JP6152433B2 - 抗tnf−抗il−17二重特異性抗体 - Google Patents
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Description
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTDYHIHWVRQAPGQCLEWMGVINPTYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGETYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGCGTKLEIK(配列番号1)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号2)。
本発明の二重特異性抗体を構築しているときに、化学および物理的安定性に関連する重大な問題に出くわした。例えば、高い濃度で親IL−17抗体は物理的安定性の欠点(例えば相分離)を示した。さらに、親IL−17抗体から構築した二重特異性抗体は、濃度依存性自己凝集を示した。したがって、化学および物理的安定性を改善し、濃度依存性凝集を減少させるために二重特異性抗体のCDRL2−1およびCDRH2−2部分において化学修飾を行った。LC/MSとの組み合わせにおける広範なタンパク質安定性および溶解度研究により、CDRL2−1およびCDRH2−2において化学的に不安定な残基が確認された。これらの不安定な残基をコドン欠失によって構築された標的ライブラリーを使用して電荷中性アミノ酸と置き換えた。これらの不安定な残基を置き換えることにより、改善された化学安定性が導かれた。さらに、二重特異性抗体の静電面を算出し、荷電したパッチを確認した。これらの荷電したパッチの破壊により、タンパク質自己凝集の減少が導かれた。したがって、表面静電分布を再平衡し、熱安定性を改善し、凝集を減少させ、化学安定性を改善した(特定の脱アミドおよび酸化部位を取り除く)、二重特異性抗体のCDRH2−1およびCDRL−2部分において変異が確認された。上記の修飾のどれも、親単一抗体の最初の特徴で確認されなかった。これらの変化は二重特異性抗体を構築する状況においてのみ出くわし、単一抗体の変異領域周囲の局所環境が二重特異性抗体の状況において異なることが示唆される。
本発明の二重特異性抗体はヒトTNFαおよびヒトIL−17の両方に結合する。本発明の二重特異性抗体はインビトロまたはインビボで少なくとも1つのヒトTNFα生物活性および少なくとも1つのヒトIL−17生物活性を中和する。本発明の二重特異性抗体は、インビトロでIL−17、ならびにインビトロで可溶性および膜結合TNFαの両方の有効な阻害剤である。
作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導できる発現ベクターは当該分野において周知である。発現ベクターは宿主細胞からポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであってもよい。第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、1つのベクターにおいて作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得るか、または代替的に、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、2つのベクター(一方は第1のポリペプチドを発現し、他方は第2のポリペプチドを発現する)において作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得る。
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAGCTATTACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTGAGCTACCTGAGTACTGCCTCCAGCCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGAGGCGGAGGATCCGGGGGAGGGGGTTCCGGAGGAGGGGGCTCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACAAGTTCACTGACTACCATATTCATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGAGTGGATGGGAGTAATTAATCCTACTTATGGTACTACTGACTACAATCAGCGGTTCAAAGGCCGTGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATATGATTACTTTACTGGGACGGGTGTGTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGATCTGGTGGAGGTGGCTCAGGAGGTGGCGGAAGCGGCGGAGGTGGAAGTGATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTAGGAGCCTTGTACACAGTCGTGGAGAAACCTATTTACATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATAAAGTTTCCAACCGGTTTATTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCCGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAAGTACACATCTTCCATTCACGTTTGGCTGCGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
(配列番号3)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTCGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACGCTATAACCGTGCCCCTTACACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC(配列番号4)
本発明の二重特異性抗体は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎を治療することが予想される。「患者」とは、TNFおよび/もしくはIL−17の減少したレベルまたはTNFおよび/もしくはIL−17の減少した生物活性から利益を受ける、疾患、障害、または病態を有する哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
二重特異性抗体は実質的に以下のように発現および精製され得る。配列番号3(配列番号1のアミノ酸配列を有する第1のポリペプチドをコードする)および配列番号4(配列番号2の軽鎖アミノ酸配列をコードする)のDNAを含有するグルタミン合成酵素(GS)発現ベクターは、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター細胞株、CHOK1SV(Lonza Biologics PLC、Slough、United Kingdom)をトランスフェクトするために使用される。発現ベクターは、SV早期(シミアンウイルス40E)プロモーターおよびGSについての遺伝子をコードする。GSの発現は、CHOK1SV細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞は50μMのL−メチオニンスルホキシミン(MSX)によるバルク選択を受ける。MSXによるGSの阻害は選択のストリンジェンシーを増加させるために利用される。発現ベクターcDNAを宿主細胞ゲノムの転写活性領域内に組み込んだ細胞は、GSの内因性レベルを発現する、CHOK1SV野生型細胞に対して選択される。トランスフェクトされたプールは、安定発現細胞のクローンに近い(close−to−clonal産物を可能にする低密度で播種される。マスターウェルは二重特異性抗体発現についてスクリーニングされ、次いで精製に使用するために無血清懸濁培地中でスケールアップされる。二重特異性抗体が分泌される無菌培地が、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)などの適合緩衝液で平衡化されるプロテインAアフィニティーカラムに適用される。カラムは非特異的結合成分を除去するために洗浄される。結合した二重特異性抗体は、例えば、pH勾配(0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.8から0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液 pH2.5など)によって溶出される。二重特異性抗体画分は、SDS−PAGEまたは分析的サイズ排除などによって検出され、次いでプールされる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去され得る。二重特異性抗体は、一般的な技術を使用して濃縮および/または濾過滅菌され得る。これらのクロマトグラフィー工程後の二重特異性抗体の純度は98%超である。二重特異性抗体は−70℃にて即座に凍結または数ヶ月間、4℃にて保存され得る。
TNFα
ヒトTNFαに対する二重特異性抗体の結合親和性は、ランニング緩衝液および試料希釈のためのPBS(Pierce)中のBlocker Caseinを使用して37℃にてSapidyne KinExA3000機器で溶解平衡結合アッセイを使用して測定する。ヒトTNFαは標準的なアミンカップリング化学によりNHSセファロースに固定される。試料は、20pMの一定濃度で二重特異性抗体を、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39および0(ブランク)pMの濃度のヒトTNFαと混合することによって調製する。試料は37℃にて18時間インキュベートして、分析前に平衡に到達させる。各分析サイクルは、(1)1mL/分にて367μLのビーズを注入することによってヒトTNFαビーズのカラムを充填すること、(2)0.5mL/分にてカラムに対して10mL(20分)の二重特異性抗体/ヒトTNFα複合体を注入すること、(3)0.25mL/分にて0.5mL(2分)の緩衝液を注入して、未結合の試料を洗い流すこと、(4)1mL(30秒)の500ng/mL DyLight−649ウサギ抗ヒトIgG検出抗体(Jackson ImmunoResearch)を注入すること、(5)1.5mL/分にて2.25mL(90秒)の緩衝液を注入して、未結合の検出抗体を洗い流すこと、および(6)1N NaOHの1mL(60秒)の注入、続いてバックフラッシュによりシステムを洗浄することからなる。データは、KinExA Proソフトウェア、バージョン2.0.1.14を使用した2つの反復実験のN曲線分析を使用して適合する。平衡解離定数(KD)は遊離二重特異性抗体のパーセントから算出する。本発明の二重特異性抗体は、4.4pM(0.6から16.3pMの95%信頼区間)のヒトTNFαに対するKDを示した。
ヒトIL−17に対する二重特異性抗体の結合親和性は、HBS−EP+(GE Healthcare、10mM Hepes pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05%界面活性剤P20)ランニング緩衝液で準備したBiacore T200機器で表面プラズモン共鳴アッセイおよび37℃に設定した分析温度を使用して測定する。全ての4つのフローセル(Fc)上で固定したプロテインA(標準的なNHS−EDCアミンカップリングを使用して生成した)を含有するCM4チップを、捕捉法を利用するために使用する。抗体試料はランニング緩衝液中での希釈によって4μg/mLにて調製する。ヒトIL−17は、ランニング緩衝液中での希釈によって80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25および0(ブランク)nMの最終濃度にて調製する。各分析サイクルは、(1)別のフローセル(Fc2、Fc3、およびFc4)上で抗体試料を捕捉すること、(2)100μL/分にて全てのフローセルに対して200μL(120秒)のヒトIL−17を注入すること、(3)解離相をモニタするために20分間、緩衝液の流れを戻すこと、(4)グリシン、pH2.0の10μL(20秒)の注入によりチップ面を再生することからなる。標準的な二重参照を使用してデータを処理し、Biacore T200評価ソフトウェア、バージョン1.0を使用して1:1結合モデルに適合して、会合速度(kon)および解離速度(koff)を求める。平衡解離定数(KD)は関係KD=koff/konから算出する。
Biacore T200機器を使用して、ヒトTNFαおよびヒトIL17が、二重特異性抗体に同時に結合できるかどうかを求める。全てのBiacore試薬および材料は、他に示さない限り、Biacoreから購入する。全ての測定は25℃で実施する。HBS−EP+緩衝液(150mM塩化ナトリウム、3mM EDTA、0.05%(w/v)界面活性剤P−20、および10mM Hepes、pH7.4)を、ランニング緩衝液および試料緩衝液として使用する。プロテインAを、アミンカップリングキットを使用してCM4センサチップのフローセル1および2上に固定する。3μg/mLに希釈した二重特異性抗体を、30μL/分にて35秒の注入によりフローセル2上で最初に捕捉して、165共鳴単位(RU)の捕捉した抗体を得る。この捕捉に続いて、緩衝液の35秒の注入を行う。次いで流量を100μL/分に増加させ、流れをフローセル1(Fc1)およびフローセル2(Fc2)に対して誘導する。TNFα結合を飽和させるために、50nMのヒトTNFαを2分間注入する。参照から差し引いたデータをFc2−Fc1として収集する。45RUの結合信号を観察する。ヒトTNFαの注入後、80nMのヒトIL−17をさらに2分間注入して、IL−17結合を飽和させる。再び、参照から差し引いたデータをFc2−Fc1として収集する。37RUのさらなる結合信号を観察する。次いで10mMグリシン、pH1.5を使用してチップ面を再生する。これらの結果により、本発明の二重特異性が、二重特異性抗体に結合する2つのリガンドからの共鳴単位の増加(最初にTNFαから45RU、次いでヒトIL−17からさらに37RU)によって示されるように、ヒトTNFαおよびヒトIL17に同時に結合できることが実証される。
HT−29細胞はIL−17受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌上皮細胞である。ヒトIL−17とのHT−29細胞のインキュベーションは、市販のELISAを使用して測定され得る、CXCL1の産生を生じる。
HT−29細胞はTNF受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌上皮細胞である。ヒトTNFαとのHT−29細胞のインキュベーションにより、市販のELISAを使用して測定され得る、CXCL1の産生が生じる。
上記のように、HT−29細胞はIL−17およびTNF受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌細胞である。ヒトTNFαおよびヒトIL−17とのHT−29細胞のインキュベーションにより、市販のELISAを使用して測定され得る、CXCL1の産生が生じる。
L929細胞はTNF受容体を天然に発現するマウス線維肉腫細胞である。ヒトTNFαとのL929細胞のインキュベーションは反応性酸素中間体の過剰形成に起因する迅速な細胞死を生じる。細胞死は、生存細胞におけるミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼがテトラゾリウム塩をホルマザン産物に還元し、蛍光プレートリーダーで検出できる、MTT細胞毒性アッセイを使用して測定され得る。
膜結合TNFαを阻害する二重特異性抗体の能力を研究するために、TNFαの既知の切断部位を、TNF切断の非存在下で、細胞表面上で生物活性TNFαの発現を可能にすることを以前に実証した変異のセット(Muellerら、1999)を使用して不活性化する。切断されていないTNFα構築物はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に安定にトランスフェクトする。これらの細胞はフローサイトメトリーによって示されるように膜結合TNFαを発現する。ヒト非切断膜結合TNFαを発現するCHO細胞とのL929細胞のインキュベーションにより、急速なL929細胞死が生じる。
ヒトIL−17またはTNFαの注射は、循環しているマウスCXCL1の急速および一時的な増加を導く。通常のC57BI/6Jマウス(n=7/群)を、以下を用いて皮下注射する(16.7nmol/kg):(a)二重特異性抗体、(b)陽性対照抗IL−17抗体(BAFF/IL−17二重特異性抗体)、(c)陽性対照抗TNFα抗体(IgG4アイソタイプでのアダリムマブ);または(d)陰性対照抗体(ヒトIgG4)。2日後、マウスにヒトIL−17(3μg/マウス)またはヒトTNFα(1μg/マウス)の単回の腹腔内注射を与える。サイトカインチャレンジの2時間後、マウスを屠殺し、市販のELISAを使用してCXCL1について血漿を分析する。
CD16a、CD32a、およびC1q
96ウェルマイクロプレートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中1μg/mLにて、100μL/ウェルの、C末端10−Hisタグ(R&D Systems)を有するCD32aまたはC末端6−Hisタグ(R&D Systems)を有する組換えヒトCD16aでコーティングする。96ウェルマイクロプレートを、PBS中2μg/mLにて100μL/ウェルのヒトC1q(MP Biologicals)でコーティングする。プレートを密封し、4℃にて一晩インキュベートする。コーティング試薬を各ウェルから取り除き、200μL/ウェルのカゼイン遮断試薬(Thermo)を加える。プレートを密封し、室温(RT)にて1時間インキュベートする。各ウェルを洗浄緩衝液(20mM Tris,0.15M NaCl、0.1% Tween−20、pH7.5)で2回洗浄する。全てカゼイン遮断試薬中で希釈した、本発明の二重特異性抗体、ヒトIgG1陽性対照、またはヒトIgG4陰性対照の連続希釈物を各ウェル(100μL/ウェル)に加え、RTにて2時間インキュベートする(抗体は2倍連続希釈で6.25〜200μg/mLの濃度範囲で試験する)。試験は二連のウェルで実施する。次いでプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後、カゼイン遮断試薬中の100μL/ウェルの1:12,500希釈のHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG、F(ab’)2(Jackson ImmunoResearchカタログ109−036−097)を加え、RTにて1時間インキュベートする。このポリクローナル抗体はヒトIgG1およびIgG4の両方を認識する(データは示さず)。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、TMB基質(Pierce、100μL/ウェル)を加える。インキュベーション時間は、CD16aについて4.5分、CD32aについて9分、およびC1qについて30分、全て暗所およびRTである。最後に、100μLの1.0NのHClを各ウェルに加える。450nmに設定した比色分析マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を即座に測定する。
96ウェルマイクロプレートを、PBS中1μg/mLにて100μL/ウェルの、C末端6−Hisタグ(R&D Systems)を有するCD64でコーティングする。プレートを密封し、4℃にて一晩インキュベートする。コーティング試薬を各ウェルから取り除き、200μL/ウェルのカゼイン遮断試薬を加える。プレートを密封し、RTにて1時間インキュベートする。各ウェルを洗浄緩衝液で2回洗浄する。全てカゼイン遮断試薬中で希釈した、本発明の二重特異性抗体、ヒトIgG1陽性対照、またはヒトIgG4陰性対照の連続希釈物を各ウェル(100μL/ウェル)に加え、RTにて1時間インキュベートする(抗体は4倍連続希釈で0.001〜300μg/mLの濃度で試験する)。試験は二連のウェルで実施する。次いでプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後、カゼイン遮断試薬中の100μL/ウェルの1:12,500希釈のHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG、F(ab’)2を加え、RTにて1時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、100μL/ウェルのTMB基質を加え、暗所中でRTにて4.5分間、インキュベートし、そのときに100μLの1.0NのHClを各ウェルに加える。450nmに設定した比色分析マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を即座に測定する。
関節リウマチ(RA−FLS)を有する患者由来のヒト線維芽細胞様滑膜細胞との活性化ヒトCD4T細胞のインキュベーションにより、MMP−1、MMP−3、IL−8およびG−CSFなどの炎症性メディエータが産生され、軟骨および骨が破壊される。本発明の二重特異性抗体(二重特異性)(30nM(MWまたは200kDaに基づく))または対照抗体(Ab)を、50μLのCD4 T細胞(1:1のビーズ/細胞比のCD3/CD28 Dynabeadsで活性化した50,000個のT細胞)を含有するウェルに50μLで加える。Abを有するまたは有さない100μLの活性化したCD4 T細胞を次いで、前の晩に100μL中に播種したRA−FLS上に加える。試験を処理ごとに8〜9回の反復ウェルにおいて実施する。ヒトIgG4アイソタイプを陰性対照として使用する。IL−17中和AbおよびTNF中和Abをアッセイにおける陽性対照として使用する。対照Abを二重特異性抗体と同じモル濃度で試験した。
ヒトTNFのトランスジェニック発現により、マウスにおいて自然発生の進行性炎症性関節炎が引き起こされる(Hayward M.D.ら、BMC Physiology.Dec 10;7:13(2007))。これらのマウスにおけるアデノ随伴ウイルス(AAV)によるヒトIL−17のさらなる発現は、自然発生の進行性多発性関節炎をさらに悪化させる。オスのヒトTNF−トランスジェニックマウス((B6.Cg(SJL)−Tg(TNF)N21、Taconic Farms、Georgetown、NY、モデル1006)は、全ての組織においてヒトTNFαの低い構成的発現を生じるプロモーターおよび安定化3’UTRを含む全ヒトTNFα遺伝子を保有する。動物を食物および水に自由にアクセスさせた状態で1ケージにつき2匹収容する。標準化したスコア付けシステムを使用して、前足および後足においてそれらの関節炎疾患をスコア付けする(前足:0=変形または腫れの証拠なし、1=足関節の軽度の腫れ、2=中度の腫れまたは軽度の変形、3=重度の腫れまたは重度の変形、4=重度の腫れおよび重度の変形。後足:0=変形または腫れの証拠なし、1=軽度の変形/足指を真っ直ぐ伸ばすことができない、2=中度の変形/足指を伸ばすことができない、3=重度中間の変形/軽度の腫れ、4=顕著な腫れを有する重度中間の変形)。8週齢のマウスに、ヒトIL−17(n=32)についての遺伝子または無関係の遺伝子(lacz、n=8)を保有するアデノ随伴ウイルス(AAV)の1×1010ゲノムコピーを静脈注射する(尾静脈を介して100uL/マウス)。ヒトIL−17のウイルス発現を、製造業者の指示書に従って市販のELISAキット(Meso Scale Discovery、Rockville、MD)を使用して尾の断片から得たマウス血漿中で検出する。平均血漿レベルは約500pg/mlのヒトIL−17である。12週齢にて、マウスを、それらの臨床関節炎スコア、ヒトIL−17血漿レベル、および体重に基づいて研究群にランダム化する。異なる抗体による処置をグループ分けの日に開始する。動物に、9週間にわたって毎週、本発明の二重特異性抗体(二重特異性)またはTNF中和抗体(TNF Ab)またはアイソタイプ対照抗体(Neg Ctrl Ab)(20nmol/kg)の2つの異なる用量(20および3.3nmol/kg)を皮下投与する。臨床関節炎スコアは通常のように盲目様式で決定する。終了時に血漿を心穿刺によって得、後肢を10%ホルマリンに固定する。後肢をEDTA中で脱塩し、トリムし、通常のように処理し、パラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。関節炎スコア付けを以下の分類について行う:0〜5のスケールで炎症、骨吸収、軟骨損傷、およびパンヌス形成:20の潜在的合計について0=正常、1=最小、2=軽度、3=中度、4=顕著、5=重度。
乾癬のヒト化マウスモデルは、免疫不全マウスの背中の皮膚に対する乾癬患者由来のヒト非病変皮膚生検の移植に関与するモデルである。ヒト皮膚を移植した後(3〜4週後)、同じドナー由来のT細胞活性化ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を移植片内に皮内注射して、乾癬様表皮肥厚を誘導する(Wrone−SmithおよびNickoloff J.、Clin Invest.15;98(8):1878−87(1996))。
二重特異性抗体を10mMクエン酸塩+150mM NaCl、pH6中で製剤化する。Amicon Ultra−4 30,000MWCO濃縮器(Millipore)を使用して100mg/mLにて二重特異性抗体を濃縮する。Tween−80を0.02%(v/v)の最終濃度まで加える。濃縮した試料を4週間にわたって25℃にて保存する。1週間後、および4週間後、ゼロ時点にてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて高分子量のパーセント(%HMW)について試料を解析する。TSK G3000SW−XL(Tosoh Bioscience)カラムを使用したAgilent1100システムでSECを実施する。50mMリン酸ナトリウム+0.35M NaCl、pH7.0を、35分間、0.5mL/分で流す移動相として使用する。1uLの体積の濃縮した二重特異性抗体をカラムに注入し、280nmにてモニタする。ChemStationを使用してクロマトグラムを解析し、モノマーピークの前に溶出したピークのAUC対全AUCの比を使用して%HMWを算出する。異なる時点にて25℃に保存した試料を%HMWについて解析する。ゼロ時点にて、%HMWは1.52であり;1週間にて、%HMWは2.01であり;4週間にて、%HMWは2.37であった。
HC−ScFv:配列番号1
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTDYHIHWVRQAPGQCLEWMGVINPTYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGETYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGCGTKLEIK
LC:配列番号2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HC−ScFv:配列番号3
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LC:配列番号4
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTCGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACGCTATAACCGTGCCCCTTACACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
[1]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、前記第1のポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を有し、前記第2のポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体。
[2]
2つの第1のポリペプチドおよび2つの第2のポリペプチドを含む、請求項1に記載の二重特異性抗体。
[3]
配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、DNA分子。
[4]
配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、DNA分子。
[5]
配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、DNA分子。
[6]
請求項3に記載のDNA分子および請求項4に記載のDNA分子を含む、哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号1のアミノ酸配列を有する第1のポリペプチドおよび配列番号2のアミノ酸配列を有する第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
[7]
前記二重特異性抗体が発現するような条件下で請求項6に記載の哺乳動物細胞を培養する工程、および発現した二重特異性抗体を回収する工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法。
[8]
請求項7に記載の方法によって産生された二重特異性抗体。
[9]
治療有効量の請求項2または8に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎を治療する方法。
[10]
療法に使用するための請求項2または8に記載の二重特異性抗体。
[11]
関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための請求項2または8に記載の二重特異性抗体。
[12]
請求項2または8に記載の二重特異性抗体と、1種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
Claims (9)
- 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む抗TNF抗IL−17二重特異性抗体であって、前記第1のポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を有し、前記第2のポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体。
- 2つの第1のポリペプチドおよび2つの第2のポリペプチドを含む、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、DNA分子。
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むDNA分子および配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むDNA分子を含む、哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号1のアミノ酸配列を有する第1のポリペプチドおよび配列番号2のアミノ酸配列を有する第2のポリペプチドを含む抗TNF抗IL−17二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
- 前記二重特異性抗体が発現するような条件下で請求項4に記載の哺乳動物細胞を培養する工程、および発現した二重特異性抗体を回収する工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法。
- 療法に使用するための請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。
- 関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1又は2に記載の二重特異性抗体と、1種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎の治療に使用するための、請求項8に記載の医薬組成物。
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