CN104231086B - 双功能融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

双功能融合蛋白及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双功能融合蛋白及其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及包含CTLA4分子胞外区、Fc片段以及具有中和TNFα活性的功能片段的双功能融合蛋白、编码该双功能融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该双功能融合蛋白的药物组合物，所述具有中和TNFα活性的功能片段是TNFR2分子胞外区或抗TNFα单链抗体，其中CTLA4分子胞外区位于双功能蛋白的N端，TNFR2分子胞外区或抗TNFαscFv位于双功能蛋白的中间或C端。本发明的双功能融合蛋白能够同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR信号通路，从而抑制炎症反应。与使用单功能蛋白的情况相比，可降低生产成本，并减少临床给药体积和频率，提高受试者顺从性。

Description

双功能融合蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及双功能融合蛋白及其制备方法和用途，具体而言，本发明涉及包含CTLA4分子胞外区、Fc片段以及有中和TNFα活性的功能片段的双功能融合蛋白、编码该双功能融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该双功能融合蛋白的药物组合物。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性、进行性、系统性自身免疫性疾病，在全球人群中的发病率为0.5％-1％。其早期的症状表现为关节的肿胀、疼痛、活动困难等。随着病情的发展，关节会严重畸形甚至致残，并且有可能累及其它的组织和器官，引起肺间质病变、胸膜炎、心包炎、类风湿血管炎等疾病的发生。因此，及时有效地治疗对于阻止病程的发展、缓解症状、改善患者的生活质量意义重大。
传统的RA治疗主要采用非甾体类抗炎药物、糖皮质激素和缓解病情的药物。随着RA发病机理研究的深入，越来越多的生物制剂被用于RA的治疗并展示了较传统RA治疗药物起效更加迅速、治疗周期更短、副作用更小的优点。目前已经上市的治疗RA的生物制剂作用于多个不同的靶点，如抑制TNFα活性的TNFα的拮抗剂、针对B细胞的单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab)、抑制T细胞活性的阿巴他赛(Abatacept)、抑制IL-6信号通路的单克隆抗体妥珠单抗(Tocilizumab)、中和IL-1活性的阿那白滞素(Anakinra)等(Vierboom M,BreedveldE,Hart BA.Expert opinion on drug discovery.2012,7(4):315-325)。其中，TNFα的拮抗剂是治疗RA的一线药物，所占市场份额也最大。TNFα是一种细胞炎症因子，通过与其受体TNFR1和TNFR2结合诱导其它炎症因子的分泌。TNFα的拮抗剂能够阻止这种结合，降低TNFα信号通路的活性，达到抑制炎症反应的目的。目前已上市的TNFα的拮抗剂主要有可溶性的TNFα受体和TNFα单克隆抗体两类。可溶性的TNFα受体是将TNFR2的胞外区与IgG的恒定区进行融合，如辉瑞(Pfizer)公司于1998年上市的依那西普(Etanercept)。TNFα单克隆抗体类是特异识别TNFα的基因工程抗体，能够中和TNFα，目前已上市的有J&J的英利昔单抗(Infliximab)和戈利木单抗(Golimumab)，UCB公司的赛妥珠单抗(Certolizumab)以及雅培(Abbott)公司的阿达木单抗(Adalimumab)(Lin J,Ziring D,Desai S,et al.ClinicalImmunology,2008,126:13-30)。临床应用显示，TNFα的拮抗剂可以有效地减轻RA炎症、缓解关节的放射学进展，患者ACR20指数的改善率达50％-70％。但是，同时也发现有20-30％的患者对TNFα的拮抗剂的应答不理想，或者在接受长期的TNFα的拮抗剂治疗后，效果逐渐下降(Gibbons LJ,Hyrich KL.Biodrugs,2009,23(2):111-124)。对于这部分患者就必须使用其它作用机制的抗RA药物进行治疗。
T细胞介导的免疫反应异常是RA的主要发病机制。研究发现RA患者的关节滑膜液中有大量的活化的T细胞浸润。这些活化的T细胞刺激滑膜细胞分泌胶原酶和蛋白酶，造成软骨的破坏，还刺激B细胞、内皮细胞的活化，表达针对自身抗原的抗体和炎症细胞因子。调节和抑制T细胞的功能被认为是一种治疗RA的有效的方式(Cope AP,Arthritis researchand therapy,2008,10(S1):1-10)。Abatacept是一种通过抑制T细胞激活的发挥作用的治疗RA的生物制剂，它由百时美施贵宝公司开发并于2005年上市。Abatacept是将CTLA4蛋白的胞外区与IgG的恒定区进行了融合，通过阻断B7分子与CD28的结合从而抑制T细胞的增殖和活化。由于其机制与现有的TNFα的拮抗剂完全不同，Abatacept被用于中重度类风湿关节炎的治疗，特别是被推荐用于TNFα的拮抗剂治疗失败的患者。临床研究显示，对TNFα的拮抗剂治疗效果不明显的患者使用Abatacept治疗后，ACR20、ACR50和ACR70指数在5年后仍可达76.4％，51.9％和22％，并且治疗产生的副作用很低(Genovese MC,Schiff M,Luggen M,etal.The Journal of Rheumatology,2012,39:1546-1554)。这一结果显示Abatacept与TNFα的拮抗剂在作用机制和效果上具有互补性。
鉴于RA对患者生活质量的巨大危害，仍然有必要研究一种结合了TNFα的拮抗剂和抑制T细胞增殖和活化两种作用机制的新型RA治疗药物。
发明内容
因此，本发明提供了结合了TNFα的拮抗剂和抑制T细胞增殖和活化两种作用机制的新型RA治疗药物。
因此，本发明的第一方面涉及一种蛋白，具体而言，一种双功能融合蛋白，其包含CTLA4分子胞外区、Fc片段、中和TNFα活性的功能片段，以及连接肽。
在一个实施方案中，CTLA4分子胞外区位于融合蛋白的N端。
在一个实施方案中，所述蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、Fc片段、连接肽和中和TNFα活性的功能片段。
在一个实施方案中，所述蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、连接肽、中和TNFα活性的功能片段和Fc片段。
在一个实施方案中，所述CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个实施方案中，所述Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组。在一个实施方案中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一个实施方案中，连接肽的氨基酸序列长度为1-50个氨基酸，例如，所述连接肽的氨基酸序列长度为10、15、20、21、22、23、24、25或30个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列长度为1-25个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列长度为15个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一个实施方案中，所述中和TNFα活性的功能片段为TNFR2分子的胞外区。在一个实施方案中，所述TNFR2分子的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在一个实施方案中，所述中和TNFα活性的功能片段为抗TNFα的单克隆抗体或其功能片段、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、双特异性抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG。在一个实施方案中，所述功能片段为单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在一个实施方案中，所述中和TNFα活性的功能片段为抗TNFα的单链抗体。在一个实施方案中，所述抗TNFα的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一个实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或7所示，或如SEQ IDNO：6或7所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：6或7序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％同一性。
在一个实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或9所示，或如SEQ IDNO：8或9所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或与SEQ ID NO：8或9序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％同一性。
本发明的第二方面涉及一种基因，其编码根据第一方面所述的蛋白。在一个实施方案中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10或11所示。
本发明的第三方面涉及一种基因，其编码根据第一方面所述的蛋白。在一个实施方案中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12或13所示。
本发明的第四方面涉及一种重组载体，其有效连接有根据第二方面或第三方面所述的基因。在某些实施方案中，所述的载体为真核细胞表达载体，在某些实施方案中，所述的载体为经改造而具有两个表达框的载体X0GC。
本发明的第五方面涉及一种宿主细胞，其含有根据第四方面所述的载体。
本发明的第六方面涉及一种制备根据第一方面所述蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将第二方面或第三方面所述基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和
(2)纯化所述蛋白。
在一个实施方案中，所述真核表达载体为X0GC，在一个实施方案中，所述宿主细胞为HEK293-T和CHO。
本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据第一方面所述的蛋白。
本发明的第八方面涉及一种根据第一方面所述的蛋白或根据第七方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述的蛋白用于制备预防或治疗下述疾病的药物：类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述的蛋白用于制备预防或治疗下述疾病的药物：骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第九方面涉及一种根据第一方面所述的蛋白或根据第七方面所述的药物组合物，其用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病。
在一个实施方案中，所述的蛋白或药物组合物用于预防或治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述的蛋白或药物组合物用于预防或治疗骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第十方面涉及一种预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的方法，其包括将治疗有效量的根据第一方面所述的蛋白或根据第七方面所述的药物组合物施与受试者。一个实施方案中，受试者是哺乳动物，在另一个实施方案中，受试者是灵长类动物，在另一个实施方案中，受试者是人类。
在一个实施方案中，所述的蛋白或药物组合物用于预防或治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，所述的蛋白或药物组合物用于预防或治疗骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。
本发明的第十一方面涉及一种试剂盒，其包含如上所述的蛋白、基因、重组载体或宿主细胞。
本发明的实验结果表明，该蛋白能够同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR信号通路，体外实验中强烈抑制炎症细胞因子的分泌，动物模型中能有效地抑制关节炎症的发展，能实现比组成该蛋白的单个功能单元所能实现的治疗RA效果更强的治疗效果，即，实现了两个功能单元治疗效果的部分叠加效果。本领域技术人员知晓，几个不同作用机理的药物联合使用或融合使用可能会出现拮抗、无关、累加或协同等不同的效果，两种或更多种药物联合使用或融合使用到底呈现何种相互作用只能通过具体的实验研究、付出大量劳动的情况下才能确定。由于人类机体的复杂性，尤其是对RA这样的发病机理极其复杂、发病机理尚未完全洞悉的全身性、免疫性疾病，药物即使联合使用或融合使用也罕有实现各个不同作用机理药物所能实现的治疗效果的完全累加或协同的效果，很多都呈现组合无关甚或拮抗的效果。本发明的蛋白实现的对RA的增强的治疗效果为RA患者、尤其是中重度RA患者的治疗提供了一种治疗效果更佳优异的候选药物。同时，本发明的蛋白同时作用于治疗RA的两个不同的靶点，降低了单一靶点治疗失败或效果不佳的机率，具有重要的经济意义和社会效益。与使用单功能的蛋白(例如CTLA4-Fc)情况相比，本发明可降低生产成本，并减少临床给药体积和频率，提高受试者顺从性，在免疫性疾病的预防和治疗上具有巨大的应用前景。
附图说明
图1：为本发明中双功能融合蛋白的结构示意图，A为CTLA4-Fc-TNFR，B为CTLA4-Fc-抗TNFαscFv，C为CTLA4-TNFR-Fc，D为CTLA4-抗TNFαscFv-Fc。
图2：为本发明中重组双功能融合蛋白的纯化流程图。
图3：为本发明中重组双功能融合蛋白的电泳检测。其中，泳道1为还原的CTLA4-Fc-TNFR，泳道2为非还原的CTLA4-Fc-TNFR，泳道3为还原的CTLA4-Fc-抗TNFαscFv，泳道4为非还原的CTLA4-Fc-抗TNFαscFv，泳道5为还原的CTLA4-TNFR-Fc，泳道6为非还原的CTLA4-TNFR-Fc，泳道7为还原的CTLA4-抗TNFαscFv-Fc，泳道8为非还原的CTLA4-抗TNFαscFv-Fc。
图4：为本发明中重组双功能融合蛋白与人TNFα的结合。A-C分别为CTLA4-Fc-TNFR与人TNFα的结合、CTLA4-Fc-抗TNFa scFv与人TNFα的结合和本发明四种重组双功能融合蛋白与人TNFα的结合的比较。
图5：为本发明中重组双功能融合蛋白与小鼠TNFα(A)和人TNFα(B)分子结合的动力学常数。
图6：为本发明中重组双功能融合蛋白与人CD80(A)和人CD86(B)分子的结合。
图7：为本发明中重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv双功能融合蛋白中和TNFα对L929细胞的毒性。
图8：为本发明中重组CTLA4-Fc-TNFR在MLR实验中抑制IL-2表达的结果。
图9：为本发明中CTLA4-Fc-TNFR治疗后，CIA诱导的小鼠的关节炎症指数的变化结果，A和B分别显示了炎症缓解效果和体重维持效果。
具体实施方式
本发明的一个目的在于提供一种能够同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR两条信号通路的双功能融合蛋白，或简称蛋白。阻断B7/CD28信号通路的功能片段与阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段有效连接，保持其各自的空间结构并发挥其各自的生理活性。所述阻断B7/CD28信号通路的功能片段与阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段可以在不影响其各自功能的情况下直接融合在一起，也可以在所述两条功能片段之间或末端加入其它序列，如连接肽或有利于促进所述两条功能片段发挥其各自活性、或有利于引起其它生物学效应，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用和补体依赖的细胞毒性性作用、或有利于提高融合蛋白药代动力学性质、或有利于生产和纯化的其他序列如抗体的Fc片段。在一个实施方式中，所述阻断B7/CD28信号通路的功能片段是CTLA4分子或其功能片段，本发明所用的术语“CTLA4分子或其功能片段”是指细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)分子及其功能片段，术语“功能片段”是指CTLA4分子发挥其功能如生理功能的部分。在一个实施方式中，所述阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段是中和TNFα活性的功能片段，在本发明中，术语“中和TNFα活性的功能片段”是指通过与TNFα结合而失活或部分失活TNFα生理功能的任何蛋白分子。在一个优选的实施方式中，所述中和TNFα活性的功能片段是TNFR2或其功能片段，在本发明中，术语“TNFR2或其功能片段”是指TNF受体2或其功能片段，术语“功能片段”是指TNFR2分子发挥其功能如生理功能的部分。在另外可选的实施方式中，所述中和TNFα活性的功能片段是抗TNFα抗体或其功能片段，术语“功能片段”是指抗TNFα抗体发挥其功能如生理功能的部分，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。
本发明的另一个目的在于提供所述双功能融合蛋白的编码基因、含有所述编码基因的载体，含有所述载体的宿主细胞以及含有所述双功能融合蛋白的药物组合物。
本发明的还一个目的在于提供一种制备所述双功能融合蛋白的方法。
本发明的再一个目的在于提供所述双功能融合蛋白的用途。
本发明提供的双功能融合蛋白有四种组合形式，其中一种为CTLA4分子胞外区-Fc片段-连接肽-TNFR2分子的胞外区，第二种为CTLA4分子胞外区-连接肽-TNFR2分子的胞外区-Fc片段，第三种为CTLA4分子胞外区-Fc片段-连接肽-抗TNFα的单链抗体，第四种为CTLA4分子胞外区-连接肽-抗TNFα的单链抗体-Fc片段。本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述双功能融合蛋白时所用限定语为“包含”，但其并不意味着可以在所述双功能融合蛋白序列中任意加入与其功能不相关的其他序列。在制备复杂组成的融合蛋白时，为了保证融合蛋白各个组成成分的空间结构、生物活性，以及为了将所述各种组分适当的融合在一起，或为了增强所述融合蛋白的抗水解能力，本领域技术人员在制备所述融合蛋白时，会根据需要在各个组分之间或所述融合蛋白的两端加入一个或多个额外的氨基酸残基，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双功能融合蛋白将不能真实地覆盖这些情形。
在一个实施方式中，阻断B7/CD28信号通路的功能片段是CTLA4分子胞外区。本发明所用的术语“CTLA4分子胞外区”是指细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)的胞外区。根据一种优选实施方式，所述CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。当然，在保证所述CTLA4分子胞外区的生理活性的基础上，其氨基酸序列可以沿着人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列相应减少或增加一个或多个氨基酸残基。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。保守氨基酸的替换是本领域公知的。
根据一种优选实施方式，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。当然，所述Fc片段的氨基酸序列也不是唯一的，其可以选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，本发明所用的术语“阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段”是指TNF受体，在一个实施方案中，术语“阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段”是指TNF受体2(TNFR2)，在一个实施方案中，术语“阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段”是指TNFR2的胞外区。根据一种优选实施方式，所述TNFR2分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。当然，在保证所述TNFR2分子胞外区的生理活性的基础上，其氨基酸序列可以沿着人TNFR2蛋白的第25-257位氨基酸序列相应减少或增加一个或多个氨基酸残基。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，本发明所用的术语“阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段”是指靶向TNFα的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。在某些实施方案中，阻断TNFα/TNFR信号通路的功能片段为靶向TNFα的IgG抗体(抗TNFα单克隆抗体)。在某些实施方案中，所述IgG为嵌合的、人源化的或全人的IgG。在某些实施方案中，所述修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了靶向TNFα的能力即可。在某些实施方案中，所述功能等同物是指能够实现所述免疫球蛋白靶向结合TNFα能力的其他多肽片段。在某些实施方案中，所述功能片段是指保留了靶向TNFα的能力的蛋白质片段，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在某些实施方案中，所述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生的多肽。
根据一种优选实施方式，所述抗TNFα的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。当然，所述抗TNFα的单链抗体的氨基酸序列也不是唯一的，其可以为任何已知的抗TNFα的单链抗体的氨基酸序列。所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基也可以进行保守氨基酸的替换。
在某些实施方案中，所述连接肽长度为1-50个氨基酸，如5-45个氨基酸、10-35个氨基酸，15-20个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列长度为1-25个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列长度为15个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明所用的连接肽并无特殊限制，只要其起到间隔融合蛋白的两个组分，使各个组分能正确形成其各自的空间结构、发挥其生物活性、保留其细胞表达水平和热稳定性即可。
根据一种优选实施方式，本发明双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8和9所示，或如SEQ ID NO：6、7、8和9所示序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：6、7、8和9序列具有至少70％同一性并具有同等功能的氨基酸序列，在一个实施方案中，本发明双功能融合蛋白的氨基酸序列为与如SEQ ID NO：6、7、8和9所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％或99.8％同一性并具有同等功能的氨基酸序列。
本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有CTLA4分子胞外区或中和IL-17的活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。
另一方面，本发明提供了一种编码基因，其包含编码本发明双功能融合蛋白的核苷酸序列。
本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述编码基因时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述编码基因两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述编码基因的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定所述编码基因将不能真实地覆盖这些情形。
本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。
根据一种优选实施方式，编码本发明CTLA4-Fc-TNFR以及分泌表达所需的信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
根据一种优选实施方式，编码本发明CTLA4-TNFR-Fc以及分泌表达所需的信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
根据一种优选实施方式，编码本发明CTLA4-Fc-抗TNFαscFv以及分泌表达所需的信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
根据一种优选实施方式，编码本发明CTLA4-抗TNFαscFv-Fc以及分泌表达所需的信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述核苷酸序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换。密码子使用表是本领域公知的。
还一方面，本发明提供了一种重组载体，其含有有效连接其中的本发明双功能融合蛋白的编码基因。所述重组载体为重组表达载体，可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选真核表达载体，更优选用于哺乳动物真核表达的重组表达载体。
本发明所用的术语“有效连接”是指这样的连接方式，其中所述编码基因置于载体的适当位置，使得所述编码基因正确地、顺利地复制、转录或表达。
还一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含含有本发明双功能融合蛋白的编码基因的载体。所述宿主细胞为原核宿主细胞或真核宿主细胞，但优选真核宿主细胞，更优选哺乳动物宿主细胞。在一个实施方案中，所述的宿主细胞包含CHO细胞、HEK293细胞、NSO细胞和SP 2/0细胞。
还一方面，本发明提供了一种制备本发明双功能融合蛋白的方法，其中，所述方法包括：(1)将上述方面的编码基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和(2)纯化所述双功能融合蛋白。优选地，所述纯化后的双功能融合蛋白的纯度为大于50％，更优选地，大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。
在一个实施方案中，所述真核表达载体为X0GC。
在一个实施方案中，所述宿主细胞为HEK293-T和CHO。
还一方面，本发明提供了一种含有本发明双功能融合蛋白的药物组合物。所述双功能融合蛋白可以是所述药物组合物的唯一活性成分，也可以是所述药物组合物活性成分之一，其他活性成分为可以与所述双功能融合蛋白组合使用的其他治疗剂。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含单次给药的剂型、局部给药的剂型和全身给药剂型。
又一方面，本发明提供了治疗有效量的所述双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述免疫性疾病选自自身免疫性疾病或器官移植疾病。
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
还一方面，本发明提供了所述双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物，其用于预防或治疗免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病。
在一个实施方案中，所述免疫性疾病选自自身免疫性疾病或器官移植疾病。
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
又一方面，本发明提供了免疫性疾病、排斥反应和心脑血管疾病的预防或治疗方法，其包括向罹患所述疾病的患者或倾向于罹患所述疾病的人群治疗有效量的给予上述方面所述的双功能融合蛋白或含有所述双功能融合蛋白的药物组合物的步骤。
在一个实施方案中，所述免疫性疾病选自自身免疫性疾病或器官移植疾病。
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、牛皮癣、Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。
本发明所用的术语“治疗有效量”是指在给药时，可以在受试者体内发挥药理作用的剂量。“治疗有效量”可以由本领域技术人员根据患者的情况如年龄、体重、疾病状态等容易地确定。
本领域技术人员知晓，虽然本发明上述内容中列出了本发明所述的双功能融合蛋白所能预防、治疗或改善的病状，但本发明的双功能融合蛋白所能处理的病状并不仅限于上述列出的具体病状，任何可以通过同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR两条信号通路而获得预防、治疗或改善益处的病状都包括在本发明的保护范围之内。
本发明提供的双功能融合蛋白能够与CTLA4的配体CD80和CD86以及TNFR的配体TNFa结合。体外实验有效地中和了TNFa对L929细胞的毒性，并且在人混合淋巴细胞反应(Mixture lymphocyte reaction，MLR)的实验中抑制细胞增殖和炎症因子的表达。治疗CIA诱导关节炎小鼠的研究显示，本发明提供的双功能融合蛋白显著地缓解病情的发展。显示本发明的双功能融合蛋白的结构组成形式保留了与天然蛋白相同的生物活性，也显示本发明的双功能融合蛋白在免疫调节特别是免疫抑制方面有潜在的应用价值。
根据本发明的上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1)将B7和TNFα两条信号通路的阻断分子(人CTLA4的胞外区和人TNFR2的胞外区或抗TNFαscFv)融合入一个分子进行表达和生产，与分别生产CTLA4蛋白的胞外区和人TNFR2的胞外区或抗TNFαscFv相比，极大地降低了操作方法和生产成本；
2)将人CTLA4蛋白的胞外区和和人TNFR2的胞外区或抗TNFαscFv通过抗体的Fc片段连接，目的蛋白形成二聚体形式，既满足了CTLA4胞外区和TNFR2胞外区发挥活性需要形成二聚体形式的要求又提高了抗TNFαscFv的效价，并且，体外结合实验也显示本发明中的连接方式对CTLA4分子的胞外区与其配体CD80和CD86的结合，对TNFR2的胞外区和抗TNFαscFv与TNFα的结合没有影响；
3)CIA小鼠模型实验结果显示，目的双功能蛋白能有效降低小鼠的炎症反应。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例
实施例1：重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc双功能融合蛋白表达载体的构建
1)CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc的氨基酸序列
CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc四种双功能融合蛋白的组合形式如图1的A-D所示。
人CTLA4蛋白的胞外区序列如SEQ ID NO：1所示，为人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列(Genbank登录号NM_005214.4.)。IgG免疫球蛋白的Fc部分(SEQ ID NO：2)参照专利US5637481。连接肽为(G4S)3(SEQ ID NO：3)。TNFR2蛋白的胞外区序列如SEQ ID NO：4所示，为人TNFR2蛋白的第23-257位氨基酸序列(Genbank登录号NP_001057.1)。抗人TNFαscFv序列如SEQ ID NO：5所示，其参考专利US20110002927A1。
CTLA4-Fc-TNFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，由N端到C端的顺序为人CTLA4蛋白的胞外区、IgG免疫球蛋白的Fc部分、连接肽(G4S)3和人TNFR2蛋白的胞外区。其带有oncostatin-M信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
CTLA4-TNFR-Fc的氨基酸如SEQ ID NO：7所示,由N端到C端的顺序为人CTLA4蛋白的胞外区、连接肽(G4S)3、人TNFR2蛋白的胞外区和IgG免疫球蛋白的Fc部分。其带有oncostatin-M信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
CTLA4-Fc-抗TNFαscFv的氨基酸如SEQ ID NO：8所示,由N端到C端的顺序为人CTLA4蛋白的胞外区、IgG免疫球蛋白的Fc部分、连接肽(G4S)3和抗人TNFαscFv。其带有oncostatin-M信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
CTLA4-抗TNFαscFv-Fc的氨基酸如SEQ ID NO：9所示,由N端到C端的顺序为人CTLA4蛋白的胞外区、连接肽(G4S)3、抗TNFαscFv和IgG免疫球蛋白的Fc部分。其带有oncostatin-M信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
上述编码核苷酸序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并利用TA克隆进入pUC57载体。
2)CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc表达载体的构建和转染质粒的准备
用pUC57-CTLA4-Fc-TNFR质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，通过常规PCR扩增CTLA4-Fc-TNFR编码序列，所用上游引物带有Hind III酶切位点，序列为CACAAGCTTGCCACCATGGGGGTCCTGCTGACTCAGAGG(SEQ ID NO：14)。下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为CCGGAATTCTCAGTCGCCAGTGCTCCC(SEQ ID NO：15)。
用pUC57-CTLA4-TNFR-Fc质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，通过常规PCR扩增CTLA4-TNFR-Fc编码序列，所用上游引物为SEQ ID NO：14。下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为CCGGAATTCTCACTTTCCTGGAGACAGG(SEQ ID NO：16)。
用pUC57-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，通过常规PCR扩增CTLA4-Fc-抗TNFαscFv编码序列，所用上游引物带有Hind III酶切位点，所用上游引物为SEQ ID NO：14。下游引物带有EcoR I酶切位点，序列为CCGGAATTCTCAGCTGCTGACAGTGACCAGT(SEQ ID NO：17)。
用pUC57-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，通过常规PCR扩增CTLA4-抗TNFαscFv-Fc编码序列，所用上游引物为SEQ ID NO：14。下游引物为SEQ ID NO：16。将扩增得到的TLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc编码序列经1％浓度的琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将回收获得的基因片段和本公司真核表达载体X0GC(专利US20100120089)用Hind III和EcoR I酶切后连接，获得重组质粒X0GC-CTLA4-Fc-TNFR、X0GC-CTLA4-TNFR-Fc、X0GC-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和X0GC-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc，分别将其转化大肠杆菌DH5α，获得重组菌DH5α/X0GC-CTLA4-Fc-TNFR、DH5α/X0GC-CTLA4-TNFR-Fc、DH5α/X0GC-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和DH5α/X0GC-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc。PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
将阳性DH5α/X0GC-CTLA4-Fc-TNFR、DH5α/X0GC-CTLA4-TNFR-Fc、DH5α/X0GC-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和DH5α/X0GC-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc分别接种至1L LB/Amp液体培养基(组成为1％蛋白胨(BD公司)、0.5％酵母提取物(BD公司)、1％NaCl(国药集团化学试剂有限公司))，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天使用天根生化科技有限公司的DP117无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒用于HEK293-T和CHO细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)转染。
实施例2：重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc双功能融合蛋白的表达
1)HEK293-T细胞的细胞工厂的准备
将生长状态良好、汇合度95％以上的HEK293-T细胞以18×107个的接种量接种于十层细胞工厂(NUNC公司)，用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自Corning公司)培养，细胞工厂反复颠倒混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养48小时，细胞贴壁完全、密度达到80％即可用于瞬时转染。
2)HEK293-T细胞的瞬时转染和表达
将X0GC-CTLA4-Fc-TNFR、X0GC-CTLA4-TNFR-Fc、X0GC-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和X0GC-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc重组质粒用0.22μm滤膜过滤后，分别吸取1330μg滤液，加入66ml无血清DMEM培养基。往2660μg转染试剂PEI(购自Sigma公司)中加入等体积的无血清DMEM培养基，之后与质粒滤液混合，静置15分钟。将含有质粒与PEI的混合物加入到1.3升的无血清DMEM培养基内，充分混匀后缓慢加入细胞工厂内。将细胞工厂置于37℃、5％CO2培养箱内培养。4小时后，加入266ml Cell Boost 5(购自Thermo Fisher公司)，混匀后继续培养3-4天，之后，7000rpm条件下离心20分钟收集上清液用于目的蛋白的纯化。
3)CHO-DG44细胞的细胞工厂的准备
将生长状态良好、汇合度95％以上的CHO-DG44细胞以25×107个的接种量接种于十层细胞工厂(NUNC公司)，用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM/F12培养基(购自Corning公司)培养，细胞工厂反复颠倒混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养48小时，细胞贴壁完全、密度达到80％即可用于瞬时转染。
4)CHO-DG44细胞的瞬时转染和表达
将X0GC-CTLA4-Fc-TNFR、X0GC-CTLA4-TNFR-Fc、X0GC-CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和X0GC-CTLA4-抗TNFαscFv-Fc重组质粒用0.22μm滤膜过滤后，分别吸取1330μg滤液，加入66ml无血清opti-MEM(购自Gibco公司)培养基。往2660μg转染试剂PEI(购自Sigma公司)中加入等体积的无血清opti-MEM培养基，之后与质粒滤液混合，静置15分钟。将含有质粒与PEI的混合物加入到1.3升的无血清opti-MEM培养基内，充分混匀后缓慢加入细胞工厂内。将细胞工厂置于37℃、5％CO2培养箱内培养。4小时后，将工厂里的培养液换成alpha-MEM(购自Corning公司)加入266ml Cell Boost 5(购自Thermo Fisher公司)，混匀后，37℃、5％CO2培养箱内培养培养9天。之后，7000 rpm条件下离心20分钟收集上清液用于目的蛋白的纯化。
实施例3：重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc双功能融合蛋白的纯化
重组双功能蛋白的纯化流程如图2所示。
1)细胞表达发酵液的预处理
将收获的细胞培养上清液7000rpm离心20min去除沉淀。细胞发酵液上清液经0.45μm滤膜过滤后，30K膜包超滤浓缩并置换成20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH 7.4。在应用层析柱纯化之前以0.45μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤操作在4℃下进行。
2)rProtein A亲和色谱纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.，10ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH7.4溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将预处理后的细胞发酵液上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行冲洗，然后以不同缓冲液进行洗脱。首先以流动相B1冲洗5个柱体积；接着以流动相B2冲洗5个柱体积；然后以流动相B3洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；最后以流动相B4冲洗5个柱体积。以上洗脱步骤流速都为5ml/min。流动相B1为在流动相A中添加0.5M精氨酸；流动相B2为20mM NaAc，pH4.5；流动相B3为100mM柠檬酸，pH3.0；流动相B4为100mM柠檬酸，pH 2.2。收集标示的洗脱峰并通过滴加1M NaAc将pH调整至5.0。
3)蛋白的离子交换色谱纯化
采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及强阴离子交换色谱柱HiTrap Q Sepharose FF(5ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM NaAc(pH 5.0)溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将上一步骤中收集并调整pH后的洗脱液进行上样，流速为5ml/min。流穿峰含有目的蛋白，收集流穿峰并置换至PBS缓冲液中。目的蛋白经SDS-PAGE检测其纯度，如图3所示。
实施例4：重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc双功能融合蛋白与人TNFα的结合
将浓度为2μg/ml的重组人TNFα(GIBCO,货号:PHC3015)按100μl/孔的量包被于96孔高吸附酶标板(Corning，2592)上，反应在pH＝9.6的碳酸盐缓冲条件下4℃过夜。第二天用PBST(Sigma,货号:P-3563)洗涤5次。每孔中加入300μl含1％BSA的PBST，于25℃封闭1小时。用PBST洗涤5次。将CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv、CTLA4-抗TNFαscFv-Fc以及阳性对照蛋白Etanercept(TNFR-Fc)(惠氏公司)用含1％BSA的PBST配置成不同浓度并按100μl的比例加到酶标板中，于25℃反应1小时。PBST洗涤5次。将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Abcam，货号:Ab7153)用3000倍体积的含1％BSA的PBST稀释后按100μl的比例加到酶标板中，于25℃反应1小时。PBST洗涤5次。每孔加入100μl比色底物TMB(BD OptEIA,货号:555214)，室温显色10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。结果如图4的A-C所示，CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc与人TNFα的结合活性与对照蛋白Etanetcept(TNFR-Fc)相当。
实施例5：重组CTLA4-Fc-TNFR双功能融合蛋白与小鼠TNFα和人TNFα结合的动力学常数
用BIAcore3000仪器来检测重组CTLA4-Fc-TNFR双功能融合蛋白与其配体TNFα结合的动力学常数。该仪器利用光学的表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。所有的测定均在室温25℃进行。
通过氨基偶联试剂盒(GE Healthcare,BR-1000-14)，将CTLA4-Fc-TNFR和Etanercept分别偶联到CM芯片(GE Healthcare,BR-1000-50)上，偶联水平达到2000个响应单位，流速设定为10μL/min。CTLA4-Fc-TNFR、Etanercept与其配体分子的结合信息均通过多个分析循环来获得。每个分析循环，都将流速设定为20μL/min，进样的时间为3分钟(小鼠TNFα和人TNFα均通过2倍稀释，得到一系列不同浓度的抗原溶液)，随后解离5分钟。再生条件为10mMGly-HCl溶液，pH 2.0。结合动力学常数和解离动力学常数通过BIAevaluationsoftware计算。重组CTLA4-Fc-TNFR双功能融合蛋白的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数见图5。
实施例6：重组CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc双功能融合蛋白与人CD80、CD86的结合
将浓度为1μg/ml的重组人CD80(Sino Biological,货号:10698-H08H)和CD86(Sino Biological,货号:10699-H08H)按100μl/孔的量分别包被于96孔高吸附酶标板上，反应在pH＝9.6的碳酸盐缓冲条件下4℃过夜。第二天用PBST(Sigma,货号:P-3563)洗涤5次。每孔中加入300μl含1％BSA的PBST，于25℃封闭1小时。用PBST洗涤5次。将CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv、CTLA4-抗TNFαscFv-Fc和阳性对照样品Abatacept(CTLA4-Fc)(施贵宝公司)用含1％BSA的PBST配置成不同浓度并按100μl的比例加到酶标板中，于25℃反应1小时。PBST洗涤5次。将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Abcam,货号:Ab7153)用3000倍体积的含1％BSA的PBST稀释后按100μl的比例加到酶标板中，于25℃反应1小时。PBST洗涤5次。每孔加入100μl比色底物TMB(BD OptEIA,货号:555214)，室温显色10分钟后加入100μl 1M H2SO4终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。结果如图6的A和B所示，CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-TNFR-Fc、CTLA4-Fc-抗TNFαscFv和CTLA4-抗TNFαscFv-Fc均能与人CD80和CD86分子结合。
实施例7：重组CTLA4-Fc-TNFR和CTLA4-Fc-抗TNFαscFv双功能融合蛋白中和TNFα对L929细胞的毒性
将测试蛋白按不同浓度稀释于含2μg/ml放线菌素D、4ng/ml人TNFα和10％的胎牛血清(Gibco,货号:10099)的RPMI-1640培养基(Gibco,货号:22400)中备用。将L929细胞(购自ATCC)用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬并调整细胞浓度为1.5×105个/ml，取100μL加至平底96孔板中，于37℃，5％CO2的细胞孵箱中培养，24小时后弃上清，加入新鲜培养基和测试蛋白各50μl，混匀后于37℃，5％CO2的细胞孵箱中培养24小时。按20μl/孔的量加入MTS(Promega，G3581)后继续培养3小时。在酶标仪上读取490nm处的吸光度。结果如图7所示，CTLA4-Fc-TNFR和CTLA4-Fc-抗TNFαscFv能有效中和TNFα对L929细胞的杀伤作用。
实施例8：重组CTLA4-Fc-TNFR双功能融合蛋白抑制IL-2的表达
人PBMCs由两位健康志愿者提供。分别按1：1的比例用DPBS稀释全血。在离心管中加入室温的人淋巴细胞分离液，按1：1的比例轻轻加入血和DPBS的混合液，400g离心20分钟，取出第二层乳白色的细胞，1：5加入DPBS，1000rpm离心10分钟收集PBMCs。DPBS洗两次，用含10％FBS的RPMI1640重悬，计数。将其中一位志愿者来源的PBMCs作为刺激者，37℃条件下用丝裂霉素C(50μg/ml)处理45分钟。另一位志愿者来源的PBMCs作为反应者。将反应者PBMCs与丝裂霉素C处理过的刺激者PBMCs加入圆底96孔板，各1×105细胞/孔，50μl/孔。将细胞混匀后加入100μl梯度稀释的CTLA4-Fc-TNFR、CTLA4-Fc、Humira(Abbott公司)或DPBS缓冲液，每种样品做三个重复。
将MLR反应的细胞于37℃培养箱中孵育3天后取出，取出50μl细胞上清使用IL-2ELISA检测试剂盒(购自RayBiotech公司，货号ELH-IL-2-001)检测IL-2的表达。结果如图8显示CTLA4-Fc-TNFR具有抑制IL-2表达的活性，且活性优于同等浓度下CTLA4-Fc或Humira单独给药的效果。
实施例9：重组CTLA4-Fc-TNFR双功能融合蛋白在Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型中的药效研究
将8周龄雄性DBA1/J小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)随机分为两组，一组7只作为正常小鼠对照，其余小鼠分入另一组建立CIA模型。CIA小鼠模型经初次免疫和加强免疫两次免疫建立。初次免疫使用70μgⅡ型牛胶原(Chondrex,货号20022)与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich,货号F5881)混合形成乳液，于小鼠尾根部皮内注射。三周以后，进行加强免疫。加强免疫使用70μgⅡ型牛胶原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich,货号F5506)混合形成乳液，于小鼠尾根部皮内注射。在加强免疫后观察到小鼠四肢足爪红肿等临床性关节炎症状之后，将CIA模型小鼠随机分组，每组7只，给予溶媒或者药物。给药样品及剂量为Abatacept(33nmol/kg)、Etanercept(33nmol/kg)、联合给药Abatacept(33nmol/kg)和Etanercept(33nmol/kg)和CTLA4-Fc-TNFR(33nmol/kg)。每两天腹腔注射给药一次，分别在第0、2、4、6、8天给药，共给药5次。称量体重，观察前后四肢足爪病变情况，并进行关节炎指数评分：0＝无红肿，1＝踝关节或者跗骨关节有红斑、轻微肿胀，2＝从踝关节到跗骨关节均有红斑、轻微肿胀，3＝从踝关节到跖骨关节均有红斑、中等程度肿胀，4＝踝关节、足爪包括趾骨关节均有红斑、严重程度肿胀或者四肢关节僵硬。结果如图9所示，CTLA4-Fc-TNFR治疗后CIA诱导的小鼠的关节炎指数显著下降，好于同等浓度下Aatacept、Etanercept以及联合给药的治疗效果，显示了良好的炎症缓解效果(图A)；而且也显示了更好的体重维持效果(图B)。

Claims (12)

1.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.一种基因，其编码根据权利要求1所述的蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.一种重组载体，其有效连接有根据权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其含有根据权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，所述方法包括：
1)将权利要求2所述基因克隆至真核表达载体中并转染至宿主细胞进行表达；和
2)纯化所述蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述真核表达载体为X0GC。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述宿主细胞为HEK293-T或CHO。
9.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的蛋白。
10.一种根据权利要求1所述的蛋白或根据权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述的蛋白用于制备治疗下述疾病的药物：类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述的蛋白用于制备治疗下述疾病的药物：银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎。
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