KR20230015997A - 항-pd-1 항체 - Google Patents

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KR20230015997A
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무하마두 라민 엠보우
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요셉 에이. 모즈드지어즈
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Abstract

본 발명은 새로운 항-PD-1 (프로그래밍된 세포사 1) 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용하는 치료학적 및 진단학적 방법 및 조성물을 위한 새로운 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

항-PD-1 항체
서열 목록
[0000] 본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.　 2021년 4월 29일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 09-0701-WO-1_SL.txt이고, 크기가 136,527 바이트이다.
[0001] 본 발명은 일반적으로 치료학적 및 진단학적 사용을 위한 항-PD-1 (프로그래밍된 세포사 1) 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, PD-1를 발현한 세포를 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 항-PD-1 항체 및 방법이 기재되어 있다. 항-PD-1 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 기재되어 있다.
[0002] PD-1 및 CD279(분화 클러스터 279)로도 알려진 프로그래밍된 세포사 1은 주로 T 세포 상에서 발현되지만 다른 면역 세포에서도 발현되는 세포 표면 수용체 단백질이다. PD-1 경로는 면역학적 관용성의 유도 및 유지에서 주요 조절인자이다. 단백질은 "면역 관문" 억제제로서 기능하며, 즉 자가면역 질환을 조절하고 제한하기 위해 면역계에서 세포의 활성을 조절하는 역할을 한다. PD-1은 세포 표면 수용체와 상호작용하는 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. 결합시, PD-1은 T-세포 반응을 음성으로 조절하는 세포내 신호를 유도한다. 활성화된 T 세포의 표면상에서 PD-1 발현은 T 세포가 말초 항원을 인지한 후 상향 조절되고; 후속적으로, PD-1과 PD-L1 및 PD-L2의 상승된 결합은 다운스트림 억제 신호 전달의 주요 단계가 된다. PD-1은 또한 증가된 Treg-세포 증식 및 증진된 면역억제 기능과 관련된다.
[0003] 최근에 많은 암이 “면역 관문” 억제제를 변형시킴에 의해 면역계로부터 그 자체를 보호하고, 따라서 검출을 회피할 수 있다. PD-1을 차단하는 PD-1 억제제인 새로운 부류의 약물은 면역계를 활성화시켜 종양을 공격하여 이를 사용하여 특정 유형의 암을 치료한다.
[0004] 대조적으로, 결함이 있는 PD-1 억제 기능은 또한 면역 매개 질환의 병리생리학과 관련이 있고, PD-1 또는 이의 리간드의 발현은 특정 자가면역 적응증에 조절불능이 있거나 완전히 개입하지 않을 수 있다. 따라서 PD-1 활성화의 유도 및 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-L2 시스템의 사용은 면역 반응을 억제하고 다양한 면역 및 염증 장애에 대한 치료를 제공하기 위한 대안적 접근법을 나타낸다.
[0005] 따라서 PD-1 경로를 유도하고, 억제 기능을 증진시키며 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-L2 시스템에 의해 제어되는 면역 및 염증 장애에 대한 치료를 제공하는 치료법이 필요하다. 특히 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2 간의 상호작용을 차단하지 않으면서 상호작용을 조절하는 항체와 같은 생물학적 치료제가 필요하다.
발명의 간단한 요약
[0006] 본 발명은 사람 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 차단하지 않는다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 증진시킨다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 PD-1 신호전달 경로를 활성화시킨다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 항-PD-1 효능제 항체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어, PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하고, 특히 PD-1 경로를 활성화시킴에 의해 완화될 수 있는 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하다.
[0007] 하나의 양상에서, 본 발명은 항-PD-1 항체, 특히, 모노클로날 항-PD-항체, 예를 들어, 하기의 본원에 기재된 성질 중 하나 이상을 갖는 사람화된 모노클로날 항-PD-1 항체를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어, 10 nM 이하, 예를 들어 5 nM 이하의 높은 친화도로 정제된 재조합 사람 PD-1에 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 50 nM 이하의 친화도로 정제된 재조합 시노몰로구스 PD-1에 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-1, 특히 사람 PD-1에 선택적으로 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 마우스, 래트 또는 토끼 PD-1에 결합하지 않는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 차단하지 않는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 증진시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 예를 들어, IFNγ 생성의 억제, IL-17A 생성의 억제 또는 IL-21 생성의 억제에 의해 기능성 세포 검정에서 T 세포 활성을 약화시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 마우스 모델에서 사람 세포 축적을 억제하고, 마우스 모델에서 사람 염증 사이토킨의 수준을 감소시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 선호될 수 있는 약동학 성질을 갖는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 선호될 수 있는 생물리학적 성질, 예를 들어, 수율, 품질, 안정성 또는 용해도를 갖는다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.
[0008] 하나의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
서열번호 43의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 44의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 45의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 1의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 43의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 46의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 45의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 1의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 47의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 48의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 49의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 50의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 51의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 52의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 7의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 8의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 9의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 53의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 54의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 55의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 10의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 11의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 12의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 56의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 57의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 58의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 13의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 15의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 59의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 60의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 61의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 16의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 17의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 18의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 62의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 63의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 19의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 20의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 21의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 65의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 66의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 67의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 22의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 23의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 24의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 68의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 69의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 70의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 25의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 71의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 58의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 28의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 29의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 74의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 75의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 164의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 167의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 80의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 81의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 82의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 33의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 34의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 83의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 84의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 85의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 16의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 35의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 86의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 87의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 88의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 37의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 38의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 39의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 89의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 90의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 91의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 40의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 41의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 42의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[0009] 하나의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 74의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 75의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 164의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 167의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[0010] 하나의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
하기 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 74의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 75의 아미노산 서열 (H-CDR3),
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열 (H-CDR3),
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열 (H-CDR3), 또는
서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열 (H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열 (H-CDR3);
및
하기 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열 (L-CDR3),
서열번호 164의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열 (L-CDR3),
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열 (L-CDR3), 또는
서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 167의 아미노산 서열 (L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열 (L-CDR3).
[0011] 하나의 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 화학적 계산 그룹(Chemical Computing Group(CCG)) 넘버링에 따라 정의된다.
[0012] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
[0013] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, Fab, F(ab’)2, Fv 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0014] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 108 및 서열번호 92; 각각 서열번호 109 및 서열번호 93; 각각 서열번호 110 및 서열번호 94; 각각 서열번호 111 및 서열번호 95; 각각 서열번호 112 및 서열번호 96; 각각 서열번호 113 및 서열번호 97; 각각 서열번호 114 및 서열번호 98; 각각 서열번호 115 및 서열번호 99; 각각 서열번호 116 및 서열번호 100; 각각 서열번호 117 및 서열번호 101; 각각 서열번호 118 및 서열번호 102; 각각 서열번호 119 및 서열번호 103; 각각 서열번호 120 및 서열번호 104; 각각 서열번호 121 및 서열번호 105; 각각 서열번호 122 및 서열번호 106; 각각 서열번호 123 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0015] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 131, 서열번호 133, 서열번호 135, 서열번호 137 또는 서열번호 139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 125, 서열번호 127 또는 서열번호 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0016] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 131 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0017] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 133 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0018] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 135 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0019] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 137 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0020] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 139 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0021] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 131 및 서열번호 125의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0022] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 133 및 서열번호 127의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0023] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 135 및 서열번호 127의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0024] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 137 및 서열번호 129의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0025] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 139 및 서열번호 129의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0026] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역, 예를 들어, 사람 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 또는 IgE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
[0027] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 중쇄 불변 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 갖는 IgG4의 중쇄 불변 영역이다.
[0028] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1의 중쇄 불변 영역이다.
[0029] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 중쇄 불변 영역은 Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 갖는 IgG1의 중쇄 불변 영역이다.
[0030] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 카파 및 람다로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
[0031] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 143 및 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
[0032] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 147 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
[0033] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 149 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
[0034] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 153 및 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
[0035] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 155 및 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
[0036] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 143의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 141의 아미노산 서열로 이루어진다.
[0037] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 147의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 145의 아미노산 서열로 이루어진다.
[0038] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 149의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 145의 아미노산 서열로 이루어진다.
[0039] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 153의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 151의 아미노산 서열로 이루어진다.
[0040] 하나의 구현예에서, 본 발명은 항-PD1 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 155의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 151의 아미노산 서열로 이루어진다.
[0041] 하나의 구현예에서, 상기된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
[0042] 하나의 구현예에서, 상기된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
[0043] 하나의 구현예에서, 상기된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효능제이다.
[0044] 하나의 구현예에서, 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어, 10 nM 이하, 예를 들어 5 nM 이하의 높은 친화도로 사람 PD-1에 결합한다.
[0045] 하나의 구현예에서, 본 발명은 PD-1에 대한 결합에 대하여 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하는 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 PD-1에 대한 결합에 대하여 항체 A, 항체 B, 항체 C, 항체 D 또는 항체 E와 경쟁하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[0046] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기된 바와 같이 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
[0047] 하나의 구현예에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위해 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
[0048] 하나의 구현예에서, 본 발명은 약제학적 유효량의 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, PD-1 경로 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 PD-1 경로 장애를 치료하는데 사용하기 위한 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 PD-1 경로 장애를 치료하기 위한 약물의 제조에서 상기된 바와 같이 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[0049] 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 경로를 활성화시키기에 충분한 양으로 상기된 바와 같이 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하는데 사용하기 위해 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하기 위한 약물의 제조에서 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[0050] 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 면역 반응을 하향 조절하기에 충분한 양으로 상기된 바와 같이 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키는데 사용하기 위해 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키기 위한 약물의 제조에서 상기된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[0051] 하나의 구현예에서, 상기 방법에서, 상기 사용을 위한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서, 또는 상기 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용에서, 상기 질환은 전신성 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0052] 하나의 구현예에서, 상기 방법에서, 상기 사용을 위한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 또는 상기 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비경구 투여 경로, 정맥내 투여 경로 또는 피하 투여 경로에 의해 투여된다.
[0053] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
[0054] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
[0055] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
[0056] 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기된 바와 같이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
[0057] 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
- 상기된 바와 같이 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계, 및
- 상기 항체를 회수하는 단계.
[0058] 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
- 상기된 바와 같이 중쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기된 바와 같은 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계; 및
- 상기 항체를 회수하는 단계.
[0059] 하나의 구현예에서, 상기 방법은 추가로 항체를 정제하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 추가로 항체를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함한다.
[0060] 하나의 구현예에서, 본 발명은 제1 항-PD-1 효능제 항원 결합 부위 및 제2 항원-결합 부위를 포함하는 다중 특이적 항체를 제공한다.
[0061] 하나의 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 부위는 항-CD48 결합 부위, 항-CD-2 결합 부위, 항-CD11 결합 부위 또는 항-CD3 결합 부위이다.
[0062] 하나의 구현예에서, 제1 항-PD-1 효능제 항원 결합 부위는 상기된 바와 같이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[0063] 하나의 구현예에서, 상기 다중 특이적 항체는 이중특이적 항체이다.
[0064] 도 1: 유동 세포측정에 의해 평가된 세포 기반 검정에서 사람 PD-1 단백질에 대한 항-PD-1 항체의 선택성. MFI는 “평균 형광 강도”를 나타낸다.
[0065] 도 2: 사람 PD-L1-Fc에 결합하는 사람 PD-1-Fc의 경쟁 결합 검정. GLM 칩 표면상에 커플링된 PD-L1-Fc 아민에 대한 25 nM PD-1-Fc의 결합 곡선을 도시하는 센서그램(도 2a). GLM 칩 표면에 커플링된 PD-L1-Fc 아민에 결합하는 25nM PD-1-Fc와 미리 혼합된 항체 C, MK-3475 및 PD1AB-6-4P(500nM)의 센서그램(도 2b).
[0066] 도 3: 항-PD-1 효능제 항체의 존재 하에 PD-L1의 PD-1로의 증진된 결합. PD-1 비오틴: PD-L1 상호작용 검정 (도 3a). CHO PD-1 - PD-L1 델피아-Eu TRF 검정 (도 3b 및 3d). CHO PD-1: 비오틴 PD-L1 결합 검정(도 3c). 도 3d에서, 개별 데이터 포인트는 단지 항체 C에 대해 도시되고; 다른 항체에 대한 개별 데이터 포인트는 서로 이들의 밀접한 근접성 때문에 도 3d에 도시되지 않는다. POC는 “대조군 퍼센트”를 나타낸다.
[0067] 도 4: 항-PD-1 효능제 항체 또는 모체 723C2 효능제 항체 (도 4a) 또는 모체 효능제 항체 820C3 (도 4b)로부터 유래된 F(ab’)2 단편의 존재하에 T 세포 기능적 활성. POC는 “대조군 퍼센트”를 나타낸다.
[0068] 도 5: 가교결합시 Mab 효능제 CD48에 의한 PD-1 활성화의 유도.
[0069] 도 6: 사람 범(pan)-T 세포의 세포추적물-바이올렛으로의 표지화, CD3 Mab를 사용한 활성화, 및 세포추적물의 희석에 의한 세포 증식의 분석.
[0070] 도 7: 이중특이적 작제물 (도 7a). PD-1을 과발현하는 Jurkat 세포에 대해 유동 세포측정에 의해 입증된 PD-1 또는 CD48로의 각각의 아암의 결합(도 7b). 플레이트 결합된 PD-1/CD48 BsAb 또는 대조군 항체의 존재 하에 플레이트 결합된 항-CD3e로 사람 기억 CD4+ T(PD1+) 세포의 자극(도 7c). MFI는 “평균 형광 강도”를 나타낸다.
[0071] 본 발명은 면역 및 염증 장애, 특히 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-L2 시스템에 의해 제어되는 면역 및 염증 장애에 대한 치료의 필요성을 해결한다. 이러한 필요성을 해결하기 위해, 본 발명은 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 차단하지 않는 항-PD-1 항체를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 증진시키는 항체를 제공한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 PD-1 신호전달 경로를 활성화시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 항-PD-1 효능제 항체이다. PD-1 효능작용은 PD-1이 발현되지만 개입되지 않거나 이의 리간드에 의해 최적으로 개입되는 사람 질환에서 자동 반응성 T 세포의 확장 및 이펙터 기능을 억제함으로써 면역 균형을 회복시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 면역 및 염증 장애 및 이식 거부를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하고, 특히 PD-1 경로를 활성화시킴에 의해 완화될 수 있는 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 전신 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 염증성 장 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.
[0072] 하나의 양상에서, 본 발명은 항-PD-1 항체, 특히, 모노클로날 항-PD-항체, 예를 들어, 하기의 본원에 기재된 성질 중 하나 이상을 갖는 사람화된 모노클로날 항-PD-1 항체를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어, 10 nM 이하, 예를 들어 5 nM 이하의 높은 친화도로 정제된 재조합 사람 PD-1에 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 50 nM 이하의 친화도로 정제된 재조합 시노몰로구스 PD-1에 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-1, 특히 사람 PD-1에 선택적으로 결합한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항체는 마우스, 래트 또는 토끼 PD-1에 결합하지 않는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 차단하지 않는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 증진시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 예를 들어, IFNγ 생성의 억제, IL-17A 생성의 억제 또는 IL-21 생성의 억제에 의해, 하기 본원에 나타낸 바와 같은 여러 기능성 세포 검정에서 T 세포 활성을 약화시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 마우스 모델에서 사람 세포 축적을 억제하고, 마우스 모델에서 사람 염증 사이토킨의 수준을 감소시킨다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 선호될 수 있는 약동학 성질을 갖는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 선호될 수 있는 생물리학적 성질, 예를 들어, 수율, 품질, 안정성 또는 용해도를 갖는다. 이들 성질은 예를 들어, 하기 본원의 실시예에 나타낸다.
[0073] 항체 또는 면역글로불린의 일반화된 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이들 분자는 이종사량체 당단백질이고 전형적으로 약 150,000 돌턴이고 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 하나의 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 공유적으로 연결되어 이종이량체를 형성하고, 이종사량체 분자는 이종이량체의 2개의 동일한 중쇄 사이에 공유 디설파이드 연결을 통해 형성된다. 경쇄 및 중쇄는 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결되지만, 2개의 중쇄 간의 디설파이드 연결의 수는 면역글로불린 이소타입에 의해 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정한 공간의 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노 말단에서 가변 도메인 (VH = 가변 중쇄)에 이어서 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4), 및 CH1와 CH2 사이의 힌지 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(VL = 가변 경쇄) 및 카복시-말단 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL 도메인은 VH 도메인과 비-공유적으로 연합하는 반면, CL 도메인은 통상적으로 디설파이드 결합을 통해 CH1 도메인에 공유적으로 연결된다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 사료된다(문헌참조: Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663. Vargas-Madrazo E, Paz-Garcia E. J Mol Recognit. 2003;16(3):113-120) 가변 도메인은 또한 본원에서 가변 영역으로서 언급되고, 불변 도메인은 불변 영역으로서 언급된다.
[0074] 가변 도메인 내 특정 도메인은 상이한 항체 사이에서 매우 상이하고, 즉, “초가변”이다. 이들 초가변 도메인은 이의 특정 항원성 결정인자에 대한 각각의 특정 항체의 결합 특이성에 직접 관여하는 특정 잔기들을 함유한다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변은 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 루프 (HVL)로서 공지된 3개의 분절에 집중되어 있다. CDR은 문헌 (참조: Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)에서 서열 비교에 의해 한정되는 반면 HVL은 구조적으로 문헌(참조: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917)에 기재된 바와 같이 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 한정된다. 이들 2개의 방법이 약간 상이한 CDR 정체를 유도하는 경우, 구조적 한정이 바람직하다. 캐뱃에 의해 한정된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서 CDR-L1은 약 잔기 24-34에 위치하고, CDR-L2는 약 잔기 50-56에 위치하고, CDR-L3은 약 잔기 89-97에 위치하고; 중쇄 가변 도메인에서 CDR-H1은 약 잔기 31-35에 위치하고, CDR-H2는 약 잔기 50-65에 위치하고, CDR-H3은 약 잔기 95-102에 위치한다. CDR의 또 다른 정의는 화학적 계산 그룹 (Chemical Computing Group)(CCG) 넘버링에 따른다(문헌참조: Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 and Maier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610). 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 소정의 항체에 특이적인 고유하고 기능적 성질을 한정한다.
[0075] 중쇄 및 경쇄 각각 내에 있는 3개의 CDR은 덜 가변적인 경향이 있는 서열을 함유하는 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단에서 카복시 말단까지, FR 및 CDR은 하기의 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. FR의 대부분의 β-시트 구성은 각각의 쇄 내에 CDR이 서로 근접하도록 할 뿐만 아니라 다른 쇄 기원의 CDR에 근접하게 한다. 상기 수득한 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만(문헌참조: Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), 모든 CDR 잔기가 필연적으로 항원 결합에 직접 관여하는 것은 아니다.
[0076] FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 일반적으로 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 이펙터 기능을 매개한다. 일부 FR 잔기들은 적어도 3가지 방식으로 항원 결합에 큰 효과를 갖는 것으로 사료된다: 에피토프에 직접적으로 비공유적 결합에 의해, 하나 이상의 CDR 잔기와의 상호작용에 의해, 및 중쇄 및 경쇄 간의 접지면에 영향을 미침에 의해. 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지 않지만 다양한 Ig 이펙터 기능, 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 매개한다.
[0077] 척추동물 면역글로불린의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 2개의 명백하게 구분된 부류 카파(κ) 및 람다 (λ)로 할당된다. 대조적으로, 포유동물 면역글로불린의 중쇄는 불변 도메인의 서열에 따라 5개의 주요 부류 중 하나로 할당한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. IgG 및 IgA는 각각 추가로 서브부류 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 분류된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 호칭된다. 고유 면역글로불린의 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다.
[0078] 용어 "항체", "항-PD-1 항체", "사람화된 항-PD-1 항체", 및 "변이체 사람화된 항-PD-1 항체"는 광범위한 의미로 본원에 사용되고 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함하는), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), N- 또는 C-말단 절단부와 같은 최소 변형을 갖는 항체 및 항체 단편, 예를 들어, 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, PD-1 결합을 나타내는 항체의 가변 도메인 및 다른 부분을 포괄한다.
[0079] 용어 “모노클로날 항체"(mAb)는 실질적으로 균일한 항체 집단의 항체를 언급하고; 즉, 해당 집단의 개별 항체는 천연적으로 존재하는 돌연변이 또는 항체 중쇄로부터 C-말단 리신 제거와 같은 가능한 잘 알려진 변경 또는 아미노산 이성체화 또는 탈아미드화, 메티오닌 산화와 같은 해독 후 변형 또는 소량으로 존재할 수 있는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 결정인자, “에피토프”에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 동일한 에피토프에 지시된 실질적으로 균일한 집단을 지적하고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 기술 또는 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로 이해되여야만 하고, 상기 방법은 예를 들어, 하이브리도마 방법(문헌참조: Kohler et al., 1975, Nature 256:495), 또는 당업계에 공지된 재조합 DNA 방법 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호), 또는 문헌(참조: Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597)에 기재된 기술을 사용하는, 파아지 항체 라이브러리를 사용하여 재조합적으로 생산되는 모노클로날의 단리 방법을 포함한다.
[0080] 키메라 항체는 하나의 종 (예를 들어, 마우스와 같은 비-사람 포유동물) 기원의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 또 다른 종 (예를 들어, 사람) 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있고 제1 종 (예를 들어, 마우스)로부터 기원하는 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 제2 (예를 들어, 사람) 종 기원의 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결시키고 숙주를 상기 연결된 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환시켜 이것이 키메라 항체를 생산하도록 함에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 키메라 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이 또 다른 면역글로불린 부류 또는 이소타입으로 기원하거나 컨센서스 또는 생식선 서열으로부터 기원하는 모노클로날 항체내 상응하는 서열과 동일하거나, 이와 상동성이거나 이의 변이체인 것일 수 있다. 키메라 항체는 상기 항체의 단편을 포함할 수 있고, 단, 상기 항체 단편은 모 항체의 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, 동일한 에피토프로의 결합을 나타낸다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
[0081] 용어 "항체 단편", “항원 결합 단편”, "항-PD-1 항체 단편", "사람화된 항-PD-1 항체 단편", "변이체 사람화된 항-PD-1 항체 단편"은 가변 영역 또는 기능적 능력, 예를 들어, 특이적 PD-1 에피토프 결합이 보유된 전장 항-PD-1 항체의 일부를 언급한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0082] 항체 단편은 예를 들어, 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리된 전장 항체를 처리하여 유용한 항체 단편을 생성시킴에 의해 수득될 수 있다. 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위 및 나머지 “Fc” 단편을 갖는, “Fab” 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원-결합 항체 단편을 생성하기 위해 사용된다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
[0083] 본 발명에 따른 항체 단편의 또 다른 예는 Fab’ 단편이다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 C-말단에서 항체 힌지 영역으로부터 기원하는 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가의 잔기들이 존재한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 공지되어 있다.
[0084] “Fv" 단편은 단단한 비-공유 연합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진 완전한 항원-인지 및 결합 부위를 함유한다. 이러한 구성에서, VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용한다. 총체적으로, 6개 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다.
[0085] 항체 단편은 또한 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 단편을 포함할 수 있다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 도메인들이 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv 변이체이다. 단일쇄 Fv는 항원을 인지하고 결합할 수 있다. scFv 폴리펩타이드는 임의로 또한 VH와 VL 도메인 사이에 위치된 폴리펩타이드 링커를 함유하여 scFv에 의한 항원 결합을 위해 목적하는 3차원 구조의 형성을 촉진시킬 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).
[0086] 항체 단편은 또한 탠덤 Fd 분절을 형성할 수 이쏘, 상기 분절은 한쌍의 탠덤 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하여 한쌍의 항원 결합 영역을 형성한다. 이들 “선형 항체”는 예를 들어, 문헌(참조: Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062)에 기재된 바와 같이 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
[0087] 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 사람화된 항체 또는 항체 단편이다. 사람화된 항체 또는 사람화된 항체 단편은 면역글로불린 아미노산 서열 변이체, 또는 이의 단편을 포함하고, 소정의 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 실질적으로 비-사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. "임포트(import)" 서열로서 흔히 언급되는 비-사람 아미노산 서열은 전형적으로 “임포트” 항체 도메인, 특히, 가변 도메인으로 부터 취해진다. 일반적으로, 사람화된 항체는 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽이뵌, 비-사람 항체의 적어도 CDR 또는 HVL을 포함한다. 항체의 사람화 방법은 예를 들어, 문헌(참조: Almagro et al., (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633)에 또는 WO12092374 A2에 의해 기재된다.
[0088] 본 발명은 사람 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에 삽입된 마우스 리드(lead) 723C2로부터 유래된 CDR을 함유하는 특이적 사람화된 항-PD-1 항체를 기재한다. 추가로, 마우스 리드 723C2의 중쇄 CDR3의 시스테인은 마우스 리드 723C2("DC"에서 "DY"로)로부터 유래된 사람화 항 PD-1 항체에서 티로신으로 대체되었다.
[0089] 하나의 양상에서, 사람화된 항-PD-1 항체는 실질적으로 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv 단편에 함유된 바와 같이) 모두를 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-사람 면역글로불린의 것들에 상응하고, 본원에서는 구체적으로 CDR은 마우스 리드 723C2의 뮤린 서열이고 FR은 사람 면역글로불린 컨센서스 또는 생식선 서열을 갖는 것들이다. 또 다른 양상에서, 사람화된 항-PD-1 항체는 또한 면역글로불린 Fc 영역, 전형적으로 사람 면역글로불린의 영역의 적어도 일부를 포함한다. 통상적으로, 항체는 경쇄, 및 중쇄의 적어도 가변 도메인 둘다를 함유한다. 항체는 또한 적당하게 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[0090] 본 발명에 따른 사람화된 항-PD-1 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 이소타입을 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인일 수 있고, 여기서, 사람화된 항체는 세포독성 활성을 나타내고 이소타입이 전형적으로 IgG1인 것이 요구된다 상기 세포독성 활성이 요구되지 않는 경우, 상기 불변 도메인은 또 다른 이소타입, 예를 들어, IgG2일 수 있다. 대안적 사람화된 항-PD-1 항체는 하나 초과의 면역글로불린 부류 또는 이소형으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 목적하는 이펙터 기능을 최적하기 위해 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 당업계의 통상적 기술 범위내에 있다.
[0091] 하나의 양상에서, 본 발명의 항체의 불변 도메인은 IgG4Pro이고, 이는 하나의 대체 돌연변이(Ser228Pro)를 갖고 이는 Fab 아암 교환을 차단한다. 상기 Ser에서 Pro로의 돌연변이는 IgG4 백본의 힌지 영역에 있고, 일반적으로 Ser228Pro로 알려져 있지만, 중쇄에서 이의 위치는 예를 들어 IgG1과 IgG4 사이의 힌지 길이의 가변 영역의 길이 및/또는 차이에 따라 몇 가지 아미노산에 따라 다양할 수 있다. 힌지 영역 (Cys-Pro-Ser-Cys-Pro)에서 Ser에서 Pro로의 돌연변이는 본원에서 “Ser228Pro”로서 언급되고, 중쇄에서 이의 위치와는 무관하다. 또 다른 양상에서, 본 발명의 항체의 불변 도메인은 IgG1KO이고, 이는 힌지 영역에서 2개의 돌연변이, Leu234Ala 및 Leu235Ala를 가져 이펙터 기능을 감소시킨다(ADCC).
[0092] 사람화된 항-PD-1 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모 서열에 정확하게 상응할 필요는 없다. 예를 들어, 임포트 CDR, 또는 HVL, 또는 컨센서스 또는 생식계열 FR 서열 내 하나 이상의 잔기는 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변경(예를 들어, 돌연변이유발)되어 수득한 아미노산 잔기는 모 서열에서의 상응하는 위치에서 본래의 잔기와 더 이상 동일하지 않을 수 있지만 상기 항체는 그럼에도 불구하고 PD-1에 결합하는 기능을 보유할 수 있다. 상기 변형은 전형적으로 광범위하지 않고 보존적 변형이다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 75%는 모 컨센서스 또는 생식선 FR 및 임포트 CDR 서열의 것들에 상응하고, 보다 흔히 적어도 90%, 및 가장 빈번하게 95% 초과, 또는 98% 초과, 또는 99% 초과가 그러하다.
[0093] 중쇄와 경쇄 가변 영역 간의 접지면 ("VL-VH 접지면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기들은 서로에 대해 2개의 쇄의 근접성 또는 배향성에 영향을 미치는 것들이다. 쇄간 상호작용에 관여할 수 있는 특정 잔기들은 VL 잔기들 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, 및 98 및 VH 잔기들 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, 및 103 (문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987))에 제시된 넘버링 시스템을 사용하여)을 포함한다. 미국 특허 제6,407,213호는 또한 VL 잔기 43 및 85, 및 VH 잔기 43 및 60과 같은 잔기들이 또한 상기 상호작용에 관여할 수 있는지를 논의한다. 이들 잔기들은 단지 사람 IgG에 대해 지정된 것이지만, 이들은 다양한 종에 걸쳐 적용될 수 있다. 합리적으로 쇄간 상호작용에 관여할 것으로 예상되는 중요한 항체 잔기들은 컨센서스 서열로의 치환을 위해 선택된다.
[0094] 용어 "컨센서스 서열" 및 "컨센서스 항체"는 임의의 특정 부류, 이소타입 또는 서브유닛 구조, 예를 들어, 사람 면역글로불린 가변 도메인의 모든 면역글로불린 내 각각의 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 언급한다. 상기 컨센서스 서열은 특정 종 또는 많은 종의 면역글로불린을 기반으로 할 수 있다. “컨센서스" 서열, 구조 또는 항체는 특정 구현예에 기재된 바와 같은 컨센서스 사람 서열을 포함하고, 임의의 특정 부류, 이소형 또는 서브유닛 구조의 모든 사람 면역글로불린 내 각각의 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 언급하는 것으로 이해된다. 따라서, 컨센서스 서열은 각각의 위치에서 하나 이상의 공지된 면역글로불린에 존재하지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열과 정확하게 동일하지 않을 수 있는 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 가변 영역 컨센서스 서열은 임의의 천연적으로 생성된 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득되지 않는다. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., and variants thereof. 중쇄 및 경쇄 컨센서스 서열, 및 이의 변이체의 FR은 사람화된 항-PD-1 항체의 제조를 위해 유용한 서열을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,037,454호 및 제6,054,297호를 참조한다.
[0095] 사람 생식선 서열은 천연적으로 사람 집단에서 발견된다. 이들 생식선 유전자들의 조합은 항체 다양성을 생성한다. 항체의 경쇄에 대한 생식선 항체 서열은 보존된 사람 생식선 카파 또는 람다 v-유전자들 및 j-유전자들로부터 기원한다. 유사하게, 중쇄 서열은 생식선 v-, d- 및 j-유전자로부터 기원한다(문헌참조: LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001).
[0096] "단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 항체의 천연 환경의 오염 성분들은 항체의 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 또는 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있다. 하나의 양상에서, 항체는 적어도 95중량% 초과의 항체로 정제되고, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과로 정제된다.
[0097] 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 이것이 생산되는 재조합 세포 내 동일계 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 재조합 세포성 물질이 제거되는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
[0098] 본 발명에 따라 사용된 바와 같은 용어 "항체 수행능"은 항원의 항체 인지 또는 생체내 항체의 효과에 기여하는 인자들/성질들을 언급한다. 항체의 아미노산 서열 내 변화는 폴딩과 같은 항체 성질에 영향을 미칠 수 있고, 물리적 인자들, 예를 들어, 항원으로의 항체의 초기 결합율(ka), 항원으로부터 항체의 해리 상수(kd), 항원에 대한 항체의 친화성 상수(Kd), 항체의 형태, 단백질 안정성 및 항체의 반감기에 영향을 줄 수 있다.
[0099] 본 발명에 따라 사용되는 용어 "효능제 항체" 또는 "효능성 항체"는 PD-1에 결합할 때 PD-1 리간드 PD-L1에 의해 유도되는 적어도 하나의 생물학적 활성을 유도하는 항체를 언급한다. 하나의 양상에서, 유도는 효능제 항체의 부재 하의 유도와 비교할 때 통계학적으로 유의적이다. 하나의 양상에서, 항체는 예를 들어, 하기의 본원에 기재된 실시예 중 하나에서와 같이 측정되는 경우, 적어도 하나의 생물학적 활성이 효능제 항체의 부재하에서 보다 적어도 약 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 5%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 초과로 유도되는 경우 효능제 항체이다. 일부 구현예에서, “효능제 항체”는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 증진시킨다. PD-1 효능제 성질을 검출하기 위한 예시적인 검정은 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있다.
[00100] "다중특이성"은 2개 이상의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개 이상의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 단백질을 지칭한다.
[00101] “이중특이적"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 단백질을 지칭한다.
[00102] 일부 구현예에서, 본 발명의 PD-1 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다중특이적 항체이다. 본원에 제공된 PD-1에 특이적으로 결합하는 단일특이적 항체는 이중특이적 항체로 가공될 수 있고, 이는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
[00103] 전장 이중특이적 항체는 예를 들어 각각의 반쪽 분자에서 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입함으로써 무세포 환경에서 또는 공동 발현을 사용하여 시험관 내에서 뚜렷한 특이성을 갖는 2개의 항체 반쪽 분자의 이종이량체 형성을 선호하는, 2개의 단일특이적 2가 항체 간의 Fab 아암 교환(예를 들어, 반쪽 분자 교환, 하나의 중쇄-경쇄 쌍 교환)을 사용하여 생성될 수 있다. Fab 아암 교환 반응은 디설파이드 결합의 결과이다.
[00104] 이중특이적 항체는 또한 트리오맙(Triomab)/쿠아드로마(Quadroma)(Trion Pharma/Fresenius Biotech), 크놉-인-홀(Knob-in-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기 유도 CH3 상호작용(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y(Genentech), 가닥 교환 가공된 도메인 바디(SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic(Merus) 및 DuoBody® 제품(Genmab A/S)과 같은 디자인을 사용하여 생성될 수 있다.
[00105] 예를 들어, 이중특이적 PD-1/CD2, 이중특이적 PD-1/CD48, 이중특이적 PD-1/CD11a 또는 PD-1/CD3 항체는 본원에 기재된 PD-1 항체의 VH/VL 도메인, 또는 공개된 항-PD-1 효능제 항체의 임의의 VH/VL 영역 및 공개된 항-CD2, 항-CD48, 항-CD11a 또는 항-CD3 항체의 임의의 VH/VL 영역 각각을 사용하여 생성될 수 있다.
[00106] 본 발명의 또 다른 구현예는 PD-1에 결합하는 제1 도메인 및 CD2, CD48, CD11a 또는 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
[00107] 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일한" 또는 "퍼센트 동일성"은 최대 상응성으로 비교되고 정렬되는 경우 동일하거나 동일한 특정 퍼센트의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기들을 갖는 2개의 이상의 서열 또는 서브서열을 언급한다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 제2 아미노산 서열 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열 내에 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 (예를 들어, 중첩 위치) × 100)이다. 일부 구현예에서, 비교되는 2개의 서열은 갭이 적당히 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다(예를 들어, 비교되는 서열 보다 더 연장되는 추가의 서열을 배제한. 예를 들어, 가변 영역 서열이 비교되는 경우, 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열 간의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 서열 둘다에서 동일한 위치에서의 CDR(예를 들어, 각각의 서열의 CDR-H1)을 언급한다.
[00108] 2개의 서열 간의 퍼센트 동일성 또는 퍼센트 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다. 2개 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 문헌(참조: Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 문헌(참조: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 관심 대상의 단백질을 암호화하는 핵산과 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어 길이=12를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 관심 대상의 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭화된 정렬을 수득하기 위해, 갭화된 BLAST는 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 반복된 검색을 수행하여 분자 (Id.)간의 먼 관계를 검출할 수 있다. BLAST, 갭화된 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLASTN)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-제한적인 예는 문헌 (참조: Myers and Miller, CABIOS (1989))의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고 문헌(참조: Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5)에기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌(참조: Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8)에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 연구의 민감성 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup=2인 경우, 비교되는 2개의 서열 중 유사 영역이 정렬된 잔기들의 쌍을 조사함에 의해 발견되고; ktup=1인 경우, 단일 정렬된 아미노산이 조사된다. ktup은 단백질 서열에 대해 2 또는 1로 또는 DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup이 특정되지 않은 경우의 디폴트는 단백질에 대해 2이고 DNA에 대해 6이다. 대안적으로, 단백질 서열 정렬은 문헌(참조: Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402)에 의해 기재된 바와 같이, CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
[00109] 핵산 서열은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치되는 경우 “작동적으로 연결된”이다. 예를 들어, 핵산 전구서열 또는 분비 리더는 이것이 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있거나; 리보솜 결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키기 위해 위치되는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로,, "작동적으로 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속성이고, 분비 리더의 경우에, 연속성이고 판독 프레임에 있다. 그러나, 인핸서는 임의로 연속성이다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 성취될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있다.
[00110] 본원에 사용된 바와 같은, 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 모든 상기 지명은 이의 후손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질감염될 수 있는, 전달 횟수에 관계없이 1차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다.
[00111] 본 발명에 따른 치료 목적을 위한 용어 “포유류”는 사람, 가정 및 농장 동물, 및 동물원 또는 스포츠 동물, 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소등을 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 언급한다. 바람직하게, 포유동물은 사람이다.
[00112] 본원에 사용된 바와 같은 "장애"는 본원에 기재된 항-PD-1 항체, 특히, 사람화된 항-PD-1 항체를 사용한 치료가 이득이 되는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물이 미지의 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이다.
[00113] 본원에서 사용되는 용어 "PD-1 경로 장애" 또는 "PD-1 경로 질환"은 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절함으로써, 특히 PD-1 경로를 활성화함으로써 완화될 수 있는 병태를 언급한다. "PD-1 경로 장애" 또는 "PD-1 경로 질환"은 PD-1이 발현되는 T-세포 관련 질환을 포함하고, "PD-1 경로 장애" 또는 "PD-1 경로 질환"은 또한 PD-1을 발현하고 만성 염증 및 자가면역 질환의 구동체이며 PD-1 발현 T 세포 활성의 약화 및/또는 면역 반응의 하향 조절이 요구되는 활성화된 자동 반응성 T 세포를 특징으로 하는 병태를 포함한다. PD-1 경로 장애의 예는 전신 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 염증성 장 질환과 같은 질환 또는 장애를 포함한다.
[00114] 용어 “특이적으로 결합한다” 등은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성함을 의미한다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지를 결정하기 위한 방법은 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 하나의 구현예에서, 특이적 결합은 본원 실시예 섹션에서 기재된 친화성 결합 방법에 따라 약 1 x 10.-7 M (100 nM) 이하의 KD를 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 본원 실시예 섹션에서 기재된 친화성 결합 방법에 따라 약 5 x 10-8 M (50 nM) 이하의 KD를 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 본원 실시예 섹션에서 기재된 친화성 결합 방법에 따라 약 1 x 10-8 M (10 nM) 이하의 KD를 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 본원 실시예 섹션에서 기재된 친화성 결합 방법에 따라 약 5 x 10-9 M (5 nM) 이하의 KD를 특징으로 한다. 사람 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 그러나 다른 종 기원의 PD-1 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
[00115] 용어 "피하 투여"는 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내로 약물 용기로부터 상대적으로 느린 지속적 전달에 의한 본 발명의 약물, 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 도입을 언급한다. 하부 조직으로부터 이격되게 위로 피부를 핀칭하거나 드로잉하면 포켓을 생성할 수 있다.
[00116] 용어 “피하 주입"은 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내로 이에 제한되지 않지만 30분 이하 또는 90분 이하를 포함하는 시기 동안 약물 용기로부터 상대적으로 느린 지속적 전달에 의한 본 발명의 약물, 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 도입을 언급한다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 사람 환자의 피부 아래 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 수행될 수 있고, 여기서, 상기 펌프는 소정량의 약물을 30분, 90분과 같은 소정의 시기 동안 또는 치료 용법 전반에 걸친 시기 동안 전달한다.
[00117] 용어 "피하 볼러스"는 동물 또는 사람 환자의 피부 바로 아래로 약물 투여를 언급하고, 여기서, 볼러스 약물 전달은 대략 15분 미만이고; 또 다른 양상에서, 5분 미만이고 여전히 또 다른 양상에서 60초 미만이다. 심지어 여전히 또 다른 양상에서, 투여는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에 있고, 여기서, 상기 포켓은 피부를 하부 조직으로부터 격리되게 위로 핀칭하거나 드로잉함에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, "피하 볼러스"는 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대략 15분 미만, 또 다른 양상에서 5분 미만, 여전히 다른 양상에서 60초 미만 내에 사람 환자에게 투여하는 것을 지칭한다.
[00118] 용어 "치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 증상 중 하나 이상을 경감시키거나 개선시키는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 언급하기 위해 사용된다. 그렇게 함으로써 상기 양은 환자에게 이로운 결과를 가져다 준다. 효능은 치료될 병태에 의존하여 통상적인 방식으로 측정될 수 있다.
[00119] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료요법"은 하나 이상의 증상의 완화 또는 경감, 퇴행, 질환 또는 장애 진행의 서행 또는 중단을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의의 임상적으로 요구될 수 있거나 이로운 효과를 유도하는, 질환 또는 장애에 대한 예방학적 또는 억제성 조치뿐만 아니라 치료학적 조치를 포함하는 것으로 의미된다. 따라서, 예를 들어, 용어 치료는 질환 또는 장애의 증상의 개시 전, 또는 후에 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거함을 포함한다. 또 다른 예로서, 용어는 질환의 증상을 퇴치하기 위해 질환의 임상적 증상 후 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여를 포함한다. 추가로, 개시 및 임상적 증상이 발병된 후 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는 조직 손상의 정도 또는 전이의 양 또는 전이 정도, 치료가 질환의 개선을 유도할지의 여부와 같은 질환 또는 장애의 임상적 파라미터에 영향을 미치고 본원에 사용된 바와 같은 “치료” 또는 “치료요법”을 포함한다. 더우기, 단독으로 또는 또 다른 치료학적 제제와 조합된 본 발명의 조성물이 항-PD-1 항체 조성물 또는 이의 항원 결합 단편의 사용 부재하의 증상과 비교하여 치료 중인 장애의 적어도 하나의 증상을 경감시키거나 개선시키는 한, 상기 결과는 장애의 모든 증상이 경감되거나 경감되지 않든 상관 없이 근본 장애의 효과적인 치료인 것으로 고려되어야 한다.
[00120] 용어 “팩키지 삽입물”은 상기 치료 제품의 사용과 관련된 징후, 용도, 투여, 사용 금지 사유 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한, 치료학적 제품의 상업 팩키지에 관례상 포함되는 지침서를 언급하기 위해 사용된다.
[00121] 항체
[00122] 본원에 기재되고 개시된 것은 항-PD-1 항체, 특히 사람화된 항-PD-1 항체, 및 본 발명의 항-PD-1 항체를 포함하는 조성물 및 제조 물품이다. 또한 기재된 것은 항-PD-1 항체의 항원-결합 단편이다. 항-PD-1 항체 및 이의 항원-결합 단편은 다양한 질환 또는 장애, 특히 PD-1을 발현하고 만성 염증 및 자가면역 질환의 구동체인 활성화된 자동 반응성 T 세포를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 각각 PD-1 에피토프를 특이적으로 인지하는 적어도 일부를 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 효능제 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편이다.
[00123] 본 발명에 따른 항-PD-1 항체의 생성 및 이들의 특징 분석은 실시예에 기재되어 있다. 초기 특징 분석에서, 항-PD-1 키메라 리드 723C2는 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 월등한 항체 수행능에 기초하여 선택되었다. 변이체 라이브러리는 키메라 리드의 CDR을 사람 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR에 위치시키고 추가로 상이한 개조와 함께 상기 FR을 가공함에 의해 생성하였다. 추가로, 마우스 리드 723C2의 중쇄 CDR3의 시스테인은 마우스 리드 723C2("DC"에서 "DY"로)로부터 유래된 사람화된 항 PD-1 항체에서 티로신으로 대체되었다. "DC"에서 "DY"로의 변화는 항체의 약리학적 성질에 영향을 미치지 않는다. 사람화된 항체의 생성을 위한 공정은 실시예에 기재되어 있다.
[00124] 대표적인 마우스 리드의 가변 영역의 아미노산 서열은 표 1 및 2에 나타낸다. 이들 마우스 리드의 CDR 영역 및 리드 723C2의 가공된 변이체의 CDR 영역은 표 3 및 4에 나타낸다.
[표 1] 항-PD-1 마우스 리드 - VK 서열
Figure pct00001
[표 2] 항-PD-1 마우스 리드 - VH 서열
Figure pct00002
[00125] 다양한 마우스 항체의 마우스 경쇄 및 중쇄 CDR은 각각 표 3 및 표 4에 나타낸다. 표 3 및 4는 또한 사람화 공정을 통해 마우스 항체 723C2로부터 유래된 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 보여준다.
[표 3] 경쇄 CDR 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 4] 중쇄 CDR 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
[00126] 화학적 계산 그룹 (Chemical Computing Group)(CCG) 넘버링에 따라 정의된 표 3 및 4에서 상기 열거된 CDR은 밑줄쳐져 있다(문헌참조: Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 and Maier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610).
[00127] 마우스 항체 723C2로부터 유래된 대표적인 수의 사람화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 제공되고 표 5 및 표 6에 나타낸다.
[표 5] 사람화된 723C2-VK 서열
Figure pct00007
[표 6] 사람화된 723C2-VH 서열
Figure pct00008
[00128] 마우스 항체 723C2로부터 유래된 사람화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 선택된 조합은 항체 A, B, C, D 및 E를 생성하였다:
항체 A: 723C2-IgG4Pro-463-60과 IgK-463-60 (중쇄 가변 영역 723C2VH-463-60 및 경쇄 가변 영역 723C2VK-463-60);
항체 B: 723C2-IgG4Pro-461-41과 IgK-462-07 (중쇄 가변 영역 723C2VH-461-41 및 경쇄 가변 영역 723C2VK-462-07);
항체 C: 723C2-IgG4Pro-461-47과 IgK-462-07 (중쇄 가변 영역 723C2VH-461-47 및 경쇄 가변 영역 723C2VK-462-07);
항체 D: 723C2-IgG4Pro-461-44와 IgK-462-08 (중쇄 가변 영역 723C2VH-461-44 및 경쇄 가변 영역 723C2VK-462-08);
항체 E: 723C2-IgG4Pro-461-40과 IgK-462-08 (중쇄 가변 영역 723C2VH-461-40 및 경쇄 가변 영역 723C2VK-462-08);
[00129] 항체 A, B, C, D 및 E는 표 7에 나타낸 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는다.
[표 7] 항체 A, B, C, D 및 E에 대한 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
[00130] 항체 A, B, C, D, 및 E의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표 7에서 밑줄쳐져 있다. 중쇄 불변 영역에서 힌지 영역은 볼드체로 나타내고 Ser228Pro 돌연변이는 박스로 나타낸다.
[00131] 마우스 리드 723C2는 또한 사람 IgG1WT, IgG1KO, 및 IgG4Pro 포맷으로 전환된다. IgG4Pro는 힌지 영역에서 하나의 돌연변이, Ser228Pro를 갖고, 이는 Fab-아암 교환을 차단한다. IgG1KO는 힌지 영역에서 2개의 돌연변이, Leu234Ala 및 Leu235Ala를 가져 이펙터 기능(ADCC)을 감소시킨다.
[00132] 사람 IgG1WT, IgG1KO, 및 IgG4Pro 포맷에서 키메라 723C2는 표 8에 나타낸다.
[표 8] 사람 IgG1WT, IgG1KO 및 IgG4Pro에서 키메라 723C2에 대한 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
H-CDR3에서 DC로부터 DY로의 변화에 상응하는 아미노산은 표 8에서 아미노산 서열에서 밑줄쳐져 있다.
[00133] 사람화 및 아미노산 서열 변이체
[00134] 추가의 변이체 PD-1 항체 및 항체 단편은 표 3 및 4에 도시된 CDR 세트를 기반으로 가공될 수 있다. 상기 변이체 항-PD-1 항체 및 항체 단편에서, CDR의 아미노산 서열은 변화되지 않은 상태로 남아있지만 주변 영역, 예를 들어, FR 영역들이 가공될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 항-PD-1 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드 변화를 항-PD-1 항체 DNA로 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변이체는 예를 들어, 본원의 실시예의 항-PD-1 항체의 아미노산 서열 내 잔기들로부터의 결실 및/또는 잔기들로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 이르도록 수행되고, 단, 상기 최종 작제물은 목적하는 특징을 갖는다. 아미노산 변화는 또한 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 사람화되거나 변이체 항-PD-1 항체의 해독 후 공정을 변경시킬 수 있다.
[00135] 일부 구현예에서, 본 발명은 항-PD-1-항체 또는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 갖는 이의 항체 단편을 포함하고, 상기 가변 중쇄 아미노산 서열 및 가변 경쇄 아미노산 서열은 표 1, 2, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 또는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
[00136] 일부 구현예에서, 본 발명은 항-PD-1-항체 또는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 갖는 이의 항체 단편을 포함하고, 상기 가변 중쇄 아미노산 서열 및 가변 경쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 131, 133, 135, 137 또는 139 및 서열번호 125, 127 또는 129의 아미노산 서열에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
[00137] 일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 갖는 항-PD-1-항체를 포함하고, 상기 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열은 표 7 및 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
[00138] 항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 본래의 당화 패턴을 변화시킴을 포함한다. 이와 관련하여 용어 "변화"는 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고/시키거나 항체에 이전에 존재하지 않은 하나 이상의 당화 부위를 첨가함을 의미한다. 예를 들어, 항체는 아스파라긴 297(예를 들어, N297A, N297G)을 대체하여 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소 복합체 매개 글리코실화를 제거하기 위해 사람 IgG1 중쇄의 위치 297에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
[00139] 일부 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-PD-1 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 항-PD-1 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우에)으로부터의 단리, 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발에 의한 제조, PCR 돌연변이유발, 및 항-PD-1 항체의 조기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 바와 같이 핵산 분자와 엄중 조건하에 하이브리드화하는 핵산 분자를 포괄하고, 이로써 본 발명의 범위내에서 용어 “엄중 조건”은 예를 들어, 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS를 포함하는 완충액에서 하이브리드화 또는 65℃에서 5XSSC 및 1% SDS를 포함하는 완충액에서 하이브리드화를 포함할 수 있고, 이 둘다는 65℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS로 세척한다. 예시적인 엄중 하이브리드화 조건은 또한 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 및 1% SDS의 완충액에서 하이브리드화 및 45℃에서 1 x SSC에서 세척을 포함할 수 있다.
[00140] 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위해 개발된 기술들이 있다. 단편들은 온전한 항체의 단백질용해 분해를 통해 유래할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; and Brennan et al., 1985, Science 229:81). 대안적으로, 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 직접적으로 이. 콜리로부터 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). 또 다른 접근법에 의해, F(ab')2 단편들은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명하다.
[00141] 하나의 양상에서, 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 글리코실화 또는 탈아미드화와 같은 변형을 포함할 수 있다.
[00142] 특정 구현예에서, 온전한 항체 보다는 항-PD-1 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어, 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프의 항체 단편으로의 혼입에 의해 성취될 수 있다. 하나의 방법에서, 항체 단편의 적당한 영역은 변화 (예를 들어, 돌연변이)될 수 있거나, 에피토프는 펩타이드 태그에 혼입될 수 있고 이는 이어서 예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 말단에서 또는 중간에서 항체와 융합된다. 예를 들어, 문헌(WO 96/32478)을 참조한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 단편은 또한 전장 IgG1 스캐폴드의 사용이 바람직하지 않은 경우, 사람 혈청 알부민에 융합되어 혈청 반감기를 증가시킬 수도 있다. 사람 혈청 알부민과 항체 단편의 이러한 융합 단백질은 2개의 상이한 항체 단편이 결합가를 증가시키거나 연장된 혈청 반감기를 갖는 이중특이적 결합 단백질을 생성하기 위해 융합될 필요가 있는 상황에서 유리할 수 있다(예를 들어 WO05077042 A2 참조).
[00143] 다른 구현예에서, 본 발명은 항-PD-1 항체의 공유 변형을 포함한다. 공유 변형은 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복실 측쇄 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기 또는 세릴 또는 트레오닐 잔기의 변형을 포함한다. 또 다른 유형의 공유 변형은 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 항체에 커플링시킴을 포함한다. 상기 변형은 적용될 수 있는 경우 항체의 화학적 합성 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 수행될 수 있다. 항체의 다른 유형의 공유 변형은, 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 아미노- 또는 카복시-말단 잔기들과 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시킴에 의해 분자에 도입될 수 있다.
[00144] 항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 성취될 수 있다. 화학적 탈당화는 문헌(참조: Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131)에 기재되어 있다. 항체 상에 탄수화물 잔기의 호소적 절단은 문헌(참조: Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350)에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용함에 의해 성취될 수 있다.
[00145] 또 다른 유형의 유용한 공유 변형은 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호 중 하나 이상에 제시된 방식으로 연결시킴을 포함한다.
[00146] 에피토프 결합
[00147] 또 다른 양상에서, 본 발명은 특이적 "PD-1 항원 에피토프" 및 "PD-1 에피토프"를 인지하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
[00148] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “PD-1 항원 에피토프” 및 “PD-1 에피토프”는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합할 수 있는 분자(예를 들어, 펩타이드) 또는 분자의 단편을 언급한다. 이들 용어는 추가로 예를 들어 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 단편에 의해 인지되는 PD-1 항원 결정기를 포함한다.
[00149] PD-1 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩타이드 등에 포함될 수 있다. 상기 에피토프는 대부분 통상적으로 단백질, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 모방체 (즉, PD-1 항원의 항체 결합 성질을 모방하는 유기 화합물), 또는 이의 조합체이다.
[00150] 하나의 양상에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 생리학적 리간드의 결합을 모방하는 방식으로 PD-1 에피토프에 특이적으로 결합하여 항체-매개 효능작용을 야기한다.
[00151] 본 발명은 또한 PD-1에 대한 결합에 대하여 본 발명에 따른 항-PD-1 항체와 경쟁하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 PD-1에 대한 결합에 대하여 본원에 기재된 항체 A, 항체 B, 항체 C, 항체 D 또는 항체 E와 경쟁하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 경쟁 검정은 예를 들어, 문헌(참조: PLoS One. 2014; 9(3): e92451 using a biosensor, or PLoS One 2020 Mar 5;15(3):e0229206)에 기재된 바와 같이, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다.
[00152] 치료학적 용도
[00153] 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 경로 장애를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다.
[00154] 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약물로서 유용하다.
[00155] 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 경로를 활성화시키기에 충분한 양으로 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하는데 사용하기 위해 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 조절하기 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[00156] 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 면역 반응을 하향 조절하기에 충분한 양으로 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 PD-1 발현 T 세포 활성을 약화시키기 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[00157] 하나의 구현예에서, PD-1 경로 질환 또는 장애는 전신 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 염증성 장 질환이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 사람 환자에게 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 사람 환자에서 전신성 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 염증성 장 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 전신성 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 염증성 장 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 전신성 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 또는 염증성 장 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[00158] 하나의 구현예에서, PD-1 경로 질환 또는 장애는 만성 또는 급성, 예를 들어, 만성 염증 질환 또는 급성 염증성 질환이다. 하나의 구현예에서, PD-1 경로 질환 또는 장애는 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 페이로니 질환(Peyronie's Disease), 셀리악 질환(coeliac disease), 담낭 질환, 필로니달 질환(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 건선성 관절염, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, 1형 당뇨병, 라임 질환, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스), 길랭-바 증후군(Guillain-Barr syndrome), 아토피 피부염, 자가면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브스 질환, IgA 신장병증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 메니에르 질환(Meniere's disease), 천포창, 원발성 담즙성 간경변증, 유육종증, 피부경화증, 베게너 육아종증, 기타 자가면역 장애, 췌장염, 외상(수술), 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 심근 경색과 같은 허혈성 질환 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 심장 질환, 혈관내 응고, 골흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 저염소혈증, 태아-산모 내약성 결핍과 관련된 불임, 쇼그렌 증후군, 백반증, 중증 근무력증 또는 전신 경화증이다.
[00159] 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에게 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 사람 환자에서 상기 질환 또는 장애 중 하나를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 상기 질환 또는 장애 중 하나를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 사람 환자에서 상기 질환 또는 장애 중 하나를 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
[00160] 하나의 양상에서, 상기된 바와 같이 사용하기 위해 또는 상기된 바와 같은 용도에서 또는 상기된 바와 같은 방법에서 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효능제이다.
[00161] 비-치료학적 용도
[00162] 본원에 기재된 항체는 친화성 정제 제제로서 유용하다. 상기 공정에서, 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 단백질 A와 같은 고체상에 고정화된다. 고정화된 항체는 정제될 PD-1 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이후 상기 지지체는 적합한 용매로 세척하여 고정화된 항체에 결합된, PD-1 단백질을 제외한 샘플 내 실질적으로 모든 물질을 제거한다. 최종적으로, 지지체는 또 다른 적합한 용매로 세척하여 항체로부터 PD-1 단백질을 방출시킨다.
[00163] 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항-PD-1 항체 및 이의 단편은 또한 PD-1 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 진단 검정, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 PD-1 발현을 검출하는데 유용하다.
[00164] 일부 구현예에서, 예를 들어, 진단학적 목적을 위해 항체를 검출가능한 모이어티로 표지시키는 것이 유리하다. 수많은 검출가능한 표지가 가용하고, 방사능동위원소, 형광성 표지, 효소 기질 표지, 양자점(quantum dots) 등을 포함한다. 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 항체와 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고 상기 언급된 표지의 임의의 3개의 광범위 카테고리가 아비딘과 접합될 수 있거나 그 반대로 접합될 수 있다. 비오틴은 아비딘과 선택적으로 결합함에 따라서, 표지는 상기 간접적 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접적 접합을 성취하기 위해, 항체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합되고 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적 접합이 성취될 수 있다.
[00165] 예시적 방사능동위원소 표지는 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I를 포함한다. 항체는 예를 들어, 문헌(참조: Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs.)에 기재된 기술을 사용하여 방사능동위원소로 표지될 수 있다. 방사능활성은 예를 들어, 섬광 계수에 의해 측정될 수 있다.
[00166] 예시적인 형광성 표지는 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드로부터 유래된 표지를 포함하고, 예를 들어, 하기의 임의의 형광성 표지: 디알킬아미노쿠마린, 로다민 이소티오시아네이트, Alexa 350, Alexa 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/ 568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, 카복시로다민 6G, 카복시-X-로다민(ROX), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우, 쿠마린 343, 시아닌 염료(Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5), 단실, 다폭실, 디알킬아미노쿠마린,. DM-NERF, 에오신, 에리트로신, 플루오레세인, FA, 하이드록시쿠마린, IRDyes(IRD40, IRD 700, IRD 800), JOE, 리사민 로다민 B, 마리나 블루, 메톡시 쿠마린, 나프토 플루오레세인, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, PyMPO, 5-카복시-4',5,-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5, ,7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸아미노, 캐스케이드 블루, Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, 단실 클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-l,3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, 패시픽 블루(Pacific Blue), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석시닐플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 유로퓸 트리스비피리딘 디아민, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 디시아닌, 라졸라 블루 염료, 올피코시아닌, 알로코시아닌 B, 피코시아닌 C , 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트로시아닌, 피코에리트린 R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), 테트라메틸로다민 또는 텍사스 레드가 가용하다. 형광성 표지는 예를 들어, 문헌(참조: Current Protocols in Immunology, supra)에 기재된 것들과 같은 공지된 기술을 통해 항체에 접합될 수 있다. 형광성은 형광측정기로 정량할 수 있다.
[00167] 당업계에 공지된 다양한 널리-특징 분석된 효소-기질 표지들이 있다(문헌참조: 예를 들어, 검토를 위한 미국 특허 제4,275,149호). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들어, 변화는 분광화학적으로 측정될 수 있는 기질 내 색 변화일 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광성을 정량하기 위한 기술은 상기된 바와 같다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전기적으로 여기하게 되고 이어서 예를 들어, 화학발광측정기를 사용하여 측정될 수 있는 광을 방출할 수 있거나, 에너지를 형광 수용체에 공여한다.
[00168] 효소적 표지의 예는 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은 예를 들어, 문헌(참조: O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166)에 기재되어 있다.
[00169] 효소-기질 조합체의 예는 예를 들어 다음을 포함한다: 기질로서 수소 퍼옥시다제와 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO) (여기서, 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체, 예를 들어, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB)를 산화시킨다); 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼린 포스파타제 (AP); 및 발색성 기질과 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal), 예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광원성 기질 4-메틸움벨리페릴l-β-D-갈락토시다제.
[00170] 수많은 다른 효소-기질 조합체는 당업자에게 가용하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,318,980호를 참조한다.
[00171] 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 항체 단편은 비표지된 상태로 사용되고 항-PD-1 항체 또는 이의 단편과 결합하는 표지된 항체로 검출된다. 예를 들어, 표지된 항-사람 Fc, 또는 항-사람 Fab 항체는 비표지된 항-PD-1 항체 또는 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 비표지된 항-PD-1 항체 또는 이의 단편의 사용은 형광 표지가 이에 융합되는 항체 또는 항체 단편의 분자량을 증가시키고/시키거나 소수성을 증가시킴으로써 조직 침투를 감소시키기 때문에 보다 양호한 조직 침투를 달성하는 데 유리할 수 있다.
[00172] 본원에 기재된 항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접적 샌드위치 검정 및 면역침전 검정에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(참조: Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987))을 참조한다. 진단학적 키트
[00173] 본 발명의 사람화된 항-PD-1 항체는 진단학적 키트, 즉, 진단학적 검정을 수행하기 위한 지침서와 함께 소정량의 시약들의 팩키징된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 상기 키트는 검출가능한 발색단 또는 형관단을 제공하는 기질 전구체와 같은 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자를 포함할 수 있다. 추가로, 다른 첨가제, 예를 들어, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 검정의 민감성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 시약은 용해 시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.
[00174] 진단학적 키트
[00175] 항-PD-1 항체 또는 이의 단편은 진단학적 키트, 즉, 진단학적 검정을 수행하기 위한 지침서와 함께 소정량의 시약들의 팩키징된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 상기 키트는 검출가능한 발색단 또는 형관단을 제공하는 기질 전구체와 같은 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자를 포함할 수 있다. 추가로, 다른 첨가제, 예를 들어, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 검정의 민감성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 시약은 용해 시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.
[00176] 조성물 및 이의 투여
[00177] 본 발명에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 본원에 기재된 PD-1 경로 질환 또는 장애를 갖거나 이의 위험에 처한 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 추가로 PD-1 경로 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에서 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미하고, 예를 들어, 사람 및 특정 비-사람 포유류, 예를 들어, 영장류, 설치류 및 개를 포함한다. 본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 위해 구체적으로 의도된 대상체는 사람을 포함한다. 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
[00178] 하나의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
[00179] 다양한 전달 시스템은 공지되어 있고 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 유기체내, 점안 (eye drop), 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 주입, 볼러스 또는 주사에 의해 투여될 수 있고 다른 생리학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 상기 주사를 위한 제형은 예를 들어, 미리 충전된 시린지로 제조될 수 있다.
[00180] 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료학적 유효량의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
[00181] 전형적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 통상의 절차에 따라 사람에게 정맥내 또는 피하 투여를 위해 적합한 약제학적 조성물로서 제형화된다. 전형적으로, 주사에 의한 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중 용액이다. 필요한 경우, 약제는 또한 가용화제, 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나, 예를 들어, 활성제의 양을 표시한 앰푸울 또는 사쉐와 같은 밀폐로 밀봉된 용기에서 무수 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 단위 투여 형태에서 함께 혼합된다. 약제가 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배할 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰푸울은 투여 전 혼합될 수 있다.
[00182] 추가로, 약제학적 조성물은 (a) 동결 건조된 형태로 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 컨테이너 및 (b) 주사용의 약제학적으로 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 컨테이너를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 동결건조된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 임의로 이러한 용기(들)는, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지와 관련되어 있으며, 당해 통지는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
[00183] PD-1 경로 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 효과적인 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검정은 임의로 최적의 용량 범위의 동정을 도와주기 위해 사용될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 장애의 단계에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
[00184] 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 독성 및 치료학적 효능은 ED50 (집단의 50%에서 치료학적 유효량)를 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 큰 치료학적 지수를 나타내는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 바람직하다.
[00185] 세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용량은 전형적으로 거의 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 용량은 사용되는 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 의존하여 상기 범위내에서 다양할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 임의의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 치료학적 유효량은 처음에 세포 배양물 검정으로부터 평가될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 최대 절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 사용하여 보다 정확하게 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA 등에 의해 측정될 수 있다.
[00186] 하나의 구현예에서, 항-PD-1-항체는 규칙적인 간격으로 투여된다.
[00187] 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 1 mg/ml 내지 250 mg/ml, 예를 들어, 20 mg/ml 내지 200 mg/ml을 포함하는 용량으로 제형화될 수 있다.
[00188] 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 결합 제제에 접합되거나 비접합된 치료학적 제제를 추가로 포함할 수 있다.
[00189] 상기 조합 치료요법 투여는 질환 파라미터 (예를 들어, 증상의 중증도, 증상의 수 또는 재발 횟수)에 대해 부가적 또는 상승작용 효과를 가질 수 있다.
[00190] 조합 투여를 위한 치료학적 용법과 관련하여, 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료학적 제제와 동시에 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 치료학적 제제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 전 또는 후에 투여된다.
[00191] 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
[00192] 본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술에 관한 것이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 전장 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하는 임의의 목적하는 형태의 항-PD-1 항체를 암호화할 수 있다.
[00193] 항-PD-1 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)은 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 조절 또는 대조군 서열에 융합될 수 있고 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 각각은 독립적으로 온전한 항체의 생성을 가능하게 하는 사람 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부는 함께 융합되어 단일쇄 항체의 생성을 위한 주형을 제공할 수 있다.
[00194] 재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 클로닝을 위해 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 재조합 항체를 발현하기 위한 많은 적합한 벡터가 가용하다. 벡터 성분들은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
[00195] 항-PD-1 항체는 또한 융합 폴리펩타이드로서 생산될 수 있고, 여기서, 상기 항체는 이종성 폴리펩타이드, 예를 들어, 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드와 융합된다. 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 항-PD-1 항체 신호 서열을 인지하지 못하고 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 원핵 세포 신호 서열로 치환될 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 지질단백질, 열-안정성 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비를 위해, 고유 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 알파-인자 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함하는), 산 포스파타제, 씨. 알비칸스 글루코아밀라제, 또는 WO90/13646에 기재된 신호로부터 수득된 리더 서열로 대체될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 사용될 수 있다. 상기 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임으로 사람화된 항-PD-1 항체를 암호화하는 DNA에 연결된다.
[00196] 발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있도록 서열이고 복제 오리진 또는 자발적 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진은 대부분의 그람-음성 세균에 대해 적합하고, 2-u. 플라스미드 오리진은 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 오리진(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)는 포유동물 세포에서 클로닝 벡터를 위해 유용하다. 일반적으로, 복제 오리진 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 요구되지 않는다(SV40 오리진은 전형적으로 이것이 어얼리 프로모터를 함유하기 때문에 유일하게 사용될 수 있다).
[00197] 발현 및 클로닝 벡터는 발현의 동정을 촉진시키기 위해 선택가능한 마커를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택가능한 마커 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나 보충 영양요구성 결핍이거나, 다른 대안에서 복합 배지에 존재하지 않는 특정 영양물을 공급하는 단백질을 암호화하고, 예를 들어, 바실리(Bacilli)에 대해 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자이다.
[00198] 선택 계획의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고 따라서 선택 용법으로부터 생존한다. 상기 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포에 대해 통상의 선택가능한 마커는 사람화된 항-PD-1 항체를 암호화하는 핵산을 취득하는데 적격인 세포의 동정을 가능하게 하는 것들, 예를 들어, DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자들), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이다. DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 처음으로 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함에 의해 동정된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍인 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, DG44)이다.
[00199] 대안적으로, 항-PD-1 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주) 는 아미노글리코시드산 항생제, 예를 들어, 가나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택가능한 마커에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
[00200] 재조합 생산이 숙주 세포와 같은 효모 세포에서 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자(문헌참조: Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)는 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. TRP1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 (문헌참조: Jones, 1977, Genetics 85:12)에 대한 선택 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈에서 trp1 병변의 존재는 이어서 트립토판의 부재하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위해 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, ATCC 20,622 및 38,626와 같은 Leu2p-결핍 효모 균주는 LEU2 유전자를 함유하는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.
[00201] 추가로, 1.6 μm 환형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 소 키모신의 대량 생산을 위한 발현 시스템은 케이. 락티스에 대해 보고되었다(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙한 재조합 사람 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 보고되었다(문헌참조: Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
[00202] 발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고 항-PD-1 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기 위해 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 세균 프로모터가 또한 적합하다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 사람화된 항-PD-1 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgamo) (S.D.) 서열을 함유한다.
[00203] 많은 진핵 프로모터 서열은 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이고, 여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3’ 말단에는 AATAAA 서열이 있고 이는 폴리 A 꼬리의 암호화 서열 3’ 말단으로의 부가를 위한 신호일 수 있다. 모든 이들 서열은 적합하게 진핵 발현 벡터에 삽입된다.
[00204] 효모 숙주와 함께 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
[00205] 유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는다. 이들은 알콜 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 관여하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에서 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 문헌(참조: EP 73,657 또는 Baghban et al. Molecular Biotechnology (2019) 61:365-384)에 기재되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
[00206] 포유동물 숙주 세포에서 벡터로 부터의 항-PD-1 항체 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 파울폭스(fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해 , 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터에 의해 제어되고, 단 상기 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
[00207] SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터 (early and late promoter)는 또한 SV40 바이러스 복제 오리진을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 사람 사이토메갈로바이러스의 이메디에이트 어얼리 프로모터(immediate early promoter)는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하여, 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스 기원의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 사람 p-인터페론 cDNA의 발현을 기재하는 문헌(Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601)을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체는 프로모터로서 사용될 수 있다.
[00208] 재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 또 다른 유용한 요소는 고등 진핵 세포에 의해 항-PD-1 항체를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 사용되는 인핸서 서열이다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 전형적으로, 그러나, 진핵 세포 바이러스로부터 기원하는 인핸서가 사용된다. 이의 예는 복제 오리진의 후기 측면 상에 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진 후기 측면 상에 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 요소들을 증진시키는 기재에 대해 문헌(Yaniv, 1982, Nature 297:17-18)을 참조한다. 인핸서는 항-PD-1 항체-암호화 서열에 대한 5’ 또는 3’ 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만 바람직하게 프로모터로부터 5’ 부위에 위치한다.
[00209] 진핵 숙주 세포 (효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 다른 다중세포 유기체 기원의 핵화된 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결을 위해 그리고 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유할 수 있다. 상기 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5’ 말단 및 때로는 3’ 비해독된 영역으로부터 가용하다. 이들 영역은 항-PD-1 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독된 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 문헌(WO94/11026) 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조한다. 일부 구현예에서, 항-ANGPT2 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 제5,888,809호를 참조하고; 이의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.)
[00210] 본원에서 벡터 내 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위해 적합한 숙주 세포는 상기된 원핵 세포, 효모. 또는 고등 진핵 세포이다. 상기 목적을 위해 적합한 원핵 세포는 유박테리아, 예를 들어, 그람-양성 또는 그람-음성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애, 예를 들어, 에스케리이치아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜리(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월에 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41), 슈도모나스, 예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 다른 균주가 적합하다. 이들 예는 제한하기 보다는 차라리 설명하기 위한 것이다.
[00211] 원핵 세포에 추가로, 진핵 세포 미생물, 예를 들어, 사상 진균류 또는 효모는 항-PD-1 항체-암호화 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(ccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 베이커 효모는 하등 진핵 숙주 유기체 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주는 통상적으로 가용하고 본원에서 유용하고, 예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 윅커아미(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토르스(Pichia pastors) (EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스, 예를 들어, 슈와니오마이세스 악시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균류, 예를 들어, 신경 포자, 페니실리움, 톨리포칼슘 및 톨리포클라듐, 및 아스퍼길루스 숙주, 예를 들어, 에이. 니듈란스(A. nidulans) 및 에이. 니거가 있다.
[00212] 당화된 항-PD-1 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다중세포 유기체로부터 유래한다. 무척추 세포의 예는 예를 들어, 다수의 바쿨로바이러스주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (애벌레), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) (누에)와 같은 숙주 기원의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포를 포함하는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 비아러스주는 대중에게 가용하고, 예를 들어, 오토그라파 캘리로니카 NPV (Autographa californica NPV)의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV (Bombyx mori NPV)의 Bm-5주가 있고, 상기 바이러스는 특히 스포도프테라 르푸기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
[00213] 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 타바코의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
[00214] 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 바이러스 벡터에 혼입될 수 있고, 즉, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 도입되고 이어서 바이러스를 사용한 감염 후 환자의 신체에서 발현된다.
[00215] 또 다른 양상에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양물 (조직 배양물) 중에 척추동물 세포의 증식은 통상적인 과정이 되고 기술은 광범위하게 가용하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR1(CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4216: 예를 들어, DG44); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251); 몽키 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 몽키 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep. G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., 1982, Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암종 세포주(Hep G2)를 포함한다.
[00216] 숙주 세포는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산을 위한 상기된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적당한 바와 같이 변형된 통상의 배양물 배지에서 배양한다.
[00217] 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어, 햄스 F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), Sigma-Aldrich Co.)는 숙주 세포를 배양하기 위해 적합하다. 추가로, 문헌 (참조: Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, WO 90/103430, 및 WO 87/00195 중 하나 이상)에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지에는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어. 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신), 미량 원소들(마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의된), 및 글루코스 또는 균등한 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 다른 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고 당업자에게 자명하다.
[00218] 재조합 기술을 사용하는 경우, 상기 항체는 원형질막주위 공간에서 세포내 생성될 수 있거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내 생산되는 경우, 상기 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출시키기 위해 파쇄될 수 있다. 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파괴물은 예를 들어 원심 분리 또는 한외 여과에 의해 제거 될 수 있다. 문헌(참조: Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167)은 이. 콜리의 원형질막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 과정을 기재한다. 간략하게, 세포 페이스트를 약 30분 초과 동안 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 해동시킨다. 세포 파괴물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 상기 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로 먼저, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF는 임의의 이전의 단계에서 단백질용해를 억제하기 위해 포함될 수 있고 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 항체를 단리할 수 있다.
[00219] 세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고 친화성 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A를 사용하여 사람 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 사람 감마3에 대해 추천된다(문헌참조: 예를 들어, Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 흔히 아가로스이지만 다른 매트릭스가 가용하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것 보다 신속한 유속 및 보다 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 상기 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술은 또한 회수될 항체에 의존하여 가용하다.
[00220] 임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 대상의 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 전형적으로 저염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
[00221] 또한 낮은, 중간 정도 및 높은 엄중도 조건하에, 특히 본원에 정의된 바와 같이 높은 엄중도 조건하에 항-PD01 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 나타난 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부 (예를 들어, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 하이브리드화하는 핵산이 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 길이가 적어도 15 (예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오타이드이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 항-PD-1 폴리펩타이드 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산 부분 또는 전부의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기재된 유형의 하이브리드화 핵산은 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다. 하나의 양상에서, “높은　엄중도　조건”은 길이가 적어도 100개 뉴클레오타이드인 프로브에 대해, 12 내지 24시간 동안 서던 블롯팅 절차 후 5×SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 50% 포름아미드에서 42℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 의미한다. 캐리어 물질은 최종적으로 65℃에서 0.2×SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 세척된다.
[00222] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 108 내지 123 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00223] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 92 내지 107 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00224] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 131, 서열번호 133, 서열번호 135, 서열번호 137 또는 서열번호 139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00225] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134, 서열번호 136 또는 서열번호 138 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00226] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 125, 서열번호 127 또는 서열번호 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00227] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 124, 서열번호 126 또는 서열번호 128 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00228] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 143, 서열번호 147, 서열번호 149, 서열번호 153 또는 서열번호 155 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00229] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 142, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 152 또는 서열번호 154 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00230] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 141, 서열번호 145 또는 서열번호 151 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00231] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 140, 서열번호 144 또는 서열번호 150 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00232] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 159, 서열번호 161 또는 서열번호 163 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00233] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 158, 서열번호 160 또는 서열번호 162 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00234] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00235] 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 156의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
[00236] 제품
[00237] 또 다른 양상에서, 상기된 장애의 치료를 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 포함된다. 제품은 컨테이너 및 표지를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜브를 포함한다. 상기 용기들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재질로 제조될 수 있다. 컨테이너는 병태를 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 잇다. 조성물 내 활성제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 컨테이너 상에 또는 이와 연합된 표지는 선택된 병태를 치료하기 위해 사용된다. 제품은 추가로 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 시린지 및 팩키지 삽입물을 사용 지침서와 함께 포함하는, 상업적 및 사용자 견지에서 요구될 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
[00238] 본 발명은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도가 없는 하기의 실시예에 추가로 기재된다.
[00239] 실시예
[00240] 실시예 1 항체 생성 (면역화)
MHC 유형 A, C, D, E, H, G 변종(strain) 마우스를 재조합 단량체 사람 PD-1 또는 사람 PD-1-사람Fc-His 단백질로 면역화하였다. 상기 재조합 단백질의 유전자 기호는 PDCD1이고 GeneID는 5133이다. 이어서, 결합을 위해 사람 PD-1 항원을 발현하는 CHO-사람 PD-1 세포를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 혈청학을 평가하였다. 선택된 혈청학적 양성 마우스에 B-세포 단리 전 최종 부스트를 제공하였다. 선택된 마우스 모두는 혈청에서 양성 항체 역가를 나타냈다. 양성 혈청 검사에서 항원 특이적 B 세포의 회수를 위해 비장 세포를 수거하였다. 모든 절차는 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다.
[00241] 실시예 2: 사람화된 항-PD-1 항체의 생성
마우스 리드 항체 723C2는 723C2의 마우스 가변 도메인과 사람 불변 IgG1WT, IgG1KO 또는 IgG4Pro 도메인으로 이루어진 키메라 항체로 전환시켰다. 마우스 항체 723C2 경쇄 가변 영역 (Vκ) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 서열은 상기 본원의 표 1 및 2에 나타낸다. IgG4Pro는 Fab-아암 교환을 방지하는 하나의 대체 돌연변이(Ser228Pro)를 갖는다. IgG1KO는 힌지 영역에서 2개의 돌연변이, Leu234Ala 및 Leu235Ala를 가져 이펙터 기능(ADCC)을 감소시킨다. 키메라 항체는 항체의 기능을 확인하고 올바른 서열이 수득되었는지를 확인하기 위해 생성된다. 사람 IgG1WT, IgG1KO, 및 IgG4Pro 포맷에서 키메라 723C2의 서열은 표 8에 나타낸다. 사람 IgG1WT 및 IgG4Pro에서 키메라 723C2는 H-CDR3에서의 돌연변이, DC에서 DY로의 돌연변이를 포함한다. 그러나 사람 IgG1KO에서 키메라 723C2는 돌연변이를 갖지 않는다. 상기 부위 내 돌연변이는 표 8에 나타낸다. 이어서, 항체의 가변 영역은 디자인 및 스크리닝 과정을 통해 사람화된다. 임의의 주어진 위치에서 사람 또는 마우스 잔기가 존재할 수 있는 방식으로 사람 및 마우스 잔기가 변화되는 라이브러리가 만들어졌다. 이러한 라이브러리는 사람 생식계열과 마우스 항체 간에 상이한 다른 아미노산에 대해 만들어졌다. 모체 마우스 항체의 기능을 유지하는 클론만이 선택되었다. 항체 723C2에 대해 대표적인 사람화된 가변 영역은 표 5 및 6에 나타낸다.
상기 방식으로, 항체 A, 항체 B, 항체 C, 항체 D, 및 항체 E는 마우스 723C2로부터 유래된 (사람 IgG4Pro/카파 백본으로 클로닝된) 사람화된 항체이다. 항체 A, B, C, D 및 E는 표 7에 나타낸다.
[00242] 실시예 3: 항체의 재조합 PD-1 단백질로의 결합
A) 재조합 사람 PD-1에 결합하는 사람 IgG4Pro 백본에서 키메라 항-PD-1 항체의 동역학 및 친화성은 하기에 나타낸다(표 9). ProteOn XPR36(Biorad, Hercules, CA)을 사용하여 단일 컬럼 정제 후 일시적 형질감염으로부터 생성된 물질을 사용하여 동력학 및 결합 친화성을 측정하였다.
[표 9]
Figure pct00018
B) 마우스 항체 723C2로부터 유래된 사람화된 항-PD-1 항체에 대한 친화성을 측정하였다. ProteOn XPR36 (Biorad, Hercules, Ca)을 사용하여 측정되고, 전반적으로 1:1 결합 모델에 피팅된 동력학 결합 데이터는 1 nM ~ 10 nM 범위에 있는 재조합 사람 PD-1과의 상호작용을 입증하였다(표 10). 항체 PD1AB-6-4P (셀겐(Celgene)의 WO2017/058859에 기재된 IgG4Pro 백본 내 항체)를 또한 시험하였다.
[표 10]
Figure pct00019
C) 시노몰로구스 PD-1에 결합하는 항-PD-1 항체에 대한 친화성 및 동력학 데이터를 ProteOn XPR36에서 측정하고, 전반적으로 1:1 결합 모델에 피팅하였다(표 11). 항체, PD1AB-6-4P를 또한 시험하였다.
[표 11]
Figure pct00020
D) 사람 PD-1에 대한 분자 선택성
세포 기반 검정에서 사람 PD-1 단백질에 대한 항-PD-1 항체의 선택성은 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 사람 PD-1 단백질을 발현하지 않는 모체 Jurkat 세포 또는 사람 PD-1 단백질을 발현하는 Jurkat 세포를 AlexaFluor 647로 표지된 항-PD-1 항체를 사용하여 하기에 나타낸 농도로 항온처리하였다. 대조군으로서, 모체 및 PD-1 발현 Jurkat 세포를 항-TNP 이소형 대조군 항체를 사용하여 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 세척하여 비결합 항체를 제거하고, PFA에 고정화시킨 다음, 염색 완충액에서 세척하였다. Jurkat 세포로의 항체의 결합은 유동 세포측정법으로 평가하였다. 염색되지 않은 세포는 또한 음성 대조군으로서 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 항-PD-1 항체는 사람 PD-1 단백질을 발현하는 Jurkat 세포로의 용량 의존적 항체 결합 및 PD-1 발현 부재의 모체 Jurkat 세포로의 AlexaFluor 647 표지된 항-PD-1 항체의 결합 부재에 의해 지적된 바와 같이 최대 적어도 1 마이크로몰로 사람 PD-1에 선택적으로 결합한다. 항체 C (Ab C)를 사용한 대표적인 실험의 결과는 도 1에 나타낸다.
실시예 4: 사람 PD-L1-Fc에 결합하는 사람 PD-1-Fc의 경쟁 결합 검정
사람 PD-L1-Fc는 60 μg/mL의 농도로 BioRad ProteOn XPR36 기구 상의 GLM 칩의 채널 1-3으로 아민 커플링시키고; 3개의 시험 항체, 항체 C, MK-3475 (펨브롤리주맙), 및 PD1AB-6-4P는 각각 30 μg/mL으로 채널 4, 5 및 6상에 아민 커플링시켰다. 사람 PD1-Fc는 25nM의 농도로 칩 표면 상의 채널 1-6에 걸쳐 주사되었다. 센서그램은 PD-L1과 PD-1 수용체 간의 특이적 결합을 나타낸다(도 2a). 500nM 항체 C, MK-3475 및 PD1AB-6-4P를 25nM PD1-Fc와 사전 혼합하고 분석물로서 칩의 모든 채널에 주사하여 개별 항체가 PD-L1의 PD-1으로의 결합을 억제하는지의 여부를 평가하였다. 항체 C 및 PD1AB-6-4P 둘 다 센서그램에 의해 입증된 바와 같이 PD-1 항원에 대한 결합에 대해 PD-L1과 비경쟁적이다. MK-3475와 PD-L1은 경쟁 검정에서 관찰된 비결합 센서그램을 기반으로 PD-1과 서로의 잠재적인 결합 차단제이다(도 2b).
실시예 5. 항-PD-1 효능제 항체의 존재 하에 PD-L1의 PD-1로의 증진된 결합
PD-1/PD-L1 상호작용은 H-CDR3에서 DC에서 DY로의 돌연변이 없이 사람 IgG4Pro 백본에서 PD-1 효능제 항체 723C2의 존재 하에 조사되었다. 항체 723C2가 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 증진시켰다는 것을 입증하기 위해 다중 검정을 사용하였다. PD-1과 플레이트 결합 PD-L1(BPS Bioscience)의 결합을 평가하기 위해 생화학적 ELISA 기반 분석을 사용하였다. 백색 96-웰 마이크로플레이트는 4°C에서 밤새 PBS 중에 2μg/ml로 50μl의 PD-L1으로 코팅하였다. 상등액을 제거하고 플레이트를 제조업체 BPS Bioscience(Cat# 72005)에 의해 제공되는 1X 면역 완충액으로 3회 세척한 다음 실온(RT)에서 1시간 동안 차단 완충액으로 차단하였다. 관련 대조군과 함께 항체를 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 0.5ng/ml(10ng)의 PD-1 비오틴을 첨가하였다. 플레이트를 차단 완충액으로 10분 동안 차단하였다. 세척된 플레이트에 스트렙타비딘 서양고추냉이 퍼옥시다제 2차 항체를 1시간 동안 첨가한 후 PD-1 검정 완충액으로 세척하였다. 플레이트를 10분동안 차단하였다. 판독 직전에 화학발광 기질 혼합물을 플레이트에 첨가하였다. 화학발광 신호는 루미노미터(Envision) 또는 화학발광을 판독할 수 있는 미세역가 플레이트에서 판독하였다.
PD-1과 PD-L1의 증진된 상호작용은 이소타입 대조군 처리된 샘플과 비교하여 증가된 화학발광 신호로 지적된 바와 같이 항체 723C2의 존재 하에 관찰되었다(도 3a). 항체 723C2는 도 3a에서 723C2-4P로 지정된다. 이것은 PD-L1- PD-1 상호작용을 차단하는 공지된 항 PD-1 길항제 항체인 MK3475와 대조적이다. 항체 PD1AB-6-4P는 상기 검정에서 PD-1- PD-L1의 제한된 증진을 입증하였다(도 3a).
항체 723C2의 존재 하에 PD-1/PD-L1 상호작용의 증진을 입증하는 ELISA 기반 결과를 확인하기 위해 세포 기반 검정을 사용하였다. 여기에서 PD-1/PD-L1의 상호작용은 PD-1을 과발현하는 CHO 세포에 대한 가용성 PD-1의 결합을 DELFIA(해리 증진된 란타나이드 형광 면역검정) 수용체-리간드 결합 검정(Perkin Elmer)으로 측정함에 의해 평가하였다.
10,000개 세포를 플레이팅하고 37°C + 5% CO2 항온처리기 (가습 항온처리기)에서 밤새 항온처리하였다. 비오틴 표지된 PD-L1 EC 10(130nM) 및 PD-1 항체 10㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트는 50μl의 1X TRF 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 20μL의 Eu-스트렙타비딘 시약을 검정 플레이트에 첨가하였고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 증진 용액을 첨가하고 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 형광 플레이트 판독기(여기: 320 또는 340nm, 방출: 615nm)에서 플레이트를 판독하였다. 상기 검정에서 및 ELISA 검정의 확인에서, 상기 세포 기반 검정에서 항체 723C2의 존재는 PD-1/PD-L1 상호작용을 증진시켰다(도 3b). 항체 723C2는 도 3b에서 723C2-4P로서 지정된다.
PD-1이 CHO 세포상에 발현되는 두 번째 세포 기반 분석도 PD-1/PD-L1 상호작용을 평가하는 데 사용되었다. 상기 검정에서, PD-1을 발현하는 CHO 세포에 대한 PD-L1-다량체 결합을 유동 세포측정법으로 측정하였다. 50μl의 2x106 세포/ml을 각각의 웰(100,000개 세포/웰)에 첨가하였다. 세포를 원심분리하고 지정된 항체 농도 50μl에 재현탁하고 빙상에서 60분 동안 항온처리하였다. PDL1-비오틴과 스트렙타비딘-APC를 염색 완충액(1μg/ml PDL1-비오틴 + 0.25μg/ml 스트렙타비딘-APC)에 배합하였다. 50μl의 2X PDL1-비오틴/스트렙타비딘-APC 혼합물을 세포에 첨가하고 60분동안 빙상에서 항온처리하였다. 세포는 180μl 염색 완충액 + 20μ PFA 중에서 세척하고 재현탁시키고 데이터는 BD LSR II상에서 획득하였다. 도 3c에 지적된 바와 같이, 상기 세포 기반 검정은 또한 항체 723C2의 존재 하에 PD-L1과 PD-1의 증진된 결합을 입증하였다. 항체 PD1AB-6-4P는 PD-L1 결합에 대해 효과를 갖지 않았고, MK3475 길항제 항체는 PD-L1과 PD-1의 결합을 억제하였다(도 3c). 항체 723C2는 도 3c에서 723C2-4P로서 지정한다.
상기된 바와 같이 CHO PD-1 - PD-L1 델피아-Eu TRF 검정은 또한 항체 C, 항체 PD1AB-6-4P, 항체 1-4Pro, 항체 PD1B1090-4Pro, 항체 PD1B1094-4Pro 및 항체 ANB-030-4Pro와 함께 수행하였다. 항체 1-4Pro 는 IgG4-Pro 백본에서 엘리 릴리(Eli Lilly)의 WO2019/168745에 기재된 항체 1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 PD1B1090-4Pro 및 항체 PD1B1094-4Pro는 IgG4-Pro 백본에서 얀센 바이오텍의 WO2018/226580에 각각 기재된 PD1B1090 및 PD1B1094의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 ANB-030-4Pro는 IgG4-Pro 백본에서 CAS 번호 CAS 2412764-40-8로 기재된 항체 ANB-030의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다(또한 아납티스비오의 WO2020/247648에 기재된 APE12537의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 상응함). IgG4-Pro 백본에서 항-TNP 항체가 또한 포함되었다.
항체 C는 농도 의존적 방식으로 PD-1/PDL-1 결합의 일관된(N=3) 증진을 보여주었다(도 3d). 모든 다른 항-PD-1 효능제는 일관되게 PD-1/PDL-1 결합의 증진을 보여주지 않았다(도 3d).
실시예 6: 기능적 세포 검정, THP-1/Jurkat-PD-1 효능제 리포터 검정에서 NFAT 활성화의 억제
THP-1/Jurkat PD1 NFAT 공동 배양 검정을 개발하여 다중 비교로부터 생성된 항-PD1 항체의 효능제 활성을 평가하였다. THP-1 세포주는 ATCC로부터 수득하였다. Jurkat 리포터 세포주는 내부적으로 생성하였다. Jurkat 리포터 세포는 세포 표면상에서 사람 PD-1(hPD-1)을 과발현하고 또한 자극에 대한 반응으로 세포의 활성화 상태를 측정하기 위해 NFAT 구동 루시퍼라제 리포터를 발현한다. Jurkat PD1 NFAT 세포는 THP-1 세포의 존재하에 CD3xCD33 BiTE로 활성화시킨다. BiTE의 항-CD33 아암은 THP-1 세포에서 발현된 CD33에 결합하는 반면 항-CD3 아암은 Jurkat 세포상의 CD3 분자에 결합한다. BiTE는 THP-1 및 Jurkat 세포에 개입하여 Jurkat 세포를 활성화시키면서 2개 세포 사이에 면역 시냅스를 형성하는 작용을 한다. Jurkat PD-1 NFAT 세포의 활성화는 NFAT 구동 루시퍼라제 리포터를 통해 측정된다. 상기 검정은 항-PD1 항체의 존재하에 수행하여 효능제 항체를 동정하였다. 루시퍼라제 신호의 손실로 지적된 바와 같이 활성화에서 20% 이상의 감소를 나타내는 분자를 효능제 항체로 분류하였다(표 12). 표 12에서 항-PD-1 항체 306E6 내지 820C3은 마우스 IgG1 백본 상에 있다. 여러 이들 항체는 사람 IgG4Pro 백본에 대한 추가의 프로파일링을 위해 선택하였다(표 12에서 키메라 항체로서 지적된).
[표 12]
Figure pct00021
실시예 7: 기능적 세포 검정 - 사람 PD-1 녹인(knockin) 비장세포로부터 IFNγ 생성의 억제
상위 항-PD1 항체를 선택하기 위해 사용된 1차 세포 검정은 hPD1 녹인 마우스 비장세포 검정이었다. 마우스 PD1 대신 사람 PD1을 발현하는 C57BL/6 마우스로부터 비장을 수거하였다. 비장 세포를 비장으로부터 분리하고 0.1 μg/ml 농도의 항-CD3(클론 2C11)으로 활성화하였다. T 세포 활성화는 MSD 분석(Meso Scale Discovery)에 의해 mIFNγ 수준을 정량화함에 의해 48시간 후 측정하였다. 검정은 THP-1/Jurkat PD1 NFAT 스크리닝 검정으로부터 선택된 항-PD1 항체의 존재 하에 수행하였다. 상기 검정으로부터 동정된 상위 분자는 mIFNγ (50% 이상)의 % 억제 및 서열 클레이드를 기준으로 선택하였다. 억제 및 IC50 값은 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pct00022
실시예 8: 기능적 세포 검정, 사람 PBMC 검정으로부터 IFNγ 생성의 억제
항-PD-1 효능제 항체는 사람 1차 세포 검정에서 IFNγ 생성에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 기능적 활성을 조절하는 이들의 능력에 대해 추가로 특징 분석하였다. PBMC는 사람 전혈로부터 단리하고 1.5pM의 항-CD3 (클론 OKT3, BioLegend)으로 활성화하였다. T 세포 활성화 및 기능은 MSD 분석에 의해 hIFNγ 수준을 정량화함에 의해 72시간 후 평가하였다. 동정된 항-PD-1 효능제 항체는 이소타입 대조군 처리된 세포와 비교하여 IFNγ 분비를 감소시킬 수 있다(표 14A).
[표 14A]
Figure pct00023
항체 C, 항체 1-4Pro, 항체 PD1B1090-4Pro, 항체 PD1B1094-4Pro, 항체 ANB-030-4Pro 및 아바타셉트는 또한 상기 검정에서 시험하였다. 상기 결과는 표 14B에 나타낸다. IgG1 야생형 백본에서 및 IgG1 KO 백본에서, 항체 C, 항체 1-4Pro의 가변 영역, 항체 PD1B1090-4Pro, 항체 PD1B1094-4Pro 및 항체 ANB-030-4Pro, 및 아바타셉트는 또한 상기 검정에서 시험하였다. 상기 결과는 하기 요약된 표 14C에 나타낸다. 각각의 실험에서 5명의 공여자를 시험하였다.
[표 14B]
Figure pct00024
[표 14C]
Figure pct00025
IgG1 KO 백본에서 항체 1-4Pro, 항체 PD1B1090-4Pro, 항체 PD1B1094-4Pro 및 항체 ANB-030-4Pro의 가변 영역에 대한 IFNγ의 억제는 40% 미만이었고 IC50 값은 30nM 초과였다.
실시예 9: 기능적 세포 검정, Th17-단핵구 공동 배양 검정으로부터 IL-17A 생성의 억제
항-PD-1 효능제 항체는 T17 분화된 T 세포에 의한 IL-17 분비의 기능적 억제에 대해 시험하였다. 1차 세포 공동 배양 검정을 개발하여 PD-1에 의한 Il-17의 조절을 평가하였다. PBMC로부터 단리된 사람 1차 T 세포는 하기의 스큐잉(skewing) 조건하에 Th17-분화시켰다: CD4 T 세포는 Th17 스큐잉 배지 (X-VIVO15 배지 + IL-1β (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), IL-6 (10 ng/mL), IL-2 (2 ng/mL), TGFβ (0.5 ng/mL), 5 μg/mL 항-IL4, 5 μg/mL 항-IFNγ)에서 4일 동안 0.5 μg/ml 플레이트 결합된 항-CD3 (클론 UCHT1)으로 자극하였다. 4일 후, 항-CD3 코팅된 플레이트에서 세포를 제거하고 Th17 스큐잉 배지를 함유하는 플라스크로 옮겼다. 분화 후, Th17 세포를 적어도 3일 동안 휴지시킨 다음, 자가 단핵구와 공동 배양하고 PD-1 항체의 존재 하에 40fM 항-CD3(클론 OKT3)로 재자극시켰다. 효능제 활성을 입증하기 위해 항-PD-1 항체에 필요한 Fc 요구 사항으로 인해 공동 배양 시스템이 필요하였다. IL-17의 억제는 항-PD-1 효능제 항체의 존재하에 상기 검정에서 관찰되었다. IL-17 반응의 항체 IC50 및 최대 억제는 하기 표에 나타낸다(표 15). 최대 억제는 이소타입 대조군 항체에 상대적으로 비교하였다.
[표 15]
Figure pct00026
실시예 10: 기능적 세포 검정, Tfh-단핵구 공동 배양 검정으로부터 IL-21 생성의 억제
항-PD-1 효능제 항체가 시험관 내에서 T 소낭 헬퍼(Tfh) 세포 활성을 억제하는 능력을 평가하기 위한 분석법이 개발되었다. CD4 T 세포와 자가 단핵구는 ALLCELLS에서 구입하였다. IL-23(25ng/ml) 및 TGFβ(5ng/ml)의 존재 하에 5일 동안 다이나비드(Dynabeads) 사람 T-활성화제 CD3/CD28(Gibco)로 세포를 활성화하여 T 세포를 Tfh 계통으로 스큐잉한 다음 세포를 세척하고 활성화 비드를 제거한 후 4.5 pM 항-CD3(클론 OKT3, BioLegend) 및 항-PD-1 효능제 항체의 존재 하에 자가 단핵구와 배합하였다. 24시간 후, 상등액을 수거하고 IL-21(Meso Scale Discovery, MSD V-Plex 사람 IL-21 키트)의 존재에 대해 분석하였다. 재자극된 Tfh 분화된 세포의 IL-21 생성은 항-PD-1 효능제 항체에 의해 억제하였다. 대표적인 IC50 및 Emax 억제 값은 표 16에 나타낸다.
[표 16]
Figure pct00027
실시예 11: PD-1 효능제 활성에 대한 FcgR 상호작용의 역할
효능제 항체의 기능적 활성에 대한 Fc-Fcg 수용체 상호작용의 역할은 상이한 백본 포맷(IgG1 야생형, IgG1 KO 또는 IgG4 Pro) 또는 2가 항체 단편(F(ab ')2 단편)에 대한 후보물 항 PD-1 효능제 항체를 사용함에 의해 특징 분석하였다. 항체 변이체의 기능적 활성은 상기된 사람 PBMC 검정에서 활성화된 T 세포로부터 IFNγ 생성을 조절하는 능력에 의해 평가하였다. IFNγ 생성에서 감소에 의해 측정된 바와 같은 기능적 효능제 활성은 모체 723C2 및 820C3 항체의 2가 F(ab’)2 단편과 함께 상실된다 (도 4a 및 4b). 대조적으로, 사람 IgG4Pro 백본에서 전장 항체는 용량 의존성 방식으로 IFNγ 생성을 억제하였다(도 4a 및 4b, 각각 723C2-4P 및 820C3-4P로서 지정된). 이들 검정에서, 사람 PBMC를 전혈로부터 단리하고 항-PD-1 항체 또는 지적된 항-PD-1의 F(ab')2 단편의 존재하에 1.5pM의 항-CD3 클론 OKT3으로 활성화시켰다. 72시간 후, 상등액 중 사람 IFN 감마 사이토킨 수준을 MSD 분석으로 측정하였다.
이는 Fc 상호작용이 항-PD-1 항체의 기능적 효능제 활성에 필요하다는 것을 시사하므로, 이러한 상호작용을 추가로 특징 분석하기 위해 IgG1WT, IgG1KO 및 IgG4Pro 백본에서 723C2 항체를 생성하였다(각각 하기 표 17에서 723-IgG1WT, 723-IgG1KO 및 723-IgG4Pro). IgG1 WT와 IgG4 Pro는 둘 다 사람 Fc 수용체에 서로 다른 정도로 결합하는 반면, IgG1 KO 백본은 Fc 수용체에 대한 결합을 크게 감소시켰다. IgG4 Pro에 대한 항-PD-1 효능제 항체는 사람 PBMC 검정에서 IFNγ의 최고 억제 농도를 입증하였고, IgG1 KO에 대한 항체는 크게 감소된 활성을 입증하였다(표 17). 총체적으로, 이들 데이터는 항-PD-1 항체의 기능적 효능작용이 Fc 상호작용에 의존함을 지적한다.
[표 17]
Figure pct00028
실시예 12: 생체내 모델 - 이종 CD4 + T 세포 GvHD 모델
생체내 이종 CD4+ T 세포 GvHD 마우스 모델을 사용하여 PD-1 효능제 항체의 효능을 시험하였다. 그룹당 8마리의 NSG 마우스(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, The Jackson Laboratory)에 건강한 공여자 백혈구로부터 얻은 5 x 106 CD4+ T 세포(음성 선택으로 정제)를 IV 주사하였다. 마우스에는 하기에 따라 0.625 mg/kg IP로 주당 2회 투여하였다; 그룹 1: 723 (IgG4-Pro), 그룹 2: PD1AB-6-4P (IgG4-Pro), 그룹 3: 항-TNP 이소타입 (IgG4-Pro), 그룹 4: 아벨루맙 (hIgG1-LALAPG), 그룹 5: 항-TNP 이소타입 (hIgG1-LALAPG), 그룹 6: CTLA4-Ig (hIgG1-LALA). TNP는 트리니트로페놀이다. LALA는 항체 이펙터 기능을 파괴하기 위해 통상적으로 사용되는 Leu234Ala/Leu235Ala 돌연변이를 나타낸다. PG는 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 방지하여 이펙터 기능을 제거하는 Pro329Gly 돌연변이를 나타낸다.
3개의 실험 반복을 수행하고, 각각은 특유의 공여자를 갖는다. 4주까지, 사람 세포 축적의 현저한 억제는 시험된 모든 공여자에 대한 이소타입-매칭 대조군과 비교하여 그룹 1, 2 및 6에서 주지되었다(표 18). 4주차에 염증성 사이토킨의 정량화는 모든 공여자에서 사람 IFNγ, TNFα 및 IL-10 수준의 유의적인 감소를 보여주었다(표 19). 사람 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12p70, 및 IL-13은 또한 시험되었지만, 모두는 검정을 위한 검출 한계치 미만이다.
[표 18] 사람 CD45+ 세포 축적
Figure pct00029
[표 19] 사람 혈장 사이토킨 생성
Figure pct00030
실시예 13: 시노몰구스 몽키에서 약동학적 연구
항체 C의 약동학(PK)은 0.1, 0.3 및 1.5 mg/kg의 단일 정맥내(IV) 볼러스 투여 또는 1.5 mg/kg의 피하(SC) 투여(그룹 당 n=3) 후 중국 기원의 수컷 시노몰구스 몽키에서 평가하였다. 항체 C의 혈청 농도는 2개의 상이한 MSD 면역검정 포맷을 사용하여 결정하였다: (1) "전체" 약물 일반 항-사람 포획 및 검출 검정 및 (2) 항원(PD1-ECD) 포획 및 항-사람 검출을 사용한 "유리된" 약물 검정. 검정 둘다의 PK 프로필은 중첩 가능하고, 이는 내인성 sPD-1이 항체 C의 측정을 방해하지 않고 TMDD에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 항체 C는 0.1 내지 0.3 mg/kg 사이의 용량 의존적 CL(유리된 및 "전체" 검정 둘 다를 사용함)을 입증하였고, 전체 제거율에 대한 표적 매개 약물 처분(TMDD) 기여를 시사한다. 용량의 각각에 대한 NCA 약동학 파라미터의 개요는 하기 표 20에 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00031
실시예 14: CHO 세포 및 생물리학적 데이터에서 형질감염 및 생성
CHO 세포에서 형질감염 및 생성:
CHO-E 세포는 Irvine BalanCD Transfectory CHO + 4mM L-글루타민(또는 Glutamax)에서 ~2x10E6 세포/mL로 형질감염시켰다. 1L 형질감염에 필요한 양은 0.15mg의 HC DNA와 0.3mg의 LC DNA 및 1.05mg 충전제 DNA(청어 정자) 및 0.15mg XBP1 DNA이다. DNA는 100mL의 OptiPro SFM에 의해 희석시키고 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과시킨다. 0.75mL의 Mirus TransIT Pro 형질감염 시약을 희석된 DNA 혼합물에 첨가하고, DNA 복합체를 즉시 제조된 CHO-E 세포에 첨가하고, 진탕 플라스크는 37°C, 140 rpm의 5% CO2 진탕기로 복귀시켰다. 형질감염 24시간 후, 온도를 32°C로 전환시키고 Gibco 응집 방지제 2mL와 Irvine Transfectory 보충제 100ml를 형질감염된 세포에 첨가한다. 형질감염 5일 후 진탕기 온도는 30oC로 전환시킨다. Irvine Transfectory 보충물 200mL은 글루코스 수준이 2g/L - 1g/L 사이로 떨어지는 시점에 따라 5일 또는 7일 사이에 첨가된다. 형질감염된 배양물은 10일동안 유지한다. 세포를 회전 하강시키고 0.2 μm PES 필터 (Thermo Scientific)를 통해 멸균여과하여 수거한다.
수거 후, 정화된 세포 배양 상등액을 다음과 같이 단백질 A 바이오센서가 있는 ForteBio/Pall Octet Red 96 기구에 의한 적정을 위해 샘플링하였다.
항체 A, 항체 C 및 항체 E에 대한 역가는 18 내지 38 mg/L이고, 단백질 정제로부터 약 80%가 회수되고 SEC 정제 후에는 98% 초과의 단량체가 회수된다. 단백질은 10mM 히스티딘-HCl(pH 6.0)을 함유하는 최종 완충액에서 완충액 교환되고, 상기 완충액에서 적어도 4개월 동안 4oC에서 최대 180 mg/ml의 용해도로 안정하다.
[표 21]
Figure pct00032
[표 22]
Figure pct00033
AUC: 0.5-1 mg/ml의 농도에서 침강 속도 방법에 의해 측정된 분석 초원심분리; SEC: 크기 배제 크로마토그래피; %M: 퍼센트 단량체.
실시예 15: 이중특이적 항체
재료 및 방법
마우스 항체 및 시약. 항-hPD1 (EH12.2H7)(Biolegend, 329912); 항-hCD48 (Bio-gems, 10511-25-500); IgG1 (cat#16-4714-85), 항-hCD3 (OKT3) (16-0037-85), 항-hCD3 (UCHT1) (16-0038-85) 및 항-CD11a (140011982) (제조원: eBiosciences); 항-hCD71 (제조원: Southern Biotech, 9670-14). aCD3/aCD28 사람 T-세포 활성화인자 다이나비드(Gibco, 11131D)
이미지스트림. Jurkat PD-1 세포는 AF-488 콜레라 독소 (제조원: Life Technologies, V-34403) 및 가교결합 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch) 및 APC aCD3 (제조원: Biolegend, 317318), PV786 aPD-1 (제조원: Biolegend, 329930) 또는 APC aCD48 (제조원: Sigma, SAB4700193)로 10분동안 빙상에서 XVIVO 15 배지 (제조원: Lonza)에서 항온처리하였다. 예비 예열된 X-VIVO 15로 옮겨 세포를 활성화하고 추가로 12분 동안 항온처리되도록 하였다. 냉각 PBS-2% PFA(대략 1:10 비율, 세포:PFA)를 첨가하여 세포 활성화를 중단하고, 세포를 고정 용액에서 20분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 세포를 세척하고 XVIVO에 재현탁하고 이미지스트림 소프트웨어를 사용하여 캡 형성 및 경계 임계값에 대해 분석하였다.
유동 세포측정. 1×105 Jurkat, Jurkat-PD-1 또는 aCD3/aCD28-자극된 1차 사람 T 세포는 1mg/ml의 1차 Mab로로 4°C에서 1시간 동안 항온처리하거나, 이중특이적 분자가 시험된 경우, 8-포인트 결합 곡선은 6.25 mg/ml의 출발 농도로부터 작성하였고 1:4로 연속 희석하였다. 세포를 세척하고, 4°C에서 1시간 동안 1:100 희석된 PE-항-마우스 Ig (제조원: Life Technologies, P852), 또는 1:800 희석된 PE-염소 항-사람 F(ab’)2 (제조원: Invitrogen AHI1707) 각각으로 염색하였다. 샘플을 세척하고 1x fix/lyse 완충액 (제조원: eBioscience, 00-5333-57) 중에 고정화시키고 LSR2 (BD) 상에서 분석하였다.
PD-1 상보성 검정. 전장 PD-1-PK 및 세포내 전장 SHP1-EA 융합 단백질을 과발현하는 2×104 Jurkat T 세포는 제조원(DiscoverX (DRX-BI-080515A))으로부터 구입하였고 제조자의 지침에 따라 배양하였다. 세포는 세포 플레이팅 배지 (DiscoverX, 93-0563R4B)에 재현탁시키고, 30분동안 4°C에서 1차 마우스 또는 사람 항체로 예비 항온처리하였다. 실험에 따라, 세포를 10mM의 범-Src 키나제 억제제 PP2(Abcam, ab120308) 또는 비활성 유사체 PP3(Abcam, ab120617)로 추가로 사전 항온처리하였다. 세포를 세척하고, 가교결합 2차 염소 항-마우스 IgG (Thermo Scientific, 31170)의 존재 또는 부재하에 처리하였다. 세포는 384-백색 Opti-플레이트 (PerkinElmer)로 옮기고, 플래시 검출 시약(DiscoverX, 93-0247)을 투여하고, EnVision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 판독한다.
1차 huT 세포 활성화. 1차 사람 범-T 세포(AllCells, PB009-1F)를 500nM의 세포추적 바이올렛(Life Technologies, cat#c34557)으로 표지시켰다. 에폭시-다이나비드 M450(Invitrogen, 14011)을 제조업체 지침에 따라 2.5mg의 마우스 Abs/107 비드로 공유 코팅하였다. 세포를 자극하지 않은 상태로 두거나 Ab 코팅된 에폭시 비드의 존재 하에 플레이트 결합된 항-CD3(UCHT1)(250 및 500ng/mL)로 자극하였다. 96시간 후 세포를 수거하고, BV510 항-CD4(BD, 562970) 및 PeCy7 항-CD8(BD, 335787) Ab로 염색하고, 세포 증식을 LSR2(BD)에서 세포 추적 바이올렛 희석으로 분석하였다. 1차 기억 CD4+/CD45RO+ T 세포(AllCells, PB009-7F)는 각각 1mg/웰의 플레이트 결합된 이소타입 대조군(ISO) 또는 BsAbs의 존재 하에 1mg/웰의 플레이트 결합된 항-CD3(UCHT1)으로 자극하였다. 배양 상등액은 72h에 수거하고, IL-2 및 IL-10 분비에 대해 분석하였다(MSD).
BsAbs 생성 및 작제물 디자인. 이중특이적 항체(BsAbs)는 빌딩 블록으로 사용된 공개된 항-CD48(US2012/0076790) 및 항-PD1(WO 2011/110621A1) 서열로부터 생성되었다. 항-PD-1 및 항-CD48(PD-1/CD48) 또는 대조군으로서 항-PD-1 및 항-TNP(PD-1/ISO)를 함유하는 BsAb를 생성하기 위해 2개의 상이한 표적 가변 영역(IgG1-KO)의 이종이량체화를 용이하게 하는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술로 이중특이적 작제물을 디자인하였다(도 7a).각각의 표적에 대해 수득된 가변 영역 서열을 사람 불변 영역을 함유하는 pTT-5(National Research Council Canada로부터 허가됨) 발현 벡터에 클로닝하였다. 간략하게, 가변 영역 아미노산 서열은 포유동물 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 표적 V-유전자의 경쇄 및 중쇄를 결합 링커 분절을 포함하는 동일한 발현 벡터에 클로닝하였다. 벡터는 EcoRI 및 NheI 인지 부위를 사용하여 제한 효소 분해에 의해 선형화하였다. 가변 영역에 대한 DNA 서열은 제조사 (Integrated DNA Technology (IDTDNA)로부터 G-블록(dsDNA)으로 주문되었고, 벡터 및 인접 링커 분절에 대한 상동성 말단이 중첩되어 있다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 Gibson 어셈블리 방법(NEBuilder HiFi 키트, New England Biolabs, cat#E5510S)을 통해 G 블록을 연결하였다. 그런 다음 어셈블리 혼합물을 적격 세포(NEB 5-알파 C2987, New England Biolabs)로 전환시켜 통상의 클로닝을 완료한 다음 100μg/ml 카르베니실린(Teknova)이 포함된 LB 한천 플레이트상에서 37°C에서 밤새 성장시켰다. 개별 콜로니를 픽킹하고 카베니실린을 갖는 LB 배지에서 37°C에서 밤새 성장시켰다. 삽입에 대한 양성 클론은 Lasergene 소프트웨어 팩키지(DNAstar)를 사용한 서열 분석에 의해 확인되었다. 서열이 확인된 플라스미드 DNA를 0.5L 배양액으로 스케일-업시킨 다음 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드 플러스(Plasmid Plus) 메가프렙 키트(Qiagen, cat# 12981)를 통해 정제하였다.
CHO-E 일시적 형질감염. CHO-E 세포는 2mM 글루타민이 보충된 FS-CHO에서 2e6 세포/mL로 형질감염시켰다. 1L mAb 형질감염 용적의 경우, 1mg 경쇄(LC) 플라스미드 DNA 및 0.5mg 중쇄(HC) 플라스미드 DNA를 OptiPro SFM(Gibco) 100mL에 희석하고 0.2μm 필터(Millipore)를 통해 멸균 여과시킨다. 1.5mL의 TransIT Pro(Mirus Bio LLC) 형질감염 시약을 첨가하고 실온에서 15-30분 동안 항온처리되도록 하였다. 복합체는 이어서 제조된 CHO-E 세포에 첨가하고, 진탕 플라스크를 진탕기로 복귀시켰다. 형질감염 24시간 후, 10mL의 응집 방지제 및 150mL의 CHO CD 효율적 공급물 B(둘 다 Gibco 제품)를 형질감염된 세포에 첨가하고 온도를 32°C로 전환시킨다. 형질감염된 배양은 6-12일 동안 유지시키고, 세포 성장, 생존력 및 영양소 소비에 대해 배양 전반에 걸쳐 일상적으로 모니터링한다. 4°C에서 4700rpm으로 원심분리한 후 멸균 여과하여 배양물 수거를 완료하였다.
BsAbs 정제. 1.0ml/min에서 완충액 A(DPBS, pH7.2)로 사전 평형화된 GE(Cat#11003493)의 1ml HiTrap MabSelect SuRe 컬럼상으로 수거된 배양 상등액을 부하한다. 컬럼을 완충액 A, 완충액 B(DPBS + 1.0 M NaCl) 및 완충액 A를 각각 10ml씩 1ml/분으로 다시 컬럼을 세척한다. 이어서, 30mM 나트륨 아세테이트, pH3.5로 결합된 단백질을 용출시킨다. 5ml 분획을 용적 대 용적의 1%의 3M 나트륨 아세테이트, pH~9로 중화시킨다. 최종 완충액은 단백질 A 용출 후 60mM NaOAc, pH~5이다. 단량체 퍼센트는 aSEC에 의한 PD1/ISO의 경우 71% 및 PD1/CD48의 경우 63%였다.
MabSelect Sure 정제된 물질은 양이온 교환에 의해 응집체를 제거하기 위해 추가로 연마하였다. Poros GoPure HS 사전 팩킹된 컬럼 (제조사: Thermo Fisher (Cat#4481316))을 이온 교환을 위해 사용하였다. 완충액 A(60mM NaOAc. pH 5.0)로 사전 평형화된 1ml Poros HS 컬럼에 단백질 A 샘플을 부하하고 10 컬럼 용적의 완충액 A로 컬럼을 세척한다. 이어서 0.5 ml/min에서 20 컬럼 용적에서 완충액 B(60mM NaOA, 1 M NaCl, pH 5.0)의 0%에서 40%의 농도 구배로 결합된 단백질을 용출시킨다. 피크 주변의 분획을 풀링하고 염 농도를 100mM NaCl로 조정한다. 여과 유닛으로 샘플을 멸균 여과하고, 단백질 농도를 측정하고, 엔도톡신 수준을 결정하고, SDS-PAGE와 aSEC를 수행한다.
NFAT 루시퍼라제 검정. Jurkat PD-1 NFAT 리포터 세포주는 인-하우스 생성하였다. 사람 PD-1(제조사: GeneCopoeia (EX-B0169-M02))을 벡터에 클로닝하고 이는 전기천공을 통해 Jurkat 세포 (ATCC)에 형질감염시켰다. 이어서, NFAT 루시퍼라제 리포터(Promega E8481)를 전기천공을 통해 PD-1 발현 클론으로 형질감염시켰다. THP-1 세포주는 ATCC (TIB-202)로부터 구입하였고 제조사의 지침에 따라 배양하였다.
Jurkat PD-1 및 NFAT 리포터 세포를 검정 배지(RPMI, 2% HI-FBS)에 재현탁시키고, 3×104개 세포/조건을 384개의 평저 Opti-플레이트에서 15분 동안 BsAbs(시작 농도 100nM 및 1:3의 희석)와 함께 사전 배양하였다. THP-1 세포(3×104개 세포/조건)를 첨가하고, 세포를 10nM의 aCD3×aCD33 활성화제 용액으로 37℃에서 6시간 동안 자극하였다. NFAT 리포터는 15분 형태의 Steady-Glo® 루시퍼라제 검정 시약(Promega, E2520)을 첨가하여 분석하고 EnVision 플레이트 판독기에서 판독하였다.
결과
CD48과 PD-1 가교결합은 PD-1 인산화를 증진시킨다. CD48은 마우스 및 사람 림프구에서 잘 확립된 지질 래프트 및 IS 상주 단백질이다(Elishmereni and Levi-Schaffer, 2011). PD-1 및 CD3에 비해 지질 래프트에서 CD48의 존재 및 풍부성을 더 잘 정성분석하기 위해, 본원 발명자는 이미지스트림 실험을 수행하여 단일 세포 수준에서 PD-1을 과발현하는 Jurkat 세포에서 콜레라 독소(CT) 유도 지질 래프트 유착 (캡핑)과 이들 수용체의 공동 위치화를 정량하였다. CT에 의해 유도된 지질 래프트 캡 내에서 CD48, CD3 및 PD-1의 공동 위치화 분석은 형광단 표지된 MAb를 사용하여 수행하였다. 상기 분석은 PD-1과 달리 CT에 의해 유도된 캡핑 내에서 CD3 및 CD48이 용이하게 관찰됨을 보여주었다. 보다 작은 둘레 값이 캡핑과 상관관계가 있는 둘레 정량화는 활성화 후 CD48의 캡핑이 분명하지만 CD3보다 약간 덜 풍부하다는 것을 밝혔다. 대조적으로, PD-1은 일반적으로 PD-1이 지질 래프트 농축된 IS에 동원되기 위해 능동적 과정(예를 들어, PDL-1과의 상호작용)이 필요하다는 가설과 일치하여 CT와 함께 공동위치되지 않았다(Yokosuka et al., 2012).
지질 래프트에 CD48이 존재하고 Src 키나제(T 세포에서 Lck)와의 구성적 연관성은 PD-1 활성화를 위한 카노니칼 기전이 PD-1의 세포내 ITSM 및 ITIM 도메인의 Lck 매개 인산화가 필요함으로 본원 발명자가 CD3과 유사하게 PD-1과 CD48의 근사치가 PD-1 활성화/인산화를 유도할 것이라는 가설을 가능하게 하였다. (Chemnitz et al., 2004; Parry et al., 2005; Sheppard et al., 2004). 상기 가설을 시험하기 위해, 맞춤형 Jurkat 세포주는 b-갈락토시다아제(PK)의 하나의 반쪽을 갖는 사람 PD-1 융합 단백질, 및 b-갈락토시다아제(EA)의 상보적 반쪽을 갖는 시토졸 전장 SHP1 융합 단백질을 발현하도록 생성되었다. 따라서 PD-1 활성화는 기능적 b-갈락토시다제를 생성하는 인산화된 PD1에 SHP1을 동원하기 때문에 PK/EA 상보성의 함수로 측정되었다. 이들 세포에서 PD-1, CD48 및 CD3의 발현을 확인한 후, 가교결합 시 PD-1 활성화를 유도하는 CD48에 대한 MAb의 가능성을 평가하기 위한 실험을 설정하였다(도 5). PD-1 MAb 또는 Fc 특이적 2차 F(ab')2 항체의 부재하에 PD-1 활성화는 유도되지 않았다. 2차 항체와의 가교결합은 약 3배까지 PD-1 활성화를 유도하였지만, CD48 또는 CD3 Mab의 존재 하에서 PD-1 활성화는 약 9배 증진되었고, 이는 CD48 또는 CD3과 PD-1의 긴밀한 연관성이 PD-1 활성화를 부스팅할 수 있음을 지적한다. 자체 가교결합에 의해 유도된 PD-1 활성화의 낮은 수준은 연구에서 Lck의 작은 부분이 T 세포에서 PD-1과 구성적으로 연관되어 있음을 입증했기 때문에 놀라운 일이 아니다(Sheppard et al., 2004).
PD-1의 CD48-의존성 활성화는 Src-키나제 활성을 필요로 한다. CD48에 의한 PD-1 활성화/인산화의 증진이 Src 키나제 활성에 의존하는지의 여부를 결정하기 위해 범-Src 키나제 억제제 PP2 또는 비활성 유사체 PP3의 존재 하에서 가교결합 실험을 수행하였다. Src-키나제 억제는 자가 가교결합하거나 CD48과 공동 가교결합 시 PD-1 활성화를 폐기하였고, 이는 Lck 활성이 PD-1 활성화에 필요함을 지적한다. 상기 개념을 추가로 검증하기 위해, PD-1 활성화는 지질 래프트로 이동하지 않거나 Src-키나제와 연합하지 않는 수용체인 CD71에 대한 항체의 존재 하에 준최적 양의 항-PD-1과 PD-1을 가교결합시킴으로써 평가되었다(Schatzlmaier et al., 2015). PD-1과 CD71의 가교결합은 PD-1 활성화를 유도하지 않았고, 이는 PD-1이 활성화된 Src 키나제가 풍부한 환경으로 전위되어 PD-1 인산화 및 활성화가 가능하다는 발견을 뒷받침한다.
CD48 의존성 PD-1 활성화는 1차 사람 T 세포의 AR 유도 증식을 무디게 한다. CD48 의존성 PD-1 활성화가 T 세포 기능을 조절하는 능력을 기능적으로 평가하기 위해, 자기 비드를 CD48, PD-1 MAb 및 이소타입 대조군과 공유적으로 공동 코팅하고 플레이트 결합 항-CD3로 자극된 1차 사람 T 세포(CD4+ 및 CD8+ )에 대해 시험하였다. 첫번째로, 본원 발명자는 사전 활성화된 사람 CD4+ 및 CD8+ T 림프구에서 CD48 및 PD-1의 발현을 확인하였다. 코팅된 비드가 세포 활성화에 미치는 효과를 평가하기 위해, 사람 범-T 세포를 세포추적 바이올렛으로 표지시킨 다음 CD3 MAbs로 활성화시키고 세포추적물을 희석하여 세포 증식을 분석하였다(도 6). 도 6에 나타낸 바와 같이, CD48 및 PD-1 MAbs 둘 다로 공동-코팅된 비드는 CD48 또는 PD-1 MAbs 단독으로 코팅된 비드로 처리된 세포에 비해 T 세포 증식을 상당히 감소시킬 수 있었고, 억제 효과는 CD8+ 세포보다 CD4+에 보다 유의적이었다. 추가 대조군으로서, 본원 발명자는 또한 PD-1 및 CD11a Mabs로 공동 코팅된 비드를 시험하였고; 후자는 CD11a가 구조적으로 지질 래프트 상주 단백질이 아니라는 전제에서 선택되었다. 예상한 바와 같이, PD-1은 CD11a와 공동 동원 시 억제 기능을 갖지 않았다. 이들 결과는 추가로 지질 래프트 상주 분자(즉, CD48)에 의한 PD-1 활성화가 PD-1을 효과적으로 활성화시켜 T 세포 확장을 억제할 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
PD-1 및 CD48에 대한 이중특이적 항체는 PD-1 활성화를 유도하여 AR 자극된 사람 T 세포에서 사이토킨 분비 및 NFAT 활성화를 조절한다. 별도의 모노클로날 항체 코팅 비드를 사용하여 수득된 결과는 PD-1과 CD48의 분자 위치화가 활성화된 사람 T 세포에 대한 억제 신호를 제공할 것이라는 가설을 시험하기 위해 이중특이적 항체(BsAbs)를 생성하도록 본원 발명자를 자극하였다(도 7). 공개된 항체가 생성되었고(특허 출원 WO 2011/110621A1의 효능작용 항-PD-1 항체 및 US2012/0076790의 항-CD48 Ab), BsAb를 놉 또는 홀 단일 중쇄/경쇄 작제물로서 가공하여 항-PD-1 및 항-CD48(PD-1/CD48), 또는 대조군으로서 항-PD-1 및 항-TNP(PD-1/ISO)을 포함하는 BsAb를 생성하였다(도 7a). PD-1 또는 CD48에 대한 각 아암의 결합은 PD-1 및 CD48 결합 둘다를 검출하기 위해 PD-1을 과발현하거나 CD48 결합 만을 검출하기 위해 PD-1 발현이 결핍된 Jurkat 세포에 대한 유동 세포 분석에 의해 입증되었다(도 7b). 상기된 Jurkat PD-1 상보성 검정 시스템을 사용하여, 본원 발명자는 PD-1/CD48 BsAb가 PD-1/ISO 대조군보다 약 3배 더 강력하게 PD-1 활성화를 유도한다는 것을 입증하였고, 이는 BsAb 포맷을 사용한 PD-1/CD48 공동위치화가 또한 증진된 PD-1 인산화를 유도함을 확인시켜준다(도 6). PD-1/CD48 BsAb의 기능적 효과를 평가하기 위해, 사람 기억 CD4+ T(PD1+) 세포를 플레이트 결합 PD-1/CD48 BsAb 또는 대조군 항체의 존재 하에 플레이트 결합 항-CD3e로 자극하고, 사이토킨 분비에 대해 분석하였다(도 7c). 상기 분석은 PD-1/CD48 BsAb가 염증 촉진 사이토킨 IL2의 분비를 상당히 감소시켰지만 항염증성 사이토킨 IL-10의 생산을 증진시켰기 때문에 PD-1/CD48 BsAb의 면역조절 효과를 밝혔다. IL-2 분비는 NFAT 잔사 활성화를 요구하기 때문에(Chow et al., 1999), NFAT 활성화에 대한 PD-1/CD48 BsAb의 효과를 PD-1 및 NFAT-루시퍼라제 리포터 둘다를 발현하는 Jurkat T 세포에서 평가하고 공동 자극을 위한 THP-1 세포의 존재 하에 항-CD3e로 활성화시켰다. 상기 분석은 PD-1/CD48 BsAb가 대조군 항체보다 >10-30% NFAT 리포터를 감소시킬 수 있음을 보여주었고 PD-1의 CD48 의존적 활성화가 또한 IL-2 생성을 유도하는 주요 T 세포 이펙터 전사 이벤트를 억제함을 지적한다.
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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 97 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 98 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys 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aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccgcga ggagatgacc 1080 aagaaccagg taagtttgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg t 1341 <210> 159 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser 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<400> 160 gaagtgcagc tggtggaatc tggcggagga cttgttcaac ctggcggcag cctgaaactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctgggt ccgacagacc 120 cctgagaaga gactggaatg ggtcgcctac atcagctctg gcggcggaag cagctactac 180 cctgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acaccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatgt ccagcctgaa gtctgaggac accgccgtgt actactgtgc cagactgcct 300 cactacttcg ccatggattg ttggggccag ggcacatctg tgaccgttag ttctgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agcgcgttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgctgg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccgcga ggagatgacc 1080 aagaaccagg taagtttgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg t 1341 <210> 161 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 161 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 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Synthetic polynucleotide" <400> 162 gaagtgcagc tggtggaatc tggcggagga cttgttcaac ctggcggcag cctgaaactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctgggt ccgacagacc 120 cctgagaaga gactggaatg ggtcgcctac atcagctctg gcggcggaag cagctactac 180 cctgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acaccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatgt ccagcctgaa gtctgaggac accgccgtgt actactgtgc cagactgcct 300 cactacttcg ccatggatta ttggggccag ggcaccagcg tgaccgtttc ttctgcctcc 360 acaaagggcc cttccgtgtt ccccctggcc ccttgctccc ggtccacctc cgagtctacc 420 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480 tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc ctccggcctg 540 tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgccc tcctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 600 tgtaacgtgg accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660 ggccctccct gccccccctg ccctgcccct gaatttctgg gcggaccctc cgtgttcctg 720 ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780 gtggtggacg tgtcccagga agatcccgag gtccagttta attggtacgt ggacggcgtg 840 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaactccac ctaccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960 gtgtccaaca agggcctgcc ctccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020 ccccgcgagc cccaggtgta caccctgcct ccaagccagg aagagatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140 tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tgtactctcg gctgaccgtg gacaagtccc ggtggcagga aggcaacgtc 1260 ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 1320 ctgagcctgg gc 1332 <210> 163 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly 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Claims (35)

  1. 하기를 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 43의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 44의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 45의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 1의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 43의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 46의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 45의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 1의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 2의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 3의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 47의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 48의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 49의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 4의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 5의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 6의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 50의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 51의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 52의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 7의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 8의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 9의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 53의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 54의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 55의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 10의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 11의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 12의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 56의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 57의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 58의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 13의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 15의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 59의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 60의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 61의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 16의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 17의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 18의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 62의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 63의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 64의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 19의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 20의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 21의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 65의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 66의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 67의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 22의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 23의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 24의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 68의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 69의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 70의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 25의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 26의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 27의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 71의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 72의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 58의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 28의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 29의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 74의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 75의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 164의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 167의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 80의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 81의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 82의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 33의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 14의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 34의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 83의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 84의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 85의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 16의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 35의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 36의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 86의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 87의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 88의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 37의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 38의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 39의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 89의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 90의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 91의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 40의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 41의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 42의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 74의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 75의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 30의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 76의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 164의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 31의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 78의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 166의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    서열번호 73의 아미노산 서열 (H-CDR1); 서열번호 79의 아미노산 서열(H-CDR2); 및 서열번호 77의 아미노산 서열(H-CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 165의 아미노산 서열 (L-CDR1); 서열번호 167의 아미노산 서열(L-CDR2); 및 서열번호 32의 아미노산 서열(L-CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 사람화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 모노클로날 항체, Fab, F(ab’)2, Fv 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 각각 서열번호 108 및 서열번호 92; 각각 서열번호 109 및 서열번호 93; 각각 서열번호 110 및 서열번호 94; 각각 서열번호 111 및 서열번호 95; 각각 서열번호 112 및 서열번호 96; 각각 서열번호 113 및 서열번호 97; 각각 서열번호 114 및 서열번호 98; 각각 서열번호 115 및 서열번호 99; 각각 서열번호 116 및 서열번호 100; 각각 서열번호 117 및 서열번호 101; 각각 서열번호 118 및 서열번호 102; 각각 서열번호 119 및 서열번호 103; 각각 서열번호 120 및 서열번호 104; 각각 서열번호 121 및 서열번호 105; 각각 서열번호 122 및 서열번호 106; 각각 서열번호 123 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호 131, 서열번호 133, 서열번호 135, 서열번호 137 또는 서열번호 139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 125, 서열번호 127 또는 서열번호 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 각각 서열번호 131 및 서열번호 125; 각각 서열번호 133 및 서열번호 127; 각각 서열번호 135 및 서열번호 127; 각각 서열번호 137 및 서열번호 129; 또는 각각 서열번호 139 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 각각 서열번호 131 및 서열번호 125; 각각 서열번호 133 및 서열번호 127; 각각 서열번호 135 및 서열번호 127; 각각 서열번호 137 및 서열번호 129; 또는 각각 서열번호 139 및 서열번호 129의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역이 Ser228Pro 돌연변이를 갖는 IgG4의 중쇄 불변 영역인, 항-PD-1 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역이 IgG1의 중쇄 불변 영역인, 항-PD-1 항체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역이 Leu235Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 갖는 IgG1의 중쇄 불변 영역인, 항-PD-1 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 카파 및 람다로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항체가 각각 서열번호 143 및 서열번호 141; 각각 서열번호 147 및 서열번호 145; 각각 서열번호 149 및 서열번호 145; 각각 서열번호 153 및 서열번호 151; 또는 각각 서열번호 155 및 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항-PD-1 항체.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 모노클로날 항체인, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 유효량의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, PD-1 경로 장애를 치료하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 경로 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. PD-1 경로 장애를 치료하기 위한 약물의 제조에서 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  21. 상기 질환이 전신성 경화증(SSc), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성근염, 거대 세포 동맥염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제18항의 방법, 제19항의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제20항의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 비경구 투여 경로, 정맥내 투여 경로 또는 피하 투여 경로에 의해 투여되는, 방법, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 용도.
  23. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제14항에 따른 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제23항 또는 제24항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  26. 제25항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포가 포유 동물 세포인, 숙주 세포.
  28. 하기의 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법:
    - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계, 및
    - 상기 항체를 회수하는 단계.
  29. 하기의 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법:
    - 제14항에 따른 중쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 제14항에 따른 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 항체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계; 및
    - 상기 항체를 회수하는 단계.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 항체를 약제학적 조성물에 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제1 항-PD-1 효능제 항원 결합 부위 및 제2 항원-결합 부위를 포함하는 다중 특이적 항체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위가 항-CD48 결합 부위, 항-CD-2 결합 부위, 항-CD11a 결합 부위 또는 항-CD3 결합 부위인, 다중 특이적 항체.
  34. 제32항에 있어서, 상기 제1 항-PD-1 효능제 항원 결합 부위가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 다중 특이적 항체.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체.


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