CN109777783B - 表达cxcr2的car-nk92细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了表达CXCR2的CAR‑NK92细胞、制备方法及其应用。具体地，本发明提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2。CXCR2不仅可以帮助靶向CD47的CAR‑NK细胞向肿瘤细胞的迁移，还可以提高靶向CD47的CAR‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。尤其是本发明表达含有vSIRPα的CAR和CXCR2的NK细胞，能够有效地杀伤肿瘤细胞，显著提高疗效和减少复发和副作用。

Description

表达CXCR2的CAR-NK92细胞、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及表达CXCR2的CAR-NK92细胞、制备方法及其应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)，其基础结构包括：肿瘤相关抗原结合区，胞外铰链区，跨膜区和胞内信号区。肿瘤相关抗原的选择直接影响其对肿瘤的治疗效果。

现有的CAR-T细胞对血液瘤有较好治疗效果，但对实体瘤治疗效果欠佳，同时存在细胞因子风暴等问题，需要进一步的去完善。

综上所述，本领域仍然需要进一步的研究，开发一种能更有效、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的工程化免疫细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种能更有效、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的工程化免疫细胞。

本发明的主要目的是提供一种制备表达CXCR2的CAR-NK92细胞的方法，得到的CAR-NK92细胞可以特异性的识别高表达CD47的肿瘤细胞，同时CAR-NK92表达的趋化因子受体CXCR2可以帮助CAR-NK92细胞向肿瘤细胞的迁移和提高CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，可在制备和治疗肿瘤的药物中进行应用。

本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为NK细胞，更佳地为NK92细胞。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR含有靶向CD47的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，所述“-”为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向CD47的抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、SIRPα、vSIRPα、或其组合。

在另一优选例中，所述L为SIRPα或vSIRPα来源的信号肽。

在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-30位所示。

在另一优选例中，所述靶向CD47的抗原结合结构域为天然或突变的SIRPα胞外结合区，较佳地为突变的SIRPα胞外结合区(vSIRPα)。

在另一优选例中，所述S的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第31-148位所示。

在另一优选例中，所述L-S的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-148位所示。

在另一优选例中，所述vSIRPα的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-148位所示。

在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述H的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第149-195位所示。

在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、NKG2D、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述TM为NKG2D来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第196-217位所示。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、4-1BB(CD137)、NKG2D、或其组合。

在另一优选例中，所述C为4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第218-259位所示。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第1-371位所示。

在另一优选例中，所述CXCR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第390-748位所示。

在另一优选例中，所述CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1中第1-1113位所示。

在另一优选例中，所述CXCR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1中第1168-2247位所示。

本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2，从而获得本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述靶向CD47的CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达CXCR2的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。

在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的免疫细胞已经表达所述CAR时，则步骤(B1)可以省略。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。

在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列。

在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码CXCR2的核酸序列。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。优选地，所述肿瘤为实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤、或其组合。

本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达所述CXCR2的第二表达盒。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。

本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述需要的对象为人或非人哺乳动物。

本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2。

在另一优选例中，所述CAR和CXCR2通过连接肽连接。

在另一优选例中，所述连接肽为2A肽或IRES，较佳地为T2A或P2A。

在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式II所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ-A-Q (II)

式中，所述“-”为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向CD47的抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽，较佳地为T2A或P2A；

Q为CXCR2。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第七方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示融合蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；

(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

本发明的第九方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第八方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第八方面所述的多核苷酸的载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达本发明第七方面所述的融合蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明实施例1中的重组慢病毒载体pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2的主要结构图。

图2显示了本发明实施例4中慢病毒感染后CAR-NK92(CXCR2)细胞的CXCR2表达情况。

图3显示了本发明实施例4中慢病毒感染后CAR-NK92(CXCR2)细胞的趋化活性。

图4显示了本发明实施例5中CAR-NK92(CXCR2)细胞的杀伤活性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现靶向CD47的CAR-NK细胞和趋化因子受体CXCR2具有协同作用，CXCR2不仅可以帮助靶向CD47的CAR-NK细胞向肿瘤细胞的迁移，还可以提高靶向CD47的CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。尤其是本发明表达含有vSIRPα的CAR和CXCR2的NK细胞，能够有效地杀伤肿瘤细胞，显著提高疗效和减少复发和副作用。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在免疫细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，本发明嵌合抗原受体的基础结构包括：肿瘤相关抗原结合区，胞外铰链区，跨膜区和胞内信号区。肿瘤相关抗原的选择直接影响其对肿瘤的治疗效果。在本发明中，本发明的嵌合抗原受体靶向CD47。

CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)，是免疫球蛋白超家族成员，可与信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47，这是癌细胞为了避免被巨噬细胞摄取的一种逃生手段。

在本发明的一个优选例中，选择人SIRPα胞外结合区或其变异体(vSIRPα)作为本发明CAR中靶向CD47的抗原结合结构域。

在本发明的另一个优选例中，选择vSIRPα(SEQ ID NO.:2中第31-148位)作为本发明CAR中靶向CD47的抗原结合结构域。相比SIRPα，vSIRPα与CD47的亲和力提高了数万倍，可以高效的与CD47结合。

在本发明中，本发明的靶向CD47的抗原结合结构域还包括vSIRPα保守性变异体，指与本发明vSIRPα的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

在一个实施方式中，本发明CAR的结构为vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ。优选地，本发明CAR的序列如SEQ ID NO.:2所示。

CXCR2

趋化因子是一种小分子量细胞因子，可使白细胞发生定向趋化功能，可分为CXC、CC、C、CX3C四大类。CXCR2是CXC类趋化因子所对应的受体家族中的一员，常分布于中性粒细胞，是趋化因子CXCL5和CXCL8的受体。研究发现肝癌细胞分泌大量的CXCL8，招募骨髓间充质干细胞到肿瘤微环境中发挥调节功能，促进肿瘤的转移。CXCL5与CXCL8基因结构类似,在前列腺上皮细胞中通过激活了PI3K信号通路促进上皮细胞的增殖和侵袭，CXCL5还促进EGR1基因的转录，发挥促进肿瘤的生长和生存的作用。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡(减少)是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。

NK92细胞系是经过单克隆化，可永久生存的大颗粒淋巴细胞。它几乎缺失了所有的KIRs，但同时又表达一系列激活性受体，表达丰富的颗粒酶和穿孔素，识别靶细胞没有MHC限制，可在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞，是临床细胞过继治疗的理想选择，也是唯一被美国FDA批准应用于临床I期和II期的NK细胞系。而且NK92细胞的细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有以下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

融合蛋白

如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第七方面所述的结构。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:2所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPEGRGSLLTCGDVEENPGPEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL(SEQID NO.:2)

其中，第1-30位为vSIRPα来源的信号肽；第31-148位是vSIRPα的CD47结合区；第149-195位是CD8铰链区；第196-217位是NKG2D跨膜区；第218-259位是4-1BB共刺激信号分子；第260-371位是CD3ζ；第372-389位是T2A；第390-748位是CXCR2。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:2所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

ATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCCCCGGCCGCCTCGGGCCGCTGCTCTGCCTGCTGCTCGCCGCGTCCTGCGCCTGGTCAGGAGTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGATCATTCAGCCTGACAAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTATCACCTCTCTGTTCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGTGTTAATCTACAATCAAAGACAGGGCCCCTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACACCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTATCAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACCCACTACAACTCCAGCACCCAGACCCCCTACACCTGCTCCAACTATCGCAAGTCAGCCCCTGTCACTGCGCCCTGAAGCCTGTCGCCCTGCTGCCGGGGGAGCTGTGCATACTCGGGGACTGGACTTTGCCTGTGATATCTACTGGATAGCAGTAATGATTATTTTCCGTATCGGAATGGCCGTAGCTATCTTCTGCTGCTTCTTTTTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAGAAGATTTTAACATGGAGAGTGACAGCTTTGAAGATTTCTGGAAAGGTGAAGATCTTAGTAATTACAGTTACAGCTCTACCCTGCCCCCTTTTCTACTAGATGCCGCCCCATGTGAACCAGAATCCCTGGAAATCAACAAGTATTTTGTGGTCATTATCTATGCCCTGGTATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAACTCCCTCGTGATGCTGGTCATCTTATACAGCAGGGTCGGCCGCTCCGTCACTGATGTCTACCTGCTGAACCTAGCCTTGGCCGACCTACTCTTTGCCCTGACCTTGCCCATCTGGGCCGCCTCCAAGGTGAATGGCTGGATTTTTGGCACATTCCTGTGCAAGGTGGTCTCACTCCTGAAGGAAGTCAACTTCTATAGTGGCATCCTGCTACTGGCCTGCATCAGTGTGGACCGTTACCTGGCCATTGTCCATGCCACACGCACACTGACCCAGAAGCGCTACTTGGTCAAATTCATATGTCTCAGCATCTGGGGTCTGTCCTTGCTCCTGGCCCTGCCTGTCTTACTTTTCCGAAGGACCGTCTACTCATCCAATGTTAGCCCAGCCTGCTATGAGGACATGGGCAACAATACAGCAAACTGGCGGATGCTGTTACGGATCCTGCCCCAGTCCTTTGGCTTCATCGTGCCACTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGATTCACCCTGCGTACGCTGTTTAAGGCCCACATGGGGCAGAAGCACCGGGCCATGCGGGTCATCTTTGCTGTCGTCCTCATCTTCCTGCTCTGCTGGCTGCCCTACAACCTGGTCCTGCTGGCAGACACCCTCATGAGGACCCAGGTGATCCAGGAGACCTGTGAGCGCCGCAATCACATCGACCGGGCTCTGGATGCCACCGAGATTCTGGGCATCCTTCACAGCTGCCTCAACCCCCTCATCTACGCCTTCATTGGCCAGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCAAGATTCTAGCTATACATGGCTTGATCAGCAAGGACTCCCTGCCCAAAGACAGCAGGCCTTCCTTTGTTGGCTCTTCTTCAGGGCACACTTCCACTACTCTCTAA(SEQ ID NO.:1)

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

本发明还提供了含有本发明多核苷酸的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

制备方法

本发明还提供了制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的方法，所述制备方法如本发明第二方面所述。

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种工程化免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：

S1:以CD3ζ作为CAR的胞内信号段，以NKG2D作为跨膜区，4-1BB作为共刺激因子，人SIRPα胞外结合区的变异体来识别CD47，构成一个特异性识别CD47的嵌合抗原受体,并人工合成对应的核苷酸序列：vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ，同时通过T2A的核苷酸序列将CAR与CXCR2的核苷酸序列连接起来，构成一个融合基因：vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ-T2A-CXCR2。

S2：将所述融合基因片段插入到慢病毒表达质粒中，得到目的质粒。包装成携带vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ-T2A-CXCR2的慢病毒

S3：取对数生长期的293FT细胞接种到细胞培养皿中，将S2中的目的质粒同包装质粒，包膜质粒一同转染到293FT细胞包出病毒，收集病毒液并浓缩。

S4：取S3中的病毒浓缩液，加入到培养的NK92细胞中，同时加入终浓度为8ug/mL的聚凝胺，37℃，5％CO₂培养过夜，收集细胞，1500rpm/min，离心5min，弃掉上清，PBS洗一遍，加入含有100IU白细胞介素2的TBD细胞培养液，得到可以表达CXCR2的CAR-NK92细胞。

进一步的S2中构建成功的慢病毒表达质粒为pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2。

进一步的，慢病毒包装的具体方法为：

(1)对数生长期的293FT细胞接种于10cm细胞培养皿中，带细胞密度达到80％开始转染。

(2)取无菌水450uL,加入50uL的2M的CaCl2溶液，同时加入PLP1质粒4.63ug，PLP2质粒4.3ug，VSVG质粒3.01ug和pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2质粒9ug，充分涡旋混匀。

(3)将含有CaCl2和质粒的混合溶液逐滴加入到500uL的HEPPS缓冲液中，充分涡旋混匀，室温静止20min。

(4)将步骤(3)中的混合溶液逐滴且均匀的加入10cm细胞培养皿中，充分混匀，放入37℃，5％CO2培养箱过夜培养。

(5)第二天更换为新鲜的含2％胎牛血清的DMEM细胞培养基，继续培养。

(6)转染48h后收集病毒液，2000rpm/min，离心10min后，将上清用0.45uM的滤膜进行过滤，并使用超速离心机对病毒液进行浓缩，浓缩液放入-80℃冰箱保存。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括含本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，NK细胞)进行的治疗性应用。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NK细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明第一方面所述的免疫细胞，如表达CXCR2的靶向CD47的CAR-NK细胞。

在一个实施方式中，本发明CAR-NK就可以治疗表达该抗原的所有癌症。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰NK细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD47CAR-NK细胞引起抗表达CD47的细胞的特异性免疫应答。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤、或其组合。

本发明的CAR-NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将本发明表达盒引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用含本发明表达盒的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。本发明CAR-NK细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的NK细胞。

本发明的CAR-NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的NK细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。NK细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的NK细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的NK细胞组合物优选通过i.v.注射施用。NK细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将NK细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的NK细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁵个至1×10¹⁰个本发明经修饰的NK细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的技术方案，具有如下有益效果：

1.本发明工程化的免疫细胞表达的CXCR2与靶向CD47的CAR具有协同作用，CXCR2不仅可以帮助靶向CD47的CAR-NK细胞向肿瘤细胞的迁移，还可以显著提高靶向CD47的CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

2.本发明工程化的免疫细胞，尤其是表达含有vSIRPα的CAR和CXCR2的NK细胞能更好的发挥抗肿瘤作用，能够有效地杀伤肿瘤细胞，显著提高疗效，安全、毒副作用小，并且可以防止肿瘤细胞的免疫逃逸，不易脱靶和复发。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1重组慢病毒载体pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2的构建

基因合成vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ-T2A-CXCR2核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)，其主要结构图如图1所示。通过酶切转化连接到pLV-EF1-MCS质粒中，基因上游为EF1a启动子。载体转化到Stb13大肠杆菌菌株中，通过氨苄青霉素筛选获得阳性克隆。提取质粒，酶切鉴定克隆，获得慢病毒的表达质粒pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2。

实施例2慢病毒的制备

(1)转染前一天，将处于对数生长期的293FT细胞接种于10cm的细胞培养皿中，当细胞密度达到80％左右时开始转染。

(2)将无菌水和2M的CaCl2溶液按照9：1的体积充分混匀，总体积500uL，同时慢病毒表达质粒pLV-EF1-MCS-vSIRPα-T2A-CXCR2加入9ug，包装质粒PLP1加入4.63ug、PLP2加入4.3ug、VSVG加入3.01ug，充分涡旋混匀，然后将其逐滴加入到500uL的HEPPS缓冲液中，充分涡旋混匀，室温静止20min。最后将混好的转染溶液均匀的加入10cm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱培养12h。

(3)将细胞培养皿中的液体吸弃，换为新鲜的含2％胎牛血清的DMEM细胞培养基继续培养。

(4)48h后，收集细胞培养皿中的病毒液，2000rpm/min，离心10min，以去除细胞碎片，将上清用0.45uM的滤膜进行过滤，最后用超速离心机对病毒液离心2h，条件为：27000rpm/min，4℃。弃掉离心管中的上清液，用100uL的PBS对浓缩液进行重悬，放入-80℃冰箱保存。

实施例3NK92细胞慢病毒感染

计数NK92细胞，1×10⁵个/孔接种于24孔板，采用TBD细胞培养液(含100IU的白介素2)，加入慢病毒浓缩液100uL，同时加入终浓度为8ug/mL的聚凝胺，放入37℃，5％CO2培养箱过夜培养。第二天换为正常的新鲜培养基。当细胞扩增到一定量时，采用流式细胞仪检测细胞表面vSIRPα的表达情况。取一定数量的细胞，分成2管，一管用FITC anti-humanCD172a(SIRPα)流式标记抗体和细胞孵育，然后加入FITC二抗，另一管用FITC二抗和细胞孵育，作为阴性对照(control)，由流式分析结果来看，有71％的细胞表达了vSIRPα，即慢病毒感染的NK92细胞为71％。

实施例4慢病毒感染的NK92细胞CXCR2表达检测和趋化活性检测

(1)含全长vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ-T2A-CXCR2或只包含CAR结构(vSIRPα-CD8-NKG2D-4-1BB-CD3ζ)的慢病毒感染NK92细胞，48小时后收集细胞，PBS洗2遍，用抗人CXCR2抗体(货号：MM0222-7J40，abcam公司)检测细胞膜CXCR2表达，结果显示：与CAR-NK92组相比，CAR-NK92(CXCR2)的CXCR2表达明显，平均荧光强度(对数值)由38升高至230(如图2所示)。

(2)趋化活性检测采用5um孔径(货号3421；Costar,Cambridge,MA)transwell检测,transwell中聚碳酸酯膜在含有20ug/mL的BSA的PBS中4℃浸泡过夜，使用前于24孔板中晾干。实验前将CAR-NK92细胞和CAR-NK92(CXCR2)细胞饥饿处理4小时(TBD培养液含100IU的白介素2，1％的BSA，10mM HEPES缓冲液，pH6.9)。在24孔板中加入500uL含100ng/mLCXCL5的无血清TBD培养基(含100IU的白介素2)或培养过K562细胞的TBD培养基(含100IU的白介素2)；晾干的transwell放入孔中，然后将200uL的Far red标记的血清饥饿处理的细胞5×10⁵个加入transwell上室。培养4小时，收集下室迁细胞，离心沉淀，重悬于300uL预冷的FACS缓冲液(含10％的小牛血清和0.2％的叠氮钠)，每个样品加1×10⁵数量的9微米的乳胶珠(BCR167,sigma公司)和50ug/mL的Propidium Iodide/碘化丙啶工作液25微升(ST511,碧云天生物技术有限公司)，流式细胞仪检测样品。以各组中的乳胶珠作为参照，统计PI染色阴性细胞(迁移细胞数＝APC(-)％,APC(+)％×10⁵，迁移率为＝迁移细胞数,10⁵×100)。

结果显示K562细胞培养上清可促进，CAR-NK92(CXCR2)细胞迁移，从2.2％增加到4％(图3A)；在趋化因子CXCL5浓度为100ng/mL时，可明显增加CAR-NK92(CXCR2)细胞趋化效率，由3.5％上升到9.5％左右(图3B)；充分说明CXCR2可以增强CAR-NK92(CXCR2)细胞向高浓度CXCL5部位迁移的趋化活性。

实施例5杀伤实验

计数K562细胞，1×10⁴个K562细胞/孔铺于96孔细胞培养板中；计数感染和未感染的NK92细胞，按照效靶比10:1,5:1,1:1的比例加入到对应的96孔细胞培养板中，同时设计空白对照组(只加培养基)和阴性对照组(只加K562细胞或只加NK92细胞)。通过测量死亡细胞释放的LDH，计算NK92细胞、CAR-NK92细胞和CAR-NK92(CXCR2)细胞对K562靶细胞的杀伤效率。

结果如图4所示，可以看出相对于未修饰的NK92细胞，修饰过的NK92细胞对K562有更好的杀伤效果。同时，CAR-NK92(CXCR2)细胞对K562细胞的杀伤百分比达到90％以上。相比NK92细胞、CAR-NK92细胞，CAR-NK92(CXCR2)细胞杀伤K562的效率分别提高了132％、26％，表达CXCR2更有助于NK92细胞对K562细胞的杀伤作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海尚泰生物技术有限公司

<120> 表达CXCR2的CAR-NK92细胞、制备方法及其应用

<130> P2019-0111

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60

gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcagatcat tcagcctgac 120

aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactat cacctctctg 180

ttccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccgggt gttaatctac 240

aatcaaagac agggcccctt cccccgggta acaactgttt cagacaccac aaagagaaac 300

aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360

tgtatcaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 420

gagctgtctg tgcgcgccaa acccactaca actccagcac ccagaccccc tacacctgct 480

ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg 540

ggagctgtgc atactcgggg actggacttt gcctgtgata tctactggat agcagtaatg 600

attattttcc gtatcggaat ggccgtagct atcttctgct gcttcttttt taaacggggc 660

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 720

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 780

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 840

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 900

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctgagggca gaggaagtct gctaacatgc 1140

ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccagaa gattttaaca tggagagtga cagctttgaa 1200

gatttctgga aaggtgaaga tcttagtaat tacagttaca gctctaccct gccccctttt 1260

ctactagatg ccgccccatg tgaaccagaa tccctggaaa tcaacaagta ttttgtggtc 1320

attatctatg ccctggtatt cctgctgagc ctgctgggaa actccctcgt gatgctggtc 1380

atcttataca gcagggtcgg ccgctccgtc actgatgtct acctgctgaa cctagccttg 1440

gccgacctac tctttgccct gaccttgccc atctgggccg cctccaaggt gaatggctgg 1500

atttttggca cattcctgtg caaggtggtc tcactcctga aggaagtcaa cttctatagt 1560

ggcatcctgc tactggcctg catcagtgtg gaccgttacc tggccattgt ccatgccaca 1620

cgcacactga cccagaagcg ctacttggtc aaattcatat gtctcagcat ctggggtctg 1680

tccttgctcc tggccctgcc tgtcttactt ttccgaagga ccgtctactc atccaatgtt 1740

agcccagcct gctatgagga catgggcaac aatacagcaa actggcggat gctgttacgg 1800

atcctgcccc agtcctttgg cttcatcgtg ccactgctga tcatgctgtt ctgctacgga 1860

ttcaccctgc gtacgctgtt taaggcccac atggggcaga agcaccgggc catgcgggtc 1920

atctttgctg tcgtcctcat cttcctgctc tgctggctgc cctacaacct ggtcctgctg 1980

gcagacaccc tcatgaggac ccaggtgatc caggagacct gtgagcgccg caatcacatc 2040

gaccgggctc tggatgccac cgagattctg ggcatccttc acagctgcct caaccccctc 2100

atctacgcct tcattggcca gaagtttcgc catggactcc tcaagattct agctatacat 2160

ggcttgatca gcaaggactc cctgcccaaa gacagcaggc cttcctttgt tggctcttct 2220

tcagggcaca cttccactac tctctaa 2247

<210> 2

<211> 748

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

145 150 155 160

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

165 170 175

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

180 185 190

Asp Ile Tyr Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg Ile Gly Met Ala

195 200 205

Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

210 215 220

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

225 230 235 240

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

245 250 255

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

260 265 270

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

275 280 285

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

290 295 300

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

305 310 315 320

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

325 330 335

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

340 345 350

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

355 360 365

Leu Pro Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

370 375 380

Glu Asn Pro Gly Pro Glu Asp Phe Asn Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu

385 390 395 400

Asp Phe Trp Lys Gly Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr

405 410 415

Leu Pro Pro Phe Leu Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu

420 425 430

Glu Ile Asn Lys Tyr Phe Val Val Ile Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu

435 440 445

Leu Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Met Leu Val Ile Leu Tyr Ser

450 455 460

Arg Val Gly Arg Ser Val Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu

465 470 475 480

Ala Asp Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp Ala Ala Ser Lys

485 490 495

Val Asn Gly Trp Ile Phe Gly Thr Phe Leu Cys Lys Val Val Ser Leu

500 505 510

Leu Lys Glu Val Asn Phe Tyr Ser Gly Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile

515 520 525

Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Arg Thr Leu Thr

530 535 540

Gln Lys Arg Tyr Leu Val Lys Phe Ile Cys Leu Ser Ile Trp Gly Leu

545 550 555 560

Ser Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr

565 570 575

Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Cys Tyr Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr

580 585 590

Ala Asn Trp Arg Met Leu Leu Arg Ile Leu Pro Gln Ser Phe Gly Phe

595 600 605

Ile Val Pro Leu Leu Ile Met Leu Phe Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg

610 615 620

Thr Leu Phe Lys Ala His Met Gly Gln Lys His Arg Ala Met Arg Val

625 630 635 640

Ile Phe Ala Val Val Leu Ile Phe Leu Leu Cys Trp Leu Pro Tyr Asn

645 650 655

Leu Val Leu Leu Ala Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu

660 665 670

Thr Cys Glu Arg Arg Asn His Ile Asp Arg Ala Leu Asp Ala Thr Glu

675 680 685

Ile Leu Gly Ile Leu His Ser Cys Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe

690 695 700

Ile Gly Gln Lys Phe Arg His Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ala Ile His

705 710 715 720

Gly Leu Ile Ser Lys Asp Ser Leu Pro Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe

725 730 735

Val Gly Ser Ser Ser Gly His Thr Ser Thr Thr Leu

740 745

Claims (25)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2的融合蛋白；

其中，所述融合蛋白的结构如下式II所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ-A-Q (II)

式中，所述“-”为连接肽或肽键；

L为信号肽序列；

S为靶向CD47的抗原结合结构域，所述靶向CD47的抗原结合结构域为突变的SIRPα的胞外结合区；并且，所述L-S的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第1-148位所示；

H为铰链区，所述H为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第149-195位所示；

TM为跨膜结构域，所述TM为NKG2D，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第196-217位所示；

C为共刺激信号分子，所述C为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第218-259位所示；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽；

Q为CXCR2；

并且所述免疫细胞为NK细胞。

2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为NK92细胞。

3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。

4.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第1-30位所示。

5.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述S的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第31-148位所示。

6. 如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第1-371位所示。

7.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CXCR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中第390-748位所示。

8.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第1-1113位所示。

9.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CXCR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1168-2247位所示。

10. 一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A) 提供一待改造的免疫细胞，所述免疫细胞为NK细胞；和

(B) 对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2的融合蛋白，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

13.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1-9任一项所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

14.如权利要求13所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml。

15.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗白血病的药物。

16. 一种用于制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1) 第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和

(2) 第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达所述CXCR2的第二表达盒；

其中，所述的第一核酸序列和第二核酸序列依次相连。

17.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含靶向CD47的嵌合抗原受体CAR和CXCR2；

所述融合蛋白的结构如下式II所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ-A-Q (II)

式中，所述“-”为连接肽或肽键；

L为信号肽序列；

S为靶向CD47的抗原结合结构域，所述靶向CD47的抗原结合结构域为突变的SIRPα的胞外结合区；并且，所述L-S的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第1-148位所示；

H为铰链区，所述H为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第149-195位所示；

TM为跨膜结构域，所述TM为NKG2D，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第196-217位所示；

C为共刺激信号分子，所述C为4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2中第218-259位所示；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽；

Q为CXCR2。

18.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为2A肽。

19.如权利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为T2A或P2A。

20.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示。

21.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求17所述的融合蛋白。

22.如权利要求21所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO: 2所示融合蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

23.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求21所述的多核苷酸。

24.如权利要求23所述的载体，其特征在于，所述载体为含有或插入有如权利要求22所述的多核苷酸的载体。

25.如权利要求23所述的载体，其特征在于，所述载体用于表达如权利要求17所述的融合蛋白。

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