ES2654681T3

ES2654681T3 - Anticuerpos biespecíficos anti-TNF-anti-IL-17

Info

Publication number: ES2654681T3
Application number: ES14711895.4T
Authority: ES
Inventors: Barrett Allan; Andrew Lawrence Glasebrook; Donmienne Doen Mun Leung; Jirong Lu; Ying Tang; Andrew Charles VENDEL; Derrick Ryan Witcher; Pia Pauliina Yachi
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2018-02-14
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: AR094872A1; US9416182B2; BR112015018203A2; CA2896888C; CN105283467B; JP6152433B2; US20140255406A1; MX2015011957A; ZA201506568B; KR20150113199A; EP2964674B1; CN105283467A; AU2014226093A1; JP2016510743A; WO2014137961A1; EP2964674A1; TW201444867A; CA2896888A1; AP2015008709A0; EA201591478A1

Abstract

Un anticuerpo biespecífico anti-TNFα-anti-IL-17 que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

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como CDRL1-1, CDRL1-2, y CDRL1-3, y se hace referencia las 3 CDR de LCVR2 como CDRL2-1, CDRL2-2, y CDRL2-3.

La CH se fusiona a la HCVR2 por un engarce aminoacídico (L1). La HCVR2 está fusionada a la LCVR2 por un engarce aminoacídico (L2).

5 La presente invención también engloba diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos en los que las regiones HCVR2 y LCVR2 se expresan en una cadena polipeptídica única pero en vez de que los dominios variables se emparejen con los dominios complementarios de la misma cadena, los dominios variables se emparejan con dominios complementarios de la otra cadena, Por ejemplo, si el anticuerpo biespecífico comprende dos primeros polipéptidos (por conveniencia, 1A y 1B) y los dos segundo polipéptidos (por conveniencia 2A y 2B), la HCVR2 del 10 polipéptido 1A se empareja con dominios complementarios de la LCVR2 del polipéptido 1B en vez de emparejarse con la LCVR2 del polipéptido 1A, y viceversa. Los diacuerpos biespecíficos como se describen en el presente documento mantienen la afinidad de unión y capacidad de neutralización para el TNFα humano e IL-17 humana.

De manera alternativa puede ser beneficioso purifica los diacuerpos de los anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente. El contenido en diacuerpos puede ser hasta del 17 % después de la expresión celular y se puede

15 reducir a menos del 1 % después de la purificación.

La relación de las distintas regiones y engarces es la siguiente, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxilo, de acuerdo con la convención de numeración de Kabat:

Polipéptido 1 -SEQ ID NO: 1: Polipéptido 2 -SEQ ID NO: 2

HCVR1 TNF: Región Posiciones LCVR1 TNF Región Posiciones

FRH1-1: 1-25 FRL1-1 1-23

CDRH1-1: 26-35 CDRL1-1 24-34

FRH1-2: 36-49 FRL1-2 35-49

CDRH1-2: 50-66 CDRL1-2 50-56

FRH1-3: 67-98 FRL1-3 57-88

CDRH1-3: 99-110 CDRL1-3 89-97

FRH1-4: 111-121 FRL1-4 98-107

Constante: CH 122-447 Constante CL 108-214

Engarce: L1 448-461

HCVR2 IL-17: FRH2-1 462-486

CDRH2-1: 487-496

FRH2-2: 497-510

CDRH2-2: 511-527

FRH2-3: 528-559

CDRH2-3: 560-569

FRH2-4: 570-580

Engarce: L2 581-600

LCVR2 IL-17: FRL2-1 601-623

CDRL2-1: 624-639

FRL2-2: 640-654

CDRL2-2: 655-661

FRL2-3: 662-693

CDRL2-3: 694-702

FRL2-4: 703-712

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Una secuencia de polinucleótido de ADN particular que codifica el segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 es:

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5 El medio, en el que se secreta el anticuerpo biespecífico, se puede purificar por técnicas convencionales. Por ejemplo, el medio se puede aplicar y eluir de una columna de Proteína A o G utilizando procedimientos convencionales. Los agregados solubles y multímeros se pueden retirar eficazmente por técnicas comunes, incluyendo la cromatografía de exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, o de hidroxiapatita. El producto se puede congelar inmediatamente por ejemplo a -70 C, o se puede liofilizar.

10 Puede que sea necesario reducir el nivel de diacuerpo presente en el medio. Por ejemplo, el medio que contiene el diacuerpo se puede aplicar y eluir de una resina de intercambio catiónico fuerte. Por ejemplo, se utilizan resinas de intercambio catiónico fuerte SP-Sepharose HP para purificar el anticuerpo biespecífico plegado correctamente del diacuerpo. El pH del medio que contiene el diacuerpo se ajusta a un pH de 8,1 utilizando 20 mM de Bicina. El medio se carga en una columna SP-Sepharose SP, se lava con 2 volúmenes de columna de 20 mM de Bicina (pH 8,1), y

15 se eluye con 2 mM de Bicina y 100 mM de NaCl (pH 8,1) sobre 20 volúmenes de columna (10-90 mM de NaCl). Los agrupamientos recolectados se pueden evaluar por el alto peso molecular frente al pico principal. Un resultado típico es una mejora de aproximadamente el 17 % de diacuerpo a menos del 1 % de diacuerpo con una recuperación de aproximadamente un 68 %.

Opcionalmente, el diacuerpo se puede purificar de acuerdo con el siguiente procedimiento no limitante: El medio

20 clarificad en el que se habían secretado el anticuerpo biespecífico y el diacuerpo se puede aplicar a una columna de afinidad de Proteína A que se había equilibrado con un tampón compatible, tal como solución salina tampón fosfato (pH 7,4). La columna se puede lavar para retirar los componentes de unión no específica. La unión del anticuerpo biespecífico y el diacuerpo se puede eluir, por ejemplo, por un gradiente de pH (tal como 0,1 M de tampón de fosfato sódico pH 6,8 a tampón de citrato sódico 0,1 M pH 2,5). Las fracciones de diacuerpo biespecífico se pueden detectar

25 por digestión con lisil endopeptidasa limitada (LysC) que corta entre la región Fc y la región ScFv/diacuerpo, seguido por análisis cuantitativo por HLPC de fase inversa. En resumen, se pueden digerir 15 µg de muestra durante aproximadamente 20 horas a 37 C con 0,2 µg de LysC (Wako, P/N 125-05061) en 20 mM de Tris pH 8,0 + 0,1 mg/ml de yodoacetamida en un volumen total de 50 µl. Las muestras se pueden analizar inyectando 20 µl (6 µg) en una columna de fase inversa PLRP-S 50 x 2,1 mm (Varian P/N PL1912-1802). El caudal puede ser de 0,6 ml/min, la

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además que para un sujeto en particular, se deberían ajustar regímenes de dosificación específicos en el tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, particularmente las que se asocian con inflamación, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriásica, y espondilitis anquilosante. Normalmente, el anticuerpo biespecífico se administra sistémicamente, aunque parara ciertos trastornos, puede ser beneficiosa la administración local del anticuerpo biespecífico en el sitio de la inflamación.

La presente invención se ilustra adicionalmente por el siguiente ejemplo no limitante.

Ejemplo

Expresión y purificación del anticuerpo biespecífico

El anticuerpo biespecífico se puede expresar y purificar esencialmente de la siguiente manera. Se utiliza un vector de expresión de glutamina sintetasa (GS) que contiene el ADN de SEQ ID NO: 3 (que codifica el primer polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1) y SEQ ID NO: 4 (que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 2) para transfectar la línea celular de hámster chino, CHOK1SV (Lonza Biologics PLC, Slough, Reino Unido) por electroporación. El vector de expresión codifica un promotor temprano SV (de Virus de Simio 40E) y el gen de la GS. La expresión de GS permite la síntesis bioquímica de glutamina, un aminoácido necesario para las células CHOK1SV. Tas la transfección, las células se someten a una selección grosera con 50 mM de L-metionina sulfoximina (MSX). Se utiliza la inhibición de la GS por MSX para aumentar la rigurosidad de la selección. Las células con la integración del ADNc del vector de expresión en regiones transcripcionalmente activas del genoma de la célula huésped se seleccionan frente a las células CHO1SV de tipo silvestre, que expresan un nivel endógeno de GS. Los agrupamientos transfectados se colocan en placas a baja densidad para permitir el crecimiento casi clónico de células con expresión estable. Los pocillos maestros se exploran en cuanto a la expresión de anticuerpos biespecíficos y entonces se aumentan de escala en cultivos en suspensión libres de suero que se van a utilizar para la producción. El medio clarificado, en el que se va a secretar el anticuerpo biespecífico, se aplica en una columna de afinidad de Proteína A que se había equilibrado con un tampón compatible, tal como una solución salina tampón de fosfato (pH 4,7). La columna se lava para retirar los componentes de unión no específica. El anticuerpo biespecífico unido se eluye, por ejemplo, mediante un gradiente de pH (tal como 0,1 M de tampón de fosfato sódico pH 6,8 a 0,1 M de tampón de citrato sódico pH 2,5). Se detectan las fracciones de anticuerpos biespecíficos, tal como mediante SDS-PAGE o exclusión por tamaño analítica, y entonces se agrupan. El agregado soluble y los multímeros se pueden retirar eficazmente mediante técnicas comunes, incluyendo la cromatografía de exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, o de hidroxiapatita. El anticuerpo biespecífico se puede concentrar y/o esterilizar por filtrado utilizando técnicas comunes. La pureza del anticuerpo biespecífico después de estas etapas cromatográficas es mayor del 98 %. El anticuerpo biespecífico se puede congelar inmediatamente a -70 C o almacenarse a 4 C durante varios meses.

Afinidad de unión por TNFα e IL-17

TNFα

La afinidad de unión del anticuerpo biespecífico para el TNFα humano se determina utilizando un ensayo de unión de equilibrio en solución en un instrumento Sapidyne KinExA 3000 a 37 C utilizando el Bloqueador Caseína en PBS (Pierce) para procesar el tampón y el diluyente de muestra. El TNFα humano se inmoviliza en NHS Sepharose mediante un acoplamiento químico amina convencional. Las muestras se preparan mezclando el anticuerpo biespecífico en una concentración fija de 20 pM con TNFα humano a concentraciones de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,78, 0,39, y 0 (blanco) pM. Las muestras se incuban durante 18 horas a 37 C para alcanzar el equilibrio antes del análisis. Cada ciclo de análisis consiste en (1) empaquetar una columna de perlas de TNFα humano inyectando 367 µl de perlas a 1 ml/min, (2) inyectar 10 ml (20 minutos) de complejo anticuerpo biespecífico/TNFα humano sobre la columna a 0,5 ml/min, (3) inyectar 0,5 ml (2 minutos) de tampón a 0,25 ml/min para la var la muestra no unida, (4) inyectar 1 ml (30 s) de 500 mg/ml de anticuerpo de detección de conejo anti-IgG humana CyLight-649 (Jackson ImmunoResearch), (5) inyectar 2,25 ml (90 s) de tampón a 1,5 ml/min para lavar el anticuerpo de detección no unido, y (6) limpiar el sistema con 2 ml (60 s) de inyección de NaOH 1 N seguido por una toma retroactiva. Los datos se ajustan utilizando una curva N de análisis de dos experimentos repetidos utilizando el Software KinExA Pro, versión 2.0.1.14. La constante de disociación (KD) se calcula a partir del porcentaje libre de anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico de la presente invención presentaba un KD para el TNFα humano de 4,4 pM (95 % de intervalo de confianza de 0,6 a 16,3 pM).

IL-17

La afinidad de unión del anticuerpo biespecífico para la IL-17 human se determina utilizando un ensayo de resonancia de plasmones superficiales en un instrumento Biacore T200 preparado con tampón de procesamiento HBS-EP+ (GE Healthcare, 10 mM Hepes pH 7,4 + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0,05 % tensioactivo P20) y la temperatura de análisis fijada a 37 C. Se utiliza un chip CM4 que contiene inmovilizada la proteína A (generada

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utilizando un acoplamiento de amina NHS-EDC convencional) en las cuatro celdas de flujo (Fc) para emplear una metodología de captura. Las muestras de anticuerpo se preparan a 4 mg/ml por dilución en el tampón de procesamiento. La IL-17 humana se preparar a concentraciones finales de 80,0, 40,0, 20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, y 0 (blanco) nM por dilución en el tampón de procesamiento. Cada ciclo de análisis consiste en (1) captura de las muestras de anticuerpo en las celdas de flujo separadas (Fc2, Fc3, y Fc4), (2) inyectar 200 µl (120 s) de IL-17 humana sobre todas las celdas de flujo a 100 µl/min, (3) reinvertir el flujo de tampón durante 20 min para controlar la fase de disociación, (4) generación de las superficies del chip con una inyección de 10 µl (20 s) de glicina, pH 2,0. Los datos se procesan utilizando una referencia doble convencional y se ajusta a un modelo de unión 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore T200, versión 1.0, para determinar la tasa de asociación (kon) y tasa de disociación (koff). La constante de equilibrio de disociación (KD) se calcula de la relación KD = koff/ kon.

Tabla 1: Afinidad de unión para IL-17 humana por el anticuerpo biespecífico

Antígeno: kon (M-1s-1) koff(As-1) KD (pM)

IL-17A Humana: 5,02 ± 0,22 x 106 4,44 ± 0,14 x 10-5 8,9 ± 0,1

IL-17A/F Humana: 2,35 ± 0,00 x 106 5,71 ± 4,95 x 10-5 42,3 ± 21,1

Estos resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención puede unirse por separado al TNFα humano y la IL-17 humana.

Unión simultánea al TNFα humano y la IL-17 humana

Se utiliza un instrumento Biacore T200 para determinar si el TNFα humano y la IL-17 humana se pueden unir al anticuerpo biespecífico simultáneamente. Todos los reactivos y materiales Biacore se adquirieron en Biacore a menos de que se señale otra cosa. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 C. Se utilizó tampón HBS-EP+ (150 mM de cloruro sódico, 3 mM EDTA, 0,05 % (p/v) tensioactivo P-20, y 10 mM de Hepes, pH 7,4) como tampón de procesamiento y tampón de muestras. La proteína A se inmovilizó en las celdas de flujo 1 y 2 de un chip sensor CM4 utilizando un kit de acoplamiento de amina. El anticuerpo biespecífico diluido a 3 µg/ml se captura primero en la celda de flujo 2 con una inyección de 35 segundos a 30 µl min que da lugar a 165 unidades de resonancia (RU) de anticuerpo capturado. Esta captura se continúa con una inyección de 35 segundos de tampón. El caudal se aumenta entonces a 100 µl/min y el flujo se dirige sobre la celda de flujo 1 (Fc1) y la celda de flujo 2 (Fc2). Para saturar la unión a TNFα, se inyectan 50 nM de TNFα humano durante 2 minutos. Los datos sustraídos de referencia se recolectan como Fc2-Fc1. Se observó una señal de unión de 45 RU. Después de la inyección de TNFα humano, se inyectaron 80 nM de IL-17 humana durante 2 minutos adicionales para saturar la unión a IL-17. De nuevo, los datos sustraídos de referencia se recolectaban como Fc2-Fc1. Se observó una señal de unión adicional de 37 RU. La superficie del chip se regenera entonces utilizando 10 mM de glicina, pH 1,5. Estos resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención se puede unir al TNFα humano y la IL-17 humana simultáneamente, como se demuestra por el aumento de unidades de resonancia (inicialmente 45 RU para el TNFα, después 37 RU adicionales de la IL-17 humana) por la unión de los dos ligandos al anticuerpo biespecífico.

Inhibición de la producción de CXCL1 inducida

Las células HT-29 son células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano que expresan naturalmente el receptor IL-17. La incubación de las células HT-29 con IL-17 humana da como resultado la producción de CXCL1, que se puede medir utilizando una ELISA disponible en el mercado.

Un intervalo de dosis del anticuerpo biespecífico desde 20 pM a 10 nM se evaluó (el PM del anticuerpo biespecífico es de 200 kDa). Cada concentración de ensayo de anticuerpo biespecífico se añade (50 µl) a los pocillos que contenían 50 µl de 2 nM (concentración final) de IL-17 recombinante. El ensayo se llevó a cabo en pocillos duplicados por tratamiento. El medio de ensayo se utilizó para los controles de “medio solo” e “IL-17 sola”. Se utilizó un anticuerpo neutralizante de IL-17 (Patente de EE. UU. Nº 7.838.638) como control positivo en el ensayo. Los anticuerpos de control se ensayaron en el mismo intervalo molar que el anticuerpo biespecífico. Las placas que contenían IL-17 y las mezclas de anticuerpo se incubaron durante 60 a 90 minutos (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular.

Las células HT-29 se cultivaron de manera rutinaria en medio de ensayo (5A de McCoy que contenía un 10 % de FBS, penicilina G (0,2 U/ml) y estreptomicina (0,2 mg/ml)). Las células se recolectaron un día antes del día del ensayo. Las células se aclararon con 1x de PBS y se despegaron de los matraces de cultivo con el tampón de disociación, libre de enzimas, PBS. Se añadió medio de ensayo completo a las células despegadas. Las células se centrifugaron entonces a 310 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El aglomerado celular se re-suspendió en medio de ensayo. Se midió la densidad celular con un Countess de Invitrogen, y se añadieron 20.000 células HT29 (en 100 µl) a cada uno de las placas de 96 pocillos. Las placas de 96 pocillos se colocaron en una incubadora de cultivo tisular (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante una noche. Las mezclas de anticuerpo/IL-17 (100 µl) se añadieron a las células HT-29 y se incubaron (a 37 C, con un 95 % de humedad

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relativa y un 5 % de CO2) durante 24-48 horas.

Al final del ensayo, las placas se centrifugaron (a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), y el medio de cultivo celular se transfirió a placas de polipropileno de 96 pocillos, que se sellaron y congelaron a -80 C. El día de la medición de CXCL1 por ELISA, las placas se descongelaron a temperatura ambiente. Los niveles de CXCL1 en el medio se midieron con un ELISA sándwich CXCL1 (R&D Systems DuoSet nº DY275), según las instrucciones del fabricante. Al final de las reacciones ELISA, se leyeron las pacas a 450 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices VersaMax Tunable). Los resultados se expresan como la concentración en la que se inhibía el 50 % de la respuesta inducida por IL-17 (CI50) del anticuerpo biespecífico o el control positivo se calcula utilizando un ajuste sigmoideo de 4 parámetros de los datos (GraphPad Prism).

Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibía la secreción de CXCL1 inducida por IL-17 por las células HT-29 de una manera dependiente de la concentración. La inhibición era comparable a la que se observa con el anticuerpo de control positivo [con una CI50 para el anticuerpo biespecífico de 0,628 ± 0,072 nM frente a 0,614 ± 0,099 nM para el anticuerpo de control positivo (media de 3 experimentos independientes ± SEM)], mientras que el anticuerpo de control negativo no inhibía la producción de CXCL1. El anticuerpo biespecífico de la presente invención neutralizaba eficazmente la IL-17.

Inhibición de la producción de CXCL1 inducida por TNF in vitro a partir de células HT-29

Las células HT-29 son células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano que expresan naturalmente el receptor TNF. La incubación de las células HT-29 con TNFα humano da como resultado la producción de CXCL1, que se puede medir utilizando una ELISA disponible en el mercado.

Un intervalo de dosis del anticuerpo biespecífico desde 0,5 pM a 10 nM se evaluó (el PM del anticuerpo biespecífico es de 200 kDa). Cada concentración de ensayo de anticuerpo biespecífico se añade (50 µl) a los pocillos que contenían 50 µl de 30 pM (concentración final) de TNFα recombinante. El ensayo se llevó a cabo en pocillos duplicados por tratamiento. El medio de ensayo se utilizó para los controles de “medio solo” y “TNFα solo”. Se utilizó un anticuerpo neutralizante de TNF (adalimumab) como control positivo en el ensayo. Los anticuerpos de control se ensayaron en el mismo intervalo molar que el anticuerpo biespecífico. Las placas que contenían TNFα y las mezclas de anticuerpo se incubaron durante 60 a 90 minutos (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular.

Las células HT-29 se cultivaron de manera rutinaria en medio de ensayo (5A de McCoy que contenía un 10 % de FBS, penicilina G (0,2 U/ml) y estreptomicina (0,2 mg/ml)). Las células se recolectaron un día antes del día del ensayo. Las células se aclararon con 1x de PBS y se despegaron de los matraces de cultivo con el tampón de disociación, libre de enzimas, PBS. Se añadió medio de ensayo completo a las células despegadas. Las células se centrifugaron entonces a 310 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El aglomerado celular se re-suspendió en medio de ensayo. Se midió la densidad celular con un Countess de Invitrogen, y se añadieron 20.000 células HT29 (en 100 µl) a cada uno de las placas de 96 pocillos. Las placas de 96 pocillos se colocaron en una incubadora de cultivo tisular (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante una noche. Las mezclas de anticuerpo/ TNFα se añadieron a las células HT-29 y se incubaron (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante 24 horas.

Al final del ensayo, las placas se centrifugaron (a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), y el medio de cultivo celular se transfirió a placas de polipropileno de 96 pocillos, que se sellaron y congelaron a -80 C. El día de la medición de CXCL1 por ELISA, las placas se descongelaron a temperatura ambiente. Los niveles de CXCL1 en el medio se midieron con un ELISA sándwich CXCL1 (R&D Systems DuoSet nº DY275), según las instrucciones del fabricante. Al final de las reacciones ELISA, se leyeron las pacas a 450 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices VersaMax Tunable). Los resultados se expresan como la concentración en la que se inhibía el 50 % de la respuesta inducida por TNF (CI50) del anticuerpo biespecífico o el control positivo se calcular utilizando un ajuste sigmoideo de 4 parámetros de los datos (GraphPad Prism).

Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibía la secreción de CXCL1 inducida por TNFα por las células HT-29 de una manera dependiente de la concentración. La inhibición era comparable a la que se observa con el anticuerpo de control positivo [con una CI50 para el anticuerpo biespecífico de 18,8 ± 1 pM frente a 14,0 ± 1 pM para el anticuerpo de control positivo (media de 3 experimentos independientes ± SEM)], mientras que el anticuerpo de control negativo no inhibía la producción de CXCL1. El anticuerpo biespecífico de la presente invención neutralizaba eficazmente la TNFα.

Inhibición de la producción de CXCL1 por las células HT-29 inducida por la combinación de IL-17 y TNF

Como se ha descrito anteriormente, las células HT-29 son células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano que expresan naturalmente los receptores de IL-17 y TNF. La incubación de las células HT-29 con TNFα humano e IL-17 humana da como resultado la producción de CXCL1, que se puede medir utilizando una ELISA disponible en el mercado.

Los anticuerpos se ensayaron a una dosis fija de 4 nM (el PM del anticuerpo biespecífico es de 200 kDa). Se añadió

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entonces el anticuerpo biespecífico (50 µl) a los pocillos que contenían 50 µl de 3 pM de TNFα recombinante y 50 µl de 100 pM de IL-17 recombinante. El ensayo se llevó a cabo en cinco pocillos duplicados por tratamiento. El medio de ensayo se utilizó para los controles de “medio solo” e “IL-17+TNF solos”. Se utilizaron un anticuerpo neutralizante de IL-17 (Patente de EE. UU. Nº 7.838.638); anticuerpo anti-TNFα (adalimumab); y una combinación de anticuerpo anti-IL-17/anticuerpo anti-TNF como controles positivo en el ensayo. Los anticuerpos de control se ensayaron en el mismo intervalo molar que el anticuerpo biespecífico. Las placas que contenían TNF+IL-17 y las mezclas de anticuerpo se incubaron durante 60 a 90 minutos (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular.

Las células HT-29 se cultivaron de manera rutinaria en medio de ensayo (5A de McCoy que contenía un 10 % de FBS, penicilina G (0,2 U/ml) y estreptomicina (0,2 mg/ml)). Las células se recolectaron un día antes del día del ensayo. Las células se aclararon con 1x de PBS y se despegaron de los matraces de cultivo con el tampón de disociación, libre de enzimas, PBS. Se añadió medio de ensayo completo a las células despegadas. Las células se centrifugaron entonces a 310 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El aglomerado celular se re-suspendió en medio de ensayo. Se midió la densidad celular con un Countess de Invitrogen, y se añadieron 20.000 células HT29 (en 100 µl) a cada uno de las placas de 96 pocillos. Las placas de 96 pocillos se colocaron en una incubadora de cultivo tisular (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante una noche. Las mezclas de anticuerpo biespecífico/IL-17/TNF se añadieron a las células HT-29 y se incubaron (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante 24-48 horas.

Al final del ensayo, las placas se centrifugaron (a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente), y el medio de cultivo celular se transfirió a placas de polipropileno de 96 pocillos, que se sellaron y congelaron a -80 C. El día de la medición de CXCL1 por ELISA, las placas se descongelaron a temperatura ambiente. Los niveles de CXCL1 en el medio se midieron con un ELISA sándwich CXCL1 (R&D Systems DuoSet nº DY275), según las instrucciones del fabricante. Al final de las reacciones ELISA, se leyeron las pacas a 450 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices VersaMax Tunable). Los resultados se expresan como el porcentaje de CXCL1 humano (siendo con TNF + IL-17 solos el 100 %) mantenidos tras la incubación con distintos anticuerpo: anticuerpo biespecífico 0,85 +/-0,12 %; anti-TNFα 8,97+/-2,65 %; anti-IL-17 27+/-2,07 %; anti-TNFα + anti-IL-17 0,59+/-1,23 %. Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibía la secreción de CXCL1 inducida por TNFα e IL-17 simultáneamente por las células HT-29 mejor que los agentes únicos solos.

Inhibición de citotoxicidad inducida por el TNFα soluble en células L292 in vitro

Las células L929 son células de fibrosarcoma de ratón que expresan naturalmente el receptor de TNF. La incubación de las células L929 con TNFα humano da como resultado la muerte celular rápida debido a la formación excesiva de intermediaros reactivos con oxígeno. La muerte celular se puede medir utilizando un ensayo de citotoxicidad MTT, en el que la succinato deshidrogenasa mitocondrial en células viables reduce la sal de tetrazolio en un producto formazan, que se puede detectar en un lector de fluorescencia de placas.

Se evaluó un intervalo de dosis del anticuerpo biespecífico de 20 nM a 10 pM (el PM del anticuerpo biespecífico es de 200 kDa). Se añadió cada concentración de ensayo del anticuerpo biespecífico (100 µl), 200 pg/ml de TNFα humano recombinante (100 µl), y 6,25 µl/ml de Actinomicina D (100 µl) a los pocillos que contenían las células L929. El ensayo se llevó a cabo en pocillos duplicados por tratamiento. Se utilizó un anticuerpo neutralizante de TNFα (adalimumab con el isotipo IgG4) como control positivo en el ensayo. Las placas que contenían las mezclas de anticuerpos se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Las células L929 se cultivaron de manera rutinaria en un medio de ensayo (1x DMEM Cellgro, un 10 % de FBS, un 1 % de Pen-Estrep, un 1 % de aminoácidos esenciales MEM, un 1 % de L-glutamina, un 1 % de piruvato sódico). El día del ensayo, las células se aclararon con un 1x de PBS (sin Ca++ ni Mg++) y se despegaron de los matraces de cultivo con un 0,25 % de tripsina + EDTA. La tripsina se inactivó con medio de ensayo. Las células L929 se centrifugaron a 215 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El aglomerado celular se res-suspendió en medio de ensayo. La densidad celular se midió con un hemocitómetro, y se añadieron 10.000 células L929 (en 100 µl) a las placas de 96 pocillos y se colocaron en una incubadora de cultivo tisular (a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2) durante una noche. La mezcla de anticuerpo/ TNFα/actinomicina-D se transfiere a las placas de 96 pocillos con células L929 adherentes y se incubó durante 18 h a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2. El medio de ensayo se retiró y se añadió la mezcla de sustrato MTT a los pocillos (120 µl). Las placas se colocaron a 37 C, con un 95 % de humedad relativa y un 5 % de CO2 durante 3 horas. La muerte celular se determinó leyendo las palcas a 490 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices SpectraMax 190). Los resultados se expresaron como la concentración en la que se inhibía el 50 % de la respuesta inducida por el TNFα (CI50) (media de cuatro experimentos independientes +/-SEM) por el anticuerpo biespecífico o el anticuerpo de control positivo calculado utilizando un ajuste sigmoideo de 4 parámetros de los datos (GraphPad Prism).

Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención inhibía la destrucción de las células L929 inducida por el TNFα de una manera dependiente de la dosis con una CI50 de 226 +/-52 pM. Esta inhibición era comparable a la que se observa con el anticuerpo de control positivo (CI50 = 243 +/-49 pM), mientras que el anticuerpo de control negativo no inhibía el TNFα humano. El anticuerpo biespecífico de la presente invención neutraliza eficazmente el TNFα humano.

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Se utilizaron 50 mM de fosfato sódico + 0,35 M de NaCl, pH 7,0 como la fase móvil, fluyendo a 0,5 ml/min durante 35 minutos. Se inyectó un volumen de 1 ul del anticuerpo biespecífico concentrado en la columna y se controló a 280 nm. Los cromatogramas se analizaron utilizando ChemStation, y el %HMW se calculó utilizando el AUC de los picos eluídos antes del pico monomérico respecto al AUC total. Las muestras se almacenaron a 25 C y se analizaron en

5 diferentes momentos del %HMW. En el momento cero, el %HMW era 2,52, a 1 semana el %HMW era 2,01; y a las 4 semanas, el %HMW era 2,37.

Los resultados demuestran que el anticuerpo biespecífico de la presente invención es estable ya que no había un cambio significativo en los agregados solubles después de 4 semanas.

Secuencias

10 HC-ScFv: SEQ ID NO: 1

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LC: SEQ ID NO: 2

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HC-ScFv: SEQ ID NO: 3

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Claims

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