептор Fc представляет собой рецептор Fc_γ. Fc_∈. Fc_α, Fc_μ. или Fc_δ. Согласно некоторым вариантам осуществления рецептор или лиганд иммунных клеток является представителем суперсемейства TNF или его рецептором, представителем суперсемейства TNF-L или его рецептором, трансферрином или его рецептором, человеческим сывороточным альбумином или его рецептором, или представителем структурного семейства липокалинов или его рецептором.

Линкеры

Согласно некоторым вариантам осуществления компоненты слитого белка согласно настоящему изобретению могут быть необязательно связаны через пептидный линкер. Остатки линкера могут быть выбраны из встречающихся в природе аминокислот, не встречающихся в природе аминокислот и модифицированных аминокислот. Линкер, как правило, соединяет карбокси-конец первого компонента с амино-концом второго компонента. Линкер может изменять расстояние между двумя структурными компонентами слитого белка, а также изменять гибкость этой области. Линкер может содержать любое количество аминокислот. Таким образом, линкер может содержать, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер может состоять из от 3 до 60 аминокислотных остатков, от 3 до 40 аминокислотных остатков, от 3 до 30 аминокислотных остатков, от 3 до 24 аминокислотных остатков, от 3 до 18 аминокислотных остатков, или от 3 до 15 аминокислотных остатков. Линкер может содержать, например, повторяющуюся подпоследовательность из 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков, включая в себя 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше повторов подпоследовательности.

Линкеры могут быть встречающимися в природе последовательностями или сконструированными последовательностями. Пептидные линкеры, применимые в слитом белке согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения глициновые линкеры, богатые глицином линкеры, серин-глициновые линкеры и т.п. Линкер, обогащенный глицином, содержит по меньшей мере приблизительно 50% глицина и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60% глицина. Согласно одному варианту осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность Gly-Ser или ее повторы. См., например, Huston, et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991). Согласно другому варианту осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность Gly-Lys или ее повторы. См., например, Whitlow et al., Protein Eng., 6:989 (1993). Согласно другому варианту осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность Gly-Gly-Ser или ее повторы. Согласно другому варианту осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 29) или ее повторы. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 30). Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления линкер содержит от 2 до 12 повторов Gly-Gly-Ser или Gly-Gly-Gly-Ser или Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 29). См. патент США. №6541219, где приведены примеры пептидных линкеров. Согласно одному варианту осуществления линкер может содержать последовательность GDPLVTAASVLEFGGSGGCrSEGGGSEGGGSEGGGSDI (SEQ ID NO: 31).

Линкеры являются применимыми для разделения двух компонентов слитого белка, чтобы обеспечить правильную укладку компонентов, уменьшить потенциальные стерические проблемы и/или внести вклад в оптимальное связывание рецептора. Квалифицированный специалист знаком с конструированием и выбором пептидных линкеров. См., например, Robisonetal., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5929-5934. Также доступны автоматизированные программы для конструирования пептидного линкера (например, Crasto et al., 2000, Protein Engineering 13:309-312).

Другие необязательные элементы

Слитый белок необязательно может также включать в себя дополнительные элементы, помимо компонента А, компонента В, компонента С и/или компонента D. Такие дополнительные элементы могут включать в себя без ограничения следующее: инициатор метионин, сигнальный пептид, антигенный полипептид, домен тримеризации, домен мультимеризации более высокого порядка и метка очистки, такая как His-6. Примером метки очистки является ASHHHHHHM (SEQ ID NO: 46). Согласно одному из вариантов осуществления слитый белок согласно настоящему изобретению содержит необязательный домен тримеризации.

Слитые белки согласно настоящему изобретению необязательно содержат сигнальный пептид. Сигнальные пептиды можно варьировать в соответствии с потребностями пользователя, системой экспрессии и другими факторами, как будет понятно специалисту в настоящей области техники. Сигнальные пептиды хорошо известны в настоящей области техники, и можно использовать любой требуемый сигнальный пептид, включая в себя те, которые распознаются/предсказываются общедоступным программным обеспечением распознавания сигнальных пептидов, известным специалистам в настоящей области техники.

Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок согласно настоящему изобретению содержит шарнирную область, которая обеспечивает гибкость между компонентами. См. Lobneret al. (2016) Immunol. Reviews 270:113-131. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Y и компонент Z₂ соединены через шарнир, например шарнир IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент Z_1' и компонент Z₂' соединены посредством шарнира, например шарнир IgG.

Согласно некоторым вариантам осуществления N-связанный гликан прикреплен к Asn на компоненте А и/или компоненте В. Согласно некоторым вариантам осуществления N-связанный гликан прикреплен к Asn297 на компоненте А и/или компоненте В. Без ограничения какой-либо теорией, это может способствовать связыванию FcR и может способствовать структурной целостности и термостабильности слитого белка. См. Arnold et al. (2007) Annu Rev Immunol 25:21-50.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и/или компонент В содержат мутацию К в А. Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и/или компонент В содержат мутацию К322А. Без ограничения какой-либо теорией, это может снизить связывание Clq и лизис, опосредованный комплементом. См. Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178-4184.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и компонент В содержат мутации типа «выступы-во-впадины». Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А содержит мутации Y349C и T366W, и компонент В содержит мутации D356C, T366S, L368A и Y407V (мутации «выступы-во-впадины»). Без ограничения какой-либо теорией, это может способствовать гетеродимеризации по сравнению с гомодимеризацией. См. Merchant et al. (1998) Nature Biotech. 16:677-681.

Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и/или компонент В содержат мутации, которые увеличивают связывание с неонатальным рецептором Fc (FcRn). Согласно некоторым вариантам осуществления компонент А и/или компонент В содержат мутации M428L и N434S. Без ограничения какой-либо теорией, это может увеличить связывание с неонатальным рецептором Fc (FcRn) на различных клетках, увеличивая период полужизни в сыворотке. См. Kuo and Aveson (2011) mAbs 3:422-430.

Домены тримеризации

Домены тримеризации хорошо известны в настоящей области техники. Неограничивающие примеры доменов тримеризации, подходящих в качестве домена гетерологичной тримеризации в слитом белке согласно настоящему изобретению, включают в себя следующее: лейциновая «молния» GCN4 (Harbury et al., 1993, "A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants," Science 262(5138): 1401-7); 35 аминокислотная последовательность из белка легочного сурфактанта (Норре et al., 1994, "A parallel three stranded alpha helical bundle at the nucleation site of collagen triple- helix formation" FEBS letters 344(2-3): 191-5); короткие повторяющиеся гептадные последовательности из коллагена (McAlinden et al., 2003, "Alpha-helical coiled-coil oligomerization domains are almost ubiquitous in the collagen superfamily," J Biol Chem. 278(43):42200-7. Epub 2003 Aug 14.); домен сборки фибритина бактериофага Т4 (см., например, Miroshnikov et al., 1998, "Engineering trimeric fibrous proteins based on bacteriophage T4 adhesins," Protein Eng. 11(4):329-32). Иллюстративные домены тримеризации также раскрыты в патентах США №№6911205 и 8147843 и патентной публикации США №2010/0136032. Иллюстративной последовательностью тримеризации является домен сборки Т4, характеризующийся последовательностью: GYIPEAPRDGQAYVRKRGEWVLLSTFL (SEQ NO: 47). Другой иллюстративный домен тримеризации происходит от тромбоспондина-1 и характеризуется последовательностью: VTTLQDSIRKVTEENKELANELRR (SEQ NO: 56).

Модификация

Настоящее изобретение охватывает варианты слитых белков, описанных в настоящем документе. Хотя в целом желательно, чтобы варианты демонстрировали повышенную способность к связыванию с данной молекулой, согласно некоторым вариантам осуществления варианты могут быть сконструированы со слегка пониженной активностью по сравнению с другими слитыми белками согласно настоящему изобретению, например, в тех случаях, когда хотят намеренно ослабить активность. Кроме того, могут быть созданы варианты или производные, которые имели бы измененные свойства мультимеризации.

Предпочтительно варианты или производные слитых белков согласно настоящему изобретению сохраняют гидрофобность/гидрофильность аминокислотной последовательности.

Согласно дополнительным вариантам осуществления слитый белок согласно настоящему изобретению представляет собой вариант и/или производное аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или 71. Согласно одному варианту осуществления варианты слитых белков согласно настоящему изобретению будут характеризоваться по меньшей мере 80% или более идентичности или гомологии последовательностей, как эти термины понимаются в настоящей области техники, с SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или 71, более предпочтительно по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70 или 71.

Настоящее изобретение также предусматривает химическую модификацию слитого белка согласно настоящему изобретению. Неограничивающие примеры таких модификаций могут включать в себя без ограничения алифатические сложные эфиры или амиды карбоксильного конца или остатков, содержащих боковые карбоксильные цепи, О-ацильные производные остатков, содержащих гидроксильную группу, и N-ацильные производные аминоконцевой аминокислоты или содержащих аминогруппу остатков, например лизина или аргинина.

Другие производные слитых белков согласно настоящему изобретению включают в себя включение неприродных аминокислотных остатков или фосфорилированных аминокислотных остатков, таких как остатки фосфотирозина, фосфосерина или фосфотреонина. Другие возможные модификации включают в себя сульфирование, биотинилирование или добавление других фрагментов, особенно тех, которые характеризуются молекулярной формой, подобной фосфатным группам.

Производные также включают в себя полипептиды, модифицированные гликозилированием. Они могут быть получены путем модификации паттернов гликозилирования во время синтеза и обработки в различных альтернативных системах экспрессии эукариотических хозяев или во время дальнейших стадий обработки. Способы получения модификаций гликозилирования предусматривают воздействие на слитые белки гликозилирующих ферментов, происходящих из клеток, которые обычно осуществляют такой процессинг, таких как ферменты гликозилирования млекопитающих. Альтернативно, ферменты дегликозилирования можно использовать для удаления углеводов, присоединенных во время продукции в эукариотических системах экспрессии. Кроме того, можно также модифицировать кодирующую последовательность так, чтобы сайт(ы) гликозилирования добавлялся(ись) или сайты гликозилирования удалялись или блокировались. Кроме того, если гликозилирование не требуется, белки могут продуцироваться в системе экспрессии прокариотического хозяина.

Варианты и/или производные слитых белков согласно настоящему изобретению могут быть получены путем химического синтеза или с использованием сайт-направленного мутагенеза (Gillman et al, Gene 8:81 (1979); Roberts et al., Nature 328:731 (1987) или Innis (Ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, N. Y.) или методом полимеразной цепной реакции (PCR; Saiki et al., Science 239:487 (1988)), как представлено в качестве примера примере Daugherty et al., Nucleic Acids Res. 19:2471 (1991)) для модификации нуклеиновых кислот, кодирующих полные рецепторы.

Согласно дополнительным вариантам осуществления слитые белки согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных полипептидных доменов, добавленных для облегчения очистки белка, для увеличения экспрессии рекомбинантного белка или для увеличения растворимости рекомбинантного белка. Такие домены, способствующие

очистке/экспрессии/растворимости, включают в себя без ограничения металлохелатирующие пептиды, такие как гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах (Porath, 1992, Protein Expr Purif 3-0.26328 1), домены протеина А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности FLAGS (Immunex Corp, Seattle, Wash.). Включение расщепляемой линкерной последовательности, такой как фактор Ха или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego, СА), между доменом очистки и слиянием компонентов А и В является применимым для облегчения очистки.

Слитые экспрессионные векторы включают в себя pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) и pRITS (Pharmacia, Piscataway, N.J.), которые объединяют глутатион-8-трансферазу (GST), связывающий белок мальтозы В или протеин А соответственно с целевым рекомбинантный белок. Также можно использовать EBV, BKV и другие эписомные экспрессионные векторы (Invitrogen). Кроме того, также можно использовать ретровирусные и лентивирусные экспрессионные векторы. Кроме того, любая из ряда экспрессионных систем in vivo, разработанных для высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков внутри организмов, может быть задействована для получения указанных в настоящем документе слитых белков.

Как обсуждалось выше, слитый белок согласно настоящему изобретению может содержать гетерологичную сигнальную последовательность на своем N-конце. В некоторых клетках-хозяевах (например, клетках-хозяевах млекопитающих) экспрессия и/или секреция слитого белка может быть увеличена за счет использования гетерологичной сигнальной последовательности. Сигнальные последовательности, как правило, характеризуются ядром из гидрофобных аминокислот, которые, как правило, отщепляются от зрелого белка во время секреции в одном или нескольких событиях расщепления. Такие сигнальные пептиды содержат сайты процессинга, которые позволяют отщеплять сигнальную последовательность от зрелых белков, когда они проходят секреторный путь. Таким образом, настоящее изобретение относится к описанным полипептидам, содержащим сигнальную последовательность, а также к полипептидам, от которых сигнальная последовательность была протеолитически отщеплена (то есть продуктам расщепления).

Чтобы усилить стабильность и/или реактивность, слитый белок согласно настоящему изобретению также можно модифицировать, чтобы включить один или несколько полиморфизмов в аминокислотную последовательность, возникающих в результате естественной аллельной вариации. Кроме того, D-аминокислоты, неприродные аминокислоты или аналоги, не являющиеся аминокислотами, могут быть заменены или добавлены для получения модифицированного слитого белка в пределах объема настоящего изобретения.

Аминокислотные последовательности согласно настоящему изобретению могут быть получены путем экспрессии кодирующей их нуклеотидной последовательности в подходящей системе экспрессии.

Кроме того, или в качестве альтернативы, сам слитый белок может быть получен с использованием химических способов для синтеза требуемой аминокислотной последовательности, полностью или частично. Например, полипептиды могут быть синтезированы твердофазными методами, отщеплены от смолы и очищены препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (например, Creighton (1983) Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York N.Y.). Состав синтетических полипептидов может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, процедурой деградации Эдмана). Кроме того, аминокислотная последовательность слитого белка согласно настоящему изобретению или любой его части может быть изменена во время прямого синтеза и/или скомбинирована с использованием химических способов с последовательностью из других субъединиц или любой их части для получения вариантного полипептида.

Анализы для измерения биологической активности любого гомолога, производного или варианта любого слитого белка согласно настоящему изобретению хорошо известны в настоящей области техники.

Активность и применимость

Согласно одному варианту осуществления слитые белки согласно настоящему изобретению уменьшают или предотвращают миграцию опухолевой клетки, инфильтрацию соседних тканей и/или метастазирование в отдаленные участки, фактически иммобилизуя указанную клетку. Согласно другому варианту осуществления слитые белки согласно настоящему изобретению уменьшают или предотвращают уклонение опухолевой клетки от фагоцитоза фагоцитозной клеткой, такой как макрофаг, а также способствуют апоптозу и/или иммунному разрушению опухолевой клетки. Согласно другим вариантам осуществления слитые белки согласно настоящему изобретению уменьшают или предотвращают уклонение опухолевой клетки от фагоцитоза фагоцитозной клеткой, одновременно способствуя апоптозу соседней опухолевой клетки. Таким образом, слитые белки согласно настоящему изобретению способствуют разрушению опухолевых клеток с помощью любого из ряда механизмов.

Лиганды или рецепторы PD-1 экспрессируются на широком спектре опухолевых клеток, таких как клетки солидных опухолей. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пролиферативного нарушения путем введения терапевтически эффективного количества слитого белка согласно настоящему изобретению субъекту, у которого диагностировано пролиферативное нарушение.

Слитые белки согласно настоящему изобретению можно вводить индивидуумам (таким как млекопитающие, включая в себя животных и людей), страдающим клеточным пролиферативным нарушением, таким как рак, и злокачественными и доброкачественными опухолями. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения индивидуумом, которого лечат, представляет собой человека.

Считается, что слитые белки эффективны против широкого диапазона типов опухолей, включая в себя без ограничения следующие: рак яичников; рак шейки матки; рак молочной железы; рак предстательной железы; рак яичек, рак легких, рак почек; рак толстой и прямой кишки; рак кожи; рак головного мозга; лейкоз, включая в себя острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз и хронический лимфоидный лейкоз.

Более конкретно, формы рака, которые можно лечить с помощью соединений, композиций и способов согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения следующее:

формы рака сердца, включая в себя, например, следующее: саркома, например, ангиосаркома, фибросаркома, рабдомиосаркома и липосаркома; миксома; рабдомиома; фиброма; липома и тератома;

формы рака легких, включая в себя, например, следующее: бронхогенная карцинома, например плоскоклеточная, недифференцированная мелкоклеточная, недифференцированная крупноклеточная и аденокарцинома; альвеолярная и бронхиолярная карцинома; бронхиальная аденома; саркома; лимфома; хондроматозная гамартома; и мезотелиома;

рак желудочно-кишечного тракта, включая в себя, например, следующее: формы рака пищевода, например плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, лейомиосаркома и лимфома; формы рака желудка, например карцинома, лимфома и лейомиосаркома; формы рака поджелудочной железы, например протоковая аденокарцинома, инсулинома, глюкагонома, гастринома, карциноидные опухоли и випома; формы рака тонкой кишки, например аденокарцинома, лимфома, карциноидные опухоли, саркома Капоши, лейомиома, гемангиома, липома, нейрофиброма и фиброма; формы рака толстой кишки, например аденокарцинома, канальцевая аденома, ворсинчатая аденома, гамартома и лейомиома;

формы рака мочеполовых путей, включая в себя, например, следующее: формы рака почки, например аденокарцинома, опухоль Вильмса (нефробластома), лимфома и лейкоз; формы рака мочевого пузыря и уретры, например плоскоклеточная карцинома, переходно-клеточная карцинома и аденокарцинома; формы рака предстательной железы, например аденокарцинома и саркома; формы рака яичка, например семинома, тератома, эмбриональная карцинома, тератокарцинома, хориокарцинома, саркома, интерстициальная клеточная карцинома, фиброма, фиброаденома, аденоматоидные опухоли и липома;

формы рака печени, включая в себя, например, следующее: гепатома, например, гепатоцеллюлярная карцинома; холангиокарцинома; гепатобластома; ангиосаркома; гепатоцеллюлярная аденома; и гемангиома;

формы рака костей, включая в себя, например, следующее: остеогенная саркома (остеосаркома), фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная лимфома (ретикулосаркома), множественная миелома, гигантоклеточная сарком, хордома, остеохондрома (костно-хрящевой экзостоз), доброкачественная хондрома, хондробластома, хондромиксофиброма, остеоид-остеома и гигантоклеточные опухоли;

формы рака нервной системы, включая, например, следующее: формы рака черепа, например остеома, гемангиома, гранулема, ксантома и деформирующий остит; формы рака мозговых оболочек, например менингиома, менингиосаркома и глиоматоз; формы рака головного мозга, например астроцитома, медуллобластома, глиома, эпендимома, герминома (пинеалома), мультиформная глиобластома, олигодендроглиома, шваннома, ретинобластома и врожденные опухоли; и формы рака спинного мозга, например нейрофиброма, менингиома, глиома и саркома;

гинекологические формы рака, включая, например, следующее: формы рака матки, например карцинома эндометрия; формы рака шейки матки, например карцинома шейки матки и предопухолевая дисплазия шейки матки; формы рака яичников, например карцинома яичника, включая в себя следующее: серозная цистаденокарцинома, муцинозная цистаденокарцинома, неклассифицированная карцинома, гранулезотекальные опухоли, опухоли из клеток Сертоли-Лейдига, дисгерминома и злокачественная тератома; формы рака вульвы, например плоскоклеточная карцинома, интраэпителиальная карцинома, аденокарцинома, фибросаркома и меланома; формы рака влагалища, например, светлоклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, ботриоидная саркома и эмбриональная рабдомиосаркома; и формы рака фаллопиевых труб, например, карцинома;

гематологические формы рака, включая, например, следующее: формы рака крови, например, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественная миелома и миелодиспластический синдром, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома (злокачественная лимфома) и макроглобулинемия Вальденстрема, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (AITL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, миелоцитарный лейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Негели, лейкоз из плазматических клеток, плазмоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, лейкоз из клеток Ридера, лейкоз Шиллинга, недифференцированный бластный лейкоз, сублейкемический лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых, алейкемический лейкоз, алейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоз, недифференцируемый лейкоз, коровий лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, гематодермия, недифференцируемый лейкоз, лейкоз из недифференцированных клеток, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, волосатоклеточный лейкоз, гемобластный лейкоз, гемоцитобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, недифференцируемый лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфолейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфогенный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лимфосаркома, тучноклеточный лейкоз, мегакариоцитарный лейкоз и микромиелобластный лейкоз;

формы рака кожи, включая в себя, например, следующее: злокачественная меланома, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, саркома Капоши, родинки, диспластические невусы, липома, ангиома, дерматофиброма, келоиды, псориаз; и

формы рака надпочечников, включая в себя, например, нейробластому.

Более конкретные примеры таких форм рака включают в себя следующее: рак почки или почек, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак тоетой и прямой кишки, рак легких, включая в себя мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, плоскоклеточный рак (например, плоскоклеточный рак эпителия), рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак печени, рак мочевого пузыря, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая в себя рак желудочно-кишечного тракта, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, глиобластома, ретинобластома, астроцитома, текомы, арренобластомы, гепатома, гематологические злокачественные новообразования, включая в себя неходжкинскую лимфому (НХЛ), множественную миелому и острые гематологические злокачественные новообразования, карцинома эндометрия или матки, эндометриоз, фибросаркомы, хориокарцинома, карцинома слюнных желез, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома пищевода, карцинома печени, карцинома анального канала, карцинома полового члена, карцинома носоглотки, карцинома гортани, саркома Капоши, меланома, карциномы кожи, шваннома, олигодендроглиома, нейробластомы, рабдомиосаркома, остеогенная саркома, лейомиосаркомы, карциномы мочевыводящих путей, карциномы щитовидной железы, опухоль Вильма, а также В-клеточная лимфома (включая в себя следующее: NHL низкой степени дифференцировки/фолликулярная неходжкинская лимфому (NHL); мелкоклеточная лимфоцитарная (SL) NHL; NHL средней степени дифференцировки/фолликулярная NHL; диффузная NHL средней степени дифференцировки; иммунобластная NHL высокой степени дифференцировки; лимфобластная NHL высокой степени дифференцировки; мелкоклеточная NHL с нерассеченными ядрами высокой степени дифференцировки; NHL с генерализованной лимфаденопатией; лимфома из клеток мантийной зоны; лимфома, связанная со СПИД; и макроглобулинемия Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); острый миелолейкоз (AML); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальная пролиферация сосудов, ассоциированная с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса. Используемый в настоящем документе термин «опухоль» относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, злокачественных или доброкачественных, и ко всем предраковым и злокачественным клеткам и тканям.

Формы рака могут являться солидными опухолями, которые могут являться или не являться метастатическими. Формы рака также могут возникать, как при лейкемии, в виде диффузной ткани. Таким образом, используемый в настоящем документе термин «опухолевая клетка» включает в себя клетку, пораженную любым из указанных выше нарушений.

Согласно предпочтительному варианту осуществления рак представляет собой солидную опухоль. Согласно предпочтительным вариантам осуществления рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, меланому и глиобластому.

Согласно другому варианту осуществления рак представляет собой гематологический рак. Согласно предпочтительным вариантам осуществления гематологический рак представляет собой рак из острого лимфобластного лейкоза (ALL) и острого миелогенного лейкоза (AML).

Фармацевтические композиции и режимы введения доз

Введение композиций согласно настоящему изобретению, как правило, осуществляют парентерально, путем подкожной, внутривенной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекции, или путем инфузии, или любым другим приемлемым системным способом. Согласно предпочтительному варианту осуществления введение осуществляется путем подкожной инъекции. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления введение осуществляется путем внутривенной инфузии, которая, как правило, может происходить в течение приблизительно от 1 до 5 часов. Кроме того, существует множество способов пероральной доставки терапевтических белков, и они могут быть применены к терапевтическим слитым белкам согласно настоящему изобретению.

Часто лечебные дозировки постепенно увеличиваются с низкого уровня для оптимизации безопасности и эффективности. Как правило, суточные дозировки находятся в диапазоне от 0,01 до 20 мг белка на килограмм массы тела. Как правило, диапазон дозировки составляет приблизительно от 0,1 до 5 мг белка на килограмм массы тела. Различные модификации или производные слитых белков, такие как добавление цепей полиэтиленгликоля (пегилирование), могут быть выполнены для влияния на их фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства.

Для введения слитого белка иным способом, чем парентеральное введение, может быть необходимо покрыть белок материалом или совместно ввести белок с материалом для предотвращения его инактивации. Например, белок можно вводить в неполном адъюванте, совместно с ингибиторами ферментов или в липосомах. Ингибиторы ферментов включают в себя ингибитор трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфат (DEP) и тразилол. Липосомы включают в себя эмульсии CGF вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (Strejan et al., 1984, J. Neuroimmunol. 7:27).

Хотя композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в виде простых растворов, их чаще используют в комбинации с другими материалами, такими как носители, предпочтительно фармацевтически приемлемыми носителями. Подходящие фармацевтически приемлемые носители могут быть любым совместимым нетоксичным веществом, подходящим для доставки композиций согласно настоящему изобретению. В носитель могут быть включены стерильная вода, спирт, жиры, воски и инертные твердые вещества. Фармацевтически приемлемые адъюванты (буферные агенты, диспергирующие агенты) также могут быть включены в фармацевтическую композицию. Как правило, композиции, пригодные для парентерального введения таких лекарственных средств, хорошо известны; например, Remington's Pharmaceutical Science, 17-е изд. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990). Альтернативно, композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в организм пациента с помощью имплантируемых систем доставки лекарственных средств (Urquhartetal., 1984. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199).

Терапевтические составы можно вводить во многих обычных дозированных составах. Составы, как правило, содержат по меньшей мере один активный ингредиент вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Составы могут включать в себя те, которые подходят для перорального, ректального, назального или парентерального (включая в себя подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введения.

Составы могут быть для удобства представлены в виде стандартной лекарственной формы и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармации. См., например, Gilman et al. (ред.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8-е изд., Pergamon Press; и Remington's Pharmaceutical Sciences, ранее, Easton, Pa.; Avis et al. (ред.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, N.Y.; Lieberman et al. (ред.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y.; и Lieberman et al. (ред.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y.

Согласно дополнительным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает введение слитых белков методами генной терапии, например, введение выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес слитый белок. Строительные блоки белка (например, компонент А и компонент В) слитого белка согласно настоящему изобретению хорошо охарактеризованы как в отношении последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, так и полученных в результате аминокислотных последовательностей белков. Конструирование таких выделенных нуклеиновых кислот методами рекомбинантной ДНК находится в пределах компетенции специалиста в настоящей области техники. Оптимизация кодонов с целью максимизации выхода рекомбинантных белков на определенных клеточных фонах также находится в компетенции специалиста в настоящей области техники. Введение выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, охватывается выражением «введение терапевтически эффективного количества слитого белка согласно настоящему изобретению». Способы генной терапии хорошо известны в настоящей области техники. См., например, WO96/07321, в которой раскрыто применение методов генной терапии для генерации внутриклеточных антител. Методы генной терапии также были успешно продемонстрированы на пациентах - людях. См., например, Baumgartner et al., 1998, Circulation 97: 12, 1114-1123, и совсем недавно, Fatham, 2007, "A gene therapy approach to treatment of autoimmune diseases," Immun. Res. 18:15-26; и патент США №7378089, оба включены в настоящее описание посредством ссылки. См. также Bainbridge et al., 2008, "Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital Amaurosis," N Engl Med 358:2231-2239; и Maguire et al., 2008, "Safety and efficacy of genetransferfor Leber's congenital Amaurosis," N Engl J Med 358:2240-8. Существует два основных подхода к введению нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок (необязательно содержащегося в векторе), в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновая кислота вводится непосредственно пациенту, как правило, в то место, где требуется слитый белок. Для лечения ex vivo клетки пациента удаляются, нуклеиновая кислота вводится в эти выделенные клетки, а модифицированные клетки вводятся пациенту либо непосредственно, либо, например, инкапсулированы в пористые мембраны, которые имплантируются пациенту (см., например, патенты США №№4892538 и 5283187). Существует множество доступных методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Методы варьируются в зависимости от того, переносится ли нуклеиновая кислота в культивируемые клетки in vitro или in vivo в клетки предполагаемого хозяина. Методы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают в себя использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, DEAE-декстран, метод преципитации фосфатом кальция и т.д. Как правило, используемые векторы для доставки гена ex vivo являются ретровирусными и лентивирусными векторами.

Предпочтительные методы переноса нуклеиновых кислот in vivo включают в себя трансфекцию вирусными векторами, такими как аденовирус, вирус простого герпеса I, аденоассоциированный вирус), липидные системы (применимыми липидами для липид-опосредованного переноса гена являются DOTMA, DOPE и DC-Chol, например), голую ДНК и системы экспрессии на основе транспозонов. Для обзора известных в настоящее время протоколов маркировки генов и генной терапии см. Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). См. также WO 93/25673 и цитируемые в ней ссылки.

«Генная терапия» включает в себя как общепринятую генную терапию, при которой длительный эффект достигается за счет однократного лечения, так и введение генных терапевтических агентов, которое включает в себя однократное или многократное введение терапевтически эффективной ДНК или мРНК. Олигонуклеотиды можно модифицировать для увеличения их поглощения, например заменой их отрицательно заряженных фосфодиэфирных групп незаряженными группами. Слитые белки согласно настоящему изобретению можно доставлять с использованием способов генной терапии, например, локально в ложах опухоли, интратекально или системно (например, с помощью векторов, которые избирательно нацелены на определенные типы тканей, например, тканеспецифические аденоассоциированные вирусные векторы). Согласно некоторым вариантам осуществления первичные клетки (такие как лимфоциты или стволовые клетки) индивидуума можно трансфицировать ex vivo геном, кодирующим любой из слитых белков согласно настоящему изобретению, с последующим возвращением трансфицированных клеток в организм индивидуума.

«Осуществление лечения» или «лечение» относится к терапевтическому лечению, цель которого состоит в том, чтобы предотвратить или замедлить (уменьшить) целевое патологическое состояние или нарушение. Субъект успешно «лечится», если: после приема терапевтического количества слитого белка согласно настоящему изобретению в соответствии со способами согласно настоящему изобретению субъект показывает наблюдаемое и/или измеримое уменьшение или отсутствие одного или нескольких признаков и симптомов конкретного заболевания. Например, для рака - уменьшение количества раковых клеток или отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени и предпочтительно остановка) метастазирования опухоли; ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли; увеличение продолжительности ремиссии и/или облегчение, до некоторой степени, одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности, а также улучшение качества жизни. Пациент также может почувствовать уменьшение признаков или симптомов заболевания. Лечение может обеспечить полный ответ, определяемый как исчезновение всех признаков рака, или частичный ответ, при котором размер опухоли уменьшается, предпочтительно более чем на 50%, более предпочтительно на 75%. Пациент также считается вылеченным, если у пациента наблюдается стабилизация заболевания. Эти параметры для оценки успешного лечения и улучшения состояния легко измерить с помощью обычных процедур, знакомых врачу с соответствующей квалификацией в настоящей области техники.

В контексте лечения рака слитые белки согласно настоящему изобретению необязательно можно вводить пациенту в комбинации с другими химиотерапевтическими агентами. Подходящие химиотерапевтические агенты включают в себя, например, следующее: алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросиилфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая в себя альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хломафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK.R^; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например пакбтаксел (TAXOL.R™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) и доцетаксел (TAXOTERE.R™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметиломитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных.

Другие химиотерапевтические агенты дополнительно включают в себя антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая в себя, например, следующее: тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон иторемифен (Фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных.

Другие цитотоксические агенты опухоли, которые можно использовать в комбинации со слитым белком согласно настоящему изобретению, сами по себе являются слитыми белками. Примерами опухолевых цитотоксических слитых белков являются CTLA-4-FasL и Fn 14-TRAIL, которые, как цис-закольцованные белки, могут действовать, создавая аутоапоптотические сигнальные петли на поверхности опухолевых клеток. См. патенты США №7569663; 8329657 и 8039437, каждый из которых полностью включен посредством ссылки. В свою очередь, эти цис-закольцованные белки, включающие в себя компонент TRAIL, можно вводить в комбинации с химиотерапевтическими агентами, которые способны сенсибилизировать опухолевые клетки к TRAIL и преодолевать резистентность к TRAIL, такими как ингибиторы протеасом и ингибиторы гистондеацетилазы (HD АС), циклогексимид, иматиниб мезилат и другие ингибиторы протеинтирозинкиназы, 17-аллиламино-17-деметоксигельданамицин, триоксид мышьяка и Х-связанные ингибиторы низкомолекулярных антагонистов белка апоптоза; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из них.

Дополнительная информация о способах лечения рака представлена в патенте США №7285522, включенном последством ссылки во всей его полноте.

Осуществление на практике настоящего изобретения иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Настоящее изобретение не следует истолковывать как ограничивающееся только описанными в настоящем документе композициями и способами, но следует рассматривать как включающее также другие композиции и способы. Специалисту в настоящей области техники понятно, что доступны другие композиции и способы для выполнения описанных в настоящем документе процедур.

В осуществлении на практике настоящего изобретения используются, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии (включая в себя рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции квалифицированного специалиста. Такие методы полностью объяснены в такой литературе, как, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4-е изд. (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). Эти методы применимы для получения полинуклеотидов и полипептидов согласно настоящему изобретению и, как таковые, могут рассматриваться при создании и практическом применении настоящего изобретения. В следующих разделах будут обсуждаться особенно применимые методы для конкретных вариантов осуществления.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры предоставлены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, настоящее изобретение никоим образом не следует истолковывать как ограниченное следующими примерами, а, скорее, должно толковаться как охватывающее любые и все вариации, которые становятся очевидными в результате раскрытия, представленного в настоящем документе.

Без дальнейшего описания считается, что специалист в настоящей области техники может, используя предыдущее описание и следующие иллюстративные примеры, производить и использовать соединения согласно настоящему изобретению и применять заявленные способы на практике. Поэтому следующие рабочие примеры конкретно указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом оставшуюся часть раскрытия.

Пример 1. Связывание слитых белков Конструкты слитых белков и экспрессия

Конструкты экспрессионных плазмид для этих слитых белков создавали с использованием фрагментов генов, синтезированных de novo (ThermoFisher Scientific) для каждого из требуемых компонентов лиганда/рецептора, связанных с синтезированными фрагментами генов шарнирного домена, доменов СН2 и СН3 либо А, либо В цепей (т.е. домены Z₂, Z₃, Z₂' или Z₃'). Отдельные компоненты подвергали сплайсингу с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров на концах, содержащих сайты рестрикции, для клонирования в экспрессионную плазмиду рСЕР4, эписомальный экспрессионный вектор EBV (первоначально разработанный в лаборатории Tykocinski), который реплицируется вне хромосом с высокой копийностью. Во время синтеза гена фрагменты ДНК оптимизируют по частоте использования кодонов для экспрессии в клетках суспензии яичников китайского хомячка (CHO-S). Слитые белки получали путем временной котрансфекции конструкта А-цепи и конструкта В-цепи в культуры во встряхиваемых колбах ExpiCHO-S с использованием реагента TransIT-Pro (MIRUS) при 37°С в течение 24 часов, затем инкубировали при 32°С в течение 8-10 дней всего. Белки очищали из кондиционированного культурального супернатанта путем смешивания со смолой протеин А-агароза при 6°С в течение ночи, а затем собирали и элюировали неденатурирующим элюирующим буфером с нейтральным рН (PIERCE). Размер и целостность каждого слитого белка проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).

Исследования связывания слитых белков

Конструкты лигандов, экспрессирующие полноразмерную кДНК для человеческого CD155, Т-клеточный иммунорецептор с иммуноглобулином и доменами ITIM (TIGIT), CD112 и CD 16 (Fc RHIIIa), создавали с помощью ПЦР и клонированы в экспрессионную плазмиду pcDNA3.1+ (ThermoFisher Scientific). Каждый экспрессионный конструкт трансфицировали в клетки CHO-S с помощью липофектамина 3000 (ThermoFisher) и стабильных трансфектантов, выбранных путем добавления G418. Экспрессию лиганда определяли с помощью проточной цитометрии после иммуноокрашивания подходящим конъюгированным с флуорохромом антителом к лиганду (черная линия) или соответствующим конъюгированным с флуорохромом антителом изотипического контроля (серая линия и заливка). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FCSalyzer. Для исследований связывания слитых белков слитые белки добавляли либо к нетрансфицированным клеткам CHO-S в качестве контроля (серая линия и заливка), либо к трансфектантам CHO-S, экспрессирующим соответствующие лиганды, и инкубировали в течение 1 ч при 6°С, затем промывали и иммуноокрашивали с помощью Су5-конъюгированного антитела к IgG человека, Fcγ-специфического антитела (черная линия) и проанализировали с помощью проточной цитометрии. См. фигуры 18-20. Для исследований связывания CD16 слитые белки, содержащие TIGIT или CD155, инкубировали либо с нетрансфицированными клетками CHO-S в качестве контроля (серая линия и заливка), либо с трансфектантами CHO-S, экспрессирующими CD16, и определяли с помощью иммуноокрашивания с помощью АРС- или РЕ-конъюгированного антитела, распознающего TIGIT или CD155 соответственно (черная линия). См. фигуру 21.

Пример 2. Анализы связывания слитых белков и анализы миграции

Гель-анализ белков

Слитые белки разделяли и восстанавливали (R) или не восстанавливали (NR) на 12% геле SDS-PAGE и окрашивали в течение 12 часов в растворе для окрашивания белков PageBlue (Thermo Scientific). См. фигуру 22.

Иммуноблоттинг

Затем слитые белки количественно определяли с помощью набора Pierce ВСА Protein Assay Kit (Thermo Fisher) и наносили на 12% гели SDS-PAGE. Белки переносили электротрансфекцией на мембраны Immobilon-P (EMD Millipore, Billerica, MA) и инкубировали с (А) Ab к PD1 и (В) Ab к первичным антителам легкой цепи IgG в течение 12 часов в блокирующем буфере Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Соответствующие вторичные антитела использовали в разведениях 1:10000 (Santa Cruz). Иммуноблоты сканировали с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences, модель №9120). См. фигуру 23.

Исследования связывания слитых белков

Линии клеток меланомы CXCR4/7 и PD1+, (А) клетки YUMMER1.7 или (В) В16, инкубировали с указанными слитыми белками в течение 1 ч при 6°С, затем промывали и иммуноокрашивали Су5-конъюгированными антителами к IgG человека, Fcγ-специфическим антителом и анализировали с помощью проточной цитометрии (сплошная черная линия), контрольный образец, инкубированный без слитого белка (закрашенная серая линия), как показано на фигуре 24.

Анализ Transwell

Вставки Transwell вставляли в 24-луночные сопутствующие планшеты (Coming, № по кат. 353504). Суспензии клеток высевали в верхние камеры для инвазии при 25000 клеток/камеру. DMEM с 100 нг/мл CXCL12 добавляли в каждую нижнюю лунку в качестве хемоаттрактанта. Образцы инкубировали при 37°С в течение 24 часов, чтобы обеспечить миграцию клеток. Непроникающие клетки на апикальной поверхности вставки удаляли ватными тампонами, а клетки, которые мигрировали на нижнюю поверхность подложек, окрашивали с использованием 2% кристаллического фиолетового. См. фигуру 25.

Пример 3. TriTouch-101 вызывает регрессию меланомы

Ингибирование роста опухоли индуцировали с помощью TriTouch-101 PD1hFcA*vMIPIICH-hFcB*CL (FP) in vivo. Подкожную модель меланомы B16F10 использовали для демонстрации индукции регрессии меланомы с помощью PD1hFcA*vMIPIICH-hFcB*CL (FP). Вкратце, мышам BL16 вводили 100 мкл (10 мкг/мл) FP (мыши R, 2L и 2R) или PBS (мыши X или L) 5 раз на 13, 14, 15, 16 и 21 день после подкожной инокуляции 1×10⁵ клеток B16F10. Измеряли размеры опухолей (фигура 26А). Репрезентативные изображения 1 мыши из каждой группы лечения (X вверху и 2R внизу) изображены на фигуре 26 В. Эти данные in vivo, показывающие, что TriTouch-101 индуцирует регрессию меланомы, согласуются с предыдущими данными, показывающими, что этот слитый белок ингибирует клетки меланомы в анализе миграции (фигура 25).

Пример 4. NK-модулирующие виды белков TriTouch

ADCC увеличивали за счет добавления многофункциональных слитых белков (фиг. 27). Клеточную линию яичников SKOV-3 помещали в 96-луночный планшет из расчета 3000 клеток/лунку, давали прилипнуть и метили реагентом CellTracker Red СМТРХ. Затем клетки SKOV-3 метили зеленым флуоресцентным реагентом для определения активности каспазы-3. Клеточную линию CD16.NK-92 (вариант V158) добавляли в лунки при Е:Т 5:1 с различными слитыми белками в концентрации 25 мг/мл или без белка и анализировали с использованием системы анализа живых клеток Incucyte, измеряя количество флуоресцентных двойных положительных (красный + зеленый) клеток. Показанные результаты отражают 20-часовую временную точку (фиг. 27).

Другие варианты осуществления

Перечисление перечня элементов в любом определении переменной в настоящем документе включает в себя определения этой переменной как любого отдельного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Перечисление варианта осуществления в настоящем документе включает в себя этот вариант осуществления в виде любого отдельного варианта осуществления или комбинации с любым другим вариантом осуществления или его частями.

Раскрытия всех без исключения патентов, патентных заявок и публикаций, цитируемых в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на конкретные варианты осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и вариации настоящего изобретения могут быть разработаны другими специалистами в настоящей области техники без отклонения от истинной сущности и объема настоящего изобретения. Прилагаемая формула изобретения предназначена для включения всех таких вариантов осуществления и эквивалентных вариаций.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Томас Джефферсон Юниверсити

Тыкоцински, Марк Л.

Вебер, Мэтью

Смит, Кармелло Ромео

<120> МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 205961-7028WO1(00150)

<150> 62/789212

<151> 2019-01-07

<160> 69

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr

20 25 30

Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg

35 40 45

Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp

50 55 60

Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp

85 90 95

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

100 105 110

Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala

115 120 125

Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135 140

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr

20 25 30

Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg

35 40 45

Glu Ser Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp

50 55 60

Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro

65 70 75 80

Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp

85 90 95

Ser Gly Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln

100 105 110

Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala

115 120 125

Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135 140

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala Thr Leu

1 5 10 15

Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly Phe Phe

20 25 30

Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp Leu Ile Ala

35 40 45

Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg Pro Cys

50 55 60

Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp

65 70 75 80

Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu

85 90 95

Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys Ile Tyr Asn

100 105 110

Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu Trp Asn Ser Asn His

115 120 125

Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln

130 135 140

Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp Ser Val

145 150 155 160

Glu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Trp Val Leu Leu Ser Lys Gly Ile Lys

165 170 175

Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn His Leu Ile

180 185 190

Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly Thr Asp Tyr

195 200 205

Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe

210 215 220

Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr

225 230 235 240

Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile Val Glu Asn

245 250 255

Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys Leu Leu Lys

260 265 270

Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe

275 280 285

Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys

290 295 300

Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His

305 310 315 320

Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala

325 330 335

Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys

340 345 350

Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp Pro Pro Leu

355 360 365

Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser

370 375 380

Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Val Asp

385 390 395 400

Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser Asn Ser Ser

405 410 415

Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp

420 425 430

Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser Ser Ser

435 440 445

Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr Ser Thr

450 455 460

Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr Lys

465 470 475 480

Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys Pro Lys Asp

485 490 495

Gly Met

<210> 5

<211> 151

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Gly His Arg Thr Leu Val Leu Pro Trp Val Leu Leu Thr Leu Cys

1 5 10 15

Val Thr Ala Gly Thr Pro Glu Val Trp Val Gln Val Arg Met Glu Ala

20 25 30

Thr Glu Leu Ser Ser Phe Thr Ile Arg Cys Gly Phe Leu Gly Ser Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Leu Val Thr Val Ser Trp Gly Gly Pro Asn Gly Ala Gly

50 55 60

Gly Thr Thr Leu Ala Val Leu His Pro Glu Arg Gly Ile Arg Gln Trp

65 70 75 80

Ala Pro Ala Arg Gln Ala Arg Trp Glu Thr Gln Ser Ser Ile Ser Leu

85 90 95

Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ala Ser Ser Pro Cys Ala Asn Thr Thr Phe

100 105 110

Cys Cys Lys Phe Ala Ser Phe Pro Glu Gly Ser Trp Glu Ala Cys Gly

115 120 125

Ser Leu Pro Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala Pro Pro Thr Pro

130 135 140

Ala Pro Ile Leu Arg Ala Asp

145 150

<210> 6

<211> 236

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn Met Ser

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val Glu Trp

20 25 30

Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser Pro Thr

35 40 45

His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg Asn Ala

65 70 75 80

Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro

85 90 95

Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp Ser Phe

100 105 110

Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro Gly Lys

115 120 125

Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val Gln Ala

130 135 140

Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu Thr Tyr

145 150 155 160

Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro Arg Gln

165 170 175

Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val Ile Pro

180 185 190

Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu Gln Ala

195 200 205

Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val Ala Glu

210 215 220

Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala

225 230 235

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Asn Leu Phe Thr Lys Asp Val Thr Val Ile Glu Gly Glu Val Ala

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Gln Val Asn Lys Ser Asp Asp Ser Val Ile Gln Leu

20 25 30

Leu Asn Pro Asn Arg Gln Thr Ile Tyr Phe Arg Asp Phe Arg Pro Leu

35 40 45

Lys Asp Ser Arg Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu Lys

50 55 60

Val Ser Leu Thr Asn Val Ser Ile Ser Asp Glu Gly Arg Tyr Phe Cys

65 70 75 80

Gln Leu Tyr Thr Asp Pro Pro Gln Glu Ser Tyr Thr Thr Ile Thr Val

85 90 95

Leu Val Pro Pro Arg Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys Asp Thr Ala

100 105 110

Val Glu Gly Glu Glu Ile Glu Val Asn Cys Thr Ala Met Ala Ser Lys

115 120 125

Pro Ala Thr Thr Ile Arg Trp Phe Lys Gly Asn Thr Glu Leu Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Glu Val Glu Glu Trp Ser Asp Met Tyr Thr Val Thr Ser Gln

145 150 155 160

Leu Met Leu Lys Val His Lys Glu Asp Asp Gly Val Pro Val Ile Cys

165 170 175

Gln Val Glu His Pro Ala Val Thr Gly Asn Leu Gln Thr Gln Arg Tyr

180 185 190

Leu Glu Val Gln Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr Tyr Pro

195 200 205

Leu Gln Gly Leu Thr Arg Glu Gly Asp Ala Leu Glu Leu Thr Cys Glu

210 215 220

Ala Ile Gly Lys Pro Gln Pro Val Met Val Thr Trp Val Arg Val Asp

225 230 235 240

Asp Glu Met Pro Gln His Ala Val Leu Ser Gly Pro Asn Leu Phe Ile

245 250 255

Asn Asn Leu Asn Lys Thr Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Ala Ser

260 265 270

Asn Ile Val Gly Lys Ala His Ser Asp Tyr Met Leu Tyr Val Tyr Asp

275 280 285

Pro Pro Thr Thr Ile Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr

290 295 300

Thr Thr Thr Thr Thr Ile Leu Thr Ile Ile Thr Asp Ser Arg Ala Gly

305 310 315 320

Glu Glu Gly Ser Ile Arg Ala Val Asp His

325 330

<210> 8

<211> 342

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val

1 5 10 15

Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser

20 25 30

Trp Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His

35 40 45

Pro Gln Tyr Gly Phe Ser Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu

50 55 60

Phe Lys Asn Tyr Ser Leu Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile

65 70 75 80

Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro

85 90 95

Leu Gly Asn Ala Gln Ser Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro

100 105 110

Thr Val Ser Leu Ile Lys Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn

115 120 125

Glu Thr Val Ala Ala Ile Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala

130 135 140

His Ile Asp Trp Glu Gly Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr

145 150 155 160

Ser Phe Pro Asn Glu Thr Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe

165 170 175

Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His

180 185 190

Pro Ala Leu Glu Lys Asp Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln

195 200 205

Tyr Ala Pro Glu Val Ser Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val

210 215 220

Gly Arg Lys Gly Val Asn Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro

225 230 235 240

Pro Phe Lys Ser Val Trp Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly

245 250 255

Leu Leu Ala Ser Asp Asn Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe

260 265 270

Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln

275 280 285

Arg Ser Asp Gln Lys Val Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Gln Pro Thr Ile Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu

305 310 315 320

Asp Leu Ala Thr Glu Pro Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu

325 330 335

Ala Thr Ile Lys Asp Asp

340

<210> 9

<211> 285

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp

1 5 10 15

Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu Val His Leu Asp Gly Gln

20 25 30

Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly

35 40 45

Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr

50 55 60

Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His

65 70 75 80

Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val

85 90 95

Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr

100 105 110

Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Lys Glu Trp

115 120 125

Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg

130 135 140

Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala

145 150 155 160

Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Ser Gly

165 170 175

Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser

180 185 190

Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu

210 215 220

Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly

225 230 235 240

Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro

260 265 270

Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp

275 280 285

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly

20

<210> 12

<211> 103

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

50 55 60

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

85 90 95

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 14

<211> 396

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PD-1-hFcA человека

<400> 14

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

35 40 45

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu

50 55 60

Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

65 70 75 80

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

85 90 95

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

100 105 110

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

130 135 140

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

165 170 175

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

180 185 190

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

195 200 205

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

210 215 220

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

225 230 235 240

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

245 250 255

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val

260 265 270

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

275 280 285

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

290 295 300

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

340 345 350

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

355 360 365

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His

370 375 380

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390 395

<210> 15

<211> 396

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Высокоаффинный PD-1-hFcA человека

<400> 15

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

35 40 45

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val

50 55 60

Val Trp His Arg Glu Ser Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala

65 70 75 80

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

85 90 95

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

100 105 110

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

130 135 140

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

165 170 175

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

180 185 190

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

195 200 205

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

210 215 220

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

225 230 235 240

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

245 250 255

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val

260 265 270

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

275 280 285

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

290 295 300

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

340 345 350

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

355 360 365

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His

370 375 380

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390 395

<210> 16

<211> 403

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD112R-hFcA человека

<400> 16

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Met Gly His Arg Thr Leu Val Leu Pro Trp Val Leu

20 25 30

Leu Thr Leu Cys Val Thr Ala Gly Thr Pro Glu Val Trp Val Gln Val

35 40 45

Arg Met Glu Ala Thr Glu Leu Ser Ser Phe Thr Ile Arg Cys Gly Phe

50 55 60

Leu Gly Ser Gly Ser Ile Ser Leu Val Thr Val Ser Trp Gly Gly Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ala Gly Gly Thr Thr Leu Ala Val Leu His Pro Glu Arg Gly

85 90 95

Ile Arg Gln Trp Ala Pro Ala Arg Gln Ala Arg Trp Glu Thr Gln Ser

100 105 110

Ser Ile Ser Leu Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ala Ser Ser Pro Cys Ala

115 120 125

Asn Thr Thr Phe Cys Cys Lys Phe Ala Ser Phe Pro Glu Gly Ser Trp

130 135 140

Glu Ala Cys Gly Ser Leu Pro Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala

145 150 155 160

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Ile Leu Arg Ala Asp Glu Pro Lys Ser Ser

165 170 175

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

180 185 190

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

195 200 205

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

210 215 220

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

225 230 235 240

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

245 250 255

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

260 265 270

Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

275 280 285

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

290 295 300

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

305 310 315 320

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

325 330 335

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

340 345 350

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

355 360 365

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

370 375 380

His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

385 390 395 400

Pro Gly Lys

<210> 17

<211> 370

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TIGIT-hFcA человека

<400> 17

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala

20 25 30

Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr

35 40 45

Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala

50 55 60

Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr

85 90 95

Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp

100 105 110

Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val

115 120 125

Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Ser Asp

130 135 140

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

145 150 155 160

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

165 170 175

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

180 185 190

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

195 200 205

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

210 215 220

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

245 250 255

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

260 265 270

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

275 280 285

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

290 295 300

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

305 310 315 320

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

325 330 335

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His

340 345 350

Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

355 360 365

Gly Lys

370

<210> 18

<211> 748

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD96-hFcA человека

<400> 18

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala

20 25 30

Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly

35 40 45

Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp Leu

50 55 60

Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg

65 70 75 80

Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly Ser

85 90 95

Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser Gly Arg

100 105 110

Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys Ile

115 120 125

Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu Trp Asn Ser

130 135 140

Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys

145 150 155 160

Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp

165 170 175

Ser Val Glu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Trp Val Leu Leu Ser Lys Gly

180 185 190

Ile Lys Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn His

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly Thr

210 215 220

Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg

225 230 235 240

Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg Ser

245 250 255

Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile Val

260 265 270

Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys Leu

275 280 285

Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu

305 310 315 320

Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg

325 330 335

Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys

340 345 350

Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser

355 360 365

Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp Pro

370 375 380

Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala

385 390 395 400

Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu

405 410 415

Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser Asn

420 425 430

Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly

435 440 445

Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser

450 455 460

Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr

465 470 475 480

Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser

485 490 495

Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys Pro

500 505 510

Lys Asp Gly Met Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

515 520 525

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

530 535 540

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

545 550 555 560

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

565 570 575

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

580 585 590

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

595 600 605

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val

610 615 620

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

625 630 635 640

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

645 650 655

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

660 665 670

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

675 680 685

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

690 695 700

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

705 710 715 720

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His

725 730 735

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

740 745

<210> 19

<211> 486

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD226-hFcA человека

<400> 19

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn

20 25 30

Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val

35 40 45

Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser

50 55 60

Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr

65 70 75 80

Phe Leu Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg

85 90 95

Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr

100 105 110

Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp

115 120 125

Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro

130 135 140

Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val

145 150 155 160

Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu

165 170 175

Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro

180 185 190

Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val

195 200 205

Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu

210 215 220

Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Glu Pro

245 250 255

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

260 265 270

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

325 330 335

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

385 390 395 400

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 20

<211> 580

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> NECL2-hFcA человека

<400> 20

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Asn Leu Phe Thr Lys Asp Val Thr Val Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Val Ala Thr Ile Ser Cys Gln Val Asn Lys Ser Asp Asp Ser Val Ile

35 40 45

Gln Leu Leu Asn Pro Asn Arg Gln Thr Ile Tyr Phe Arg Asp Phe Arg

50 55 60

Pro Leu Lys Asp Ser Arg Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Ser Ser Glu

65 70 75 80

Leu Lys Val Ser Leu Thr Asn Val Ser Ile Ser Asp Glu Gly Arg Tyr

85 90 95

Phe Cys Gln Leu Tyr Thr Asp Pro Pro Gln Glu Ser Tyr Thr Thr Ile

100 105 110

Thr Val Leu Val Pro Pro Arg Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys Asp

115 120 125

Thr Ala Val Glu Gly Glu Glu Ile Glu Val Asn Cys Thr Ala Met Ala

130 135 140

Ser Lys Pro Ala Thr Thr Ile Arg Trp Phe Lys Gly Asn Thr Glu Leu

145 150 155 160

Lys Gly Lys Ser Glu Val Glu Glu Trp Ser Asp Met Tyr Thr Val Thr

165 170 175

Ser Gln Leu Met Leu Lys Val His Lys Glu Asp Asp Gly Val Pro Val

180 185 190

Ile Cys Gln Val Glu His Pro Ala Val Thr Gly Asn Leu Gln Thr Gln

195 200 205

Arg Tyr Leu Glu Val Gln Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr

210 215 220

Tyr Pro Leu Gln Gly Leu Thr Arg Glu Gly Asp Ala Leu Glu Leu Thr

225 230 235 240

Cys Glu Ala Ile Gly Lys Pro Gln Pro Val Met Val Thr Trp Val Arg

245 250 255

Val Asp Asp Glu Met Pro Gln His Ala Val Leu Ser Gly Pro Asn Leu

260 265 270

Phe Ile Asn Asn Leu Asn Lys Thr Asp Asn Gly Thr Tyr Arg Cys Glu

275 280 285

Ala Ser Asn Ile Val Gly Lys Ala His Ser Asp Tyr Met Leu Tyr Val

290 295 300

Tyr Asp Pro Pro Thr Thr Ile Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr

305 310 315 320

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ile Leu Thr Ile Ile Thr Asp Ser Arg

325 330 335

Ala Gly Glu Glu Gly Ser Ile Arg Ala Val Asp His Glu Pro Lys Ser

340 345 350

Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

355 360 365

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

370 375 380

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

385 390 395 400

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

405 410 415

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

420 425 430

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

435 440 445

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

450 455 460

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

465 470 475 480

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

485 490 495

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

500 505 510

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

515 520 525

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

530 535 540

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

545 550 555 560

Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

565 570 575

Ser Pro Gly Lys

580

<210> 21

<211> 594

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD113-hFcA человека

<400> 21

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp

20 25 30

Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile

35 40 45

Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Ser Gln Thr Val

50 55 60

Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser Val Gln Gly Glu Tyr Gln

65 70 75 80

Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu Asn Asp Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala

100 105 110

Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser Ser Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys Gly Pro Asp Ser Leu Ile

130 135 140

Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile Cys Ile Ala Ala Thr Gly

145 150 155 160

Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly Asp Leu Gly Glu Met Glu

165 170 175

Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr Ala Thr Ile Ile Ser Gln

180 185 190

Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Arg Arg Ile Thr Cys

195 200 205

Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp Ile Arg Tyr Ser Phe Ile

210 215 220

Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser Val Thr Gly Tyr Asp Gly

225 230 235 240

Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn Leu Lys Cys Asn Ala Asp

245 250 255

Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp Ser Arg Leu Asp Gly Gln

260 265 270

Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn Thr Leu His Phe Val His

275 280 285

Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ile Cys Lys Val Thr Asn

290 295 300

Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val Ile Tyr Ile Ser Asp Pro

305 310 315 320

Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile Gln Trp His Pro Ser Thr

325 330 335

Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro Lys Lys Leu Pro Phe Pro

340 345 350

Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp Glu Pro Lys Ser Ser Asp

355 360 365

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

370 375 380

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

385 390 395 400

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

405 410 415

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

420 425 430

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

435 440 445

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

450 455 460

Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

465 470 475 480

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

485 490 495

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

500 505 510

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

515 520 525

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

530 535 540

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

545 550 555 560

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His

565 570 575

Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

580 585 590

Gly Lys

<210> 22

<211> 537

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> MICA-hFcA человека

<400> 22

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val

20 25 30

Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu Val His

35 40 45

Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala

50 55 60

Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp

65 70 75 80

Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met

85 90 95

Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln

100 105 110

Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser

115 120 125

Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu

130 135 140

Thr Lys Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala

145 150 155 160

Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr

165 170 175

His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn

195 200 205

Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg

210 215 220

Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Asp

225 230 235 240

Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro

245 250 255

Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln

260 265 270

Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His

275 280 285

Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His

290 295 300

Trp Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

305 310 315 320

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

325 330 335

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

340 345 350

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

355 360 365

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

370 375 380

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

385 390 395 400

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys

405 410 415

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

420 425 430

Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

450 455 460

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

465 470 475 480

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

485 490 495

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

500 505 510

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln

515 520 525

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530 535

<210> 23

<211> 252

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FcA человека

<400> 23

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

20 25 30

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

35 40 45

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

50 55 60

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

65 70 75 80

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

85 90 95

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

100 105 110

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val

115 120 125

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

130 135 140

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

145 150 155 160

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

165 170 175

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

180 185 190

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

195 200 205

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

210 215 220

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His

225 230 235 240

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245 250

<210> 24

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln

1 5 10 15

Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln

20 25 30

Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg

35 40 45

His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro

50 55 60

Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly

65 70 75 80

Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu

85 90 95

Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser

100 105 110

Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr

115 120 125

Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala

130 135 140

Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His

145 150 155 160

Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu

165 170 175

Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser

180 185 190

Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe

195 200 205

Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro

210 215 220

Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn

225 230 235 240

Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly

245 250 255

Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala

260 265 270

Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr

275 280 285

Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu

290 295 300

Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met

305 310 315 320

Ser Arg Asn

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 26

<211> 170

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys Asn Ala Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Met Cys Trp

20 25 30

Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr Asn Glu Leu Leu Arg

35 40 45

Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr Gln Leu

50 55 60

Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu Ile Ile Lys Asn Val

65 70 75 80

Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Phe Pro Gly

85 90 95

Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu Asp Ile Lys Ala Ala

100 105 110

Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp Ser Thr Thr Ala Ser

115 120 125

Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser Glu Thr Gln Thr Leu

130 135 140

Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile Ser Thr Trp Ala Asp

145 150 155 160

Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg

165 170

<210> 27

<211> 342

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val

1 5 10 15

Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser

20 25 30

Trp Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His

35 40 45

Pro Gln Tyr Gly Phe Ser Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu

50 55 60

Phe Lys Asn Tyr Ser Leu Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile

65 70 75 80

Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro

85 90 95

Leu Gly Asn Ala Gln Ser Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro

100 105 110

Thr Val Ser Leu Ile Lys Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn

115 120 125

Glu Thr Val Ala Ala Ile Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala

130 135 140

His Ile Asp Trp Glu Gly Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr

145 150 155 160

Ser Phe Pro Asn Glu Thr Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe

165 170 175

Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His

180 185 190

Pro Ala Leu Glu Lys Asp Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln

195 200 205

Tyr Ala Pro Glu Val Ser Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val

210 215 220

Gly Arg Lys Gly Val Asn Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro

225 230 235 240

Pro Phe Lys Ser Val Trp Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly

245 250 255

Leu Leu Ala Ser Asp Asn Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe

260 265 270

Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln

275 280 285

Arg Ser Asp Gln Lys Val Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Gln Pro Thr Ile Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu

305 310 315 320

Asp Leu Ala Thr Glu Pro Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu

325 330 335

Ala Thr Ile Lys Asp Asp

340

<210> 28

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 29

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Компонент A Y349C и T366W

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn Ser Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Компонент B D356C, T366S, L368A и Y407V

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 37

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 31

Gly Asp Pro Leu Val Thr Ala Ala Ser Val Leu Glu Phe Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Asp Ile

35

<210> 32

<211> 575

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD155-hFcB человека

<400> 32

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln

20 25 30

Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro

35 40 45

Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu

50 55 60

Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln

65 70 75 80

Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly

100 105 110

Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe

115 120 125

Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys

130 135 140

Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro

145 150 155 160

Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln

165 170 175

Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val

180 185 190

Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu

195 200 205

Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu

210 215 220

His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr

245 250 255

Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro

260 265 270

Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro

275 280 285

Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys

290 295 300

Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala

305 310 315 320

Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu

325 330 335

His Ser Gly Met Ser Arg Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

340 345 350

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

355 360 365

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

370 375 380

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

385 390 395 400

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

405 410 415

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

420 425 430

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

435 440 445

Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

450 455 460

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

465 470 475 480

Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

485 490 495

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

500 505 510

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

515 520 525

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

530 535 540

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

545 550 555 560

His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565 570 575

<210> 33

<211> 372

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TIGIT-hFcB человека

<400> 33

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile

20 25 30

Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser

35 40 45

Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu

50 55 60

Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe

65 70 75 80

Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser

85 90 95

Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr

100 105 110

Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser

115 120 125

Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser

130 135 140

Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

165 170 175

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

180 185 190

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

195 200 205

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

210 215 220

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

225 230 235 240

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

245 250 255

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

260 265 270

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

275 280 285

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

290 295 300

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

305 310 315 320

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

325 330 335

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

340 345 350

Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

355 360 365

Ser Pro Gly Lys

370

<210> 34

<211> 422

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TIM-3-hFcB мыши

<400> 34

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Leu Glu Asp Gly Tyr Lys Val Glu Val Gly Lys Asn

20 25 30

Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Ser Gly Thr Leu Val

35 40 45

Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr Asn

50 55 60

Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu Ile

85 90 95

Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu Asp

115 120 125

Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp Ser

130 135 140

Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser Glu

145 150 155 160

Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile Ser

165 170 175

Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Glu Pro

180 185 190

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

195 200 205

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

210 215 220

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

225 230 235 240

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

245 250 255

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

260 265 270

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

275 280 285

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

290 295 300

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

305 310 315 320

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn

325 330 335

Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

340 345 350

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

355 360 365

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys

370 375 380

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

385 390 395 400

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

405 410 415

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420

<210> 35

<211> 594

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD113-hFcB человека

<400> 35

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Ile Val Glu Pro His Val Thr Ala Val Trp

20 25 30

Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile Glu Val Asn Glu Thr Ile

35 40 45

Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Ser Gln Thr Val

50 55 60

Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser Val Gln Gly Glu Tyr Gln

65 70 75 80

Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu Asn Asp Ala Thr Ile Thr

85 90 95

Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Ile Cys Lys Ala

100 105 110

Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser Ser Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys Gly Pro Asp Ser Leu Ile

130 135 140

Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile Cys Ile Ala Ala Thr Gly

145 150 155 160

Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly Asp Leu Gly Glu Met Glu

165 170 175

Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr Ala Thr Ile Ile Ser Gln

180 185 190

Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg Gly Arg Arg Ile Thr Cys

195 200 205

Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp Ile Arg Tyr Ser Phe Ile

210 215 220

Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser Val Thr Gly Tyr Asp Gly

225 230 235 240

Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn Leu Lys Cys Asn Ala Asp

245 250 255

Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp Ser Arg Leu Asp Gly Gln

260 265 270

Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn Thr Leu His Phe Val His

275 280 285

Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ile Cys Lys Val Thr Asn

290 295 300

Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val Ile Tyr Ile Ser Asp Pro

305 310 315 320

Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile Gln Trp His Pro Ser Thr

325 330 335

Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro Lys Lys Leu Pro Phe Pro

340 345 350

Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp Glu Pro Lys Ser Ser Asp

355 360 365

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

370 375 380

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

385 390 395 400

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

405 410 415

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

420 425 430

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

435 440 445

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

450 455 460

Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

465 470 475 480

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

485 490 495

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

500 505 510

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

515 520 525

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

530 535 540

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

545 550 555 560

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His

565 570 575

Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

580 585 590

Gly Lys

<210> 36

<211> 252

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FcB человека

<400> 36

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

20 25 30

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

35 40 45

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

50 55 60

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

65 70 75 80

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

85 90 95

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

100 105 110

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val

115 120 125

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

130 135 140

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

145 150 155 160

Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

165 170 175

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

180 185 190

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

195 200 205

Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

210 215 220

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His

225 230 235 240

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

245 250

<210> 37

<211> 71

<212> PRT

<213> Гаммагерпесвирус человека 8 типа

<400> 37

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg

35 40 45

Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu Met Gln

50 55 60

Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg

65 70

<210> 38

<211> 21

<212> PRT

<213> Гаммагерпесвирус человека 8 типа

<400> 38

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro

20

<210> 39

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта

<400> 39

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro

20

<210> 40

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта mut

<400> 40

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro

20

<210> 41

<211> 34

<212> PRT

<213> Гаммагерпесвирус человека 8 типа

<400> 41

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu

<210> 42

<211> 34

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта

<400> 42

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu

<210> 43

<211> 34

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта mut

<400> 43

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly Tyr Gln

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro Thr Ser

20 25 30

Gln Leu

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен Z3 IgG1

<400> 44

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn Ser Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 45

<211> 100

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративная последовательность для компонента Z1’

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 45

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

1 5 10 15

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

20 25 30

Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

35 40 45

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

65 70 75 80

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

85 90 95

Lys Lys Val Xaa

100

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративная метка очистки

<400> 46

Ala Ser His His His His His His Met

1 5

<210> 47

<211> 27

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративная последовательность тримеризации

<400> 47

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Arg Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративная последовательность для компонента Z3’

<400> 48

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 49

<211> 421

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> vMIPII-CH-hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (189)..(189)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 49

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu

65 70 75 80

Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

85 90 95

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

100 105 110

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr

115 120 125

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

130 135 140

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

145 150 155 160

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

165 170 175

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys

180 185 190

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

210 215 220

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

225 230 235 240

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

245 250 255

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

260 265 270

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

275 280 285

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

290 295 300

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln

325 330 335

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

340 345 350

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

355 360 365

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

370 375 380

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

385 390 395 400

Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

405 410 415

Leu Ser Pro Gly Lys

420

<210> 50

<211> 371

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1-CH-hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (139)..(139)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 50

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

35 40 45

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser

65 70 75 80

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

85 90 95

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

100 105 110

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

115 120 125

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser

130 135 140

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

165 170 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

180 185 190

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

195 200 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

210 215 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

245 250 255

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

290 295 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

325 330 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

340 345 350

His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

355 360 365

Pro Gly Lys

370

<210> 51

<211> 371

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта-CH-hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (139)..(139)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 51

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

35 40 45

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser

65 70 75 80

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

85 90 95

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

100 105 110

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

115 120 125

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser

130 135 140

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

165 170 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

180 185 190

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

195 200 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

210 215 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

245 250 255

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

290 295 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

325 330 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

340 345 350

His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

355 360 365

Pro Gly Lys

370

<210> 52

<211> 371

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта mut-CH-hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (139)..(139)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 52

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

35 40 45

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser

65 70 75 80

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

85 90 95

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

100 105 110

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

115 120 125

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser

130 135 140

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

165 170 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

180 185 190

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

195 200 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

210 215 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

245 250 255

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

290 295 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

325 330 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

340 345 350

His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

355 360 365

Pro Gly Lys

370

<210> 53

<211> 384

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1-CH-hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(152)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 53

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

50 55 60

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

65 70 75 80

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

85 90 95

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

100 105 110

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

130 135 140

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

290 295 300

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

355 360 365

Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 54

<211> 384

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта-CH- hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(152)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 54

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

50 55 60

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

65 70 75 80

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

85 90 95

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

100 105 110

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

130 135 140

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

290 295 300

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

355 360 365

Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 55

<211> 384

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта mut-CH- hFcB

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(152)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<400> 55

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

50 55 60

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

65 70 75 80

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

85 90 95

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

100 105 110

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

130 135 140

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Xaa Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

290 295 300

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

355 360 365

Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 56

<211> 24

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративный домен тримеризации

<400> 56

Val Thr Thr Leu Gln Asp Ser Ile Arg Lys Val Thr Glu Glu Asn Lys

1 5 10 15

Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg

20

<210> 57

<211> 197

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> vMIPII-CL’

<400> 57

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg

50 55 60

Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys Leu

65 70 75 80

Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

85 90 95

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

100 105 110

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

115 120 125

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

130 135 140

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

145 150 155 160

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

165 170 175

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

180 185 190

Asn Arg Gly Glu Cys

195

<210> 58

<211> 147

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1-CL’

<400> 58

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

35 40 45

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

50 55 60

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

65 70 75 80

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

85 90 95

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

100 105 110

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

115 120 125

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

130 135 140

Gly Glu Cys

145

<210> 59

<211> 147

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта-CL’

<400> 59

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

35 40 45

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

50 55 60

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

65 70 75 80

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

85 90 95

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

100 105 110

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

115 120 125

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

130 135 140

Gly Glu Cys

145

<210> 60

<211> 147

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V1дельта mut-CL’

<400> 60

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

35 40 45

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

50 55 60

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

65 70 75 80

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

85 90 95

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

100 105 110

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

115 120 125

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

130 135 140

Gly Glu Cys

145

<210> 61

<211> 160

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1-CL’

<400> 61

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

50 55 60

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

65 70 75 80

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

100 105 110

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

115 120 125

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

130 135 140

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

145 150 155 160

<210> 62

<211> 160

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта-CL’

<400> 62

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

50 55 60

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

65 70 75 80

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

100 105 110

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

115 120 125

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

130 135 140

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

145 150 155 160

<210> 63

<211> 160

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Vp1дельта mut-CL’

<400> 63

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Ala Cys Ala Leu Gly

20 25 30

Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr Pro

35 40 45

Thr Ser Gln Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

50 55 60

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

65 70 75 80

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

100 105 110

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

115 120 125

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

130 135 140

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

145 150 155 160

<210> 64

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> иллюстративная последовательность для компонента CL’ или

компонента CL

<400> 64

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

1 5 10 15

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

20 25 30

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

35 40 45

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

50 55 60

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

85 90 95

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 65

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 66

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 67

<211> 98

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен Z1 IgG1

<400> 67

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 68

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнирная область IgG1

<400> 68

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly

20

<210> 69

<211> 103

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен Z2 IgG1

<400> 69

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

50 55 60

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

85 90 95

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100

<---

Claims (16)

1. Слитый белок, содержащий компонент A, компонент B и компонент C;

причем:

компонент A содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14-15,

компонент B содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49-55,

компонент C содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57-63, и

компонент A связан с компонентом B и компонент B связан с компонентом C через дисульфидные связи;

причем слитый белок способен связывать i) PD-L1, ii) CXCR4 и iii) Fc-рецептор.

2. Слитый белок по п. 1, причем слитый белок способен связывать i) PD-L1 на опухолевой клетке, ii) CXCR4 на упомянутой опухолевой клетке и iii) рецептор Fc на иммунной клетке - естественном киллере (NK).

3. Слитый белок по п. 1, в котором указанный компонент A содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14, указанный компонент B содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 49, и указанный компонент C содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 57.

4. Слитый белок по п. 1, в котором указанный компонент A содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14, указанный компонент B содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 53, и указанный компонент C содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 61.

5. Система нуклеиновых кислот, кодирующая слитый белок по любому из пп. 1-4, содержащая:

первую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный компонент А, функционально связанную с регуляторным элементом для управления экспрессией указанной первой нуклеиновой кислоты в клетке млекопитающих;

вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный компонент B, функционально связанную с регуляторным элементом для управления экспрессией указанной второй нуклеиновой кислоты в клетке млекопитающих; и

третью нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный компонент С, функционально связанную с регуляторным элементом для управления экспрессией указанной третьей нуклеиновой кислоты в клетке млекопитающих.

6. Способ получения слитого белка по любому из пп. 1-4, причем способ предусматривает введение в клетку млекопитающих системы нуклеиновых кислот по п. 5, культивирование указанной клетки млекопитающих после указанного введения и очищение указанного слитого белка после указанного культивирования.

7. Способ лечения меланомы у пациента, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества слитого белка по любому из пп. 1-4 пациенту, нуждающемуся в таком лечении.