CN116240173A - 一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116240173A CN116240173A CN202310052269.3A CN202310052269A CN116240173A CN 116240173 A CN116240173 A CN 116240173A CN 202310052269 A CN202310052269 A CN 202310052269A CN 116240173 A CN116240173 A CN 116240173A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- car
- cells
- tumor
- macrophage
- mononuclear
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 76
- 208000037966 cold tumor Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 208000037967 hot tumor Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title abstract description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 102
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 22
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 27
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 27
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 claims description 16
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 11
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 11
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 7
- -1 CCL22 Proteins 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025250 C-X-C motif chemokine 14 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000858060 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000858068 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 14 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 230000002336 repolarization Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 2
- JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N (2-nonanoyloxy-3-octadeca-9,12-dienoyloxypropoxy)-[2-(trimethylazaniumyl)ethyl]phosphinate Chemical compound CCCCCCCCC(=O)OC(COP([O-])(=O)CC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002224 CCK cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150107690 CD80 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006028 immune-suppresssive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000495 immunoinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005008 immunosuppressive cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920006289 polycarbonate film Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明一种冷热肿瘤调控型CAR‑单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，属于免疫学及肿瘤治疗技术领域。本发明冷热肿瘤调控型CAR‑单核/巨噬细胞为嵌合抗原受体与单核/巨噬细胞的复合结构，嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域。胞外域包含抗原结合域；跨膜域包含α1β1TM；胞内域包含α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM‑CSF、招募免疫细胞的细胞因子。抗原结合域为PD‑L1scFv分子或PD1scFv分子。本发明CAR‑单核/巨噬细胞发挥自身深度浸润、特异吞噬杀伤实体肿瘤，招募T细胞等免疫细胞、调控实体肿瘤冷热转换，实现CAR‑单核/巨噬细胞与T细胞免疫的协同抗肿瘤效应。
Description
技术领域
本发明属于免疫学及肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用。
背景技术
随着肿瘤生物学和免疫学的发展，肿瘤免疫治疗已成为近年来肿瘤治疗领域的新途径。与传统化放疗相比，免疫治疗颠覆了人们以往对于肿瘤治疗的理念，从传统的依靠外界方式杀死肿瘤，到免疫治疗依靠自身免疫系统杀死肿瘤。其中免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗备受瞩目。
基于免疫检查点理论的单抗阻断治疗技术，以及基于细胞治疗技术平台的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术受到广泛关注。免疫检查点阻断的肿瘤免疫治疗方法是通过阻断负荷肿瘤对T细胞的抑制途径来激活抗肿瘤免疫。目前抗PD1抗体药物已被用于治疗多种癌症，但仍然存在一些问题：(1)较低的客观应答率，PD1抑制剂在未经选择的实体瘤患者中，有效率只有10％-30％，多由于肿瘤局部存在的多种免疫逃逸机制导致，包括肿瘤相关抗原的缺乏，免疫抑制细胞的渗透，免疫抑制肿瘤微环境的限制等，免疫治疗作用十分有限；(2)被动给药的药代动力学不理想，实体瘤内部药物富集率很低，药物的长期使用也可能产生耐药，往往第一剂之后，治疗不响应；(3)缺少主动靶向，导致毒副作用大。CAR-T疗法虽然在血液瘤中已经取得良好的治疗效果，但对于实体肿瘤治疗仍存在一定局限，其无法高效浸润实体肿瘤内部，且T细胞在肿瘤微环境中遭遇免疫衰竭等因素，使得当前免疫治疗在临床恶性肿瘤治疗中收效不甚理想。
基于T细胞的浸润情况，肿瘤免疫微环境分为3种不同的表型，分别是免疫沙漠(immune-desert)型、免疫排斥(immune-excluded)型和免疫炎症(immune-inflamed)型，前两种也称为“冷肿瘤”，也就是对免疫检查点抑制剂(CPI)治疗不敏感的非炎症性肿瘤。而最后一种称为“热肿瘤”，免疫炎症表型被T细胞深度浸润，显著响应CPI。“冷肿瘤”的特点包括T细胞浸润程度低、突变负荷低、PD-L1表达低，而TAMs和Tregs等免疫抑制细胞群被表达，这使得“冷肿瘤“对ICI单抗疗法几乎不反应。
免疫排斥型对CPI应答率较低，表现出T细胞浸润不良或滞留在肿瘤外。免疫沙漠表型对CPI几乎没有应答，主要是由于肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)中缺乏CD8+T细胞，反映出缺乏T细胞的启动和生成。这两种肿瘤微环境由于缺乏T细胞或者T细胞无法浸润到实体肿瘤内部，最终导致肿瘤免疫逃逸，CPI治疗效果不佳且个体差异性较大。可见，若要基于免疫检查点理论实现肿瘤免疫治疗的突破进展，首先要解决的就是实体肿瘤的冷热调控。
当前即便是采用CAR-T、CAR-NK等细胞疗法，在临床治疗实体冷肿瘤中仍存在诸多瓶颈。实体瘤通常被隔离于密集的纤维化肿块和缺氧的免疫抑制环境中，这阻碍了CAR-T、CAR-NK的细胞浸润；肿瘤微环境中含有许多免疫抑制性细胞和其它免疫抑制因子都会降低CAR-T的抗肿瘤效力，同时CAR-T存在的细胞因子风暴问题，临床应用挑战诸多。
当前研究对冷热肿瘤的免疫机制逐渐清晰，为针对性地设计治疗策略提供了创新可能。研究表明肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAM)是形成“T细胞排斥肿瘤表型”的重要决定因素，在小鼠肿瘤研究模型及患者肿瘤中均已发现由于TAM对TME的免疫负调控影响、及其与T细胞等的长期相互作用，CD8+T细胞很难迁移和侵袭肿瘤巢，无法有效形成T细胞对肿瘤的杀伤作用，这也是“冷肿瘤”临床治疗不响应的根本机制之一。并且更多证据表明，T细胞向肿瘤内的迁移缺陷构成了对癌症免疫治疗的耐药机制。T细胞无法高效侵入实体瘤内部并有效工作，免疫治疗则很难发挥显著作用，最终导致患者生存率低。所以，如何避免肿瘤微环境的T细胞抵抗、实现T细胞高效富集肿瘤并活化激活，从而协同发挥抗肿瘤效应，这是当下免疫治疗亟待解决的问题。
因此，针对上述免疫治疗的困境，本发明设计的针对免疫检查点的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞(CAR-M)，包括PD-L1 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγR1跨膜信号传导域胞内、GM-CSF、CCL5细胞招募因子。获得的过继细胞免疫治疗CAR-M技术，(1)不但可以基于CAR-M的底盘细胞优势深度递送免疫检查点单链抗体结构域，靶向肿瘤组织并深度浸润实体肿瘤内部特异吞噬肿瘤细胞；(2)GM-CSF调节TAM介导的肿瘤微环境，同时CCL5招募T细胞等免疫细胞在肿瘤处的有效富集，系统逆转冷肿瘤形成的肿瘤免疫抑制微环境，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”；(3)胞外抗PD-L1/PD1结构域解除T细胞的免疫抑制，给予招募来的T细胞充分的杀伤活性。从而使得CAR-单核/巨噬细胞的特异吞噬及单抗杀伤效应、与肿瘤微环境的逆转及冷热肿瘤的调节效应、T细胞免疫的协同控肿瘤效应相互结合，发挥“立体化”的肿瘤免疫杀伤机制，预期获得显著临床治疗效果。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，对以往免疫治疗对冷肿瘤不响应的问题给予根本解决。本发明冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞可分泌表达CCL5及GM-CSF，可逆转肿瘤微环境；同时招募T细胞等免疫细胞到达肿瘤部位实现“冷热”转换；同时，抗原结合域包含抗PD-L1scFv分子或抗PD1 scFv分子，进而增敏T细胞的肿瘤协同杀伤效应。
本发明冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞的作用机制及原理为：
(1)本发明冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞可特定分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，维持自身保持M1表型的同时，可将TAM中M2型抗炎巨噬细胞逆转为M1型促炎巨噬细胞，逆转肿瘤微环境。
(2)进而重塑肿瘤微环境，并且减少对CD8+T侵袭的抑制，营造适宜T细胞的迁移和发挥功能的肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫应答。
(3)同时本发明冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞可通过分泌CCL5等细胞招募因子，招募T细胞等免疫细胞到达肿瘤部位，增加肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量，促进它们在肿瘤部位的富集，以及增强它们攻击肿瘤细胞的能力，从而根本调节“冷热肿瘤”转换。
(4)最终使得发明技术方案中胞外PD-L1 scFv在实体瘤内部发挥最大化的抗肿瘤效应。PD-L1 scFv一方面通过阻断PD1/PD-L1免疫检查点通路恢复T细胞杀伤作用，另一方面PD-L1 scFv可与巨噬细胞表面PD-L1结合，促进巨噬细胞增殖与激活，促进巨噬细胞杀伤作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，所述冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞为嵌合抗原受体与单核/巨噬细胞的复合结构，其中嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；
所述胞外域包含抗PD-L1 scFv分子或抗PD1 scFv分子；所述跨膜域包含α1β1TM；所述胞内域包含α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、招募免疫细胞的细胞因子。抗PD-L1 scFv分子或抗PD1 scFv分子，能够增敏T细胞的肿瘤协同杀伤效应。
所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，所述招募免疫细胞包括T细胞、NK细胞。
所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，所述招募T细胞或NK细胞细胞的细胞因子包括CCL5。胞内域可分泌表达CCL5及GM-CSF，促进CAR-单核/巨噬细胞逆转冷肿瘤微环境的同时，招募T细胞等免疫细胞富集至肿瘤处实现“冷热”转换。
所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，由包含有抗PD-L1 scFv分子的胞外域、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、CCL5作为招募T细胞的细胞因子，组成的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；
胞外域包含抗PD-L1 scFv分子或抗PD1 scFv分子；跨膜域包含α1β1TM；胞内域包含α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、招募免疫细胞的细胞因子；
优选，免疫细胞包括T细胞、NK细胞；
更优选，T细胞等免疫细胞的细胞招募因子包括CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CCL22、IL-8、IL12、IL-15、IL-18等机体具有免疫细胞招募活化能力的细胞因子。
第三方面，本发明提供了一种含有所述的嵌合抗原受体的重组表达载体。
第四方面，本发明提供了任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞的制备方法，构建所述的重组表达载体，将重组表达载体转染单核/巨噬细胞。
所述的制备方法，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：
(1)将PD-L1 scFv或PD1 scFv、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域和OFP使用linker进行连接，再使用P2A连接GM-CSF基序，再使用P2A连接招募T细胞的细胞因子基序，合成嵌合抗原受体PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5或PD1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5；
(2)将嵌合抗原受体PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5或PD1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5与慢病毒载体重组，构成重组表达载体。
第五方面，本发明提供了任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，所述的嵌合抗原受体，所述的重组表达载体在制备治疗实体瘤的药物中的应用。
第六方面，本发明提供了一种治疗实体瘤的药物组合物，包含任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，或所述的嵌合抗原受体，或所述的重组表达载体，及药物学上可接受的辅料或载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于CCL5招募因子构建了免疫细胞招募、冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，不但能够靶向肿瘤组织并深度浸润实体肿瘤内部特异吞噬肿瘤细胞，同时还能将肿瘤抗原提呈给T细胞，激活T细胞对肿瘤的免疫反应。本发明利用巨噬细胞的天然优势，增强肿瘤内部的深度浸润。并依靠细胞因子GM-CSF和CCL5，逆转肿瘤微环境，募集CD8+T细胞，恢复T细胞对肿瘤的杀伤作用，将免疫抑制型微环境恢复成免疫炎症型，将“冷肿瘤”逆转成“热肿瘤”，提高抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实施例1中靶向PD-L1的Immune cell recruiting CAR-M(ICR CAR-M)的分子结构图；
图2为实施例3中抗PD-L1型ICR CAR-M与细胞膜的共聚焦共定位图；
图3为实施例4中ICR CAR-M的活力检测结果图；
图4为实施例5中UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M组对PDL1+肿瘤细胞的效靶比杀伤结果图；
图5为实施例6中ICR CAR-M吞噬B16F10肿瘤能力检测结果图；
图6为实施例7中ICR CAR-M体外自身M1表型极化检测结果图，其中，*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；
图7为实施例8中ICR CAR-M体外抗M2复极化检测结果图，其中，*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；
图8为实施例9中ICR CAR-M体外调控M0型巨噬细胞极化为M1型的结果图，其中，*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；
图9为实施例10中ICR CAR-M体外调控M2型巨噬细胞逆转情况分析结果图，其中，*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；
图10为实施例11中Transwell趋化实验验证ICR CAR-M招募T细胞能力检测结果图；
图11为实施例12中ICR CAR-M体内靶向小鼠肿瘤模型IVIS成像及定量结果图；
图12为实施例13中ICR CAR-M体内治疗结果图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例采用慢病毒载体构建巨噬细胞的特异性CAR成为肿瘤微环境修复和治疗型CAR-M，以PD-L1为模式分子成功建立肿瘤微环境修复和招募免疫细胞的治疗型CAR-M，于细胞膜表面表达跨膜PD-L1 scFv胞外段。
实施例1：ICR CAR-M慢病毒的构建和包装
基于慢病毒载体，通过将PD-L1 scFv、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域和OFP使用linker进行连接，再使用P2A连接GM-CSF基序，再使用P2A连接CCL5基序，构建的靶向PD-L1ICR CAR-M的分子结构如图1所示，靶向PD-L1 ICR CAR-M的分子结构由胞外域、跨膜域和胞内域三部分构成。胞外域中的抗原结合域是抗PD-L1 scFv分子。跨膜域α1β1TM的主要功能在于将CAR分子锚定在细胞膜上，其对CAR分子表达的稳定性及活化胞内刺激域具有重要作用。胞内域主要由α1β1、FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、CCL5组成，其转染单核/巨噬细胞，构建为ICR CAR-M。再将其转染巨噬细胞，构建巨噬细胞特异性CAR，通过将合成的PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5的CAR慢病毒质粒与Rev、Gag、VSV三种辅助质粒进行共转染，使其包装成为完整的PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5 CAR慢病毒。用于转染单核/巨噬细胞，构建单核/巨噬细胞特异性CAR-M(即ICR CAR-M)。
具体步骤如下：
(1)将处于对数生长期的HEK293T细胞均匀接种于6孔板中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中静置培养至细胞汇合度达到60％-70％，按3:1:1:1比例分别取质粒pCDH-PD-L1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5、Rev、Gag和VSV加入到装有Opti-MEM的离心管中混匀室温孵育，再加入TurboFect Transfection Reagent转染试剂，枪头轻柔吹打混匀，室温孵育；
(2)将上述孵育好的混合液缓慢滴加接种到293T细胞中，混合均匀，置于37℃、5％CO2培养16-24h后，弃掉培养板各孔中的转染混合液，添加2-3mL包含10％FBS、1×CD、0.01mM胆固醇、4.0mM L-Glu、0.01mM蛋黄卵磷脂的Advanced DMEM完全培养基，将细胞培养板重置于37℃、5％CO2培养48h，待合成为PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5CAR慢病毒；
(3)慢病毒的收集：将上述步骤中获得的细胞培养基于离心管中3000rpm离心5min，吸取上清液至新的无菌离心管中进行下一步的浓缩纯化；
(4)慢病毒的纯化浓缩：为去除细胞碎片，将含有慢病毒的培养基于4℃、4000g下离心10min。用0.22μm的过滤器过滤上清液并收集，离心机4℃、15000g离心2h。弃上清，利用病毒保存液重悬病毒颗粒，再10000g离心5min后取上清于-80℃中保存备用；
(5)随后，检测包装出来的慢病毒滴度，设置不加入病毒稀释液的293T细胞作为阴性对照；倒置荧光显微镜下观察各孔荧光情况，计算慢病毒滴度为后期使用提供用量依据。
上述PD-L1 ICR CAR-M分子(即PDL1 scFv-linker-α1β1-FcγRⅠ-linker-OFP-P2A-GM-CSF-P2A-CCL5)的核苷酸序列如下SEQ ID NO.1所示：
tctagaatgaatttacaaccaattttctggattggactgatcagttcagtttgctgtgtgtttgctgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcgacagctggatccactgggtgaggcaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcctggatcagcccctacggcggcagcacctactacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcgccgacaccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggaggcactggcccggcggcttcgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccaggacgtgagcaccgccgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacagcgccagcttcctgtacagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtacttcatcacccccaccaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagaggggcggtggttccggcggtggatctggtggaggaactggaggaggttcaggaggtggtttatgggtcatcctgctgagtgcttttgccggattgttgctgttaatgctgctcattttagcactgtggaagatcggattcttcaagagacctctgaagaagaagatggagaagaagatccatagactgcagagagagaagaagtacaacctggaggtgcctctggtgagcgagcagggcaagaaggccaacagcttccagcaggtgaggagcgacggcgtgtacgaggaggtgaccgccaccgccagccagaccacccctaaggaggcccctgacggccctaggagcagcgtgggcgactgtggccctgagcagcctgagcctctgcctcctagcgacagcaccggcgcccagaccagccagagcggcggtggttccggcggtggatctggtggaggaactggaggaggttcaggaggtggtgatagcactgagaacgtcatcaagcccttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgtgggcgagggccgcccctacgagggctttcagaccgctaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcatttcacctacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaactacgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctacaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtgatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggtgccctgaagggcaagatcaagatgaggctgaagctgaaggacggcggccactacacctccgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacatcgtcgacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccaccacctgttccagggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgtggctgcagaacctgctgttcctgggcatcgtggtgtacagcctgagcgcccccacaaggtctccaatcacagtgaccagaccctggaagcacgtggaggccatcaaggaggccctgaatctgctggacgacatgcccgtgaccctgaacgaagaggtggaggtggtgtccaacgagttcagcttcaagaagctgacctgtgtgcagaccaggctgaagatcttcgagcagggcctgaggggcaacttcaccaagctgaagggagccctgaatatgaccgccagctactaccagacctactgcccccccacccctgagacagattgcgagacccaggtgaccacctacgccgacttcatcgatagcctcaagacctttctgacagacatccccttcgagtgtaagaagccaggccagaagggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgaagatctctgctgccgccctgacaatcatcctgacagctgccgccctgtgtacacctgcccctgcttctccatatggaagcgatacaacaccttgttgttttgcttatctgtctctggctctgcctagagcccacgtgaaggagtacttttacacatcttctaagtgtagcaacctggctgtggtgttcgtgacaagaagaaatagacaggtgtgtgccaaccctgagaagaagtgggtgcaggagtacatcaactacctggagatgtcttaagaattc。
实施例2：制备ICR CAR-M细胞系
在包装为完整的慢病毒并检测了其滴度后，使用PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5 CAR慢病毒感染巨噬细胞，获得PD-L1 scFv ICR CAR-M稳转细胞系，取单核/巨噬细胞接种于细胞培养板内，待其生长到细胞汇合度至60-70％时，向巨噬细胞的培养基中加入PD-L1 scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5 CAR慢病毒病毒颗粒，24h前后更换新鲜DMEM完全培养基，48h后即完成巨噬细胞的慢病毒感染；观察细胞生长情况及形态变化，传代至新的培养瓶或培养皿中进行扩增或者冻存。
实施例3：ICR CAR-M细胞系的共聚焦表征
将PD-L1 scFv ICR CAR-M细胞系由含10％FBS的DMEM高糖培养基(hyclone)于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置培养。
(1)将培养的巨噬细胞利用PBS清洗1-2次，再用胰酶消化2min，并利用完全培养基重悬，重悬细胞浓度为105个细胞/mL，将1mL细胞重悬液加入共聚焦小皿中，平铺均匀，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置培养12h，待细胞贴壁；
(2)取出共聚焦小皿，利用PBS清洗细胞，每次清洗5min，清洗3次，再向共聚焦小皿中加入1mL的4％多聚甲醛固定20-30min，吸尽固定液，同样PBS清洗3次，每次5min；
(3)DiO处理：通过DiO(DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针对ICR CAR-M细胞膜进行染色，首先利用DMSO将DiO粉末颗粒稀释成浓度为1-5mM的储存液，再利用PBS稀释浓度至1-5μM形成工作液，将100μL的工作液从共聚焦小皿的小室边缘加入，轻轻晃动覆盖所有细胞，15-20min后吸尽染色液，PBS清洗3次，每次5min；
(4)DAPI染色处理：利用DAPI蓝色荧光染料对ICR CAR-M细胞核进行染色，首先将浓度为5mg/mL的DAPI储存液利用PBS稀释至0.5-10μg/mL形成工作液再将100μL的工作液，加入共聚焦皿并覆盖所有细胞，10-15min后吸尽染色液，PBS清洗3次，每次5min；
(5)封片及成像处理：样品用抗荧光衰减封片剂进行封片处理，使之完全覆盖样本细胞并且不能产生气泡，最终样品置于共聚焦扫描显微镜的载物台台上进行荧光监测。如图2所示，共聚焦显微镜结果显示PD-L1 scFvICR CAR-M融合蛋白成功跨膜表达。其中，DAPI代表DAPI蓝色荧光染料对ICR CAR-M细胞核染色成功，DiO代表DiO细胞膜绿色荧光探针对细胞膜进行染色成功，OFP红色荧光代表ICR CAR-M跨膜构建表达成功，Merge为DAPI、DiO、ICR CAR-M的叠加图片，体现了PD-L1 scFv-OFP跨膜表达与DiO细胞膜染色的共定位。(由于专利说明书附图不能带有色彩的限制，图2不能够完整用色彩清楚显示，Merge结果实为DAPI、DiO、PD-L1 scFv-OFP的叠加图片，验证了CAR结构的跨膜正确表达。)
实施例4：ICR CAR-M细胞系的活力检测
采用CCK细胞增殖试验验证ICR CAR-M细胞系的活力，具体操作如下：
(1)于96孔板中每孔加入100μL的不同组的巨噬细胞悬液，分别为J774A.1(UTD-M)、Empty-pCDH J774A.1(Empty)、PD-L1 scFv J774A.1(CAR-like)、PD-L1 scFv CARJ774A.1(ICR CAR-M)密度为1×104个细胞/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；
(2)细胞培养24-48h之后，吸去96孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向96孔板中加入10μL的CCK-8检测溶液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养3-4h；
(3)用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，靶细胞细胞活性大小＝(效靶比作用组吸光度－效应细胞对照组吸光度)/(靶细胞阳性对照组吸光度－空白孔吸光度)。
结果如图3所示，ICR CAR-M组细胞增殖显著增强于CAR-Like组和UTD-M、Empty组。研究结果提示，ICR CAR-M的基础活力显著增强，其中GM-CSF的表达增强了CAR-M的活力。
实施例5：ICR CAR-M效靶比肿瘤细胞杀伤效果验证
(1)于96孔板中每孔加入100μL的PD-L1阳性肿瘤靶细胞B16F10悬液，密度为1×105个细胞/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；
(2)待PD-L1阳性肿瘤靶细胞贴壁后，吸去孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，分别向96孔板中分别加入100μL 1:1，0.75:1，0.5:1，0.25:1效靶比的UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M，剂量效应组依次设置不同效靶比，同时在没有靶细胞的96孔板中加入等量的UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M细胞作为效应细胞对照，设置全部裂解的未加效应细胞的等量PD-L1阳性肿瘤靶细胞孔作为靶细胞阳性对照组，每组实验设置3个平行孔；
(3)细胞共培养24-48h之后，吸去96孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向96孔板中加入10μL的CCK8检测溶液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养3-4h；
(4)用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，靶细胞细胞活性大小＝(效靶比作用组吸光度－效应细胞对照组吸光度)/(靶细胞阳性对照组吸光度－空白孔吸光度)。
结果如图4所示，相比于UTD-M、Empty、CAR-like组，ICR CAR-M组对PD-L1阳性肿瘤细胞有显著杀伤作用。
实施例6：ICR CAR-M吞噬肿瘤细胞能力验证
将实施例2中构建的ICR CAR-M，分别基于1:1的效靶比，以PD-L1+-B16F10肿瘤细胞为模型，使用ICR CAR-M吞噬肿瘤细胞，具体操作为：于6孔板中分别接种4×105个UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M、PD-L1阳性肿瘤靶细胞，以10％FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2条件培养，待细胞长至汇合度为70-80％时，向巨噬细胞组中加入工作浓度4μM的DiO染料，向PD-L1阳性肿瘤靶细胞组中加入工作浓度4μM DiI染料，孵育4-6h。效靶细胞分别染色互做后于荧光显微镜下拍照。
结果如图5所示，相对于UTD-M、Empty、CAR-like组，ICR CAR-M组的吞噬肿瘤细胞能力得到了显著提升，这意味着本专利设计的CAR-M吞噬能力得到了显著增强。(因专利说明书附图不能带有色彩限制，图5的荧光结果显示不全，第二列红色代表各类型巨噬细胞与肿瘤细胞相互作用后被吞噬的肿瘤细胞，在1小时后ICR CAR-M的图案中红色荧光分布最多。)
实施例7：ICR CAR-M的体外M1表型极化检测
将实施例2中构建的ICR CAR-M，基于2×105个细胞/mL的密度，于6孔板中进行培养并检测，具体操作为：于6孔板中分别接种4×105个UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M以10％FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2培养箱中静置培养48h，随后分别提取各组细胞总RNA，采用qPCR检测CAR-M自身极化。利用SuperReal PreMix Plus试剂盒检测上述细胞中极化相关细胞因子的表达情况，按照试剂盒说明书进行实验，qPCR实验步骤如下：
(1)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；
(2)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向引物、Mix、ROX、ddH2O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中，20μL体系包括：10μL 2×SuperRealPremix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、0.6μL反向引物(10μM)、0.1-2μL cDNA模板、0.4μL 50×ROX Reference Dye，使用RNase-free ddH2O补充至总体积20μL；
(3)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5-10s，确保所有组分均在管底；
(4)将反应体系放置于RT-qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，95℃预变性15min、95℃变性10s、60℃±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循环，运行程序，待程序结束后导出Ct值，并利用2-ΔΔCt(Livak)法计算最终结果。
结果如图6所示，与CAR-like组和UTD-M、Empty组相比，ICR CAR-M组M1型因子CD80基因表达水平均显著上升，但其M2型因子CD206表达水平均显著下降，说明ICR CAR-M组相对于CAR-like组和UTD-M、Empty组均呈现显著性的M1型抗肿瘤巨噬细胞特性，提示GM-CSF在CAR-M的极化方面发挥了作用，说明本发明ICR CAR-M能够维持自身M1表型不被极化改变。
实施例8：ICR CAR-M体外抗M2复极化验证
采用肿瘤细胞培养上清液体外模拟肿瘤抑制性微环境体系，分别作用ICR CAR-M、CAR-Like及UTD-M、Empty组，将实施例2构建成功的ICR CAR-M细胞与CAR-Like和UTD-M、Empty组进行对照分析，肿瘤培养上清对ICR CAR-M诱导5d，提取细胞总RNA，qPCR检测进一步验证CAR-M抗极化能力。具体步骤包括：
(1)于6孔板中每孔加入2×105个的ICR CAR-M、CAR-like、UTD-M、Empty组，置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；
(2)待ICR CAR-M、CAR-like、UTD-M、Empty组细胞贴壁后，吸去孔板中的培养基，PBS清洗细胞2-3次，分别向孔板中每组加入肿瘤细胞培养上清，每组实验设置3个平行孔。
(3)细胞诱导5d后，吸去孔板中的培养基，PBS清洗细胞2-3次，再向孔板中每孔加入1mL的Trizol，提取RNA，利用SuperReal PreMix Plus试剂盒，并按照其说明书进行实验。
(4)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；
(5)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向引物、Mix、ROX、ddH2O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中，20μL体系包括：10μL 2×SuperRealPremix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、0.6μL反向引物(10μM)、0.1-2μL cDNA模板、0.4μL 50×ROX Reference Dye，使用RNase-free ddH2O补充至总体积20μL；
(6)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5-10s，确保所有组分均在管底；
(7)将反应体系放置于RT-qPCR仪中，设置仪器参数，95℃预变性15min、95℃变性10s、60±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循环，运行程序，待程序结束后导出Ct值，并利用2-ΔΔCt(Livak)法计算最终结果。
结果如图7所示，在肿瘤上清液的作用下，与ICR CAR-M组相比，CAR-like组、UTD-M、Empty组M2型因子CD206基因表达水平均显著上升，提示CAR-like组、和UTD-M、Empty组在肿瘤微环境诱导性出现M2型极化，而ICR CAR-M组仍然保持显著性的M1型巨噬细胞特征，说明ICR CAR-M能够在肿瘤微环境中抗M2复极化。
实施例9：ICR CAR-M体外调控M0型巨噬细胞逆转为M1型
采用培养上清液体外诱导普通巨噬细胞，提取其细胞总RNA，qPCR检测进一步验证ICR CAR-M极化能力。具体步骤包括：
(1)于6孔板中每孔加入2×105个普通巨噬细胞，使用UTD-M、Empty、CAR-like、ICRCAR-M细胞培养液上清进行诱导；
(2)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向6孔板中每孔加入1mL的Trizol，提取RNA，检测方法同上述的qPCR的检测方法。
结果如图8所示，UTD-M、Empty、CAR-like组M2型标志物CD206基因表达水平均显著上升，提示UTD-M、Empty、CAR-like组不能诱导M0型巨噬细胞重编程为M1表型，而ICR CAR-M组上清诱导的巨噬细胞显示出显著性的M1型巨噬细胞特征，说明ICR CAR-M上清能够调控M0型巨噬细胞极化为M1型，初步评价其体外调控能力。
实施例10：ICR CAR-M体外调控M2型巨噬细胞逆转为M1型
采用肿瘤细胞培养上清液体外模拟肿瘤抑制性微环境体系，分别作用ICR CAR-M、CAR-like、UTD-M、Empty组，将构建成功的ICR CAR-M细胞与CAR-Like和UTD-M、Empty组进行对照分析，肿瘤培养上清对普通巨噬细胞诱导，随后使用CAR-M上清进行诱导，提取其提取细胞总RNA，qPCR检测进一步验证ICR CAR-M抗极化能力。具体步骤包括：
(1)于6孔板中每孔加入2×105个普通巨噬细胞，使用肿瘤细胞培养上清诱导5d，置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，每组实验设置3个平行孔；
(2)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，使用ICR CAR-M、CAR-like组、UTD-M、Empty组细胞培养液上清进行诱导；
(3)细胞诱导5d后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗细胞2-3次，再向6孔板中每孔加入1mL的Trizol，提取RNA，检测方法同上述的qPCR的检测方法。
结果如图9所示，与CAR-like组、UTD-M、Empty组相比，在ICR CAR-M组上清液的作用下，CAR-like组、UTD-M、Empty组M2型因子CD206表达水平均显著上升，提示CAR-like组、UTD-M、Empty组在肿瘤微环境中不能诱导M2型巨噬细胞重编程为M1表型，而ICR CAR-M组上清诱导的巨噬细胞显示出显著性的M1型巨噬细胞特征，说明ICR CAR-M上清能够调控M2型巨噬细胞逆转为M1型，初步评价其体外肿瘤微环境调控能力。
实施例11：Transwell趋化实验验证ICR CAR-M招募T细胞
采用5.0μM孔径的聚碳酸酯膜Transwell 24孔板用来验证ICR CAR-M特异性招募T细胞体外趋向性，其具体实验操作如下：
(1)下层细胞的接种：向Transwell 24孔板中分别接种2.5×105、3.75×105、5×105个CAR-like组和ICR CAR-M组细胞，并分别标定为Ⅰ(2.5×105)组、Ⅱ(3.75×105)组、Ⅲ(5×105)组，用含10％FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h；
(2)上层T细胞的接种：将聚碳酯膜Transwell嵌套嵌入24孔板中，将5×105个T细胞接种至Transwell嵌套上层，并将T细胞用CD3+抗体进行激活，T细胞来源自小鼠脾脏；
(3)5％CO2，37℃培养箱共培养2h，检测上室未迁移的T细胞和下室迁移的T细胞，流式进行计数。
结果如图10显示，与CAR-like组相比，ICR CAR-M组能够显著使T细胞迁移至下室，说明ICR CAR-M通过胞内表达CCL5的设计，使其具备招募T细胞的能力。
实施例12：ICR CAR-M体内靶向肿瘤效果验证
本发明使用小鼠B16F10肿瘤模型验证ICR CAR-M在体内对肿瘤的靶向效果，B16F10肿瘤模型的建立及体内靶向验证包括如下步骤：
(1)小鼠黑色素瘤细胞系B16F10利用1640培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(2)4-6周龄的雌性C57小黑鼠购买后需于恒温无菌通风小鼠饲养间饲养一周以上后进行小鼠实验；
(3)将B16F10细胞扩大培养，待小鼠饲养约一周后，消化B16F10细胞，用PBS清洗2-3次，并利用PBS重悬，稀释密度为107个细胞/mL，将100μL细胞重悬液以皮下注射的方式注射到小鼠右肢上方皮下；
(4)将UTD-M、ICR CAR-M细胞均利用DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(5)待B16F10细胞成瘤后，每组设置1只小鼠，分别将100μL UTD-M或ICR CAR-M细胞悬液通过尾静脉方式进行注射，注射前先利用IR780对UTD-M和ICR CAR-M进行染色，每6mL培养基加入15μL染料，悬浮染色半小时。UTD-M、ICR CAR-M组分别注射3×106个细胞，随后利用IVIS进行成像拍摄，分为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h，随后进行离体拍摄心，肝，脾，肺，肾，肿瘤。
结果如图11所示，CAR-M能够很好的富集到肿瘤细胞处，在器官中分布较UTD-M少。
实施例13：ICR CAR-M体内治疗肿瘤效果验证
本发明使用小鼠B16F10肿瘤模型验证ICR CAR-M的抗肿瘤效果，B16F10肿瘤模型的建立及肿瘤治疗过程包括如下步骤：
(1)小鼠黑色素瘤细胞系B16F10利用1640培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(2)4-6周龄的雌性C57小黑鼠购买后需于恒温无菌通风小鼠饲养间饲养一周以上后进行小鼠实验；
(3)将B16F10细胞扩大培养，待小鼠饲养约一周后，消化B16F10细胞，用PBS清洗2-3次，并利用PBS重悬，稀释密度为107个细胞/mL，将100μL细胞重悬液以皮下注射的方式注射到小鼠右肢上方皮下；
(4)将UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M细胞均利用DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(5)待B16F10细胞成瘤后，每组设置6只小鼠的平行实验，分别将100μL PBS或细胞重悬液通过尾静脉方式进行注射，UTD-M、Empty、CAR-like、ICR CAR-M组每组每次分别注射3×106个细胞，在注射第一次后的第5d，进行第二次注射，共注射两次。
(6)用电子游标卡尺对小鼠肿瘤的长和宽分别进行测量，利用电子天平对小鼠体重进行测量，小鼠肿瘤体积＝(长*宽2)/2，每两天测量一次，最后计算小鼠生存曲线。
结果如图12，相对于CAR-like组和UTD-M、Empty组，ICR CAR-M组肿瘤得到了明显抑制(图12-B)，UTD-M、Empty组与PBS组无法对小鼠肿瘤生长形成显著性抑制，CAR-like组虽然相对于普通巨噬细胞治疗有一定抑制效果，但是无法有效治疗，而ICR CAR-M组对小鼠肿瘤取得了显著性抑制效果；图12-C显示相对于CAR-like组和UTD-M、Empty、PBS组荷瘤小鼠陆续出现死亡，ICR CAR-M组小鼠生存期显著延长，部分小鼠完全治愈，ICR CAR-M组取得了显著的治疗效果。另外，相对于CAR-like组和UTD-M、Empty组，ICR CAR-M组体重无明显变化，提示其具有较好安全性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，其特征在于，所述冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞为嵌合抗原受体与单核/巨噬细胞的复合结构，其中嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；
所述胞外域包含抗PD-L1scFv分子或抗PD1scFv分子；所述跨膜域包含α1β1TM；所述胞内域包含α1β1、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、招募免疫细胞的细胞因子。
2.如权利要求1所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，其特征在于，所述招募免疫细胞包括T细胞、NK细胞。
3.如权利要求2所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，其特征在于，所述招募T细胞或NK细胞的细胞因子包括CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CCL22、IL-8、IL12、IL-15、IL-18。
4.如权利要求1所述的一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，其特征在于，由包含有抗PD-L1scFv分子的胞外域、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、CCL5作为招募T细胞的细胞因子，组成的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；
胞外域包含抗PD-L1scFv分子或抗PD1scFv分子；跨膜域包含α1β1TM；胞内域包含α1β1、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM-CSF、招募免疫细胞的细胞因子；
优选，招募免疫细胞包括T细胞、NK细胞；
更优选，招募T细胞或NK细胞的细胞因子包括CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CCL22、IL-8、IL12、IL-15、IL-18。
6.一种含有如权利要求5所述的嵌合抗原受体的重组表达载体。
7.如权利要求1-4任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞的制备方法，其特征在于，构建如权利要求6所述的重组表达载体，将重组表达载体转染单核/巨噬细胞。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：
(1)将PD-L1scFv或PD1scFv、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域和OFP使用linker进行连接，再使用P2A连接GM-CSF基序，再使用P2A连接招募T细胞的细胞因子基序，合成嵌合抗原受体PD-L1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5或PD1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5；
(2)将嵌合抗原受体PD-L1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5或PD1scFv-α1β1-FcγRⅠ-GM-CSF-CCL5与慢病毒载体重组，构成重组表达载体。
9.如权利要求1-4任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，如权利要求5所述的嵌合抗原受体，如权利要求6所述的重组表达载体在制备治疗实体瘤的药物中的应用。
10.一种治疗实体瘤的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞，或如权利要求5所述的嵌合抗原受体，或如权利要求6所述的重组表达载体，及药物学上可接受的辅料或载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310052269.3A CN116240173A (zh) | 2023-02-02 | 2023-02-02 | 一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310052269.3A CN116240173A (zh) | 2023-02-02 | 2023-02-02 | 一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116240173A true CN116240173A (zh) | 2023-06-09 |
Family
ID=86630617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310052269.3A Pending CN116240173A (zh) | 2023-02-02 | 2023-02-02 | 一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116240173A (zh) |
Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170151281A1 (en) * | 2015-02-19 | 2017-06-01 | Batu Biologics, Inc. | Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer |
| WO2019199689A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions comprising a viral vector for expression of a transgene and an effector |
| CN111093679A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-05-01 | 瑞非生物科技有限公司 | 用于条件调控基因表达的方法和系统 |
| US20200172865A1 (en) * | 2018-12-04 | 2020-06-04 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Modified Cell with Enhanced Migration Capability |
| US20200345773A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Myeloid Therapeutics, Inc. | Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof |
| CN112512594A (zh) * | 2018-03-23 | 2021-03-16 | 瑞非生物科技有限公司 | 经由基因调节多肽的条件性核定位的基因调节 |
| CN112533942A (zh) * | 2018-06-01 | 2021-03-19 | 华盛顿大学 | 嵌合抗原受体细胞疗法中细胞因子释放综合征的抑制 |
| CN113106067A (zh) * | 2020-01-10 | 2021-07-13 | 南京大学 | 一种嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(car-m)的构建及其应用 |
| CN114025787A (zh) * | 2019-06-21 | 2022-02-08 | 北卡罗莱纳州立大学 | Car-t细胞的原位募集、重编程和释放 |
| CN114249832A (zh) * | 2020-09-24 | 2022-03-29 | 博源润生医药（杭州）有限公司 | 一种靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体及表达该嵌抗原受体的免疫效应细胞及其应用 |
| US20220119476A1 (en) * | 2018-08-31 | 2022-04-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation of Antigen Presenting Cells and Methods for Using the Same |
| CN114410588A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-29 | 西安电子科技大学 | 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用 |
| CN114657143A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-06-24 | 西安电子科技大学 | 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
| CN114854692A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-08-05 | 北京默赛尔生物科技有限责任公司 | Car-巨噬细胞及其制备方法 |
| WO2022166665A1 (zh) * | 2021-02-08 | 2022-08-11 | 浙江大学 | 一种以内源性蛋白质分子替代单结构域抗体的嵌合抗原受体 |
| CN115772232A (zh) * | 2022-12-09 | 2023-03-10 | 宁蓬勃 | 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体单核/巨噬细胞及构建方法和应用 |
| CN115960256A (zh) * | 2022-09-26 | 2023-04-14 | 东南大学 | 一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用 |
| US20230183340A1 (en) * | 2020-02-26 | 2023-06-15 | Washington University | Compositions and Methods for Reducing Resistance to or Enhancing Immunotherapy |
| TW202325320A (zh) * | 2021-08-24 | 2023-07-01 | 瑞典商阿斯特捷利康公司 | 用於產生原代免疫細胞之方法 |
-
2023
- 2023-02-02 CN CN202310052269.3A patent/CN116240173A/zh active Pending
Patent Citations (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170151281A1 (en) * | 2015-02-19 | 2017-06-01 | Batu Biologics, Inc. | Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer |
| CN111093679A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-05-01 | 瑞非生物科技有限公司 | 用于条件调控基因表达的方法和系统 |
| CN112512594A (zh) * | 2018-03-23 | 2021-03-16 | 瑞非生物科技有限公司 | 经由基因调节多肽的条件性核定位的基因调节 |
| WO2019199689A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions comprising a viral vector for expression of a transgene and an effector |
| CN112533942A (zh) * | 2018-06-01 | 2021-03-19 | 华盛顿大学 | 嵌合抗原受体细胞疗法中细胞因子释放综合征的抑制 |
| US20220119476A1 (en) * | 2018-08-31 | 2022-04-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation of Antigen Presenting Cells and Methods for Using the Same |
| US20200172865A1 (en) * | 2018-12-04 | 2020-06-04 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Modified Cell with Enhanced Migration Capability |
| US20200345773A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Myeloid Therapeutics, Inc. | Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof |
| CN114025787A (zh) * | 2019-06-21 | 2022-02-08 | 北卡罗莱纳州立大学 | Car-t细胞的原位募集、重编程和释放 |
| CN113106067A (zh) * | 2020-01-10 | 2021-07-13 | 南京大学 | 一种嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(car-m)的构建及其应用 |
| US20230183340A1 (en) * | 2020-02-26 | 2023-06-15 | Washington University | Compositions and Methods for Reducing Resistance to or Enhancing Immunotherapy |
| CN114249832A (zh) * | 2020-09-24 | 2022-03-29 | 博源润生医药（杭州）有限公司 | 一种靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体及表达该嵌抗原受体的免疫效应细胞及其应用 |
| WO2022166665A1 (zh) * | 2021-02-08 | 2022-08-11 | 浙江大学 | 一种以内源性蛋白质分子替代单结构域抗体的嵌合抗原受体 |
| TW202325320A (zh) * | 2021-08-24 | 2023-07-01 | 瑞典商阿斯特捷利康公司 | 用於產生原代免疫細胞之方法 |
| CN114410588A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-29 | 西安电子科技大学 | 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用 |
| CN114657143A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-06-24 | 西安电子科技大学 | 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
| WO2023169092A1 (zh) * | 2022-03-11 | 2023-09-14 | 西安电子科技大学 | 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 |
| CN114854692A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-08-05 | 北京默赛尔生物科技有限责任公司 | Car-巨噬细胞及其制备方法 |
| CN115960256A (zh) * | 2022-09-26 | 2023-04-14 | 东南大学 | 一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用 |
| CN115772232A (zh) * | 2022-12-09 | 2023-03-10 | 宁蓬勃 | 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体单核/巨噬细胞及构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| SHENGBO ZHANG等: "CCL5-deficiency enhances intratumoral infiltration of CD8+ T cells in colorectal cancer", CELL DEATH AND DISEASE, 10 July 2018 (2018-07-10), pages 1 - 15 * |
| 徐栩;姚健楠;: "肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤免疫治疗作用的研究进展", 检验医学与临床, no. 11, 14 June 2019 (2019-06-14), pages 1610 - 1613 * |
| 杨颖;李勤;郭忠慧;杨启修;张嘉敏;赵俸涌;王晨;朱自严;: "M-CSF、GM-CSF诱导人源外周血单个核细胞来源巨噬细胞的不同极化和吞噬", 中国输血杂志, no. 09, 25 September 2020 (2020-09-25), pages 859 - 864 * |
| 秦瑜等: "靶向肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤细胞治疗应用的研究进展", 中国医药导刊, 15 November 2022 (2022-11-15), pages 1068 - 1072 * |
| 顾杰艺;张二浩;徐寒梅;: "靶向实体瘤微环境以提高CAR-T细胞疗效的新策略研究", 药物生物技术, no. 02, 15 April 2018 (2018-04-15), pages 171 - 176 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101918544B (zh) | 提高免疫反应性的方法 | |
| CN108504668A (zh) | 靶向cd19和cd22嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN106659742A (zh) | 表达免疫应答刺激细胞因子以吸引和/或激活免疫细胞的基因修饰间充质干细胞 | |
| CN114410588B (zh) | 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用 | |
| CN105188768A (zh) | 免疫保护性原代间充质干细胞和方法 | |
| EP3299023A1 (en) | Low-oxygen-treated mesenchymal stem cell and use thereof | |
| CN114657143B (zh) | 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 | |
| CN113416260B (zh) | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
| CN115772232A (zh) | 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体单核/巨噬细胞及构建方法和应用 | |
| CN111606999A (zh) | 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用 | |
| Swan et al. | IL7 and IL7 Flt3L co-expressing CAR T cells improve therapeutic efficacy in mouse EGFRvIII heterogeneous glioblastoma | |
| CN105950662B (zh) | 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用 | |
| CN110016465A (zh) | 一种包含b细胞及肿瘤双识别性t细胞的免疫细胞药物 | |
| JP7051060B2 (ja) | 脳腫瘍治療用細胞製剤 | |
| TWI794699B (zh) | 一種質體組合及其在製備經修飾的免疫細胞中的應用 | |
| CN102787097A (zh) | 经修饰的树突状细胞及包含该树突状细胞的疫苗 | |
| CN107164412A (zh) | 一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用 | |
| CN116478932A (zh) | 基因修饰的免疫细胞及其应用 | |
| CN116240173A (zh) | 一种冷热肿瘤调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 | |
| CN102776235B (zh) | 一种重组表达质粒及其在制备抗肿瘤免疫基因治疗药物中的应用 | |
| CN110358737A (zh) | 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体t淋巴细胞的方法 | |
| CN102660579B (zh) | HBx和人IL-12双基因重组载体及抗肝癌疫苗 | |
| CN104922153A (zh) | Nrg1-erbb4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用 | |
| CN107502596A (zh) | 表达ny‑eso‑1特异性tcr的t细胞及其应用 | |
| CN114410686A (zh) | 一种工程化外泌体原位纳米疫苗及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |