KR20200005746A - 이중특이적 항체의 제조 방법, 이중특이적 항체 및 이러한 항체의 치료적 용도 - Google Patents

이중특이적 항체의 제조 방법, 이중특이적 항체 및 이러한 항체의 치료적 용도 Download PDF

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티나 부흐
크리스티안 그라프
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토마스 요스토크
한스-페터 크노프
롤프 쾰러
이리 코파리크
슈테펜 욘 올리퍼
트하팔쿠마어 파텔
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Abstract

본 발명은 2가의 이중특이적 단클론 항체(bbmAb) 또는 이의 변이체, 및 포유동물 세포주에서 2종의 상이한 단클론 항체의 변형된 Fc-5 돌연변이된 유도체를 공동 발현시킴으로써 이러한 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이중특이적 항체의 제조 방법, 이중특이적 항체 및 이러한 항체의 치료적 용도
[서열목록]
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는 서열목록을 포함한다. 2018년 5월 30일에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 PAT057716-WO-PCT_SL.txt이고, 크기가 68,498 바이트이다.
[기술분야]
본 발명은 2가의 이중특이적 단클론 항체(bbmAb) 또는 이의 변이체, 및 포유동물 세포주에서 2종의 상이한 단클론 항체의 소위 노브-인투-홀(knob-into-hole) 변형된 FC 돌연변이된 유도체를 공동 발현시킴으로써 이러한 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이중특이적 항체, 즉, 두 개의 별개의 에피토프에 결합하는 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 이중특이적 항체 생성을 위한 한 가지 접근법은 예컨대, Merchant 등(Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998))에 의해 기술된 소위 노브-인투-홀(KiH) 접근법으로, 여기서 제1 중쇄 IgG는 Y349C, T366S, L368A, Y407V와 같은 점 돌연변이를 도입하여 홀 유사 구조를 나타내도록 변형되고; 제2 중쇄 IgG는 점 돌연변이 S354C, T366W를 도입하여 노브 유사 구조를 나타내도록 변형된다((Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), 678쪽, 표 1). 그런 다음, 두 개의 상이한 IgG 구조가 상호 작용하여 두 개의 상이한 경쇄 및 두 개의 상이한 중쇄로 구성된 2가의 이중특이적 항체(bbmAb), 즉 이종사량체 단백질을 형성한다.
동일한 숙주 세포주에서 두 개의 KiH 변형된 mAb를 발현시킬 때, 원하는 bbmAb는 통계적으로 발현된 단백질의 겨우 25%만을 구성하며, 75%는 소위 생성물 관련 불순물이다(Klein, Ch. et al., 2012).
이를 극복하기 위한 일부 접근법, 예컨대 추가 서열 변형을 적용하여 정확한 H-L-결합을 강제함으로써 정확한 bbmAb의 형성을 촉진하는 접근법이 당해 분야에 공지되어 있다(개요는 문헌[Klein, Ch. et al., 2012; Kontermann, R. and Brinkmann, U., 2015] 참조). 그러나 이러한 추가 변형은 항약물 항체의 위험을 증가시킬 수 있다.
bbmAb를 생성하기 위한 또 다른 접근법은 WO12023053A2 또는 WO04009618A2에 개시되어 있는데, 이는 다른 가변 쇄와 조합하여 공유 중쇄 또는 경쇄를 사용한다. 그러나 중쇄를 일정하게 유지하면 결합제가 스크리닝될 수 있는 항체 레퍼토리의 다양성이 상당히 감소된다.
bbmAb의 생성에 대한 또 다른 접근법은 US9212230에 개시되어 있으며, 상이한 변형을 갖는 mAb의 개별적인 발현 및 정제를 수반한다. 생성된 mAb는 최종적으로 시험관 내에서 셔플링되어 의도한 bbmAb를 형성한다. 이러한 시험관 내 셔플링은 신중한 검증 및 분석적 평가가 필요한 복잡한 추가 공정 단계로, 비용을 크게 증가시킬 수 있다.
따라서, bbmAb를 생성하는 기존의 방법은 결합제 스크리닝에 이용할 수 있는 항체 레퍼토리의 다양성을 제한하거나 임상 개발 및 상업화에 적합한 규모로 제조할 수 있도록 충분히 비용 효과적인 방식으로 충분한 전체 수율, 순도 및 생성물 품질을 제공하지 않을 수 있다. 또한, 단백질 쇄의 임의의 변형은 본질적으로 항약물 항체를 유도할 위험성을 증가시킨다. 따라서, 최소한의 단백질 공학만을 요구하는 접근법이 임상적으로 유리할 수 있다.
2가 이중특이적 항체 제조를 위한 개선된 방법을 제공할 필요가 있다. 특히, 합리적인 비용으로 임상 개발 및 상업적 제조를 진행하기에 충분한 전체 수율, 순도 및 생성물 품질을 보장하는 2가 이중특이적 단클론 항체(bbmAb)의 제조 방법이 필요하다.
본 발명은 무엇보다도 다음의 장점 중 하나 이상을 갖는 bbmAb의 생성 방법을 제공한다: 공유 경쇄 또는 중쇄가 필요하지 않으므로 결합제를 확인하기 위하여 큰 항체 레퍼토리 사용을 가능하게 한다; H-쇄 이량체화를 유도하는 돌연변이 이외에 광범위한 단백질 공학을 필요로 하지 않으므로 항약물 항체의 위험성을 제한한다; 발현이 일반 세포주에서 이루어지므로 비용 효과적이어서, 특정 시험관 내 셔플링 없이 하나의 세포 배양 과정에서 bbmAb가 생산될 수 있다; 생성물 관련 불순물이 효과적으로 제거될 수 있으므로 인간 사용에 적합한 고품질 재료를 생산한다.
본 발명은 카파 및 람다 유형의 항체를 확인하는 데 유용하며, 여기서 경쇄는 대응물의 중쇄에 대하여 강한 마구잡이식 결합을 나타내지 않는다. 이는 항체를 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하게 만든다. 이 방법의 장점은 두 경쇄가 본래의 중쇄 결합 상대를 바꾸어 H1L2-H2L1 유형의 생성물 관련 불순물을 초래하는 항체 조합이 선택에서 취소될 수 있다는 점일 수 있다. 이러한 생성물 관련 불순물은 최신 정제 공정을 이용하여 고갈시키기가 용이하지 않기 때문에 이것은 유리하다.
아래에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 구현예는 CHO 공동 발현을 이용하여 bbmAb를 생물제제의 임상 개발 및 상업화에 적합한 수율 및 품질로 제조할 수 있게 한다.
본 발명의 제1 양태에서 공통 숙주 세포에서 공동 발현에 적합한 이중특이적 항체가 제공되는데, 이때, 항체는 a) 제1 표적에 특이적으로 결합하는, 람다 야생형의 가변 경쇄(VL1) 및 야생형의 가변 중쇄(VH1), 및 이종이량체화 변형이 있는 제1 불변 중쇄(CH1)를 갖는 면역글로불린인 제1 부분 및 b) 제1 표적과 상이한 제2 표적에 특이적으로 결합하는, 카파 야생형의 가변 경쇄(L2) 및 야생형의 가변 중쇄(H2), 및 제1 불변 중쇄의 이종이량체화 변형에 대해 상보적인 이종이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)를 갖는 면역글로불린인 제2 부분을 포함하고, 제1 부분과 제2 부분은 공통 숙주 세포에서 공동 발현될 때 이중특이적 항체를 형성한다.
제1 양태의 추가 구현예에서, 공통 숙주 세포에서 공동 발현에 적합한 이중특이적 항체는, 정확하게 매치된 이중특이적 항체로부터 잘못 매치된 단편을 제거하여 이중특이적 항체를 정제한 후, 적어도 60%(질량), 70%(질량), 80%(질량), 85%(질량) 순수한, 예컨대 적어도 90%(질량) 순수한, 95%(질량), 96%(질량), 97%(질량), 98%(질량), 또는 99%(질량) 순수한 이중특이적 항체를 생성한다.
이중특이적 항체의 제1 및 제2 불변 중쇄는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 바람직하게는 IgD, IgE 또는 IgG일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 불변 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 가장 바람직하게는 IgG1이다. 일 구현예에서, 제1 가변 경쇄는 람다 유형이고, 제2 가변 경쇄는 카파 유형이다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 가변 경쇄는 람다 1 유형이고, 제2 가변 경쇄는 카파 6 유형이다.
제1 및 제2 불변 중쇄는 IgG1일 수 있으며, 이때, 제1 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖거나, 또는 제1 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖는다. 선택적으로, 제1 및 제2 불변 중쇄는 추가로 이황화 가교를 생성하는 돌연변이를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 제1 면역글로불린 VH1 도메인, 제1 면역글로불린 VL1 도메인, 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함하는데, 이때 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 (예컨대, 서열에) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하거나(상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐); 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고(상기 CDR1은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 81의 아미노산 서열을 가짐); 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 (예컨대, 서열에) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하거나(상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가짐); 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고(상기 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 가짐); 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 (예컨대, 서열에) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하거나(상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가짐); 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고(상기 CDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열을 가짐); 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 (예컨대, 서열에) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하거나(상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 가짐); 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다(상기 CDR1은 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 65의 아미노산 서열을 가짐).
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 제1 면역글로불린 VH1 도메인, 제1 면역글로불린 VL1 도메인, 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함하는데, 이때 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항체는 제1 면역글로불린 중쇄, 제1 면역글로불린 경쇄, 제2 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 경쇄를 포함하는데, 이때 제1 면역글로불린 중쇄는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 면역글로불린 경쇄는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 면역글로불린 경쇄는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
제2 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 이중특이적 항체의 선택 방법이 제공되는데, 상기 방법은 제1 부분과 제2 부분을 선택하는 제1 단계; 제1 부분과 제2 부분을 공통 숙주 세포에서 공동 발현시켜 제1 부분과 제2 부분을 포함하는 이중특이적 항체를 생성하는 제2 단계; 정확하게 매치된 이중특이적 항체로부터 잘못 매치된 단편을 제거하여 이중특이적 항체를 정제하는 제3 단계를 포함한다. 구현예에서, 제3 정제 단계는 적어도 60%(질량), 70%(질량), 80%(질량), 85%(질량) 순수한, 예컨대 적어도 90%(질량) 순수한, 95%(질량), 96%(질량), 97%(질량), 98%(질량), 또는 99%(질량) 순수한 이중특이적 항체를 생성한다.
제3 양태에 따르면, 공통 숙주 세포에서의 공동 발현에 의해 제1 양태에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 제1 부분과 제2 부분을 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 생성하는 제1 단계; 적어도 하나의 벡터를 공통 숙주 세포에 도입하는 제2 단계; 이중특이적 항체를 특이적으로 발현하는 세포를 선택하는 제3 단계; 세포가 이중특이적 항체를 발현하는 조건 하에서 선택된 세포를 배양하는 제4 단계; 및 적어도 60%(질량), 70%(질량), 80%(질량), 85%(질량) 순수한, 예컨대 적어도 90%(질량) 순수한, 95%(질량), 96%(질량), 97%(질량), 98%(질량), 또는 99%(질량) 순수한 이중특이적 항체를 정제하는 제5 단계를 포함한다.
구현예에서, 제1 단계는 제1 부분을 암호화하는 제1 벡터 및 제2 부분을 암호화하는 제2 벡터를 생성하는 것을 포함한다.
제4 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 이중특이적 항체의 제1 부분 또는 제2 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터 및 선택 마커를 포함하는 발현 시스템이 제공된다.
구현예에서, 발현 시스템은 제1 선택 마커(sm I)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 제1 선택 마커(sm I)와 상이한 제2 선택 마커(sm II)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구현예에서, 제1 선택 마커(sm I)는 엽산염 수송체 또는 돌연변이된 엽산염 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 돌연변이된 엽산염 수용체는 야생형 엽산염 수용체와 비교하여 감소된 엽산염 결합 친화도를 갖고, 제2 선택 마커(sm II)는 DHFR이다.
구현예에서, 제1 선택 마커(sm I)는 하이그로마이신이고, 제2 선택 마커(sm II)는 Neo/G418이다.
구현예에서, 발현 시스템은 두 개의 발현 벡터를 포함하는데, 제1 벡터는 적어도 제1 선택 마커(sm I)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 제1 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 제2 벡터는 적어도 제2 선택 마커(sm II)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 제2 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발현 시스템은 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하류의 정지 코돈 및 정지 코돈의 하류에 위치한 면역글로불린 막 앵커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
제5 양태에 따르면, 이전의 양태에 따른 방법에 사용하기 위한 공통 숙주 세포의 선별 방법이 제공되는데, 이 방법은 이전의 양태에 따른 발현 시스템을 포함하는 복수의 숙주 세포를 제공하는 제1 단계; 및 선택 마커에 대해 선택적인 조건 하에서 상기 복수의 숙주 세포를 배양하여 관심 생성물을 발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 선택 배양 배지는, 한계 농도의 엽산염 포함; 및/또는 500 nM 이하의 농도의 엽산 포함; 및/또는 1000 nM 내지 100 pM; 100 nM 내지 1 nM; 15 nM 내지 1 nM; 10 nM 내지 1 nM; 및 10 nM 내지 2.5 nM로부터 선택되는 농도의 엽산 포함; 및/또는 DHFR 억제제 포함; 및/또는 항엽산염 포함; 및/또는 500 nM 이하의 농도의 항엽산염 포함; 및/또는 500 nM 내지 3 nM; 100 nM 내지 10 nM; 50 nM 내지 10nM; 및 50 nM로부터 선택되는 농도의 MTX 포함; 및/또는 엽산염 농도의 최대 20배 농도의 항엽산염 포함; 및/또는 엽산염 농도의 10 내지 20배 농도의 항엽산염 포함; 및/또는 최대 15 nM 농도 및 MTX의 최대 20배 등몰 농도의 엽산 포함 배지를 포함하는 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 숙주 세포는 발현 시스템을 포함하는데, 이때 제1 부분 또는 제2 부분의 적어도 일부분은 면역글로불린 막관통 앵커 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 노출되고 있으며, 복수의 숙주 세포를 융합 폴리펩티드와 결합하는 검출 화합물과 접촉시키고; 세포 표면에 결합된 검출 화합물의 존재 또는 양을 기반으로 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다.
구현예에서, 검출 화합물은 제1 또는 제2 표적, 또는 이의 유도체, 및 검출 라벨을 포함한다.
구현예에서, 이중특이적 항체를 정제하는 제5 단계는 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
구현예에서, 크로마토그래피는 제1 포획 단계; 제2 연마 단계; 및 선택적으로 제3 연마 단계를 포함한다.
구현예에서, 제1 포획 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 당해 분야에 잘 알려져 있으며 상업적으로 용이하게 이용 가능한 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예를 들어 람다Fab셀렉트(LambdaFabSelect™), 당해 분야에 잘 알려져 있으며 상업적으로 용이하게 이용 가능한 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예를 들어 카파셀렉트(KappaSelect™), 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 당해 분야에 잘 알려져 있으며 상업적으로 용이하게 이용 가능한 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 캡토 어드히어(Capto™ adhere) 또는 프랙토겔(Fractogel™) EMD SO3, 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 원리로 수행된다.
구현예에서, 제2 연마 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트, 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트, 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 캡토 어드히어, 또는 프랙토겔 EMD SO3, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 바이러스 불활성화로 구성된 군으로부터 선택되는 원리로 수행된다.
구현예에서, 제3 연마 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트, 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트, 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 캡토 어드히어, 또는 프랙토겔 EMD SO3, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 바이러스 불활성화로 구성된 군으로부터 선택되는 원리로 수행된다.
구현예에서, 방법은 제1 단백질 A 포획, 예컨대 Mab셀렉트(MabSelect™) SuRe™ 단계, 제2 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계, 및 제3 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계; 또는 제1 단백질 A, 예컨대 Mab셀렉트 SuRe™ 단계, 제2 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계, 및 제3 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계; 또는 제1 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계 및 제2 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계; 또는 제1 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계 및 제2 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계를 포함한다.
구현예에서, 세포주는 CHO 세포, 비생산 하이브리도마, 예컨대 Sp 2/0 또는 NS0, 인간 유래 세포주, 예컨대 HEK 또는 PER.C6, 새끼 햄스터 신장(BHK) 유도체, 효모 또는 사상 진균, 원핵 박테리아, 예컨대 E. 콜라이 또는 슈도모나스 플루오레센스, 식물 유도체, 조류 및 섬모충으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제6 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
제7 양태에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 항체, 또는 제6 양태에 따른 약학적 조성물이 제공된다.
제7 양태에 따르면, 인플라마솜(inflammasome) 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 항체, 또는 제6 양태에 따른 약학적 조성물이 제공된다.
제8 양태에 따르면, 인플라마솜 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 항체, 또는 제6 양태에 따른 약학적 조성물이 제공되는데, 이때 인플라마솜 관련 질환은 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 폐 사르코이드증, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제9 양태에 따르면, 유효량의 제1 양태에 따른 항체 또는 제6 양태에 따른 약학적 조성물을 인플라마솜 관련 장애를 앓는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플라마솜 관련 장애의 치료 방법이 제공된다.
인플라마솜 관련 장애는 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 폐 사르코이드증, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 또는 크론병일 수 있다.
도 1은 구현예에 따른 벡터 구성의 개략적 개요이다.
도 2a 내지 도 2e는 구현예에 따른 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 2a는 구현예에 따른 탈글리코실화된 온전한 bbmAb의 RP-UV 크로마토그램이다. 도 2b는 구현예에 따른 온전한 탈글리코실화된 bbmAb1의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼이다. 도 2c는 구현예에 따른 bbmAb의 파파인 분해된 단편을 보여주는 RP-UV 크로마토그램이다. 도 2d는 구현예에 따른 bbmAb의 IdeS 소화된 단편을 보여주는 RP-UV 크로마토그램이다. 도 2e는 구현예에 따른 bbmAb의 탈글리코실화 및 DTT 환원된 단편을 보여주는 RP-UV 크로마토그램이다.
도 3a 내지 도 3d는 구현예에 따른 RP-UV 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 3a는 배양 후 구현예에 따른 bbmAb의 발현 순도 프로파일을 보여주는 크로마토그램이다. 도 3b는 람다Fab셀렉트에 의한 포획 후 구현예에 따른 bbmAb의 크로마토그램이다. 도 3c는 Mab셀렉트 SuRe™를 이용한 포획 후 구현예에 따른 bbmAb의 크로마토그램이다. 도 3d는 람다Fab셀렉트에 의한 포획, 프랙토겔 EMD SO3에 의한 연마 및 한외여과 후 구현예에 따른 bbmAb의 크로마토그램이다.
도 4a 내지 도 4m은 이중특이적 미스매칭에 대한 상이한 옵션의 개략적 개요이다. 도 4a는 mAb1 노브 (람다) 단량체의 개략도로, 숫자 1은 가변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 2는 제1 불변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 3은 제2 불변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 4는 제3 불변 중쇄 도메인을 나타낸다. 숫자 5는 가변 경쇄 도메인을 나타내고, 숫자 6은 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 도 4b는 mAb1 노브 (람다) 동종이량체의 개략도이다. 도 4c는 mAb2 홀 (카파) 단량체의 개략도로, 숫자 7은 가변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 8은 제1 불변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 9는 제2 불변 중쇄 도메인을 나타내고, 숫자 10은 제3 불변 중쇄 도메인을 나타낸다. 숫자 11은 가변 경쇄 도메인을 나타내고, 숫자 12는 불변 중쇄 도메인을 나타낸다. 도 4d는 mAb2 홀 (카파) 동종이량체의 개략도이다. 도 4e는 하나의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb1 노브 동종이량체의 개략도이다. 도 4f는 두 개의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb1 노브 동종이량체의 개략도이다. 도 4g는 하나의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb1 노브 동종이량체의 개략도이다. 도 4h는 하나의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb2 홀 동종이량체의 개략도이다. 도 4i는 두 개의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb2 홀 동종이량체의 개략도이다. 도 4j는 하나의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 mAb2 홀 동종이량체의 개략도이다. 도 4k는 하나의 카파 (CH/LC) 짝짓기 오류가 있는 bbmAb1의 개략도이다. 도 4l은 하나의 람다 (CH/LC) 짝짓기 오류가 있는 bbmAb1의 개략도이다. 도 4m은 두 개의 CH/LC 짝짓기 오류가 있는 bbmAb1의 개략도이다.
도 5는 실시예에 따른 ECL 기반 친화도 결정의 적정 곡선을 도시한 것이다.
도 6a와 도 6b는 실시예에 따른 두 개의 그래프를 도시한 것이다.
도 7a와 도 7b는 실시예에 따른 두 개의 그래프를 도시한 것이다.
도 8a와 도 8b는 실시예에 따른 mRNA 발현 수준을 도시한 것이다.
도 9a와 도 9b는 실시예에 따른 mRNA 발현 수준을 도시한 것이다.
도 10a와 도 10b는 실시예에 따른 두 개의 그래프를 도시한 것이다.
도 11은 실시예에 따른 통계적 상관 관계를 도시한 그래프이다.
본 개시는 무엇보다도 람다(λ) 유형의 경쇄가 있는 특정 항체가 카파(κ) 유형의 경쇄가 있는 특정 항체와 공동 발현되어 원하는 bbmAb를 형성할 수 있다는 예상치 못한 발견을 기반으로 한 것이다.
이론에 구속되기를 바라지 않지만, 각각의 경쇄 및/또는 중쇄의 CDR은 어떠한 람다(λ) 유형의 경쇄가 카파(κ) 유형의 경쇄가 있는 특정 항체와 공동 발현되어 형성된 bbmab를 성공적으로 수득할 수 있는지에 상당히 영향을 미칠 수 있다.
이하에서 단일특이적 결합제라고도 지칭되는, 카파(κ) 유형의 경쇄가 있는 특정 항체와 공동 발현되어 원하는 bbmAb를 형성할 수 있는 람다(λ) 유형의 경쇄가 있는 항체는 카파 또는 람다 유형의 항체 중 두 유형의 항체 모두를 수득할 기회를 제공하는 기술, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리, 예컨대 HuUCAL GOLD® 또는 HuCAL PLATINUM®(MorphoSys)를 이용하여, 또는 관련 있는 인간 면역글로불린 서열이 유전자 공학에 의해 동물의 게놈으로 도입된 형질전환 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 예컨대, OmniAb 항체(OMT), Kymouse™(Kymab), Trianni Mouse™(Trianni) 또는 AlivaMab 마우스(Ablexis)(기준)는 카파 또는 람다 유형의 항체를 생성할 수 있다. 이러한 단일특이적 결합제를 생성하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 관련 있는 관심 표적을 향한 카파 또는 람다 단일특이적 결합제의 다양한 세트를 생성하는 데 널리 적용된다. 개별 단일특이적 결합제는 관련 있는 생물학적 파라미터, 예컨대 친화도 또는 효능과 관련하여 특성이 분석되며, 또한 예를 들어 당해 분야에 매우 잘 알려져 있는 소위 개발가능성 특성(예컨대, Lorenz et al., American Pharmaceutical Review, August 2014) 판단과 관련 있는 물리화학적 특성에 대해서도 스크리닝된다. 아래에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 최고의 특성을 나타내는 단일특이적 결합제는 최종적으로 예컨대, CHO 세포에서 공동 발현된다. 제1 표적에 결합하는 카파 유형 항체가 제2 표적에 결합하는 람다 유형 항체와 조합되는 조합 및 그 반대의 조합만이 공동 발현에 의해 시험된다. 최고의 프로파일을 가져오는 조합, 특히 하나의 경쇄(예컨대, L1, 경쇄 1, 예컨대, 람다)의 잘못된 중쇄(예컨대 H2, 중쇄 2)에 대한 마구잡이식 결합을 적은 양만 보여주는 조합을 선택하고자 하는 의도로, 생성된 공동 발현 생성물 및 관련 있는 생성물 관련 불순물이 상세히 특성 분석된다. 이 방법의 장점은 두 경쇄가 본래의 중쇄 결합 상대를 바꾸어 H1L2-H2L1 유형의 생성물 관련 불순물을 초래하는 항체 조합이 선택에서 취소될 수 있다는 점일 수 있다. 이러한 생성물 관련 불순물은 최신 정제 공정을 이용하여 고갈시키기가 용이하지 않기 때문에 이것은 유리하다. 개별 항체를 공동 발현시키는 방법 및 공동 발현 생성물을 분석하는 방법은 아래에서 더욱 상세히 서술된다.
특정 항체, 주로, 경쇄 Vκ6이 있는, IL-1β에 결합하는 mAb2와 경쇄 Vλ1이 있는, IL-18에 결합하는 mAb1이 예로서 사용되었다.
바람직한 일 구현예에서, Ridgway et al., (1996)에 따른 두 개의 항체의 Fc 부분의 KiH 변형이 사용되었다. 다른 항체들 또한 시험하였다.
아래의 특정 예에서 나타난 바와 같이, 바람직한 구현예 bbmAb1은 임상 개발 및 상업화를 진행하기에 충분한 전체 수율, 순도 및 생물제제 및 진단에 필요한 생성물 품질을 보장하는 단일, 일반 세포주로 발현된다.
1. 정의
본 명세서를 해석할 목적으로, 다음의 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 복수형을 포함하고, 그 반대도 마찬가지일 것이다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
용어 "IL-18"은 IL-18 폴리펩티드, 인터루킨-18 폴리펩티드, IFN-감마 유도 인자 또는 인터페론-감마 유도 인자 또는 INF-γ 유도 인자의 동의어이다. 용어 "IL-18"은 다른 종이 명시되지 않는 한 인간 IL-18을 지칭한다. IL-18은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 제품 참고번호 #B001-5로 MBL® International Corporation으로부터 입수 가능하다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 용어 IL-18은 프로형 또는 성숙형이 의미됨이 명시되지 않는 한 프로-IL-18(프로테아제 절단 전의 성숙 IL-18의 전구체)과 성숙 IL-18(프로테아제 절단 후) 둘 다를 상호 교환적으로 포괄한다.
용어 "IL-1β" 또는 "IL-1b"는 IL-1β 폴리펩티드 및 인터루킨-1β 폴리펩티드의 동의어이다. 용어 "IL-1β"는 다른 종이 지시되지 않는 한 인간 IL-18를 지칭한다. IL-1β는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 제품 참고번호 #10139-HNAE-5로 Sino Biological로부터 입수 가능하다.
용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 또는 이의 기능적 단편을 지칭한다. 자연 발생적인 항체는 보통 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 구성된 사량체를 전형적으로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 보통 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입), IgM 및 IgE를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄는 카파(κ) 쇄와 람다(λ) 쇄를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 전형적으로 항원 인식을 담당하는 데 반하여, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다.
본 명세서에 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항원 부분")은 IL-18 또는 IL-1β 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전체 길이 또는 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전체-길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음은 알려져 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
더욱이, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 가요성 링커에 의해 연결될 수 있으며, 이러한 링커는 이들을 VL 영역 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단쇄 Fv(scFv)로서 알려져 있음)로서 만들어질 수 있게 한다(예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sc;. 85:5879-5883] 참조). 이러한 단쇄 항체 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄시키고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 이러한 단편은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 그 이용성에 대해 스크리닝된다.
용어 "단리된"은 본 명세서 전체에 걸쳐, 면역글로불린, 항체 또는 폴리뉴클레오티드가 경우에 따라 자연계에서 발생할 수 있는 것과는 다른 물리적 환경에 존재할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 상보성 결정 영역("CDR")은 CDR이 또 다른 정의에 따라 정의된다고 명시되지 않는 한 Kabat 정의에 따라 정의된다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("Kabat" 넘버링 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948]("Chothia" 넘버링 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" 넘버링 체계)에 기재된 것들을 포함한, 다수의 주지된 체계 중 임의의 것을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 고전적인 형식의 경우, Kabat 하에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 넘버링된다. Chothia 하에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26~32(HCDR1), 52~56(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 아미노산 잔기는 26~32(LCDR1), 50~52(LCDR2), 및 91~96(LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat 및 Chothia 둘 모두의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 이루어진다. IMGT 하에 VH 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 26~35(CDR1), 51~57(CDR2) 및 93~102(CDR3)로 넘버링되고, VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 27~32(CDR1), 50~52(CDR2), 및 89~97(CDR3)("Kabat"에 따른 넘버링)로 넘버링된다. IMGT 하에, 항체의 CDR 영역은 IMGT/DomainGap Align 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
관례상, 중쇄의 CDR 영역은 전형적으로 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3으로 지칭되고, 경쇄의 CDR 영역은 L-CDR1, LCDR2 및 L-CDR3으로 지칭된다. 이들은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단의 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 기원의 서열들로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한 것이다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어, 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 예를 들어, 문헌[Knappik, et al., (2000) J Mol Biol; 296:57-86]에 기술된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의하거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래되는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체는 포함하지 않고자 한다.
용어 "인간 단클론 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 형질전환 또는 염색체이식 동물(예컨대 마우스)로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질변환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자의 전부 또는 일부의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나 특정 구현예에서 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열을 위한 형질전환 동물이 사용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 유발) 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체 내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "IL-18에 특이적으로 결합하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 인간 IL-18에 결합하는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "IL-1β에 특이적으로 결합하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 인간 IL-1β에 결합하는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다.
"IL-18 이외의 항원과 교차 반응하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 그 항원과 결합하는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다. "IL-1β 이외의 항원과 교차 반응하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 그 항원과 결합하는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다.
"특정 항원과 교차 반응하지 않는" 결합 분자는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출할 수 없는 결합을 나타내는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "길항제"는 활성화 화합물의 존재 하에 신호전달 활성을 억제하는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다. 예를 들어, IL-18의 경우, IL-18 길항제는 인간 세포 분석, 예컨대 인간 혈액 세포의 IL-18 의존성 인터페론-감마(IFN-γ) 생산 분석에서 IL-18의 존재 하에 신호전달 활성을 억제하는 결합 분자이다. 인간 혈액 세포의 IL-18 의존성 IFN-γ 생산 분석의 예는 아래 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.
용어 2가 이중특이적 항체(들)은 두 개의 상이한 표적, 예컨대 IL-18 및 IL-1β에 결합하는 항체를 지칭한다.
이중특이적 항체는 "이종이량체"로, 이는 한 부분은 제1 표적에 특이적인 제1 항체로부터 유래하며, 또 다른 부분은 제2 표적에 특이적인 제2 항체로부터 유래함을 의미한다. "이종이량체화 변형"은 이러한 형성을 촉진하기 위한, 이종이량체 이중특이적 항체를 형성하는 항체의 한 부분 또는 두 부분 모두에 대한 변형이다. 이중특이적 항체를 형성하기 위한 항체의 두 IgG1 부분의 Fc 도메인의 이종이량체화 변형의 예는 제1 중쇄에 부피 큰 아미노산(aa) 측쇄(S354C, T366W)가 있는 "노브"와 작은 aa 측쇄(Y349C, T366S, L368A, Y407V)가 있는 "홀"이 제2 중쇄에 도입되었고, 두 중쇄를 연결하는 CH3 영역의 추가적인 이황화 가교가 있는 것이다(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), 678쪽, 표 1).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "효현 활성이 없는" 항체는 세포 기반 분석에서 표적의 부존재 및/또는 존재 하에 표적 의존적 신호전달 활성을 유의미하게 증가시키지 않는, 예컨대 IL-18의 경우, 인간 혈액 세포 IFN-γ 생산 분석에서 IL-18의 부존재 및/또는 존재 하에 IL-18 의존적 신호전달 활성을 유의미하게 증가시키지 않는 결합 분자를 지칭하고자 한 것이다. 이러한 분석은 아래 실시예에서 더욱 상세히 기술된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 결합 분자-항원 상호 작용의 결합 속도를 지칭하고자 한 것이고, 한편 본 명세서에 사용되는 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 결합 분자-항원 상호 작용의 해리 속도를 지칭하고자 한 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고자 한 것으로, 이는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고, 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당해 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용함으로써 수행된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 결합 분자와 항원 사이의 상호 작용의 강도를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 항체에 대한 "고친화도"는 표적 항원에 대해 1 nM 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비포유동물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "최적화된 뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드 서열이, 생성 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모" 서열로도 공지되어 있는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 본래 암호화된 아미노산 서열을 완전히 유지하도록 조작된다. 본 명세서의 최적화된 서열은 CHO 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었으나, 다른 진핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현 또한 본 명세서에서 고려된다.
용어 "동일성"은 적어도 두 개의 상이한 서열 사이에서의 유사성을 지칭한다. 이 동일성은 동일성 백분율로 표현될 수 있고, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, BLAST(Basic Local Alignment Tool)(Altshul et al., (1990) J MoI Biol; 215:403-410); 문헌[Needleman et al., (1970) J MoI Biol; 48:444-453]의 알고리즘 또는 문헌[Meyers et al., (1988) Comput Appl Biosci; 4:11-17]의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 파라미터 세트는 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임이동 갭 페널티 5를 갖는 블로섬(Blosum) 62 점수 매트릭스일 수 있다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM 120 가중 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS; 4(1):1-17]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율은 보통 유사한 길의 서열을 비교하여 계산된다.
용어 "면역 반응"은 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 포식세포, 과립구, 및 위의 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 지칭하며, 이는 침입 병원체, 병원체 감염 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병적 염증의 경우, 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 손상시키거나, 이들을 파괴하거나, 이들을 인체로부터 제거한다.
"신호 전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 단백질-단백질 상호 작용, 예컨대 성장 인자의 수용체에 대한 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과관계를 지칭하며, 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분으로 신호를 전송한다. 일반적으로, 이 전송은 신호 전달을 유발하는 일련의 반응에서 1개 이상의 단백질 상의 1개 이상의 티로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기의 특이적인 인산화를 수반한다. 끝에서 두 번째 과정은 전형적으로 유전자 발현의 변화를 초래하는 핵 사건을 포함한다.
용어 "중화한다" 및 이의 문법적 변이형은 본 명세서 전체에 걸쳐 표적의 생물학적 활성이 경우에 따라 결합 단백질 또는 항체의 존재 하에 전체적으로 또는 부분적으로 감소됨을 의미한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생적인 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"의 뉴클레오티드는 염기 변형, 예컨대 브로모우리딘 및 이노신 유도체, 리보오스 변형, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포르포로아미데이트를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포의 형질변환 또는 형질감염에 적합하며, 작동 가능하게 연결된 1개 이상의 이종의 암호화 영역의 발현을 (숙주 세포와 함께) 유도 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 임의의 분자 또는 엔티티(예컨대, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
용어 "공동 발현"은 상이한 폴리펩티드가 모든 폴리펩티드에 공통적인 단일 숙주 세포에서 함께 발현됨을 의미한다. 이중특이적 항체의 공동 발현은 기능적 이중특이적 항체를 형성하는 상이한 부분들이 공통적인 단일 숙주 세포에서 발현됨을 의미한다. 공동 발현은 발현 숙주 세포에 여러 발현 벡터를, 예컨대 이중특이적 항체의 각각의 절반에 대해 하나를 도입하거나, 이중특이적 항체의 모든 부분을 암호화하는 하나의 발현 벡터를 도입함으로써 달성될 수 있다.
용어 "잘못 매치된"은 의도한 단백질 복합체, 예컨대 이중특이적 항체의 상이한 부분들이 의도한 대로 복합적으로 결합하지 않음을 의미하며, 이는 이 단백질 복합체가 의도한 대로 보이거나 거동하지 않음을 의미한다. 이중특이적 항체의 맥락에서 미스매칭의 예를 도 4에 나타내었다.
결합 분자, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 서열의 "보존적 변이체"는 보존적 아미노산 변형을 포함하는 서열을 지칭한다. "보존적 아미노산 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미하게 영향을 미치거나 이를 유의미하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하고자 한 것이다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 결합 단백질 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 체계에서 합성에 의해서라기 보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 도입되는 비자연 발생적 아미노산 잔기를 포괄할 수 있다. 비자연 발생적 아미노산은 아미노산 모이어티의 펩티도미메틱(peptidomimetic), 역전 또는 반전 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 이의 단편과 같은, 면역계에 의해 인식되는 항원의 일부분이다. 본 명세서 내에서, 용어 "에피토프"는 입체형태 에피토프와 선형 에피토프 둘 다를 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 입체형태 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 구간으로 구성되는 반면, 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다.
용어 "치료하다", "치료하는", "치료", "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 대상체가 장애 또는 기타 위험 인자를 발달시킬 위험을 감소시키는 치료적 처치, 예방적 처치 및 적용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않으며, 증상 또는 근본적인 위험 인자의 감소를 포괄한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 인간 항체 또는 이의 단편은, 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 체계로부터 수득되는 경우, 특정 생식계열 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 체계는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 관심 항원을 이용하여 면역화시키는 것, 또는 파지 상에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 이용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체 또는 이의 단편은, 이러한 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열에서 인간 항체의 서열에 가장 가까운(즉, 가장 큰 동일성%) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그와 같이 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연 발생적 체세포 돌연변이, 또는 부위 특이적 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서, 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예컨대 뮤린 생식계열 서열)과 비교하여 인간인 인간 항체를 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우, 인간 항체는 아미노산 서열에서, 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래되는 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 소정의 경우, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
인간 항체는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적인 방법은 인간 가변 영역 레퍼토리를 사용하는 파지 라이브러리 또는 형질전환 마우스의 사용을 포함한다(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:11-23).
마우스 면역글로불린 유전자좌가 인간 면역글로불린 유전자 절편으로 교체된 여러 계통의 형질전환 마우스가 현재 이용가능하다(Tomizuka K, (2000) Proc Natl Acad Sci , 97:722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol 14:845-851; Mendez MJ, (1997) Nature Genetics 15:146-156). 항원 접종 시, 이러한 마우스는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있고, 그로부터 관심 항체가 선택될 수 있다. 인간 림프구가 조사된 마우스에 이식되는 트리메라(Trimera)™ 시스템(Eren R et al., (1988) Immunology 93:154-161), 대규모의 풀링된 시험관 내 단리된 항체 생성 절차에 이은 디컨볼루션, 한계 희석 및 선택 절차를 통해 인간 (또는 다른 종) 림프구가 효과적으로 제공되는 선택된 림프구 단리된 항체 시스템(Selected Lymphocyte Isolated antibody System)(SLAM, Babcook et al, Proc Natl Acad Sci (1996) 93:7843-7848) 및 제노마우스(Xenomouse)™(Abgenix Inc.)가 특히 주목된다. 대안적인 접근법은 모르포도마(Morphodoma)™ 기술을 사용하는 Morphotek Inc로부터 이용 가능하다.
인간 항체 및 이의 단편을 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다(McCafferty; (1990) Nature, 348:552-553 and Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260). 이러한 기술에 따르면, 단리된 항체 가변 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 단백질 유전자의 주요 또는 소수 코트에 인 프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능 단리된 항체 단편으로서 (통상적으로 헬퍼 파지의 보조 하에) 디스플레이된다. 단리된 항체의 기능 특성에 기초한 선택은 이들 특성을 나타내는 단리된 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 초래한다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여 질환 또는 장애를 앓는 개체로부터 또는 대안적으로 비면역화된 인간 공여자로부터 채취한 인간 B 세포로 제조된 라이브러리로부터 항원 특이적 항체를 선택할 수 있다(Marks; J Mol Bio (1991) 222:581-591). Fc 도메인을 포함하는 온전한 인간 단리 항체가 바람직한 경우에, 파지에 디스플레이된 유도된 단편을 원하는 불변 영역을 포함하고 안정적인 발현 세포주를 확립한 포유동물 발현 벡터 내로 재클로닝하는 것이 필수적이다.
친화도 성숙 기술(Marks; Biotechnol (1992) 10:779-783)을 사용하여 결합 친화도를 제공할 수 있는데, 이때 1차 인간 단리 항체의 친화도는 자연 발생적인 변이체에 의한 H 및 L 쇄 가변 영역의 순차적 대체 및 개선된 결합 친화도에 기초한 선택에 의해 개선된다. '에피토프 각인'과 같은 이러한 기술의 변형이 현재 또한 이용 가능하다(WO 93/06213; Waterhouse; Nucl Acids Res (1993) 21:2265-2266).
용어 "순수한"은, 정제된 이중특이적 항체의 맥락에서 사용될 때, 세포가 이중특이적 항체를 발현하는 조건 하에서 선택된 세포에서 공동 발현 후 및 온전한 UPLC-MS 질량 스크리닝 접근법을 이용한 단백질-A 정제 후의 상이한 이중특이적 항체 조합물 및 구축물의 순도 및 동일성에 관한 것이다. 순수한 또는 순도는 형성된 이종 및 동종이량체 bbmAb의 상대적인 양을 지칭한다. 본 발명의 방법을 사용하여 정확하게 형성된 이종이량체 bbmAb1과 bbmAb2를 온전한 질량 신호 강도를 기반으로 하여 85% 초과의 상대 순도로 관찰할 수 있었다.
2. IL-18 항체
개시된 방법에 사용되는 특히 바람직한 IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체이다.
참조 편의를 위하여, Kabat 정의 및 Chothia 정의에 기반한, mAb1로 지칭되는, 특정 IL-18 항체의 초가변 영역뿐만 아니라, VL 및 VH 도메인과 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 아래 표 1에 제공하였다.
Figure pct00001
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 VH 도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 VL 도메인을 포함하며, 이때 a) 면역글로불린 VH 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고; b) 면역글로불린 VL 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 가짐)을 포함한다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH); b) 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL); c) 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; d) 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; e) 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; f) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; g) 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; h) 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; i) 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; j) 서열번호 19를 포함하는 경쇄; k) 서열번호 9를 포함하는 중쇄; 또는 l) 서열번호 19를 포함하는 경쇄 및 서열번호 9를 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb1)은 서열번호 7의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 17의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 7의 세 개의 CDR 및 서열번호 17의 세 개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 19의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9의 세 개의 CDR 및 서열번호 19의 세 개의 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb1)은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb1)은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N 말단 맨 끝과 제2 도메인의 C 말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C 말단 맨 끝과 제2 도메인의 N 말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb1)은 a) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 16의 아미노산 서열을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N 말단 맨 끝과 제2 도메인의 C 말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C 말단 맨 끝과 제2 도메인의 N 말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
개시된 방법에서 사용되는 IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 또는 VL 도메인은 서열번호 7 및 서열번호 17에 기재된 VH 또는 VL 도메인과 실질적으로 동일한 VH 및/또는 VL 도메인을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-18 항체는 서열번호 9로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 서열번호 19로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-18 항체는 서열번호 9를 포함하는 중쇄 및 서열번호 19를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-18 항체는 a) 인간 중쇄의, 서열번호 7에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, 서열번호 17에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 경쇄를 포함할 수 있다.
개시된 방법, 키트 및 요법에 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-18 길항제(예컨대, 항체)는 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,376,489에 기재된 것들이다.
3. IL-1β 항체
개시된 방법에 사용되는 특히 바람직한 IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체이다.
참조 편의를 위하여, Kabat 정의 및 Chothia 정의에 기반한, mAb2로 지칭되는, 특정 IL-1β 항체의 초가변 영역뿐만 아니라, VL 및 VH 도메인과 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 아래 표 2에 제공하였다.
Figure pct00002
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 VH 도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 VL 도메인을 포함하며, 이때 a) 면역글로불린 VH 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 23의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 26의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고; b) 면역글로불린 VL 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 36의 아미노산 서열을 가짐)을 포함한다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 서열번호 27로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH); b) 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL); c) 서열번호 27로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; d) 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; e) 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; f) 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; g) 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; h) 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; i) 서열번호 24, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; j) 서열번호 37을 포함하는 경쇄; k) 서열번호 29를 포함하는 중쇄; 또는 l) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29를 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb2)은 서열번호 37의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 27의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 37의 세 개의 CDR 및 서열번호 27의 세 개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 39의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 29의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 39의 세 개의 CDR 및 서열번호 29의 세 개의 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb2)은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 23의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb2)은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 26의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 36의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 23의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N 말단 맨 끝과 제2 도메인의 C 말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C 말단 맨 끝과 제2 도메인의 N 말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, mAb2)은 a) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 26의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 36의 아미노산 서열을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N 말단 맨 끝과 제2 도메인의 C 말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C 말단 맨 끝과 제2 도메인의 N 말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커를 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
개시된 방법에서 사용되는 IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 또는 VL 도메인은 서열번호 27 및 서열번호 37에 기재된 VH 또는 VL 도메인과 실질적으로 동일한 VH 및/또는 VL 도메인을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-1β 항체는 서열번호 29로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 서열번호 39로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-1β 항체는 서열번호 29를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간 IL-1β 항체는 a) 인간 중쇄의, 서열번호 27에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, 서열번호 37에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 경쇄를 포함할 수 있다.
개시된 방법, 키트 및 요법에 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-1β 길항제(예컨대, 항체)는 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,446,175 또는 7,993,878 또는 8,273,350에 기재된 것들이다.
4. Fc 변형
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존적 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예컨대 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경시키기 위해, 즉, 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 구현예는 각각 아래에 더 상세히 기술된다. Fc 영역의 잔기 넘버링은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계의 넘버링이다.
일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 저하되도록 변형된다. 이러한 접근법은 Bodmer 등에 의한 미국 특허 번호 5,677,425에 더 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 저하하도록 변경된다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 저하하도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 본래의 Fc 힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합에 비해 약화된 SpA 결합을 갖도록, Fc 힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 경계면(interface) 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 Ward 등의 미국 특허 번호 6,165,745에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, Ward의 미국 특허 번호 6,277,375에 기술된 바와 같이, 다음 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는, Presta 등의 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프들로부터 취한 구제 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또 다른 구현예에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 Winter 등의 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 이러한 접근법은 Idusogie 등의 미국 특허 번호 6,194,551에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 항체가 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 더 상세히 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/증가시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 Presta의 PCT 공개 WO 00/42072에 더 상세히 기재되어 있다. 더욱이, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었으며, 개선된 결합을 나타내는 변이체가 기술된 바 있다(문헌[Shields, R.L. et al, (2001) J Biol Chem 276:6591-6604] 참조).
특정 구현예에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 특정 구현예에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어 융합 폴리펩티드가 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 매개하고/하거나 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 감소시키거나 제거하는 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. 문헌[Hezareh et al, J. Virol (2001); 75(24):12161-8]에 아미노산 위치 234 및 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 교체된 IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예가 기재되어 있다.
특정 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297에서의 글리코실화를 막는 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297에서 아스파라긴 잔기의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N297의 글리신 또는 알라닌으로의 교체이다.
침묵화된 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역의 돌연변이에 의해 얻을 수 있고, 당해 분야의 문헌에 기재되어 있다: LALA 및 N297A(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A(Baudino et al., 2008, J. lmmunol. 181:6664-69; Strohl, W., 위의 문헌); 및 DAPA(D265A 및 P329A)(Shields RL., J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604; 미국 특허 공개 US2015/0320880). 침묵 Fc IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 대한 D265A 및 P329A 돌연변이를 포함하는 소위 DAPA 돌연변이체이다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 아글리코실화된(aglycosylated)/비글리코실화 항체를 야기하는 N297A 돌연변이를 포함한다. 침묵화된 이펙터 기능을 제공하는 추가의 Fc 돌연변이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2014/145806(예컨대, WO2014/145806의 도 7)에 기술되어 있다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806으로부터의 한 예는 E233P, L234V, L235A, 및 S267K 돌연변이, 및 G236의 결실(G236del)을 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806으로부터의 또 다른 예는 E233P, L234V, 및 L235A 돌연변이, 및 G236의 결실(G236del)을 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806으로부터의 또 다른 예는 S267K 돌연변이를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여, 이로써 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등의 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 더 상세히 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분면(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 조직을 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 조직을 갖는 세포는 당해 분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 이로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는, 기능적으로 방해된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 이러한 세포주에서 발현된 항체는 하이포푸코실화를 나타낸다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 하이포푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어, 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서 재조합 발현에 의해 생산된다. Presta의 PCT 공개 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 하이포푸코실화를 초래하는 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고 있다(또한 문헌[Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예컨대 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있으며, 따라서 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분면 GlcNac 구조를 나타내며 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래한다(또한 문헌[Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 본 발명의 항체는 포유동물-유사 글리코실화 패턴으로 조작되고, 글리코실화 패턴으로서 푸코스 결핍 항체를 생산할 수 있는 효모 또는 사상 진균에서 생산될 수 있다(예를 들어 EP1297172B1 참조).
본 발명에 의해 고려되는 본 명세서의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는 예를 들어, 항체의 생물학적(예컨대, 혈청) 반감기를 증가시키기 위하여 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위하여, 항체, 또는 이의 단편을 전형적으로, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에, PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용되었던 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하고자 한 것이다. 특정 구현예에서, 페길화되는 항체는 아글리코실화된 항체이다. 단백질의 페길화 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등의 EP 0 401 384 참조.
본 발명에 의해 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성된 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편에 대한 본 발명의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 접합체 또는 단백질 융합체이다. 이러한 접근법은 예를 들어, Ballance 등의 EP0322094에 기재되어 있다.
본 발명에 의해 고려되는 항체의 또 다른 변형은 이종이량체 이중특이적 항체의 형성을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형이다. 예를 들어, EP 1870459A1; 미국 특허 번호 5,582,996; 미국 특허 번호 5,731,168; 미국 특허 번호 5,910,573; 미국 특허 번호 5,932,448; 미국 특허 번호 6,833,441; 미국 특허 번호 7,183,076; 미국 특허 출원 공개 번호 2006204493A1; 및 PCT 공개 번호 WO2009/089004A1(이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 개시된 바와 같이, 이중특이적 항체, 예컨대, bbmAb의 두 개의 중쇄 도메인의 이량체화를 증진시키기 위하여 당해 분야에서 이용할 수 있는 다양한 접근법이 이용될 수 있다.
노브-인투-홀을 이용한 이중특이적 항체의 생성은 예컨대, PCT 공개 번호 WO1996/027011, Ridgway et al., (1996), 및 Merchant et al. (1998)에 개시되어 있다.
(1) 노브-인-홀(KIH)
본 발명의 다중특이적 분자, 예컨대, 다중특이적 항체 또는 항체-유사 분자는 하나 이상의 불변 도메인, 예컨대, CH3 도메인에 대해 하나 이상, 예컨대, 복수의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 각각 항체의 중쇄 불변 도메인, 예컨대, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 두 개의 폴리펩티드를 포함한다. 예에서, 다중특이적 분자의 두 개의 중쇄 불변 도메인, 예컨대, CH2 또는 CH3 도메인은 두 쇄 사이에 이종이량체 결합을 가능하게 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 다중특이적, 예컨대, 이중특이적, 항체 또는 항체-유사 분자의 두 개의 중쇄의 CH2 도메인 상에 배치된다. 일 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 다중특이적 분자의 적어도 두 개의 폴리펩티드의 CH3 도메인 상에 배치된다. 일 양태에서, 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제1 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 돌연변이는 "노브"를 만들어 내고, 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제2 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 돌연변이는 "홀"을 만들어 내어, 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 폴리펩티드의 이종이량체화가 "노브"와 "홀"을 연결되게 한다(예컨대, 상호 작용하게 한다. 예컨대, 제2 폴리펩티드의 CH2 도메인과 상호 작용하는 제1 폴리펩티드의 CH2 도메인, 또는 제2 폴리펩티드의 CH3 도메인과 상호 작용하는 제1 폴리펩티드의 CH3 도메인). 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "노브"는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제1 폴리펩티드의 경계면으로부터 돌출되는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭하며, 따라서 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제2 폴리펩티드의 경계면에 보상 "홀"에 위치될 수 있어, 이종다량체를 안정화시켜 예를 들어, 동종다량체 형성보다는 이종다량체 형성에 더 유리하다. 노브는 본래의 경계면에 존재할 수 있거나 합성에 의해(예컨대, 경계면을 암호화하는 핵산을 변경함으로써) 도입될 수 있다. 노브 형성을 위한 바람직한 이입(import) 잔기는 일반적으로 자연 발생적인 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로부터 선택된다. 트립토판 및 티로신이 가장 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 돌기 형성을 위한 본래의 잔기는 작은 측쇄 부피, 예컨대 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린을 갖는다.
"홀"은 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제2 폴리펩티드의 경계면으로부터 리세스되는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭하며, 따라서 중쇄 불변 도메인을 포함하는 다중특이적 분자의 제1 폴리펩티드의 인접한 경계면 상의 상응하는 노브를 수용한다. 홀은 본래의 경계면에 존재할 수 있거나 합성에 의해(예컨대, 경계면을 암호화하는 핵산을 변경함으로써) 도입될 수 있다. 홀 형성을 위한 바람직한 이입 잔기는 보통 자연 발생적인 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로부터 선택된다. 세린, 알라닌 또는 트레오닌이 가장 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 홀 형성을 위한 본래의 잔기는 큰 측쇄 부피, 예컨대 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 잔기 366, 405 또는 407에서 돌연변이되어 (위에 기술된 바와 같이) "노브" 또는 "홀"을 만들어 내고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라, 잔기 366이 제1 CH3 도메인에서 돌연변이되는 경우 잔기 407에서, 잔기 405가 제1 CH3 도메인에서 돌연변이되는 경우 잔기 349에서, 또는 잔기 407이 제1 CH3 도메인에서 돌연변이되는 경우 잔기 366에서 돌연변이되어, 제1 CH3 도메인의 "노브" 또는 "홀"에 대해 상보적인 "홀" 또는 "노브"를 만들어 낸다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 잔기 366에서 돌연변이되어 (위에 기술된 바와 같이) "노브" 또는 "홀"을 만들어 내고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라, 잔기 366, 368 및/또는 407에서 돌연변이되어, 제1 CH3 도메인의 "노브" 또는 "홀"에 대해 상보적인 "홀" 또는 "노브"를 만들어 낸다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인에 대한 돌연변이는 위치 366에서 티로신(Y) 잔기를 도입한다. 구현예에서, 제1 CH3에 대한 돌연변이는 T366Y이다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인에 대한 돌연변이는 위치 366에서 트립토판(W) 잔기를 도입한다. 구현예에서, 제1 CH3에 대한 돌연변이는 T366W이다. 구현예에서, 위치 366에서 돌연변이된(예컨대, 위치 366에서 도입된 티로신(Y) 또는 트립토판(W)을 갖는, 예컨대, 돌연변이 T366Y 또는 T366W을 포함하는) 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인에 대한 돌연변이는 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라, 위치 366에서의 돌연변이, 위치 368에서의 돌연변이 및 위치 407에서의 돌연변이를 포함한다. 구현예에서, 위치 366에서의 돌연변이는 세린(S) 잔기를 도입하고, 위치 368에서의 돌연변이는 알라닌(A)을 도입하고, 위치 407에서의 돌연변이는 발린(V)을 도입한다. 구현예에서, 돌연변이는 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 일 구현예에서 다중특이적 분자의 제1 CH3 도메인은 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 또는 그 반대로도 포함한다. 일 구현예에서 다중특이적 분자의 제1 CH3 도메인은 돌연변이 T366W를 포함하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 또는 그 반대로도 포함한다.
추가의 입체 또는 "왜곡(skew)"(예컨대, 노브 인 홀) 돌연변이는 PCT 공개 번호 WO2014/145806(예를 들어, WO2014/145806의 도 3, 도 4 및 도 12), PCT 공개 번호 WO2014/110601, 및 PCT 공개 번호 WO 2016/086186, WO 2016/086189, WO 2016/086196 및 WO 2016/182751(이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다. KIH 변이체의 예는 S364K 및 E357Q 돌연변이를 포함하는 제2 불변 쇄와 짝지어진, L368D 및 K370S 돌연변이를 포함하는 제1 불변 쇄를 포함한다.
본 발명의 다중특이적 분자 중 임의의 것에 사용하기에 적합한 홀 돌연변이 쌍의 추가 노브는 예를 들어, WO1996/027011, 및 문헌[Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998)](이의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨)에 더 기재되어 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 구현예에서, CH3 도메인은 시스테인 잔기 쌍을 도입하기 위하여 추가로 돌연변이될 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 쌍의 도입은 이종이량체화된 다중특이적 분자에 안정성을 제공하는 것으로 여겨진다. 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 354에 시스테인을 포함하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 349에 시스테인을 포함한다. 구현예에서, 다중특이적 분자의 제1 CH3 도메인은 위치 354에 시스테인을 포함(예컨대, 돌연변이 S354C를 포함)하고 위치 366에 티로신(Y)을 포함(예컨대, 돌연변이 T366Y를 포함)하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 위치 349에 시스테인을 포함(예컨대, 돌연변이 Y349C를 포함)하고, 위치 366에 세린을 포함(예컨대, 돌연변이 T366S를 포함)하고, 위치 368에 알라닌을 포함(예컨대, 돌연변이 L368A를 포함)하고, 위치 407에 발린을 포함(예컨대, 돌연변이 Y407V를 포함)한다. 구현예에서, 다중특이적 분자의 제1 CH3 도메인은 위치 354에 시스테인을 포함(예컨대, 돌연변이 S354C를 포함)하고 위치 366에 트립토판(W)을 포함(예컨대, 돌연변이 T366W를 포함)하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 위치 349에 시스테인을 포함(예컨대, 돌연변이 Y349C를 포함)하고, 위치 366에 세린을 포함(예컨대, 돌연변이 T366S를 포함)하고, 위치 368에 알라닌을 포함(예컨대, 돌연변이 L368A를 포함)하고, 위치 407에 발린을 포함(예컨대, 돌연변이 Y407V를 포함)한다.
(2) 대안적인 노브와 홀: IgG 이종이량체화
일 양태에서, 다중특이적 분자의 폴리펩티드 쇄의 (예컨대, 절반 항체의) 이종이량체화는 IgG1 항체 클래스로부터 유래되는 CH3 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 증가된다. 구현예에서, 돌연변이는 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라, 제2 CH3 도메인의 F405L 돌연변이와 짝지어진 하나의 CH3 도메인에 대한 K409R 돌연변이를 포함한다. 추가의 돌연변이는 또한, 또는 대안적으로, 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라, 위치 366, 368, 370, 399, 405, 407, 및 409에 있을 수 있다. 바람직하게는, 이러한 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드의 이종이량체화는 25 내지 37℃, 예컨대, 25℃ 또는 37℃에서 1 내지 10, 예컨대 1.5 내지 5, 예컨대, 5시간 동안, 환원 조건, 예컨대, 10 내지 100 mM 2-MEA(예컨대, 25, 50, 또는 100 mM 2-MEA) 하에서 달성된다.
본 명세서에 기술된 아미노산 교체는 당해 분야에 주지된 기법을 이용하여 CH3 도메인 내로 도입된다. 보통은 중쇄(들)을 암호화하는 DNA는 문헌[Mutagenesis: a Practical Approach]에 기술된 기법을 이용하여 유전자 조작된다. 올리고뉴클레오티드 매개성 돌연변이 유발은 두 개의 하이브리드 중쇄를 암호화하는 DNA의 치환 변이체를 제조하는 바람직한 방법이다. 이 기법은 문헌[Adelman et al., (1983) DNA, 2:183]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
IgG 이종이량체화 전략은 예를 들어, WO2008/119353, WO2011/131746, 및 WO2013/060867(이의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 구현예에서, CH3 도메인은 시스테인 잔기 쌍을 도입하기 위하여 추가로 돌연변이될 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 쌍의 도입은 이종이량체화된 다중특이적 분자에 안정성을 제공하는 것으로 여겨진다. 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 354에 시스테인을 포함하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 349에 시스테인을 포함한다.
(3) 극성 가교
일 양태에서, 다중특이적 분자의 폴리펩티드 쇄의 (예컨대, 절반 항체의) 이종이량체화는 "극성 가교화" 원리를 기반으로 한 돌연변이를 도입함으로써 증가되는데, "극성 가교화" 원리는 동종이량체 배치 형태의 상이한 물리적 특성의 잔기와 상호 작용하면서 이종이량체 배치 형태의 유사한(또는 상보적인) 물리적 특성의 잔기와 상호 작용하게 하기 위하여 두 폴리펩티드 쇄의 결합 경계면에 잔기를 만드는 것이다. 특히, 이들 돌연변이는 이종이량체 형태에서, 극성 잔기는 극성 잔기와 상호 작용하는 한편, 소수성 잔기는 소수성 잔기와 상호 작용하도록 설계된다. 이와 대조적으로, 동종이량체 형태에서, 잔기는 극성 잔기가 소수성 잔기와 상호 작용하도록 돌연변이된다. 이종이량체 배치 형태에서 유리한 상호 작용과 동종이량체 배치 형태에서 불리한 상호 작용은 함께 작용하여 CH3 도메인이 동종이량체를 형성하기보다는 이종이량체를 형성할 가능성을 더 높인다.
예시적인 구현예에서, 위의 돌연변이는 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따른 아미노산 넘버링의 CH3 도메인의 잔기 364, 368, 399, 405, 409, 및 411의 하나 이상의 위치에서 생성된다.
일 양태에서, Ser364Leu, Thr366Val, Leu368Gln, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe 및 Thr411Lys으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이가 두 개의 CH3 도메인 중 하나로 도입된다. (Ser364Leu: 위치 364의 본래의 세린 잔기가 류신으로 교체됨; Thr366Val: 위치 366의 본래의 트레오닌 잔기가 발린으로 교체됨; Leu368Gln: 위치 368의 본래의 류신 잔기가 글루타민으로 교체됨; Asp399Lys: 위치 399의 본래의 잔기 아스파르트산이 리신으로 교체됨; Phe405Ser: 위치 405의 본래의 잔기 페닐알라닌이 세린으로 교체됨; Lys409Phe: 위치 409의 본래의 잔기 리신이 페닐알라닌으로 교체됨; Thr411Lys: 위치 411의 본래의 잔기 트레오닌이 리신으로 교체됨).
또 다른 양태에서, 다른 CH3은 Tyr407Phe, Lys409Gln 및 Thr411Asp로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다(Tyr407Phe: 위치 407의 본래의 잔기 티로신이 페닐알라닌으로 교체됨; Lys409Glu: 위치 409의 본래의 잔기 리신이 글루탐산으로 교체됨; Thr411Asp: 위치 411의 본래의 잔기 트레오닌이 아스파르트산으로 교체됨).
추가적인 양태에서, 하나의 CH3 도메인은 Ser364Leu, Thr366Val, Leu368Gln, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe 및 Thr411Lys으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 한편, 다른 CH3 도메인은 Tyr407Phe, Lys409Gln 및 Thr411Asp로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
예시적인 일 구현예에서, 하나의 CH3 도메인의 위치 366의 본래의 잔기 트레오닌은 발린으로 교체되는 한편, 다른 CH3 도메인의 위치 407의 본래의 잔기 티로신은 페닐알라닌으로 교체된다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 하나의 CH3 도메인의 위치 364의 본래의 잔기 세린은 류신으로 교체되는 한편, 동일한 CH3 도메인의 위치 368의 본래의 잔기 류신은 글루타민으로 교체된다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 하나의 CH3 도메인의 위치 405의 본래의 잔기 페닐알라닌은 세린으로 교체되고, 이 CH3 도메인의 위치 409의 본래의 잔기 리신은 페닐알라닌으로 교체되는 한편, 다른 CH3 도메인의 위치 409의 본래의 잔기 리신은 글루타민으로 교체된다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 하나의 CH3 도메인의 위치 399의 본래의 잔기 아스파르트산은 리신으로 교체되고, 동일한 CH3 도메인의 위치 411의 본래의 잔기 트레오닌은 리신으로 교체되는 한편, 다른 CH3 도메인의 위치 411의 본래의 잔기 트레오닌은 아스파르트산으로 교체된다.
본 명세서에 기술된 아미노산 교체는 당해 분야에 주지된 기법을 이용하여 CH3 도메인 내로 도입된다. 보통은 중쇄(들)을 암호화하는 DNA는 문헌[Mutagenesis: a Practical Approach]에 기술된 기법을 이용하여 유전자 조작된다. 올리고뉴클레오티드 매개성 돌연변이 유발은 두 개의 하이브리드 중쇄를 암호화하는 DNA의 치환 변이체를 제조하는 바람직한 방법이다. 이 기법은 문헌[Adelman et al., (1983) DNA, 2:183]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
극성 가교 전략은 예를 들어, WO2006/106905, WO2009/089004, 및 문헌[K.Gunasekaran, et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285:19637-19646](이의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
추가의 극성 가교 돌연변이는 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2014/145806(예를 들어, WO2014/145806의 도 6), PCT 공개 번호 WO2014/110601, 및 PCT 공개 번호 WO 2016/086186, WO 2016/086189, WO 2016/086196 및 WO 2016/182751(이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다. 극성 가교 변이체의 예는 N208D, Q295E, N384D, Q418E 및 N421D 돌연변이를 포함하는 불변 쇄를 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 구현예에서, CH3 도메인은 시스테인 잔기 쌍을 도입하기 위하여 추가로 돌연변이될 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 쌍의 도입은 이종이량체화된 다중특이적 분자에 안정성을 제공하는 것으로 여겨진다. 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 354에 시스테인을 포함하고, 제1 CH3 도메인과 이종이량체화되는 제2 CH3 도메인은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계에 따라 위치 349에 시스테인을 포함한다.
이종이량체화를 증진하기 위한 추가 전략은 예를 들어, WO2016/105450, WO2016/086186, WO2016/086189, WO2016/086196, WO2016/141378, 및 WO2014/145806, 및 WO2014/110601(이의 각각의 전체 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다. 상기 전략 중 임의의 전략이 본 명세서에 기술된 다중특이적 분자에 사용될 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에서 논의된 변형 중 둘 이상이 단일 이중특이적 항체, 예컨대, bbmAb에서 조합된다.
5. 실시예 1: bbmAb bbmAb1의 생성
당업자가 본 발명을 실현할 수 있게 하기 위하여, 예로서, 특정 bbmAb의 생성을 아래에 기술하였다.
생성된 bbmAb인 bbmAb1은 두 개의 별개의 표적인 IL-1β과 IL-18에 동시에 결합하는, LALA 침묵 돌연변이가 있는, 이중특이적 IgG1이다. 이 항체는 두 개의 별개의 항원 결합 암(Fab 단편)을 결합시키지만, IL-1β에 대한 Fab는 mAb2를 기반으로 하며 카파 경쇄(Vk6)를 함유한다. IL-18에 대한 Fab는 mAb1을 기반으로 하며 람다 경쇄(Vλ1)로 구성된다. 발현 중에 Fc 도메인의 이종이량체화를 유도하기 위하여, mAb1 중쇄에 부피가 큰 아미노산(aa) 측쇄(S354C와 T366W)가 있는 "노브"와 작은 aa 측쇄(Y349C, T366S, L368A, Y407V)가 있는 "홀"을 mAb2 중쇄에 도입하였다.
참조 편의를 위하여, Kabat 정의 및 Chothia 정의에 기반한, bbmAb1의 초가변 영역뿐만 아니라, VL 및 VH 도메인과 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 아래 표 3에 제공하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 79의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 80의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 82의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 83의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 98의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 99의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 63의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하며, 상기 CDR1은 서열번호 66의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 제1 면역글로불린 VH1 도메인 및 제1 면역글로불린 VL1 도메인을 포함하며, 이때 a) 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 81의 아미노산 서열을 가짐); 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 84의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고, b) 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 가짐); 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 100의 아미노산 서열을 가짐)을 포함한다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함하며, 이때 a) 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열을 가짐); 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 52의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고, b) 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 (예컨대, 서열에) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 65의 아미노산 서열을 가짐); 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 68의 아미노산 서열을 가짐)을 포함한다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1); b) 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1); c) 서열번호 85로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 VH1 도메인 및 서열번호 101로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 VL1 도메인; d) 서열번호 76, 서열번호 77, 및 서열번호 78로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VH1 도메인; e) 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VL1 도메인; f) 서열번호 79, 서열번호 80 및 서열번호 81로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VH1 도메인; g) 서열번호 95, 서열번호 96 및 서열번호 97로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VL1 도메인; h) 서열번호 76, 서열번호 77, 및 서열번호 78로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VH1 도메인 및 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VL1 도메인; i) 서열번호 79, 서열번호 80, 및 서열번호 81로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VH1 도메인 및 서열번호 95, 서열번호 96 및 서열번호 97로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 VL1 도메인; j) 서열번호 103을 포함하는 제1 경쇄; k) 서열번호 87을 포함하는 제1 중쇄; 또는 l) 서열번호 103을 포함하는 제1 경쇄 및 서열번호 87을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2); b) 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2); c) 서열번호 53으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 서열번호 69로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 VL2 도메인; d) 서열번호 44, 서열번호 45, 및 서열번호 46으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VH2 도메인; e) 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 62로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VL2 도메인; f) 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 49로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VH2 도메인; g) 서열번호 63, 서열번호 64 및 서열번호 65로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VL2 도메인; h) 서열번호 44, 서열번호 45, 및 서열번호 46으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 62로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VL2 도메인; i) 서열번호 47, 서열번호 48, 및 서열번호 49로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 서열번호 63, 서열번호 64 및 서열번호 65로 기재된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 VL2 도메인; j) 서열번호 81을 포함하는 제2 경쇄; k) 서열번호 55를 포함하는 제2 중쇄; 또는 l) 서열번호 81을 포함하는 제2 경쇄 및 서열번호 55를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 53의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 69의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 53의 세 개의 CDR 및 서열번호 69의 세 개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 85의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 101의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 85의 세 개의 CDR 및 서열번호 101의 세 개의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 85의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 101의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 85의 세 개의 CDR 및 서열번호 101의 세 개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 53의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 69의 세 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 53의 세 개의 CDR 및 서열번호 69의 세 개의 CDR을 포함한다. 구현예에서, L-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 85의 세 개의 CDR, 서열번호 101의 세 개의 CDR, 서열번호 53의 세 개의 CDR 및 서열번호 69의 세 개의 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제1 부분은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다. 나아가, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제2 부분은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제1 부분은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다. 나아가, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제2 부분은 적어도: a) 서열에, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다.
개시된 방법에 사용되는 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제1 VH1 또는 VL1 도메인은 서열번호 85 및 서열번호 101에 기재된 VH 또는 VL 도메인과 실질적으로 동일한 제1 VH1 및/또는 제1 VL1 도메인을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 87로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 제1 중쇄 및/또는 서열번호 103으로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 제1 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 87을 포함하는 제1 중쇄 및 서열번호 103을 포함하는 제1 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 이종이량체화 변형을 갖는 인간 중쇄의, 서열번호 85에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제1 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, 서열번호 101에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제1 경쇄를 포함할 수 있다. 인간 중쇄의 불변 부분은 IgG1일 수 있다. 일 구현예에서, IgG1은 이펙터 돌연변이가 없는 인간 IgG1이다. 일 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1는 침묵 돌연변이 N297A, D265A 또는 L234A 및 L235A의 조합을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1은 서열번호 87에 따라, L234A 및 L235A의 조합인 침묵 돌연변이를 포함한다.
개시된 방법에 사용되는 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제2 VH2 또는 VL2 도메인은 서열번호 53 및 서열번호 69에 기재된 VH 또는 VL 도메인과 실질적으로 동일한 제2 VH2 및/또는 제1 VL2 도메인을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 55로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 제2 중쇄 및/또는 서열번호 71로서 기재된 것과 실질적으로 동일한 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 서열번호 53을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 69를 포함하는 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 제1 중쇄의 이종이량체화에 대해 상보적인 이종이량체화 변형을 갖는 인간 중쇄의, 서열번호 53에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제2 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, 서열번호 69에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 인간 중쇄의 불변 부분은 IgG1일 수 있다. 일 구현예에서, IgG1은 이펙터 돌연변이가 없는 인간 IgG1이다. 일 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1는 침묵 돌연변이 N297A, D265A 또는 L234A 및 L235A의 조합을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1은 서열번호 55에 따라, L234A 및 L235A의 조합인 침묵 돌연변이를 포함한다.
개시된 방법, 키트 및 요법에서 이중특이적 항체의 제1 부분으로서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-18 길항제(예컨대, 항체)는 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,376,489에 기재된 것들이다.
개시된 방법, 키트 및 요법에서 이중특이적 항체의 제2 부분으로서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-1β 길항제(예컨대, 항체)는 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,446,175 또는 7,993,878 또는 8,273,350에 기재된 것들이다.
(1) 벡터 설계
두 개의 벡터, 벡터 A와 벡터 B를 다음 설정에 따라 생성하였다. 벡터 A는 항체 부분 mAb1(항-IL18 IgG1)를 위하여 설계하였다. 노브 구조를 생성하고 Cys 가교화를 가능하게 하기 위하여 중쇄 1의 불변 영역을 서열번호 87의 위치 366에서 보이는 바와 같이 T에서 W로, 서열번호 87의 위치 354에서 보이는 바와 같이 S에서 C로의 두 개의 점 돌연변이에 의해 변형시켰다. 나아가, FC 이펙터 기능의 부분 침묵화를 위하여 중쇄 1의 불변 영역을 서열번호 87의 위치 234에서 보이는 바와 같이 L에서 A로, 서열번호 87의 위치 235에서 보이는 바와 같이 L에서 A로의 (소위 LALA) 점 돌연변이에 의해 변형시켰다. 이 항체는 람다 1 유형의 가변 경쇄 영역 Vλ1을 갖는다.
벡터 B는 항체 부분 mAb2(항 IL-1β IgG1)를 위하여 설계하였다. 홀 구조를 생성하고 추가의 Cys 가교화를 가능하게 하기 위하여, 중쇄 2의 불변 영역을 서열번호 55의 위치 366에서 보이는 바와 같이 T에서 S로, 서열번호 55의 위치 368에서 보이는 바와 같이 L에서 A로, 서열번호 55의 위치 407에서 보이는 바와 같이 Y에서 V로, 그리고 서열번호 55의 위치 349에서 보이는 바와 같이 Y에서 C로의 네 개의 점 돌연변이에 의해 변형시켰다. 홀 구조는 노브 구조와 상호 작용하여 이중특이적 항체의 생성을 촉진한다. 나아가, FC 이펙터 기능의 침묵화를 위하여 중쇄 2의 불변 영역을 서열번호 55의 위치 234에서 보이는 바와 같이 L에서 A로, 서열번호 55의 위치 235에서 보이는 바와 같이 L에서 A로의 두 개의 LALA 돌연변이로 변형시켰다. 이 항체는 카파 6 유형의 가변 경쇄 영역 Vκ6을 갖는다.
벡터 A와 B는 각각 DHFR과 네오마이신 선택 마커의 조합뿐만 아니라, FOLR 및 하이그로마이신 선택 마커도 보유한다. 엽산은 퓨린과 메티오닌 합성에 필수적인 비타민으로, 배양 배지로부터 포유동물 세포에 의해 흡수되어야 한다. 발현 플라스미드 A에 존재하는 "엽산 수용체"(FolR)는 엽산염에 대한 변경된 친화도를 갖는 돌연변이체 FolR로, 배지로부터 포유동물 세포로의 엽산 수송을 촉진한다. 고친화도 엽산 수용체는 배양된 CHO 세포에서 오로지 약하게 발현된다는 점을 고려하면, 재조합 FolR을 발현하는 세포는 저엽산염 조건(50 nM) 하에서 명백한 성장 이점을 갖는다. FoIR 선택 마커는 벡터 B에서 암호화되었다.
FoIR 이외에도, "디하이드로폴레이트 환원효소"(DHFR)은 선택 마커로서 벡터 A에 존재한다. DHFR은 엽산을 퓨린과 메티오닌 합성을 위한 필수 전구체로 전환시킨다. MTX는 엽산의 화학적 유사체이다. 이것은 DHFR의 유리 결합 부위와 경쟁하여 이 효소를 차단한다. 외인성 DHFR을 과발현하는 세포는 상승된 MTX 농도를 처리할 수 있어, MTX가 보충된 배지에서 성장하는 명백한 선택적 이점을 세포에 제공한다. 조합된 FoIR 및 DHFR 선택은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대, 전체가 본 명세서에 참조로서 포함되는 특허 문헌 WO2010/097240A1에 개시되어 있다. MTX는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대, 전체가 본 명세서에 참조로서 포함되는 특허 문헌 WO2010/097239A1에 개시되어 있다. 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대, 전체가 본 명세서에 참조로서 포함되는 특허 문헌 WO2009/080720A1에 개시되어 있다.
두 벡터의 개략적 개요는 도 1에 제시되어 있다.
(2) 숙주 세포주 및 형질감염
모 CHO 세포주를 bbmAb1 발현 세포주의 생산을 위한 숙주 세포주로 사용하였다. 숙주 세포주는 예컨대, 특허 출원 WO2015092737 및 WO2015092735(둘 다 전체가 참조로서 포함됨)에 기술된 방식으로, 당업자에게 잘 알려져 있는 CHO-K1 세포주로부터 유래되었다.
CHO 세포주로부터의 단일 바이알을 사용하여 bbmAb1 재조합 세포주를 제조하였다. CHO 세포주를 화학적으로 한정된 배지에서 제조하였다.
세포를 화학적으로 한정된 배양 배지에서 성장시켰다.
bbmAb를 암호화하는 발현 벡터 A & B인 SwaI 선형화된 플라스미드 DNA 1 μg을 각 형질감염에 대하여 첨가하였다. 형질감염 반응을 화학적으로 한정된 배양 배지에서 수행하였다.
제조사의 지시에 따라 AMAXA 유전자 펄서를 사용하여 전기천공에 의해 형질감염을 수행하였다. 형질감염에 사용된 모 CHO 세포는 지수 성장기에 있었고, 세포 생존률은 95%를 초과하였다. 전체로서, 형질감염당 5x106개 세포로 3회의 형질감염을 수행하였다.
형질감염 직후, 세포를 화학적으로 한정된 배양 배지를 함유하는 쉐이크 플라스크로 옮겼다.
선택 과정을 시작하기 전에 세포 풀을 36.5℃ 및 10% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
(3) 세포 선택 및 분류
위에 기술된 바와 같이, 개별 발현 벡터 A와 B에 의해 암호화된 선택 마커를 사용하여 선택 절차를 수행하였다. 두 단백질(FolR과 DHFR)은 동일한 분자 경로에 참여하고 있다; FolR은 엽산뿐만 아니라 엽산염 유사체 MTX를 세포 내로 수송하고, DHFR은 이를 퓨린과 메티오닌 합성을 위한 필수 전구체로 전환시킨다. 이들을 선택적 원리로서 조합하여, 재조합 단백질 둘 다를 발현하는 재조합 세포를 농축하기 위한 특정한 강력한 선택 요법이 취해질 수 있다.
형질감염 및 저엽산염 조건 하에서의 성장 48시간 후, 화학적으로 한정된 배양 배지에 10 nM MTX를 첨가하여 추가의 선택적 압력을 가하였다. MTX 선택 개시 22일 후, 주로 MTX 내성 세포로 구성된 풀 집단이 출현하였다. 풀 회수 후, 세포를 동결시키고 세포 펠릿을 제조하였다. bbmAb의 농도 측정을 위하여 화학적으로 한정된 배양 배지에서 표준 배치를 준비하였다.
단백질 A HPLC 방법론을 사용하여 Fc 부분을 보유하는 모든 종류의 생성물 및 관련 불순물을 완벽하게 측정하는 한편, 역상 크로마토그래피(RPC)를 사용하여 개별 분획의 분포와 관련하여 지문을 수득하였다. 개별 피크는 MS 방법론에 의해 지정되었다.
bbmAb1을 생산하는 CHO 세포 풀은 모든 추가 평가를 위한 출발 물질로서 개별화된 클론 세포주를 수득하기 위한 FACS 클로닝 절차에 사용되었다. FACS 분석을 사용한 세포 선택은 예를 들어, 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는 특허 출원 US20110281751에 기재되어 있다.
bbmAb1을 발현하는 개별 클론 CHO 세포주는 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 생성되었다. FACS 분류를 가능하게 하기 위해, 세포를 FITC가 라벨링된 항 IgG1 Fab와 함께 30분 동안 인큐베이션시키고, PBS에서 2회 세척한 다음, 당업자에게 잘 알려진 방법인 FACS 보조 단일 세포 분류에 사용하였다.
FACS 세포 분류는 FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 ACDU(Automatic Cell Deposition Unit)가 장착된 FACS Aria(Becton Dickinson)로 수행되었다.
단일 세포만이 FACS 기기에 의해 분류되도록 하기 위하여, 130 μm의 노즐 및 양호한 분류 품질을 보장하는 적절한 유속을 사용하여 설정을 단일 세포 정밀 모드로 조정하였다.
단일 세포 모드에서, 순도 마스크를 최대로 설정하여, 입자가 없는 소적(drop) 또는 추가 세포만이 분류되었다.
위상 마스크를 최대값의 절반으로 설정하여, 분류된 소적 내의 중심에 있는 입자만 편향시켰다. 각 소적이 1개 초과의 단일 세포를 함유하지 않는 가능성을 높이기 위해 수율을 희생시켜 소적 궤적 및 카운트 정확도를 최적화하였다.
단클론 기원을 확인하여 기록하고, FACS 클로닝 후 제0일의 단일 세포 상태를 확인하기 위하여, 96웰 플레이트의 모든 웰의 영상을 영상화 시스템을 사용하여 촬영하였다.
bbmAb1 생산 클론을 지칭하는 제0일의 영상을 2반복으로(in duplicate) 육안으로 검사하여, 영상화 시스템으로 촬영한 각 웰의 영상에서 하나의 단일 세포만 식별할 수 있음을 확인하였다.
이는 bbmAb1 생산 클론의 단일 세포 기원을 분명히 보여주었다.
(4) 세포 증식
FACS 클로닝 후, 클론은 첫째 주 동안 로봇 시스템으로 처리되었고 이후에는 수동으로 처리되었으며, 단계적으로 96-웰, 24-웰, 진탕기 쪽으로 증식시키고, 마지막으로 당업자에게 잘 알려진 생물반응기 배양을 수행하여 성과(bbmAb 발현의 생산성 및 품질)를 평가하였다.
증식/배양하는 동안 재조합 CHO 세포를 메토트렉세이트(MTX)가 보충된 화학적으로 한정된 배양 배지에서 10 nM의 최종 농도로 배양하였다.
세포는 주당 2 내지 3회 신선한 배지로 통과시켰고 연구 전반에 걸쳐 로그 성장기에서 유지시켰다.
생산성을 단백질 A HPLC로 평가하였고, 초기 생성물 품질 프로파일을 역상 크로마토그래피(RPC)로 결정하였다.
모든 냉동 스톡은 7.5% DMSO가 보충된 배양 배지에서 생성되었다.
(5) 클론 안정성
풀에서 단리된 bbmAb 및 클론을 상이한 분석 방법론으로 신중하게 평가하여 생성물 특성 및 품질 파라미터를 판단하여 가장 적합한 생산 클론을 확실히 선택하였다.
또한, 가장 적합한 생산 클론의 선택을 확실히 하기 위하여 생산 클론에 대하여 생산 안정성에 대한 과도한 분석을 수행하였다.
상이한 최신 분석 방법론을 이용하여 클론 안정성을 평가하였다: 친화도 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, FACS 및 MS.
(6) 제조
(a) 상류 처리
bbmAb 물질을 진탕 플라스크 또는 파동 유가식 배양에서 제조하였다. 풀 또는 클론, 예컨대 PSL의 냉동 스톡을 해동시키고, 화학적으로 한정된 배지에서 필요한 기간 동안 증식시켜 생산 배양물을 시딩하는 데 필요한 수의 세포를 수득하였으며, 전형적으로 시드 세포 밀도는 4.0 x 105개 세포/ml이었다. 개별 배양물은 13 내지 14일의 기간 동안 배양되었다. 배양하는 동안 공정 중 제어를 수행하여 상청액 중 bbmAb의 농도 및 품질 프로파일을 모니터링하였다. 배양 공정 종료 시, 세포를 원심분리(예를 들어 진탕기) 또는 심층 여과에 의해 배양 상청액으로부터 분리한 다음, 추가 DSP 처리 전에 멸균 여과를 수행하였다.
(b) 하류 처리
형식 설계 및 공동 발현 접근법에 기초하여, 온전한 생성물 bbmAb1 및 공통 불순물, 예컨대, 응집물, DNA 및 숙주 세포 단백질뿐만 아니라, 도 4에 도시된 바와 같이 mAb1 및 mAb2 유래 단량체, 동종이량체 및 잘못 매치된 경쇄/중쇄 bbmAb1 변이체도 세포 배양 및 세포 잔해 제거 후 상청액에서 예상되었다. 잘못 짝지어진 경쇄/중쇄 bbmAb1 변이체(도 4e 내지 도 4m)는 예비적 규모로 용이하게 제거될 수 없는 온전한 bbmAb1과 동일한 생물물리학적 특성을 가지고 있음이 의심된다.
접근법 I: Mab셀렉트 SuRe™ 에서의 포획, 람다Fab셀렉트 및 카파셀렉트에서의 연마에 의한 정제
Mab셀렉트 SuRe™에서의 제1 친화도 액체 크로마토그래피(ALC) 단계에 의해 무세포 상청액으로부터 bbmAb1 및 Fc 부분을 보유하는 bbmAb1 변이체를 포획하였다. 카파 경쇄만을 함유하는 bbmAb1 변이체(mAb2 홀, 도 4c 및 도 4d) 및 HCP를 람다Fab셀렉트에서의 제1 연마에 의해 제거하였고, 람다 경쇄만을 함유하는 bbmAb1 변이체(mAb1 노브, 도 4a 및 도 4b) 및 HCP를 카파셀렉트에서의 제2 연마 단계에 의해 제거하였다.
방법 전체에 걸쳐 4분의 체류 시간(RT)을 이용하여 실온에서 크로마토그래피를 수행하였다. 모든 컬럼을 로딩 전에 4 컬럼 부피(CV) 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0으로 평형화시켰다. 생성물로부터 비특이적 결합 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), 배지 성분 및 DNA를 고갈시키기 위해, 진탕플라스크로부터 무세포 bbmAb1 상청액을 ALC 컬럼에 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 4 CV 250 mM 아르기닌-HCl, 1 M NaCl, 88 mM NaOH, pH 9.0 및 3 CV 평형화 완충액으로 세척하였다. 카파셀렉트 및 람다Fab셀렉트로부터의 용출을 위해 각각 50 mM 아세트산, pH 3.0, 50 mM 아세트산/HCl, pH 2.0을 이용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 bbmAb1 및 잠재적인 bbmAb1 변이체를 용출시켰다. 생성물 피크 수집은 0.5 AU/cm 또는 0.25 AU/cm(280 nm)에서 시작되고 종료되었다. 각각 분석적 평가를 위하여 2 내지 8℃에서 저장하기 전에 bbmAb1 용출액의 pH를 0.1 또는 1 M 트리스로 약 pH 5.0으로 조정하였다.
접근법 II: 람다Fab셀렉트에서의 포획, 캡토 어드히어 및 프랙토겔 EMD SO 3 에서의 연마에 의한 정제
제2 접근법에서는 온전한 bbmAb1 및 람다 경쇄만을 함유하는 bbmAb1 변이체(mAb1 노브 단량체 및 동종이량체, 도 4a 및 도 4b)를 람다Fab셀렉트 상에서의 친화도 액체 크로마토그래피에 의해 무세포 상청액으로부터 포획하였다. 잠재적으로 존재하는 외피 바이러스를 불활성화시키기 위하여 ALC 용출액의 낮은 pH 처리를 수행한 다음, 생성물 관련 불순물 DNA와 HCP를 제거하기 위하여 캡토 어드히어 및 프랙토겔 EMD SO3에서의 두 가지의 크로마토그래피 연마 단계를 수행하였다. 잠재적으로 존재하는 바이러스는 이후에 접선 유동 여과를 사용하는 최종 농축 및 완충액 교환 단계 전에 나노여과에 의해 제거되었다.
a) 람다Fab셀렉트에서의 친화도 액체 크로마토그래피(ALC)
방법 전체에 걸쳐 3.6 내지 4.4분의 체류 시간(RT)을 이용하여 18 내지 28℃에서 ALC를 수행하였다. 먼저, ALC 컬럼을 4 내지 6 CV 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0으로 평형화시켰다. 그런 다음, 파동 또는 생물반응기로부터 정화된 무세포 bbmAb1 상청액을 로딩 밀도 7 내지 23 g/L로 람다Fab셀렉트 컬럼에 로딩하였다. 4 내지 6 CV 50 mM 아세트산으로의 생성물 용출 전에 4 내지 6 CV 250 mM 아르기닌-HCl, 1 M NaCl, 88 mM NaOH, pH 9.0으로의 컬럼 세척 및 3 내지 5 CV 평형화 완충액으로의 제2 세척을 수행하였다. 0.5 내지 2.0 AU/cm(280 nm) 상향 및 0.5 내지 2.0 AU/cm(280 nm) 하향으로부터 생성물 피크를 수집하였다. 3 내지 5 CV 120 mM 인산, 167 mM 아세트산, pH 1.5을 이용하여 람다Fab셀렉트 컬럼을 세척한 후, 3 내지 5 CV 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0으로 재평형화시키고 4 내지 6 CV 20% 에탄올에 저장하였다.
b) 바이러스 불활성화
ALC 용출액의 pH를 0.3 M 인산을 이용하여 pH 3.4 내지 3.6으로 조정하였다. 그런 다음, 단백질 용액을 이후에 이 낮은 pH에서 60 내지 90분 동안 인큐베이션한 후, pH를 1M 트리스로 7.3 내지 7.7로 조정하였다. 100 내지 300 LMH의 유속을 적용하는 Millipore B1HC Pod 필터를 이용한 심층 여과 단계를 이용한 후, 0.45/0.2 μm Sartopore™ 멸균 필터로 멸균 여과를 수행하였다.
c) 캡토 어드히어에서의 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)
방법 전체에 걸쳐 4 내지 6분의 체류 시간을 이용하여 18 내지 28℃에서 플로-스루 모드로 MAC을 수행하였다. 먼저, MAC 컬럼을 7 내지 9 CV 20 mM 트리스/트리스-HCl, pH 7.5으로 평형화시켰다. 그런 다음, 낮은 pH 처리된 ALC 용출액을 175 내지 350 g/L의 로딩 밀도를 이용하여 캡토 어드히어 컬럼에 로딩하였다. 이에 따라 생성물 피크 수집을 0.5 내지 2.0 AU/cm(280 nm) 상향에서 시작하였다. 그런 다음, MAC 컬럼을 5 내지 7 CV 평형화 완충액으로 세척하고, 생성물 피크 수집을 0.5 내지 2.0 AU/cm(280 nm) 하향에서 종료하였다. 캡토 어드히어 컬럼을 이후에 6 내지 8 CV 100 mM 아세트산으로 스트리핑한 후, 3 내지 5 CV 0.5 M NaOH로 정치 세척(cleaning-in place) 단계를 수행하고, 3 내지 5 CV 0.1 M NaOH에 저장하였다.
d) 프랙토겔 EMD SO3에서의 양이온 교환 크로마토그래피
프랙토겔 EMD SO3 상에서의 CEC를 18 내지 28℃에서 결합-용출 모드로 수행하였다. 평형화, 스트립, CIP 및 저장 중에는 6 내지 8분의 체류 시간을 사용하였고, 로드, 세척 및 용출 중에는 8 내지 10분의 체류 시간을 이용하였다. CEC 컬럼을 6 내지 8 CV 20 mM 숙신산, 35.1 mM NaOH, pH 6.0으로 평형화시켰다. 그런 다음, MAC 삼출액을 35 내지 70 g/L의 로딩 밀도로 컬럼에 로딩하였다. 이후에, CEC 컬럼을 5 내지 7 CV 평형화 완충액으로 세척하였다. 15 CV에 걸쳐 10부터 90%까지 20 mM 숙신산, 500 mM NaCl, 37.4 mM NaOH, pH 6.0의 선형 염 구배를 이용하여 용출을 수행하였다. 0.1 내지 0.4 AU/cm 상향에서 시작하여 300 nm에서 20% 내지 40% 최대 피크 높이까지 bbmAb1 생성물 피크를 수집하였다. 프랙토겔 EMD SO3 컬럼을 3 내지 5 CV 1 M NaCl로 스트리핑한 후, 3 내지 5 CV 0.5 M NaOH로 정치 세척 단계를 수행하고, 3 내지 5 CV 0.1 M NaOH에 저장하였다.
e) 나노여과
잠재적으로 존재하는 바이러스는 Planova™ 20N 나노필터 및 0.5/0.1 μm Millipore SHR-P 프리필터를 사용하여 나노여과에 의해 제거하였다. 0.7 내지 0.9바의 차등 압력을 가하여 사전 여과 및 나노여과를 수행하였다.
f) 접선 유동 여과 및 제형화
bbmAb1을 농축하고 정용여과하기 위하여, Millipore™ Pellicon™ 3 RC 30 kDa 막에서 접선 유동 여과 단계를 18 내지 28℃에서 수행하였다. 먼저, 나노여과된 bbmAb1 단백질 용액을 0.5 내지 1.5 바의 공급 유압 및 0.3 내지 0.6 바의 막관통 압력(TMP)을 이용하여 1000 g/m2의 최대 로딩 밀도로 60 내지 80 g/L까지 농축하였다. 그런 다음, bbmAb1을 0.8 내지 1.8 바의 공급 유압 및 0.4 내지 0.9 바의 TMP에서 7 내지 9 정용여과 부피 20 mM 히스티딘/히스티딘-HCl, pH 6.0에 대해 정용여과하였다. 1.4 내지 3.0 바의 공급 유압 및 0.7 내지 1.5 바의 TMP에서 134±10 g/L까지의 제2 농축 단계를 수행하였다. 한외여과된 bbmAb1 단백질 용액을 최종적으로 100±10 g/L 및 0.04%(w/v) 폴리소르베이트 20의 농도로 제형화하였다. 최종 원료 의약품(DS)을 0.2 μm 필터로 여과하고, ≤-60℃에 냉동 보관한다.
(7) 분석적 특성화 및 순도 평가
(a) 온전한 bbmAb 및 변이체의 LC-MS 스크리닝
100 μg의 단백질-A 정제된 bbmAb 샘플을 96-웰 플레이트에서 동결건조시키고, 100 μl의 50 mM 트리스-HCl pH 7.5 완충액 중에서 37℃에서 18시간 동안 PNGaseF(New England Biolabs)에 의해 탈글리코실화시켰다. 샘플을 Synapt G2 Q-TOF 질량 분광분석기(Waters)에 연결된 H-클래스 UPLC(Waters)에서 LC-ESI-MS에 의해 측정하였다. MassPREP 마이크로 탈염 컬럼 2.1 x 5 mm(Waters)을 80℃ 컬럼 온도에서 사용하였다. 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산, 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% FA: 0 내지 2분 5% B, 2 내지 12분 5 내지 90% B로 0.3 ml/분에서 선형 구배를 적용하였고, 0.5 ml/분에서 여러 세척 단계가 이어졌다. MS 파라미터: ESI + 분해능 모드, 모세관 전압 3kV, 샘플링 콘 40V, 소스 온도 150℃, 탈용매화 온도 400℃. 시스템을 NaCl 보정 용액으로 보정하였고, 잠금 질량은 류신 엔케팔린이었다. 데이터를 UNIFI 1.6 소프트웨어(Waters)를 사용하여 자동 MaxEnt1 디콘볼루션(질량 범위 60 내지 150 kDa, 고조파 억제)에 의해 처리하였다. bbmAb 종 및 잘못 짝지어진 변이체의 식별 및 상대 정량은 이론적으로 예상되는 질량에 대한 매치 및 디콘볼루션된 질량 스펙트럼의 상대 질량 신호 강도를 기반으로 한다.
(b) bbmAb1의 LC-MS 특성화
온전한 탈글리코실화된 bbmAb: 정제된 bbmAb1 항체를 20 mM 트리스-HCl pH 7.5에 1 mg/ml까지 희석시키고, 2 μl PNGaseF 효소(New England Biolabs)를 이용하여 37℃에서 4시간 동안 탈글리코실화시켰다. 트리플루오로아세트산(TFA)을 2%까지 첨가하여 분해를 정지시켰다.
환원된 탈글리코실화 bbmAb: bbmAb1를 20 μl 0.1 M 트리스-HCl pH 7.5에 5 mg/ml까지 희석시켰다. 2 μl의 PNGase F를 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 80 μl의 변성 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 6 M 구아니딘 염산염) 및 1 μl의 1 M DTT를 혼합물에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 1 μl TFA로 산성화시켰다.
bbmAb의 Fab 및 Fc로의 파파인 분해. bbmAb1을 분해 완충액(20 mM 숙신산, 35.1 mM NaOH, pH 6.0, 1 mM Cys-HCl, 1 mM EDTA)과 5 mg/ml까지 혼합한 다음, 파파인 프로테아제(Roche, 독일)를 최종 농도 5 μg/ml(프로테아제/단백질 비율 1:1000)까지 첨가하고, 진탕 하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.2 mM 최종 농도까지 요오도아세트아미드 용액을 첨가하여 용액을 정지시켰다.
bbmAb의 F(ab') 2 및 Fc로의 IdeS 분해. 100 μg bbmAb1을 절단 완충액(50 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 6.6)과 혼합하고, 37℃에서 밤새 100 U IdeS 프로테아제(Fabricator, Genovis)로 분해시켰다. 인큐베이션 후, 2% 최종 농도까지 TFA를 첨가하여 용액을 정지시켰다.
환원된 LysC 분해 - 펩티드 매핑. (Rombach-Riegraf et al, PlosOne 2014에 따라) 150 μl의 변성 용액(6 M 구아니딘 염산염, 50 mM 트리스-HCl, 5 mM Na2EDTA, pH 8.0)을 이용하여 200 μg 단백질을 변성시키고, 1.5 μl의 1 M DTT를 첨가하여 환원시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 알킬화는 3 μl의 1 M 요오도아세트아미드를 첨가한 후 37℃에서 암소에서 인큐베이션함으로써 수행되었다. 반응을 1 μl의 1 M DTT로 ?치시켰다. 환원/알킬화 후, 750 μl 분해 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 8)을 샘플에 첨가하였다. 그런 다음, 4 μl의 1 μg/μl 엔도프로테나아제 LysC 용액(Wako (일본 오사카))을 2회 첨가하고, 각각 1시간 및 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 분해시켰다. 5 μl TFA를 첨가하여 분해를 ?치시켰다.
LC-MS 측정. 단백질 샘플은 BEH C4 RP 컬럼(1.7 μm, 2.1 x 100 mm, 300
Figure pct00006
, Waters) 및 Xevo G2 TOF 질량 분광분석기(Waters, Milford)가 장착된 Waters UPLC H-Class를 사용하여 LC-MS 시스템에 적용되었다. 용출액은 A: 물 중 0.1% TFA이고, B: 아세토 니트릴 중 0.09% TFA였다. 컬럼을 80℃로 설정하였다. 유속은 0.2 ml/분이었다. 단백질을 다음과 같이 40분 구배로 용출시켰다: 0 내지 5분 10% B, 5 내지 10분 10 내지 30% B, 10 내지 25분 30 내지 40% B, 25 내지 26분 40 내지 95% B, 26 내지 28분 95%, 28 내지 40분 10% B.
MS 설정: ESI (+) TOF 모드, 분해능 모드, 질량 범위 400 내지 4000 Da, 스캔 시간 1초, 모세관 전압 3 kV, 샘플링 콘 25 V 내지 40 V. NaCsI 용액을 사용하여 시스템을 보정하였다.
펩티드 분해물을 CSH130 C18 2.1 mm x 150, 1.7 μm(Waters, Milford)를 사용하여 Synapt G2 Q-TOF 질량 분광분석기(Waters)에 연결된 H-Class UPLC(Waters)에서 RP-LC-MS로 분석하였다. 이동상 A: 물 중 0.1% TFA 및 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.09% TFA. 펩티드를 다음의 구배로 컬럼으로부터 용출시켰다: 40℃ 컬럼 온도에서 0 내지 5분 0% B, 5 내지 10분 0 내지 2% B, 10 내지 40분 2 내지 20% B, 40 내지 120분 20 내지 40% B, 120 내지 135분 40 내지 70%. UV 크로마토그램을 214 nm에서 기록하였고, MS 데이터 획득은 낮은 에너지(4 eV) 및 높은 에너지 단편화(30 내지 55V)를 사용하는 MSE 실험으로서 양의 ES(+) 분해능 모드에서 수행되었다. 잠금 질량은 류신 엔케팔린(Waters)이었다.
데이터 처리 및 평가는 MassLynx 4.2 또는 UNIFI 1.6 소프트웨어(Waters)에 의해 수행되었다. 단백질 질량 스펙트럼의 디콘볼루션을 위하여 MaxEnt1 알고리즘을 사용하였다. 이론적 질량 계산은 GPMAW 9.2 소프트웨어(Lighthouse data)로 수행되었다.
(c) 역상 크로마토그래피
bbmAb 샘플을 Poroshell 300 SB-C8 RP 컬럼, 2.1 mm x 75 mm, 5 μm(Agilent)를 이용하여 Agilent 1260 HPLC에서 분석하였다. 컬럼 온도를 80℃로 설정하였고, 유속은 2 ml/분이었고, 이동상 A: 90% 물, 10% 아세토니트릴, 0.1% TFA, 0.3% PEG-300, 이동상 B: 10% 물, 90% 아세토니트릴, 0.1% TFA, 0.3% PEG-300. 사용된 구배는 다음과 같았다: 0 내지 5분 22 내지 37% B, 5.0 내지 5.1분 100% B, 5.1 내지 6분 100% B, 6.1. 내지 8.5분 22% B. UV 신호를 210 nm에서 기록하였다. 데이터 획득 및 평가는 Chromeleon™ 6.8 소프트웨어(Thermo Scientific)를 이용하여 제어하고 수행하였다.
(d) 크기 배제 크로마토그래피
bbmAb1 샘플을 Agilent 1260 시스템을 이용하여 TSK 겔 G3000SWXL(Tosoh #808541, 5 μm, 7.8 mm x 300 mm) SEC 컬럼, 기공 크기 250 A에 적용하였다. 이동상은 150 mM 인산칼륨 용액, pH 6.5였고, 유속은 0.4 ml/분이었고, 컬럼 온도는 30℃였다. UV를 210 nm에서 기록하였다. 데이터 획득 및 피크 적분은 Chromeleon™ 6.8(Thermo Scientific)을 이용하여 수행하였다.
(e) 모세관 전기영동 CE-SDS
비환원 CE-SDS의 경우, bbmAb 샘플을 샘플 완충액(0.1 인산나트륨/1.0% SDS, pH 6.6)과 혼합한 다음, 요오도아세트아미드 용액과 혼합하였다. 환원 CE-SDS의 경우, 단백질을 0.1M 트리스/1% SDS 샘플 완충액, pH 8.0과 혼합하고, 5%(v/v) 메르캅토에탄올로 환원시켰다. 두 샘플 모두 70℃에서 10분 동안 열 변성 단계를 거쳤다.
샘플을 총 모세관 길이가 30 cm이고 Beckman SDS MW 체질 겔 완충액으로 충전된 베어 용융 실리카 모세관(50 μm, 375 OD, 67 cm, Beckman)이 장착된 Beckman PA 800 시스템에서 분석하였다. 15 kV 및 25℃ 모세관 온도에서 음극성에서 양극까지 분리를 행하고 214 nm에서 UV에 의해 검출하였다. 전기영동도는 Chromeleon™ 6.8 소프트웨어를 이용하여 처리하고 적분하였다.
(f) 모세관 구역 전기영동 CZE
214 nm UV 검출기가 장착된 Beckman Coulter PA 800 제약 분석 시스템에서 분리를 수행하였다. 25℃ 및 양극성에서 20 kV의 모세관 전압으로 총 길이 40 cm의 용융 실리카 모세관(50 μm ID)상에서 단백질을 분리하였다. 실행 완충액: 2 mM TETA 및 0.03% Tween 20이 있는 400 mM 6-아미노카프로산/아세트산 pH 5.7. Chromeleon™ 6.8 소프트웨어로 피크 적분을 수행하였다.
(8) 분석 결과
온전한 UPLC-MS 질량 스크리닝 접근법을 이용하여 단백질-A 정제 후에 공동 발현 후 상이한 이중특이적 항체 조합 및 구축물의 순도 및 동일성을 분석하였다. 이 접근법을 사용하여 세포 상청액으로부터 형성된 이종이량체 및 동종이량체를 확인하고 상대 정량하였다. 정확하게 형성된 이종이량체 bbmAb1과 bbmAb2를 온전한 질량 신호 강도를 기반으로 하여 85% 초과의 상대 순도로 관찰할 수 있었다. 스크린에서 관찰된 주요 불순물은 두 개의 카파 경쇄, 두 개의 람다 경쇄 및 HC 홀-이량체 분자가 있는 잘못 짝지어진 항체였다.
Figure pct00007
지시어 l은 람다 쇄이고, k는 카파 쇄이다.
mAb3은 유형 VH3, Vk1의 항체이다.
mAb4는 유형 VH3, Vk1의 항체이다.
mAb5는 mAb1(VH1, Vl1)의 그래프트 버전이다.
mAb6은 mAb2(VH1_46, Vk3)의 그래프트 버전이다.
mAb7은 유형 VH3, Vk1의 항체이다.
mAb8은 유형 VH1_2, Vk2의 항체이다.
mAb9는 유형 VH5, Vk6의 항체이다.
mAb10은 유형 VH1_46, Vk6의 항체이다.
mAb11은 유형 VH3, Vk3의 항체이다.
mAb12는 유형 VH3, Vk2의 항체이다.
여러 가지 샘플 준비 방법을 사용하는 LC-MS 및 다른 분리 기술을 사용하는 상이한 정제 단계 후, 모든 형성된 생성물 변이체 및 불순물을 평가하기 위하여 bbmAb1을 더욱 상세히 특성화하였다. PNGaseF 효소로 탈글리코실화하고 이후에 RP-LC-MS 셋업으로 주입한 후에 온전한 2-단계(람다/CEC) 정제된 생성물의 질량을 측정하였다. 온전한 bbmAb1의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼은 공동 발현 및 람다-셀렉트 정제 후의 노브-인-홀 이종이량체의 정확한 형성을 확인시켜 주었다. 람다-셀렉트 정제 후 동종이량체 또는 부분 항체와 같은 주요 불순물을 검출할 수 없었다. 4개의 상이한 항체 쇄의 동일성은 샘플의 환원 및 탈글리코실화 후에 확인할 수 있었다.
쇄 짝짓기 오류 및 기타 낮은 수준의 불순물을 확인하기 위하여, 정제된 샘플을 파파인 프로테아제로 분해하여 개별 Fab 및 Fc 단편을 분석하였다. 측정된 단편의 질량은 상이한 Fab 암(노브-람다, 홀-카파)의 정확한 형성 및 노브-인-홀 Fc 단편의 정확한 형성을 다시 확인시켜 주었다. 잘못 짝지어진 Fab 단편(Fab4, 노브-카파)은 1% 미만의 수준으로 관찰할 수 있었다. 대안적인 접근법에서, 풀 및 클론 선택 중에 더욱 신속한 샘플 준비를 가능하게 하는 제한된 LysC 분해로 생성된 FaB 단편을 시험하였다.
IdeS(Fabricator) 효소를 사용하는 다른 분해 전략을 시험하여 Fc 및 F(ab')2 단편을 생성하였다. 이 실험에서, Fc 이종이량체의 질량을 관찰하였고, 이종이량체 F(ab')2가 정확하게 형성되었다. Fc 이종이량체의 존재는 또한 bbmAb1의 Fc 부분에서 추가의 이황화 가교의 정확한 형성의 증거이며, 그렇지 않으면 더 작은 질량의 Fc/2 단편만이 생성될 것이기 때문이다.
LC-MS를 사용한 LysC 펩티드 매핑은 펩티드의 전체 서열 범위가 99%로 분자의 동일성을 확인시켜 줄 수 있다.
정제된 샘플의 구체적인 결과는 도 2에 제시되어 있다. 특히, 탈글리코실화된 온전한 이중특이적 mAb의 RP-UV 크로마토그램은 도 2a에 제시되어 있다. 파파인 분해된 bbmAb1 단편은 도 2c에 제시되어 있다. IdeS 분해된 bbmAb1 단편은 도 2d에 제시되어 있다. 탈글리코실화 및 DTT 환원된 bbmAb1 단편은 도 2e에 제시되어 있다. 온전한 탈글리코실화된 이중특이적 mAb bbmAb1의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼은 도 2b에 제시되어 있다.
결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pct00008
위에서 설명된 상이한 단계를 적용한 후 수득된 증가된 순도는 도 3에 제시되어 있다. 도 3a는 배양 후 발현 프로파일을 보여주는 크로마토그램이고, 도 3b는 람다Fab셀렉트에 의한 포획 후의 크로마토그램이고, 도 3c는 Mab셀렉트 SuRe™으로의 포획 후의 크로마토그램이고, 도 3d는 람다Fab셀렉트로의 포획, 프랙토겔 EMD SO3로의 연마 및 한외여과 후의 크로마토그램이다.
마지막 2-단계 정제된(람다/CEC) 이중특이적 bbmAb1을 표 6에 열거된 방법으로 추가 분석하였다. 전체적으로 이 물질은 여러 분리 방법, 예컨대, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), CE-SDS 및 모세관 구역 전기영동(CZE)에 의해 검출된 바와 같이 낮은 수준의 응집물 또는 분해 생성물을 갖는, 높은 순도를 보여준다.
Figure pct00009
다른 항체의 추가 조합도 시험하였다. 표 4는 획득한 분석 결과의 요약을 보여준다.
6. 실시예 2: bbmAb1의 시험관 내 활성
bbmAb1의 결합 활성을 여러 가지 상이한 세포 분석에서 시험하였다.
(1) 재료 및 방법
(a) 용액 평형 적정(solution equilibrium titration, SET) 분석의 경우
다음 재료를 사용하였다:
재조합 인간 IL-18, 비오틴 부착형(BTP25828)
재조합 시노몰구스 원숭이 IL-1β(Novartis)
항-인간 IgG 항체, SULFO-TAG 라벨 부착형(Meso Scale discovery (MSD) # R32AJ-5)
염소 항-인간 Fab 특이적, MSD SULFO-TAG NHS 에스테르와 접합형(Jackson Immuno Research # 109-005-097, MSD #R91AN-1) BSA(Sigma # A-9647)
계면활성제가 있는 MSD 판독 완충액 T(MSD #R92TC-1)
인산염 완충 식염수(PBS) 10x(Teknova #P0195) 트리스 완충 식염수, pH 7.5(TBS) 10x(Teknova #T1680) 트윈-20(Fluka #93773)
폴리프로필렌 미세적정 플레이트(MTP)(Greiner #781280)
384-웰 플레이트, 표준형(MSD #L21XA)
(b) 세포 분석 및 SET 분석의 경우
IL-1β 항체 섹션에 기술된 바와 같은 mAb2.
IL-18 항체 섹션에 기술된 바와 같은 mAb1.
실시예 1에 기술된 바와 같은 bbmAb1.
MBL Int. Corp.로부터 구입한 재조합 인간 IL-18(BTP 25829)(#B001-5)
재조합 마모셋 IL-1β(Novartis)
재조합 마모셋 IL-18(Novartis)
재조합 인간 IL-12(#573008)는 Biolegend KG-1 세포주(ATCC #CCL-246)로부터 구입하였다.
정상 인간 진피 섬유모세포(#CC-2509)는 Lonza로부터 구입하였다.
마모셋 피부 섬유모세포(#42637F (510))
HEK-Blue™ IL-18/IL-1β 세포(#hkb-il18)는 InvivoGen으로부터 구입하였다.
PBMC는 Blutspendezentrum Bern으로부터 입수한 백혈구 연층으로부터 단리하였다.
마모셋 혈액은 SILABE(Niederhausbergen)로부터 입수하였다.
IL-6 ELISA: 인간(BioLegend, #430503); 마모셋(U-CyTech biosciences, CT974-5)
IFNγ ELISA: 인간(BD555142) 및 마모셋(U-CyTech biosciences #CT340A)
SEAP 검출을 위한 QUANTI-Blue™ 분석(#rep-qb1)은 InvivoGen으로부터 구입하였다.
세포 배지: 10% 소 태아 혈청(Invitrogen #10108-157), 1% L-글루타민(Invitrogen #25030-03), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen #15140-148), 10 μM 2-메르캅토에탄올(Gibco #31350-010), 5 mM Hepes(Gibco #15630-080)가 보충된 RPMI 1640(Invitrogen #31870)
둥근 바닥, 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3799)
평평 바닥, 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3596)
Ficoll-Pacque™ 플러스(GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) PBS 1X, 칼슘과 마그네슘 불포함(Gibco #14190094)
다공성 배리어가 있는 Leucosep 튜브, 50 ml, 폴리프로필렌(Greiner bio-one #227290) Falcon 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD#352096)
Falcon 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD #352070)
(c) SET에 의한 친화도 측정
SET 개별 표적 결합 분석
항원의 22 연속 1.6n 희석물(가장 높은 농도: huIL-18, 5 nM; marIL-18, 10 nM; huIL-1β, 0.5 nM; marIL-1β, 0.5 nM)을 샘플 완충액(0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS)에 제조하고, 일정한 농도의 항체를 첨가하였다(IL-18 판독의 경우 10 pM, IL-1β 판독의 경우 1 pM). 60 μl/웰 부피의 각 항원-항체 혼합물을 384-웰 폴리프로필렌 미세적정 플레이트(MTP)에 2반복으로 분배하였다. 샘플 완충액은 음성 대조군으로, 항체만을 함유하는 샘플은 양성 대조군으로 작용하였다(항원이 없는 최대 전기화학발광 신호, Bmax). 플레이트를 밀봉하고 진탕기에서 실온(RT)에서 밤새(o/n, 적어도 16시간) 인큐베이션하였다.
IL-18 판독: 스트렙타비딘 코팅된 384-웰 MSD 어레이 MTP를 30 μl/웰의 비오틴 부착된 huIL-18(0.1 μg/ml, PBS)로 코팅하고 진탕기에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
IL-1β 판독: 표준 384-웰 MSD 어레이 MTP를 포집제로서 PBS에 희석된 30 μl/웰의 huIL-1(3 μg/ml, PBS)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
플레이트를 실온 (RT)에서 1시간 동안 50 μl/웰의 차단 완충액(5% BSA를 함유하는 PBS)으로 차단시켰다. 세척(TBST, 0.05% 트윈 20을 함유하는 TBS) 후, 부피 30 μl/웰의 평형화된 항원-항체 혼합물을 폴리프로필렌 MTP에서 코팅된 MSD 플레이트로 옮기고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 추가 세척 단계 후, 샘플 완충액에 희석된 30 μl의 설포 태그-라벨 부착된 항-IgG 검출 항체(0.5 μg/ml)를 각 웰에 첨가하고, 진탕기에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 세척하고 35 μl/웰의 MSD 판독 완충액을 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 전기화학발광(ECL) 신호를 MSD 섹터 이미저 6000에 의해 생성하고 측정하였다.
SET 동시 표적 결합 분석
분석 A를 제외하고, 위에 기술된 바와 같이 SET 분석을 수행하였다: 과량의 한 표적(500 pM의 IL18 또는 IL-1β)의 존재 하에 평형화 과정(항체/항원 혼합)을 수행하면서 다른 표적의 KD를 평가하였다.
분석 B: 한 혼합물 내의 연속 희석물 중 두 표적으로 평형화 과정(항체/항원 혼합)을 동시에 수행하였다(일정한 농도의 항체 10 pM, 최고 항원 농도. 위 참조). 그런 다음, 동일한 혼합물을 위에 기술된 바와 같이 IL18 및 IL-1β 코팅된 플레이트에서 유리 항체 농도에 대해 분석하였다.
SET 데이터를 MS Excel 애드-인 소프트웨어인 Xlfit으로 내보내기 하였다. 각 분석 내의 2반복 측정으로부터 평균 ECL-신호를 계산하였다. 모든 데이터 점에서 가장 낮은 값을 빼서 데이터를 기준선으로 조정하고 상응하는 항원 농도에 대해 플로팅하여 적정 곡선을 생성하였다. KD 값은 다음으로 도표를 적합화하여 결정하였다:
단일특이적 Ab의 경우 1:2 결합 모델
Figure pct00010
노브 인 홀 이중특이적 Ab의 경우 1:1 결합 모델
Figure pct00011
(여기서:
y: ECL 신호를 뺀 블랭크
Bmax: 0의 항원 농도에서의 최대 ECL 신호
[IgG]: 적용된 항체 농도
[Fab]: 적용된 총 Fab 농도
KD: 해리 평형 상수
x: 적용된 항원 농도)
(d) 세포 배양
10% 소 태아 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 KG-1 세포를 2x105 내지 1x106개 생존 세포/mL의 밀도로 성장시켰다.
정상 인간 섬유모세포 및 마모셋 섬유모세포를 bFGF(1 ng/ml, CC-4065), 인슐린(5 μg/ml, CC-4021) 및 2% FCS(CC-4101)를 포함하는 FBM(Clonetics, CC-3131)에서 성장시켰다. 기아 배지로서, 섬유모세포 기본 배지(LONZA # CC-3131)가 사용되었다.
HEK-Blue™ IL-18/IL-1β 세포를 성장 배지(DMEM, 4.5 g/l 글루코스, 10% (v/v) 소 태아 혈청, 50 U/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 100 mg/ml 노르모신(Normocin™); 30 μg/ml의 블라스티시딘, 200 μg/ml의 하이그로골드(HygroGold™) 및 100 μg/ml의 제오신(Zeocin™)이 보충된 2 mM L-글루타민)에서 성장시켰다.
제조사의 지시에 따라 LeucoSep 튜브를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 백혈구 연층으로부터 신선하게 단리하였다. 간략히 설명하면, 13 ml의 Ficoll-Paque를 1,000 × g에서 30초 동안 원심분리하여 14 ml LeucoSep 튜브에 사전로딩하였다. 헤파린 처리된 전혈 샘플을 동일한 부피의 PBS로 희석하고, 희석된 혈액 25 ml를 LeucoSep 튜브에 첨가하였다. 실온에서 중단 없이 세포 분리 튜브를 800 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 현탁액 층을 수집하고, 세포를 PBS에서 2회(2회 연속 세척에 대해 각각 640 및 470 × g에서 10분 동안) 세척하고, 계수하기 전에 배양 배지에 재현탁시켰다.
마모셋 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집하고 70 μm 세포 여과기를 사용하여 여과하였다(BD Biosciences # 352350).
(e) IL-1β 중화 분석
섬유모세포에서의 IL-1β 유도된 IL-6 생산 분석은 약간만 변형하여 본질적으로는 기재된 바와 같이(Gram 2000) 수행하였다. 간략히 설명하면, 섬유모세포를 96 웰 평평 바닥 조직 배양 플레이트에 웰당 5x103개 세포의 밀도(100 μl)로 시딩하였다. 다음날, 재조합 IL-1β/화합물 용액 혼합물(표에 표시된 IL-1β 농도)을 첨가하기 전에 기아 배지에서 세포를 5시간 동안 굶겼다. IL-1β/화합물 용액 혼합물은 37℃에서 30분 동안 소정의 농도 범위의 화합물과 재조합 IL-1β를 인큐베이션함으로써 미리 제조하였다. 37℃에서 o/n 인큐베이션 후 세포 상청액을 수집하고 방출된 IL-6의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. PBMC에서 IL-1β 유도된 IL-6 생산 분석은 다음에 따라 수행하였다. PBMC를 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 3x105개 세포(100 μl)로 시딩하고 37℃에서 24시간 동안 재조합 IL-1β/화합물 용액 혼합물(표에 표시된 IL-1β 농도)과 함께 인큐베이션하였다. IL-1β/화합물 용액 혼합물은 37℃에서 30분 동안 소정의 농도 범위의 화합물과 재조합 IL-1β를 인큐베이션함으로써 미리 제조하였다. 24시간의 자극 후 세포 상청액을 수집하고 ELISA에 의해 방출된 IL-6의 양을 결정하였다.
(f) IL-18 중화 분석
분석을 본질적으로 다음에 따라 수행하였다. 웰당 3 x105개의 밀도로 KG-1 세포(사전에 PBS + 1 % FCS에서 1시간 동안 굶김) 또는 PBMC를 둥근 바닥 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고 소정 농도 범위의 화합물과 함께 재조합 IL-18/IL-12의 용액 혼합물(표에 표시된 IL-18/IL-12 농도)과 인큐베이션하였다. 37℃에서 24시간의 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고 방출된 IFNγ의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 마모셋 혈액으로의 분석을 위해 웰당 85 μl의 혈액을 사용하였다.
(g) HEK-Blue™ 세포에서 이중 IL1β/IL-18 중화
본질적으로 제조사의 취급 절차에 기술된 바와 같이 분석을 수행하였다. 간략히 설명하면, HEK-Blue™ 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 4 x 104개의 밀도로 시딩하고, 소정 농도 범위의 화합물과 함께 (1:1 SEAP 신호를 생성하기 위하여) 재조합 IL-1β 및 IL-18의 용액 혼합물과 인큐베이션하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상청액을 수집하고 제조사의 지시에 따라 QUANTI-Blue™ 방법을 사용하여 방출된 SEAP의 양을 결정하였다.
모든 데이터를 EXCEL 소프트웨어로 내보내기 하고, EXCEL/XLfit4 또는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 로지스틱 곡선 적합화 함수에 대한 용량-반응 곡선을 플로팅하여 IC50 값을 계산하였다.
(2) 결과
(a) 재조합 인간 및 마모셋 IL1β 및 IL-18에 대한 친화도
인간 및 마모셋 재조합 IL-1β 및 IL-18 단백질에 대한 bbmAb1의 결합 친화도를 용액 평형 적정(SET)(도 5)에 의해 측정하고, 생성된 KD 값을 IL-1β에 대한 mAb2 및 IL-18 결합에 대한 mAb1의 결합 친화도와 비교하였다. 도 5는 용액에서 ECL 기반 친화도 결정의 적정 곡선을 보여준다. 일정 농도의 항체: IL-18 판독의 경우 10 pM, IL-1β 판독의 경우 1 pM; 항원 희석물: 최고 농도: huIL-18, 5 nM; marIL-18, 10 nM; huIL-1β, 0.5 nM; marIL-1β, 0.5 nM. 실선은 위에서 기술된 모델을 사용한 데이터의 적합을 나타낸다. 점선은 95% 신뢰 구간, n=3을 나타낸다.
개별 표적 결합 분석에서 결합 친화도를 비교한 결과, bbmAb1은 인간 및 마모셋 IL-18에 대한 mAb1과 비교하여 유사한 평균 KD를 나타내었다(표 7). 인간 IL-1β 결합의 경우, 평균 KD 값은 mAb2(0.6 pM)에 비해 bbmAb1(2.6 pM)에 대해 약간 더 컸으나, 여전히 동일한 낮은 pM 범위에 있었다. 동시 이중 표적 결합 분석(표 8)에서의 후속 측정은 IL-1β에 대한 bbmAb1 결합 KD 값이 전임상뿐만 아니라 임상 등급 물질의 mAb2의 값과 유사하다는 것을 확인시켜 주었다. 따라서, bbmAb1은 인간 및 마모셋에서 두 표적에 대해 각각 mAb2 및 mAb1과 유사한 결합 친화도를 보유한다.
Figure pct00012
개별 표적 결합 결과에 더하여, 다른 표적의 결합 KD 값을 평가하는 동안 과량의 한 표적을 적용하거나(분석 A) 연속 희석에서 두 표적의 혼합물을 적용하여(분석 B) bbmAb1의 동시 이중 표적 결합 친화도를 조사하였다(표 8). 동시 IL-1β/IL-18 친화도 결정은 분석 A(과량의 한 항원)와 분석 B(연속 희석에서 두 항원의 혼합물) 사이에 유의미한 차이를 나타내지 않았는데, 이는 두 표적이 다른 표적의 결합에 영향을 미치지 않으면서 동시에 결합됨을 증명하였다. 나아가, 동시 이중 결합 분석으로 수득한 KD 값은 표준 분석으로 수득한 KD 값(표 7; 제2 항원의 부존재 하)과 유사하였으며, 이는 bbmAb1이 두 항원에 독립적으로 결합할 수 있음을 증명하였다. 따라서, bbmAb1은 인간 IL-1β와 IL-18 둘 다와 동시에, 그리고 독립적으로 결합하며, 상응하는 마모셋 단백질과 완전히 교차 반응한다.
Figure pct00013
(b) 인간 및 마모셋 세포 분석에서 bbmAb1의 중화 활성
두 사이토카인(IL1β 및 IL-18) 둘 다에 대한 bbmAb1의 중화 활성을 평가하였다(mAb2mAb1). 또한, 마모셋 세포 분석 시스템을 사용하여 마모셋 IL-1β 및 IL-18의 중화에 대한 bbmAb1의 효능을 평가하였다(섹션 d 참조).
(c) 인간 세포에서 개별 및 동시적 IL-1β 및 IL-18 중화
IL-1β에 대한 bbmAb1의 중화 활성은 인간 진피 섬유모세포(6 pM로 사용된 IL-1β) 및 인간 PBMC(60 pM로 사용된 IL-1β)에서의 재조합 IL-1β 유도성 IL-6 생산 억제에 의해 평가하였다. IL-18에 대한 bbmAb1의 중화 활성은 KG-1 세포 및 인간 PBMC(두 세포는 1 ng/ml의 재조합 인간 IL-12와 함께 3 nM 재조합 인간 IL-18로 활성화됨)에서 재조합 IL-18 유도성 IFN-γ 생산 억제에 의해 측정하였다. IL-1β와 IL-18에 대한 bbmAb1의 억제 효능을 항상 각각 mAb2 또는 mAb1의 억제 효능과 비교하였다. 분석에 따라, bbmAb1의 평균 IC50 값은 nM 미만 또는 한 자릿수 nM 범위에 있었고 직접 비교에서 각각 mAb2(IL-1β의 경우)와 mAb1(IL-18의 경우)보다 최대 2 내지 4배 컸다(표 9 및 표 10). mAb2/mAb1의 2가 형식과 비교하여 bbmAb1의 1가 형식뿐만 아니라 잠재적으로 KiH 돌연변이도 bbmAb1의 효능의 이러한 약간의 차이의 원인일 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
재조합 IL-1β 및 IL-18로의 1+1 자극에 반응하여 SEAP를 생산하는 HEK Blue™ 리포터 세포로 증명된 바와 같이, bbmAb1은 IL-1β와 IL-18 둘 다의 생물활성을 동시에 중화시킬 수 있었다(표 11). 이 분석 시스템에서 SEAP의 유사한 억제는 개별 항체의 사용에 의해서가 아니라 mAb2와 mAb1의 조합에 의해서만 달성될 수 있었다.
Figure pct00016
(d) 마모셋 세포 분석에서 마모셋 IL-1β 및 마모셋 IL-18에 미치는 bbmAb1의 중화 활성
마모셋에서 bbmAb1의 억제 활성을 증명하기 위하여, 인간 세포와 유사하게 마모셋 세포로, 그러나 자극을 위하여 재조합 마모셋 IL-1β와 IL-18을 사용하여 시험관 내 분석을 수행하였다. 마모셋 진피 섬유모세포에서 재조합 마모셋 IL-1β 유도성 IL-6 생산의 억제를 평가할 때, bbmAb1은 nM 미만의 효능을 나타내었고, mAb2와 비교하여 2 내지 3배 더 큰 IC50 값을 나타내었다(표 12). 마모셋 IL-1β로 자극한 인간 진피 섬유모세포로의 bbmAb1 시험은 인간 IL-6과 유사한 억제 프로파일을 생성하였다.
Figure pct00017
bbmAb1의 한 자리 내지 두 자릿수 nM IC50 값은 마모셋 혈액 세포를 이용한 IFNγ 생산 분석에서 시험한 마모셋 IL-18에 대한 bbmAb1의 중화 활성을 확인시켜 주었다(표 3 내지 표 7). 마모셋 IL-18로 자극한 인간 PBMC로 bbmAb1을 시험한 결과, 인간 IFNγ의 생산을 측정할 때 유사한 억제 프로파일이 생성되었다.
따라서, bbmAb1은 마모셋 반응 세포를 사용하는 기능 분석에서 마모셋 IL-1β 및 마모셋 IL-18에 대해 완전히 교차 반응성인 것으로 나타났다.
Figure pct00018
KiH 형식 IL-1β/IL-18 이중특이적 mAb인 bbmAb1은 여러 상이한 세포 분석에서 본래의 mAb인 mAb2와 mAb1과 비교할 때 두 개의 개별 표적인 IL-1β와 IL-18에 대한 사이토카인 중화 효능뿐만 아니라 높은 친화도 결합을 보유함이 증명되었다. bbmAb1의 이중 IL-1β 및 IL-18 중화 특성은 인간 사이토카인/세포뿐만 아니라 상응하는 마모셋 사이토카인/세포에 대해서도 증명되어, 적절한 독성학 연구를 용이하게 한다. IL-1β 및 IL-18 중화에 대한 일부 세포 분석에서 생성된 최대 2배 내지 4배 더 큰 IC50 값은, 각각 mAb2와 mAb1의 2가 결합과 대조적으로, bbmAb1의 1가 결합의 결과일 수 있다. 그럼에도, bbmAb1에 의한 이중 사이토카인 중화는 본 발명자들의 시험관 내 세포 시스템에서 적절하게 표현되지 않을 수 있는 부가적 또는 상승적 억제 활성을 생체 내에서 초래할 수 있다.
7. 실시예 3: PBMC에서 조합된 IL-1β와 IL-18 자극 및 차단의 영향
이펙터 사이토카인 IL-1β 및 IL-18의 인플라마솜 활성화 의존적 절단은 2차성 전염증성 매개체 유도를 초래하고, 면역 세포 동원/활성화를 전신적으로뿐만 아니라 염증 부위에서도 촉진시킨다. 치명적 전신 염증에 대한 두 가지 상이한 마우스 모델인 (a) LPS 주사 모델 및 (b) FCAS 마우스(NLRP3에서 미스센스 돌연변이를 활성화함)에서, IL-1β와 IL-18 둘 다의 동시 부존재/억제는 단일 IL-1β 또는 단일 IL-18 부존재/억제와 비교하여 치사로부터 더욱 보호적이어서, 면역 활성화에 대한 부가적 또는 상승적 기전을 증명하였다(Brydges 2013, van den Berghe 2014). bbmAb1은 설치류 교차 반응성이 없는 인간/마모셋 IL-1β/IL-18 반응성 이중특이적 mAb이므로, 마우스 모델에서 시험할 수 없다. 따라서, bbmAb1에 의한 조합된 IL-1β/IL-18 중화의 부가적 또는 상승적 억제 효과를 드러내기 위하여 인간 PBMC의 자극에 대해 시험관 내에서 인플라마솜 의존적 경로 활성화를 모방하기 위해 LPS/IL-12를 사용하였고, 마이크로어레이를 이용하여 비편향 유전자 발현 분석을 수행하였다. 상보적 활성으로서, 또한 재조합 IL-1β와 재조합 IL-18의 조합 또는 단일 사이토카인 단독으로 자극한 상이한 공여자로부터의 PBMC의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다.
(1) 재료 및 방법
(a) 세포 배양 및 ELISA
10% 소 태아 혈청(Invitrogen #10108-157), 1% L-글루타민(Invitrogen #25030-03), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen #15140-148), 10 μM 2-메르캅토에탄올(Gibco #31350-010), 5 mM Hepes(Gibco #15630-080)가 보충된 RPMI 1640(Invitrogen #31870 또는 Gibco #61870-010)
재조합 인간 IL-1β는 Sino Biological Inc.로부터 구입하였다(#10139-HNAE-5).
재조합 인간 IL-18은 MBL로부터 구입하였다(#B001-5).
재조합 인간 IL-12는 Biolegend(#573008)로부터 구입하였다.
IFNγ ELISA: MAX 표준물질 세트, BioLegend, #430103 또는 BD OptEIA 인간 IFNγ ELISA 세트, BD #555142
IL-6 ELISA: MAX 표준물질 세트, BioLegend, #430503
IL-26 ELISA: Cloud Clone Corp #SEB695Hu
IL-1β 항체 섹션에 기술된 바와 같은 mAb2.
IL-18 항체 섹션에 기술된 바와 같은 mAb1.
실시예 1에 기술된 바와 같은 bbmAb1.
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 엔테리티디스(enteritidis)로부터의 LPS, Sigma #L7770
PBMC는 Blutspendezentrum Bern으로부터 입수한 백혈구 연층으로부터 단리하였다.
둥근 바닥, 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3799) 평평 바닥, 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3596) Ficoll-Pacque ™ 플러스(GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) PBS 1X, 칼슘과 마그네슘 불포함(Gibco #14190094)
Falcon 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD#352096) Falcon 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD #352070)
다공성 배리어가 있는 LeucosepTM 튜브, 50 ml, Greiner bio-one #227290
세포 여과기 70 μM, BD Biosciences #352350
트리판블루, Sigma # T8154
RNA 단리, 양 및 품질 측정 및 qPCR:
뉴클레아제 불포함 수, Ambion #AM9938
Rnase Zap, Ambion #AM9780
1.5 ml 에펜도르프 튜브, 멸균, Rnase & Dnase 불포함
RLT 완충액, Qiagen #1015762
Rneasy 미니 키트, Qiagen #74104
RNase 불포함 DNase 세트, Qiagen #79254
Agilent RNA 6000 나노 키트, Agilent #5067-1511
칩 프라이밍 스테이션(Chip priming station), Agilent #5065-4401
IKA 와류 믹서
RNaseZAP®, Ambion #9780
Agilent 2100 바이오애널라이저
고성능 cDNA 역전사 키트, Applied Biosystems, # PN4374966
Nase 불포함, 박막, 반투명 뚜껑 0.2 ml PCR 튜브, Ambion #AM12225
MicroAmp Optical 384 웰 반응 플레이트, Applied Biosystems #4309849
TaqMan GenEx Master Mix, Applied Biosystems #4369514
PCR 프라이머(Applied Biosystems)
Figure pct00019
PBMC 준비: 제조사의 지시에 따라 Leucosep 튜브에서 Ficoll -Paque 구배 원심분리에 의해 PBMC를 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 간략히 설명하면, 15 mL의 Histopaque를 50mL LeucosepTM 튜브에 넣고 실온에서 1300 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다. 피펫으로, 백혈구 연층의 희석된 현탁액 30 mL을 Histopaque 용액의 상부에 첨가하고, 중단 없이 1000 g에서 실온에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장(약 20 ml)을 버리고 경계면 고리(=인간 PBMC)를 수집하고 50 ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 튜브에 멸균 PBS 50 mL을 채우고 실온에서 5분 동안 1200 rpm에서 1회 원심분리하였다. 이 원심분리를 2회 반복하였다. 상청액을 살살 버리고 세포를 2% FCS 및 2 mM EDTA가 있는 PBS 50 mL에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기를 사용하여 여과하고, 트리판블루 염색(500 μL의 트리판블루 + 200 μL의 세포 + 300 μL의 PBS)을 사용하여 세포를 계수하였다.
PBMC의 LPS/IL-12 자극: 상청액에서의 사이토카인 생산은 다음에 따라 준비하였다. 최종 부피 100 ul의 웰 중 250000개 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 분배하였다. LPS는 10 ng/ml의 재조합 IL-12와 함께 0.3 ug/ml 내지 3000 ug/ml의 농도로 사용되었다. 상청액을 37℃ 및 10% CO2에서 24시간 후에 수확하였다.
세포 펠릿으로부터 RNA 추출을 다음에 따라 수행하였다. 1000 ul 최종 부피의 웰 중 3x106개 세포를 평평 바닥 24-웰 플레이트에 분배하였다. LPS는 10 ng/ml의 재조합 IL-12와 함께 3 ug/ml로 사용되었다. 세포를 37℃ 및 10% CO2에서 24시간 후에 수확하였다.
재조합 사이토카인에 의한 PBMC의 자극: 12-웰 플레이트의 웰당 7x106개 PBMC를 1.5 ml 최종 부피의 완전 RPMI 배지에 사용하였다. 재조합 사이토카인을 다음의 최종 농도로 첨가하였다: 재조합 IL-1β 10 ng/ml, 재조합 IL-18 3 nM, 재조합 IL-12 1 ng/ml. 37℃ 및 10% CO2에서 4시간 및 24시간 후에 상청액과 세포를 수집하였다.
RNA 단리, 양 및 품질 평가: 세포를 펠릿화하고 펠렛을 2% β-메르캅토에탄올이 있는 350 μl의 Qiagen RTL 완충액에 용해시키고, 연구의 모든 샘플이 수집될 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 동결시켰다. Qiagen 표준 프로토콜을 사용하여 RNA 단리를 수행하였다. 간략히 설명하면, RNeasy 스핀 컬럼으로 옮기기 전에 350 μl의 70% 에탄올을 모든 샘플에 첨가하고, 8000 g에서 15초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버린 후, 350 μl의 완충액 RW1을 첨가하고 컬럼을 8000 g에서 15초 동안 원심분리하여 스핀 컬럼 막을 세척하였다. DNase I 인큐베이션 혼합 용액을 제조사의 지시에 따라 제조하고 RNeasy 스핀 컬럼에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 350 μl 및 500 μl의 완충액 RW1로 세척한 후, RNeasy 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브에 넣고 1분 동안 최고 속도로 원심분리하였다. 35 μl의 RNase 불포함 수를 스핀 컬럼 막에 직접 첨가하고 8000 g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시켜 RNA를 최종적으로 수집하였다. RNA의 양을 Nanodrop ND-1000을 사용하여 측정하였고, RNA를 -20℃에 저장하였다. 제조사의 지시에 따라 RNA 품질 평가를 위하여 RIN 측정을 수행하였다. 간략히 설명하면, 1 μl의 RNA 또는 사다리를 Agilent RNA 6000 나노 칩에 피펫팅하고 Agilent 2100 바이오애널라이저를 사용하여 측정하였다.
qPCR에 의한 사이토카인 유전자 발현 분석:
이 방법은 제조사의 지시에 상응하여 수행되었다. 간략히 설명하면, 400 ng의 RNA를 고성능 cDNA 역전사 키트를 사용하여 지시에 따라 역전사시켰다. cDNA 용액을 RNA/DNA 불포함 수에 1/10으로 희석하고 1 μl cDNA를 384-웰 반응 플레이트에 옮긴 후, 1 μl의 20X TaqMan® 유전자 발현 분석 표적 FAM 유전자 및 10 μl의 2x TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스 및 10 μl의 RNA/DNA 불포함 수와 혼합하였다. 플레이트를 Applied Biosystems ViiA™ 7 실시간 PCR 시스템에 로딩하고, 다음과 같은 기기 설정을 사용하였다:
Figure pct00020
이 연구에 사용된 하우스키핑 유전자는 HPRT1과 RLP27이었다. 다음의 식을 사용하여 표적 유전자의 상대적인 발현을 계산하였다:
1) Ct [기준] = (Ct [HPRT1] + Ct [RLP27]) /2
2) dCt [기준] = 40 - Ct [기준]
3) dCt [표적] = Ct [표적] - Ct [기준]
4) ddCt = dCt [기준] - dCt [표적]
5) 상대적 표적 유전자 발현 = 2^ddCt
다음에 따라 마이크로어레이를 수행하였다. 샘플을 Affymetrix HG_U133_Plus2 마이크로어레이에서 CiToxLAB France에 의해 처리하였다. 이들을 GeneSpring 11.5.1(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아 주 산타클라라 소재)에서 RMA 정규화하고 분석하였다. IPA(Ingenuity Pathway Analysis) 및 Nextbio(Illumina)를 사용하여 경로 분석을 수행하였다. 두 데이터 세트를 독립적으로 처리하였다.
처음에, RStudio suite 및 GeneSpring(PCA, 혼성화 대조군)에서 R 스크립트(MA_AffyQC.R)를 사용하여 사내 QC인 CiToxLAB에 의해 데이터를 표준 품질 제어(QC) 처리하였다. 이후에, 이를 필터링하여 신뢰할 수 없는 발현 수준을 제거하였다: 실험 조건 중 임의의 하나에서 적어도 100%의 샘플이 20번째 백분위수를 초과하는 값을 갖는 경우 엔티티(프로브세트)를 유지하였다.
GeneSpring의 "필터 온 볼케이노 플롯(filter on volcano plot)" 기능을 이용하여 차등 발현된 유전자(DEG)를 확인하였다. 비쌍체 T 검정과 함께 필터링된 유전자(20.0 내지 100.0번째 백분위수의 발현)를 이용하여, 0.05 미만의 보정된 p-값 및 2.0 초과의 배수 변화를 나타내는 프로브세트를 차등 발현된 것으로 간주하였다. 가능한 경우, 즉 LPS(NUID-0000-0202-4150)를 이용한 연구에서, 벤자미니-호크베르그 다중 검정 보정(Benjamini-Hochberg Multiple Testing Correction)이 사용되었다.
사이토카인 자극 실험의 경우, 다음 식을 사용하여 상승 작용을 계산하였다: 신호 A+B / (신호 A + 신호 B - 대조군) ≥1.5
각각의 시그니처(또는 DEG 리스트)를 사용하여 시그니처와 공개 데이터세트의 '질병 유전자 목록'(병변 대 비병변) 간의 중복을 관찰하는 통계적 유의도를 나타내는 Fisher 정확 검정으로 p-값을 계산하였다. 이를 위하여, 목록을 Illumina Base Space Correlation Engine(전 Nextbio)에 업로드하고, 메타 분석 기능과 질병에 대한 키워드 검색을 사용하여 비교하였다.
모든 데이터를 EXCEL 소프트웨어로 내보내기 하고, EXCEL/XLfit4 또는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 로지스틱 곡선 적합화 함수에 대한 용량-반응 곡선을 플로팅하여 IC50 값을 계산하였다. 처리군 간의 차이를 일원 분산분석에 이어 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용한 Dunnett의 다중 비교에 의해 분석하였으며, 결과는 p < 0.05에서 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
(2) 결과
(a) bbmAb1은 전혈에서 LPS/IL-12 유도성 IFNγ 생산을 억제하는 데 매우 효과적이다
10 ng/ml IL-12가 보충된 LPS에 대한 인간 전혈의 노출은 혈액 세포에 의해 생산된 "천연" IL-18에 주로 의존하지만 전적으로는 의존하지 않는 IFNγ 반응을 초래한다. IL-12의 첨가는 아마 반응 세포에서 IL-18 수용체를 상향 조절함으로써, LPS 유도성 IFNγ 반응을 증진시킨다.
사용된 실험 조건에서, mAb1로의 IL-18 중화는 오로지 IFNγ 생산의 불완전한 억제를 초래하는 반면, (mAb2를 사용하는) IL-1β 차단은 IFNγ 반응에 단지 작은 영향을 미쳤다. 흥미롭게도, bbmAb1 또는 mAb2와 mAb1의 조합에 의한 IL-1β와 IL-18의 조합된 억제는 단일 사이토카인 중화와 비교하여 IFNγ 생산을 보다 완전하게 전적으로 억제하였다(도 6). 도 6은 bbmAb1, mAb2, mAb1 또는 조합된 mAb2 & mAb1(콤보)에 의한 전혈에서의 LPS(0.3 μg/ml)/IL-12 유도성 IFNγ의 억제를 나타낸다(도 6a에 도시된 전형적인 억제 곡선). 100 nM에서 사용된 bbmAb1, mAb1 또는 mAb2에 의한 전혈에서 n=4 개별 공여자의 IFNγ 억제 백분율(도 6b에 도시된 평균 및 SEM).
IFNγ와는 별도로, 시험한 다른 사이토카인(IL-2, -4, -6, -8, -10, -13 및 TNFα) 중 어느 것도 본 세포 분석에서 IL-1β와 IL-18의 조합 중화에 의해 부가적으로 억제되지 않았다(데이터 미도시). bbmAb1의 효능은 이중특이적 분자의 1가 형태를 고려하여 mAb2와 mAb1의 조합(콤보)과 동일한 범위에 있었다.
(b) IFNγ는 LPS/IL-12 활성화 인간 PBMC에서 단일 IL-1β 또는 IL-18 억제와 비교하여 bbmAb1(즉, 조합된 IL-1β/IL-18 억제)에 의해 부가적으로 억제된다
bbmAb1을 사용하여 조합된 IL-1β/IL-18 억제에 의한 추가의 부가 효과(IFNγ 이외)를 밝히기 위하여 비편향 전사체학 평가가 요구되었다. 전혈은 전사체학 분석에 최적이 아니므로, 위의 재료 및 방법 섹션에 기재된 LPS/IL-12 자극 분석 조건을 인간 PBMC 샘플에 대해 조정하였다. 총 9명의 공여자로부터의 PBMC를 사용하여, bbmAb1이 PBMC의 상청액으로의 IFNγ 단백질 분비를 부가적으로 억제함을 확인할 수 있었다(도 7). 전혈 실험과 비교하여, 사용된 각각의 mAb의 대략 10배 더 낮은 농도에서 IFNγ 생성이 억제되었다. 중요하게도, IFNγ에 대한 mRNA 수준에서 유사한 억제 패턴이 증명되었으며(도 7), 이는 비편향 마이크로어레이 기반 유전자 발현 분석에 대한 샘플의 적합성을 확인시켜 주었다. 도 7은 인간 PBMC에서 (각각 10 nM 농도의) bbmAb1, mAb2 및 mAb1에 의한 LPS(0.3 μg/ml)/IL-12 유도성 IFNγ 단백질 생산(도 7a) 및 IFNγ 유전자 발현(도 7b)의 억제를 보여준다. n=9의 공여자에서의 억제 백분율 ± SEM이 제시되어 있다. ***p < 0.05 (일원 분산분석)
위의 재료 및 방법 섹션에 기술된 LPS/IL-12 자극 실험으로부터 샘플링된 PBMC로부터 n=5의 개별 공여자로 Affymetrix 마이크로어레이를 수행하였다. 유감스럽게도, 유전자 발현 프로파일의 전반적인 평가는 강력한 LPS/IL-12 자극 효과를 증명하였고, PCA는 자극되거나 자극되지 않은 군 내의 화합물보다는 공여자당 클러스터링을 보여주었다. 그럼에도, 차등 발현된 유전자에 대해 LPS/IL-12 자극된 샘플을 자극된 플러스 bbmAb1과 비교하자 bbmAb1과 조합된 IL-1β/IL-18 차단에 의해 하향 조절되는 유전자의 최종 후보자 목록이 밝혀졌다(표 14). 본 발명자들의 마이크로어레이 데이터를 재확인한 IFNγ 유전자의 강력한 하향 조절과 별도로, 또한 IL-26 유전자는 (mAb2에 의한) 단일 IL-1β 억제 또는 (mAb1에 의한) IL-18 억제에 비해 bbmAb1에 의해 부가적으로 억제된 추가 사이토카인 유전자였다(도 8 참조). 도 8과 도 9는 24시간에 LPS(0.3 ug/ml)/IL-12 자극된 PBMC에서 bbmAb1, mAb2 및 mAb1(각각 10 nM)에 의한 IFNγ와 IL-26에 대한 마이크로어레이 데이터 유래 유전자 발현 수준 및 억제를 도시한 것이다. 개별 공여자의 값은 도 8a(IFNγ)와 도 8b(IL-26)에 도시되어 있고, n=5의 공여자로부터의 억제 백분율(평균 ± SEM)은 도 9a(IFNγ)와 도 9b(IL-26)에 도시되어 있다.
Figure pct00021
(c) IL-26은 LPS/IL-12 자극 PBMC에서 bbmAb1에 의해 부가적으로 억제되는 또 다른 전염증성 사이토카인이다
LPS/IL-12 유도성 IL-26 유전자 발현 및 단백질 생산이 bbmAb1을 사용하여 조합된 IL-1β/IL-18 차단에 의해 가장 효율적으로 억제됨을 추가로 확인하기 위해, 연구를 총 n=9의 PBMC 공여자로 확대하고, qPCR에 의한 IL-26 유전자 발현 및 ELISA에 의한 IL-26 단백질 생산을 조사하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 이는 주로 마이크로어레이 접근법으로 얻은 IL-26 유전자 발현의 억제를 확인시켜 주었다(도 10a). 흥미롭게도, mAb의 추가에 의해 상청액의 IL-26 단백질 수준은 24시간에 부분적으로만 감소되었다(도 10b). 이러한 차이에 대한 이유는 알려져 있지 않지만, IL-26 유전자 발현과 단백질 생산 간의 동역학적 차이뿐만 아니라 IFNγ와 비교하여 IL-26의 소비 차이와 관련이 있을 수 있다. 그럼에도, bbmAb1은 mAb2 및 mAb1과 비교하여 PBMC 상청액에서 IL-26 단백질 수준을 감소시키는 데 우수하였다. 도 10은 인간 PBMC에서 bbmAb1, mAb2 및 mAb1(각각 10 nM)에 의한 LPS(0.3 ug/ml)/IL-12 유도성 IL-26 유전자 발현(qPCR에 의한)(도 10a) 및 IL-26 단백질 수준(도 10b)의 억제를 보여준다. n=9 개별 PBMC 공여자의 억제 백분율(평균 및 SEM). ***p < 0.05 (일원 분산분석).
(d) IL1β/IL18 신호전달 시그니처는 질병과 상관 관계가 있다
재조합 IL-1β 자극이 IL-6 생산을 초래하거나 재조합 IL-18/IL-12 자극이 IFNγ 생산을 초래하는 이전에 확립된 PBMC 배양 조건을 조합하여 부가적 또는 상승적 하류 표적 유전자 또는 시그니처를 밝혀냈다(데이터 미도시). 두 상이한 시점(6시간과 24시간)에서 샘플링된 n=4 공여자로부터의 PBMC로, 유전자 발현 프로파일의 비편향 평가를 위한 Affymetrix 마이크로어레이 평가를 수행하였다. IL-1β 및 IL-18에 의한 조합 자극으로 6시간 및 24시간에 상승적으로 상향 조절된 유전자가 밝혀졌다(데이터 미도시). IL-1β/IL-18 조합에 대한 IL-12 첨가는 일련의 상향 조절된 유전자에 대한 상승 작용을 크게 증가시켰다. 단일 또는 조합된 IL-1β/IL-18 경로 자극(상향 조절된 유전자만)의 생성된 신호전달 시그니처를 사용하여 몇몇 자가 면역 질환에 걸친 환자로부터의 데이터세트를 얻었다. 예를 들어, 공개 사르코이드증 데이터세트와의 상관 관계를 도 11에 예로서 도시하였다. (피셔 정확 검정으로 계산된) p-값은 사르코이드증 환자의 건강한 조직을 병든 조직과 비교하는 여러 공개 연구에 대하여 유의미한 상관 관계를 보여준다. 조직은 피부뿐만 아니라 폐, 눈물샘 및 앞 안와를 포함한다. 모든 데이터세트에 걸쳐, IL1β/IL18 신호전달의 조합이 질병과 가장 좋은 상관 관계를 나타내고, IL-1β와 IL-18이 뒤를 잇는다. IL-1β/IL-18은 5종의 상이한 사르코이드증 조직의 '병든 대 건강한' DEG와 비교하여 PBMC(x-축)의 유전자(DEG)를 차등적으로 상향 조절하였다. p-값(y-축)은 시그니처와 '질병 유전자 목록' 간의 중복을 관찰하는 통계적 유의도를 나타낸다. 검은색 막대는 피부 사르코이드증 병변의 피부 대 건강한 환자의 피부이다. 연회색 막대는 피부 사르코이드증 병변의 피부 대 비병변 피부이다. 흰색 막대는 사르코이드증 환자 대 정상의 눈물샘이다. 진회색 막대는 사르코이드증 환자 대 정상의 앞 안와 조직이다. 줄무늬 막대는 진행성 섬유증의 폐 사르코이드증 대 결절 자기한정적 폐 사르코이드증이 있는 폐 샘플이다.
(e) 결론
LPS 및 재조합 IL-12를 사용하여 시험관 내 배양의 첫 24시간 이내의 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 의존적 NLRP3 인플라마솜 활성화를 모방하였다. bbmAb1을 사용하여 IL-1β 및 IL-18의 조합된 억제가 부가적으로 작용하여 LPS/IL-12로 자극한 PBMC에서 IFNγ 생산을 감소/억제한다는 점이 증명되었다. (Nakanishi, 2001에 의해 검토된 바와 같이) IL-12는 IL-18과 상승적으로 작용하여 T, B, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포에서 IFNγ 생산을 유도하는 것으로 이전에 설명되었지만, 이제 IFNγ 생산에 대한 IL-1β의 부가적인 자극 효과가 사용된 실험 조건 하에서 증명될 수 있었다. 따라서, PBMC와 LPS/IL-12의 공동 배양은, 강력한 IFNγ 반응에 기여하는 "천연" IL-1β 및 IL-18의 생산을 효율적으로 유도한다. 비편향 마이크로어레이 전사체학을 사용함으로써, 단일 IL-1β 또는 IL-18 차단에 비해 조합된 IL-1β/IL-18 중화에 의해 부가적으로 하향 조절된 추가 유전자가 확인되었다. 그 중에는 대부분의 척추동물 종에서는 보존되지만 (마우스와 랫트를 포함하는) 대부분의 설치류 혈통에는 존재하지 않는 IL-20 사이토카인 서브패밀리(IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, 및 IL-26)의 구성원인 IL-26이 있었다(Donnelly 2010). 이것은 IL-20R1과 IL-10R2 쇄로 구성된 이종이량체 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. IL-26 수용체는 주로 비조혈 세포 유형, 특히 상피 세포에서 발현된다. IL-26의 증가된 수준은 RA 환자의 혈청 및 특히 활액에서 보고되었는데(Corvaisier 2012), 여기서 이것은 Th17 세포 성장 및 분화를 촉진하는 인자로서 작용할 수 있었다. 유감스럽게도, IL-1β 및 IL-18의 조합된 차단에 의해 유도된 추가 유전자/경로의 발견은 PBMC 샘플의 LPS/IL-12 자극의 강한 효과에 의해 방해를 받았다. 그럼에도, IFNγ와 IL-26 둘 모두와 어느 정도까지는 IL-22도 PBMC에서 재조합 IL-1β 및 IL-18과의 조합된 자극에 의해 상승적으로 상향 조절된 유전자 가운데 있었으며, 이들 두 인자가 이 활성화 경로에서 하류 이펙터임을 확인시켜 주었다. 따라서, (IL-26과 IL-22를 포함하는) 사이토카인의 IL-20 서브패밀리는 IL-1β 및 IL-18로부터의 동시 신호에 강하게 의존하는 것으로 보인다. 개별 신호 전달 시그니처의 선택성 및 잠재적인 차단 효능에 대해 모든 적절한 주의를 기울일 경우, 이러한 비교는 각 경로가 사르코이드증과 같은 질병에서 활발함을 보여주는 데 유용하다.
8. 실시예 4: 치료적 용도
IL-1β와 IL-18의 조합된 표적화는 선천성 및 적응성 면역 성분 둘 모두가 관여하는 인플라마솜 유발성 염증성 병태에서 단일 사이토카인 차단보다 더 효과적인 치료 전략을 나타낼 수 있다. IL-1β와 IL-18의 동시 중화는 호중구, Th1/Tc1 및 NK 세포, 면역 및 내피 세포의 접착 분자 및 전염증성 사이토카인(예컨대, IL-6, IFNγ 및 IL-17)을 포함한 선천성 및 적응성 면역 성분 둘 모두를 표적으로 한다. IL-1β와 IL-18 둘 다를 차단하는 이점은 구성성 Nlrp3 인플라마솜 활성화 및 IL-1β와 IL-18의 과잉 생산에 의해 유도되는 가족성 한랭 자가면역 증후군(FCAS)의 전임상 마우스 모델에서 얻은 데이터에 의해 뒷받침된다(Brydges 2013). 여기서, IL-1β 또는 IL-18 신호전달이 유전적으로 제거되었을 때 마우스에서 FCAS 병태로부터의 부분 구조가 달성되어, 질환 발병에서 두 사이토카인의 관여를 증명하였다. 중요하게도, IL-18과 IL-1β 신호전달이 결여된 FCAS 마우스는 2개의 사이토카인 중 하나만이 불활성화된 마우스와 비교하여 질환을 훨씬 덜 발달시켜, 이중 IL-1β/IL-18 중화의 부가적 효과를 증명하였다. IL-1β와 IL-18 중화의 부가적 효과는 고용량의 LPS를 마우스에 주사하여 패혈 쇼크를 유발한 또 다른 마우스 모델에서도 증명되었다(van den Berghe 2014). 이 모델에서, IL-1β와 IL-18 둘 모두에 대한 유전적 결핍 또는 항체 중화에 의한 두 사이토카인의 조합된 중화는 LPS 치사를 완전히 방지하였으나, 단일 사이토카인 결핍/중화는 부분적으로만 보호하였다.
IL-1β와 IL-18을 동시에 표적으로 하는 이중특이적 항체에 대한 전반적인 임상 전략은 현재 이용 가능한 옵션보다 더 효과적인 치료 수단을 나타낼 수 있다. 후보 질환을 확인하기 위하여, 전임상 및 번역 연구를 이용하여 후보 질환의 기본 병리생리학에서 IL-1β 및 IL-18 하류 경로의 적극적인 관여를 증명하였다. 만성 폐 사르코이드증은 선천성 및 적응성 면역 개입이 있는 인플라마솜 유도성 질환이라는 신규한 증거가 있다. 나아가, 초기 연구 결과는 이 질환에서 IL-1β와 IL-18 이펙터 사이토카인 둘 다에 대한 중요한 역할을 나타낸다. 따라서, 사르코이드증은 확립된 만성 조직 염증이 있는 질환에서 bbmAb1의 이중 특이성을 증명할 이상적인 기회를 나타낸다. 사르코이드증에서 bbmAb1의 효능은 실리카 또는 베릴륨으로 인한 다른 간질성 폐 질환, 예컨대 과민 (직업성) 폐 질환에서 진전을 초래할 수 있다. 다른 후보 질환은 다른 기관 조직과 관련된 육아종 염증, 예컨대 크론병이다.
조직 손상 및 내피 기능 이상이 있는 혈관 염증은 또한 bbmAb1에 대한 잠재적인 표적을 나타낸다. 기능 장애 내피 세포는 효과적인 항염증 치료에 반응하여, 고정된 혈관 내 결함이 있는 경우에도 개선된 혈관 흐름을 초래할 수 있다. 최근의 문헌 증거는 겸상 적혈구 질환(SCD)이 높은 비율의 구성적 혈관 내 용혈을 통해 강력한 인플라마솜 유발성 요소를 갖는 것을 확인하였다. 만성 RBC 용해로부터의 위험 신호(요산, 헴/Fe3+, 기타 세포 내 성분)의 방출로 인한 인플라마솜 활성화는 인플라마솜 수용체를 유발하고, 이를 활성화하며 혈관 내 염증 캐스케이드를 초래하여, 내피 세포 부착 분자의 상향 조절, 호중구와 혈소판의 활성화를 가져와, 내피 세포의 만성 활성화를 초래한다. SCD 환자에서 이러한 끊임없는 혈관 염증은 재발성의 고통스러운 혈관 막힘 위기 및 만성 조직 손상의 급성 악화로 이어진다. 예비적인 내부 증거는 SCD의 기본 질환 과정에서 IL-1β뿐만 아니라 IL-18의 관여에 대한 뒷받침을 제공한다. 따라서, bbmAb1 치료에 의해 SCD 환자의 기저 염증을 감소시키는 것은 관련된 만성 통증과 피로를 감소시킴으로써 환자의 일반적인 삶의 질을 개선하는 것과 함께, 만성 배경 염증을 약화시킬 수 있고, 관련된 종말 기관 손상으로 인한 급성 위기를 예방하고, 급성 겸상 적혈구 위기 및 관련된 종말 기관 손상을 예방할 수 있다. SCD 환자에서 bbmAb1 치료 효능의 증명은 높은 용혈률을 수반하는 만성 염증성 병태, 예컨대 말라리아 및 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환의 기타 만성 또는 급성 악화에서 진전을 초래할 수 있다. IL-1β와 IL-18 조절로부터 혜택을 받을 수 있는 추가 적응증은 허혈 재관류 조직 손상, 예컨대, 심혈관 질환 또는 모든 유형의 상처의 개선된 치유, 그러나 특히 화상의 가장 중증의 연조직 손상과 관련된 적응증이다.
따라서, 본 발명의 구현예에서, 인플라마솜 관련 장애를 앓는 대상체에게 유효량의 본 명세서에 개시된 bbmAb, 예컨대 bbmAb1을 투여하는 단계를 포함하는 인플라마솜 관련 장애의 치료 방법이 제공된다. 잠재적인 인플라마솜 관련 장애는 크라이오피린 관련 자가염증 증후군(CAPS), 가족성 지중해열(FMF), 전신 소아 특발성 관절염(SJIA), 루푸스 신장염, 당뇨 신장병, 급성 신장 손상, 신장성 고혈압, IgA 신장병, 사구체신염(GN), 전두측두엽 치매(FTD), 알츠하이머병(AD), 간질, 뇌졸중, 파킨슨병(PD), 우울증, 사르코이드증, 예컨대 폐 사르코이드증, 췌장염, 특발성 폐 섬유증(IPF), 비알코올성 지방간염(NASH), 죽상동맥경화증, 거대세포 동맥염, 항중성구 세포질 항체(ANCA) 관련 혈관염, 연령 관련 황반 변성(AMD), 이식편 대 숙주병, 제2형 당뇨병, 여드름, 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환(PAD), 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 또는 크론병이다.
일 구현예에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 bbmAb, 예컨대 bbmAb1을 대상체에게 투여함으로써, 대상체의 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 폐 사르코이드증, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 또는 크론병을 치료하는 방법이 제공된다.
9. 실시예 5: 약학적 조성물
약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 bbmAb 항체, 예컨대 bbmAb1을 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이 조성물은 의학적 병태 치료에 적합한 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 증진시키거나 안정화시키며, 또는 조성물의 제제화를 촉진하는 데 이용될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 작용제 및 흡수 지연제, 및 생리적으로 적합한 것 등을 포함한다.
본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 요망되는 결과에 따라 다르다. 투여는 유리체 내, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 또는 피하이거나 표적 부위에 근접하여 투여되는 것이 바람직하다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 유리체 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예컨대, 주사 또는 주입에 의해)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, bbmAb는, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 이 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균성이고 유체여야 한다. 적절한 유체성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 그리고 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 유발될 수 있다.
본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 당해 분야에 잘 알려져 있고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, 치료적으로 유효한 용량 또는 효과적인 용량의 bbmAb가 본 명세서에 기술된 약학적 조성물에 사용된다. bbmAb는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여량 형태로 제형화된다. 투여량 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 여러번 분할된 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에서 사용된 투여 단위 형태는 치료받고자 하는 대상체에 대한 단일 투여용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 연계되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 명세서에 기술된 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 본 명세서에 기술된 특정 조성물 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 이용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 전반적인 건강 및 과거 병력 및 유사한 인자들을 포함한 여러 가지 약물동력학적 인자들에 따라 다르다.
의사 또는 수의사는, 약학적 조성물에 이용되는 본 명세서에 기술된 항체의 용량을 요망되는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 용량보다 낮은 수준에서 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지, 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 소모성 장애의 치료를 위한 본 명세서에 기술된 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하는, 많은 상이한 인자들에 따라 다르다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우, 투여량은 숙주 체중 kg당 약 0.0001 내지 100 mg 및 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg의 범위이다. 항체를 유리체 내로 투여하는 경우, 투여량은 0.1 mg/눈 내지 5 mg/눈의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 전신 투여를 수반한다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회, 또는 필요에 따라(PRN) 전신 투여를 수반한다.
생물학적 치료제, 예컨대 bbmAb1은 일반적으로 여러 차례 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 주, 월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 bbmAb1의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 또한, 대안적인 투약 간격은 의사에 의해 결정될 수 있고, 매월 또는 필요에 따라 효과적이도록 투여될 수 있다. 일부 전신 투여 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 μg/ml, 일부 방법에서는 25 내지 500 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우, 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 인간 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 긴 반감기를 보여준다. 투여량 및 투여 빈도는, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다. 예방적 적용에서, 상대적으로 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 이들의 삶의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질환 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 많은 투여량이 이따금 필요하다. 그 후에, 환자는 예방적 요법으로 투여 받을 수 있다.
서열 표
본 발명을 실행하기에 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표 15에 개시되어 있다.
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본 출원의 본문 전체에 걸쳐, 명세서의 본문(예를 들어 표 15)과 서열 목록 사이에 불일치가 존재할 경우, 본 명세서의 본문이 우선한다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> METHOD OF MANUFACTURING BISPECIFIC ANTIBODIES, BISPECIFIC ANTIBODIES AND THERAPEUTIC USE OF SUCH ANTIBODIES <130> PAT057716-WO-PCT <140> <141> <150> 62/518,090 <151> 2017-06-12 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 71 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 72 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 72 gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60 atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120 gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240 gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300 ggcactaaag tggatattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 73 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Ile Pro Met Thr Gly Gln 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala 1 5 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Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 86 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120 ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180 gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300 tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 87 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 88 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 88 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120 ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180 gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300 tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagcgct 360 agcactaagg gcccctcagt gttccccctg gcccctagct ctaagtctac tagcggcggc 420 accgccgctc tgggctgcct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcatgg 480 aatagcggcg ctctgactag cggagtgcac accttccccg ccgtgctgca gtctagcggc 540 ctgtatagcc tgtctagcgt ggtgaccgtg cctagctcta gcctgggcac tcagacctac 600 atctgtaacg tgaaccacaa gccctctaac actaaggtgg acaagcgggt ggaacctaag 660 tcctgcgata agactcacac ctgtcccccc tgccctgccc ctgaggctgc cggaggacct 720 agcgtgttcc tgttcccacc taagcctaag gacaccctga tgatctctag gacccccgaa 780 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca caacgctaag actaagccta gagaggaaca gtataactcc 900 acctatagag tggtgtcagt gctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggcaaagag 960 tataagtgta aagtctctaa caaggccctg ccagccccta tcgaaaagac tatctctaag 1020 gctaagggcc agcctagaga acctcaggtg tacaccctgc ccccctgtag agaagagatg 1080 actaagaatc aggtgtccct gtggtgtctg gtgaaaggct tctaccctag cgatatcgcc 1140 gtggaatggg agtctaacgg ccagcccgag aacaactata agactacccc ccctgtgctg 1200 gatagcgacg gctcattctt cctgtactct aagctgaccg tggacaagtc taggtggcag 1260 cagggcaatg tgtttagctg tagcgtgatg cacgaggccc tgcataatca ctacactcag 1320 aagtcactga gcctgagccc cggcaag 1347 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 90 Arg Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 91 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 92 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 93 Arg Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 94 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 95 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5 <210> 96 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 96 Arg Asn Asn 1 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 97 Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 98 Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5 <210> 99 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 99 Arg Asn Asn 1 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 100 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 101 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 101 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 102 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 102 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg 330 <210> 103 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 103 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 104 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 104 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg ggtcagccta aggctgcccc cagcgtgacc 360 ctgttccccc ccagcagcga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540 tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600 cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gccccaaccg agtgcagc 648

Claims (34)

  1. 공통 숙주 세포에서 공동 발현에 적합한 이중특이적 항체로서, 이 항체는
    a. 제1 표적에 특이적으로 결합하는, 람다 야생형의 제1 가변 경쇄(VL1) 및 야생형의 제1 가변 중쇄(VH1), 및 이종이량체화 변형이 있는 제1 불변 중쇄(CH1)를 갖는 면역글로불린인 제1 부분 및
    b. 제1 표적과 상이한 제2 표적에 특이적으로 결합하는, 카파 야생형의 제2 가변 경쇄(VL2) 및 야생형의 제2 가변 중쇄(VH2), 및 제1 불변 중쇄의 이종이량체화 변형에 대해 상보적인 이종이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)를 갖는 면역글로불린인 제2 부분을 포함하고,
    제1 부분과 제2 부분은 공통 숙주 세포에서 공동 발현될 때 이중특이적 항체를 형성하는 것인, 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 불변 중쇄는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 바람직하게는 IgD, IgE 또는 IgG, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG1인, 이중특이적 항체.
  3. 제2항에 있어서, 제1 가변 경쇄는 람다 1 유형이고, 제2 가변 경쇄는 카파 6 유형인, 이중특이적 항체.
  4. 제3항에 있어서, 제1 및 제2 불변 중쇄는 IgG1이고,
    a. 제1 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖거나,
    b. 제1 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고, 선택적으로
    c. 제1 및 제2 불변 중쇄는 이황화 가교를 생성하는 돌연변이를 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 면역글로불린 VH1 도메인, 제1 면역글로불린 VL1 도메인, 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함하며, 이때:
    a. 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 (예컨대, 서열에):
    i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 76의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 77의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐); 또는
    ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 79의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 80의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 81의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고;
    b. 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 (예컨대, 서열에):
    i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 가짐) 또는
    ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 95의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 96의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 97의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고;
    c. 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 (예컨대, 서열에):
    i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가짐); 또는
    ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 49의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하고;
    d. 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 (예컨대, 서열에):
    i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 62의 아미노산 서열을 가짐) 또는
    ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 63의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2는 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3은 서열번호 65의 아미노산 서열을 가짐)을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 면역글로불린 VH1 도메인, 제1 면역글로불린 VL1 도메인, 제2 면역글로불린 VH2 도메인 및 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함하며, 이때:
    a. 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고,
    b. 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하고,
    c. 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하고,
    d. 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 면역글로불린 중쇄, 제1 면역글로불린 경쇄, 제2 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 경쇄를 포함하며, 이때:
    a. 제1 면역글로불린 중쇄는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하고,
    b. 제1 면역글로불린 경쇄는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하고,
    c. 제2 면역글로불린 중쇄는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고,
    d 제2 면역글로불린 경쇄는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 선택하는 방법으로,
    a. 제1 부분과 제2 부분을 선택하는 제1 단계;
    b. 제1 부분과 제2 부분을 공통 숙주 세포에서 공동 발현시켜 제1 부분과 제2 부분을 포함하는 이중특이적 항체를 생성하는 제2 단계;
    c. 정확하게 매치된 이중특이적 항체로부터 잘못 매치된 단편을 제거하여 이중특이적 항체를 정제하는 제3 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제3 정제 단계는 적어도 60%(질량), 70%(질량), 80%(질량), 85%(질량) 순수한, 예컨대 적어도 90%(질량) 순수한, 95%(질량), 96%(질량), 97%(질량), 98%(질량), 또는 99%(질량) 순수한 이중특이적 항체를 생성하는 것인, 방법.
  10. 공통 숙주 세포에서의 공동 발현에 의해 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로,
    a. 제1 부분과 제2 부분을 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 생성하는 제1 단계;
    b. 적어도 하나의 벡터를 공통 숙주 세포에 도입하는 제2 단계;
    c. 이중특이적 항체를 특이적으로 발현하는 세포를 선택하는 제3 단계;
    d. 세포가 이중특이적 항체를 발현하는 조건 하에서 선택된 세포를 배양하는 제4 단계; 및
    e. 적어도 60%(질량), 70%(질량), 80%(질량), 85%(질량) 순수한, 예컨대 적어도 90%(질량) 순수한, 95%(질량), 96%(질량), 97%(질량), 98%(질량), 또는 99%(질량) 순수한 이중특이적 항체를 정제하는 제5 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제1 단계는 제1 부분을 암호화하는 제1 벡터 및 제2 부분을 암호화하는 제2 벡터를 생성하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 제1 부분 또는 제2 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터 및 선택 마커를 포함하는, 발현 시스템.
  13. 제12항에 있어서,
    a. 제1 선택 마커(sm I)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    b. 제1 선택 마커(sm I)와 상이한 제2 선택 마커(sm II)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 선택 마커(sm I)는 엽산염 수송체 또는 돌연변이된 엽산염 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 돌연변이된 엽산염 수용체는 야생형 엽산염 수용체와 비교하여 감소된 엽산염 결합 친화도를 갖고, 제2 선택 마커(sm II)는 DHFR인, 발현 시스템.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 선택 마커(sm I)는 하이그로마이신이고, 제2 선택 마커(sm II)는 Neo/G418인, 발현 시스템.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 적어도 제1 선택 마커(sm I)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 제1 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터; 및
    b. 적어도 제2 선택 마커(sm II)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 제2 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터의 두 개의 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하류의 정지 코돈 및 정지 코돈의 하류에 위치한 면역글로불린 막 앵커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템.
  18. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 공통 숙주 세포를 선택하는 방법으로,
    a. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템을 포함하는 복수의 숙주 세포를 제공하는 제1 단계; 및
    b. 선택 마커에 대해 선택적인 조건 하에서 상기 복수의 숙주 세포를 배양하여 관심 생성물을 발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    a. 한계 농도의 엽산염 포함; 및/또는
    b. 500 nM 이하의 농도의 엽산 포함; 및/또는
    c. 다음으로부터 선택되는 농도의 엽산 포함:
    i. 1000 nM 내지 100 pM;
    ii. 100 nM 내지 1 nM;
    iii. 15 nM 내지 1 nM;
    iv. 10 nM 내지 1 nM; 및
    v. 10 nM 내지 2.5 nM; 및/또는
    d. DHFR 억제제 포함; 및/또는
    e. 항엽산염 포함; 및/또는
    f. 500 nM 이하의 농도의 항엽산염 포함; 및/또는
    g. 다음으로부터 선택되는 농도의 MTX 포함:
    i. 500 nM 내지 3 nM;
    ii. 100 nM 내지 10 nM;
    iii. 50 nM 내지 10 nM; 및
    iv. 50 nM; 및/또는
    h. 엽산염 농도의 최대 20배 농도의 항엽산염 포함; 및/또는
    i. 엽산염 농도의 10 내지 20배 농도의 항엽산염 포함; 및/또는
    j. 최대 15 nM 농도 및 MTX의 최대 20배 등몰 농도의 엽산 포함 선택 배양 배지가 사용되는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 숙주 세포는 제17항에 따른 발현 시스템을 포함하고, 제1 또는 제2 부분의 적어도 일부분은 면역글로불린 막관통 앵커 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 융합 폴리펩티드는 상기 숙주 세포의 표면 상에 노출되고 있으며,
    a. 복수의 숙주 세포를 융합 폴리펩티드와 결합하는 검출 화합물과 접촉시키고;
    b. 세포 표면에 결합된 검출 화합물의 존재 또는 양을 기반으로 적어도 하나의 숙주 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 검출 화합물은 제1 또는 제2 표적, 또는 이의 유도체, 및 적어도 하나의 검출 라벨을 포함하는 것인, 방법.
  22. 제10항 또는 제11항에 있어서, 이중특이적 항체를 정제하는 제5 단계는 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 크로마토그래피는
    a. 제1 포획 단계;
    b. 제2 연마 단계; 및 선택적으로
    c. 제3 추가 연마 단계를 포함하는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1 포획 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트, 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트, 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 캡토 어드히어, 또는 프랙토겔 EMD SO3, 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 원리로 수행되는 것인, 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제2 연마 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트, 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트, 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 캡토 어드히어, 또는 프랙토겔 EMD SO3, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 바이러스 불활성화로 구성된 군으로부터 선택되는 원리로 수행되는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제3 추가 연마 단계는 Fc 결합 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G, 람다 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트, 카파 경쇄 특이적 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트, 항개별특이형 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 부분 또는 제2 부분, 표적 기반 친화도 크로마토그래피, 예컨대 제1 표적 또는 제2 표적을 이용한 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 캡토 어드히어, 또는 프랙토겔 EMD SO3, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 바이러스 불활성화로 구성된 군으로부터 선택되는 원리가 단독으로 또는 조합하여 수행되는 것인, 방법.
  27. 제23항에 있어서,
    a. 제1 단백질 A 포획, 예컨대 Mab셀렉트(MabSelect™) SuRe™ 단계, 제2 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계, 및 제3 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계; 또는
    b. 제1 단백질 A, 예컨대 Mab셀렉트 SuRe™ 단계, 제2 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계, 및 제3 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계; 또는
    c. 제1 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계 및 제2 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계; 또는
    d. 제1 람다 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 람다Fab셀렉트 단계 및 제2 카파 경쇄 친화도 크로마토그래피, 예컨대 카파셀렉트 단계로부터 선택된 방법.
  28. 제8항 내지 제11항 또는 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 CHO 세포, 비생산 하이브리도마, 예컨대 Sp 2/0 또는 NS0, 인간 유래 세포주, 예컨대 HEK 또는 PER.C6, 새끼 햄스터 신장(BHK) 유도체, 효모 또는 사상 진균, 원핵 박테리아, 예컨대 E. 콜라이 또는 슈도모나스 플루오레센스, 식물 유도체, 조류 및 섬모충으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  30. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제29항에 따른 약학적 조성물.
  31. 인플라마솜 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제29항에 따른 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 인플라마솜 관련 질환은 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 폐 사르코이드증, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 이중특이적 항체 또는 약학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제29항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 인플라마솜 관련 장애를 앓는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 인플라마솜 관련 장애의 치료 방법.
  34. 제33항에 있어서, 인플라마솜 관련 장애는 겸상 적혈구 질환, 혈관병, 허혈 재관류 손상, 심혈관 질환, 말초 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 혈관 기능 장애, 골격근 허혈, 폐 사르코이드증, 섬유증, 말라리아, 혈액 투석 의존적 만성 신장 질환 또는 크론병인, 방법.
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