JP2024506068A - 内因性タンパク質分子で単一ドメイン抗体を置き換えたキメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

本出願は内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）を提供し、当該内因性キメラ抗原受容体における抗原結合ドメインが内因性タンパク質分子である。本発明の工学化された免疫細胞は特異的に、選択的に数種類の細胞を殺傷することができる。

Description

本発明は、免疫治療の分野に関し、具体的に、内因性タンパク質分子で単一ドメイン抗体を置き換えたキメラ抗原受容体に関する。

細胞免疫治療の発展および臨床応用における成功に伴い、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＡＲ Ｔ）免疫治療は現在最も将来性のある腫瘍免疫治療のアプローチの一つである。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ）は、遺伝子修飾後、人体内において特異的に特定の抗原を認識し、そして特定の抗原が存在する標的細胞を殺傷するＴ細胞である。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）はウイルス感染などの技術によってＴリンパ球を修飾することで、キメラ抗原受容体を発現させることができ、このようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって改変されたＴ細胞は非ＭＨＣ制限的に特異的に標的抗原を認識して結合し、そして特異的に標的細胞を殺傷することができる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞外抗原結合ドメインは、現在、主に単一ドメイン抗体で、そして特定の標的抗原に対して特定の単一ドメイン抗体を設計して製造するが、その理由の一つは、これらの標的抗原は主に腫瘍表面特異的マーカーで、体内に相応するリガンドが欠けているからである。

そして、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を標的とするＣＡＲ Ｔの臨床研究（２０１３年）では、キメラ抗原受容体におけるネズミ由来抗体の単一ドメインがアレルギー反応を引き起こし、かつそのうちの一名の被験者が死亡したことが見出された。これにより、単一ドメイン抗体を細胞外結合ドメインとするキメラ抗原受容体は臨床において存在する拒絶問題が示された。また、抗体一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を細胞外抗原結合ドメインとするキメラ抗原受容体は、製造過程に時間がかかり、時間コストが高く、経済的コストが高く、そして抗体スクリーニングの難易度が高いといった問題がある。

そのため、本分野では、拒絶反応が避けられ、良い耐性を有する、新たなキメラ抗原受容体の開発が切望されている。

本発明の目的は、拒絶反応が避けられ、良い耐性を有する、新たなキメラ抗原受容体を提供することである。

本発明の第一の側面では、内因性タンパク質分子である抗原結合ドメインを含む、内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）を提供する。

もう一つの好適な例において、前記内因性タンパク質分子は、インターロイキンファミリー、ケモカインファミリー、コロニー刺激因子、成長因子、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、インターフェロンファミリー、腫瘍マーカー、老化細胞関連因子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記インターロイキンファミリーは、ＩＬ１α（インターロイキン１α）、ＩＬ１β（インターロイキン１β）、ＩＬ２（インターロイキン２）、ＩＬ３（インターロイキン３）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＩＬ５（インターロイキン５）、ＩＬ６（インターロイキン６）、ＩＬ９（インターロイキン９）、ＩＬ１０（インターロイキン１０）、ＩＬ１２（インターロイキン１２）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＩＬ１４（インターロイキン１４）、ＩＬ１７Ａ（インターロイキン１７Ａ）、ＩＬ１７Ｂ（インターロイキン１７Ｂ）、ＩＬ１７Ｃ（インターロイキン１７Ｃ）、ＩＬ１７Ｅ（インターロイキン１７Ｅ）、ＩＬ１７Ｆ（インターロイキン１７Ｆ）、ＩＬ３３（インターロイキン３３）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ケモカインファミリーは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、 ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ（メラノーマ増殖刺激活性）、ＰＦ－４（血小板第４因子）、血小板塩基性タンパク質、ＩＰ－１０（炎症性タンパク質－１０）、ＥＮＡ－７８、ＭＩＰ－１α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ（単球走化性タンパク質－１）、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記コロニー刺激因子は、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記成長因子は、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来内皮細胞増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＧＦ－Ｉ（インスリン様成長因子）、ＩＧＦ－ＩＩ、ＬＩＦ（白血病抑制因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＴＧＦ－α（形質転換増殖因子）、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦβ１β２、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍壊死因子は、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記インターフェロンファミリーは、ＩＦＮ－α（インターフェロンα）、ＩＦＮ－β（インターフェロンβ）、ＩＦＮ－γ（インターフェロンγ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍マーカーは、ＣＥＡ（血清癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記老化細胞関連因子は、Ｐｌａｕ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）を含む。

もう一つの好適な例において、前記内因性タンパク質分子は、野生型の内因性タンパク質分子および突然変異型の内因性タンパク質分子を含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型は、突然変異後、コードされるタンパク質の機能が変わらない突然変異の様態（すなわち、機能が野生型によってコードされるタンパク質と同様かほぼ同様である）および機能が増強した突然変異の様態含む。

もう一つの好適な例において、前記の内因性タンパク質分子は、全長のタンパク質またはタンパク質の断片を含む。

もう一つの好適な例において、前記の内因性タンパク質分子は、哺乳動物、好ましくは齧歯動物（たとえば、マウス、ラット）、霊長動物およびヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記内因性タンパク質分子は、さらに、内因性タンパク質分子の誘導体を含む。

もう一つの好適な例において、前記内因性タンパク質分子は、修飾された内因性タンパク質分子、アミノ酸配列が天然の内因性タンパク質分子と相同のタンパク質分子、内因性タンパク質分子の二量体または多量体、内因性タンパク質分子のアミノ酸配列を含有する融合タンパク質を含む。

もう一つの好適な例において、前記修飾された内因性タンパク質分子は、ＰＥＧ化された内因性タンパク質分子である。

もう一つの好適な例において、前記「アミノ酸配列が天然の内因性タンパク質分子と相同で、かつ天然の内因性タンパク質のペプチド活性を有するタンパク質分子」とは、そのアミノ酸配列が内因性タンパク質分子と比べ、≧８５％の相同性、好ましくは≧９０％の相同性、より好ましくは≧９５％の相同性、最も好ましくは９８％の相同性を有し、そして天然の内因性タンパク質のペプチド活性を有するタンパク質分子である。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型の内因性タンパク質分子の遺伝子によってコードされるポリペプチドは野生型の内因性タンパク質分子の遺伝子によってコードされるポリペプチドと同様かほぼ同様である。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型の内因性タンパク質分子の遺伝子は、野生型の内因性タンパク質分子の遺伝子と比べ、相同性が≧８０％（好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、さらに好ましくは≧９８％または９９％）のポリヌクレオチドを含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型の内因性タンパク質分子の遺伝子は、野生型の内因性タンパク質分子の遺伝子の５’末端および／または３’末端が短縮されたか、ヌクレオチドが１～６０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個）付加されたポリヌクレオチドを含む。

もう一つの好適な例において、前記内因性タンパク質分子のアミノ酸配列は、以下の群から選ばれる：
（ｉ）配列番号１～５のいずれかで示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１～５のいずれかで示されるアミノ酸配列が１個または複数個（たとえば１～１０個）のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を経てなる、前記内因性タンパク質のペプチド活性を有する、（ｉ）から誘導されるポリペプチド；あるいは
（ｉｉｉ）アミノ酸配列が配列番号１～５のいずれかで示されるアミノ酸配列との相同性が≧８０％（好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％または≧９８％）で、前記内因性タンパク質のペプチド活性を有する、（ｉ）から誘導を有するポリペプチド。

もう一つの好適な例において、前記の内在性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）の構造は、式Ｉで表される。

［式１］
Ｌ－Ｚ１－Ｚ２－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｉ）

（式中において、
各「－」は独立に連結ペプチドまたはペプチド結合である。
Ｌは任意にシグナルペプチド配列である。
Ｚ１は内因性タンパク質分子である抗原結合ドメインである。
Ｚ２はなしか、ヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。）

もう一つの好適な例において、前記Ｌは、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃＥＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のシグナルペプチドである。

もう一つの好適な例において、前記Ｌのシグナルペプチドはヒト由来ＣＤ８のシグナルペプチドで、アミノ酸配列がＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１６）である。

もう一つの好適な例において、前記Ｌのシグナルペプチドはネズミ由来ＣＤ８のシグナルペプチドで、アミノ酸配列がＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＥＡ（配列番号１７）である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ２は、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、Ｉｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のヒンジ領域である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ２は野生型のヒンジ領域および突然変異型のヒンジ領域を含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型は、上記タンパク質のヒンジ領域において１個または複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換した融合ヒンジ領域、あるいはこれらの組み合わせを含む。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ２はヒト由来ＣＤ２８ヒンジ領域で、アミノ酸配列がＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１８）である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ２はヒト由来ＣＤ８αヒンジ領域で、アミノ酸配列がＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１９）である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ２はネズミ由来ＣＤ８αヒンジ領域で、アミノ酸配列がＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹ（配列番号２０）である。

もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ８α、ＩＣＯＳ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通領域である。

もう一つの好適な例において、前記ＴＭ膜貫通領域は野生型のタンパク質膜貫通領域および突然変異型のタンパク質膜貫通領域を含む。

もう一つの好適な例において、前記の突然変異型は、上記タンパク質の膜貫通領域において１個または複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換した融合タンパク質膜貫通領域、あるいはこれらの組み合わせを含む。

もう一つの好適な例において、前記ＴＭはヒト由来ＣＤ２８タンパク質から選ばれる膜貫通領域で、アミノ酸配列がＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号２１）である。

もう一つの好適な例において、前記ＴＭはヒト由来ＣＤ８タンパク質から選ばれる膜貫通領域で、アミノ酸配列がＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号２２）である。

もう一つの好適な例において、前記ＴＭはネズミ由来ＣＤ８タンパク質から選ばれる膜貫通領域で、アミノ酸配列がＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ（配列番号２３）である。

もう一つの好適な例において、前記Ｃは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＯＸ４０、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－Ｌ ＬＦＡ－１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢＡ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３のリガンド、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の共刺激シグナル分子である。

もう一つの好適な例において、前記のＣはヒト由来ＣＤ２８からの共刺激シグナル分子で、アミノ酸配列がＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２４）である。

もう一つの好適な例において、前記のＣはヒト由来４－１ＢＢからの共刺激シグナル分子で、アミノ酸配列がＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２５）である。

もう一つの好適な例において、前記のＣはネズミ由来ＣＤ２８からの共刺激シグナル分子で、アミノ酸配列がＮＳＲＲＮＲＬＬＱＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＬＴＲＫＰＹＱＰＹＡＰＡＲＤＦＡＡＹＲＰ（配列番号２６）である。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ３ζはＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域である。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ３ζは野生型のＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域および突然変異型のＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異型のアミノ酸配列は、上記ＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換した融合アミノ酸配列またはこれらの組み合わせを含む。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ３ζはヒト由来ＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域で、アミノ酸配列がＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２７）である。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ３ζはネズミ由来ＣＤ３ζタンパク質分子の細胞内領域で、アミノ酸配列がＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２８）である。

もう一つの好適な例において、前記内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）のアミノ酸配列は配列番号６～１０のいずれかで示される。

本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）をコードする核酸分子を提供する。

もう一つの好適な例において、前記核酸分子は、以下の群から選ばれる：
（ａ） 配列番号１～５のいずれかで示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ） 配列が配列番号１１～１５のいずれかで示されるポリヌクレオチド；
（ｃ） ヌクレオチド配列の（ｂ）で示される配列との相同性が≧７５％（好ましくは≧８０％、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％）のポリヌクレオチド；
（ｄ） （ｂ）で示されるポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端が短縮されたかヌクレオチドが１～６０個（好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個）付加されたポリヌクレオチド；
（ｅ） （ａ）～（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド。

もう一つの好適な例において、前記の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１１～１５のいずれかで示される。

もう一つの好適な例において、前記の核酸分子はポリヌクレオチドである。

本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。

もう一つの好適な例において、前記のベクターは、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。

もう一つの好適な例において、前記ベクターはレトロウイルスベクターである。

本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第二の側面に記載の核酸分子が組み込まれたか、あるいは本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲを発現する宿主細胞を提供する。

もう一つの好適な例において、前記細胞は単離された細胞で、および／または前記細胞は遺伝子工学化された細胞である。

もう一つの好適な例において、前記細胞は哺乳動物の細胞である。

もう一つの好適な例において、前記細胞はマクロファージ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。

もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、工学化された免疫細胞である。

もう一つの好適な例において、前記の工学化された免疫細胞は、マクロファージ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含み、好ましくは（ｉ）内因性キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＥＣＡＲ－Ｔ細胞）、（ｉｉ）内因性キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＥＣＡＲ－ＮＫ細胞）、（ｉｉｉ）外来Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）または（ｉｖ）内因性キメラ抗原受容体マクロファージ（ＥＣＡＲ－マクロファージ）である。

もう一つの好適な例において、前記免疫細胞は自家のものである。

もう一つの好適な例において、前記免疫細胞は非自家のものである。

もう一つの好適な例において、前記免疫細胞は内因性タンパク質分子に相応する受容体を発現する標的細胞を標的とする。

本発明の第五の側面では、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲを発現する工学化された免疫細胞を製造する方法であって、本発明の第二の側面に記載の核酸分子または本発明の第三の側面に記載のベクターをマクロファージ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の中に形質導入することにより、前記工学化された免疫細胞を得る工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記導入は、同時に、前後に、または順に導入することを含む。

もう一つの好適な例において、前記の細胞はＥＣＡＲ－マクロファージ、ＥＣＡＲ－Ｔ細胞またはＥＣＡＲ－ＮＫ細胞である。

もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、得られた工学化された免疫細胞に対して機能および有効性の検出を行う工程を含む。

本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する薬物組成物を提供する。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は液体製剤である。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物の剤形は注射剤である。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物では、前記細胞の濃度が１×１０^５～１×１０^８個細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０^６～１×１０^７個細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０^６～５×１０^６個細胞／ｍＬである。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は、さらに、細胞を殺傷するほかの薬物（たとえば、抗体薬物、ほかのＣＡＲ－Ｔ薬物または化学治療薬）を含む。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は、さらに、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲの発現を調節する薬物、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞の殺傷機能および細胞活性を調節する薬物、宿主体内における免疫反応を調節する薬物、副反応を調節する薬物（たとえば、Ｔ細胞アポトーシスシグナル経路阻害剤、サイトカインストームに抵抗する中和抗体）を含む。

本発明の第七の側面では、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞、または本発明の第六の側面に記載の薬物組成物の使用であって、（ａ）細胞の選択的な殺傷、および／または（ｂ）疾患の治療に用いられる、薬物または製剤を製造するための使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記細胞は内因性タンパク質分子に相応する受容体を含有する。

もう一つの好適な例において、前記細胞は、炎症細胞、老化細胞、腫瘍細胞、自己免疫性細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記疾患は、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍疾患は、上皮細胞由来の悪性／良性腫瘍、間葉細胞由来の悪性／良性腫瘍、血液幹細胞由来の悪性／良性腫瘍、神経上皮細胞由来の悪性／良性腫瘍からなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記アレルギー性疾患は、皮膚アレルギー性疾患、気道アレルギー性疾患、消化管アレルギー性疾患、アレルギー性ショック、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、１型糖尿病、炎症性腸疾患、セリアック病、多発性硬化症、再生不良性貧血、バセドウ病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記老化関連疾患は、老化関連肝線維化、老化関連肺線維化、老化関連アテローム性動脈硬化、老化関連糖尿病、老化関連骨関節炎、老化関連筋肉減少症、老化関連肥満症、老化関連緑内障からなる群から選ばれる。

本発明の第八の側面では、選択的に細胞を殺傷するためのキットであって、容器と、容器内に位置する本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞または本発明の第六の側面に記載の薬物組成物とを含むキットを提供する。

もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、タグまたは取扱説明書を含む。

本発明の第九の側面では、選択的に細胞を殺傷する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
治療が必要な対象に安全有効量の本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞、または本発明の第六の側面に記載の薬物組成物を施用する。

もう一つの好適な例において、前記対象はヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。

もう一つの好適な例において、前記ヒト以外の哺乳動物は、げっ歯動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ）、霊長類動物（たとえば、サル）、イノシシ科動物を含む。

もう一つの好適な例において、前記方法は非治療的かつ非診断的なものである。

本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に安全有効量の本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞または本発明の第六の側面に記載の薬物組成物を施用する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、治療が必要な対象に、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患を治療するほかの薬物を施用する工程を含む。

もう一つの好適な例において、前記ほかの薬物は、細胞を殺傷するほかの薬物（たとえば、抗体薬物、ほかのＣＡＲ－Ｔ薬物や化学治療薬）、内因性キメラ抗原受容体の発現を調節する薬物、宿主細胞の殺傷能力および細胞活性を調節する薬物、宿主体内における免疫反応を調節する薬物、副反応を調節する薬物、ＣＡＲ－Ｔ薬物を含む。

もう一つの好適な例において、前記疾患は、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍疾患は、上皮細胞由来の悪性／良性腫瘍、間葉細胞由来の悪性／良性腫瘍、血液幹細胞由来の悪性／良性腫瘍、神経上皮細胞由来の悪性／良性腫瘍からなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記アレルギー性疾患は、皮膚アレルギー性疾患、気道アレルギー性疾患、消化管アレルギー性疾患、アレルギー性ショック、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、１型糖尿病、炎症性腸疾患、セリアック病、多発性硬化症、再生不良性貧血、バセドウ病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記老化関連疾患は、老化関連肝線維化、老化関連肺線維化、老化関連アテローム性動脈硬化、老化関連糖尿病、老化関連骨関節炎、老化関連筋肉減少症、老化関連肥満症、老化関連緑内障からなる群から選ばれる。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術的特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術的特徴の間で、新しい技術方案または好適な技術方案が構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

図１は、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲプラスミドの図である。 図２は、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞系とｈＩＬ５Ｒａを発現する標的細胞を共培養した後の活性化検出である。 図３は、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞のレンチウイルスでヒトＴ細胞に回転感染させてから７２時間後のＣＡＲ発現効率である。 図４は、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴとｈＩＬ５Ｒａを発現する標的細胞を共培養した後の特異的殺傷効果である。 図５は、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴとｈＩＬ５Ｒａを発現する標的細胞を共培養した後のＩＦＮ－γ分泌の様子である。 図６は、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲプラスミドの図である。 図７は、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲレトロウイルスでマウスＴ細胞に回転感染させてから４８時間後のＣＡＲ発現効率である。 図８は、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の好酸球に対する殺傷作用である。 図９は、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の炎症性因子に対する緩和作用である。 図１０は、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の炎症に対する緩和作用である。 図１１は、ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲプラスミドの図である。 図１２は、ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ ＴとｈＰｌａｕＲを発現する標的細胞を共培養した後の特異的殺傷効果である。 図１３は、ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲプラスミドの図である。 図１４は、ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ ＴとｈＣＣＲ３を発現する標的細胞を共培養した後の特異的殺傷効果である。 図１５は、ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲプラスミドの図である。 図１６は、ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ ＴとｈＣＣＲ３を発現する標的細胞を共培養した後の特異的殺傷効果である。

具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて意外に、抗体単一ドメイン断片の代わりに内因性タンパク質分子をＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインとし、設計された内因性キメラ抗原受容体（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＡＲ、ＥＣＡＲ）は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなどの中において膜に発現されると、上記細胞は特異的に、選択的に細胞を殺傷し、そして顕著な殺傷効果を有し、また疾患、たとえば、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患を治療することができることを見出した。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。

本発明において、ＥＣＡＲ－Ｔ細胞を例とし、代表的に本発明の工学化された免疫細胞を詳しく説明する。本発明の工学化された免疫細胞は、前記と後記のＥＣＡＲ－細胞に限定されないが、前記と後記のＥＣＡＲ－細胞と同様または類似の技術的特徴および有益な効果を有する。具体的に、免疫細胞が内因性キメラ抗原受容体ＥＣＡＲを発現する場合、マクロファージ、ＮＫ細胞がＴ細胞と同等で（あるいは、Ｔ細胞がＮＫ細胞、マクロファージの代わりになれる）、免疫細胞がＴ細胞の場合、ＴＣＲがＥＣＡＲと同等である（あるいは、ＥＣＡＲがＴＣＲの代わりになれる）。

内因性タンパク質分子
本発明において、内因性タンパク質分子とは、ヒトゲノムを翻訳の鋳型とし、人体内において転写して翻訳することができる、アミノ酸が「脱水縮合」の形で構成するペプチド鎖またはタンパク質分子である。このようなタンパク質分子は、２０種類の異なるアミノ酸が連結してなるポリマーで、そして立体空間構造を有する。生理的状態において、多くのタンパク質分子は、ほかのタンパク質分子と特異的に結合する能力を有し、これはタンパク質の相互作用の過程において重要な役割を果たす。一方、病理的状態において、病理的過程の発生を促進する細胞は表面に特異的なタンパク質受容体が発現している。これに基づき、内因性タンパク質分子が連結したキメラ抗原受容体（ＥＣＡＲ）を設計し、そして殺傷細胞、たとえば、Ｔ細胞において発現させることで、ＥＣＡＲ殺傷細胞がこれらの病理的過程の発生を促進する有害な細胞に対する特異的殺傷と排除の役割を果たすようにさせる。

本発明の一つの好適な実施形態において、本発明の内因性タンパク質分子は、インターロイキンファミリー、ケモカインファミリー、コロニー刺激因子、成長因子、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、インターフェロンファミリー、腫瘍マーカー、老化細胞関連因子などの種類が好ましい。

本発明は内因性タンパク質分子およびそのバリアントに関する。

本発明の一つの好適な実施形態において、本発明の内因性タンパク質分子のアミノ酸配列は配列番号１～５のいずれかで示される。
ＩＰＴＥＩＰＴＳＡＬＶＫＥＴＬＡＬＬＳＴＨＲＴＬＬＩＡＮＥＴＬＲＩＰＶＰＶＨＫＮＨＱＬＣＴＥＥＩＦＱＧＩＧＴＬＥＳＱＴＶＱＧＧＴＶＥＲＬＦＫＮＬＳＬＩＫＫＹＩＤＧＱＫＫＫＣＧＥＥＲＲＲＶＮＱＦＬＤＹＬＱＥＦＬＧＶＭＮＴＥＷＩＩＥＳ （配列番号１、ヒト由来インターロイキン５（ＩＬ５）からのもの）；

ＭＥＩＰＭＳＴＶＶＫＥＴＬＴＱＬＳＡＨＲＡＬＬＴＳＮＥＴＭＲＬＰＶＰＴＨＫＮＨＱＬＣＩＧＥＩＦＱＧＬＤＩＬＫＮＱＴＶＲＧＧＴＶＥＭＬＦＱＮＬＳＬＩＫＫＹＩＤＲＱＫＥＫＣＧＥＥＲＲＲＴＲＱＦＬＤＹＬＱＥＦＬＧＶＭＳＴＥＷＡＭＥＧ（配列番号２、マウス由来インターロイキン５（ＩＬ５）からのもの）

ＳＮＥＬＨＱＶＰＳＮＣＤＣＬＮＧＧＴＣＶＳＮＫＹＦＳＮＩＨＷＣＮＣＰＫＫＦＧＧＱＨＣＥＩＤＫＳＫＴＣＹＥＧＮＧＨＦＹＲＧＫＡＳＴＤＴＭＧＲＰＣＬＰＷＮＳＡＴＶＬＱＱＴＹＨＡＨＲＳＤＡＬＱＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＮＲＲＲＰＷＣＹＶＱＶＧＬＫＬＬＶＱＥＣＭＶＨＤＣＡＤＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴＩＥＮＱＰＷＦＡＡＩＹＲＲＨＲＧＧＳＶＴＹＶＣＧＧＳＬＩＳＰＣＷＶＩＳＡＴＨＣＦＩＤＹＰＫＫＥＤＹＩＶＹＬＧＲＳＲＬＮＳＮＴＱＧＥＭＫＦＥＶＥＮＬＩＬＨＫＤＹＳＡＤＴＬＡＨＨＮＤＩＡＬＬＫＩＲＳＫＥＧＲＣＡＱＰＳＲＴＩＱＴＩＣＬＰＳＭＹＮＤＰＱＦＧＴＳＣＥＩＴＧＦＧＫＥＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫＭＴＶＶＫＬＩＳＨＲＥＣＱＱＰＨＹＹＧＳＥＶＴＴＫＭＬＣＡＡＤＰＱＷＫＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＳＬＱＧＲＭＴＬＴＧＩＶＳＷＧＲＧＣＡＬＫＤＫＰＧＶＹＴＲＶＳＨＦＬＰＷＩＲＳＨＴＫＥＥＮＧＬＡＬ（配列番号３、ヒト由来ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子Ｐｌａｕからのもの）

ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＱＲＬＥＳＹＲＲＩＴＳＧＫＣＰＱＫＡＶＩＦＫＴＫＬＡＫＤＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ（配列番号４、ヒト由来ＣＣＬ１１因子からのもの）；

ＶＶＩＰＳＰＣＣＭＦＦＶＳＫＲＩＰＥＮＲＶＶＳＹＱＬＳＳＲＳＴＣＬＫＡＧＶＩＦＴＴＫＫＧＱＱＦＣＧＤＰＫＱＥＷＶＱＲＹＭＫＮＬＤＡＫＱＫＫＡＳＰＲＡＲＡＶＡＶＫＧＰＶＱＲＹＰＧＮＱＴＴＣ（配列番号５、ヒト由来ＣＣＬ２４因子からのもの）

本発明は、さらに、本発明の配列番号１～５のいずれかで示される配列と５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上、たとえば９９％）の相同性を有する、同様または類似の機能を有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。

本発明のタンパク質は、組み換えタンパク質、天然タンパク質、合成タンパク質でもよい。本発明のタンパク質は、天然精製の産物、あるいは化学合成の産物、あるいは組換え技術で原核または真核宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫や哺乳動物細胞）から生成するものでもよい。組み換え生産プロセスで用いられる宿主によって、本発明のタンパク質は、グリコシル化されたものでもよく、又はグリコシル化されていないものでもよい。また、本発明のタンパク質は、開始のメチオニン残基を含有してもよく、含有しなくてもよい。

本発明のタンパク質は、さらに、内因性タンパク質分子の活性を有する、内因性タンパク質分子の断片および類似体を含む。本明細書で用いられるように、用語「断片」および「類似体」とは、基本的に本発明の天然内因性タンパク質分子と同様の生物学的機能または活性を維持するタンパク質である。

本発明の突然変異タンパク質の断片、誘導体や類似体は、（ｉ）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換された突然変異タンパク質でもよく、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、または（ｉｉ）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基がある突然変異タンパク質でもよく、または（ｉｉｉ）成熟の突然変異タンパク質と他の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのような突然変異タンパク質の半減期を延ばす化合物）と融合した突然変異タンパク質でもよく、または（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこの突然変異タンパク質に融合した突然変異タンパク質（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこの突然変異タンパク質を精製するための配列または蛋白質前駆体配列、あるいは抗原ＩｇＧ断片と形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。本発明において、保存的に置き換えたアミノ酸は、表Ｉのようにアミノ酸の置き換えを行って生成することが好ましい。

本発明は、さらに、本発明の天然の内因性タンパク質分子と５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上、たとえば９９％）の相同性を有する、同様または類似の機能を有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。タンパク質のバリアントは、いくつか（通常は１～６０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）、少なくとも一つのアミノ酸の置換、欠失または付加を経て得られる誘導配列、ならびにＣ末端および／またはＮ末端に１個または複数個（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸が付加したものでもよい。たとえば、前記タンパク質において、機能が近いか、類似するアミノ酸で置換する場合、通常、タンパク質の機能を変えることがなく、Ｃ末端および／またはＮ末端への１個または複数個のアミノ酸の付加も、通常、タンパク質の機能を変えることがない。本発明は天然の内因性タンパク質分子の類似体を含み、天然の内因性タンパク質分子との違いは、アミノ酸配列における違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態における違いでもよく、あるいは両者でもよい。これらのタンパク質の類似体は、天然の遺伝変異体または誘導された遺伝変異体を含む。誘導変異体は、様々な技術、たとえば放射または突然変異原への露出によるランダム突然変異、また部位特異的変異法またはほかの既知の分子生物学の技術によって得られる。類似体は、さらに、天然Ｌ－アミノ酸と異なる残基（たとえばＤ－アミノ酸）を有する類似体、および非天然または合成のアミノ酸（たとえばβ、γ－アミノ酸）を有する類似体を含む。もちろん、本発明のタンパク質は、上記で挙げられた代表的なタンパク質に限定されない。

修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外のタンパク質の化学的に誘導された形態、たとえばアセチル化またはカルボキシ化のものを含む。修飾は、さらに、グリコシル化を含み、たとえば、タンパク質の合成および加工においてグリコシル化修飾を行う。このような修飾は、タンパク質をグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（たとえばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。また、本発明の突然変異タンパク質を修飾してもよい。修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外の突然変異タンパク質の化学的に誘導された形態、たとえばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえば突然変異タンパク質の合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行った突然変異タンパク質も含む。このような修飾は、突然変異タンパク質をグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（たとえばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させた突然変異タンパク質または溶解性を改善した突然変異タンパク質を含む。

また、本発明は、内因性タンパク質分子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含み、ＤＮＡは一本鎖のものまたは二本鎖のものでもよい。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。さらに、本発明は、本発明と同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は、天然に発生した対立遺伝子変異体でも非天然に発生した変異体でもよい。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態で、１つまたは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入でもよいが、実質的にコードするポリペプチドの機能を変えることはない。

本明細書に記載のヌクレオチド配列に基づき、当業者は便利に様々な既知の方法によって本発明のコード核酸を製造することができる。これらの方法は、たとえば、ＰＣＲ、ＤＮＡ人工合成などを含むが、これらに限定されず、具体的な方法はＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋの「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」を参照することができる。本発明の一つの実施形態として、ヌクレオチド配列を分けて合成し、さらにオーバーラップエクステンションＰＣＲの方法によって本発明のコード核酸配列を構築することができる。

本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、たとえば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。
本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドは、好ましくは分離された形態で提供し、より好ましくは均質に精製される。

本発明のポリヌクレオチドの全長配列は、通常、ＰＣＲ増幅法、組み換え法または人工合成の方法で得られる。ＰＣＲ増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、２回または２回以上のＰＣＲ増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。

関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。

また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。

現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。

本発明のポリヌクレオチドを得るには、ＰＣＲ技術でＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が好適に使用される。特にライブラリーから全長のｃＤＮＡを得ることが困難な場合、好適にＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ－ｃＤＮＡ末端快速増幅法）を使用し、ＰＣＲに使用されるプライマーはここで公開された本発明の配列情報によって適切に選択し、かつ通常の方法で合成することができる。通常の方法、たとえばゲル電気泳動によって増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片を単離、精製することができる。

抗原結合ドメイン
本発明において、キメラ抗原受容体ＣＡＲの抗原結合ドメインが特異的に細胞表面における内因性タンパク質分子とマッチする受容体（たとえば、ＩＬ－５、ＩＬ－１７の受容体）に結合する。

ヒンジ領域と膜貫通領域
ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、ＣＡＲはＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天然のＣＡＲにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例において、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このようなドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。

膜貫通ドメインは天然由来のものまたは合成由来のものでもよい。天然由来のものでは、当該ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質からのものでもよい。好適に、本発明のＣＡＲにおけるヒンジ領域がＣＤ８αのヒンジ領域またはＣＤ２８のヒンジ領域で、本発明の膜貫通領域はＣＤ８αの膜貫通領域またはＣＤ２８の膜貫通領域である。

細胞内ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞内ドメインまたはほかの細胞内シグナル伝達ドメインは、その中にＣＡＲが置かれた免疫細胞の少なくとも一つの正常なエフェクター機能の活性化の原因となる。用語「エフェクター機能」とは、細胞の専有機能である。たとえば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカイン分泌を含む細胞溶解活性または補助活性でもよい。そのため、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞が専有機能を実行するようにガイドするタンパク質である。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用してもよいが、多くの例において、必ず鎖全体を使用することはない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分の使用について、このような短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達するものであれば、完全な鎖の代わりに使用してもよい。そのため、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含む。

本発明のＣＡＲに用いられる細胞内シグナル伝達ドメインの好適な例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内配列および協同作用して抗原受容体に結合するとシグナル伝達が開始する共受容体、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同様に機能する能力を有する任意の合成配列を含む。

好適な実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは自身にＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが含まれているように設計されてもよく、あるいは本発明のＣＡＲの内容において有用な任意のほかの望ましい細胞内ドメイン（一つまたは複数）と併用してもよい。たとえば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含んでもよい。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部である。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子是、抗原受容体またはそのリガンドではない。好適に、ＣＤ２８、４－１ＢＢなどを含む。

本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分における細胞内シグナル伝達配列は、ランダムに、または所定の順に互いに連結してもよい。任意に、短いオリゴペプチドまたはポリペプチド連結体は、好適に長さが２および１０のアミノ酸で、そのように連結してもよい。グリシン－セリン二量体は特に適切な連結体を提供する。
一つの実施形態において、本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン（共刺激分子）およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計されている。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ免疫抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識領域、通常、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖可変断片）、膜貫通領域および細胞内共刺激シグナル領域からなる。ＣＡＲの設計は以下の過程を経てきた。第一世代のＣＡＲは一つのみの細胞内シグナル成分のＣＤ３ζまたはＦｃγＲＩ分子を有し、細胞内に一つの活性化ドメインしかないため、短時間のＴ細胞増殖および少ないサイトカイン分泌しか引き起こせず、長時間のＴ細胞増殖シグナルおよび持続的な体内抗腫瘍効果を提供することができるため、臨床治療効果が十分に得られない。第二世代のＣＡＲは元の構造に基づいて一つの共刺激分子、たとえばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳが導入され、第一世代のＣＡＲよりも機能が大幅に向上し、さらにＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および腫瘍細胞に対する殺傷能力を強化する。第二世代のＣＡＲに基づいて一部の新たな免疫共刺激分子、たとえばＣＤ２７、ＣＤ１３４を直列連結すると、第三世代および第四世代のＣＡＲに発展してきた。

ＣＡＲの細胞外断片は特異的な抗原を認識し、さらに細胞内ドメインによって当該シグナルを伝達し、細胞の活性化・増殖、細胞溶解毒性およびサイトカインの分泌を引き起こし、よって標的細胞を除去する。まず、患者の自家細胞（または異系ドナー）を分離し、活性化させて遺伝子改変し、ＣＡＲの免疫細胞が生成した後、同患者の体内に注入する細胞療法を含む。このような方法では、移植片対宿主病に罹る確率は極めて低く、抗原は免疫細胞によってＭＨＣに拘束されずに認識される。
ＣＡＲ－免疫細胞による治療は血液悪性腫瘍の治療において非常に高い臨床反応率が得られ、このような高反応率は従来の治療手段のいずれでも実現できないもので、世界中で臨床研究のブームを引き起こした。

具体的に、本発明の内因性キメラ抗原受容体（ＥＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域および／またはζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子で、抗原受容体またはそのリガンドではない。
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、リンカーを導入してもよい。本明細書で用いられるように、用語「リンカー」とは、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに連結させる作用を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドをいう。リンカーは、０～３００個のアミノ酸、好ましくは２～１００個のアミノ酸、最も好ましくは３～５０個のアミノ酸を含んでもよい。

本発明のＥＣＡＲがＴ細胞において発現される場合、抗原結合の特異性に基づいて抗原を認識することができる。ＥＣＡＲが標的細胞の表面の特異的抗原と結合すると、ＥＣＡＲ Ｔ細胞を活性化させ、そしてＥＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を殺傷するようにさせる。抗原結合ドメインは、共刺激分子および／またはζ鎖から由来する一つまたは複数の細胞内ドメインと融合することが好ましい。好ましくは、抗原結合ドメインはＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ζシグナルドメインと組み合わせた細胞内ドメインと融合している。

一つの好適な実施形態において、本発明のＥＣＡＲの抗原結合部分は、内因性タンパク質分子に相応する（マッチする）受容体を標的とする。一つの好適な実施形態において、本発明のＥＣＡＲの抗原結合部分は、内因性タンパク質分子にマッチする受容体を標的とする内因性タンパク質分子である。

一つの好適な実施形態において、内因性タンパク質分子はバリアントの様態を含み、前記バリアントはその野生型の内因性タンパク質分子のタンパク質配列と≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、≧９８％または≧９９％の相同性を有する。

本発明において、本発明の内因性タンパク質分子は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の内因性タンパク質分子のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。

本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸数は、好ましくは元のアミノ酸配列の合計アミノ酸数の４０％以下、より好ましくは３５％以下、より好ましくは１～３３％、より好ましくは５～３０％、より好ましくは１０～２５％、より好ましくは１５～２０％である。

本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸の数は、通常、１、２、３、４または５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個である。

ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、ＣＡＲはＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天然のＣＡＲにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例において、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このようなドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。

本発明のＥＣＡＲの細胞外ドメインは内因性タンパク質分子、好ましくは特定の配列を有する内因性タンパク質分子を含む。

本発明において、本発明のＥＣＡＲにおける細胞内ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の共刺激因子、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。

本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＥＣＡＲのアミノ酸配列は配列番号６～１０のいずれかで示される。

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＩＰＴＥＩＰＴＳＡＬＶＫＥＴＬＡＬＬＳＴＨＲＴＬＬＩＡＮＥＴＬＲＩＰＶＰＶＨＫＮＨＱＬＣＴＥＥＩＦＱＧＩＧＴＬＥＳＱＴＶＱＧＧＴＶＥＲＬＦＫＮＬＳＬＩＫＫＹＩＤＧＱＫＫＫＣＧＥＥＲＲＲＶＮＱＦＬＤＹＬＱＥＦＬＧＶＭＮＴＥＷＩＩＥＳＲＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ （配列番号６、内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）ｈＣＤ２８シグナルペプチド－ｈＩＬ５－ｈＣＤ２８ヒンジ領域－ｈＣＤ２８膜貫通領域－ｈＣＤ２８共刺激分子－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ）

ＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＥＡＭＥＩＰＭＳＴＶＶＫＥＴＬＴＱＬＳＡＨＲＡＬＬＴＳＮＥＴＭＲＬＰＶＰＴＨＫＮＨＱＬＣＩＧＥＩＦＱＧＬＤＩＬＫＮＱＴＶＲＧＧＴＶＥＭＬＦＱＮＬＳＬＩＫＫＹＩＤＲＱＫＥＫＣＧＥＥＲＲＲＴＲＱＦＬＤＹＬＱＥＦＬＧＶＭＳＴＥＷＡＭＥＧＲＡＡＡＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＮＳＲＲＮＲＬＬＱＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＬＴＲＫＰＹＱＰＹＡＰＡＲＤＦＡＡＹＲＰＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＧＳＧ （配列番号７、ｍＣＤ８αシグナルペプチド－ｍＩＬ５－ｍＣＤ８αヒンジ領域－ｍＣＤ８α膜貫通領域－ｍＣＤ２８共刺激分子－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ）

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＮＥＬＨＱＶＰＳＮＣＤＣＬＮＧＧＴＣＶＳＮＫＹＦＳＮＩＨＷＣＮＣＰＫＫＦＧＧＱＨＣＥＩＤＫＳＫＴＣＹＥＧＮＧＨＦＹＲＧＫＡＳＴＤＴＭＧＲＰＣＬＰＷＮＳＡＴＶＬＱＱＴＹＨＡＨＲＳＤＡＬＱＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＮＲＲＲＰＷＣＹＶＱＶＧＬＫＬＬＶＱＥＣＭＶＨＤＣＡＤＧＫＫＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫＩＩＧＧＥＦＴＴＩＥＮＱＰＷＦＡＡＩＹＲＲＨＲＧＧＳＶＴＹＶＣＧＧＳＬＩＳＰＣＷＶＩＳＡＴＨＣＦＩＤＹＰＫＫＥＤＹＩＶＹＬＧＲＳＲＬＮＳＮＴＱＧＥＭＫＦＥＶＥＮＬＩＬＨＫＤＹＳＡＤＴＬＡＨＨＮＤＩＡＬＬＫＩＲＳＫＥＧＲＣＡＱＰＳＲＴＩＱＴＩＣＬＰＳＭＹＮＤＰＱＦＧＴＳＣＥＩＴＧＦＧＫＥＮＳＴＤＹＬＹＰＥＱＬＫＭＴＶＶＫＬＩＳＨＲＥＣＱＱＰＨＹＹＧＳＥＶＴＴＫＭＬＣＡＡＤＰＱＷＫＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＳＬＱＧＲＭＴＬＴＧＩＶＳＷＧＲＧＣＡＬＫＤＫＰＧＶＹＴＲＶＳＨＦＬＰＷＩＲＳＨＴＫＥＥＮＧＬＡＬＲＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ （配列番号８、ｈＣＤ２８シグナルペプチド－ｈＰｌａｕ－ｈＣＤ２８ヒンジ領域－ｈＣＤ２８膜貫通領域－ｈＣＤ２８共刺激分子－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列、ｈＰＬａｕ－ＥＣＡＲ）

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＱＲＬＥＳＹＲＲＩＴＳＧＫＣＰＱＫＡＶＩＦＫＴＫＬＡＫＤＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰＲＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ （配列番号９、ｈＣＤ２８シグナルペプチド－ｈＣＣＬ１１－ｈＣＤ２８ヒンジ領域－ｈＣＤ２８膜貫通領域－ｈＣＤ２８共刺激分子－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列、ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ）

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＶＶＩＰＳＰＣＣＭＦＦＶＳＫＲＩＰＥＮＲＶＶＳＹＱＬＳＳＲＳＴＣＬＫＡＧＶＩＦＴＴＫＫＧＱＱＦＣＧＤＰＫＱＥＷＶＱＲＹＭＫＮＬＤＡＫＱＫＫＡＳＰＲＡＲＡＶＡＶＫＧＰＶＱＲＹＰＧＮＱＴＴＣＲＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ （配列番号１０、ｈＣＤ２８シグナルペプチド－ｈＣＣＬ２４－ｈＣＤ２８ヒンジ領域－ｈＣＤ２８膜貫通領域－ｈＣＤ２８共刺激分子－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列、ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ）

本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＥＣＡＲのヌクレオチド配列は配列番号１１～１５のいずれかで示される。

ここで、配列番号６において、１～５４番目はシグナルペプチドで、５５～３９９番目は内因性タンパク質分子（たとえば、ヒトＩＬ５）で、４１２～５２８番目はヒンジ領域（たとえば、ヒトＣＤ２８のヒンジ領域）で、５２９～６０９番目は膜貫通領域（たとえば、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域）で、６１０～７３２番目は共刺激エレメント（たとえば、ヒトＣＤ２８の共刺激エレメント）で、７３３～１０６８番目はＣＤ３ζである。

ここで、配列番号７において、１～８１番目はシグナルペプチドで、８２～４２０番目は内因性タンパク質分子（たとえば、ネズミＩＬ５）で、４３３～５７０番目はヒンジ領域（たとえば、ネズミＣＤ８αのヒンジ領域）で、５７１～６３３番目は膜貫通領域（たとえば、ネズミＣＤ８αの膜貫通領域）で、６４０～７６２番目は共刺激エレメント（たとえば、マウスＣＤ２８の共刺激エレメント）で、７６３～１１０１番目はＣＤ３ζである。

ここで、配列番号８において、１～５４番目はシグナルペプチドで、８２～１３１４番目は内因性タンパク質分子（たとえば、ヒトＰｌａｕ）で、１３２７～１４４３番目はヒンジ領域（たとえば、ヒトＣＤ２８のヒンジ領域）で、１４４４～１５２４番目は膜貫通領域（たとえば、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域）で、１５２５～１６４７番目は共刺激エレメント（たとえば、ヒトＣＤ２８の共刺激エレメント）で、１６４８～１９８３番目はＣＤ３ζである。

ここで、配列番号９において、１～５４番目はシグナルペプチドで、８２～３０３番目は内因性タンパク質分子（たとえば、ヒトＣＣＬ１１）で、３１６～４３２番目はヒンジ領域（たとえば、ヒトＣＤ２８のヒンジ領域）で、４３３～５１３番目は膜貫通領域（たとえば、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域）で、５１４～６３６番目は共刺激エレメント（たとえば、ヒトＣＤ２８の共刺激エレメント）で、６３７～９７２番目はＣＤ３ζである。

ここで、配列番号１０において、１～５４番目はシグナルペプチドで、８２～３６０番目は内因性タンパク質分子（たとえば、ヒトＣＣＬ２４）で、３７３～４８９番目はヒンジ領域（たとえば、ヒトＣＤ２８のヒンジ領域）で、４９０～５７０番目は膜貫通領域（たとえば、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域）で、５７１～６９３番目は共刺激エレメント（たとえば、ヒトＣＤ２８の共刺激エレメント）で、６９４～１０２９番目はＣＤ３ζである。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＣＡＲ－Ｔ」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」、「抗原受容体Ｔ細胞」、「ＥＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＥＣＡＲ－Ｔ」、「本発明のＥＣＡＲ－Ｔ細胞」、「本発明のＥＣＡＲ－Ｔ細胞」、「内因性キメラ抗原受容体Ｔ細胞」は、いずれも、本発明の第六の側面に記載のＥＣＡＲ－Ｔ細胞を指し、本発明のＥＣＡＲ－Ｔ細胞は内因性タンパク質分子に相応する（マッチする）受容体を標的とし、細胞（たとえば、炎症細胞、老化細胞、腫瘍細胞、自己免疫性細胞）を殺傷または滅殺するか、疾患（たとえば、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患）を治療することができる。
ＣＡＲ－Ｔ細胞はほかのＴ細胞に基づいた治療手段よりも以下の優勢がある。（１）ＣＡＲ－Ｔ細胞の作用過程はＭＨＣに制限されない。（２）多くの細胞が同様の抗体を発現するため、ある抗原に対するＣＡＲ遺伝子の構築が完成されると、幅広く利用することが可能になる。（３）ＣＡＲはタンパク質抗原も、糖脂質の非タンパク質抗原も利用できるため、抗原の標的範囲が広がる。（４）患者の自家細胞を使用するため、拒絶反応のリスクが降下する。（５）ＣＡＲ－Ｔ細胞は免疫記憶機能を有するため、長期間体内で生存することができる。

本発明において、本発明のＣＡＲは、（ｉ）内因性タンパク質分子である、細胞外ドメイン、（ｉｉ）任意のヒンジ領域、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｖ）共刺激因子、および（ｖ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。

キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「ＣＡＲ－ＮＫ」、「本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「抗原受容体ＮＫ細胞」、「ＥＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「ＥＣＡＲ－ＮＫ」、「本発明のＥＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「本発明のＥＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「内因性抗原受容体ＮＫ細胞」は、いずれも、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞は内因性タンパク質分子に相応する（マッチする）受容体を標的とし、細胞（たとえば、炎症細胞、老化細胞、腫瘍細胞、自己免疫性細胞）を殺傷または滅殺することができる。

ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は主要な免疫エフェクター細胞で、非抗原特異的経路を介して生体をウイルス感染および腫瘍細胞の侵襲から守る。工学化（遺伝子改変）されたＮＫ細胞により、特異的に細胞抗原を認識する能力および増強した細胞を殺傷または滅殺する作用を含む新たな機能が得られる。

自家ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べ、ＣＡＲ－ＮＫ細胞はさらに以下の利点がある。たとえば、（１）パーフォリンおよびグランザイムを放出することによって直接細胞を殺傷するが、生体の正常細胞に殺傷作用がない。（２）僅かなサイトカインを放出するため、サイトカインストームのリスクが降下する。（３）体外で増幅して「既成の」製品になることが非常に容易である。それ以外、ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療と類似する。

キメラ抗原受容体マクロファージ（ＣＡＲ－マクロファージ）
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ－マクロファージ細胞」、「ＣＡＲ－マクロファージ」、「本発明のＣＡＲ－マクロファージ」、「本発明のＣＡＲ－マクロファージ」、「抗原受容体マクロファージ」、「ＥＣＡＲ－マクロファージ細胞」、「ＥＣＡＲ－マクロファージ」、「本発明のＥＣＡＲ－マクロファージ」、「本発明のＥＣＡＲ－マクロファージ」、「内因性抗原受容体マクロファージ」は、いずれも、本発明の第一の側面に記載のＥＣＡＲ－マクロファージを指す。本発明のＣＡＲ－マクロファージは内因性タンパク質分子にマッチする受容体を標的とし、細胞（たとえば、炎症細胞、老化細胞、腫瘍細胞、自己免疫性細胞）を殺傷または滅殺するか、疾患（たとえば、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患）を治療することができる。

外因性Ｔ細胞抗原受容体
本明細書で用いられるように、外因性Ｔ細胞抗原受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は遺伝子移行技術によって腫瘍反応性Ｔ細胞からＴＣＲのα鎖とβ鎖をクローニングし、遺伝子工学の手段により、レンチウイルスまたはレトロウイルスをベクターとし、外因的にＴ細胞内に導入されたＴＣＲである。
外因性ＴＣＲで修飾されたＴ細胞は細胞を特異的に認識して殺傷することができ、そしてＴＣＲと特異性抗原の親和力を最適化させすることにより、Ｔ細胞と殺傷される細胞の親和力を向上させ、細胞を殺傷または滅殺する効果を上げることができる。

ベクター
所期の分子をコードする核酸配列は本分野で既知の組み換え方法、たとえば遺伝子を発現する細胞においてライブラリーをスクリーニングすること、既知の当該遺伝子を含むベクターから当該ベクターを得ること、あるいは標準の技術で当該遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって得ることができる。必要により、興味のある遺伝子は合成によって生産することもできる。

また、本発明は本発明の発現カセットが挿入されたベクターを提供する。レトロウイルス、たとえばレンチウイルス由来のベクターは、導入された遺伝子の長期間で、安定した組み込みおよびその子細胞における増殖を可能にするため、長期間の遺伝子の移動を実現させる適切な道具である。レンチウイルスは、増殖しない細胞、たとえば肝細胞に導入することができるため、発癌性レトロウイルス、たとえばマウス白血病ウイルスのベクターを超える利点を持つ。また、低免疫原性という利点もある。

簡単に要約すると、通常、本発明の発現カセットまたは核酸配列を操作可能にプロモーターに連結し、そしてそれを発現ベクターに組み込む。当該ベクターは、真核細胞の複製および組み込みに適する。典型的なクローニングベクターは、所期の核酸配列の発現を調節するのに使用できる転写と翻訳のターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。

本発明の発現構築体は標準の遺伝子送達プロトコールによって、核酸免疫および遺伝子療法に使用することもできる。遺伝子送達の方法は、本分野では既知である。たとえば、米国特許番号５，３９９，３４６、５，５８０，８５９、５，５８９，４６６を参照し、ここで引用によって全文を取り込む。もう一つの実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。

当該核酸は様々な種類のベクターにクローニンすることができる。たとえば、当該核酸がクローニングできるベクターは、プラスミド、ファージ、ファージ誘導体、動物ウイルスやコスミドを含むが、これらに限定されない。特定の興味のあるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。

さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態によって細胞に提供することができる。ウイルスベクターの技術は本分野公知のもので、そしてたとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびほかのウイルス学と分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスやレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。通常、適切なベクターは少なくとも１種類の有機体において作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素切断部位および１つまたは複数の選択できるマーカーを含む（たとえば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８および米国特許番号６，３２６，１９３）。

すでに多くのウイルスに基づいたシステムが開発され、哺乳動物細胞への遺伝子の導入に使用されている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットホームを提供する。本分野で既知の技術によって選択された遺伝子をベクターに挿入してレトロウイルス顆粒にパッケージングすることができる。当該組み換えウイルスは、さらに分離されて体内または体外の対象細胞に送達される。多くのレトロウイルスシステムは本分野では既知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターは本分野では既知である。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。

付加のプロモーターエレメント、たとえばエンハンサーは転写が開始する頻度を調節することができる。通常、これらは開始点の上流の３０～１１０ ｂｐの領域に位置するが、最近、多くのプロモーターは開始点の下流の機能エレメントも含むことが明らかになった。プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが別のエレメントに対して逆さまになったか、移動した場合、プロモーターの機能が維持できるように、可動性のものが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低下することなく、５０ ｂｐまで増加することができる。プロモーターによって、単一のエレメントは共同にまたは独立に作用し、転写を開始させる。

適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。当該プロモーター配列は操作可能にそれに連結した任意のポリヌクレオチド配列を高レベルで発現させることができる強力な構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターのもう一例は、伸長因子１α（ＥＦ－１α）である。しかし、ほかの構成型プロモーター配列を使用してもよく、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ）ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されず、ヒト遺伝子プロモーターは、たとえばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーターやクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は構成型プロモーターの使用に限定されない。誘導型プロモーターも本発明の一部として考えられる。誘導型プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、それによって、そのような発現が必要な場合、操作可能に誘導型プロモーターに連結したポリヌクレオチド配列の発現を開始させ、あるいは発現が必要ではない場合、発現を終止させることができる。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターやテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。

ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入された発現ベクターは選択できるマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のうちの任意の一方または両方を含むようにすることによって、ウイルスベクターで形質導入または感染された細胞群から発現細胞を同定および選択することもできる。また、選択できるマーカーは単独のＤＮＡ断片に載せて共形質移入のプロセスに使用することができる。選択できるマーカー遺伝子およびレポーター遺伝子の両者の隣接する領域には、いずれも適切な調節配列を有することによって、宿主細胞において発現できるようにしてもよい。有用な選択できるマーカーは、たとえば抗生物質耐性遺伝子、たとえばｎｅｏなどを含む。

レポーター遺伝子は形質導入された可能性のある細胞の同定および調節配列の機能性の評価に使用される。通常、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織に存在しないか、レシピエントの有機体または組織によって発現され、そしてその発現が容易に検出できる性質、たとえば酵素活性によって明確に示すことができるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがすでにレシピエントの細胞に導入されると、レポーター遺伝子の発現は適切な時間で測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、分泌型アルカリホスファターゼや緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む（たとえば、Ｕｉ－Ｔｅｉら，２０００ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ４７９：７９－８２）。適切な発現系は公知で、かつ既知の技術によって製造するか、市販品として入手することができる。通常、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、少なくとも５つのフランキング領域を有する構築体はプロモーターと同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、かつ試薬のプロモーターを調節して転写を活性化させる能力の評価に使用することができる。

遺伝子を細胞に導入する方法および細胞において遺伝子を発現させる方法は、本分野では既知である。発現ベクターの内容において、ベクターは本分野における任意の方法によって宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母や昆虫の細胞に容易に導入することができる。たとえば、発現ベクターは物理、化学または生物学の手段によって宿主細胞に導入することができる。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を生産する方法は本分野では公知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照する。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好適な方法は、リン酸カルシウム形質導入である。

興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターを使用する方法を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、すでに最も幅広く使用される、遺伝子を哺乳動物、たとえばヒト細胞に挿入する方法になっている。ほかのウイルスベクターはレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどからのものでもよい。例えば、米国特許番号５，３５０，６７４および５，５８５，３６２を参照する。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、コロイド分散系、たとえば大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、やリポソームを含む脂質に基づいた系を含む。体外および体内の送達担体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用される例示的なコロイド系はリポソーム（たとえば、人工膜小胞）である。

非ウイルス送達系を使用する場合、例示的な送達担体はリポソームである。脂質製剤を使用し、核酸を宿主細胞に導入することが考えられる（体外、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）または体内）。また、当該核酸は脂質と関連してもよい。脂質と関連した核酸は、リポソームの水性の内部に封入し、リポソームの脂質二重層に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者に連結する連結分子を介してリポソームに接着し、リポソームに取り込まれ、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と配合し、懸濁液として脂質に含まれ、ミセルに含まれるか、ミセルと複合体化し、あるいはほかの形態で脂質と結合することができる。組成物と関連する脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターは溶液における具体的な構造のいずれにも限定されない。たとえば、二重層の構造において、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。簡単に溶液に分散し、大きさや形状が異なる集合体を形成してもよい。脂質は脂肪物質で、天然の脂質でも合成の脂質でもよい。たとえば、脂質は細胞質で自然に発生する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、たとえば脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類やアルデヒド類のような化合物を含む。

本発明の一つの好適な実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。

製剤
本発明は、本発明の第一の側面に記載のＣＡＲ、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを提供する。一つの実施形態において、前記製剤は液体製剤である。好ましくは、前記製剤は注射剤である。好適に、前記製剤において、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度が１×１０^５～１×１０^８個細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０^６～１×１０^７個細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０^６～５×１０^６個細胞／ｍＬである。一つの実施形態において、前記製剤は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の製剤は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。

治療的使用
本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された細胞（たとえば、Ｔ細胞）で行われる治療的使用を含む。形質導入された細胞は、内因性タンパク質分子に相応する（マッチする）受容体を標的とし、協同してＴ細胞を活性化させ、免疫応答を引き起こすことで、細胞に対する殺傷または滅殺効率を顕著に向上させることができる。

そのため、本発明は、哺乳動物の標的細胞群または組織に対するＴ細胞による免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を施用する工程を含む方法も提供する。

一つの実施形態において、本発明は、患者の自己Ｔ細胞（または異系ドナー）を分離し、活性化させて遺伝子改変し、ＥＣＡＲ－Ｔ細胞が生成した後、同患者の体内に注入する細胞療法を含む。このような方法では、移植片対宿主病に罹る確率は極めて低く、抗原はＴ細胞によってＭＨＣに拘束されずに認識される。また、一つのＥＣＡＲ－Ｔで当該内因性タンパク質分子に相応する受容体を発現するすべての疾患を治療することができる。抗体療法と異なり、ＥＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で複製可能で、持続的な細胞の殺傷または滅殺の制御につながる長期間の持久性が生じる。

一つの実施形態において、本発明のＥＣＡＲ－Ｔ細胞は安定した体内におけるＴ細胞の増殖を経て延長した時間で持続することができる。また、ＥＣＡＲによる免疫応答は養子免疫療法の工程の一部でもよく、ここで、ＥＣＡＲ－修飾Ｔ細胞は、Ｔ細胞が標的細胞に対して特異的な免疫応答をするように誘導する。

本明細書で公開されたデータは、具体的に内因性タンパク質分子、ヒンジおよび膜貫通領域、およびＣＤ２８とＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを公開したが、本発明は構築体の各構成部分の任意の数の変化を含むと解釈されるべきである。

治療できる疾患は、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、老化細胞関連疾患を含む。

本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は哺乳動物に対する体外免疫および／または体内療法のワクチンとしても有用である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

体外免疫について、ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも一つが細胞を哺乳動物に施用する前に体外で行われる。

体外プロトコールは本分野では公知で、そして後記でより完全に検討される。簡単に言えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離して本明細書で公開されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾を行う（すなわち、体外形質転換または形質導入）。ＣＡＲ修飾細胞は哺乳動物のレシピエントに施用し、治療の有益な効果を提供することができる。哺乳動物のレシピエントはヒトでもよく、そしてＣＡＲ修飾細胞はレシピエント自身の細胞でもよい。必要により、細胞はレシピエントに対して同種異系、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）または異種でもよい。

体外免疫について細胞に基づいたワクチン以外、本発明は、体内免疫によって患者における抗原に対する免疫応答を引き起こす組成物および方法も提供する。
本発明は、疾患を治療する方法であって、それが必要な対象に治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を施用する工程を含む方法を提供する。

本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は単独で、または薬物組成物として希釈剤および／またはほかの成分やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、本明細書に記載の標的細胞群を含み、一つまたは複数の薬学または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせてもよい。このような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。

本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病床、および患者の疾患の種類と重篤度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。

「免疫学的な有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０^４～１０^９個細胞／ｋｇ体重の投与量、好ましくは１０^５～１０^６個細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８）によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、患者の疾患の所見をモニタリングしてそれに基づいて調整して治療することができ、医学分野の技術者によって容易に決めることができる。

対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用される。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物はｉ．ｖ．注射によって施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は、直接、殺傷される細胞、腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入されてもよい。

本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのＴ細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増殖した細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、アザシチジン（ＡＲＡ－Ｃとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはＭＳ患者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療またはＰＭＬ患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやＦＫ５０６、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。

患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。ヒトへ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０^６個～１×１０^１０個の本発明の修飾されたＴ細胞を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。

本発明の主な利点は以下の通りである。
（１） 本発明において、初めて、抗体単一ドメイン断片の代わりに内因性タンパク質分子をＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインとし、設計された内因性キメラ抗原受容体（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＡＲ、ＥＣＡＲ）は、特異的に、選択的に数種類の細胞を殺傷することができ、そして顕著な殺傷効果を有することが見出された。

（２） 本発明において、初めて、内因性タンパク質分子をキメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインとし、新たな内因性キメラ抗原受容体（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｅＣＡＲ）が構築され、その細胞外結合ドメインの遺伝子配列が人体に存在するタンパク質の分子鎖から選ばれるため、人体内において拒絶反応を避けて良い耐性を有する。

（３） 本発明において、体内ですでにリガンドがあることが見出された抗原を標的とし、抗体単一ドメイン断片の代わりに内因性タンパク質分子をＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインとし、内因性キメラ抗原受容体（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＡＲ）が設計された。本発明の方法により、時間コストが大幅に短縮され、経済的コストが削減され、そして抗体の製造とスクリーニングの過程が避けられる。

（４） 本発明で設計された内因性キメラ抗原受容体は、完全に内因性タンパク質分子鎖からなるため、従来の外因性単一ドメイン抗体を持つキメラ抗原受容体と異なり、人体内において拒絶反応につながらない。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。

特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。

実施例１：ｈＣＤ８αシグナルペプチド－ｈＩＬ５（内因性タンパク質分子）－ｈＣＤ２８ヒンジ領域－ｈＣＤ２８膜貫通領域－ｈＣＤ２８細胞内ドメイン（共刺激分子）－ｈＣＤ３ζ遺伝子配列の確認およびレンチウイルスベクターの構築
ＮＣＢＩデータベースからヒトＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子配列、ヒトＩＬ５の遺伝子配列、ヒトＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子配列、ヒトＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子配列、ヒトＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子配列およびヒトＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子配列を検索した。

Tsingke Biotech Co., Ltd.に依頼してヒトＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子のコード領域の配列、ヒトＩＬ５の遺伝子のコード領域の配列、ヒトＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子のコード領域の配列、ヒトＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子のコード領域の配列、ヒトＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子のコード領域の配列およびヒトＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子のコード領域の配列の順で完全なｈＩＬ５－ＥＣＡＲ遺伝子配列を合成し、そしてＰＣＲ法およびVazyme Biotech Co.,Ltd.の非リガーゼ依存型単一断片快速クローニングキットによってｈＩＬ５－ＥＣＡＲをＰＨＡＧＥレンチウイルスプラスミドに連結させた。連結産物で感受性細胞（ＤＨ５α、Tsingke Biotech Co., Ltd.）を形質転換させ、プレートに塗布して一晩置き、単一のクローンを選び、そしてTsingke Biotech Co., Ltd.に送ってシークエンシングを行い、シークエンシング結果を比較し、プラスミドの構築が成功したか確認した。

康為世紀社のプラスミドマキシキットで精製されたｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスプラスミドを抽出した（プラスミドの図示は図１に示される）。

実施例２：ｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスのパッケージングと濃縮
実施例１で得られたｈＩＬ５－ＥＣＡＲプラスミドでＰＥＩ法で２９３Ｔを形質導入する方法によってウイルスをパッケージングし、そして超遠心法によってウイルスを濃縮したが、具体的な工程は以下の通りである。
１日目：継代数が２０代未満でかつ細胞密度が約９０％の２９３Ｔ細胞を選び、３０％の細胞密度で３０ｍＬ ＤＭＥＭ完全培地を含有する１５ｃｍシャーレに敷き、細胞を十分に均一に混合し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養した。
２日目：２９３Ｔ細胞密度が７０％～９０％に達したのが観察されると、培地を捨て、２７ｍＬの新しい１０％血清含有ＤＭＥＭ培地を入れ、形質導入に備えた。プラスミド混合物の準備：クリーンな１５ｍＬ遠心管にＤＭＥＭ培地を１５００μＬ入れ、そして実施例１で得られたｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスプラスミド２２．５μｇ、ｐｓＰＡＸ２ １６．８７５μｇおよびｐＭＤ２．Ｇ ５．６２５μｇを入れ、十分に均一に混合した。別途にクリーンな１５ｍＬ遠心管を取り、ＤＭＥＭ培地を１５００μＬ入れ、そしてShanghai Yisheng Bio-Technology Co., Ltd.のＰＥＩ ４００００形質導入試薬を１１２．５μＬ入れ、十分に均一に混合した。ＰＥＩ混合物をプラスミド混合物に滴下し、十分に均一に混合し、２０ｍｉｎ静置した。上記３ｍＬ混合物をシャーレ壁に沿って２９３Ｔ細胞シャーレに入れ、３７℃で８ｈ培養し、培地を吸い取って捨て、軽くシャーレ壁に沿って改めて３０ｍＬの加熱しておいた新たな１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地を入れた。
４日目：形質導入から３６～４８ｈ後、ウイルス上清を収集して０．２２μｍフィルターでろ過した。ろ過した上清を超遠心管に移してバランスを取り、４℃の条件において超遠心機で回転数３５０００ｒｐｍで９０ｍｉｎ遠心した。遠心終了後、上清を吸い取って捨て、ウイルス原液３０ｍＬあたり得られた沈殿を３００μＬ ＤＭＥＭ培地で再懸濁させ、得られた濃縮できたｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルス液は２４ｈ内で感染に使用したか、あるいは－８０℃で保存した。

実施例３：ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＪｕｒｋａｔとｈＩＬ５Ｒａ標的細胞を共培養した後のＣＤ６９発現の検出
実施例２で濃縮されたｈＩＬ５－ＥＣＡＲウイルスでＪｕｒｋａｔ細胞系を感染させてｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ安定形質移入細胞系を得た。実験群では、各ウェルにｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０^５個、ｈＩＬ５Ｒａ標的細胞（Ｕ_２ＯＳ細胞系）を１×１０^５個含まれており、陰性対照群では、各ウェルにｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０^５個、ｈＩＬ５Ｒａを持たない標的細胞（Ｕ_２ＯＳ細胞系）を１×１０^５個含まれており、ブランク群では、各ウェルにｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞のみを１×１０^５個含まれていた。全系は２００μＬの１０％血清含有１６４０完全培地で、２種類の細胞を十分に均一に混合した後、９６ウェルプレートに入れて共培養した。

インキュベーターでそれぞれ２４時間インキュベートした後、細胞を収集し、各管の細胞を１ｍＬ ＰＢＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）で１回洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。１００μＬのＰＢＳおよび０．５μＬのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社のヒトＣＤ６９フローサイトメトリー抗体（ＰＥ蛍光）を入れ、４℃で、光を避けて３０ｍｉｎ染色した。各管の細胞を１ｍＬ １×ＰＢＳで１回洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。２００μＬのＰＢＳ入れて再懸濁させ、フローサイトメーターでｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面ＣＤ６９の発現を検出した。
図２は、共培養後のｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＪｕｒｋａｔがｈＩＬ５Ｒａ標的細胞（炎症細胞（好酸球）のシミュレーション）によって顕著に活性化したことを示す。

実施例４：ヒトＴ細胞の精製と培養
ＤＡＹＯＵのリンパ分離液でヒト末梢血単核球を得、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のＣＤ３ Ｔ細胞陰性選択キットでＣＤ３ Ｔリンパ球を分離して精製した。ＬＯＮＺＡのＸ－ＶＩＶＯ １５培地で細胞密度が１×１０^６／ｍＬになるように調整し、そして数量が１×１０^６のＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｇｉｂｃｏ）を入れ、４８時間刺激して培養した。

実施例５：ｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスのヒトＴ細胞への感染とフローサイトメトリーによるウイルス感染効率の検出
実施例３で得られたｈＩＬ５－ＥＣＡＲ濃縮ウイルスを使用して遠心感染法ヒトＴ細胞を感染させてＣＡＲＴ細胞を製造し、そしてフローサイトメトリーによってｈＩＬ５－ＥＣＡＲの発現の様子を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。
Ｔ細胞を２日活性化培養した後、細胞を計数してＴ細胞密度が１×１０^６／ウェルになるように調整し、各ウェルに５００μＬの新しいＸ－ＶＩＶＯ １５を入れ、新しい２４ウェルプレートに接種した。
ウイルス液の調製：各ウェルに実施例２のウイルス濃縮液１００μＬ、６μｇ／ｍＬのポリブレン（Shanghai Yisheng Bio-Technology Co., Ltd.）、４００μＬのＸ－ＶＩＶＯ １５培地を入れた。
Ｔ細胞の遠心感染：２４ウェルプレートを遠心機にセットし、３２℃、１５００ｇで２ｈ遠心した。
遠心終了後、感染できたＴ細胞を１６００ｒｐｍの条件において５ｍｉｎ遠心し、上清と吸い取って捨て、各ウェルは１ｍＬの新しいＸ－ＶＩＶＯ培地で新しい２４ウェルプレートに接種した。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。
７２ｈ培養した後、それぞれ５×１０^５のＣＡＲ Ｔ細胞およびＴ細胞（対照群）をフローサイトメトリー管に収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、上清を捨て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のｈＩＬ５のフローサイトメトリー抗体を入れて光を避けて３０ｍｉｎ染色し、さらにＰＢＳで洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁させ、フローサイトメーターによって検出した。結果は図３に示すように、実施例２で得られたｈＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスでＴ細胞を感染させて７２ｈ後、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲの発現効率が４１％であった。

実施例６：ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴとｈＩＬ５Ｒａを発現する標的細胞を共培養した後の殺傷の検出（ルシフェラーゼ検出法）
レンチウイルス感染法によってルシフェラーゼを持つｈＩＬ５Ｒａ－Ｕ_２ＯＳ標的細胞を構築し、そしてルシフェラーゼの発光強度でｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。

ＷＨＢの全部白色の９６ウェルプレートを用意し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地でｈＩＬ５Ｒａ－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ細胞を再懸濁させ、細胞密度が１×１０^４／ウェルになるように調整し、各ウェルは１００μＬであった。
Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地で実施例５で製造されたｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を再懸濁させ、細胞密度が２×１０^６／ｍＬになるように調整し、勾配希釈して５×１０^４／ウェル、２．５×１０^４／ウェル、１．２５×１０^４／ウェル、０／ウェルの細胞密度でプレートに接種し、各ウェルは１００μＬであった。

実験群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＩＬ５Ｒａ－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞または未感染のＴ細胞（ＵＴＤ－Ｔ）を入れ、陰性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのＵ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞または未感染のＴ細胞（ＵＴＤ－Ｔ）を入れた。充分に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２４時間培養した。

２４時間後、９６ウェルプレートを取り出した。ウェルプレートにおける培地を捨て、各ウェルに１μＬの補酵素Ａ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）および１μＬ Ｄ－フルオロセイン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ならびに１００μＬのＰＢＳを入れ、光を避けて１０ｍｉｎ反応させ、Ｍ５マイクロプレートリーダーによってその化学発光強度を検出した。

結果は図４に示すように、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞とｈＩＬ５Ｒ－Ｕ２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞を共培養した後、エフェクター標的比の増加とともに、殺傷能力が増強し、投与量依存性が示された。細胞分解率（Ｌｙｓｉｓ）を（１－（ＲＬＵ_{ｓａｍｐｌｅ}）／（ＲＬＵ_ｍａｘ））×１００と定義した。ＲＬＵ_{ｓａｍｐｌｅ}はマイクロプレートリーダーによって検出されたサンプルの相対光強度を、ＲＬＵ_ｍａｘはマイクロプレートリーダーによって検出された殺傷細胞を入れていない標的細胞対照群の相対光強度を指す。

実施例７：ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴとｈＩＬ５Ｒａを発現する標的細胞を共培養した後のＩＦＮ－γ分泌の検出
透明な９６ウェルプレートを用意し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地でｈＩＬ５Ｒａ－Ｕ_２ＯＳ標的細胞、Ｕ_２ＯＳ細胞を再懸濁させ、細胞密度が１×１０^４／ウェルになるように調整した。

Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地で実施例５で製造されたｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を再懸濁させ、細胞密度が２×１０^６／ｍＬになるように調整し、勾配希釈して５×１０^４／ウェル、２．５×１０^４／ウェルの細胞密度でプレートに接種し、各ウェルは１００μＬであった。

実験群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＩＬ５Ｒａ－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れ、陰性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのＵ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れた。充分に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２４時間培養した。

２４時間後、９６ウェルプレートを取り出した。上清を１．５ｍＬ ＥＰチューブに取り出した。遠心機において、４℃、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、細胞の破片を除去し、上清を残した。Ａｂｃｌｏｎａｌ社のヒトＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡキットを使用し、説明書キットに従い、上清におけるＩＦＮ－γ含有量を検出した。

結果は図５に示すように、ｈＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞はｈＩＬ５Ｒ－Ｕ_２ＯＳ標的細胞を共培養した後、有効に大量のＩＦＮ－γを分泌したが、Ｕ_２ＯＳ標的細胞と共培養した後、ＩＦＮ－γが分泌できなかった。

実施例８：ｍＣＤ８αシグナルペプチド－ｍＩＬ５（内因性タンパク質分子）－ｍＣＤ２８ヒンジ領域－ｍＣＤ２８膜貫通領域－ｍＣＤ２８細胞内ドメイン（共刺激分子）－ｍＣＤ３ζ遺伝子配列の確認およびレンチウイルスベクターの構築
ＮＣＢＩデータベースからマウス由来ＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子配列、マウス由来ＩＬ５の遺伝子配列、マウス由来ＣＤ８αヒンジ領域の遺伝子配列、マウス由来ＣＤ８α膜貫通領域の遺伝子配列、マウス由来ＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子配列およびマウス由来ＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子配列を検索した。

Tsingke Biotech Co., Ltd.に依頼してマウス由来ＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子のコード領域の配列、マウス由来ＩＬ５の遺伝子のコード領域の配列、マウス由来ＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子のコード領域の配列、マウス由来ＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子のコード領域の配列、マウス由来ＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子のコード領域の配列およびマウス由来ＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子のコード領域の配列の順で完全なｍＩＬ５－ＥＣＡＲ遺伝子配列を合成し、そしてＰＣＲ法およびVazyme Biotech Co.,Ltd.の非リガーゼ依存型単一断片快速クローニングキットによってｍＩＬ５－ＥＣＡＲをＰＭＸレトロウイルスプラスミドに連結させた。連結産物で感受性細胞（ＤＨ５α）を形質転換させ、プレートに塗布して一晩置き、単一のクローンを選び、そしてTsingke Biotech Co., Ltd.に送ってシークエンシングを行い、シークエンシング結果を比較し、プラスミドの構築が成功したか確認した。

康為世紀社のプラスミドマキシキットで精製されたｍＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスプラスミドを抽出した（プラスミドの図示は図６に示される）。

実施例９：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲレトロウイルスのパッケージングと濃縮
実施例８で得られたｍＩＬ５－ＥＣＡＲプラスミドでＰＥＩ法でＰｌａｔ－Ｅ細胞系を形質導入する方法によってウイルスをパッケージングし、そして超遠心によってウイルスを濃縮したが、具体的な工程は以下の通りである。
１日目：継代数が２０代未満でかつ細胞密度が約９０％のＰｌａｔ－Ｅ細胞を選び、３０％の細胞密度で３０ｍＬ ＤＭＥＭ完全培地を含有する１５ｃｍシャーレに敷き、細胞を十分に均一に混合し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養した。
２日目：Ｐｌａｔ－Ｅ細胞密度が７０％～９０％に達したことが観察されると、形質移入を準備した。プラスミド混合物の準備：クリーンな１５ｍＬ遠心管にＤＭＥＭ培地を１．５ｍＬ入れ、そして実施例８で得られたｍＩＬ５－ＥＣＡＲレンチウイルスプラスミド ４５μｇを入れ、十分に均一に混合した。別途にクリーンな１５ｍＬ遠心管を取り、ＤＭＥＭ培地を１．５ｍＬ入れ、そして形質移入試薬ＰＥＩを１１２．５μＬ入れ、十分に均一に混合した。ＰＥＩ混合物をプラスミド混合物に滴下し、十分に均一に混合し、２０ｍｉｎ静置した。３ｍＬ混合物をシャーレ壁に沿ってＰｌａｔ－Ｅ細胞シャーレに入れ、３７℃で８ｈ培養し、培地を吸い取って捨て、軽くシャーレ壁に沿って改めて加熱しておいた新たな１０％血清含有ＤＭＥＭ完全培地を入れた。
４日目：形質導入から４８ｈ後、ウイルス上清を収集して０．２２μｍフィルターでろ過した。ろ過した上清を超遠心管に移してバランスを取り、４℃の条件において超遠心機で回転数３５０００ｒｐｍで９０ｍｉｎ遠心した。遠心終了後、上清を吸い取って捨て、ウイルス原液３０ｍＬあたり得られた沈殿を３００μＬ ＤＭＥＭ培地で再懸濁させ、得られた濃縮できたｍＩＬ５－ＥＣＡＲレトロウイルス液は２４ｈ内で感染に使用したか、あるいは－８０℃で保存した。

実施例１０：ネズミＴ細胞の精製と培養
ｂｉｏｌｅｇｅｎｄブランドの抗マウスＣＤ３因子および抗マウスＣＤ２８因子をＰＢＳでそれぞれ１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬに希釈し、そして２４ウェルプレートに入れ、各ウェルは５００μＬで、３７℃のインキュベーターで２ｈインキュベートし、使用に備えた。頸椎脱臼の手段で１匹のＢａｌｂ／ｃ系マウスを殺処分し、クリーンベンチにおいて脾臓を取り出して研磨し、赤血球分解液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で赤血球を分解させ、０．４５μｍフィルターネットでろ過して脾臓単細胞懸濁液を得た。ＢｉｏｌｅｇｅｎｄブランドのマウスＣＤ３ Ｔ細胞陰性選択キットで Ｔリンパ球を分離して精製した。１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１％の１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、１％のＭＥＮ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１％の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（吉諾生物医薬技術有限公司）、１‰のβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１６４０完全培地で細胞密度が１×１０^６／ｍＬになるように調整した。３７℃インキュベーターでインキュベートされた２４ウェルプレートを取り出した、液体を吸い取って捨て、各ウェルに１×１０^６のＴ細胞を入れ、３７℃インキュベーターで４８時間インキュベートした。

実施例１１：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲレトロウイルスのマウスＴ細胞への感染とフローサイトメトリーによるウイルス感染効率の検出
実施例９で得られたｍＩＬ５－ＥＣＡＲ濃縮ウイルスを使用し、遠心感染法でマウスＴ細胞を感染させてＣＡＲＴ細胞を製造し、そしてフローサイトメトリーによってｍＩＬ５－ＥＣＡＲの発現の様子を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。

Ｔ細胞を２日活性化培養した後、細胞を計数してＴ細胞密度が１×１０^６／ウェルになるように調整し、各ウェルに５００μＬの新しい１６４０完全培地を入れ、新しい２４ウェルプレートに接種した。

ウイルス液の調製：各ウェルに実施例９のウイルス濃縮液１００μＬ、６μｇ／ｍＬのポリブレン、４００μＬのＸ－ＶＩＶＯ １５培地を入れた。

Ｔ細胞の遠心感染：２４ウェルプレートを遠心機にセットし、３２℃、１５００ｇで２ｈ遠心した。

遠心終了後、感染できたＴ細胞を１６００ｒｐｍの条件において５ｍｉｎ遠心し、上清と吸い取って捨て、各ウェルは１ｍＬの新しい１６４０完全培地で新しい２４ウェルプレートに接種した。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。

７２ｈ培養した後、それぞれ５×１０^５のｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞およびＴ細胞（対照群）をフローサイトメトリー管に収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、上清を捨て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のｍＩＬ５のフローサイトメトリー抗体を入れて光を避けて３０ｍｉｎ染色し、さらにＰＢＳで洗浄し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁させ、フローサイトメーターによって検出した。結果は図７に示すように、実施例９で得られたｍＩＬ５－ＥＣＡＲレトロウイルスでＴ細胞を感染させて７２ｈ後、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲの発現効率が５６％であった。

実施例１２：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の好酸球に対する殺傷作用の検出
６～８週のＳＰＦ級の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを取り、浙江大学動物センターで飼育し、尾静脈からｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を注射し、細胞の使用量が３×１０^６／匹で、生理食塩水（源叶生物）に再懸濁させ、各マウスの注射体積が２００μＬで、対照群では、同体積の生理食塩水を注射した。

感作液の調製（使用直前に調製する）：オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０ｍｇ秤量し、１ｍＬの生理食塩水で溶解させ、Ａ液とした。Ａ液から０．４ｍＬ～１５ｍＬ取って無菌遠心管に入れ、９．６ｍＬの無菌生理食塩水と均一に混合し、Ｂとした。Ｂ液から２ｍＬ取って新しい１５ｍＬ遠心管に入れ、２ｍＬのＩｍｊｅｃｔ^（商標） アラムアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ^（商標））を入れ、十分に混合し、感作液とし、使用に備えた。

感作：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を戻して１週間後、各マウスに２００μＬの感作液を腹腔注射し、その時点を１日目とし、１４日目に、同様の溶媒および体積で、二回目の感作を行った。

霧化：その後、それぞれ２７、２８、２９日目に毎日ＯＶＡ霧化を行った（霧化液は体積が１０ｍＬで、生理食塩水を溶媒とし、１３０ｍｇ ＯＶＡを含有する）。

マウスの処理：３０日目にマウスを処理した。各マウスに１．５％ペントバルビタールトンナトリウム（山東西亜化学工業有限公司）を２００μＬ腹腔注射し、マウスが麻酔した後、マウスの胸腔を切り開き、そして心臓から採血し、１．５ｍＬ ＥＤＴＡ抗凝血管に入れ、そして氷の上に置いた。気道および両側の肺葉を露出させ、細線で右肺の肺門の近くで右肺を結紮して気道の遠端に小さい切り口を作り、注射器（人工的に鈍くした２０ｍＬ注射器針および１ｍＬ注射器シリンダー）を用意した。注射器を小穴から気道に挿入し、針を気道内に留置し、シリンダーを抜き、そしてクリーンなＰＢＳを４００μＬ吸い取った後、ゆっくり気道から肺に押し込み、２～３回繰り返して往復し、最後に吸い出した液体を１．５ｍＬ ＥＰチューブに出して氷の上に置き、全液体が気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）となった。以上の工程を三回繰り返し、計１ ｍＬ程度のＢＡＬＦを得た。最後に、４００μＬの４％ホルムアルデヒド溶液（国薬グループ）を吸い取って左肺に注入し、そしてホルムアルデヒドが漏れないように気道を結紮した。右側の４つの肺葉を切り、それぞれ組織均質化管に入れ、液体窒素に投入して保存した。気道を結紮した線を引き上げ、左側の肺全体を切り、心臓と共に１３ｍＬの４％ホルムアルデヒドの入った１５ｍＬ遠心管に入れた。

ＢＡＬＦ液を均一に混合した後、ＰＣＲ管に２０μＬ取り、２０μＬの赤血球分解液を入れ、均一に混合した後、１ｍｉｎ待ち、顕微鏡において計数した。残りのＢＡＬＦ液を６０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心し、上清を収集し、－８０℃で保存した。細胞沈殿を２００μＬの冷やしておいたＰＢＳで希釈した（ＯＶＡ群では３００μＬ入れた）。１００μＬの細胞懸濁液を１ｍＬ ＰＢＳの入ったフローサイトメトリー管に入れ（１本のブランク群、６本の単基準管を含む）、４００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、ほかの１００μＬは遠心分離に供した。遠心後、上清を捨て、１００μＬの冷やしておいたＰＢＳ（０．５μＬのフローサイトメトリー抗体を含み、ＣＤ４５（ＰＥ－ＣＹ７，ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ＳｉｇｌｅｃＦ（ＰＥ，ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），Ｆ４／８０（ＡＰＣ－ＣＹ７，ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ，ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ＣＤ１１ｃ（ＡＰＣ，ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＤＡＰＩ（ＰＢ４５０）を含む）、吹いて均一にかき混ぜた後、光を避け、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。各管に１ｍＬの冷やしておいたＰＢＳを入れ、４００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた後、２００μＬの冷やしておいたＰＢＳを入れ、装置にセットして好酸球の発現を検出した。

結果は図８に示すように、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴでＯＶＡ喘息モデル（図８ａのモデル構築フロー図を参照する）のＢａｌｂ／ｃマウスを治療した後、そのＢＡＬＦ液における好酸球の比率（図８ｂの右の縦棒グラフにおける左からの４つ目）およびＢＡＬＦ液における好酸球の絶対値（図８ｃの縦棒グラフにおける左からの４つ目）は生理食塩水を注射したＯＶＡ喘息モデル群（図８ｂの右および図８ｃの縦棒グラフにおける左からの３つ目）よりも顕著に低下した。同時に、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴによるＯＶＡ喘息モデル群の治療と生理食塩水を注射したＯＶＡ喘息モデル群を比較すると、好酸球の比率は、ＢＡＬＦ液において低下する傾向が現れた以外、肺組織（図８ｄの縦棒グラフにおける左からの３つ目と４つ目）および末梢血（図８ｅの縦棒グラフにおける左からの３つ目と４つ目）においても同様の低下した変化が現れたことから、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔが有効にＯＶＡによって誘導される喘息モデルにおける好酸球を減少させることができることが示唆された。

実施例１３：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の炎症性因子に対する緩和作用の検出
肺組織のＲＮＡ抽出：処理できたマウスの肺組織の一切れを選び、研磨ビーズを入れ、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ）を入れた。研磨機において６０Ｈｚの速度で１ｍｉｎ研磨し、一回繰り返した。室温で５ｍｉｎ静置し、吹いてかき混ぜ、分解液を１．５ｍＬ ＥＰチューブに収集した。各管に０．２ｍＬのトリクロロメタン（国薬グループ）を入れ、十分に振とうして均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心した。遠心後、３層に分かれ、ＲＮＡが上層の水相に分布し、４００μＬの上層の液体を新しいＥＰチューブに吸い取った。各管のＲＮＡ液に０．５ｍＬのイソプロパノール（国薬グループ）を入れ、上下逆さまにして軽く均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、沈殿を残した。各管に１ｍＬの冷やしておいた７５％エタノールを入れ、上下に軽く逆さまにし、沈殿を浮かばせ、沈殿が破裂するほど力を入れすぎることがないように注意した。４℃、９０００ｇで５ｍｉｎ遠心した。吸水紙で残液を吸い取り、室温で５ｍｉｎ乾燥させた。適量のＤＥＰＣ水を入れ、ＲＮＡが溶解するまで吹いて混ぜた。ＮａｎｏｄｒｏｐによってＲＮＡの濃度および質量を測定した。

ＲＮＡ逆転写：Ｔａｋａｒａ社の逆転写キットを使用し、以下のような反応系で、ｃＤＮＡを得た。
逆転写反応系：５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １μＬ
Ｒａｎｄｏｍ ６ ｍｅｒｓ（１００ｕＭ） １μＬ
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒ（５０ｕＭ） １μＬ
全ｍＲＮＡ １０００ｎｇ
ＤＥＰＣ 水 ２０μＬまで
反応条件：３７℃ １５ｍｉｎ
８５℃ ５ｓｅｃ

Ｔａｋａｒａ社の蛍光定量ＰＣＲキットを使用し、蛍光定量ＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ）によってＩＬ４、ＩＬ２５炎症性因子のｍＲＮＡレベルを定量的に検出したが、反応系は以下の通りである。
ＲＴ－ＰＣＲ反応系 ：Ｔａｑ Ｍｉｘ １０μＬ
プライマー Ｆ １μＬ
プライマー Ｒ １μＬ
ｄｄＨ２０ ６μＬ
ｃＤＮＡ ２μＬ
反応プログラムは、以下の通りである。
９４℃ ２ ｍｉｎ
９４℃ １５ ｓｅｃ，６０℃ ３０ ｓｅｃ，７２℃ ３０ ｓｅｃ，４０サイクル
７２℃ １０ ｍｉｎ
４℃持続

データの処理および分析後、結果は図９に示すように、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴでＯＶＡモデルのＢａｌｂ／ｃマウス（図９の縦棒グラフにおける左からの４つ目）を治療した後、その肺組織における炎症関連因子（ＩＬ４、ＩＬ２５）のｍＲＮＡレベルが単に生理食塩水を注射したＯＶＡモデル群（図９の縦棒グラフにおける左からの３つ目）よりも顕著に低下した。そして、未処理群（図９の縦棒グラフにおける左からの１つ目）および単にｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔを注射した群（図９の縦棒グラフにおける左からの２つ目）と比べ、明らかな違いがなかったという結果から、気道炎症が明らかに緩和した。

実施例１４：ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ Ｔをマウス喘息モデルに戻した後の炎症に対する緩和作用の検出
肺組織の病理学により、マウスの肺組織の気道周辺の炎症細胞の浸潤を観測することで、気道炎症の重篤度を判断した。

谷歌生物科技有限公司に肺組織の切片の作成を依頼し、そして炎症細胞の浸潤の様子が観測しやすいように、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ、ＨＥ）染色を行った。

具体的な半定量の気道炎症スコアは以下の通りである。
０点：気道周辺に炎症細胞の浸潤がない。
１点：気道周辺にたまに炎症細胞の浸潤が見られた。
２点：大半の気道周辺に薄層の炎症細胞の浸潤があるか、局所に厚層の炎症細胞の浸潤がある。
３点：大半の気道周辺に厚層の炎症細胞の浸潤がある。

結果は図１０に示すように、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴでＯＶＡモデルのＢａｌｂ／ｃマウスを治療した肺組織ＨＥ切片の代表的な図において（図１０ａにおける左からの４つ目の図）、炎症細胞の浸潤が単に生理食塩水を注射したＯＶＡモデル群（図１０ａにおける左からの３つ目の図）よりも顕著に少なかったのがはっきり見える。データのさらなる判定量分析後、ｍＩＬ５－ＥＣＡＲ ＴでＯＶＡモデルを治療した（図１０ｂの縦棒グラフにおける左からの４つ目）炎症レベルが単に生理食塩水を注射したＯＶＡモデル群（図１０ｂの縦棒グラフにおける左からの３つ目）よりも明らかに緩和したことが示された。

実施例１５：ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ初代マウス細胞の構築
ＮＣＢＩデータベースからヒト由来Ｐｌａｕ遺伝子配列を検索した。

Tsingke Biotech Co., Ltd.に依頼してヒト由来Ｐｌａｕ遺伝子のコード領域の断片を合成した。そしてＰＣＲ法およびVazyme Biotech Co.,Ltd.の非リガーゼ依存型単一断片快速クローニングキットにより、マウス由来ＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子のコード領域の配列、ヒト由来Ｐｌａｕ遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子のコード領域の配列およびマウスＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子のコード領域の配列の順で完、ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ遺伝子配列をＰＭＸレトロウイルスプラスミドに連結させた。連結産物で感受性細胞（ＤＨ５α）を形質転換させ、プレートに塗布して一晩置き、単一のクローンを選び、そしてTsingke Biotech Co., Ltd.に送ってシークエンシングを行い、シークエンシング結果を比較し、プラスミドの構築が成功したか確認した。

康為世紀社のプラスミドマキシキットで精製されたｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲレトロウイルスプラスミドを抽出した（プラスミドの図示は図１１に示される）。

実施例９に従ってｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲレトロウイルスのパッケージングと濃縮を行った。

実施例１０に従ってネズミＴリンパ細胞の獲得、活性化および培養を行った。

実施例１１に従ってｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の構築する行った。

実施例１６：ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔとヒト由来Ｐｌａｕ受容体（ｈＰｌａｕＲ）を発現する標的細胞（老化細胞のシミュレーション）を共培養した後の殺傷の検出（ルシフェラーゼ検出法）
レンチウイルス感染法によってルシフェラーゼを持つｈＰｌａｕＲ－２９３Ｔ標的細胞を構築し、そしてルシフェラーゼの発光強度でｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。

ＷＨＢブランドの全部白色の９６ウェルプレートを用意し、１００μＬの１６４０完全培地でｈＰｌａｕ－２９３Ｔ－ルシフェラーゼ標的細胞、２９３Ｔ－ルシフェラーゼ細胞を再懸濁させ、細胞密度が１×１０^４／ウェルになるように調整した。

１６４０完全培地培地で実施例５で製造されたｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を再懸濁させ、細胞密度が２×１０^６／ｍＬになるように調整し、勾配希釈して１×１０^５／ウェル、５×１０^４／ウェル、２．５×^４０／ウェルの細胞密度でプレートに接種し、各ウェルは１００μＬであった。

実験群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＰｌａｕＲ－２９３Ｔ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れ、陰性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの２９３Ｔ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れ、ブランク対照群および陽性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＰｌａｕＲ－２９３Ｔ－ルシフェラーゼおよび１００μＬの１６４０完全培地を入れ、十分に均一に混合した後、３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで１２ｈ培養した。

１２時間後、９６ウェルプレートを取り出した。陽性対照群では、各ウェルに１μＬのＮＰ４０（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を入れ、十分に均一に混合した。５ｍｉｎ後、ウェルプレートにおける培地を捨て、各ウェルに１μＬの補酵素Ａおよび１μＬ Ｄ－フルオロセインならびに１００μＬのＰＢＳを入れ、光を避けて１０ｍｉｎ反応させ、Ｍ５マイクロプレートリーダーによってその化学発光強度を検出した。

結果は図１２に示すように、ｈＰｌａｕ－ＥＣＡＲ Ｔ細胞とｈＰｌａｕＲ－２９３Ｔ－ルシフェラーゼ標的細胞を共培養した後、エフェクター標的比の増加とともに、殺傷能力が増強し、投与量依存性が示された。

実施例１７：ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔ初代マウス細胞の構築
ＮＣＢＩデータベースからヒト由来ＣＣＬ１１遺伝子配列を検索した。

Tsingke Biotech Co., Ltd.に依頼してヒト由来ＣＣＬ１１遺伝子のコード領域の断片を合成した。そしてＰＣＲ法およびVazyme Biotech Co.,Ltd.の非リガーゼ依存型単一断片快速クローニングキットにより、マウスＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子のコード領域の配列、ヒトＣＣＬ１１遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子のコード領域の配列およびマウスＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子のコード領域の配列の順で完、ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ遺伝子配列をＰＭＸレトロウイルスプラスミドに連結させた。連結産物で感受性細胞（ＤＨ５α）を形質転換させ、プレートに塗布して一晩置き、単一のクローンを選び、そしてTsingke Biotech Co., Ltd.に送ってシークエンシングを行い、シークエンシング結果を比較し、プラスミドの構築が成功したか確認した。

康為世紀社のプラスミドマキシキットで精製されたｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲレトロウイルスプラスミドを抽出した（プラスミドの図示は図１３に示される）。

実施例９に従ってｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲレトロウイルスのパッケージングと濃縮を行った。

実施例１０に従ってネズミＴリンパ細胞の獲得、活性化および培養を行った。

実施例１１に従ってｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の構築する行った。

実施例１８：ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔとヒト由来ＣＣＲ３受容体を発現する標的細胞（炎症細胞（好酸球）のシミュレーション）を共培養した後の殺傷の検出（ルシフェラーゼ検出法）
レンチウイルス感染法によってルシフェラーゼを持つｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ標的細胞を構築し、そしてルシフェラーゼの発光強度でｈＣＣｌ１１－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。

ＷＨＢの全部白色の９６ウェルプレートを用意し、１００μＬの１６４０完全培地でｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞を再懸濁させ、細胞密度が１×１０^４／ウェルになるように調整した。

１６４０完全培地培地で実施例１７で製造されたｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を再懸濁させ、細胞密度が２×１０^６／ｍＬになるように調整し、勾配希釈して２×１０^５／ウェル、１×１０^５／ウェル、５×１０^４／ウェル、２．５×１０^４／ウェルの細胞密度でプレートに接種し、各ウェルは１００μＬであった。

実験群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れ、ブランク対照群および陽性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞および１００μＬの１６４０完全培地を入れ、十分に均一に混合した後、３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで１２時間培養した。

１２時間後、９６ウェルプレートを取り出した。陽性対照群では、各ウェルに１μＬのＮＰ４０を入れ、十分に均一に混合した。５ｍｉｎ後、ウェルプレートにおける培地を捨て、各ウェルに１μＬの補酵素Ａおよび１μＬ Ｄ－フルオロセインならびに１００μＬのＰＢＳを入れ、光を避けて１０ｍｉｎ反応させ、Ｍ５マイクロプレートリーダーによってその化学発光強度を検出した。

結果は図１４に示すように、ｈＣＣＬ１１－ＥＣＡＲ Ｔ細胞とｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞を共培養した後、エフェクター標的比の増加とともに、殺傷能力が増強し、投与量依存性が示された。

実施例１９：ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔ初代マウス細胞の構築
ＮＣＢＩデータベースからヒト由来ＣＣＬ２４遺伝子配列を検索した。
Tsingke Biotech Co., Ltd.に依頼してヒト由来ＣＣＬ２４遺伝子のコード領域の断片を合成した。そしてＰＣＲ法およびVazyme Biotech Co.,Ltd.の非リガーゼ依存型単一断片快速クローニングキットにより、マウスＣＤ８αシグナルペプチドの遺伝子のコード領域の配列、ヒトＣＣＬ２４遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８ヒンジ領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８膜貫通領域の遺伝子のコード領域の配列、マウスＣＤ２８細胞内ドメインの遺伝子のコード領域の配列およびマウスＣＤ３ζ細胞内領域の遺伝子のコード領域の配列の順で完、ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ遺伝子配列をＰＭＸレトロウイルスプラスミドに連結させた。連結産物で感受性細胞（ＤＨ５α）を形質転換させ、プレートに塗布して一晩置き、単一のクローンを選び、そしてTsingke Biotech Co., Ltd.に送ってシークエンシングを行い、シークエンシング結果を比較し、プラスミドの構築が成功したか確認した。

康為世紀社のプラスミドマキシキットで精製されたｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲレトロウイルスプラスミドを抽出した（プラスミドの図示は図１５に示される）。

実施例９に従ってｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲレトロウイルスのパッケージングと濃縮を行った。

実施例１０に従ってネズミＴリンパ細胞の獲得、活性化および培養を行った。

実施例１１に従ってｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の構築する行った。

実施例２０：ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔとヒト由来ＣＣＲ３受容体を発現する標的細胞を共培養した後の殺傷の検出（ルシフェラーゼ検出法）
レンチウイルス感染法によってルシフェラーゼを持つｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ標的細胞を構築し、そしてルシフェラーゼの発光強度でｈＣＣｌ２４－ＥＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を検出したが、具体的な工程は以下の通りである。

ＷＨＢの全部白色の９６ウェルプレートを用意し、１６４０完全培地でｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞を再懸濁させ、細胞密度が１×１０^４／ウェルになるように調整した。

５０μＬの１６４０完全培地培地で実施例１７で製造されたｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を再懸濁させ、細胞密度が２×１０^６／ｍＬになるように調整し、勾配希釈して２×１０^５／ウェル、１×１０^５／ウェル、５×１０^４／ウェル、２．５×１０^４／ウェルの細胞密度でプレートに接種し、各ウェルは１００μＬであった。

実験群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞、１００μＬの異なる細胞密度のｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔ細胞を入れ、ブランク対照群および陽性対照群では、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞および１００μＬの１６４０完全培地を入れ、十分に均一に混合した後、３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで１２時間培養した。

１２時間で、９６ウェルプレートを取り出した。陽性対照群では、各ウェルに１μＬのＮＰ４０を入れ、十分に均一に混合した。５ｍｉｎ後、ウェルプレートにおける培地を捨て、各ウェルに１μＬの補酵素Ａおよび１μＬ Ｄ－フルオロセインならびに１００μＬのＰＢＳを入れ、光を避けて１０ｍｉｎ反応させ、Ｍ５マイクロプレートリーダーによってその化学発光強度を検出した。

結果は図１６に示すように、ｈＣＣＬ２４－ＥＣＡＲ Ｔ細胞とｈＣＣＲ３－Ｕ_２ＯＳ－ルシフェラーゼ標的細胞を共培養した後、エフェクター標的比の増加とともに、殺傷能力が増強し、投与量依存性が示された。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (10)

1. 内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）であって、前記内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）が抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが内因性タンパク質分子であることを特徴とするＥＣＡＲ。
2. 前記内因性タンパク質分子は、インターロイキンファミリー、ケモカインファミリー、コロニー刺激因子、成長因子、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、インターフェロンファミリー、腫瘍マーカー、老化細胞関連因子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とするある請求項１に記載のＥＣＡＲ。
3. 前記キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）の構造は式Ｉで表されることを特徴とする請求項１に記載のＥＣＡＲ。
   ［式１］
   Ｌ－Ｚ１－Ｚ２－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｉ）
   （式中において、
   各「－」は独立に連結ペプチドまたはペプチド結合である。
   Ｌは任意にシグナルペプチド配列である。
   Ｚ１は内因性タンパク質分子である抗原結合ドメインである。
   Ｚ２はなしか、ヒンジ領域である。
   ＴＭは膜貫通ドメインである。
   Ｃは共刺激シグナル分子である。
   ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。）
4. 請求項１に記載の内因性キメラ抗原受容体ＣＡＲ（ＥＣＡＲ）をコードすることを特徴とする核酸分子。
5. 請求項４に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項４に記載の核酸分子が組み込まれているか、あるいは請求項１に記載のＥＣＡＲを発現することを特徴とする宿主細胞。
7. 工学化された免疫細胞を製造する方法であって、前記の工学化された免疫細胞は請求項１に記載のＥＣＡＲを発現し、請求項４に記載の核酸分子または請求項５に記載のベクターをマクロファージ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の中に形質導入することにより、前記工学化された免疫細胞を得る工程を含む方法。
8. 請求項１に記載のＥＣＡＲ、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載のベクター、または請求項６に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有することを特徴とする薬物組成物。
9. 請求項１に記載のＥＣＡＲ、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の宿主細胞、または請求項８に記載の薬物組成物の使用であって、（ａ）細胞の選択的な殺傷、および／または（ｂ）疾患の治療に用いられる、薬物または製剤を製造するためであることを特徴とする使用。
10. 選択的に細胞を殺傷するためのキットであって、容器と、容器内に位置する請求項１に記載のＥＣＡＲ、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の宿主細胞または請求項８に記載の薬物組成物とを含むキット。