KR20150113199A

KR20150113199A - 항-tnf-항-il-17 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR20150113199A
Application number: KR1020157024020A
Authority: KR
Inventors: 바렛 알란; 앤드류 로렌스 글레이스브룩; 돈미엔느 든 문 렁; 지롱 루; 잉 탕; 앤드류 찰스 벤델; 데릭 라이언 윗쳐; 피아 파울리나 야치
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-10-07
Also published as: AR094872A1; US9416182B2; BR112015018203A2; CA2896888C; CN105283467B; ES2654681T3; JP6152433B2; US20140255406A1; MX2015011957A; ZA201506568B; EP2964674B1; CN105283467A; AU2014226093A1; JP2016510743A; WO2014137961A1; EP2964674A1; TW201444867A; CA2896888A1; AP2015008709A0; EA201591478A1

Abstract

종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 및 인터류킨-17 (IL-17) 둘 다에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 류마티스 관절염 (RA), 건선성 관절염 (PsA) 및 강직성 척추염 (AS)을 비롯한, 각종 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

항-TNF-항-IL-17 이중특이적 항체 {ANTI-TNF-ANTI-IL-17 BISPECIFIC ANTIBODIES}

본 발명은 의약 분야, 특히 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 및 인터류킨-17 (IL-17A)에 대한 이중특이적 항체에 관한 신규 분야에 속한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 류마티스 관절염 (RA), 건선성 관절염 (PsA) 및 강직성 척추염 (AS) 치료에서 유용할 것으로 예상된다.

RA는 전신 만성 염증성 질환이다. 염증은 주로 TNFα 및 IL-17을 비롯한 다수의 시토카인에 의해 유도된다. TNFα에 결합하여 그를 중화시키는, 현재 FDA 승인을 받은 바이오제품 (예컨대, 휴미라(HUMIRA)®)들은 환자 하위세트에서 RA의 징후 및 증상을 감소시키고, RA의 진행을 저속화시키는데 효능이 있는 것으로 입증되었다. IL-17 항체 (세쿠키누맙, 익세키주맙 및 브로달루맙) 또한 임상 시험에서 다양한 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염에 대하여 연구 중에 있다. 그러나, 염증은 다수의 시토카인에 의해 유도되기 때문에, 단일 항체로 2개의 시토카인을 표적화하는 것이 이로울 것이다. 그러므로, RA 환자에서 동시에 염증을 최소한도로 완화시키고, 면역 반응을 최소한도로 감소시키기 위해 TNFα 및 IL-17 둘 다를 표적화하는 것이 이로울 것이다.

현재, TNFα 항체 및 IL-17 항체를 공동 투여하기 위해서는 별개의 두 제품을 주사하거나, 또는 상이한 두 항체로 이루어진 공동 제제를 단일 주사하여야 한다. 두 주사는 투여량 및 시기 선택에 있어 탄력적일 수 있지만, 순응도 및 통증 둘 다에 있어 환자에게 불편을 준다. 공동 제제는 또한 투여량에 있어 약간의 탄력성을 제공할 수는 있지만, 상이한 두 항체의 상이한 분자적 특징에 기인하여 두 항체 모두의 화학적 및 물리적 안정성을 허용하는 제제화 조건을 찾는 것은 큰 도전 과제가 되거나, 아예 불가능하다. 추가로, 공동 투여 또는 공동 제제는 상이한 두 약물 요법의 추가 비용을 포함하며, 이는 환자 및/또는 지불인의 지출 비용을 증가시킬 수 있는 반면, 단일 이중특이적 항체를 통해서는 제공되는 이익을 위해 가격이 최적화될 수 있다.

WO2010/102251에는 TNFα 및 IL-17에 결합하는 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린 ("DVD-Ig")이 개시되어 있다. DVD-Ig는, 특이성이 동일하고, CDR 서열이 동일한 2개의 동일한 항원 결합 아암을 가지고, 그가 결합하는 각 항원에 대해 2가인 다중특이적 이뮤노글로불린이다. 각 항원 결합 아암은 가변 도메인 사이에 개재 불변 영역도 없이 일렬로 연결된 상이한 두 가변 도메인을 포함하고, 각 가변 도메인은 상이한 항원에 대한 특이성을 가진다. WO1995/09917에는 특이성이 다른 완전한 항체에 융합된 단일 쇄 항체를 생산함으로써 재조합 DNA 기술을 사용하여 이중특이적 4가 항체를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 유전자 융합체는 형질감염에 의해 발현되고, 이로써 이중 특이성을 가지는 4가 항체가 생성된다. 미국 특허 번호 6,090,382에는 hTNFα에 결합하여 그를 중화시키는 인간 항체가 개시되어 있다. WO2007/070750에는 인간 IL-17에 결합하여 그를 중화시키는 항-IL-17 항체가 개시되어 있다.

상기 개시내용에도 불구하고, 본 발명의 이중특이적 항체를 구축할 때, 화학적 및 물리적 안정성과 관련된 중요한 문제에 직면하게 되었다. 무수히 많은 문제들을 충분히 극복하기 위해서는 출발 이중특이적 항체에, 두 항원 모두에 대한 결합 친화도는 그대로 유지시키면서, 단일 쇄 단편 가변 영역의 VH/VL 계면을 안정화시키고, 열적 안정성을 증가시키고, 응집을 감소시키고, 이중특이적 항체의 결합 표면에서 정전기적 분포를 재조정하는 것을 비롯한, 많은 변화가 필요하였다.

그러므로, 인간 TNFα 및 인간 IL-17 둘 다를 중화시키는 단일 이중특이적 항체가 여전히 요구되고 있다. 열적으로 안정하고, 물리적으로도 안정하며, 응집성이 낮고, 인간 TNFα 및 인간 IL-17을 중화시키는 이중특이적 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 인간 TNFα 및 인간 IL-17 둘 다를 중화시키는 단일 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공함으로써 상이한 별개의 두 항체의 상이한 분자적 특징을 충족시켜야 하는 제제화 조건을 찾아야 하는 도전 과제를 막는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 상기 언급한 문제들 중 하나 이상의 것을 해결하고자 한다.

본 발명은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 가지고 제2 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 2개의 제1 폴리펩티드 및 2개의 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 가지고 제2 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 제1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명은 추가로 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명은 제1 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체를 발현할 수 있는, DNA 분자(들)로 형질전환된 포유동물 세포를 제공한다.

본 발명은 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건하에서 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 2개의 제1 폴리펩티드 및 2개의 제2 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 생산된 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본 개시내용에 따른 이중특이적 항체를 투여하는 것을 포함하는, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 요법에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 추가로 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염 치료용 의약의 제조를 위한 본 개시내용에 따른 이중특이적 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염의 치료에서 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 항체 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 "인간 IL-17"이라는 용어는 2개의 15 kD 인간 IL-17A 단백질을 포함하는 동종이량체 단백질 ("인간 IL-17A"로도 알려져 있음), 뿐만 아니라 15 kD 인간 IL-17A 단백질 및 15 kD 인간 IL-17F 단백질을 포함하는 이종이량체 단백질 ("인간 IL-17A/F"로도 알려져 있음)을 포함하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 "이중특이적 항체"라는 용어는 본원에 기재된 2개의 제1 폴리펩티드 및 2개의 제2 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 이중특이적 항체는 각 항원에 대한 특이성을 가지고 상이한 두 항원에 결합한다. 이중특이적 항체는 각 항원에 단독으로 또는 각 항원에 동시에 결합할 수 있다. 상기 용어는 글리코실화 프로파일을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 이중특이적 항체에의 임의의 세포 번역 후 변형을 포함하는 것으로 추가로 이해된다.

본 발명의 이중특이적 항체는 2개의 제1 폴리펩티드 및 2개의 제2 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드 중 하나는 제2 폴리펩티드 중 하나와 쇄간 디술피드 결합을 형성한다. 2개의 제1 폴리펩티드는 각각 서로 2개의 쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 각각의 제1 폴리펩티드는 1개 이상의 쇄내 디술피드 결합을 형성한다. 단지 예시적인 목적을 위해 폴리펩티드와 디술피드 결합 사이의 관계가 하기 개략도에 제시되어 있다:

제1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:

서열 3의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터는 서열 1의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩티드를 코딩한다.

제2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:

서열 4의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터는 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 제2 폴리펩티드를 코딩한다.

제1 폴리펩티드 중 하나 및 제2 폴리펩티드 중 하나로 이루어진 쇄간 디술피드 결합은 서열 1의 시스테인 잔기 135와 서열 2의 시스테인 잔기 214 사이에 형성된다. 한 제1 폴리펩티드가 나머지 다른 제1 폴리펩티드와 2개의 쇄간 디술피드 결합을 형성한다. 제1 쇄간 디술피드 결합은 서열 1의 제1 폴리펩티드의 시스테인 잔기 227과 서열 1의 나머지 다른 제1 폴리펩티드의 시스테인 잔기 227 사이에 형성된다. 제2 쇄간 디술피드 결합은 서열 1의 제1 폴리펩티드의 시스테인 잔기 230과 서열 1의 나머지 다른 제1 폴리펩티드의 시스테인 잔기 230 사이에 형성된다.

각각 제1 폴리펩티드 중 서열 1의 시스테인 잔기 505와 서열 1의 시스테인 잔기 705 사이에 1개 이상의 쇄내 디술피드 결합이 형성된다.

제1 폴리펩티드는 제1 중쇄 가변 영역 (HCVR1), 중쇄 불변 영역 (CH), 및 제2 중쇄 가변 영역 (HCVR2), 및 제2 경쇄 가변 영역 (LCVR2)을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 제1 경쇄 가변 영역 (LCVR1) 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. HCVR 및 LCVR 영역은 골격 영역 (FR) 사이에 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 HCVR 및 LCVR은 아미노 말단에서부터 카르복실 말단으로 하기: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4인 순서로 정렬된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다.

HCVR1의 3개의 CDR은 본원에서 CDRH1-1, CDRH1-2, 및 CDRH1-3으로 지칭된다. HCVR2의 3개의 CDR은 본원에서 CDRH2-1, CDRH2-2, 및 CDRH2-3으로 지칭된다. 유사하게, LCVR1의 3개의 CDR은 본원에서 CDRL1-1, CDRL1-2, 및 CDRL1-3으로 지칭되고, LCVR2의 3개의 CDR은 본원에서 CDRL2-1, CDRL2-2, 및 CDRL2-3으로 지칭된다.

CH는 아미노산 링커 (L1)에 의해 HCVR2에 융합된다. HCVR2는 아미노산 링커 (L2)에 의해 LCVR2에 융합된다.

본 발명은 또한 디아바디를 포함한다. 디아바디는 HCVR2 및 LCVR2 영역이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 가변 도메인은 동일 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하는 대신, 가변 도메인이 나머지 다른 한 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하는 것인, 이중특이적 항체이다. 예를 들어, 이중특이적 항체가 2개의 제1 폴리펩티드 (편의상, 1A 및 1B) 및 2개의 제2 폴리펩티드 (편의상, 2A 및 2B)를 포함하는 경우, 1A 폴리펩티드의 HCVR2는 1A 폴리펩티드의 LCVR2와 쌍을 형성하는 대신, 1B 폴리펩티드의 LCVR2의 상보성 도메인과 쌍을 형성하고, 그 반대도 그러하다. 본원에 기재된 바와 같이 이중특이적 디아바디는 인간 TNFα 및 인간 IL-17 둘 다에 대한 결합 친화도 및 중화 능력을 유지한다.

대안적으로, 상기 기재된 이중특이적 항체로부터 디아바디를 정제해 내는 것이 유익할 수 있다. 디아바디 함량은 세포 발현 후 최대 17%일 수 있고, 정제 후에는 1% 미만으로까지 감소될 수 있다.

다양한 영역과 링커의 관계는 카바트(Kabat) 넘버링 협약에 따라 아미노 말단에서부터 카르복실 말단으로 하기와 같이 배열된다:

이중특이적 항체 조작

본 발명의 이중특이적 항체를 구축할 때, 화학적 및 물리적 안정성과 관련된 중요한 문제에 직면하게 되었다. 예를 들어, 모 IL-17 항체는 고농도에서는 물리적 안정성에 있어서 한계 (예컨대, 상 분리)를 보였다. 추가로, 모 IL-17 항체로부터 구축된 이중특이적 항체는 농도-의존성 자가-응집을 보였다. 그러므로, 화학적 및 물리적 안정성을 개선시키고, 농도-의존성 응집을 감소시키기 위해 이중특이적 항체의 CDRL2-1 및 CDRH2-2 부분을 화학적으로 변형시켰다. LC/MS와 함께 조합하여 이루어진 단백질 안정성 및 가용성에 관한 광범위한 연구를 통해 CDRL2-1 및 CDRH2-2 중의 화학적으로 불안정한 잔기가 확인되었다. 이러한 불안정한 잔기를 코돈 결핍에 의해 구축된 표적화된 라이브러리를 사용하여 중성 전하의 아미노산으로 대체하였다. 이러한 불안정한 잔기를 대체한 결과, 화학적 안정성은 개선되었다. 추가로, 이중특이적 항체의 정전기적 표면적을 계산하고, 하전된 패치를 확인하였다. 상기 하전된 패치를 파괴시킨 결과, 단백질 자기-결합은 감소되었다. 따라서, 이중특이적 항체의 CDRH2-1 및 CDRL2-1 부분 중 표면 정전기적 분포를 재조정하고, 열적 안정성을 증가시키고, 응집을 감소시키고, (특이 탈아미드화 및 산화 부위를 제거하면서) 화학적 안정성을 개선시킨 돌연변이가 확인되었다. 상기 변형 중 어느 것도 모 단일 항체의 초기의 특징규명에서는 확인되지 않았다. 이러한 변화는 이중특이적 항체를 구축하는 것과 관련된 경우에만 직면하게 되었으며, 이는 단일 항체의 돌연변이화된 영역 주변의 국부 환경이 이중특이적 항체의 맥락에서는 상이하였다는 것을 제안하는 것이다.

이중특이적 항체 응집을 감소시키기 위해 추가로 화학적으로 변형시켰다. 특히, 이중특이적 항체의 IL-17 부분 중 VH/VL 계면을 안정화시키기 위해 화학적으로 변형시켰다. 이중특이적 항체 응집 배후의 구동력을 측정하기 위해 수행된 연구를 통해, 관찰된 단백질 자기-결합은 개별 VH 또는 VL 도메인의 입체구조적 불안정성에 의해 구동되는 것이 아니라, VH-VL 계면의 개방 또는 "브리딩(breathing)"에 의해 구동되는 것이며, 이로써 분자간 단백질 상호작용이 일어난다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 다양한 쇄내 디술피드 결합이 이중특이적 항체의 IL-17 부분의 VH-VL 계면 내로 도입되었다. 상기와 같은 한 쇄내 디술피드 결합은 각각의 제1 폴리펩티드 중 서열 1의 시스테인 잔기 505와 서열 1의 시스테인 잔기 705 사이에서 일어난다. 상기 디술피드 결합은 이중특이적 항체의 IL-17 부분 중 VH 및 VL 계면을 공유적으로 연결시키고, 이는 VH-VL 계면을 안정화시키며, 물리적 불안정성 및 바람직하지 못한 제제화 제한을 일으킬 수 있는 분자가 단백질 상호작용을 감소시킨다. 시험된 9가지의 상이한 디술피드 결합 중에서 8가지가 기능적 단백질을 발현하였고, 친화도 손실 규모는 약 2 내지 약 35배 범위였다. 각각의 제1 폴리펩티드 중 서열 1의 시스테인 잔기 505와 서열 1의 시스테인 잔기 705 사이에서 이루어진 쇄내 디술피드 결합이 IL-17에 대한 최적의 결합 친화도를 유지하면서, VH/VL 계면을 가장 잘 안정화시켰다.

추가로, 연구 결과, L1의 경우, 링커 길이가 이중특이적 항체의 기능적 활성, 특히 결합 동력학적 성질에 영향을 준 것으로 나타났다. (표면 플라즈몬 공명에 의한) 동력학적 성질 분석 결과, 15개의 아미노산 및 20개의 아미노산 링커와 비교하였을 때, 10개의 아미노산 링커가 K_온 속도를 2배 더 느리게 저속화시킨 것으로 나타났다. 따라서, 최소 링커 길이가 15개인 링커를 본 발명의 이중특이적 항체 내로 도입하였다.

Fcγ 수용체와의 상호작용을 통해 면역계의 활성화를 감소시키거나 또는 제거하기 위해 본 발명의 이중특이적 항체를 또한 조작하였다. 면역 활성화는 본 발명의 이중특이적 항체의 의도된 작용 기전의 일부는 아니다. 그 목적을 달성하기 위하여, Fcγ 수용체 또는 보체계의 성분에의 결합능이 낮은 것으로 알려져 있는 IgG4 이소형으로 본 발명의 이중특이적 항체를 구축하였다. 추가로, 상기 결합 잠재능을 추가로 감소시키기 위해 하위의 힌지 영역 중의 두 알라닌을 돌연변이화하였다.

이중특이적 항체 결합

본 발명의 이중특이적 항체는 인간 TNFα 및 인간 IL-17 둘 다에 결합한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 인간 TNFα 생체활성 및 하나 이상의 인간 IL-17 생체활성을 중화시킨다. 본 발명의 이중특이적 항체는 시험관내에서 IL-17 및 시험관내에서 가용성 및 막 결합 TNFα 둘 다의 강력한 억제제이다.

본 발명의 이중특이적 항체는 인간 TNFα에 대하여 약 30 pM 내지 약 1 pM 범위, 및 인간 IL-17A에 대하여 약 40 pM 내지 약 1 pM 범위의 결합 친화도 (K_D)를 가진다. 추가로, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 IL-17A/F 이종이량체에 대해 약 50 pM 내지 약 1 pM 범위의 K_D를 가진다. 한 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 TNFα에 대해 약 21 pM 내지 약 3 pM 범위의 K_D를 가진다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 IL-17A에 대하여 약 8 pM 내지 약 10 pM 범위의 K_D를 가진다.

이중특이적 항체 발현

작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터가 관련 기술분야에 주지되어 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드일 수 있다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 한 벡터에서 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는, 하나가 제1 폴리펩티드를 발현하고 하나가 제2 폴리펩티드를 발현하는 두 벡터에서 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있다.

숙주 세포로는 본 발명의 제1 폴리펩티드, 및 제2 폴리펩티드, 또는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 둘 다를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항체를 생산하는 숙주 세포주의 생성 및 단리는 관련 기술분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 달성할 수 있다. 포유동물 세포는 이중특이적 항체의 발현을 위해 바람직한 숙주 세포이다. 특정 포유동물 세포는 HEK 293, NS0, DG-44, 및 CHO이다. 바람직하게, 이중특이적 항체는 숙주 세포가 배양된 배지 내로 분비되고, 그로부터 본 발명의 이중특이적 항체가 회수 또는 정제될 수 있다.

항체가 포유동물에서 발현되면, 글리코실화된다는 것은 관련 기술분야에 주지되어 있다. 전형적으로, 글리코실화는 항체의 Fc 영역 중 고도로 보존되는 N-글리코실화 부위에서 일어난다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다. 각각의 제1 폴리펩티드는 서열 1의 아스파라긴 잔기 300에서 글리코실화된다.

서열 1의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 특정 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

서열 2의 아미노산 서열을 가지는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 특정 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

이중특이적 항체가 분비되어져 있는 배지를 종래 기법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 종래 방법을 사용하여 배지를 프로테인(Protein) A 또는 G에 도포하고, 그로부터 용리시킬 수 있다. 가용성 응집체 및 다량체는 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 비롯한 일반 기법에 의해 효과적으로 제거할 수 있다. 생성물을 예를 들어, -70℃에서 즉시 냉동시킬 수 있거나, 또는 동결건조시킬 수 있다.

배지 중에 존재하는 디아바디의 수준을 감소시켜야 할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 디아바디를 함유하는 배지를 강한 양이온 교환 수지에 도포하고, 그로부터 용리시킬 수 있다. 예를 들어, SP-세파로스(SP-Sepharose) HP 강한 양이온 교환 수지를 사용하여 디아바디로부터 올바르게 폴딩된 이중특이적 항체를 정제한다. 디아바디를 함유하는 배지의 pH를 20 mM 비신(Bicine)을 사용하여 pH 8.1로 조정한다. 배지를 SP-세파로스 HP 칼럼 상에 로딩하고, 2 칼럼 부피의 20 mM 비신 (pH 8.1)으로 세척하고, 20 칼럼 부피 (10-90 mM NaCl) 상에서 20 mM 비신 및 100 mM NaCl (pH 8.1)로 용리시킨다. 수집된 풀을 고분자량 대 주요 피크에 대하여 평가할 수 있다. 전형적인 결과는 약 68%의 회수율과 함께, 약 17% 디아바디에서 1% 미만의 디아바디로의 개선이다.

임의로, 하기 비제한적인 방법에 따라 디아바디를 정제할 수 있다: 이중특이적 항체 및 디아바디가 분비되어져 있는 정화된 배지를, 상용성 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 프로테인 A 친화도 칼럼에 도포할 수 있다. 칼럼을 세척하여 비특이 결합 성분을 제거할 수 있다. 결합된 이중특이적 항체 및 디아바디를, 예를 들어 pH 구배 (예컨대, 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 6.8)에서 0.1 M 시트르산 나트륨 완충제 (pH 2.5))에 의해 용리시킬 수 있다. 제한 리실 엔도펩티다제 (LysC) 분해에 의해 Fc 영역과 ScFv/디아바디 영역 사이를 절단한 후, 역상 HPLC 정량 분석에 의해 이중특이적 디아바디 분획을 검출할 수 있다. 간략하면, 15 ㎍의 샘플을 37℃에서 대략 20시간 동안 총 부피 50 ㎕로 20 mM 트리스(Tris) pH 8.0 + 0.1 mg/mL 아이오도아세트아미드 중 0.2 ㎍의 LysC (와코(Wako), P/N 125-05061)를 이용하여 분해할 수 있다. 샘플을 PLRP-S 50 x 2.1 mm 역상 칼럼 (베리안(Varian) P/N PL1912-1802) 상에 20 ㎕ (6 ㎍) 주입하여 분석할 수 있다. 유량은 0.6 mL/min일 수 있고, 칼럼 온도는 80℃일 수 있고, 검출은 214 nm에서 이루어질 수 있고, 완충제 A는 물 중 0.05% TFA일 수 있고, 완충제 B는 아세토니트릴 중 0.04% TFA일 수 있다. 적절한 피크를 통합하여 ScFv 및 디아바디 피크 (LC-MS에 의해 앞서 확인된 것)를 측정할 수 있다. 이중특이적 디아바디를 함유하는, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피로부터의 물질을 풀링하고, PBS (pH 7.0)로 di-여과시킬 수 있다. 고분자량 응집체를 제거하기 위해, CEX 풀을 PBS (pH 7) 중에서 7 mL/min으로 전개되는 슈퍼덱스(Superdex) 200 50/60 SEC 칼럼 상에 배치할 수 있다. 이중특이적 디아바디 풀을 SDS-PAGE 및 분석용 SEC 분석에 의해 측정할 수 있다. 이어서, SEC 풀을 하기 완충제 시스템으로 5배 희석시킬 수 있다: 3.3 mM MES, 3.3 mM Hepes, 3.3 mM 트리스, 3.3 mM 비스-트리스 프로판, 3.3 mM CHES, 3.3 mM CAPS (pH 5.8). 이어서, 희석된 단백질 풀을 15 mL/min으로 정제용 프로팩 WCX-10 바이오LC(ProPAC WCX-10 BioLC) 양이온 교환 칼럼 (22 x 250 mm 정제 규모) 상에 로딩할 수 있다. 앞서 기재된 완충제 시스템을 사용하여 45분 동안에 걸쳐 15 mL/min로 pH 8.4에서 pH 11로의 선형 pH 구배를 이용하는 용리에 의해 이중특이적 디아바디를 이중특이적 항체로부터 분리시켜 7.5 mL의 분획을 수집하였다. 제조된 프로팩 CEX 풀은 각 분획 중 디아바디 함량을 측정하기 위해 분석용 SEC (TSK3000), 분석용 CEX (프로팩 WCX-10), 겔 분석 (MES 완충제 시스템을 이용하는 NuPAGE), 및 Lys C 분해에 기반할 수 있다. 최종 프로팩 CEX 풀을 PBS (pH 7)로 투석시킬 수 있다.

상기 정제 프로세스는 디아바디 함량을 최대 12% 디아바디에서 5% 미만의 디아바디로 감소시킬 수 있다.

제약 조성물 및 치료 용도

본 발명의 이중특이적 항체는 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염을 치료할 수 있을 것으로 기대된다. "환자"란, TNF 및/또는 IL-17 수준 감소 또는 TNF 및/또는 IL-17의 생체활성 감소가 도움이 되는 질환, 장애 또는 병증을 앓는 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다.

"치료" 및/또는 "치료하는"은 본원에 기재된 장애 진행을 저속화, 방해, 제어, 또는 중단시킬 수 있지만, 반드시 장애 증상 모두를 완전하게 제거하는 것을 나타내는 것은 아닌, 모든 방법을 의미하는 것으로 한다. 치료는 포유동물, 특히 인간에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 본 발명의 이중특이적 항체를 투여하는 것을 포함하고, (a) 질환 추가 진행을 억제시키고, 즉, 그의 발생을 정지시키고; (b) 질환을 경감시키고, 즉, 질환 또는 장애를 퇴행시키거나, 그의 증상 또는 합병증을 완화시키는 것을 포함한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 대상체에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 도입될 수 있다. 전형적으로, 제약 조성물은 본 발명의 이중특이적 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 이중특이적 항체의 저장 수명 또는 효능을 증진시키는 최소량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 의도되는 투여 방식 및 치료 적용에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사용 또는 주입용 액제 형태, 예컨대 인간을 다른 항체로 수동 면역화시키는데 사용되는 것과 유사한 조성물 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 피하 주사에 의해 투여된다. 그러나, 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 제약 조성물은 "치료 유효량"의 본 발명의 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. "치료 유효량"이란 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량으로 그러한 시간 동안 상기 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다. 이중특이적 항체의 치료 유효량은 인자, 예컨대 질환 상태, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 이중특이적 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료학상 유익한 효과가 이중특이적 항체의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다.

투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예컨대, 치료 반응)을 제공할 수 있도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 수개의 분할된 용량을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 치료 상황의 긴급한 사정에 의해 명시되는 대로 그에 비례하여 용량을 감량하거나 증가시킬 수 있다.

투여량 값은 완화시키고자 하는 병증의 유형 또는 중증도에 따라 달라질 수 있다. 임의의 특정 대상체의 경우, 구체적인 투여량 요법은 개체의 필요에 따라서, 및 조성물을 투여하고 조성물 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라서, 시간 경과에 따라 조정되어야 한다는 것을 추가로 이해하여야 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 자가면역 질환, 특히 염증과 관련된 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염을 치료하는 방법을 제공한다. 비록 특정 장애의 경우, 이중특이적 항체를 염증 부위에 국부 투여하는 것이 유익할 수도 있지만, 전형적으로는 이중특이적 항체는 전신 투여된다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

이중특이적 항체의 발현 및 정제

이중특이적 항체는 본질적으로 하기와 같이 발현 및 정제될 수 있다. (서열 1의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩티드를 코딩하는) 서열 3 및 (서열 2의 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는) 서열 4의 DNA를 함유하는 글루타민 신테타제 (GS) 발현 벡터를 사용하여 전기천공에 의해 차이니즈 햄스터 세포주, CHOK1SV (론자 바이올로직스 PLC(Lonza Biologics PLC: 영국 슬라우))를 형질감염시켰다. 발현 벡터는 SV 조기 (시미안 바이러스(Simian Virus) 40E) 프로모터 및 GS에 대한 유전자를 코딩하였다. GS를 발현함으로써 CHOK1SV 세포가 필요로 하는 아미노산인 글루타민을 생화학적으로 합성할 수 있었다. 형질감염 후, 50 μM L-메티오닌 술폭시민 (MSX)을 이용하여 세포에 대해 벌크 선별을 수행하였다. MSX에 의한 GS 억제를 이용하여 선별의 엄격성을 증가시켰다. 발현 벡터 cDNA가 숙주 세포 게놈의 전사적으로 활성인 영역 내로 통합된 세포를, 내인성 수준의 GS를 발현하는 CHOK1SV 야생형 세포와의 비교로 선별하였다. 안정한 발현 세포가 클로날 성장에 가깝게 성장할 수 있도록 하기 위해 형질감염된 풀을 저밀도로 플레이팅하였다. 마스터웰을 이중특이적 항체 발현에 대해 스크리닝한 후, 생산을 위해 사용하고자 하는 무혈청 현탁 배양물로 규모를 확장하였다. 상용성 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 평형화된 프로테인 A 친화도 칼럼에 이중특이적 항체가 분비되어 있는 정화된 배지를 도포하였다. 칼럼을 세척하여 비특이 결합 성분을 제거하였다. 예를 들어, pH 구배 (예컨대, 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 6.8)에서 0.1 M 시트르산 나트륨 완충제 (pH 2.5))에 의해 결합된 이중특이적 항체를 용리시켰다. 예컨대, SDS-PAGE 또는 분석용 크기 배제에 의해 이중특이적 항체 분획을 검출한 후, 풀링하였다. 가용성 응집체 및 다량체를 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 비롯한 일반 기법에 의해 효과적으로 제거할 수 있었다. 일반 기법을 사용하여 이중특이적 항체를 농축시키고/거나, 멸균 여과시킬 수 있었다. 상기 크로마토그래피 단계 이후 이중특이적 항체의 순도는 98% 초과였다. 이중특이적 항체를 -70℃에서 즉시 냉동시킬 수 있거나, 또는 수개월 동안 4℃에서 보관할 수 있었다.

TNFα 및 IL -17에의 결합 친화도

TNFα

전개용 완충제 및 샘플 희석제를 위해 PBS 중 블로커 카세인(Blocker Casein) (피어스(Pierce))을 사용하면서, 37℃에서 사피다인(Sapidyne) KinExA 3000 장치 상에서 용액 평형 결합 검정을 사용하여 이중특이적 항체의 인간 TNFα에의 결합 친화도를 측정하였다. 인간 TNFα를 표준 아민 커플링 화학법을 통해 NHS 세파로스 상에 고정화시켰다. 20 pM의 고정 농도의 이중특이적 항체를 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 및 0 (블랭크) pM 농도의 인간 TNFα와 혼합하여 샘플을 제조하였다. 분석에 앞서, 샘플을 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션시켜 평형에 도달하도록 하였다. 각 분석 사이클은 (1) 367 ㎕의 비드를 1 mL/min으로 주입하여 인간 TNFα 비드의 칼럼을 패킹하고, (2) 10 mL (20분)의 이중특이적 항체/인간 TNFα 복합체를 0.5 mL/min으로 칼럼 상에 주입하고, (3) 0.5 mL (2분)의 완충제를 0.25 mL/min으로 주입하여 비결합 샘플을 세척해 내고, (4) 1 mL (30 sec)의 500 ng/mL 디라이트(DyLight)-649 토끼 항-인간 IgG 검출 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 주입하고, (5) 2.25 mL (90 sec)의 완충제를 1.5 mL/min으로 주입하여 비결합 검출 항체를 세척해 내고, (6) 1 mL (60 sec)의 1 N NaOH를 주입한 후, 역류 세정하여 시스템을 세정하는 것으로 이루어졌다. KinExA 프로 소프트웨어(KinExA Pro Software) 버전 2.0.1.14를 사용하여 2회 반복된 실험의 N-곡선 분석을 사용하여 데이터를 피팅하였다. 유리 이중특이적 항체의 비율(%)로부터 평형 해리 상수 (K_D)를 계산하였다. 본 발명의 이중특이적 항체의 인간 TNFα에 대한 K_D는 4.4 pM인 것으로 나타났다 (0.6 내지 16.3 pM의 95% 신뢰 구간).

IL-17

37℃로 설정된 분석 온도에서 HBS-EP+ (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), 10 mM Hepes (pH 7.4) + 150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05% 계면활성제 P20) 전개용 완충제로 프라이밍된 비아코어(Biacore) T200 장치 상에서 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 이중특이적 항체의 인간 IL-17에의 결합 친화도를 측정하였다. 4개의 모든 유동 세포 (Fc) 상에 (표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 생성된) 고정화된 프로테인 A를 함유하는 CM4 칩을 사용하여 포획 방법을 이용하였다. 전개용 완충제로 희석하여 항체 샘플을 4 ㎍/mL로 제조하였다. 전개용 완충제로 희석하여 인간 IL-17을 80.0, 40.0, 20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 및 0 (블랭크) nM의 최종 농도로 제조하였다. 각 분석 사이클은 (1) 별개의 유동 세포 (Fc2, Fc3, 및 Fc4) 상에서 항체를 포획하고, (2) 200 ㎕ (120 sec)의 인간 IL-17을 100 ㎕/min으로 모든 유동 세포 상에 주입하고, (3) 20 min 동안 완충제 유동을 복귀시켜 해리 단계를 모니터링하고, (4) 10 ㎕ (20 sec)의 글리신 (pH 2.0)을 주입하여 칩 표면을 재생시키는 것으로 이루어졌다. 표준 이중-참조를 이용하여 데이터를 프로세싱하고, 비아코어 T200 이밸루에이션(Biacore T200 Evaluation) 소프트웨어, 버전 1.0을 사용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 결합 속도 (k_온) 및 해리 속도 (k_오프)를 측정하였다. 관계식 K_D = k_오프/k_온으로부터 평형 해리 상수 (K_D)를 계산하였다.

<표 1>

이중특이적 항체에 의한 인간 IL -17에의 결합 친화도

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 인간 TNFα 및 인간 IL-17에 별개로 결합할 수 있다는 것이 입증되었다.

인간 TNFα 및 인간 IL -17에의 동시 결합

비아코어 T200 장치를 사용하여 인간 TNFα 및 인간 IL17이 이중특이적 항체에 동시에 결합할 수 있는지 여부를 측정하였다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 비아코어 시약 및 물질을 비아코어로부터 구입하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. HBS-EP+ 완충제 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.05% (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM Hepes, (pH 7.4))를 전개용 완충제 및 샘플 완충제로서 사용하였다. 아민 커플링 키트를 사용하여 프로테인 A를 CM4 센서 칩의 유동 세포 1 및 2 상에 고정화시켰다. 먼저, 3 ㎍/mL로 희석된 이중특이적 항체를 30 ㎕/min으로 35초 동안 주입하여 유동 세포 2 상에 포획시켜 165 공명 단위 (RU)의 포획 항체를 수득하였다. 상기 포획 후, 35초 동안 완충제를 주입하였다. 이어서, 유량을 100 ㎕/min으로 증가시키고, 유동 세포 1 (Fc1) 및 유동 세포 2 (Fc2) 상으로 유동하도록 유도하였다. TNFα 결합을 포화시키기 위해, 50 nM의 인간 TNFα를 2분 동안 주입하였다. Fc2-Fc1과 같은 참조-감산된 데이터를 수집하였다. 45 RU의 결합 신호가 관찰되었다. 인간 TNFα 주입 후, 80 nM의 인간 IL-17을 추가로 2분 동안 주입하여 IL-17 결합을 포화시켰다. 다시, Fc2-Fc1과 같은 참조-감산된 데이터를 수집하였다. 37 RU의 추가의 결합 신호가 관찰되었다. 이어서, 10 mM 글리신 (pH 1.5)을 사용하여 칩 표면을 재생시켰다. 이중특이적 항체에의 2개의 리간드 결합으로부터의 공명 단위 증가 (초기에 TNFα로부터 45 RU, 이어서, 인간 IL-17로부터 추가의 37 RU)에 의해 나타난 바와 같이, 상기 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 인간 TNFα 및 인간 IL17에 동시에 결합할 수 있다는 것이 입증되었다.

HT-29 세포로부터의 시험관내 IL-17-유도성 CXCL1 생산 억제

HT-29 세포는 천연적으로 IL-17 수용체를 발현하는 인간 결장직장 선암종 상피 세포이다. HT-29 세포를 인간 IL-17과 인큐베이션시키면, CXCL1이 생산되고, 이는 상업적으로 이용가능한 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다.

20 pM 내지 10 nM 용량 범위의 이중특이적 항체를 평가하였다 (이중특이적 항체의 MW는 200 kDa이다). 50 ㎕의 2 nM (최종 농도) 재조합 IL-17을 함유하는 웰에 각 시험 농도의 이중특이적 항체 (50 ㎕)를 첨가하였다. 시험을 각 처리당 이중 웰에서 수행하였다. 검정 배지를 "배지 단독" 및 "IL-17 단독" 대조군을 위해 사용하였다. IL-17 중화 항체 (미국 특허 번호 7,838,638)를 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 대조군 항체를 이중특이적 항체와 같은 몰 범위로 시험하였다. IL-17 및 항체 혼합물을 함유하는 플레이트를 조직 배양물 처리된 96 웰 플레이트 중에서 60 내지 90분 동안 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서) 인큐베이션시켰다.

HT-29 세포를 검정 배지 (10% FBS, 페니실린G (0.2 U/mL) 및 스트렙토마이신 (0.2 ㎍/mL)을 함유하는 맥코이(McCoy's) 5A) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정일 하루 전 세포를 수거하였다. 세포를 1 x PBS로 세정하고, 세포 해리 완충제, 효소-무함유, PBS를 이용하여 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 완전 검정 배지를 탈착된 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 실온에서 5분 동안 310 x g로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 검정 배지에 재현탁시켰다. 인비트로젠 카운테스(Invitrogen Countess)로 세포 밀도를 측정하고, (100 ㎕ 중) 20,000개의 HT-29 세포를 96 웰 플레이트 각각에 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 밤새도록 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂)에 놓았다. (100 ㎕ 중) 항체/IL-17 혼합물을 HT-29 세포에 첨가하고, 24-48시간 동안 인큐베이션시켰다 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂).

검정 종료시, 플레이트를 (실온에서 5분 동안 500 x g로) 원심분리하고, 세포 배양 배지를 폴리프로필렌 96 웰 플레이트로 옮기고, 이를 실링하고, -80℃에서 냉동시켰다. ELISA에 의한 CXCL1 측정 당일, 플레이트를 실온에서 해동시켰다. CXCL1 샌드위치 ELISA (R&D 시스템즈 듀오세트(R&D Systems DuoSet) #DY275)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 배지 중 CXCL1 수준을 측정하였다. ELISA 반응 종료시, 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 베르사맥스 튜너블(Molecular Devices VersaMax Tunable)) 상에서 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 데이터의 4 파라미터 S자형 피트 (그래프패드 프리즘(GraphPad Prism))를 이용하여 계산된, IL-17-유도성 반응의 50%가 이중특이적 항체 또는 양성 대조군 중 어느 하나에 의해 억제되는 농도 (IC₅₀)로서 결과를 표시하였다.

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 HT-29 세포에 의한 CXCL1의 IL-17-유도성 분비를 농도에 의존하는 방식으로 억제시켰다는 것이 입증되었다. 억제는 양성 대조군 항체를 사용하여 관찰된 것과는 유사한 반면 [이중특이적 항체의 경우, IC₅₀은 0.628 ± 0.072 nM 대 양성 대조군 항체의 경우, IC₅₀은 0.614 ± 0.099 nM (3회의 독립 실험의 평균 ± SEM)], 음성 대조군 항체는 CXCL1 생산을 억제시키지 못했다. 본 발명의 이중특이적 항체는 IL-17을 효과적으로 중화시켰다.

HT-29 세포로부터의 시험관내 TNF -유도성 CXCL1 생산 억제

HT-29 세포는 천연적으로 TNF 수용체를 발현하는 인간 결장직장 선암종 상피 세포이다. HT-29 세포를 인간 TNFα와 인큐베이션시키면, CXCL1이 생산되고, 이는 상업적으로 이용가능한 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다.

0.5 pM 내지 10 nM 용량 범위의 이중특이적 항체를 평가하였다 (이중특이적 항체의 MW는 200 kDa이다). 이어서, 50 ㎕의 30 pM (최종 농도) 재조합 TNFα를 함유하는 웰에 각 시험 농도의 이중특이적 항체 (50 ㎕)를 첨가하였다. 시험을 각 처리당 이중 웰에서 수행하였다. 검정 배지를 "배지 단독" 및 "TNF 단독" 대조군을 위해 사용하였다. TNF 중화 항체 (아달리무맙)를 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 대조군 항체를 이중특이적 항체와 같은 몰 범위로 시험하였다. TNFα 및 항체 혼합물을 함유하는 플레이트를 조직 배양물 처리된 96 웰 플레이트 중에서 60 내지 90분 동안 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서) 인큐베이션시켰다.

HT-29 세포를 검정 배지 (10% FBS, 페니실린G (0.2 U/mL) 및 스트렙토마이신 (0.2 mcg/mL)을 함유하는 맥코이 5A) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정일 하루 전 세포를 수거하였다. 세포를 1 x PBS로 세정하고, 세포 해리 완충제, 효소-무함유, PBS를 이용하여 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 완전 검정 배지를 탈착된 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 실온에서 5분 동안 310 x g로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 검정 배지에 재현탁시켰다. 인비트로젠 카운테스로 세포 밀도를 측정하고, (100 ㎕ 중) 20,000개의 HT-29 세포를 96 웰 플레이트 각각에 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 밤새도록 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂)에 놓았다. 항체/TNFα 혼합물을 HT-29 세포에 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂).

검정 종료시, 플레이트를 (실온에서 5분 동안 500 x g로) 원심분리하고, 세포 배양 배지를 폴리프로필렌 96 웰 플레이트로 옮기고, 이를 실링하고, -80℃에서 냉동시켰다. ELISA에 의한 CXCL1 측정 당일, 플레이트를 실온에서 해동시켰다. CXCL1 샌드위치 ELISA (R&D 시스템즈 듀오세트 #DY275)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 배지 중 CXCL1 수준을 측정하였다. ELISA 반응 종료시, 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 베르사맥스 튜너블) 상에서 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 데이터의 4 파라미터 S자형 피트 (그래프패드 프리즘)를 이용하여 계산된, TNF-유도성 반응의 50%가 이중특이적 항체 또는 양성 대조군 중 어느 하나에 의해 억제되는 농도 (IC₅₀)로서 결과를 표시하였다.

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 HT-29 세포에 의한 CXCL1의 TNF-유도성 분비를 농도에 의존하는 방식으로 억제시켰다는 것이 입증되었다. 억제는 양성 대조군 항체를 사용하여 관찰된 것과는 유사한 반면 [이중특이적 항체의 경우, IC₅₀은 18.8 ± 1 pM 대 양성 대조군 항체의 경우, IC₅₀은 14.0 ± 2 pM (3회의 독립 실험의 평균 ± SEM)], 음성 대조군 항체는 CXCL1 생산을 억제시키지 못했다. 본 발명의 이중특이적 항체는 TNFα를 효과적으로 중화시켰다.

IL-17 및 TNF의 조합에 의해 유도되는 HT-29 세포로부터의 CXCL1 생산 억제

상기 기재된 바와 같이, HT-29 세포는 천연적으로 IL-17 및 TNF 수용체를 발현하는 인간 결장직장 선암종 상피 세포이다. HT-29 세포를 인간 TNFα 및 인간 IL-17과 함께 인큐베이션시키면, CXCL1이 생산되고, 이는 상업적으로 이용가능한 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다.

항체를 4 nM의 고정 용량으로 시험하였다 (이중특이적 항체의 MW는 200 kDa이다). 이어서, 50 ㎕의 3 pM 재조합 TNFα 및 50 ㎕의 200 pM 재조합 IL-17을 함유하는 웰에 이중특이적 항체 (50 ㎕)를 첨가하였다. 시험을 각 처리당 5개의 중복 웰에서 수행하였다. 검정 배지를 "배지 단독" 및 "IL-17+TNF 단독" 대조군을 위해 사용하였다. 항-IL-17 항체 (미국 특허 번호 7,838,638); 항-TNFα 항체 (아달리무맙); 및 항-IL-17항체/항-TNF 항체의 조합을 검정에서 대조군으로서 사용하였다. 대조군 항체를 이중특이적 항체와 같은 몰 범위로 시험하였다. TNF+IL-17 및 항체 혼합물을 함유하는 플레이트를 조직 배양물 처리된 96 웰 플레이트 중에서 60 내지 90분 동안 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서) 인큐베이션시켰다.

HT-29 세포를 검정 배지 (10% FBS, 페니실린G (0.2 U/mL) 및 스트렙토마이신 (0.2 mcg/mL)을 함유하는 맥코이 5A) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정일 하루 전 세포를 수거하였다. 세포를 1 x PBS로 세정하고, 세포 해리 완충제, 효소-무함유, PBS를 이용하여 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 완전 검정 배지를 탈착된 세포에 첨가하였다. 이어서, HT-29 세포를 실온에서 5분 동안 310 x g로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 검정 배지에 재현탁시켰다. 인비트로젠 카운테스로 세포 밀도를 측정하고, (100 ㎕ 중) 20,000개의 HT-29 세포를 96 웰 플레이트 각각에 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 밤새도록 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂)에 놓았다. 이중특이적 항체/IL-17/TNF 혼합물을 HT-29 세포에 첨가하고, 24-48 h 동안 인큐베이션시켰다 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂).

검정 종료시, 플레이트를 (실온에서 5분 동안 500 x g로) 원심분리하고, 세포 배양 배지를 폴리프로필렌 96 웰 플레이트로 옮기고, 이를 실링하고, -80℃에서 냉동시켰다. ELISA에 의한 CXCL1 측정 당일, 플레이트를 실온에서 해동시켰다. CXCL1 샌드위치 ELISA (R&D 시스템즈 듀오세트 #DY275)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 배지 중 CXCL1 수준을 측정하였다. ELISA 반응 종료시, 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 베르사맥스 튜너블) 상에서 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 다양한 항체와 인큐베이션시킨 후에 남아있는 인간 CXCL1의 비율(%) (여기서, TNF + IL-17 단독인 경우, 100%)로서 결과를 표시하였으며: 이중특이적 항체 0.85 ± 0.12%; 항-TNFα 8.97 ± 2.65%; 항-IL-17 27 ± 2.07%; 항-TNFα + 항-IL-17 0.59 ±1.23%였다. 본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 HT-29 세포에 의한 CXCL1의 동시의 TNFα- 및 IL-17-유도성 분비를 단독의 단일 작용제보다 더욱 잘 억제시켰다는 것이 입증되었다.

시험관내에서 L929 세포에서의 가용성 TNFα -유도성 세포독성 억제

L929 세포는 천연적으로 TNF 수용체를 발현하는 마우스 섬유육종 세포이다. L929 세포를 인간 TNFα와 인큐베이션시키면, 활성 산소 중간체의 과도한 형성에 기인하여 세포 사멸이 빠르게 일어난다. 세포 사멸은 MTT 세포독성 검정을 사용하여 측정될 수 있으며, 여기서 생존가능한 세포에서의 미토콘드리아 숙시네이트 데히드로게나제는 테트라졸륨 염을 포르마잔 생성물로 환원시키고, 이는 형광 플레이트 판독기로 검출될 수 있다.

20 nM 내지 10 pM 용량 범위의 이중특이적 항체를 평가하였다 (이중특이적 항체의 MW는 200 kDa이다). L929 세포를 함유하는 웰에 각 시험 농도의 이중특이적 항체 (100 ㎕), 200 pg/mL 재조합 인간 TNFα (100 ㎕), 및 6.25 ㎍/mL 악티노마이신-D (100 ㎕)를 첨가하였다. 시험을 각 처리당 이중 웰에서 수행하였다. TNFα 중화 항체 (IgG4 이소형을 갖는 아달리무맙)를 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 항체 혼합물을 함유하는 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.

L929 세포를 검정 배지 (1 x DMEM 셀그로(Cellgro), 10% FBS, 1% Pen-Strep, 1% MEM 필수 아미노산, 1% L-글루타민, 1% 피루브산나트륨) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정 당일, 세포를 1 x PBS (Ca⁺⁺ 또는 Mg⁺⁺ 불포함)로 세정하고, 0.25% 트립신 + EDTA를 이용하여 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 검정 배지를 이용하여 트립신을 불활성화시켰다. L929 세포를 실온에서 5분 동안 215 x g로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 검정 배지에 재현탁시켰다. 혈구계로 세포 밀도를 측정하고, (100 ㎕ 중) 10,000개의 L929 세포를 96 웰 플레이트에 첨가하고, 밤새도록 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂)에 놓았다. 항체/TNFα/악티노마이신-D 혼합물을 L929 부착성 세포를 포함하는 96 웰 플레이트로 옮기고, 37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서 18 hrs 동안 인큐베이션시켰다. 검정 배지를 제거하고, MTT 기질 혼합물을 웰 (120 ㎕)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서 3시간 동안 놓았다. 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 190(Molecular Devices SpectraMax 190)) 상에서 490 nm에서 플레이트를 판독하여 세포 사멸을 측정하였다. 데이터의 4 파라미터 S자형 피트 (그래프패드 프리즘)를 이용하여 계산된, TNFα 유도성 반응의 50%가 이중특이적 항체 또는 양성 대조군 항체 중 어느 하나에 의해 억제되는 농도 (IC₅₀) (4회의 독립 실험의 평균 ± SEM)로서 결과를 표시하였다.

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 IC₅₀ = 226 ± 52 pM으로 L929 세포의 TNFα-유도성 사멸을 농도에 의존하는 방식으로 억제시켰다는 것이 입증되었다. 상기 억제는 양성 대조군 항체를 사용하여 관찰된 것과는 유사한 반면 (IC₅₀ = 243 ± 49 pM), 음성 대조군 항체는 인간 TNFα를 억제시키지 못했다. 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 TNFα를 효과적으로 중화시켰다.

시험관내에서 L929 세포에서의 막 결합 인간 TNFα 유도성 세포독성 억제

막 결합 TNFα를 억제시킬 수 있는 이중특이적 항체의 능력을 연구하기 위해, TNF 절단 부재하에 생체활성 TNFα가 세포 표면 상에서 발현될 수 있도록 허용하는 것으로 앞서 입증된 (Mueller et. al. 1999) 돌연변이 세트를 사용하여 TNFα의 공지된 절단 부위를 불활성화시켰다. 비-절단가능한 TNFα 구축물을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 안정하게 형질감염시켰다. 유동 세포측정법에 의해 제시된 바와 같이, 상기 세포를 막 결합 TNFα를 발현하였다. 인간 비-절단가능한 막 결합 TNFα를 발현하는 CHO 세포와 함께 L929 세포를 인큐베이션시켰을 때, L929 세포는 빠르게 사멸되었다.

막 결합 인간 TNFα를 발현하는 CHO 세포를 선택 배지 (AM2001 배지, MSX를 포함하지 않는 내부 CHO 성장 배지, 8 mM 글루타민, GS 보충물, 500 ㎍/mL G418을 포함하는 HT 보충물) 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정 당일, 세포를 계수하고, 1 x PBS (Ca⁺⁺ 또는 Mg⁺⁺ 불포함)로 세정하고, 5 min 동안 215 x g로 원심분리하고, 50,000개의 세포/mL로 악티노마이신-D (6.25 ㎍/mL)와 함께 L929 검정 배지 중에 재현탁시켰다. (10 ㎕ 중) 500개의 세포의 세포 현탁액을, 37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서 60분 동안 인큐베이션된 각 농도의 항체 혼합물에 첨가하였다. 이중특이적 항체, 인간 비-절단가능한 막 결합 TNFα CHO 세포, 및 악티노마이신-D를 함유하는 혼합물을 L929 부착성 세포와 함께 96 웰 플레이트로 옮기고, 37℃, 95% 상대 습도, 5% CO₂에서 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기에 가용성 TNFα L929에 대하여 기재된 바와 같이 MTT 세포독성 검정을 사용하여 세포 사멸을 측정하였다. TNFα 유도성 반응의 50%가 이중특이적 항체 또는 양성 대조군 항체 중 어느 하나에 의해 억제되는 농도 (IC₅₀) (3회의 독립 실험의 평균 ± SEM)로서 결과를 표시하였다.

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 IC₅₀ = 646 ± 89.5 pM으로 인간 비-절단가능한 막 결합 TNFα CHO 세포에 의한 L929 세포의 사멸을 농도에 의존하는 방식으로 억제시켰다는 것이 입증되었다. 상기 억제는 양성 대조군 항체 (IgG4 이소형을 갖는 아달리무맙)를 사용하여 관찰된 것과는 유사한 반면 (IC₅₀ = 669 ± 134 pM), 음성 대조군 항체는 인간 TNFα를 억제시키지 못했다. 본 발명의 이중특이적 항체는 막 결합 인간 TNFα를 효과적으로 중화시켰다.

생체내 인간 IL-17 또는 TNFα -유도성 CXCL1 생산 억제

인간 IL-17 또는 TNFα를 주사하였을 때, 순환 중 마우스 CXCL1은 빠르게 일시적으로 증가하였다. 통상의 C57BI/6J 마우스 (군당 n= 7마리)에 하기의 것을 피하로 주사하였다 (16.7 nmol/kg): (a) 이중특이적 항체, (b) 양성 대조군 항-IL-17 항체 (BAFF/IL-17 이중특이적 항체), (c) 양성 대조군 항-TNFα 항체 (IgG4 이소형을 갖는 아달리무맙); 또는 (d) 음성 대조군 항체 (인간 IgG4). 2일 후, 마우스는 인간 IL-17 (3 ㎍/마우스) 또는 인간 TNFα (1 ㎍/마우스)를 단일의 복강내 주사로받았다. 시토카인 시험주사 후 2시간 경과하였을 때, 마우스를 희생시키고, 시판용 ELISA를 이용하여 혈장을 CXCL1에 대해 분석하였다.

<표 2>

생체내 인간 IL -17- 또는 TNFα -유도성 CXCL1 생산의 평균 억제율( % )

본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체가 음성 대조군 항체를 받은 동물과 비교하였을 때, 인간 IL-17- 및 TNFα-유도성 CXCL1 생산을 유의적으로 억제시켰다는 것이 입증되었다 (p<0.001, ANOVA에 이어서 터키 다중 비교 검정(Tukey's Multiple Comparison test)에 의해 계산. 이중특이적 항체를 사용하였을 때의 CXCL1 생산 감소는 양성 대조군 항체를 사용하여 관찰된 것과는 유사하였다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 마우스에서 인간 IL-17 및 TNFα에 의해 유도되는 생물학적 효과를 효과적으로 중화시켰다.

결합 검정

CD16a , CD32a , 및 C1q

96 웰 마이크로플레이트를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 1 ㎍/mL로 100 ㎕/웰의, C-말단 10-His 태그를 포함하는 CD32a (R&D 시스템즈) 또는 C-말단 6-His 태그를 포함하는 재조합 인간 CD16a (R&D 시스템즈)로 코팅하였다. 96 웰 마이크로플레이트를 PBS 중 2 ㎍/mL로 100 ㎕/웰의 인간 C1q (MP 바이오로지칼즈(MP Biologicals))로 코팅하였다. 플레이트를 실링하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 각 웰로부터 코팅 시약을 제거하고, 200 ㎕/웰의 카세인 차단용 시약 (써모(Thermo))을 첨가하였다. 플레이트를 실링하고, 실온 (RT)에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 웰을 세척 완충제 (20 mM 트리스, 0.15 M NaCl, 0.1% 트윈(Tween)-20, pH 7.5)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 모두가 카세인 차단용 시약 중에 희석된 것인, 본 발명의 이중특이적 항체, 인간 IgG1 양성 대조군, 또는 인간 IgG4 음성 대조군의 일련의 희석액을 각 웰에 첨가하고 (100 ㎕/웰), RT에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다 (일련의 2배 희석액 중 6.25 내지 200 ㎍/mL의 농도 범위의 항체를 시험하였다). 시험을 이중 웰에서 수행하였다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척한 후, 100 ㎕/웰의, 카세인 차단용 시약 중 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치 카탈로그(Jackson ImmunoResearch Catalog) 109-036-097)의 1:12,500 희석액을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 폴리클로날 항체는 인간 IgG1 및 IgG4 둘 다를 인식하였다 (데이터는 나타내지 않음). 플레이트를 세척 완충제로 4회에 걸쳐 세척하고, TMB 기질 (피어스, 100 ㎕/웰)을 첨가하였다. 모두 암실에서 및 RT에서 인큐베이션 시간은 CD16a의 경우, 4.5분, CD32a의 경우, 9분, 및 C1q의 경우, 30분이었다. 마지막으로, 100 ㎕의 1.0 N HCl을 각 웰에 첨가하였다. 450 nm로 설정된 비색 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 즉시 측정하였다.

CD64

96 웰 마이크로플레이트를 PBS 중 1 ㎍/mL로 100 ㎕/웰의 C-말단 6-His 태그를 포함하는 CD64 (R&D 시스템즈)로 코팅하였다. 플레이트를 실링하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 각 웰로부터 코팅 시약을 제거하고, 200 ㎕/웰의 카세인 차단용 시약을 첨가하였다. 플레이트를 실링하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 웰을 세척 완충제로 2회에 걸쳐 세척하였다. 모두가 카세인 차단용 시약 중에 희석된 것인, 본 발명의 이중특이적 항체, 인간 IgG1 양성 대조군, 또는 인간 IgG4 음성 대조군의 일련의 희석액을 각 웰에 첨가하고 (100 ㎕/웰), RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다 (일련의 4배 희석액 0.001 내지 300 ㎍/mL의 농도 범위의 항체를 시험하였다). 시험을 이중 웰에서 수행하였다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척한 후, 100 ㎕/웰의, 카세인 차단용 시약 중 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG, F(ab')2의 1:12,500 희석액을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충제로 4회에 걸쳐 세척하고, 100 ㎕/웰의 TMB 기질을 첨가하고, 암실에서 및 RT에서 4.5분 동안 인큐베이션시켰고, 이 시점에서 100 ㎕의 1.0 N HCl을 각 웰에 첨가하였다. 450 nm로 설정된 비색 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 즉시 측정하였다.

본 시험관내 결합 실험 결과, 본 발명의 이중특이적 항체의 CD16a, CD32a, CD64, 또는 C1q 중 임의의 것에의 결합은 인간 IgG4 음성 대조군 항체를 사용하여 관찰된 것과 동일한 것으로 나타났다. 인간 IgG1 양성 대조군 항체는 시험된 4개의 분자 모두에 결합하였고, 이를 통해 검정의 유효성이 입증되었다.

시험관내 CD4 T 세포 및 류마티스 관절염 활막세포 공동 배양물-유도성 MMP -1, MMP -3, IL -8 및 G- CSF 생산 억제

류마티스 관절염을 앓는 환자로부터의 인간 섬유모세포-유사 활막세포 (RA-FLS)와 함께 활성화된 인간 CD4 T 세포를 인큐베이션시켰을 때, 염증성 매개 인자, 예컨대 MMP-1, MMP-3, IL-8 및 G-CSF가 생산되고, 연골 및 골이 파괴되었다. 50 ㎕ CD4 T 세포 (1:1 비드/세포 비로 CD3/CD28 다이너비즈(Dynabeads)로 활성화된 50,000개의 T 세포)를 함유하는 웰에 본 발명의 이중특이적 항체 (이중특이적) ((MW 또는 200 kDa에 기초하여) 30 nM) 또는 대조군 항체 (Ab)를 50 ㎕로 첨가하였다. 이어서, 그 전날 밤에 100 ㎕로 플레이팅된 RA-FLS 상에 Ab와 함께 또는 Ab 없이 100 ㎕의 활성화된 CD4 T 세포를 첨가하였다. 시험을 각 처리당 8-9회의 중복 웰에서 수행하였다. 인간 IgG4 이소형을 음성 대조군으로서 사용하였다. IL-17 중화 Ab 및 TNF 중화 Ab를 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 대조군 Ab를 이중특이적 항체와 같은 몰 농도로 시험하였다.

피콜-플라크(Ficoll-Paque) 방법을 사용하여 샌디에고 혈액 은행(San Diego Blood Bank)으로부터 입수한 연막 [류코 리덕션 시스템(LRS: Leuko Reduction System) 챔버]으로부터 인간 PBMC를 단리시켰다. PBS를 이용하여 7 mL LRS 생성물을 140 mL가 되도록 만들었다. 35 mL의 연막/PBS를 15 mL 피콜/히스토플라크 플러스(Ficoll/Histopaque Plus) (GE 헬쓰케어) 상에 오버레이시켰다. 튜브를 평형되게 만들고, 브레이크 없이 실온 (RT)에서 30분 동안 900 x g로 회전시켰다. 혈청학적 피펫으로 세포 계면을 수집하고, PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 단리된 PBMC를 10% FBS, 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 U/mL), L-글루타민 (100 유닛/mL) 및 5 x 10^-5 M 2-베타 메르캅토에탄올을 함유하는 이스코베스 변형 둘베코스 배지(Iscoves Modified Dulbecco's Medium) 중에서 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 음성 선택 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec) 단리용 키트)에 의해 제조사의 설명서에 따라 CD4 T 세포를 단리시켰다.

셀 어플리케이션, 인크.(Cell Applications, Inc.)로부터의 RA-FLS 세포를 셀 어플리케이션, 인크.로부터의 완전 활막세포 성장 배지 중에서 통상적으로 배양하였다. 검정일 하루 전 RA-FLS를 수거하였다. 세포를 1 x PBS로 세정하고, 트립신-EDTA를 이용하여 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 완전 검정 배지를 탈착된 세포에 첨가하였다. RA-FLS를 RT에서 5분 동안 310 x g로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 검정 배지 [10% FBS, 페니실린 G (100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 U/mL)을 함유하는 검정 배지 둘베코스 변형 이글 배지]에 재현탁시켰다. 인비트로젠 카운테스로 세포 밀도를 측정하고, (100 ㎕ 중) 10,000개의 RA-FLS 세포를 96 웰 플레이트의 각각의 웰 첨가하였다. 96 웰 평평한 바닥 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5%)에 놓았다.

항-CD3 및 항-CD28 (기브코(Gibco), 라이프 테코놀러지즈(Life Technologies))로 코팅된 다이너비즈를 이용하여 T 세포 활성화를 달성하였다. 사용 전, 다이너비즈를 동량의 세척 완충제 (0.1% 우혈청 알부민 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.4))로 세척하였다. 비드를 다이너마그네트(Dynamagnet) 상에 놓고, 1분 후, 상청액을 제거하였다. 비드를 다이너마그네트로부터 제거하고, PBMC 배지 [10% FBS, 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 U/mL), L-글루타민 (100 유닛/mL) 및 5 x 10^-5 M 2-베타 메르캅토에탄올을 함유하는 이스코베스 변형 둘베코스 배지] 중에 재현탁시켜 원래 비드 농도 4 x 10⁷개의 비드/mL를 수득하였다. 1.25 ㎕ 중 50,000개의 세척된 비드를 50,000개의 T 세포에 첨가하였다. 본 발명의 이중특이적 항체 또는 대조군 항체 (Ab)를 CD3/CD28 다이너비즈를 포함하는 CD4 T 세포에 첨가하였다. 항체가 있거나 또는 없는, 다이너비드 활성화된 CD4 T 세포를 RA-FLS를 함유하는 96 웰 플레이트 상에 첨가하였다. 플레이트를 6일 동안 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5% CO₂)에 놓았다.

검정 종료시, 플레이트를 (RT에서 5분 동안 500 x g로) 원심분리하고, 세포 배양 배지를 폴리프로필렌 96 웰 플레이트로 옮기고, -80℃에서 냉동시켰다. ELISA에 의한 MMP-1, MMP-3, IL-8 및 G-CSF 측정당일, 플레이트를 RT에서 해동시켰다. 샌드위치 ELISA (각각 R&D 시스템즈 듀오세트 번호 DY901, DY513, DY208, DY214)에 의해 제조사의 설명서에 따라 배지 중 MMP-1, MMP-3, IL-8 및 G-CSF 수준을 측정하였다. ELISA 반응 종료시, 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 베르사맥스 튜너블) 상에서 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 결과를 시토카인 생산 (ng/mL)으로 표시하였다. 활성화된 CD4 T 세포:RA-FLS 공동 배양물 중에서 본 발명의 이중특이적 항체에 의한 시토카인 억제는 Ab 처리 부재하의 활성화된 CD4 T 세포:RA-FLS 공동 배양물과 비교하여 남아있는 시토카인의 평균 비율(%)로서 제시하였다.

본 발명의 이중특이적 항체는 대조군 Ab와 비교하여 활성화된 인간 CD4 T 세포:RA-FLS 공동 배양물 유도성 MMP-1, MMP-3, IL-8 및 G-CSF 생산을 억제시켰다. 본 검정은 3회 수행되었고, 유사한 결과를 얻었다.

인간화된 관절염 마우스 모델에서의 생체내 시험

인간 TNF의 트랜스제닉 발현은 마우스에서 자발적 진행성 염증성 관절염을 유발한다 (Hayward M.D., et al. BMC Physiology. Dec 10;7:13 (2007)). 상기 마우스에서 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 이용한 인간 IL-17의 추가 발현은 자발적 진행성 다발관절염을 추가로 악화시킬 것이다. 수컷 인간 TNF-트랜스제닉 마우스 ((B6.Cg(SJL)-Tg(TNF) N21, 타코닉 팜즈(Taconic Farms: 미국 뉴욕주 조지타운), 모델 1006)는 프로모터 및 안정화된 3'UTR을 포함하는 전체 인간 TNFα 유전자를 보유하였고, 이로써 모든 조직에서 인간 TNFα가 낮게 구성적으로 발현되었다. 동물을 사료 및 식수에 자유롭게 접근할 수 있도록 하면서 케이지당 2마리씩 하우징시켰다. 표준화된 점수화 체계를 사용하여 앞발 및 뒷발 중의 그의 관절염성 질환을 점수화하였다 (앞발: 0 = 염좌 또는 팽윤에 대한 증거 없음, 1 = 발목의 경미한 팽윤, 2 = 중간 정도의 팽윤 또는 경미한 염좌, 3 = 중증 팽윤 또는 중증 염좌, 4 = 중증 팽윤 및 중증 염좌. 뒷발: 0 = 염좌 또는 팽윤에 대한 증거 없음, 1 = 경미한 염좌/발가락을 곧게 펴지 못함, 2 = 중간 정도의 염좌/발가락을 펴지 못함, 3 = 중증의 내측 왜곡/경미한 팽윤, 4 = 뚜렷한 팽윤과 함께 중증의 내측 왜곡). 8주령째 마우스에 인간 IL-17에 대한 유전자 (n=32) 또는 비관련 유전자 (lacz, n=8)를 보유하는 1 x 10¹⁰개의 게놈 카피의 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 정맥내로 주사하였다 (꼬리 정맥을 통해 100 uL/마우스). 시판용 ELISA 키트 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery: 미국 메릴랜드주 로크빌))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 꼬리 조각으로부터 수득된 마우스 혈장에서 인간 IL-17의 바이러스 발현을 검출하였다. 평균 혈장 수준은 약 500 pg/ml 인간 IL-17이었다. 12주령째 마우스를 그의 임상적 관절염 점수, 인간 IL-17 혈장 수준, 및 체중에 기초하여 연구군으로 무작위화하였다. 상이한 항체를 이용하는 처리를 군 분류 당일 개시하였다. 상이한 두 용량 (20 및 3.3 nmol/kg)의 본 발명 이중특이적 항체 (이중특이적) 또는 TNF 중화 항체 (TNF Ab) 또는 이소형 대조군 항체 (Neg Ctrl Ab) (20 nmol/kg)를 9주 동안 매주 동물에게 피하로 투약하였다. 임상 관절염 점수는 맹검 방식으로 통상적으로 측정하였다. 종료시 심장 천자에 의해 혈장을 수득하고, 뒷다리를 10% 포르말린 중에 고정시켰다. 뒷다리를 EDTA 중에서 탈회시키고, 트리밍하고, 통상의 방식으로 프로세싱하고, 파라핀 중에 포매시키고, 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 하기 범주에 대하여 관절염 점수화를 수행하였다: 예상 총 합계(potential total) 20의 0 = 정상, 1 = 최소, 2= 경미한, 3 = 중간 정도, 4 = 뚜렷한 정도, 5= 중증인 0-5 등급의 염증, 골 재흡수, 연골 손상, 및 판누스 형성.

모든 항체를 PBS 중에서 적절한 농도로 제제화하여 200 uL/마우스 피하 용량을 얻었다.

처리 후 인간 TNF 트랜스제닉/IL-17 마우스의 뒷발에 대한 평균 조직학적 점수

*** p<0.001, ** p<0.01 대 Neg Ctrl Ab (일원 ANOVA). 조직학적 점수는 4개의 상이한 파라미터 (0-5 등급으로 점수화된 염증, 골 재흡수, 연골 손상, 및 판누스 형성)의 누적 점수이다.

본 데이터를 통해 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 시토카인-유도성 질환의 질환 모델에서 효과적이라는 것이 입증되었다.

인간화된 건선 마우스 모델에서의 생체내 시험

인간화된 건선 마우스 모델은 건선 환자로부터의 인간 비-병변 피부 생검을 면역결핍 마우스의 등 피부 상에 이식시키는 것을 포함하는 모델이다. 인간 피부를 이식시킨 후 (3 내지 4주 경과 후), 같은 공여자로부터의 T 세포 활성화된 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 이식편 내로 피부내로 주사하여 건선-유사 표피 비후를 유도하였다 (Wrone-Smith and Nickoloff J., Clin Invest.15;98(8): 1878-87 (1996)).

PBMC 주사 전날을 시작으로 하여, 마우스 (10-27마리/군)를 본 발명의 이중특이적 항체 (이중특이적) (66.6, 3.3 또는 0.67 nmol/kg), TNF 중화 항체 (TNF Ab) (66.6 또는 3.3 nmol/kg), PBS 또는 베타메타손 (1일 2회 국소)으로 매주 1회 처리하였다. 3주 후, 마우스를 안락사시키고, 이식된 피부를 단리시키고, 표피의 두께를 측정하였다.

PBS 대조군과 비교하였을 때 본 발명의 이중특이적 항체 (66.6 nmol/kg)가 인간 피부 이식편에서의 표피 비후를 유의적으로 감소시켰다 (p=0.047). 본 발명의 이중특이적 항체 (66.6 nmol/kg)는 TNF Ab (66.6 nmol/kg)보다 더욱 잘 인간 피부 이식편에서의 표피 비후를 감소시킬 수 있었다 (p=0.0057). 본 결과는 인간화된 건선 마우스 모델에서의 본 발명의 이중특이적 항체의 효능을 입증한다.

평균 표피 두께

안정성 분석

이중특이적 항체를 10 mM 시트레이트 + 150 mM NaCl (pH 6) 중에서 제제화하였다. 아미콘 울트라-4(Amicon Ultra-4) 30,000 MWCO 농축기 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 이중특이적 항체를 100 mg/mL로 농축시켰다. 최종 농도가 0.02% (v/v)일 때까지 트윈-80을 첨가하였다. 농축된 샘플을 4주 동안 25℃에서 보관하였다. 시점 0, 1주 경과 후, 및 4주 경과 후에 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 샘플을 고분자량 (HMW) 비율(%)에 대해 분석하였다. TSK G3000SW-XL (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)) 칼럼을 사용하여 애질런트(Agilent) 1100 시스템 상에서 SEC를 수행하였다. 35분 동안 0.5 mL/min으로 전개되는 이동상으로서 50 mM 인산나트륨 + 0.35 M NaCl (pH 7.0)을 사용하였다. 1 uL 부피의 농축된 이중특이적 항체를 칼럼 내로 주입하고, 280 nm에서 모니터링하였다. 켐스테이션(ChemStation)을 사용하여 크로마토그램을 분석하고, 단량체 피크 이전에 용리된 피크의 AUC 대 전체 AUC의 비를 사용하여 HMW를 계산하였다. 25℃에서 보관된 샘플을 상이한 시점에 HMW에 대하여 분석하였다. 시험 0에서, HMW(%)는 1.52%이고; 1주째, HMW(%)는 2.01%이고; 4주째, HMW(%)는 2.37%였다.

4주 경과 후에도 가용성 응집체에는 어떤 유의적인 변화도 없었는 바, 이에 본 결과를 통해 본 발명의 이중특이적 항체는 안정적이라는 것이 입증되었다.

서열

HC- ScFv : 서열 1

LC: 서열 2

HC- ScFv : 서열 3

LC: 서열 4

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-TNF-ANTI-IL-17 BISPECIFIC ANTIBODIES <130> X19803 <150> 61/774909 <151> 2013-03-08 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 712 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 450 455 460 Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys 465 470 475 480 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr His Ile His 485 490 495 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Val Ile 500 505 510 Asn Pro Thr Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg 515 520 525 Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 530 535 540 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr 545 550 555 560 Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 565 570 575 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 595 600 605 Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 610 615 620 Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser Arg Gly Glu Thr Tyr Leu His Trp 625 630 635 640 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val 645 650 655 Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 660 665 670 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 675 680 685 Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly 690 695 700 Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 705 710 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 2136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtgtcagct attacttgga atagtggtca catagactac 180 gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtgagc 300 tacctgagta ctgcctccag cctggactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc ccgctagcgc cctgctccag gagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 tccaaatatg gtcccccatg cccaccctgc ccagcacctg aggccgccgg gggaccatca 720 gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840 gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaaa gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260 gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320 agcctctccc tgtctctggg aggcggagga tccgggggag ggggttccgg aggagggggc 1380 tcgcaggtgc agctggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctgggtc ctcagtgaag 1440 gtttcctgca aggcatctgg ttacaagttc actgactacc atattcattg ggtgcgacag 1500 gcccctggac aatgccttga gtggatggga gtaattaatc ctacttatgg tactactgac 1560 tacaatcagc ggttcaaagg ccgtgtcacc attaccgcgg acgaatccac gagcacagcc 1620 tacatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcgagatat 1680 gattacttta ctgggacggg tgtgtactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcctca 1740 ggtggcggag gatctggtgg aggtggctca ggaggtggcg gaagcggcgg aggtggaagt 1800 gatattgtga tgactcagac tccactctcc ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 1860 atctcctgca gatctagtag gagccttgta cacagtcgtg gagaaaccta tttacattgg 1920 tatctgcaga agccaggcca atctccacag ctcctaattt ataaagtttc caaccggttt 1980 attggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca cagatttcac actgaaaatc 2040 agcagggtgg aggccgaaga tgttggggtt tattactgct ctcaaagtac acatcttcca 2100 ttcacgtttg gctgcgggac caagctggag atcaaa 2136 <210> 4 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca gggcattcgc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta ctgtcaacgc tataaccgtg ccccttacac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

Claims

제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 가지고 제2 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 이중특이적 항체.
제1항에 있어서, 2개의 제1 폴리펩티드 및 2개의 제2 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체.
서열 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
서열 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
서열 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
제3항의 DNA 분자 및 제4항의 DNA 분자를 포함하며, 서열 1의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩티드 및 서열 2의 아미노산 서열을 가지는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체를 발현할 수 있는 포유동물 세포.
제6항의 포유동물 세포를 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고, 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 것을 포함하는, 이중특이적 항체를 생산하는 방법.
제7항의 방법에 의해 생산된 이중특이적 항체.
치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제2항 또는 제8항의 이중특이적 항체를 투여하는 것을 포함하는, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염을 치료하는 방법.
제2항 또는 제8항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 이중특이적 항체.
제2항 또는 제8항에 있어서, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 또는 강직성 척추염의 치료에서 사용하기 위한 이중특이적 항체.
제2항 또는 제8항의 이중특이적 항체 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.