BR112019025904A2

BR112019025904A2 - método de fabricação de anticorpos biespecíficos, anticorpos biespecíficos e uso terapêutico de tais anticorpos

Info

Publication number: BR112019025904A2
Application number: BR112019025904-0A
Authority: BR
Inventors: Michael Otto Bardroff; Dhavalkumar Patel; Maximilian Woisetschlaeger; Tina BUCH; Christian Graf; Daniel Heitmann; Thomas Jostock; Hans-Peter Knopf; Rolf KOEHLER; Jiri Kovarik; Stephen John Oliver
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2020-06-30
Also published as: EP3638692A1; CO2019013838A2; JP7106234B2; CL2019003613A1; TWI826377B; AU2018284303B2; JOP20190283A1; KR20200005746A; MX2019015021A; RU2019140335A; MA49394A; CN110730788A; AU2021206810A1; US20190002589A1; US11987644B2; AR112419A1; IL271179A; ECSP19087580A; WO2018229612A1; PE20200384A1

Abstract

A invenção refere-se a anticorpos monoclonais biespecíficos bivalentes (bbmAb) ou suas variantes e métodos de fabricação de tais anticorpos por coexpressão de derivados mutados em Fc- 5 modificados de dois anticorpos monoclonais diferentes em linhagens de células de mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO DE FABRICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS, ANTI- CORPOS BIESPECÍFICOS E USO TERAPÊUTICO DE TAIS ANTI- CORPOS".

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada a título de referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 30 de maio de 2018, é intitulada PATO57716-WO- PCT SL.txt e tem 68 498 bytes de tamanho.

CAMPO TÉCNICO

[002] A invenção refere-se a anticorpos monoclonais biespeciífi- cos bivalentes (bbmAb) ou suas variantes e métodos de fabricação de tais anticorpos por coexpressão de derivados mutados em FC modifi- cados pelo processo denominado nó no buraco ("knob-into-hole") de dois anticorpos monoclionais diferentes em linhagens de células de mamífero.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Anticorpos biespecíficos, isto é, anticorpos que se ligam a dois epítopos distintos, são bem conhecidos na técnica. Uma aborda- gem para gerar anticorpos biespecíficos é a abordagem denominada nós em buracos (KiH) descrita, por exemplo, por Merchant et a/., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), em que uma primeira IgG de cadeia pesada é modificada para exibir uma estrutura do tipo buraco por in- trodução de mutações pontuais tais como Y349C, T366S, L368A, Y407V e em que uma segunda |gG de cadeia pesada é modificada para exibir uma estrutura de tipo nó por introdução de mutações pon- tuais S354C, T366W ((Merchant et a/., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), página 678, tabela 1). As duas estruturas de IgG diferentes podem então interagir para formar um anticorpo biespecífico bivalente

(bbmAb), isto é, uma proteína heterotetramérica, consistindo em duas cadeias leves diferentes e duas cadeias pesadas diferentes.

[004] Na expressão de dois mAbs modificados por KiH na mesma linhagem de células hospedeiras, o bbmAb desejado perfaz estatisti- camente apenas 25% da proteína expressa, mas 75% são as denomi- nadas impurezas relacionadas com o produto (Klein, Ch. et al., 2012).

[005] Algumas abordagens para ultrapassar esta situação são conhecidas na técnica, tal como facilitar a formação correta de bbmAbs por aplicação de outras modificações na sequência para im- por a ligação H-L correta (quanto a uma revisão ver Klein, Ch. et al. 2012; Kontermann, R. e Brinkmann, U., 2015). No entanto, tais modifi- cações adicionais podem aumentar o risco de formação de anticorpos antifármaco.

[006] Outra abordagem para gerar bbmAbs é revelada em WO12023053A2 ou WO04009618A2, utilizando uma cadeia pesada ou leve partilhada em combinação com diferentes cadeias variáveis. No entanto, manter a cadeia pesada constante reduz significativamen- te a diversidade do repertório de anticorpos onde os ligantes podem ser rastreados.

[007] Ainda outra abordagem para a geração de bbmAbs é reve- lada em US9212230 e implica a expressão e purificação individuais dos mAbs contendo diferentes modificações. Os mAbs resultantes são finalmente embaralhados in vitro para formar o bbmAb pretendido. Tal embaralhamento in vitro é uma etapa do processo adicional complexa que requereu validação e avaliação analítica cuidadosas e pode au- mentar significativamente os custos.

[008] Assim, métodos existentes para gerar bomAbs podem limi- tar a diversidade do repertório de anticorpos disponíveis para rastreio de ligantes ou podem não proporcionar rendimento, pureza e qualida- de do produto globais suficientes de um modo suficientemente econô-

mico para permitir a fabricação a uma escala exequível para desenvol- vimento clínico e comercialização. Adicionalmente, qualquer modifica- ção de cadeias proteicas aumenta inerentemente o risco de induzir anticorpos antifármaco. Em consequência, abordagens que requerem apenas manipulação proteica mínima podem ser clinicamente favorá- veis.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[009] É necessário proporcionar um método aperfeiçoado para a fabricação de anticorpos biespecíficos bivalentes. Particularmente, é necessário um método para a fabricação de anticorpos monoclionais biespecíficos bivalentes (bbmAb), assegurando um rendimento, pureza e qualidade do produto globais suficientes para prosseguir com o de- senvolvimento clínico e fabricação comercial a um custo razoável.

[0010] A presente invenção proporciona, inter alia, um método pa- ra a geração de bbmAbs com uma ou mais das seguintes vantagens: permite o uso de um grande repertório de anticorpos para identificar ligantes sem serem necessárias cadeias leves ou pesadas partilhadas, não requer nenhuma manipulação extensa de proteínas, para além da mutação que conduz a dimerização de cadeias H e, portanto, limita o risco de formação de anticorpos antifármaco, é econômico, pois a ex- pressão é efetuada em uma linhagem de células comum, portanto o bbmAb pode ser produzido em um processo de cultura de células sem necessidade de um embaralhamento específico in vitro e produz mate- rial de elevada qualidade adequado para uso humano, pois impurezas relacionadas com o produto podem ser eficientemente removidas.

[0011] A presente invenção é útil para identificar anticorpos de tipo capa e lambda, em que as cadeias leves não exibem uma ligação promíscua forte com a cadeia pesada correspondente. Tal torna os anticorpos adequados para uso em métodos da invenção. Uma vanta- gem do método pode ser o fato de poderem ser desselecionadas combinações de anticorpos nas quais ambas as cadeias leves trocam o parceiro de ligação da cadeia pesada original, o que origina uma im- pureza relacionada com o produto de tipo H1L2-H2L1. Tal é vantajoso, uma vez que não é fácil proceder à depleção de tais impurezas relaci- onadas com o produto usando processos de purificação da técnica corrente.

[0012] Como será mostrado abaixo, modalidades da invenção permitem a fabricação de bbmAb pelo uso de uma coexpressão em CHO a um rendimento e qualidade adequados para o desenvolvimento Clínico e comercialização de agentes biológicos.

[0013] Em um primeiro aspecto da invenção é proporcionado um anticorpo biespecífico adequado para coexpressão em uma célula hospedeira comum, em que o anticorpo compreende a) uma primeira parte que é uma imunoglobulina com uma cadeia leve variável de tipo selvagem lambda (VL1) e uma cadeia pesada variável de tipo selva- gem (VH1), que se liga especificamente a um primeiro alvo e uma pri- meira cadeia pesada constante (CH1) com uma modificação de hete- rodimerização e b) uma segunda parte que é uma imunoglobulina com uma cadeia leve variável de tipo selvagem capa (L2) e uma cadeia pe- sada variável de tipo selvagem (H2), que se liga especificamente a um segundo alvo, diferente do primeiro alvo, e uma segunda cadeia pesa- da constante (CH2) com uma modificação de heterodimerização que é complementar à modificação de heterodimerização da primeira cadeia pesada constante, em que a primeira parte e a segunda parte, quando coexpressas em uma célula hospedeira comum, formam um anticorpo biespeciífico.

[0014] Em uma modalidade adicional do primeiro aspecto, o anti- corpo biespecífico adequado para coexpressão em uma célula hospe- deira comum resulta, após purificação do anticorpo biespecífico por remoção de fragmentos com emparelhamento defeituoso do anticorpo biespecífico corretamente emparelhado, em um anticorpo biespecífico que é pelo menos 60% (massa), 70% (massa), 80% (massa), 85% (massa) puro, tal como pelo menos 90% (massa) puro, 95% (massa), 96% (massa), 97% (massa), 98% (massa) ou 99% (massa) puro.

[0015] As primeira e segunda cadeias pesadas constantes do anti- corpo biespecífico podem ser IgA, I|gD, IgE, IgG ou IgM humana, prefe- rencialmente IgD, IgE ou IgG. Em uma modalidade preferencial, as primeira e segunda cadeias pesadas constantes são IgG1, IgG2, I9gG3 ou IgG4 humana, muito preferencialmente IgG1. Em uma modalidade, a primeira cadeia leve variável é de tipo lambda e a segunda cadeia leve variável é de tipo capa.

[0016] Em uma modalidade especificamente preferencial, a primei- ra cadeia leve variável é de tipo lamba1 e a segunda cadeia leve vari- ável é de tipo capa 6.

[0017] As primeira e segunda cadeias pesadas constantes podem ser IgG1, em que a primeira cadeia pesada constante tem mutações pontuais gerando uma estrutura em nó e a segunda pesada constante tem mutações pontuais gerando uma estrutura em buraco, ou a primei- ra cadeia pesada constante tem mutações pontuais gerando uma es- trutura em buraco e a segunda pesada constante tem mutações pon- tuais gerando uma estrutura em nó. Opcionalmente, as primeira e se- gunda cadeias pesadas constantes podem adicionalmente ter muta- ções resultando em uma ponte dissulfeto.

[0018] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro domínio VH1 de imunoglobulina, um primeiro domínio VL1 de imunoglobulina, um segundo domínio VH2 de imunoglobulina e um segundo domínio VL2 de imunoglobulina, em que o primeiro domínio VH1 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): re- giões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78, ou regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:79, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:80 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:81, e o primeiro domínio VL1 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:92, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:94, ou regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:95, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:96 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:97; o segundo domínio VH2 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46, ou regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:47, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:48 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:49, e o segundo domínio VL2 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): regiões hi- pervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR2 tendo a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID NO:62, ou regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:63, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos

SEQ ID NO:64 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:65.

[0019] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro domínio VH1 de imunoglobulina, um primeiro domínio VL1 de imunoglobulina, um segundo domínio VH2 de imunoglobulina e um segundo domínio VL2 de imunoglobulina, em que: o primeiro domínio VH1 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 85, o primeiro domínio VL1 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 101, o segundo domínio VH2 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 53, o segundo domínio VL2 de imunoglobulina compreende a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO: 69.

[0020] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobuli- na e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina, em que: a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de amino- ácidos SEQ ID NO: 87, a primeira cadeia leve de imunoglobulina com- preende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 103, a segunda ca- deia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoáci- dos SEQ ID NO: 55, a segunda cadeia leve de imunoglobulina com- preende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71.

[0021] De acordo com um segundo aspecto, é proporcionado um método para selecionar um anticorpo biespecífico de acordo com o primeiro aspecto, o referido método compreendendo: uma primeira etapa de selecionar a primeira parte e a segunda parte; uma segunda etapa de coexpressar a primeira parte e a segunda parte em uma célu- la hospedeira comum, resultando em um anticorpo biespecífico com- preendendo a primeira parte e a segunda parte; uma terceira etapa de purificar o anticorpo biespecífico por remoção de fragmentos com em-

parelhamento defeituoso do anticorpo biespecífico corretamente em- parelhado. Em uma modalidade, a terceira etapa de purificação resulta em um anticorpo biespecífico que é pelo menos 60% (massa), 70% (massa), 80% (massa), 85% (massa) puro, tal como pelo menos 90% (massa) puro, 95% (massa), 96% (massa), 97% (massa), 98% (mas- sa) ou 99% (massa) puro.

[0022] De acordo com um terceiro aspecto, é proporcionado um método para a fabricação de um anticorpo biespecífico de acordo com o primeiro aspecto por coexpressão em uma célula hospedeira co- mum, o referido método compreendendo: uma primeira etapa de gerar pelo menos um vetor codificando a primeira parte e a segunda parte; uma segunda etapa de introduzir o pelo menos um vetor na célula hospedeira comum; uma terceira etapa de selecionar células expres- sando especificamente o anticorpo biespecífico; uma quarta etapa de cultivar as células selecionadas sob condições em que as células ex- pressam o anticorpo biespecífico e uma quinta etapa de purificar o an- ticorpo biespecífico que é pelo menos 60% (massa), 70% (massa), 80% (massa), 85% (massa) puro, tal como pelo menos 90% (massa) puro, 95% (massa), 96% (massa), 97% (massa), 98% (massa) ou 99% (massa) puro.

[0023] Em uma modalidade, a primeira etapa compreende gerar um primeiro vetor codificando a primeira parte e um segundo vetor co- dificando a segunda parte.

[0024] De acordo com um quarto aspecto, um sistema de expres- são compreendendo pelo menos um vetor compreendendo um polinu- cleotídeo codificando a primeira parte ou a segunda parte do anticorpo biespecífico de acordo com o primeiro aspecto e um marcador seleci- onável.

[0025] Em uma modalidade, o sistema de expressão compreende um polinucleotídeo codificando um primeiro marcador selecionável (sm

1) e um polinucleotídeo codificando um segundo marcador selecionável (sm Il), que difere do primeiro marcador selecionável (sm |).

[0026] Em uma modalidade, o primeiro marcador selecionável (sm 1) é um transportador de folato ou um polinucleotídeo codificando um receptor de folato mutado, em que o receptor de folato mutado tem uma afinidade de ligação para folato decrescida em comparação com o receptor de folato de tipo selvagem e o segundo marcador selecio- nável (sm Il) é DHFR.

[0027] Em uma modalidade, o primeiro marcador selecionável (sm 1) é Higromicina e o segundo marcador selecionável (sm |l) é Neo/G418.

[0028] Em uma modalidade, o sistema de expressão compreende dois vetores de expressão em que: um primeiro vetor compreende po- linucleotídeo codificando pelo menos um primeiro marcador selecioná- vel (sm |) e pelo menos polinucleotídeos codificando a primeira parte, e um segundo vetor compreende polinucleotídeo codificando pelo me- nos um segundo marcador selecionável (sm Il) e pelo menos polinu- cleotídeos codificando a segunda parte.

[0029] O sistema de expressão pode compreender um códon de terminação a jusante dos polinucleotídeos codificando a cadeia pesa- da e um polinucleotídeo codificando uma âncora de membrana de imunoglobulina localizada a jusante do códon de terminação.

[0030] De acordo com um quinto aspecto, é proporcionado um mé- todo para selecionar um célula hospedeira comum para uso em um método de acordo com aspectos anteriores, compreendendo uma pri- meira etapa de proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras, compreendendo o sistema de expressão de acordo com aspectos an- teriores e cultivar a referida pluralidade de células hospedeiras sob condições seletivas para o marcador selecionável, obtendo desse mo- do uma célula hospedeira expressando o produto de interesse.

[0031] Em uma modalidade, o meio de cultura seletivo é selecio- nado do grupo compreendendo um meio compreendendo uma con- centração limitante de folato e/ou compreendendo um ácido fólico em uma concentração de 500 nM ou menos e/ou compreendendo um áci- do fólico em uma concentração selecionada de: 1000 nM — 100 pM; 100 nM — 1 NM; 15 nM — 1 NM; 10 NM — 1 nM e 10 nM — 2,5 nM, e/ou compreendendo um inibidor de DHFR e/ou compreendendo um antifo- lato e/ou compreendendo um antifolato em uma concentração de 500 NM ou menos e/ou compreendendo MTX em uma concentração sele- cionada de: 500 nM — 3 nM; 100 nM — 10 nM; 50 nM — 10 nM e 50 nM, e/ou compreendendo uma concentração de antifolato até 20 vezes a concentração de folato e/ou compreendendo uma concentração de antifolato 10 — 20 vezes a concentração de folato e/ou compreendendo um ácido fólico em uma concentração até 15 nM e uma concentração equimolar até 20 vezes de MTX.

[0032] Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende o sistema de expressão em que pelo menos uma porção da primeira ou segunda parte é expressa como um polipeptídeo de fusão compreen- dendo a âncora transmembrana de imunoglobulina ou seu fragmento, em que o referido polipeptídeo de fusão está sendo exibido na superfí- cie da referida célula hospedeira, compreendendo adicionalmente uma etapa de: contatar a pluralidade de células hospedeiras com um com- posto de detecção se ligando ao polipeptídeo de fusão; selecionar pelo menos uma célula hospedeira com base na presença ou quantidade do composto de detecção ligado à superfície celular.

[0033] Em uma modalidade, o composto de detecção compreende o primeiro ou segundo alvo ou seus derivados e uma etiqueta de de- tecção.

[0034] Em uma modalidade, a quinta etapa de purificar o anticorpo biespecífico compreende cromatografia de afinidade e/ou cromatogra-

fia de troca iônica.

[0035] Em uma modalidade, a cromatografia compreende uma primeira etapa de captura; uma segunda etapa de polimento e opcio- nalmente uma terceira etapa de polimento.

[0036] Em uma modalidade, a primeira etapa de captura é realiza- da com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromatogra- fia de afinidade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, bem conhecida na técnica e prontamente disponível comercialmente, por exemplo, LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve capa, bem conhecida na técnica e prontamente disponível comercialmente, por exemplo, KappaSelect'Y, cromatogra- fia de afinidade anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, cromatografia de afinidade baseada em um alvo, tal como cro- matografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cro- matografia de troca iônica, bem conhecida na técnica e prontamente disponível comercialmente, por exemplo, Capto'“ adhere ou Fracto- gel” EMD SO; e cromatografia de interação hidrofóbica.

[0037] Em uma modalidade, a segunda etapa de polimento é reali- zada com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromato- grafia de afinidade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, cromatografia de afinida- de anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, croma- tografia de afinidade baseada em um alvo, tal como cromatografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cromatografia de troca iônica, tal como Capto'“ adhere ou Fractogel't EMD SO;, cro- matografia de interação hidrofóbica e inativação por vírus.

[0038] Em uma modalidade, a terceira etapa de polimento é reali-

zada com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromato- grafia de afinidade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, cromatografia de afinida- de anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, croma- tografia de afinidade baseada em um alvo, tal como cromatografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cromatografia de troca iônica, tal como Capto'“ adhere ou Fractogel't EMD SO;, cro- matografia de interação hidrofóbica e inativação por vírus.

[0039] Em uma modalidade, o método compreende uma primeira etapa de captura de Proteína A, tal como MabSelect'y SuRe'Y, uma segunda etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve lamb- da, tal como LambdaFabSelect'Y, e uma terceira etapa de cromato- grafia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'"Y, ou uma primeira etapa de Proteína A, tal como MabSelect'y SuReTY, uma segunda etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, e uma terceira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'", ou uma primeira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, e uma segunda etapa de croma- tografia de afinidade para a cadeia leve lambda, tal como Lambda- FabSelect'Y, ou uma primeira etapa de cromatografia de afinidade pa- ra a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, e uma segun- da etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y,

[0040] Em uma modalidade, a linhagem de células é selecionada do grupo consistindo em uma célula CHO, um hibridoma não produtor, tal como Sp 2/0 ou NSO, uma linhagem de células derivadas de huma- no, tal como HEK ou PER.C6, um derivado de rim de hamster bebê

(BHK), uma levedura ou fungos filamentosos, uma bactéria procarióti- ca, tal como fluorescência de E. coli ou Pseudomonas, um derivado de planta, uma alga e um ciliado.

[0041] De acordo com um sexto aspecto, é proporcionada uma composição farmacêutica, compreendendo o anticorpo de acordo com o primeiro aspecto e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0042] De acordo com um sétimo aspecto, é proporcionado um anticorpo de acordo com um primeiro aspecto ou a composição farma- cêutica de acordo com o sexto aspecto, para uso como medicamento.

[0043] De acordo com um sétimo aspecto, é proporcionado um anticorpo de acordo com um primeiro aspecto ou a composição farma- cêutica de acordo com o sexto aspecto, para uso no tratamento de uma doença relacionada com inflamassomos.

[0044] De acordo com um oitavo aspecto, é proporcionado um an- ticorpo de acordo com um primeiro aspecto ou a composição farma- cêutica de acordo com o sexto aspecto, para uso no tratamento de uma doença relacionada com inflamassomos, em que a doença relaci- onada com inflamassomos é selecionada do grupo consistindo em do- ença de células falciformes, vasculopatia, lesão de isquemia- reperfusão, doença cardiovascular, doença de artéria periférica, ate- rosclerose, disfunção vascular, isquemia do músculo esquelético, sar- coidose pulmonar, fibrose, malária, doença crônica do rim dependente de hemodiálise e doença de Crohn.

[0045] De acordo com um nono aspecto, é proporcionado um mé- todo de tratamento de um distúrbio relacionado com inflamassomos, compreendendo administrar a um sujeito afligido com um distúrbio re- lacionado com inflamassomos uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição farmacêutica de acordo com o sexto aspecto.

[0046] O distúrbio relacionado com inflamassomos pode ser doen-

ça de células falciformes, vasculopatia, lesão de isquemia-reperfusão, doença cardiovascular, doença de artéria periférica, aterosclerose, dis- função vascular, isquemia do músculo esquelético, sarcoidose pulmo- nar, fibrose, malária, doença crônica do rim dependente de hemodiáli- se ou doença de Crohn.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0047] A Figura 1 é uma perspectiva esquemática da montagem vetorial de acordo com uma modalidade.

[0048] As Figuras 2A - 2E mostram cromatogramas de acordo com uma modalidade. A Figura 2A é um cromatograma de RP-UV de um bbmaAb intato deglicosilado de acordo com uma modalidade. A Figura 2B é um espectro de massa deconvoluído do bbmAb1 deglicosilado intato de acordo com uma modalidade. A Figura 2C é um cromatogra- ma de RP-UV mostrando fragmentos digeridos com papaína de um bbmAb de acordo com uma modalidade. A Figura 2D é um cromato- grama de RP-UV mostrando fragmentos digeridos com IdeS de um bbmAb de acordo com uma modalidade. A Figura 2E é um cromato- grama de RP-UV mostrando fragmentos deglicosilados e reduzidos com DTT de um bbmAb de acordo com uma modalidade.

[0049] As Figuras 3A - 3D mostram cromatogramas de RP-UV de acordo com uma modalidade. A Figura 3A é um cromatograma mos- trando o perfil de pureza da expressão de um bbmAb de acordo com uma modalidade após cultivo. A Figura 3B é um cromatograma de um bbmAb de acordo com uma modalidade após captura por Lambda- FabSelect'Y. A Figura 3C é um cromatograma de um bbmAb de acor- do com uma modalidade após captura com MabSelect'y SuRe'Y, À Figura 3D é um cromatograma de um bbmAb de acordo com uma mo- dalidade após captura com LambdaFabSelect'Y, polimento por Frac- togel'M EMD SO; e ultrafiltração.

[0050] As Figuras 4A - 4M são uma perspectiva esquemática de diferentes opções para emparelhamento defeituoso biespecífico.

A Fi- gura 4A é uma representação esquemática de um monômero de nó (lambda) de mAb1, em que o número 1 representa o domínio pesado variável, o número 2 representa o primeiro domínio pesado constante, o número 3 representa o segundo domínio pesado constante e o nú- mero 4 representa o terceiro domínio pesado constante.

O número 5 representa o domínio leve variável e o número 6 representa o domínio pesado variável.

A Figura 4B é uma representação esquemática de um homodímero de nó (lambda) de mAb1. A Figura 4C é uma representa- ção esquemática de um monômero de buraco (capa) de mAb2, em que o número 7 representa o domínio pesado variável, o número 8 re- presenta o primeiro domínio pesado constante, o número 9 representa o segundo domínio pesado constante e o número 10 representa o ter- ceiro domínio pesado constante.

O número 11 representa o domínio leve variável e o número 12 representa o domínio pesado constante.

À Figura 4D é uma representação esquemática de um homodímero de buraco (capa) de mAb?2. A Figura 4E é uma representação esquemáti- ca de um homodímero de nó de MAb1 com um emparelhamento defei- tuoso CH/LC.

A Figura 4F é uma representação esquemática de um homodímero de nó de mAb1 com dois emparelhamentos defeituosos CH/LC.

A Figura 4G é uma representação esquemática de um homo- dímero de nó de mMAb1 com um emparelhamento defeituoso CH/LC.

À Figura 4H é uma representação esquemática de um homodímero de buraco de mAb2 com um emparelhamento defeituoso CH/LC.

A Figura 4| é uma representação esquemática de um homodímero de buraco de mMAb2 com dois emparelhamentos defeituosos CH/LC.

A Figura 4J é uma representação esquemática de um homodímero de buraco de mMAb2 com um emparelhamento defeituoso CH/LC.

A Figura 4K é uma representação esquemática de bbmAb1 com um emparelhamento de- feituoso capa (CH/LC). A Figura 4L é uma representação esquemática de bbmAb1 com um emparelhamento defeituoso lambda (CH/LC). À Figura 4M é uma representação esquemática de bbmAb1 com dois emparelhamentos defeituosos CH/LC.

[0051] A Figura 5 mostra curvas de titulação de determinação da afinidade à base de ECL de acordo com um Exemplo.

[0052] As Figuras 6A - 6B mostram dois gráficos de acordo com um Exemplo.

[0053] As Figuras 7A - 7B mostram dois gráficos de acordo com um Exemplo.

[0054] As Figuras 8A - 8B mostram níveis de expressão de MRNA de acordo com um Exemplo.

[0055] As Figuras 9A-9B mostram níveis de expressão de MRNA de acordo com um Exemplo.

[0056] As Figuras 10A - 10B mostram dois gráficos de acordo com um Exemplo.

[0057] A Figura 11 é um gráfico mostrando correlações estatísticas de acordo com um Exemplo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[0058] A presente revelação é baseada, inter alia, na descoberta inesperada de que é possível que certos anticorpos com uma cadeia leve de tipo lambda (A) sejam coexpressos com certos anticorpos com uma cadeia leve de tipo capa (K), para formar o bbmAb desejado.

[0059] Sem pretender ficar restringido pela teoria, as CDR de cada cadeia leve e/ou cadeia pesada podem influenciar significativamente quais cadeias leves de tipo lambda (A) é possível coexpressar com certos anticorpos com uma cadeia leve de tipo capa (K) para obter com êxito o bbmab formado.

[0060] Os anticorpos com uma cadeia leve de tipo lambda (A) que são possíveis de coexpressar com certos anticorpos com uma cadeia leve de tipo capa (K), para formar o bbmAb desejado, no seguinte tam-

bém denominados ligantes monoespecíficos, podem ser gerados usando tecnologias que oferecem a oportunidade de obter ambos os tipos de anticorpos de tipo capa ou lambda, tais como bibliotecas de apresentação em Fagos, por exemplo, HuUCAL GOLDO ou HuUCAL PLATINUMO (MorphoSys), ou usando camundongos transgênicos, em que as sequências de imunoglobulinas humanas relevantes foram in- troduzidas no genoma de um animal por engenharia genética, por exemplo, anticorpos OmniAb (OMT), Kymouse"" (Kymab), Trianni Mouse'Y (Trianni) ou AlivaMab Mouse (Ablexis) (referência) podem gerar anticorpos do tipo capa ou lambda.

Os métodos para gerar tais ligantes monoespecíficos são bem conhecidos no domínio perito e são largamente aplicados para gerar conjuntos diversificados de ligantes monoespecíficos de tipo capa ou lambda para o alvo relevante de inte- resse.

Os ligantes monoespeciíficos individuais são caracterizados re- lativamente a parâmetros biológicos relevantes, como afinidade ou po- tência, e também rastreados quanto a, por exemplo, características físico-químicas relevantes para avaliar as denominadas características de possibilidade de desenvolvimento que também são muito bem co- nhecidas no domínio (por exemplo, Lorenz et al., American Pharma- ceutical Review, agosto de 2014). Os ligantes monoespecíficos exibin- do as melhores características são finalmente coexpressos, por exem- plo, em células CHO como descrito em mais detalhe abaixo.

Só são testadas combinações por coexpressão quando um anticorpo de tipo capa se ligando ao primeiro alvo é combinado com um anticorpo de tipo lambda se ligando ao segundo alvo e vice-versa.

O produto de co- expressão resultante e as impurezas relacionadas com o produto rele- vantes são caracterizados em detalhe com a intenção de selecionar uma combinação que resulte no melhor perfil, especialmente as que exibem apenas uma pequena quantidade de ligação promíscua de uma cadeia leve (por exemplo, L1, cadeia leve 1, por exemplo, lamb-

da) com a cadeia pesada errada (por exemplo, H2, cadeia pesada 2). Uma vantagem do método pode ser o fato de poderem ser desselecio- nadas combinações de anticorpos nas quais ambas as cadeias leves trocam o parceiro de ligação da cadeia pesada original, o que origina uma impureza relacionada com o produto de tipo H1L2-H2L1. Tal é vantajoso, uma vez que não é fácil proceder à depleção de tais impu- rezas relacionadas com o produto usando processos de purificação da técnica corrente. O procedimento de como coexpressar os anticorpos individuais e como analisar o produto de coexpressão é delineado em mais detalhe abaixo.

[0061] Anticorpos específicos foram usados como exemplos, prin- cipalmente mAb2 se ligando a IL-18B, com cadeia leve VK6, e o mAb1 se ligando a IL-18, com cadeia leve VM.

[0062] Em uma modalidade preferencial foi usada uma modifica- ção KiH da porção Fc dos dois anticorpos de acordo com Ridgway et al., (1996). Também foram testados outros anticorpos.

[0063] Como será mostrado nos exemplos específicos abaixo, em uma modalidade preferencial, bomAb1 é expresso com uma única li- nhagem de células comum assegurando um rendimento, pureza e qualidade do produto globais suficientes requeridos para a prossecu- ção com desenvolvimento clínico e comercialização do agente biológi- co ou de diagnóstico.

1. Definições

[0064] Para fins de interpretação deste relatório descritivo, as se- guintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os ter- mos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. Defini- ções adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

[0065] O termo "IL-18" é sinônimo de polipeptídeo IL-18, polipeptí- deo Interleucina-18, fator indutor de IFN-gama ou fator indutor de Inter- feron-gama ou fator indutor de INF-y. O termo "IL-18" refere-se a IL-18 humano, a menos que seja indicada outra espécie. IL-18 é bem co- nhecido do perito na técnica e, por exemplo, é obtenível da MBLE In- ternational Corporation com a referência de produto %B001-5. Ao longo deste relatório descritivo, o termo I1L-18 abrange tanto pró-IL-18 (pre- cursor de IL-18 maduro antes da clivagem por proteases) quanto IL-18 maduro (após clivagem por proteases) alternadamente, a menos que seja especificado que se pretende designar a forma pró- ou madura.

[0066] O termo "IL-18" ou "IL-1b" é sinônimo de polipeptídeo IL-1B e polipeptídeo Interleucina-1B. O termo "IL-18" refere-se a IL-18 hu- mano, a menos que seja indicada outra espécie. IL-18 é bem conheci- do do perito na técnica e, por exemplo, é obtenível da Sino Biological com a referência de produto %10139-HNAE-5.

[0067] O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intata ou um seu fragmento funcional. Anticorpos de ocorrência natural com- preendem tipicamente um tetrâmero que é habitualmente composto por pelo menos duas cadeias pesadas (H) e pelo menos duas cadeias leves (L). Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variá- vel de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constan- te de cadeia pesada, habitualmente compreendida por três domínios (CH1, CH2 e CH3). As cadeias pesadas podem ser de qualquer isóti- po, incluindo IgG (subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). A cadeia leve inclui cadeias capa (K) e cadeias lambda (A). A região variável de cadeia pesada e leve é tipi- camente responsável pelo reconhecimento de antígenos, ao passo que a região constante de cadeia pesada e leve pode mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Cla) do sistema clássico do complemento. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervari- abilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que estão mais conservadas, deno- minadas regiões de arcabouço (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas, do terminal amino para o terminal carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FRA4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

[0068] O termo "porção de ligação a antígenos" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antígenos"), como usado aqui, refere-se à totalidade ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno IL-18 ou IL-1B. Foi mostrado que a função de ligação a antígenos de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo completo. Exem- plos de fragmentos de ligação englobados no termo “porção de ligação a antígenos” de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmen- to monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; um frag- mento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmen- tos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward et a/., 1989 Nature 341: 544-546), que con- siste em um domínio VH e uma região determinante de complementa- ridade (CDR) isolada.

[0069] Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante flexível que permite que sejam preparados como uma cadeia única de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; e Huston et a/., (1988) Proc Natl Acad Sc. 85:5879-5883). Também é pretendido que tais anticorpos de cadeia única estejam englobados dentro do termo "porção de ligação a antígenos" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obti- dos usando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o são anticorpos intatos.

[0070] O termo "isolado" significa, ao longo deste relatório descriti- vo, que a imunoglobulina, anticorpo ou polinucleotídeo, consoante o caso, existe em um meio físico distinto daquele onde pode ocorrer na natureza.

[0071] Ao longo deste relatório descritivo, regiões determinantes de complementaridade ("CDR") são definidas de acordo com a defini- ção de Kabat, a menos que seja especificado que as CDR são defini- das de acordo com outra definição. As fronteiras precisas de sequên- cias de aminoácidos de uma dada CDR podem ser determinadas usando qualquer um de alguns esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por Kabat et a/. (1991), "Sequences of Proteins of Immu- nological Interest", 5º Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração de “Kabat”), Al- Lazikani et a/., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeração de "Chothia") e numeração de ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (esquema de numeração de "IMGT"). Por exemplo, para formatos clássicos, sob Kabat, os resíduos de aminoá- cidos de CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são nume- rados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3), e os resí- duos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3). Sob Chothia, os aminoácidos de CDR no VH são numerados 26-32

(HCDR1), 52-56 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3), e os aminoácidos em VL são numerados 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3). Por combinação das definições de CDR de Kabat e Chothia, as CDR consistem nos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoáci- dos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) em VL humana. Sob IMGT, os resíduos de aminoácidos de CDR na VH são numera- dos aproximadamente 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) e 93-102 (CDR3) e os resíduos de aminoácidos de CDR na VL são numerados aproxi- madamente 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) e 89-97 (CDR3) (numeração de acordo com "Kabat"). Sob IMGT, as regiões de CDR de um anticor- po podem ser determinadas com o uso do programa IMGT/ Domain- Gap Align.

[0072] Por convenção, as regiões CDR na cadeia pesada são tipi- camente referidas como H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 e na cadeia leve como L-CDR1, LCDR2 e L-CDR3. São numeradas sequencialmente na direção do terminal amino para o terminal carbóxi.

[0073] Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anti- corpo monoclonal”, como usados aqui, se relacionam com uma prepa- ração de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular.

[0074] O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, se destina a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões de arcabouço e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exem- plo, sequências da linha germinativa humana, ou versões mutadas de sequências da linha germinativa humana ou anticorpo contendo se- quências de arcabouço de consenso derivadas de análise de sequên-

cias de arcabouço humanas, por exemplo, como descrito em Knappik, et al., (2000) J Mol Biol; 296:57-86).

[0075] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências humanas (por exem- plo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica pa- ra sítios in vitro, ou por mutação somática in vivo). No entanto, não é pretendido que o termo "anticorpo humano", como usado aqui, inclua anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germina- tiva de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, tenham sido enxertadas em sequências de arcabouço humanas.

[0076] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anti- corpos que exibem uma única especificidade de ligação que têm regi- ões variáveis em que as regiões de arcabouço e de CDR são deriva- das de sequências humanas.

[0077] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expres- sos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticor- pos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulinas humanas ou um hibridoma preparado a partir daqueles, anticorpos iso- lados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anti- corpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatorial recombinante de anticorpos humanos e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva encadeamento da totalidade ou de uma porção de um gene de imunoglobulina humana. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões de arcabouço e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagê-

nese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgênico para se- quências de Ig humanas, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos re- combinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticor- pos humanos in vivo.

[0078] As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são aqui utilizadas indistinta- mente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno”.

[0079] Como usado aqui, é pretendido que uma molécula de liga- ção que "se liga especificamente a IL-18" se refira a uma molécula de ligação que se liga a I1L-18 humano com uma Kp de 100 nM ou menos, nM ou menos, 1 nM ou menos.

[0080] Como usado aqui, é pretendido que uma molécula de liga- ção que "se liga especificamente a IL-18" se refira a uma molécula de ligação que se liga a IL-18 humano com uma Kp de 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos.

[0081] É pretendido que uma molécula de ligação que "reage de modo cruzado com um antígeno diferente de |IL-18" se refira a uma molécula de ligação que se liga a esse antígeno com uma Kp de 100 NM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos. É pretendido que uma molécula de ligação que "reage de modo cruzado com um antí- geno diferente de IL-18" se refira a uma molécula de ligação que se liga a esse antígeno com uma Kp de 100 nM ou menos, 10 nM ou me- nos, 1 nM ou menos.

[0082] É pretendido que uma molécula de ligação que "não reage de modo cruzado com um antígeno particular" se refira a uma molécu- la de ligação que exibe ligação essencialmente indetectável contra es-

tas proteínas em ensaios de ligação padrão.

[0083] Como usado aqui, é pretendido que o termo "antagonista" se refira a uma molécula de ligação que inibe a atividade de sinaliza- ção na presença de composto ativador. Por exemplo, no caso de IL- 18, um antagonista de IL-18 será uma molécula de ligação que inibe a atividade de sinalização na presença de IL-18 em um ensaio de célu- las humanas, como ensaio de produção de Interferon-gama (IFN-y) dependente de IL-18 em células do sangue humanas. Exemplos de um ensaio de produção de IFN-y dependente de |L-18 em células do sangue humanas são descritos em mais detalhe nos exemplos abaixo.

[0084] O termo anticorpo biespecífico bivalente ou anticorpos bi- específicos bivalentes refere-se a anticorpos se ligando a dois alvos diferentes, tais como IL-18 e IL-1B.

[0085] Os anticorpos biespecíficos são "heterodímeros", o que significa que uma parte provém de um primeiro anticorpo, específico para um primeiro alvo, e outra parte provém de um segundo anticorpo, específico para um segundo alvo. Uma "modificação de heterodimeri- zação" é uma modificação em uma ou ambas as partes dos anticorpos que formam o anticorpo biespecífico heterodimérico, destinada a facili- tar tal formação. Um exemplo de modificações de heterodimerização dos domínios Fc de duas partes I9gG1 de anticorpos destinados a for- mar um biespecífico é um "nó" com uma cadeia lateral de aminoácido (aa) volumosa (S354C, T366W) na primeira cadeia pesada e um "bu- raco" com cadeias laterais de aa pequenas (Y349C, T366S, L368A, Y407V) que foi introduzido na segunda cadeia pesada, bem como uma ponte dissulfeto adicional na região CH3 conectando ambas as cadei- as pesadas (Merchant et a/., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), pá- gina 678, tabela 1).

[0086] Como usado aqui, é pretendido que um anticorpo "sem ati- vidade agonista" se relacione com uma molécula de ligação que não aumenta significativamente a atividade de sinalização dependente do alvo na ausência e/ou presença do alvo em um ensaio à base de célu- las, tal como no caso de IL-18, não aumenta significativamente a ativi- dade de sinalização dependente de |L-18 na ausência e/ou presença de IL-18 em um ensaio de produção de IFN-y em células do sangue humanas. Tais ensaios são descritos em mais detalhe nos exemplos abaixo.

[0087] É pretendido que o termo "Kassoc" ou "Ka", como usado aqui, se relacione com a velocidade de associação de uma interação molé- cula de ligação-antígeno particular, ao passo que é pretendido que o termo "Kais' ou "Ka," como usado aqui, se relacione com a velocidade de dissociação de uma interação molécula de ligação-antígeno particu- lar. É pretendido que o termo "Kp", como usado aqui, se relacione com a constante de dissociação, que é obtida da razão de Ka com Ka (isto é, Ka/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de Kp para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar a Ko de um anticorpo consiste em usar ressonância de plásmons de superfície, tal como um sistema BiacoreO.

[0088] Como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se à força da interação entre molécula de ligação e antígeno em sítios antigênicos únicos.

[0089] Como usado aqui, o termo "afinidade elevada" para um an- ticorpo refere-se a um anticorpo tendo uma KD de 1 nM ou menos pa- ra um antígeno-alvo.

[0090] Como usado aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não humano.

[0091] O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, rép-

teis, etc.

[0092] Como aqui usado, o termo "sequência de nucleotídeos oti- mizada" significa que a sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos usando códons que são pre- ferenciais na célula ou organismo produtor, de modo geral uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia pastoris, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é manipulada para manter completamente a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência de nucleotídeos de partida, que também é conhecida como sequência "paterna". As sequências otimizadas aqui foram manipuladas de modo a terem códons que são preferenciais em células CHO de mamífero; no entanto, também é contemplada aqui expressão otimizada destas sequências noutras células eucarióticas.

[0093] O termo "identidade" refere-se à similaridade entre pelo menos duas sequências diferentes. Esta identidade pode ser expressa como percentagem de identidade e determinada por algoritmos de ali- nhamento padrão, por exemplo, o Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altshul et a/., (1990) J Mol Biol; 215:403-410); o algoritmo de Needle- man et al., (1970) J Mol Biol; 48:444-453, ou o algoritmo de Meyers et al., (1988) Comput Appl Biosci; 4:11-17). Um conjunto de parâmetros pode ser a matriz de pontuação Blosum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4 e uma pe- nalidade de lacuna de alteração de matriz de leitura de 5. A percenta- gem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotí- deos pode ser também determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (1989) CABIOS, 4: 1-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de pesos PAM 120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penali- dade de lacuna de 4. A percentagem de identidade é habitualmente calculada comparando sequências de comprimento similar.

[0094] O termo "resposta imune" refere-se à ação, por exemplo, de linfócitos, células apresentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células aci- ma ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em danos seletivos, destruição ou eliminação do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou, em casos de autoimunidade ou inflamação pa- tológica, células ou tecidos humanos normais.

[0095] Uma "via de transdução do sinal" ou "atividade de sinaliza- ção" refere-se a uma relação bioquímica causal geralmente iniciada por uma interação proteína-proteína, como ligação de um fator de crescimento a um receptor, resultando em transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Em geral, a transmissão envolve fosforilação específica de um ou mais resíduos tirosina, serina ou treonina em uma ou mais proteínas na série de rea- ções causando transdução do sinal. Penúltimos processos incluem tipicamente eventos nucleares, resultando em uma alteração da ex- pressão genética.

[0096] O termo "neutraliza" e suas variações gramaticais significa, ao longo deste relatório descritivo, que a atividade biológica do alvo é reduzida, total ou parcialmente, na presença da proteína de ligação ou anticorpo, consoante o caso.

[0097] O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” refere-se ao ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) e seus polímeros em forma de fita simples ou dupla. A menos que especifi- camente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análo- gos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de |i- gação similares às do ácido nucleico de referência e são metaboliza- dos de uma maneira similar a nucleotídeos de ocorrência natural. À menos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente suas variantes conservati- vamente modificadas (por exemplo, substituições de códons degene- rados), alelos, ortólogos, SNP e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, podem ser obtidas substituições de códons degenerados gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou to- dos) é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[0098] O nucleotídeo no "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" pode compreender modificações incluindo modificações de bases como de- rivados bromouridina e inosina, modificação de ribose como fosforotio- ato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoani- lotioato, fosforaniladato e fosforoamidato.

[0099] O termo "vetor" significa qualquer molécula ou entidade (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo, bacteriófago ou vírus) que é adequada para transformação ou transfecção de uma célula hospedei- ra e contém sequências de ácidos nucleicos que dirigem e/ou contro- lam (em conjunção com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões codificadoras heterólogas operavelmente ligadas àque- las.

[00100] O termo "coexpressão" significa que diferentes polipeptí- deos são expressos em conjunto em uma única célula hospedeira, comum para todos os polipeptídeos. Coexpressão de um anticorpo biespecífico significa que as diferentes partes formando o anticorpo biespecífico funcional são expressas em uma única célula hospedeira comum. A coexpressão pode ser alcançada incorporando vários veto- res de expressão na célula hospedeira de expressão, tal como um pa-

ra cada uma das metades de um anticorpo biespeciífico, ou incorpo- rando um vetor de expressão codificando todas as partes do anticorpo biespeciífico.

[00101] O termo "emparelhamento defeituoso" significa que diferen- tes partes de um complexo proteico pretendido, tal como um anticorpo biespecífico, não se ligam de modo complexo como pretendido, o que significa que o complexo proteico não aparenta ou não se comporta como pretendido. Exemplos de emparelhamento defeituoso no contex- to de um anticorpo biespecífico são mostrados na Figura 4.

[00102] Uma "variante conservativa" de uma sequência codificando uma molécula de ligação, um anticorpo ou seu fragmento refere-se a uma sequência compreendendo modificações conservativas de ami- noácidos. É pretendido que "modificações conservativas de aminoáci- dos" se relacione com modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticor- po contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conser- vativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos são tais que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma ca- deia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, argini- na, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, gli- cina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, tripto- fano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leuci- na, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias late- rais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidi- na). Podem ser introduzidas modificações em uma proteína de ligação da invenção por técnicas comuns conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Substi- tuição conservativa de aminoácidos também pode abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural que são tipicamente incor- porados por síntese química de peptídeos em vez de por síntese em sistemas biológicos. Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas sem limitação, peptideomiméticos, formas reversas ou invertidas de frações de aminoácidos.

[00103] O termo "epítopo" é a parte de um antígeno que é reconhe- cida pelo sistema imune, tal como um anticorpo ou seu fragmento. No presente relatório descritivo, o termo "epítopo" é usado alternadamente para epítopos conformacionais e epítopos lineares. Um epítopo con- formacional é composto por seções descontínuas da sequência de aminoácidos do antígeno, ao passo que um epítopo linear é formado por uma sequência contínua de aminoácidos do antígeno.

[00104] O termo "tratar", "tratando", "tratamento", "prevenir", "pre- venindo" ou "prevenção" inclui tratamentos terapêuticos, tratamentos profiláticos e aplicações nas quais se reduz o risco de um sujeito vir a desenvolver um distúrbio ou outro fator de risco. Tratamento não re- quer a cura completa de um distúrbio e abrange a redução dos sinto- mas ou fatores de risco subjacentes. Como usado aqui, um anticorpo humano ou seu fragmento compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves completas que são "o produto de" ou "derivadas de" uma sequência da linha germinativa par- ticular se as regiões variáveis ou cadeias completas do anticorpo fo- rem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulinas da linha germinativa humana. Tais sistemas incluem a imunização de um ca- mundongo transgênico transportando genes de imunoglobulina huma- na com o antígeno de interesse ou o rastreamento de uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana apresentada em fago com o an-

tígeno de interesse.

Um anticorpo humano ou seu fragmento que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina da li- nha germinativa humana pode ser identificado como tal por compara- ção da sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as se- quências de aminoácidos de imunoglobulinas da linha germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina da linha germinati- va humana cuja sequência é mais próxima (isto é, maior % de identi- dade) da sequência do anticorpo humano.

Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana particular pode conter diferenças de amino- ácidos, em comparação com a sequência da linha germinativa, devido, por exemplo, a mutações somáticas de ocorrência natural ou introdu- ção intencional de mutação dirigida a sítios.

No entanto, um anticorpo humano selecionado tem uma sequência de aminoácidos que é tipi- camente pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina da linha germinativa huma- na e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo hu- mano como sendo humano em comparação com as sequências de aminoácidos de imunoglobulinas da linha germinativa de outras espé- cies (por exemplo, sequências da linha germinativa murina). Em certos casos, a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou, pelo menos, 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoá- cidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa.

Ti- picamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência da linha germinativa humana particular exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa humana.

Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5 ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa.

[00105] — Anticorpos humanos podem ser produzidos por alguns mé- todos conhecidos dos peritos na técnica. Anticorpos humanos podem ser preparados pelo método de hibridoma usando linhagens de células de mieloma humano ou heteromieloma camundongo-humano (Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, "Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications", pp 51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fagos ou camundongos transgênicos, ambos os quais utilizam repertórios de regiões variáveis humanas (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:11-23).

[00106] Estão agora disponíveis várias estirpes de camundongos transgênicos nas quais seus /oci de imunoglobulina de camundongo foram substituídos por segmentos de genes de imunoglobulinas hu- manas (Tomizuka K, (2000) Proc Natl Acad Sci, 97:722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol 14:845-851; Mendez MJ, (1997) Nature Genetics 15:146-156). Por provocação com antígeno, tais camundon- gos são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos a partir do qual podem ser selecionados anticorpos de interesse. De no- ta particular é o sistema Trimera!Y (Eren R et a/, (1988) Immunology 93:154-161) no qual linfócitos humanos são transplantados para ca- mundongos irradiados, o Sistema Selected Lymphocyte Isolated Anti- body (SLAM, Babcook et al, Proc Natl Acad Sci (1996) 93:7843-7848) no qual linfócitos humanos (ou de outra espécie) são efetivamente submetidos a um procedimento massivo de geração de anticorpos iso- lados in vitro reunidos seguido de procedimento de diluição limitante com deconvolução e seleção, e o Xenomouse"“ (Abgenix Inc). Uma abordagem alternativa é disponibilizada pela Morphotek Inc usando a tecnologia Morphodoma”Y,

[00107] A tecnologia de apresentação em fagos pode ser usada pa- ra produzir anticorpos humanos e seus fragmentos (McCafferty; (1990) Nature, 348:552-553 e Griffiths AD et a/ (1994) EMBO 13:3245-3260). De acordo com esta técnica, genes de domínios variáveis de anticor- pos isolados são clonados na estrutura em um revestimento grande ou pequeno de gene de proteína de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e apresentados (habitualmente com o auxílio de um fago auxiliador) como fragmentos de anticorpo isolado funcionais na super- fície da partícula de fago. Seleções baseadas nas propriedades funci- onais do anticorpo isolado resultam na seleção do gene codificando o anticorpo isolado exibindo estas propriedades. A técnica de apresen- tação em fagos pode ser usada para selecionar anticorpos específicos para antígenos a partir de bibliotecas preparadas a partir de células B humanas recolhidas de indivíduos afligidos com uma doença ou dis- túrbio, ou alternativamente, de doadores humanos não imunizados (Marks; J Mol Bio (1991) 222:581-591). Quando for desejado um anti- corpo isolado humano intato compreendendo um domínio Fc, é neces- sário clonar novamente o fragmento derivado apresentado em fagos em vetores de expressão de mamífero compreendendo as regiões constantes desejadas e estabelecer linhagens de células com expres- são estável.

[00108] A técnica de maturação da afinidade (Marks; Biotechnol (1992) 10:779-783) pode ser usada para proporcionar afinidade de li- gação, em que a afinidade do anticorpo isolado humano primário é melhorada por substituição sequencial das regiões variáveis de cadeia H e L por variantes de ocorrência natural e seleção com base em afi- nidades de ligação melhoradas. Variantes desta técnica, como “im- pressão de epítopos', também estão agora disponíveis (WO 93/06213; Waterhouse; Nucl Acids Res (1993) 21:2265-2266).

[00109] O termo "puro", quando usado no contexto de anticorpo bi-

específico purificado, refere-se à pureza e identidade de diferentes combinações e construtos de anticorpos biespecíficos após coexpres- são em células selecionadas sob condições em que as células expres- sam o anticorpo biespecífico e após purificação com proteína A usan- do uma abordagem de rastreio de massa intata por UPLC-MS. Puro ou pureza refere-se à quantidade relativa dos bbmAbs hetero- e homodi- méricos formados. Usando o método da invenção é possível observar bbmAb1 e bbmAb2 heterodiméricos corretamente formados com uma pureza relativa maior do que 85% com base na intensidade do sinal de massa intata.

2. Anticorpo contra |L-18

[00110] Anticorpos contra IL-18 particularmente preferenciais ou seus fragmentos de ligação a antígeno usados nos métodos revelados são anticorpos humanos.

[00111] Para facilidade de referência, as sequências de aminoáci- dos das regiões hipervariáveis de um anticorpo contra IL-18 específi- co, denominado mAb1, com base na definição de Kabat e na definição de Chothia, bem como os domínios V. e Vu e cadeias pesadas e leves completas são proporcionadas na Tabela 1, abaixo. Tabela 1. Sequências de aminoácidos das regiões hipervariáveis (CDR), domínios variáveis (VH e VL) e cadeias completas de mAb1. O DNA codificando o VL de mAb1 é apresentado em SEQ ID NO:18. O DNA codificando o VH de mAb1 é apresentado em SEQ ID NO:8. [TE ses

[00112] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio va- riável de cadeia pesada (Vx) de imunoglobulina compreendendo regi- ões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:1, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:2 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, o anti- corpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreen- de pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (Vn) de imuno- globulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6.

[00113] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio va- riável de cadeia leve (V.) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:11, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:12 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:13. Em uma modalidade, o anti- corpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreen-

de pelo menos um domínio variável de cadeia leve (V.) de imunoglo- bulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:14, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:15e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:16.

[00114] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio Vn de imunoglobulina e pelo menos um domínio V. de imunoglobulina, em que: a) o domínio Vx de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:2 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:3, ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO4, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:5 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:6 e b) o domínio V. de imunoglo- bulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariá- veis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:11, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:12 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:13 ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:14, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:15 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:16.

[00115] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada (Vn) de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:7; b) um domínio variável de cadeia leve (V.) de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:17; c) um domínio Vu de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresen- tada como SEQ ID NO:7 e um domínio V. de imunoglobulina compre- endendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:17; d) um domínio Vu de imunoglobulina compreendendo as regi- ões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3; e) um domínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13; f) um domínio Vu de imunoglobulina compre- endendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6; g) um domínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16; h) um domínio Vx de imuno- globulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas co- mo SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 e um domínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresenta- das como SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13; i) um do- mínio Vu de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6 e um domínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariá- veis apresentadas como SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16; j) uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:19; k) uma ca- deia pesada compreendendo SEQ ID NO:9, ou |) uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:19 e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:9.

[00116] Em algumas modalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb1) compreende as três CDR de SEQ ID NO:7. Em outras modalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três

CDR de SEQ ID NO:17. Em outras modalidades, o anticorpo contra IL- 18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:7 e as três CDR de SEQ ID NO:17. Em algumas moda- lidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antí- geno compreende as três CDR de SEQ ID NO:9. Em outras modalida- des, anticorpo contra I1L-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:19. Em outras modalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno com- preende as três CDR de SEQ ID NO:9 e as três CDR de SEQ ID NO:19.

[00117] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb1) é selecionado de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compre- ende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu frag- mento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:1, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:2 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:3 e b) uma cadeia leve de imuno- globulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:11, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:12 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:13.

[00118] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb1) é selecionado de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a)

uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compre- ende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu frag- mento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO4, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:5 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:6 e b) uma cadeia leve de imuno- globulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:14, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:15 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:16.

[00119] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno é selecionado de um anticorpo de cadeia simples ou seu fragmento de ligação a antígeno que compreende um sítio de ligação a antígeno compreendendo: a) um primeiro domínio compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:? e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:3 e b) um segundo domínio compreendendo, na sequên- cia, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:11, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:12 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:13 e c) um ligante pep- tídico que é ligado à extremidade N-terminal do primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo domínio, ou à extremidade C- terminal do primeiro domínio e à extremidade N-terminal do segundo domínio.

[00120] Em uma modalidade, o anticorpo contra I1L-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb1) é selecionado de um anticorpo de cadeia simples ou seu fragmento de ligação a antíge- no que compreende um sítio de ligação a antígeno compreendendo: a) um primeiro domínio compreendendo, na sequência, as regiões hiper- variáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6 e b) um segundo domínio compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a refe- rida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:14, a referi- da CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:15 e a referi- da CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:16 e c) um ligante peptídico que é ligado à extremidade N-terminal do primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo domínio, ou à extre- midade C-terminal do primeiro domínio e à extremidade N-terminal do segundo domínio.

[00121] O domínio Vi ou Vi. de um anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno usado nos métodos revelados pode ter domínios Vy e/ou V. que são substancialmente idênticos aos domí- nios Vx ou V. apresentados em SEQ ID NO:7 e 17. Um anticorpo con- tra IL-18 humano revelado aqui pode compreender uma cadeia pesada que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:9 e/ou uma cadeia leve que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:19. Um anticorpo contra IL-18 humano revelado aqui pode compreender uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:9 e uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO:19. Um anticorpo con- tra IL-18 humano revelado aqui pode compreender: a) uma cadeia pe- sada, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:7 e a parte constante de uma cadeia pesada humana e b) uma cadeia le- ve, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:17 e a parte constante de uma cadeia leve humana.

[00122] Outros antagonistas de IL-18 preferenciais (por exemplo, anticorpos) para uso nos métodos, kits e regimes revelados são aque- les apresentados na Patente US No: 9.376.489, que é incorporada a título de referência aqui na sua totalidade.

3. Anticorpo contra IL-16 Anticorpos contra IL-168 particularmente preferenciais ou seus fragmen- tos de ligação a antígeno usados nos métodos revelados são anticor- pos humanos.

[00123] Para facilidade de referência, as sequências de aminoáci- dos das regiões hipervariáveis de um anticorpo contra IL-13B especiífi- co, denominado mAb2, com base na definição de Kabat e na definição de Chothia, bem como os domínios V. e Vu e cadeias pesadas e leves completas são proporcionadas na Tabela 2, abaixo. Tabela 2. Sequências de aminoácidos das regiões hipervariáveis (CDR), domínios variáveis (VH e VL) e cadeias completas de mAb2. O DNA codificando o VL de mAb2 é apresentado em SEQ ID NO:38. O DNA codificando o VH de mAb?2 é apresentado em SEQ ID NO:27.

Cadeia pesada de mAb2 CDR1 Kabat SEQ ID NO0:21 o [Chothia —[SEQIDNOX CDR2 Kabat SEQ ID NO:22 o [Chothia —[SEQIDNO25 CDR3 Kabat SEQ ID NO:23 E [Chothia —[SEQIDNO26 SEQ ID NO:27 Cadeia Pesada SEQ ID NO:29 Cadeia leve de mAb2 CDR1 Kabat SEQ ID NO:31 E [Chothia — [SEQIDNOSA CDR2 SEQ ID NO:32 o [Chothia [SEQIDNOSS =| | Cadeia Leve /SEQIDNOS9 =|

[00124] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio va- riável de cadeia pesada (Vr) de imunoglobulina compreendendo regi- ões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:21, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:22 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:23. Em uma modalidade, o anti- corpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreen- de pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (Vx) de imuno- globulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1I, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:24, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:25 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:26.

[00125] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio va- riável de cadeia leve (V.) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:31, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:32 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:33. Em uma modalidade, o anti- corpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreen- de pelo menos um domínio variável de cadeia leve (V.) de imunoglo- bulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:34, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:35 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:36.

[00126] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende pelo menos um domínio Vn de imunoglobulina e pelo menos um domínio V. de imunoglobulina, em que: a) o domínio Vx de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:21, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:22 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:23, ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:24, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:25 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:26 e b) o domínio V. de imuno- globulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hiperva- riáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:31, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:32 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:33 ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:34, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:35 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:36.

[00127] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada (Vn) de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:27; b) um domínio variá- vel de cadeia leve (V.) de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:37; c) um domínio Vn de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apre- sentada como SEQ ID NO:27 e um domínio V. de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:37; d) um domínio Vu de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23; e) um domínio V. de imunoglobulina compre- endendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33; f) um domínio Vu de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26; g) um domínio V. de imuno- globulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas co- mo SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36; h) um domínio Vu de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresen- tadas como SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23 e um do- mínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33; i) um domínio Vx de imunoglobulina compreendendo as regiões hiperva- riáveis apresentadas como SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26 e um domínio V. de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36; j) uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:37; k) uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:29, ou |) uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:39 e uma cadeia pesada compreen- dendo SEQ ID NO:29.

[00128] Em algumas modalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb2) compreende as três CDR de SEQ ID NO:37. Em outras modalidades, o anticorpo con- tra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:27. Em outras modalidades, o anticorpo contra IL- 1B ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:37 e as três CDR de SEQ ID NO:27. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a an-

tígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:39. Em outras modali- dades, anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDR de SEQ ID NO:29. Em outras modalidades, o anticorpo contra IL-18 ou seu fragmento de ligação a antígeno com- preende as três CDR de SEQ ID NO:39 e as três CDR de SEQ ID NO:29.

[00129] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb2) é selecionado de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compre- ende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu frag- mento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:21, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:22 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:23 e b) uma cadeia leve de imu- noglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:31, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:32 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:33.

[00130] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb2) é selecionado de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compre- ende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu frag- mento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a se-

quência de aminoácidos SEQ ID NO:24, a referida CDR2 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:25 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:26 e b) uma cadeia leve de imu- noglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:34, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:35 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:36.

[00131] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno é selecionado de um anticorpo de cadeia simples ou seu fragmento de ligação a antígeno que compreende um sítio de ligação a antígeno compreendendo: a) um primeiro domínio compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:21, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:22 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:23 e b) um segundo domínio compreendendo, na sequên- cia, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:31, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:32 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:33 e c) um ligante pep- tídico que é ligado à extremidade N-terminal do primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo domínio, ou à extremidade C- terminal do primeiro domínio e à extremidade N-terminal do segundo domínio.

[00132] Em uma modalidade, o anticorpo contra IL-18 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (por exemplo, mAb2) é selecionado de um anticorpo de cadeia simples ou seu fragmento de ligação a antíge-

no que compreende um sítio de ligação a antígeno compreendendo: a) um primeiro domínio compreendendo, na sequência, as regiões hiper- variáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:24, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:25 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:26 e b) um segundo domínio compreenden- do, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:34, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:35 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:36 e c) um ligante peptídico que é ligado à extremidade N-terminal do primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo domínio, ou à extre- midade C-terminal do primeiro domínio e à extremidade N-terminal do segundo domínio.

[00133] O domínio Vi ou Vi de um anticorpo contra IL-18B ou seu fragmento de ligação a antígeno usado nos métodos revelados pode ter domínios Vu e/ou V. que são substancialmente idênticos aos domí- nios Vu ou VL apresentados em SEQ ID NO:27 e 37. Um anticorpo contra IL-18 humano revelado aqui pode compreender uma cadeia pe- sada que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:29 e/ou uma cadeia leve que é substancialmente idêntica à apre- sentada como SEQ ID NO:39. Um anticorpo contra IL-18 humano re- velado aqui pode compreender uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:29 e uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO:39. Um anticorpo contra IL-18 humano revelado aqui pode compreender: a) uma cadeia pesada, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:27 e a parte constante de uma cadeia pesada humana e b) uma cadeia leve, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em

SEQ ID NO:37 e a parte constante de uma cadeia leve humana.

[00134] Outros antagonistas de IL-1B preferenciais (por exemplo, anticorpos) para uso nos métodos, kits e regimes revelados são aque- les apresentados nas Patentes US Nos: 7,446,175 ou 7,993,878 ou 8,273,350, que são incorporadas a título de referência aqui na sua to- talidade.

4. Modificações em Fc

[00135] Adicional ou alternativamente a modificações efetuadas nas regiões de arcabouço ou CDR, anticorpos da invenção podem ser ma- nipulados para incluir modificações na região Fc, tipicamente para alte- rar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia- vida no soro, fixação do complemento, ligação a receptores de Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígenos. Além disso, um anti- corpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais frações químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar a sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas mo- dalidades é descrita em maior detalhe abaixo. A numeração de resí- duos na região Fc é a do esquema de numeração EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85 .

[00136] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modi- ficada de modo que o número de resíduos cisteína na região de do- bradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente U.S. N.º 5.677.425 de Bodmer et al. O número de resíduos cisteína na região de dobradi- ça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das ca- deias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00137] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anti- corpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introdu- zidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc, de modo que o anticorpo tenha ligação comprometida de proteína Estafilocócica A (SpA) em relação à ligação de SpA ao domínio de dobradiça Fc nativo. Esta abordagem é descrita em maior detalhe na Patente U.S. N.º 6.165.745 de Ward et al.

[00138] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para au- mentar a sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais das seguintes mu- tações: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. N.º

6.277.375 de Ward. Em alternativa, para aumentar a meia-vida bioló- gica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de uma IgG, con- forme descrito nas Patentes U.S. N.º* 5.869.046 e 6.121.022 de Presta etal.

[00139] Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada subs- tituindo pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de ami- noácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um re- síduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação a antígeno do anticorpo paterno. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes U.S. N.º* 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.

[00140] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos seleciona- dos de resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um resí- duo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha ligação a

C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou abolida. Esta abordagem é descrita em maior detalhe na Patente U.S. N.º 6.194.551 de Idusogie et al.

[00141] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para alterarem assim a capacidade do anticorpo de fixar o complemento. Esta abordagem é adicionalmente descrita na publi- cação PCT WO 94/29351 de Bodmer et a/.

[00142] Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celu- lar dependente de anticorpos (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor de Fcy por modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para FcyRI, FeyRIl, FeyRIlIl e FcRn foram mapeados e variantes com ligação intensificada foram descritas (ver Shields, R.L. et al, (2001) J Biol Chem 276:6591-6604).

[00143] Em certas modalidades, o domínio Fc do isótipo I9G1 é usado. Em algumas modalidades específicas, uma variante mutante do fragmento Fc de IgG1 é usada, por exemplo, um Fc de IgG1 silen- cioso que reduz ou elimina a capacidade do polipeptídeo de fusão pa- ra mediar citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e/ou para se ligar a um receptor de Fcy. Um exemplo de um mutante silencioso do isótipo I9G1 no qual um resíduo Leucina é substituído por um resíduo Alanina nas posições de aminoácidos 234 e 235 como descrito por Hezareh et al, J. Virol (2001); 75(24):12161-8.

[00144] Em certas modalidades, o domínio Fc é um mutante preve- nindo a glicosilação na posição 297 do domínio Fc. Por exemplo, o domínio Fc contém uma substituição de aminoácidos de resíduo aspa- ragina na posição 297. Um exemplo de tal substituição de aminoácidos é a substituição de N297 por uma glicina ou uma alanina.

[00145] Funções efetoras silenciadas podem ser obtidas por muta- ção na região Fc dos anticorpos e foram descritas na técnica: LALA e N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691) e D265A (Baudino et a/., 2008, J. Immunol. 181:6664-69; Strohl, W., su- pra) e DAPA (D265A e P329A) (Shields RL, J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604; Publicação de Patente U.S. US2015/0320880). Exemplos de anticorpos Fc de IgG1 silenciosos compreendem o de- nominado mutante LALA compreendendo a mutação L234A e L235A na sequência de aminoácidos de Fc de IgG1. Outro exemplo de um anticorpo IgG1 silencioso compreende a mutação D265A. Outro exemplo de um anticorpo IgG1 silencioso é o denominado mutante DAPA, compreendendo mutações D265A e P329A na sequência de aminoácidos de Fc de IgG1. Outro anticorpo I9G1 silencioso compre- ende a mutação N297A, que resulta em anticorpos aglicosilados/não glicosilados. Mutações adicionais em Fc para proporcionar função efe- tora silenciada são descritos na publicação PCT no. WO2014/145806 (por exemplo, na Figura 7 de WO2014/145806), aqui incorporada a título de referência na sua totalidade. Um exemplo de WO2014/145806 de um anticorpo IgG1 silencioso compreende uma mutação E233P, L234V, L235A e S267K e uma deleção de G236 (G236del). Outro exemplo de WOZ2014/145806 de um anticorpo IgG1 silencioso com- preende uma mutação E233P, L234V e L235A e uma deleção de G236 (G236del). Outro exemplo de WO2014/145806 de um anticorpo IgG1 silencioso compreende uma mutação S267K.

[00146] Ainda em outra modalidade, é modificada a glicosilação de um anticorpo. Por exemplo, pode ser preparado um anticorpo aglicosi- lado (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pa- ra o antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser alcança- das, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser efetuadas uma ou mais substituições de aminoácidos que resultem na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de arcabouço de região variável para eliminar assim a glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes U.S. N.ºº 5.714.350 e

6.350.861 de Co et al.

[00147] — Adicionalmente ou alternativamente, pode ser produzido um anticorpo que possua um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bisseção aumen- tadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser alcançadas, por exemplo, por expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Célu- las com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais são expres- sos anticorpos recombinantes da invenção para produzir assim um an- ticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 de Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcional- mente desfeito, o qual codifica uma fucosil transferase, de tal modo que anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofucosila- ção. Em consequência, em uma modalidade, os anticorpos da inven- ção são produzidos por expressão recombinante em uma linhagem de células que exibe padrão de hipofucosilação, por exemplo, uma linha- gem de células de mamífero com expressão deficiente do gene FUT8 codificando fucosiltransferase. A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma variante da linhagem celular CHO, células Lecl3, com capacidade reduzida para ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), resultando também em hipofucosilação de anticorpos ex-

pressos nessa célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al., (2002) Jy. Biol. Chem. 277:2.6733 a 2.6740). A Publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. descreve linhagens celulares manipuladas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIII)) de modo que anticorpos expressos nas linhagens celulares manipuladas exibem estruturas GlcNac de bisseção aumentadas que resultam em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (ver também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser produzidos em uma levedura ou um fungo fila- mentoso manipulado para um padrão de glicosilação do tipo mamífero e capaz de produzir anticorpos sem fucose como padrão de glicosila- ção (ver, por exemplo, EP1297172B1).

[00148] Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pela invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, no soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo ou seu fragmen- to reage tipicamente com polietilenoglicol (PEG), tal como um derivado éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. À peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma re- ação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um políme- ro análogo reativo solúvel em água). Como aqui utilizado, o termo "po- lietilenoglicol" pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como mo- no(C1-C10)alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol ou polietilenoglicol- maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos de peguilação de proteínas são co- nhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da inven- ção. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimura et a/. e EP 0 401

384 de Ishikawa et al.

[00149] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela invenção é um conjugado ou uma proteína de fusão de pelo menos a região de ligação a antígeno do anticorpo da invenção a proteína do soro, tal como albumina do soro humano ou um seu fragmento, para aumentar a meia-vida da molécula resultante. Tal abordagem é descri- ta, por exemplo, em Ballance et a/. EPO322094.

[00150] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela invenção consiste em uma ou mais modificações para aumentar a formação de um anticorpo biespecífico heterodimérico. Pode ser usa- da uma variedade de abordagens disponíveis na técnica para aumen- tar a dimerização dos dois domínios de cadeia pesada de anticorpos biespecíficos, por exemplo, bbpmAbs, como revelado, por exemplo, em EP 1870459A1; Pat. U.S. N.º 5.582.996; Pat. U.S. N.º 5.731.168; Pat. U.S. N.º 5.910.573; Pat. U.S. N.º 5.932.448; Pat. U.S. N.º 6.833.441; Pat. U.S. N.º 7.183.076; Publicação de Pedido de Patente U.S. N.º 2006204493A1; e Publicação PCT N.º WO2009/089004A1, cujo con- teúdo é incorporado aqui na sua totalidade.

[00151] A geração de anticorpos biespecíficos usando nós em bu- racos é revelada, por exemplo, na Publicação PCT Nº WO1996/027011, Ridgway et a/., (1996) e Merchant et a/. (1998). (1) Nó no Buraco (KIH

[00152] Moléculas multiespecíficas, por exemplo, moléculas de an- ticorpos ou tipo anticorpos multiespecíficas, da presente invenção po- dem compreender uma ou mais, por exemplo, uma pluralidade de, mu- tações em um ou mais dos domínios constantes, por exemplo, nos domínios CH3. Em um exemplo, a molécula multiespecífica da presen- te invenção compreende dois polipeptídeos que compreendem, cada um, um domínio constante de cadeia pesada de um anticorpo, por exemplo, um domínio CH2 ou CH3. Em um exemplo, os dois domínios constantes de cadeia pesada, por exemplo, os domínios CH2 ou CH3, da molécula multiespecífica compreendem uma ou mais mutações que permitem uma associação heterodimérica entre as duas cadeias.

Em um aspecto, a uma ou mais mutações são dispostas no domínio CH2 das duas cadeias pesadas da molécula de anticorpo ou tipo anticorpo multiespecífica, por exemplo, biespecífica.

Em um aspecto, a uma ou mais mutações são dispostas nos domínios CH3 de pelo menos dois polipeptídeos da molécula multiespecífica.

Em um aspecto, a uma ou mais mutações em um primeiro polipeptídeo da molécula multiespecí- fica compreendendo um domínio constante de cadeia pesada criam um "nó" e a uma ou mais mutações em um segundo polipeptídeo da molécula multiespecífica compreendendo um domínio constante de cadeia pesada criam um "buraco", de modo que a heterodimerização do polipeptídeo da molécula multiespecífica compreendendo um do- mínio constante de cadeia pesada faz com que o "nó" estabeleça a interface (por exemplo, interaja, por exemplo, um domínio CH2 de um primeiro polipeptídeo interagindo com um domínio CH2 de um segun- do polipeptídeo, ou um domínio CH3 de um primeiro polipeptídeo inte- ragindo com um domínio CH3 de um segundo polipeptídeo) com o "bu- raco." Tal como o termo é usado aqui, um "nó" refere-se a pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido que se projeta da interface de um primeiro polipeptídeo da molécula multiespecífica compreendendo um domínio constante de cadeia pesada e pode, portanto, ser posicionado em um "buraco" compensador na interface com um segundo polipeptí- deo da molécula multiespecífica compreendendo um domínio constan- te de cadeia pesada de modo a estabilizar o heteromultímero e desse modo favorecer a formação de heteromultímero relativamente à for- mação de homomultímero, por exemplo.

O nó pode existir na interface original ou pode ser introduzido de modo sintético (por exemplo, por alteração do ácido nucleico codificando a interface). Os resíduos im-

portados preferenciais para a formação de um nó são geralmente resí- duos de aminoácidos de ocorrência natural e são preferencialmente selecionados de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). Os mais preferenciais são triptofano e tirosina. Na modalidade preferencial, o resíduo original para a formação da protuberância tem um volume pequeno da cadeia lateral, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina.

[00153] Um "buraco" refere-se a pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido que forma uma recessão na interface de um segundo poli- peptídeo da molécula multiespecífica compreendendo um domínio constante de cadeia pesada e, portanto, acomoda um nó correspon- dente na superfície de interface adjacente de um primeiro polipeptídeo da molécula multiespecífica compreendendo um domínio constante de cadeia pesada. O buraco pode existir na interface original ou pode ser introduzido de modo sintético (por exemplo, por alteração do ácido nu- cleico codificando a interface). Os resíduos importados preferenciais para a formação de um buraco são habitualmente resíduos de amino- ácidos de ocorrência natural e são preferencialmente selecionados de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). Os mais preferenciais são serina, alanina ou treonina. Na modalidade preferencial, o resíduo original para a formação do buraco tem um volume grande da cadeia lateral, tal como tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.

[00154] Em uma modalidade preferencial, um primeiro domínio CH3 é mutado no resíduo 366, 405 ou 407 de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et a/., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, para criar um "nó" ou um "buraco" (como descrito acima) e o segundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 é muta- do em: resíduo 407 se o resíduo 366 for mutado no primeiro domínio CH3, resíduo 349 se o resíduo 405 for mutado no primeiro domínio CH3 ou resíduo 366 se o resíduo 407 for mutado no primeiro domínio

CH3, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, para criar um "buraco" ou "nó" complementar ao "nó" ou "buraco" do primeiro domínio CH3.

[00155] Em outra modalidade preferencial, um primeiro domínio CH3 é mutado no resíduo 366 de acordo com o esquema de numera- ção EU de Edelman et a/., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85 para criar um "nó" ou um "buraco" (como descrito acima) e o segundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 é mutado nos resíduos 366, 368 e/ou 407, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, para criar um "buraco" ou "nó" complementar ao "nó" ou "buraco" do primeiro domí- nio CH3. Em uma modalidade, a mutação no primeiro domínio CH3 introduz um resíduo tirosina (Y) na posição 366. Em uma modalidade, a mutação no primeiro CH3 é T366Y. Em uma modalidade, a mutação no primeiro domínio CH3 introduz um resíduo triptofano (W) na posi- ção 366. Em uma modalidade, a mutação no primeiro CH3 é T366W. Em modalidades, a mutação no segundo domínio CH3 que heterodi- meriza com o primeiro domínio CH3 mutado na posição 366 (por exemplo, tem uma tirosina (Y) ou triptofano (W) introduzido na posição 366, por exemplo, compreende a mutação T366Y ou T366W), com- preende uma mutação na posição 366, uma mutação na posição 368 e uma mutação na posição 407, de acordo com o esquema de numera- ção EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85. Em mo- dalidades, a mutação na posição 366 introduz um resíduo serina (S), a mutação na posição 368 introduz uma alanina (A) e a mutação na po- sição 407 introduz uma valina (V). Em modalidades, as mutações compreendem T366S, L368A e Y407V. Em uma modalidade, o primei- ro domínio CH3 da molécula multiespecífica compreende a mutação T366Y e o segundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S, L368A e Y407V ou vice-versa. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 da molécula multiespecífica compreende a mutação T366W e o segundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende as mutações T366S, L368A e Y407V ou vice-versa.

[00156] Mutações estéricas ou "enviesadas" (por exemplo, nó no buraco) adicionais são descritis na publicação PCT no. WO?2014/145806 (por exemplo, Figura 3, Figura 4 e Figura 12 de WO?2014/145806), publicação PCT no. WO2014/110601 e publicação PCT no. WO 2016/086186, WO 2016/086189, WO 2016/086196 e WO 2016/182751, cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade. Um exemplo de uma variante KIH compreende uma primeira cadeia cons- tante compreendendo uma mutação L368D e uma K370S, emparelha- da com uma segunda cadeia constante compreendendo uma mutação S364K e E357Q.

[00157] Pares de mutações nó no buraco adicionais adequadas pa- ra uso em quaisquer das moléculas multiespecíficas da presente inven- ção são adicionalmente descritos, por exemplo, em WO1996/027011 e Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade.

[00158] Em quaisquer das modalidades descritas aqui, os domínios CH3 podem ser adicionalmente mutados para introduzir um par de re- síduos cisteína. Sem ficar restringido pela teoria, se crê que a introdu- ção de um par de resíduos cisteína capazes de formar uma ligação dissulfeto proporciona estabilidade à molécula multiespecífica hetero- dimerizada. Em modalidades, o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 354, de acordo com o esquema de numera- ção EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, e o se- gundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 349, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et al.,, PNAS, maio de 1969, 63(1):78-

85. Em modalidades, o primeiro domínio CH3 da molécula multiespecí- fica compreende uma cisteína na posição 354 (por exemplo, compre- ende a mutação S354C) e uma tirosina (Y) na posição 366 (por exem- plo, compreende a mutação T366Y) e o segundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 349 (por exemplo, compreende a mutação Y349C), uma serina na posição 366 (por exemplo, compreende a mutação T366S), uma alanina na posição 368 (por exemplo, compreende a mutação L368A) e uma valina na posição 407 (por exemplo, compreende a mu- tação Y407V). Em modalidades, o primeiro domínio CH3 da molécula multiespecífica compreende uma cisteína na posição 354 (por exem- plo, compreende a mutação S354C) e um triptofano (W) na posição 366 (por exemplo, compreende a mutação T366W) e o segundo domí- nio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 349 (por exemplo, compreende a mutação Y349C), uma serina na posição 366 (por exemplo, compreende a mu- tação T366S), uma alanina na posição 368 (por exemplo, compreende a mutação L368A) e uma valina na posição 407 (por exemplo, com- preende a mutação Y407V).

(2) Nó e Buraco Alternativo: Heterodimerização de IgG

[00159] Em um aspecto, a heterodimerização das cadeias polipep- tídicas (por exemplo, dos meios anticorpos) da molécula multiespecifi- ca é aumentada por introdução de uma ou mais mutações em um do- mínio CH3 que é derivado da classe de anticorpos I9gG1. Em uma mo- dalidade, as mutações compreendem uma mutação K409R em um domínio CH3 emparelhada com a mutação F405L no segundo domínio CH3, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85. Mutações adicionais podem tam- bém, ou alternativamente, se situar nas posições 366, 368, 370, 399, 405, 407 e 409 de acordo com o esquema de numeração EU de

Edelman et al.,, PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85. Preferencialmente, a heterodimerização de polipeptídeos compreendendo tais mutações é alcançada sob condições redutoras, por exemplo, 2-MEA 10-100 mM (por exemplo, 2-MEA 25, 50 ou 100 mM) durante 1-10, por exemplo, 1,5-5, por exemplo, 5, horas a 25-37 ºC, por exemplo, 25 ºC ou 37 ºC.

[00160] As substituições de aminoácidos descritas aqui são introdu- zidas nos domínios CH3 usando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Normalmente, o DNA codificando a(s) cadeia(s) pesada(s) é geneticamente manipulado usando as técnicas descritas em "Mutage- nesis: a Practical Approach". Mutagênese mediada por oligonucleotí- deos é um método preferencial para preparar variantes de substituição do DNA codificando as duas cadeias pesadas híbridas. Esta técnica é bem conhecida na técnica, como descrito por Adelman et a/., (1983) DNA, 2:183.

[00161] A estratégia de heterodimerização de IgG é descrita, por exemplo, em WO2008/119353, WO2011/131746 e WO2013/060867, cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade.

[00162] Em quaisquer das modalidades descritas aqui, os domínios CH3 podem ser adicionalmente mutados para introduzir um par de re- síduos cisteína. Sem ficar restringido pela teoria, se crê que a introdu- ção de um par de resíduos cisteína capazes de formar uma ligação dissulfeto proporciona estabilidade à molécula multiespecífica hetero- dimerizada. Em modalidades, o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 354, de acordo com o esquema de numera- ção EU de Edelman et al.,, PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, e o se- gundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 349, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et al, PNAS, maio de 1969, 63(1):78-

85.

(3) Ponte Polar

[00163] Em um aspecto, a heterodimerização das cadeias polipep- tídicas (por exemplo, dos meios anticorpos) da molécula multiespecifi- ca é aumentada por introdução de mutações baseadas na fundamen- tação "formação de ponte polar", que consiste em preparar resíduos na interface de ligação das duas cadeias polipeptídicas para interagi- rem com resíduos de propriedade física similar (ou complementar) na configuração de heterodímero, ao passo que com resíduos de proprie- dade física diferente na configuração de homodímero. Em particular, estas mutações são planejadas de modo que, na formação do hetero- dímero, resíduos polares interagem com resíduos polares, ao passo que resíduos hidrofóbicos interagem com resíduos hidrofóbicos. Em contraste, na formação do homodímero, resíduos são mutados de mo- do que resíduos polares interagem com resíduos hidrofóbicos. As inte- rações favoráveis na configuração de heterodímero e as interações desfavoráveis na configuração de homodímero atuam em conjunto pa- ra tornar mais provável que domínios CH3 formem heterodímeros do que formem homodímeros.

[00164] Em uma modalidade exemplificativa, as mutações acima são geradas em uma ou mais posições de resíduos 364, 368, 399, 405, 409 e 411 do domínio CH3, numeração de aminoácidos de acor- do com o esquema de numeração EU de Edelman et al., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85.

[00165] Em um aspecto, uma ou mais mutações selecionadas de um grupo consistindo em: Ser364Leu, Thr366Val, Leu368GIn, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe e Thr411Lys são introduzidas em um dos dois domínios CH3. (Ser364Leu: resíduo original de serina na posição 364 é substituído por leucina; Thr366Val: resíduo original de treonina na posição 366 é substituído por valina; Leu368GIn: resíduo original de leucina na posição 368 é substituído por glutamina;

Asp399Lys: resíduo original ácido aspártico na posição 399 é substitu- ído por lisina; Phe405Ser: resíduo original fenilalanina na posição 405 é substituído por serina; Lys409Phe: resíduo original lisina na posição 409 é substituído por fenilalanina; Thr411Lys: resíduo original de treo- nina na posição 411 é substituído por lisina.)

[00166] Em outro aspecto, o outro CH3 pode ser introduzido com uma ou mais mutações selecionadas de um grupo consistindo em: Tyr407Phe, Lys409GInh e Thr411Asp (Tyr407Phe: resíduo original tiro- sina na posição 407 é substituído por fenilalanina; Lys409Glu: resíduo original lisina na posição 409 é substituído por ácido glutâmico; Thr411Asp: resíduo original de treonina na posição 411 é substituído por ácido aspártico).

[00167] Em um aspecto adicional, um domínio CH3 tem uma ou mais mutações selecionadas de um grupo consistindo em: Ser364Leu, Thr366Val, Leu368GIh, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe e Thr411Lys, ao passo que o outro domínio CH3 tem uma ou mais mu- tações selecionadas de um grupo consistindo em: Tyr407Phe, Lys409GIn e Thr411Asp.

[00168] Em uma modalidade exemplificativa, o resíduo original de treonina na posição 366 de um domínio CH3 é substituído por valina, ao passo que o resíduo original de tirosina na posição 407 do outro domínio CH3 é substituído por fenilalanina.

[00169] Em outra modalidade exemplificativa, o resíduo original de serina na posição 364 de um domínio CH3 é substituído por leucina, ao passo que o resíduo original de leucina na posição 368 do mesmo domínio CH3 é substituído por glutamina.

[00170] Em ainda outra modalidade exemplificativa, o resíduo origi- nal de fenilalanina na posição 405 de um domínio CH3 é substituído por serina e o resíduo original de lisina na posição 409 deste domínio CH3 é substituído por fenilalanina, ao passo que o resíduo original de lisina na posição 409 do outro domínio CH3 é substituído por glutami- na.

[00171] Em ainda outra modalidade exemplificativa, o resíduo origi- nal de ácido aspártico na posição 399 de um domínio CH3 é substituí- do por lisina e o resíduo original de treonina na posição 411 do mesmo domínio CH3 é substituído por lisina, ao passo que o resíduo original de treonina na posição 411 do outro domínio CH3 é substituído por ácido aspártico.

[00172] As substituições de aminoácidos descritas aqui são introdu- zidas nos domínios CH3 usando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Normalmente, o DNA codificando a(s) cadeia(s) pesada(s) é geneticamente manipulado usando as técnicas descritas em "Mutage- nesis: a Practical Approach". Mutagênese mediada por oligonucleotí- deos é um método preferencial para preparar variantes de substituição do DNA codificando as duas cadeias pesadas híbridas. Esta técnica é bem conhecida na técnica, como descrito por Adelman et a/., (1983) DNA, 2:183.

[00173] A estratégia de ponte polar é descrita, por exemplo, em WO2006/106905, WO2009/089004 e K.Gunasekaran, et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285:19637-19646, cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade.

[00174] Mutações adicionais de ponte polar são descritas, por exemplo, na publicação PCT no. WO2014/145806 (por exemplo, Figu- ra 6 de WO2014/145806), publicação PCT no. WO2014/110601 e pu- blicação PCT no. WO 2016/086186, WO 2016/086189, WO 2016/086196 e WO 2016/182751 cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade. Um exemplo de uma variante de ponte polar compre- ende uma cadeia constante compreendendo uma mutação N208D, Q295E, N384D, Q418E e N421D.

[00175] Em quaisquer das modalidades descritas aqui, os domínios

CH3 podem ser adicionalmente mutados para introduzir um par de re- síduos cisteína. Sem ficar restringido pela teoria, se crê que a introdu- ção de um par de resíduos cisteína capazes de formar uma ligação dissulfeto proporciona estabilidade à molécula multiespecífica hetero- dimerizada. Em modalidades, o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 354, de acordo com o esquema de numera- ção EU de Edelman et a/l., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-85, e o se- gundo domínio CH3 que heterodimeriza com o primeiro domínio CH3 compreende uma cisteína na posição 349, de acordo com o esquema de numeração EU de Edelman et a/., PNAS, maio de 1969, 63(1):78-

85.

[00176] Estratégias adicionais para intensificar a heterodimerização são descritas, por exemplo, em WO2016/105450, WO2016/086186, WO?2016/086189, WO2016/086196, WO2016/141378 e WO2014/145806 e WO2014/110601, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é deste modo incorporada a título de referência na sua totalidade. Quaisquer das referidas estratégias podem ser empregues em uma molécula multiespecífica descrita aqui.

[00177] “modalidades, duas ou mais das modificações discutidas aqui são combinadas em um único anticorpo biespecífico, por exem- plo, bbpmAb.

5. Exemplo 1: Geração do bbmAb bbmAb1

[00178] Atítulo exemplificativo, a geração de um bbmAb específico é descrita abaixo, para permitir ao perito na técnica pôr em prática a invenção.

[00179] O bbmAb resultante, bbmAb1, é um IgG1 biespecífico, com mutações de silenciamento LALA, se ligando simultaneamente a dois alvos distintos, IL-18 e I1L-18. O anticorpo combina dois braços de liga- ção a antígenos distintos (fragmentos Fab), enquanto o Fab dirigido contra IL-18 é baseado em mAb2 e contém uma cadeia leve capa

(VK6). O Fab dirigido contra I1L-18 é baseado no mAb1 e é composto por uma cadeia leve lambda (VM). Para conduzir a heterodimerização do domínio Fc durante a expressão, um "nó" com uma cadeia lateral de aminoácido (aa) volumosa (S354C e T366W) na cadeia pesada de mMAb1 e um "buraco" com cadeias laterais de aa pequenas (Y349C, T366S, L368A, Y407V) foram introduzidos na cadeia pesada de mAb2.

[00180] Para facilidade de referência, as sequências de aminoáci- dos das regiões hipervariáveis de bbmAb1, com base na definição de Kabat e na definição de Chothia, bem como os domínios V, e Vx e ca- deias pesadas e leves completas são proporcionadas na Tabela 3, abaixo. Tabela 3. Sequências de aminoácidos das regiões hipervariáveis (CDR), domínios variáveis (VH e VL) e cadeias completas de bbmAb1. O DNA codificando a primeira VL é apresentado em SEQ ID NO:102 e o DNA codificando a segunda VL é apresentado em SEQ ID NO: 70. O DNA codificando a primeira VH é apresentado em SEQ ID NO:86 e o DNA codificando a segunda VH é apresentado em SEQ ID NO: 54. cadeia pesada 1 de bbmAb1 (de mAb1 CDR1-1 SEQ ID NO:76 | JChothia — | SEQIDNO79 Po IMGT SEQ ID NO:82 CDR2-1 SEQ ID NO:77 | “| chothiia SEQ ID NO:80 | lMeT SEQ ID NO:83 CDR3-1 SEQ ID NO:78 | [Chothia — |SEQIDNOS' Po IMGT SEQ ID NO:84 ME TSEQIDNO:85 Cadeia Pesada-t | | SEQIDNO:87 cadeia leve 1 de bbmAb1 (de mAb1 CDR1-1 SEQ ID NO:92 LL Jfenotia —|[SEQIDNO:SS Po IMGT SEQ ID NO:98 CDR2-1 SEQ ID NO:93 | “| chothiia SEQ ID NO:96 | lMeT SEQ ID NO:99 CDR3-1 SEQ ID NO:94 LL [cnotia —|[SEQIDNOS7

[00181] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra |IL- 18/I1L-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesa- da (VH) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:79, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:80 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoá-

cidos SEQ ID NO:81. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariá- veis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:82, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:83 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:84.

[00182] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL- 18/IL-18 compreende um segundo domínio variável de cadeia pesada (Vr2) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um segundo domínio variável de cadeia pe- sada (Vx2) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:47, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:48 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:49. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende um segundo domínio variável de ca- deia pesada (Vnr2) de imunoglobulina compreendendo regiões hiperva- riáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:50, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:51 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:52.

[00183] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL- 18/I1L-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve (V.L1) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos

SEQ ID NO:92, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:94. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:95, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:96 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:97. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve (Vu1) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:98, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:99 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:100.

[00184] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL- 18/IL-18 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve (V12) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:62. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve (V12) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:63, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:64 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:65. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve (V12) de imunoglobulina compreendendo regiões hipervariáveis CDR1,

CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:66, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:67 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:68.

[00185] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra |IL- 18/I1L-18 compreende um primeiro domínio VH: de imunoglobulina e um primeiro domínio V.1 de imunoglobulina, em que: a) o primeiro domínio VH: de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78, ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:79, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:80 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoá- cidos SEQ ID NO:81, ou iii) regiões hipervariáveis CDR1I, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:82, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:83 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:84 e b) o primeiro domínio V11 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:92, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:94 ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:95, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:96 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:97 ou iii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:98, a referida CDR2 tendo a se-

quência de aminoácidos SEQ ID NO:99 e a referida CDR3 tendo a se- quência de aminoácidos SEQ ID NO:100.

[001868] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra |IL- 18/IL-18 compreende um segundo domínio Vx2 de imunoglobulina e um segundo domínio V12 de imunoglobulina, em que: a) o segundo domínio Vrx2 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequên- cia): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46, ou ii) regiões hiper- variáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:47, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:48 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:49, ou iii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:50, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:51 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:52 e b) o segundo domínio V.2 de imunoglobulina compre- ende (por exemplo, na sequência): i) regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:62 ou ii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:63, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:64 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:65 ou iii) regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 ten- do a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:66, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:67 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:68.

[00187] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra |IL- 18/I1L-18 compreende: a) um primeiro domínio variável de cadeia pe- sada (VH1) de imunoglobulina compreendendo a sequência de amino- ácidos apresentada como SEQ ID NO:85; b) um primeiro domínio vari- ável de cadeia leve (V.1) de imunoglobulina compreendendo a se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:101; c) um primeiro domínio Vx: de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:85 e um primeiro do- mínio V., de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoá- cidos apresentada como SEQ ID NO:101; d) um primeiro domínio VnHi de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresen- tadas como SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:78; e) um primeiro domínio V.1 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 e SEQ ID NO:94; f) um primeiro domínio Vx: de imunoglobulina compre- endendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 e SEQ ID NO:81; g) um primeiro domínio V11 de imu- noglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 e SEQ ID NO:97; h) um primeiro domínio Vx1: de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariá- veis apresentadas como SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:78 e um primeiro domínio V.1 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 e SEQ ID NO:94; i) um primeiro domínio VH: de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 e SEQ ID NO:81 e um primeiro domínio V11 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresenta- das como SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 e SEQ ID NO:97; j) uma pri- meira cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:103; k) uma primeira cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:87, ou |) uma primeira ca-

deia leve compreendendo SEQ ID NO:103 e uma primeira cadeia pe- sada compreendendo SEQ ID NO:87.

[00188] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra |IL- 18/IL-18 compreende: a) um segundo domínio variável de cadeia pe- sada (Vur2) de imunoglobulina compreendendo a sequência de amino- ácidos apresentada como SEQ ID NO:53; b) um segundo domínio va- riável de cadeia leve (V.2) de imunoglobulina compreendendo a se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:69; c) um se- gundo domínio Vx2 de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:53 e um segundo domínio Vi2 de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:69; d) um segundo domínio Vx2 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresenta- das como SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46; e) um se- gundo domínio V.2 de imunoglobulina compreendendo as regiões hi- pervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:62; f) um segundo domínio Vx2 de imunoglobulina com- preendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:49; g) um segundo domínio Vi? de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresen- tadas como SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:65; h) um segundo domínio Vx2 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46 e um segundo domínio V12 de imunoglobulina compre- endendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:62; i) um segundo domínio Vnr2 de imu- noglobulina compreendendo as regiões hipervariáveis apresentadas como SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:49 e um segundo domínio V.2 de imunoglobulina compreendendo as regiões hipervariá- veis apresentadas como SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 e SEQ ID

T4/147 NO:65; j) uma segunda cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:81; k) uma segunda cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:55, ou |) uma segunda cadeia leve compreendendo SEQ ID NO:81 e uma se- gunda cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:55.

[00189] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL-18/I1L-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:53. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:69. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:53 e as três CDR de SEQ ID NO:69. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:85. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico con- tra I1L-18/I1L-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:101. Em ou- tras modalidades, o anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 compre- ende as trêê CDR de SEQ ID NO:85 e as três CDR de SEQ ID NO:101. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:85. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico contra 1L-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:101. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:85 e as três CDR de SEQ ID NO:101. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:53. Em outras modalidades, o anticorpo biespecífico contra IL- 18/I1L-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:69. Em outras mo- dalidades, o anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:53 e as três CDR de SEQ ID NO:69. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 compreende as três CDR de SEQ ID NO:85, as três CDR de SEQ ID NO:101, as três CDR de SEQ ID NO:53 e as três CDR de SEQ ID NO:69.

[00190] Em uma modalidade, a primeira parte do anticorpo biespe- cífico contra I1L-18/IL-18 é selecionada de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a) uma cadeia pesada de imu- noglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78 e b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu frag- mento que compreende um domínio variável compreendendo, na se- quência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:92, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:94. Além disso, a segunda parte do anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 é selecio- nada de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo me- nos: a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46 e b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variá- vel compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos

SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:62.

[00191] Em uma modalidade, a primeira parte do anticorpo biespe- cífico contra I1L-18/IL-18 é selecionada de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo menos: a) uma cadeia pesada de imu- noglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ |D NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78 e b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu frag- mento que compreende um domínio variável compreendendo, na se- quência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:92, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:94. Além disso, a segunda parte do anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 é selecio- nada de um anticorpo contra IL-18 humano que compreende pelo me- nos: a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variável compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada humana; a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46 e b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende um domínio variá- vel compreendendo, na sequência, as regiões hipervariáveis CDR1, CDR?2 e CDR3 e a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia

TTIIAT leve humana, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:62.

[00192] O primeiro domínio Vx1: ou V.1 de um anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 usado nos métodos revelados pode ter um primeiro domínio VH', e/ou primeiro domínio V11 que são substancialmente idên- ticos aos domínios Vx ou V. apresentados em SEQ ID NO:85 e 101. Um anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-18 revelado aqui pode com- preender uma primeira cadeia pesada que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:87 e/ou uma primeira cadeia leve que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:103. Um anticorpo biespeciífico contra IL-18/IL-18 revelado aqui pode compre- ender uma primeira cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:87 e uma primeira cadeia leve que compreende SEQ ID NO:103. Um anti- corpo biespeciífico contra I1L-18/IL-18 revelado aqui pode compreender: a) uma primeira cadeia pesada, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:85 e a parte constante de uma cadeia pesa- da humana tendo uma modificação de heterodimerização e b) uma primeira cadeia leve, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:101 e a parte constante de uma cadeia leve humana. À parte constante da cadeia pesada humana pode ser I9gG1. Em uma modalidade, a IgG1 é uma IgG1 humana sem mutações efetoras. Em uma modalidade, a cadeia pesada de IgG1 humana compreende uma mutação silenciadora N297A, D265A ou uma combinação de L234A e L235A. Em uma modalidade específica, a cadeia pesada de I9G1 hu- mana compreende a mutação silenciadora que é uma combinação de L234A e L235A, de acordo com SEQ ID NO:87.

[00193] O segundo domínio Vx2 ou V.2 de um anticorpo biespecífico contra IL-18/IL-18 usado nos métodos revelados pode ter um segundo domínio Vn2 e/ou primeiro domínio V.2 que são substancialmente idên- ticos aos domínios Vx ou V. apresentados em SEQ ID NO:53 e 69. Um anticorpo biespecífico contra I1L-18/IL-168 revelado aqui pode compre- ender uma segunda cadeia pesada que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:55 e/ou uma segunda cadeia leve que é substancialmente idêntica à apresentada como SEQ ID NO:71. Um anticorpo biespeciífico contra IL-18/IL-18 revelado aqui pode compre- ender uma segunda cadeia pesada que compreende SEQ ID NO:53 e uma segunda cadeia leve que compreende SEQ ID NO:69. Um anti- corpo biespeciífico contra I1L-18/IL-18 revelado aqui pode compreender: a) uma segunda cadeia pesada, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:53 e a parte constante de uma cadeia pesa- da humana tendo uma modificação de heterodimerização que é com- plementar à heterodimerização da primeira cadeia pesada e b) uma segunda cadeia leve, compreendendo um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em SEQ ID NO:69 e a parte constante de uma cadeia leve humana. A par- te constante da cadeia pesada humana pode ser IgG1. Em uma moda- lidade, a I9G1 é uma IgG1 humana sem mutações efetoras. Em uma modalidade, a cadeia pesada de IgG1 humana compreende uma mu- tação silenciadora N297A, D265A ou uma combinação de L234A e L235A. Em uma modalidade específica, a cadeia pesada de IgG1 hu- mana compreende a mutação silenciadora que é uma combinação de L234A e L235A, de acordo com SEQ ID NO:55.

[00194] Outros antagonistas (por exemplo, anticorpos) preferenciais de I1L-18 para uso como primeira parte de um anticorpo biespecífico nos métodos, kits e regimes revelados são os apresentados na Paten-

te US No: 9.376.489, que é incorporada a título de referência aqui na sua totalidade. Outros antagonistas (por exemplo, anticorpos) preferenciais de IL-1B para uso como segunda parte de um biespecífico nos métodos, kits e regimes revelados são os apresentados nas Patentes US Nos:

7.446.175 ou 7.993.878 ou 8.273.350, que são incorporadas a título de referência aqui na sua totalidade. (1) Planejamento de vetores

[00195] Dois vetores, vetor A e vetor B, foram gerados de acordo com a montagem seguinte. O vetor A foi planejado para a porção de anticorpo mAb1 (I9G1 anti-IL18). A região constante da cadeia pesada 1 foi modificada por duas mutações pontuais, T para W, como obser- vado na posição 366 de SEQ ID NO: 87 e S para C, como observado na posição 354 de SEQ ID NO: 87, para gerar uma estrutura em nó e permitir a formação de ponte de Cys. Além disso, a região constante da cadeia pesada 1 foi modificada por mutações pontuais, L para A, como observado na posição 234 de SEQ ID NO: 87 e L para A, como observado na posição 235 de SEQ ID NO: 87 (denominado LALA), pa- ra silenciamento parcial de funções efetoras de FC. O anticorpo tem uma região leve variável, que é do tipo lambda 1, VA1.

[00196] O vetor B foi planejado para a porção de anticorpo mMAb2 (I9G1 anti-IL-18). A região constante de cadeia pesada 2 foi modifica- da por quatro mutações pontuais T para S, como observado na posi- ção 366 de SEQ ID NO: 55, L para A, como observado na posição 368 de SEQ ID NO: 55, Y para V, como observado na posição 407 de SEQ ID NO: 55 e Y para C, como observado na posição 349 de SEQ ID NO: 55, para gerar uma estrutura em buraco e permitir a formação de uma ponte de Cys adicional. A estrutura em buraco interage com a es- trutura em nó para facilitar a geração de um anticorpo biespeciífico. Além disso, a região constante de cadeia pesada 2 foi modificada com as duas mutações LALA, L para A, como observado na posição 234 de SEQ ID NO: 55, L para A, como observado na posição 235 de SEQ ID NO: 55, para silenciamento de funções efetoras de FC. O anticorpo tem uma região leve variável, que é do tipo capa 6, VK6.

[00197] Os vetores Ae B têm uma combinação de marcadores de seleção de DHFR e neomicina bem como marcadores de seleção de FOLR e higromíicina, respectivamente. O ácido fólico é uma vitamina essencial para a síntese de purina e metionina e necessita de ser re- colhido por células de mamífero do meio de cultura. O "receptor de ácido fólico" (FolR) presente no plasmídeo de expressão A é um FolR mutante com afinidade alterada para folatos, facilitando o transporte de ácido fólico do meio para células de mamífero. Uma vez que recepto- res de ácido fólico de elevada afinidade são expressos apenas fraca- mente em células CHO cultivadas, células expressando FolIlR recombi- nante têm uma vantagem de crescimento clara sob condições pobres em folato (50 nM). O marcador de seleção FolIR foi codificado no vetor B.

[00198] Para além de FoIlR, "di-hidrofolato redutase" (DHFR) está presente no vetor A como marcador de seleção. DHFR converte ácido fólico em precursores vitais para a síntese de purina e metionina. MTX é um análogo químico do ácido fólico. Compete por sítios de ligação livres em DHFR e bloqueia desse modo a enzima. Células sobre- expressando DHFR exógeno podem lidar com concentrações eleva- das de MTX, conferindo às células uma vantagem seletiva clara cres- cendo em meio suplementado com MTX. A seleção por FolR e DHFR combinada é bem conhecida do perito na técnica e revelada, por exemplo, no documento de patente WO2010/097240A1, incorporado aqui a título de referência na sua totalidade. MTX é bem conhecido do perito na técnica e revelado, por exemplo, no documento de patente WO?2010/097239A1, incorporado aqui a título de referência na sua to-

talidade. Vetores de expressão são bem conhecidos do perito na téc- nica e revelados, por exemplo, no documento de patente WO?2009/080720A1, incorporado aqui a título de referência na sua to- talidade.

[00199] Uma perspectiva esquemática dos dois vetores é observa- da na Figura 1. (2) Linhagem de células hospedeiras e transfecção

[00200] Uma linhagem de células CHO paterna foi usada como |i- nhagem de células hospedeiras para a produção da linhagem de célu- las expressando bbmAb1. A linhagem de células hospedeiras foi deri- vada da linhagem de células CHO-K1, bem conhecida do perito na técnica, de um modo descrito, por exemplo, nos pedidos de patentes WO?2015092737 e WO2015092735, ambos incorporados a título de referência na sua totalidade.

[00201] “Um único frasco da linhagem CHO foi usado para preparar a linhagem de células recombinantes para bbmAb1. A linhagem CHO foi preparada em meio quimicamente definido.

[00202] As células cresceram em meio de cultivo quimicamente de- finido.

[00203] Um ug de DNA plasmídico linearizado com Swal, vetor de expressão A & B codificando o bbmAb, foi adicionado por transfecção. A reação de transfecção foi realizada em meio de cultivo quimicamen- te definido.

[00204] As transfecções foram realizadas por eletroporação usando um AMAXA Gene Pulser, de acordo com as instruções do fabricante. As células CHO paternas usadas para a transfecção estavam na fase de crescimento exponencial com viabilidades celulares maiores do que 95%. No total foram realizadas três transfecções com 5x10º células por transfecção.

[00205] Imediatamente após a transfecção, células foram transferi-

das para Balões Agitadores, contendo meio de cultivo quimicamente definido.

[00206] Reuniões de células foram incubadas durante 48 horas a 36,5 ºC e 10% de CO, antes do início do processo de seleção. (3) Seleção e triagem de células

[00207] Foi realizado um procedimento de seleção usando o mar- cador de seleção codificado pelos vetores de expressão A e B indivi- duais, como descrito acima. Ambas as proteínas (FolR e DHFR) parti- cipam na mesma via molecular; o FoIlR transporta ácido fólico bem como o análogo de folato MTX para dentro da célula, o DHFR converte aquele em precursores vitais para a síntese de purina e metionina. Combinando aquelas como princípio seletivo, um regime seletivo forte particular pode enriquecer quanto a células recombinantes expressan- do ambas as proteínas recombinantes.

[00208] 48h após a transfecção e crescimento sob condições po- bres em folato, foi aplicada pressão seletiva adicional por adição de MTX 10 nM ao meio de cultivo quimicamente definido. 22 dias após o início da seleção com MTX emergiram populações reunidas consistin- do predominantemente em células resistentes ao MTX. Após a recupe- ração da reunião, células foram congeladas e péletes celulares foram preparados. Lotes padrão em meio de cultivo quimicamente definido foram preparados para a determinação da concentração do bbmAb.

[00209] Foiusada metodologia de HPLC com Proteína A para de- terminar de modo completo todos os tipos de produto e impurezas re- lacionadas contendo uma parte Fc, ao passo que cromatografia de fa- se reversa (RPC) foi usada para obter uma impressão digital relativa- mente à distribuição das frações individuais — picos individuais foram atribuídos pela metodologia de MS.

[00210] Reuniões de células CHO produtoras de bbmAb1 foram usadas para um procedimento de clonagem por FACS para obter |i-

nhagens de células clonais individualizadas como material de partida para todas as avaliações adicionais. Seleção de células usando análi- se por FACS é descrita, por exemplo, no pedido de patente US20110281751, incorporado aqui a título de referência na sua totali- dade.

[00211] Linhagens de células CHO clonais individuais expressando bbmAb1 foram geradas por Triagem de células ativadas de modo fluo- rescente (FACS). Para permitir a triagem por FACS, as células foram incubadas com um Fab anti-lgG1 etiquetado com FITC durante 30 min e lavadas duas vezes em PBS antes de serem usadas na triagem de células isoladas auxiliada por FACS, um processo bem conhecido do perito na técnica.

[00212] A triagem de células por FACS foi realizada com um FACS Aria (Becton Dickinson), equipado com uma Unidade de Deposição de Células Automática (ACDU) usando o software FACS Diva.

[00213] Para assegurar que apenas células isoladas eram submeti- das a triagem pelo instrumento de FACS, os parâmetros foram ajusta- dos para o modo de precisão de células isoladas usando um bocal de 130 um bem como uma vazão apropriada assegurando uma boa qua- lidade da triagem.

[00214] No modo de Células Isoladas, A Máscara de Pureza foi fi- xada no máximo, de modo a serem submetidas à triagem apenas go- tas desprovidas de partículas ou outras células.

[00215] A Máscara de Fase foi fixada em metade do máximo, de modo que apenas partículas centradas na gota submetida a triagem eram defletidas. A trajetória de gotas e precisão da contagem foram otimizadas à custa do rendimento para aumentar a probabilidade de cada gotícula não conter mais do que 1 célula isolada.

[00216] Para verificar e documentar a origem monoclonal e para confirmar o estado de células isoladas no dia O após FACS, imagens da clonagem de todos os poços das placas de 96 poços foram recolhi- das usando um sistema de imagiologia.

[00217] A imagem do dia O referente ao clone de produção de bbmAb1 foi visualmente inspecionada em duplicado, confirmando que apenas uma célula isolada pode ser identificada na imagem do poço respectivo recolhida pelo sistema de imagiologia.

[00218] Tal sublinhou a origem de células isoladas do clone de pro- dução de bbmAb1. (4) Expansão de células

[00219] Após clonagem por FACS, os clones foram manejados por um sistema robótico durante as primeiras semanas e manejados ma- nualmente em seguida, expandidos em passos do agitador de 96 po- ços para o de 24 poços e finalmente culturas no biorreator, bem co- nhecidos do perito na técnica, para avaliar o desempenho (produtivi- dade e qualidade da expressão de bbmAb).

[00220] Durante a expansão/cultura, células CHO recombinantes foram cultivadas em meio de cultivo quimicamente definido suplemen- tado com Metotrexato (MTX) a uma concentração final de 10 nM.

[00221] As células foram submetidas a passagem 2-3 vezes por semana para meio fresco e foram mantidas na fase de crescimento logarítmico ao longo do estudo.

[00222] A produtividade foi avaliada por HPLC com Proteína A, um perfil inicial da qualidade do produto foi determinado por cromatografia de fase reversa (RPC).

[00223] “Todos os estoques congelados foram gerados em meio de cultura, suplementado com DMSO 7,5%. (5) Estabilidade de clones

[00224] “bbmAbs isolados de reuniões e clones foram cuidadosa- mente avaliados por diferentes metodologias analíticas para avaliar as características do produto e parâmetros de qualidade com o propósito de assegurar a seleção do clone de produção mais adequado.

[00225] — Adicionalmente, uma análise excessiva da estabilidade da produção foi efetuada para os clones de produção com o propósito de assegurar a seleção dos clones de produção mais adequados.

[00226] Diferentes metodologias analíticas do estado da técnica fo- ram usadas para avaliar a estabilidade de clones: cromatografia líqui- da de afinidade, cromatografia de fase reversa, FACS e MS. (6) Fabricação (a) Processamento a montante

[00227] O material de bbmAb foi produzido em balões agitados ou culturas descontínuas com alimentação programada Wave. Estoques congelados de reuniões ou clones como PSL foram descongelados e expandidos ao longo do período de tempo requerido em meio quimi- camente definido para obter o número requerido de células para se- mear a cultura de produção, tipicamente com uma densidade de célu- las semeadas de 4,0 x 105 células/mL. A cultura individual foi cultivada ao longo de um período de 13-14 dias. Durante a cultura foram efetua- dos controles no processo para monitorar a concentração do bbmAb e o perfil de qualidade no sobrenadante. No final do processo de cultura, células foram separadas do sobrenadante de cultura por centrifugação (por exemplo, agitador) ou filtração profunda seguido de filtração este- rilizada antes do processamento DSP adicional. (b) Processamento a jusante

[00228] “Com base no planejamento do formato e na abordagem de coexpressão, não só o produto intato bbmAb1 e impurezas comuns, como agregados, DNA e proteínas de células hospedeiras, mas tam- bém monômeros derivados de mMAb1 e mAb2, homodímeros e varian- tes de bbmAb1 de cadeia leve/pesada com emparelhamento defeituo- so, como mostrado na Figura 4, eram esperados no sobrenadante após cultura de células e remoção de detritos celulares. Variantes de bbmAb1 de cadeia leve/pesada com emparelhamento defeituoso (Fi- guras 4E até 4M) são suspeitas de terem as mesmas propriedades biofísicas do bbmAb1 intato que não podem ser facilmente removidas à escala preparativa. Abordagem |: Purificação por captura em MabSelect"y SuRe'Y, poli- mento em LambdaFabSelect"" e KappaSelect""

[00229] “bbmAb1 e variantes de bbmAb1 contendo a parte Fc foram capturadas do sobrenadante sem células por uma primeira etapa de cromatografia líquida de afinidade (ALC) em MabSelect'y SuRe'Y., Va- riantes de bbmAb1 contendo apenas cadeias leves capa (buraco de mMAb?2, Figuras 4C e 4D) e HCP foram removidas por um primeiro po- limento em LambdaFabSelect'" e variantes de bbmAb1 contendo apenas cadeias leves lambda (nó de mAb1, Figuras 4A e 4B) e HCP foram removidas por um segundo passo de polimento em KappaSe- lectTv,

[00230] A cromatografia foi realizada à temperatura ambiente usan- do um tempo de permanência (RT) de 4 minutos ao longo do método. Todas as colunas foram equilibradas com 4 volumes de coluna (CV) de Na2HPO/NaH2PO, 20 mM, pH 7,0 antes da carga. Para depletar do produto impurezas ligadas de modo inespecífico, tais como proteí- nas de células hospedeiras (HCP), componentes do meio e DNA, a coluna de cromatografia foi lavada com 4 CV de Arginina-HCI 250 mM, NaCl 1 M, NaOH 88 mM, pH 9,0 e 3 CV de tampão de equilíbrio após carga de sobrenadante de bbmAb1 sem células do balão agitado para a coluna de ALC. bbmAb1 e variantes potenciais de bbmAb1 eluíram da coluna cromatográfica usando ácido acético 50 mM, pH 3,0, res- pectivamente ácido acético 50 MM/HCI, pH 2,0 para eluição a partir de KappaSelect'"" e LambdaFabSelect'Y. A recolha de picos de produto começou e terminou a 0,5 AU/cm ou 0,25 AU/cm (280 nm). O pH dos eluatos de bbmAb1 foi ajustado para -pH 5,0 com Tris 0,1 ou 1 M an-

tes do armazenamento a 2-8 ºC, respectivamente, para avaliação ana- lítica.

Abordagem |l: Purificação por captura em LambdaFabSelect"“, poli- mento em Capto'“ adhere e Fractogel"" EMD SO;

[00231] Em uma segunda abordagem, bbmAb1 intato e variantes de bbmAb1 contendo apenas cadeias leves lambda (monômero e ho- modímero de nó de mAb1, Figuras 4A e 4B) foram capturadas de so- brenadante sem células por cromatografia líquida de afinidade em LambdaFabSelect'Y, Para inativar vírus com envelope potencialmente presentes foi efetuado um tratamento a baixo pH do eluato de ALC se- guido de duas etapas de polimento cromatográfico em Capto adhere e Fractogel'*" EMD SO; para remover impurezas relacionadas com o produto, DNA e HCP. Vírus potencialmente presentes foram subse- quentemente removidos por nanofiltração antes de uma etapa final de concentração e troca do tampão usando filtração com fluxo tangencial. a) Cromatografia Líquida de Afinidade (ALC) em LambdaFabSelectTY

[00232] ALC foi realizada a 18-28 ºC usando um tempo de perma- nência (RT) de 3,6-4,4 minutos ao longo do método. Em primeiro lu- gar, a coluna de ALC foi equilibrada com 4-6 CV de Na2HPO/ NaH2PO, 20 mM, pH 7,0. Em seguida, sobrenadante de bbmAb1 sem células clarificado de Wave ou biorreatores foi carregado na coluna LambdaFabSelect'Y com uma densidade de carga de 7-23 g/L. Uma lavagem da coluna com 4-6 CV de Arginina-HCI 250 mM, NaCl 1 M, NaOH 88 mM, pH 9,0 e uma segunda lavagem com 3-5 CV de tampão de equilíbrio foram realizadas antes da eluição do produto com 4-6 CV de acético ácido 50 mM. O pico de produto foi recolhido de 0,5-2,0 AU/cm (280 nm) ascendente e 0,5-2,0 AU/cm (280 nm) descendente. A coluna LambdaFabSelect'Y foi limpa usando 3-5 CV de ácido fosfó- rico 120 mM, acético ácido 167 mM, pH 1,5 antes de reequilíbrio com 3-5 CV de Na2HPO4/NaH2PO, 20 mM, pH 7,0 e armazenamento em 4-

6 CV de etanol 20%. b) Inativação de vírus

[00233] O pH do eluatode ALC foi ajustado para pH 3,4-3,6 usando ácido fosfórico 0,3 M. Em seguida, a solução proteica foi subsequen- temente incubada durante 60-90 min a este pH baixo antes do ajusta- mento do pH para 7,3-7,7 com Tris 1 M. Foi usado um passo de filtra- ção em profundidade usando filtros Millipore B1HC Pod aplicando uma vazão de 100-300 LMH antes de filtração esterilizada com filtro esteri- lizado Sartopore'“Y de 0,45/0,2 um. c) Cromatografia de Troca Aniônica Multimodal (MAC) em Capto'“Y adhere

[00234] MAC foi realizada em modo de fluxo contínuo a 18-28 ºC usando um tempo de permanência de 4-6 minutos ao longo do méto- do. Em primeiro lugar, a coluna de MAC foi equilibrada com 7-9 CV de Tris/Tris-HCI 20 mM, pH 7,5. Em seguida, o eluato de ALC tratado a baixo pH foi carregado na coluna Capto'?Y adhere usando uma densi- dade de carga de 175-350 g/L. A recolha do pico de produto começou assim a 0,5-2,0 AU/cm (280 nm) ascendente. Em seguida, a coluna de MAC foi lavada com 5-7 CV de tampão de equilíbrio e a recolha do pi- co de produto terminou a 0,5-2,0 AU/cm (280 nm) descendente. A co- luna Capto'?“ adhere foi subsequentemente extraída com 6-8 CV de ácido acético 100 mM, seguido de um passo de limpeza no local com 3-5 CV de NaOH 0,5 M e armazenamento em 3-5 CV de NaOH 0,1 M. d) Cromatografia de Troca Catiônica em Fractogel"y EMD SO;.

[00235] CEC em Fractogel'” EMD SO; foi realizada em modo liga- ção-eluição a 18-28 *C. Um tempo de permanência de 6-8 minutos foi usado durante a equilíbrio, extração, CIP e armazenamento e 8-10 min de tempo de permanência durante a carga, lavagem e eluição. A colu- na de CEC foi equilibrada com 6-8 CV de ácido succínico 20 mM, Na- OH 35,1 mM, pH 6,0. Então, o percolato de MAC foi carregado na co-

luna com uma densidade de carga de 35-70 g/L. Subsequentemente, a coluna de CEC foi lavada com 5-7 CV de tampão de equilíbrio. A elui- ção foi realizada usando um gradiente linear de sal desde 10 até 90% de ácido succínico 20 mM, NaCl 500 mM, NaOH 37,4 mM, pH 6,0 ao longo de 15 CV. O pico de produto de bbmAb1 foi recolhido começan- do a 0,1-0,4 AU/cm ascendente até 20%-40% da altura máxima do pi- co a 300 nm. A coluna de Fractogel"" EMD SO; foi extraída com 3-5 CV de NaCl 1 M, seguido de um passo de limpeza no local com 3-5 CV de NaOH 0,5 M e armazenamento em 3-5 CV de NaOH 0,1 M. e) Nanofiltração

[00236] Vírus potencialmente presentes foram removidos por nano- filtração usando um nanofiltro Planova?Y 20N e um pré-filtro Millipore SHR-P de 0,5/0,1 um. A pré- e nanofiltração foram realizadas por apli- cação de uma pressão diferencial de 0,7-0,9 bar. f) Filtração de fluxo tangencial e Formulação

[00237] Para concentrar e diafiltrar bomAb1 foi efetuada uma etapa de filtração de fluxo tangencial em membranas Millipore'Y Pellicon'y 3 RC de 30 kDa a 18-28 ºC. Em primeiro lugar, a solução de proteína bbmAb1 nanofiltrada foi concentrada com uma densidade de carga máxima de 1000 g/m? para 60-80 g/L usando uma pressão do fluxo de alimentação de 0,5 até 1,2 bar e uma pressão de transmembrana (TMP) de 0,3-0,6 bar. Em seguida, bbmAb1 foi diafiltrado contra 7-9 volumes de diafiltração de histidina/histidina-HCl 20 mM, pH 6,0 a uma pressão do fluxo de alimentação de 0,8 até 1,8 bar e uma TMP de 0,4- 0,9 bar. Foi realizada uma segunda etapa de concentração para 134+10 g/L a uma pressão do fluxo de alimentação de 1,4-3,0 bar e uma TMP de 0,7 até 1,5 bar. A solução de proteína bbmAb1 ultrafiltrada foi finalmente formulada para uma concentração de 100+10 g/L e Polis- sorbato 20 0,04% (p/v). A substância de fármaco (DS) final é filtrada através de um filtro de 0,2 um, é armazenada congelada a <-60ºC.

(7) Caracterização analítica e avaliação da pureza (a) Rastreio por LC-MS de bbmAbs intatos e variantes

[00238] 100 ug de amostras de bbmAb purificadas com proteína À foram liofiizados em uma placa de 96 poços e deglicosilados por PNGaseF (New England Biolabs) durante 18 horas a 37 ºC em 100 ul de tampão Tris-HCI 50 mM pH 7,5. As amostras foram medidas por LC-ESI-MS em um UPLC H-Class (Waters) conectado a um espectrô- metro de massa Q-TOF Synapt G2 (Waters). Foi usada uma coluna MassPREP Micro Desalting 2,1x 5 mm (Waters) a 80 ºC de temperatu- ra da coluna. Foi aplicado um gradiente linear a 0,3 mL/min com fase móvel A: ácido fórmico 0,1% em água, fase móvel B: FA 0,1% em ace- tonitrila: 0-2 min 5% de B , 2-12 min 5-90% de B, seguido de vários passos de lavagem a 0,5 mL/min. Parâmetros de MS: ES| + Modo de resolução, Voltagem do capilar 3 kV, cone de amostragem 40 V, tem- peratura da fonte 150 ºC, temperatura de dessolvação 400 ºC. O sis- tema foi calibrado com solução de calibração de NaCl, o padrão de massa de calibração em tempo real ("lock mass") foi Leucina Encefali- na. Os dados foram processados por deconvolução MaxEnt1i automá- tica (gama de massas 60-150 kDa, supressão harmônica) com softwa- re UNIFI 1.6 (Waters). A identificação e quantificação relativa de espé- cies de bbmAb e variantes com emparelhamento defeituoso são base- adas na correspondência com a massa teoricamente esperada e a in- tensidade relativa do sinal de massa do espectro de massa deconvolu- ido. (b) Caracterização por LC-MS de bbmAb1

[00239] “bbmAb deglicosilado intato: Anticorpo bbmAb1 purificado foi diluído em Tris-HCI 20 mM pH 7,5 para 1 mg/mL e foi deglicosilado durante 4 h a 37 ºC usando 2 ul de enzima PNGaseF (New England Biolabs). A digestão foi terminada por adição de ácido trifluoroacético (TFA) para 2%.

[00240] bbmAb deglicosilado reduzido: bbmAb1 foi diluído para 5 mg/mL em 20 uL de Tris-HCI 0,1 M pH 7,5. Foram adicionados 2 ul de PNGase F e o sistema foi incubado durante 4 h a 37 ºC, então 80 ul de tampão de desnaturação (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, cloridrato de guanidina 6 M) e 1 ul de DTT 1 M foram adicionados à mistura. Após incubação durante 1 hora a 37 ºC, a amostra foi acidificada com 1 ul. de TFA.

[00241] Digestão com papaína de bbmAb em Fab e Fc. bbmAb1 foi misturado com tampão de digestão (ácido succínico 20 MM, NaOH 35,1 MM, pH 6,0, Cys-HCI 1 mM, EDTA 1 mM) para 5 mg/mL, então papaína protease (Roche, Alemanha) foi adicionado para uma concen- tração final de 5 ug/mL (razão protease/ proteína 1:1000) e o sistema foi incubado durante 2 horas a 37 ºC com agitação. Após a incubação, a solução foi terminada por adição de solução de iodoacetamida para a concentração final de 1,2 mM.

[00242] Digestão com IdeS de bbmAb em F(ab'), e Fc. 100 ug de bbmAb1 foram misturados com tampão de clivagem (fosfato de sódio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,6) e digeridos com 100 U de protease IdeS (Fabricator, Genovis) durante a noite a 37 ºC. Após incubação, a solução foi terminada por adição de TFA para a concentração final de 2%.

[00243] Digestão com LysC reduzida - Mapeamento de peptí- deos. (De acordo com Rombach-Riegraf et al, PlosOne 2014.) 200 ug de proteína foram desnaturados usando 150 uL de solução desnatu- rante (cloridrato de guanidina 6 M, Tris-HCI 50 mM, Na2EDTA 5 mM, pH 8,0) e reduzidos por adição de 1,5 ul de DTT 1 M e incubação a 37 ºC durante uma hora. A alquilação foi efetuada por adição de 3 ul de iodoacetamida 1 M seguido de incubação a 37 ºC no escuro. A reação foi extinta com 1 ul de DTT 1 M. Após redução/alquilação, 750 ul de tampão de digestão (Tris-HCl 50 mM, pH 8) foram adicionados à amostra. A amostra foi então digerida por duas adições de 4 ul de uma solução 1 ug/yl de solução de endoproteinase LysC (Wako (Osaka, Japão)) e incubação a 37 ºC durante 1 hora e 3 horas, respec- tivamente. 5 uL de TFA foram adicionados para extinguir a digestão.

[00244] “Medições de LC-MS. Amostras de proteína foram sujeitas a um sistema de LC-MS usando UPLC Waters H-Class equipado com uma coluna BEH C4 RP (1,7 um, 2,1 x 100 mm, 300 À, Waters) e um espectrômetro de massa TOF Xevo G2 (Waters, Milford). Os eluentes foram A: TFA 0,1% em água e B: TFA 0,09% em acetonitrila. A coluna foi fixada em 80 ºC. A vazão foi 0,2 mL/min. As proteínas eluíram com um gradiente durante 40 min do modo seguinte: 0-5 min 10% de B, 5- min 10-30% de B, 10-25 min 30-40% de B, 25-26 min 40-95% de B, 26-28 min 95%, 28-40 min 10% de B.

[00245] Parâmetros de MS: Modo ESI (+) TOF, Modo de resolução, Gama de Massas 400-4000 Da, Tempo de Varredura 1 s, voltagem do capilar 3 kV, cone de amostragem 25 V-40 V. O sistema foi calibrado usando solução de NaCsl.

[00246] Os digestos peptídicos foram analisados por RP-LC-MS em UPLC H-Class (Waters) acoplado a um espectrômetro de massa Q- TOF Synapt G2 (Waters) usando uma CSH130 C18 2,1 mm x 150, 1,7 um (Waters, Milford). Fase móvel A: TFA 0,1% em água e fase móvel B: TFA 0,09% em acetonitrila. Os peptídeos eluíram da coluna com o seguinte gradiente: 0-5 min 0% de B, 5-10 min 0-2% de B, 10-40 min 2-20% de B, 40-120 min 20-40% de B, 120-135 min 40-70% à tempe- ratura da coluna de 40 ºC. Os cromatogramas de UV foram registrados a 214 nm e a aquisição de dados de MS foi efetuada no modo de reso- lução positiva ES(+) como uma experiência de MSF usando fragmen- tação de baixa energia (4 eV) e alta energia (30-55 V). O padrão de massa de calibração em tempo real foi Leucina Encefalina (Waters).

[00247] O processamento e avaliação de dados foram efetuados por software MassLynx 4.2 ou UNIFI 1.6 (Waters). O algoritmo Ma- xEnt1 foi usado para a deconvolução de espectros de massa de prote- ínas. Os cálculos teóricos de massa foram realizados com software GPMAVW 9.2 (Lighthouse data). (c) Cromatografia de fase reversa

[00248] Amostras de bbmAb foram analisadas em HPLC Agilent 1260 usando uma coluna Poroshell 300 SB-C8 RP, 2,1 mm x 75 mm, um (Agilent). A temperatura da coluna foi fixada em 80 ºC, a vazão foi 2 mL/min, fase móvel A: 90% de água, 10% de acetonitrila, TEA 0,1%, PEG-300 0,3%, fase móvel B: 10% de água, 90% de acetonitri- la, TFA 0,1%, PEG-300 0,3%. O gradiente usado foi: 0-5 min 22-37% de B, 5,0-5,1 min 100% de B, 5,1-6 min 100% de B, 6,1-8,5 min 22% de B. O sinal de UV foi registrado a 210 nm. A aquisição e avaliação de dados foram controladas e efetuadas usando software Chromele- on'Y 6.8 (Thermo Scientific). (d) Cromatografia de exclusão por tamanho

[00249] “Uma amostra de bbmAb1 foi sujeita a coluna de SEC TSK gel G3000SWXL (Tosoh 4808541, 5 um, 7,8 mm x 300 mm), tamanho dos poros 250 A usando um sistema Agilent 1260. A fase móvel foi solução de fosfato de potássio 150 mM, pH 6,5, a Vazão foi 0,4 mL/min, a temperatura da coluna foi 30 ºC. UV foi registrado a 210 nm. A aquisição de dados e integração de picos foram realizadas usando Chromeleon'Y 6.8 (Thermo Scientific). (e) Eletroforese Capilar CE-SDS

[00250] Para CE-SDS não redutora, a amostra de bbmAb foi mistu- rada com tampão de amostras (fosfato de sódio 0,1/ SDS 1,0%, pH 6,6) e então misturada com solução de iodoacetamida. Para CE-SDS redutora, a proteína foi misturada com tampão de amostras Tris 0,1 M/ SDS 1%, pH 8,0 e reduzida com mercaptoetanol 5% (v/v). Ambas as amostras foram submetidas a uma etapa de desnaturação térmica a

70 ºC durante 10 minutos.

[00251] As amostras foram analisadas em um sistema Beckman PA 800 equipado com um capilar de sílica fundida sem revestimento inter- no (50 um, 375 OD, 67 cm, Beckman) com um comprimento total do capilar de 30 cm e cheio com tampão de gel de peneiramento Beck- man SDS MW. A separação foi efetuada de polaridade negativa para positiva a 15 kV e 25 ºC de temperatura do capilar, detecção por UV a 214 nm. Os eletroferogramas foram processados e integrados usando software Chromeleon'Y 6.8. (f) Eletroforese Capilar de Zona CZE

[00252] As separações foram realizadas em um Sistema de Análise Farmacêutica Beckman Coulter PA 800 equipado com detector de UV a 214 nm. A proteína foi separada em capilar de sílica fundida (DI 50 um) com comprimento total de 40 cm com uma voltagem do capilar de kV a 25 ºC e polaridade positiva. Tampão de processamento: ácido 6-aminocaproico 400 mM /ácido acético pH 5,7 com TETA 2 mM e Tween 20 0,03%. A integração de picos foi efetuada com software Chromeleon'"Y 6.8. (8) Resultados Analíticos

[00253] A pureza e identidade de diferentes combinações e constru- tos de anticorpos biespecíficos após coexpressão foram analisadas após purificação com proteína A usando uma abordagem de rastreio de massa por UPLC-MS intata. Esta abordagem foi usada para con- firmar e quantificar relativamente os hetero- e homodímeros formados do sobrenadante de células. Foi possível observar bbpmAb1 e bbmAb2 heterodiméricos corretamente formados com uma pureza relativa mai- or do que 85% com base na intensidade do sinal de massa intata. As impurezas principais observadas no rastreio consistiram no anticorpo com emparelhamento defeituoso com duas cadeias leves capa, duas cadeias leves lambda e moléculas buraco de HC-dímero.

Tabela 4. Resumo de resultados analíticos obtidos para bbmAb1- bbmAb11. Candidato | Nó/Buraco LiL2 Identidade de variantes de Ab biespe- Classifi- cíficos por MS cação MD | QuantficaçãoRel | bbmAb1 mAbimAb2 | mAb1(IVmMAb2(k) | bsAb 85% 1 KH:L2L2 5% KH:L1IL1 10% KH:L1IL1 6% KH:L2L2 10% bbmAb3 | mAL3mMAb4 | mAb3(kymAb4(k) | bsAb 54% 2 KH:L1IL1 35% HH:L1L1 (dímero H) 11% bomAb4 | mAb5mAb2 | mAb2(kKymAb5S() | bsab 63% 2 KH:L2L2 9% HH:L1L1 (dímero H) 11% KH:L2L2 17% HH:L2L2 (dímero H) 47% bbmAb8 —| mAb7mAb1 | mAbI(ymAb7 (k) bsAb 51% 3 KH:L2L2 21% KH:L1IL1 20% HH:L1L1 (dímero H) 9% HH:L2L2 (dímero H) 20% Ab parcial: H:L2, H:L2+ bbmAb8 MAb9/mMAb1 MAbS9 (k/ mAb1 (|) bsAb 35% 3 KH:L2L2 34% KH:L1IL1I 17% HH:L2L2 (dímero H) 14% bbmAb9 — | mALIOMAb1 | mAbIO(k)/mMAb1(I) | bsAb 58% 3 KH:L1IL1 23% HH:L1L1 (dímero H) 12% KH:L2L2 7% bbmAb1O | mAbIImMAbI | mAb11 (k)/mMAb1(I) | bsAb 45% 2 KH:L1IL1 22% HH:L1L1 (dímero H) 23% Corte HC bsAb 10% Ab parcial: H:L1, H:L1+O) bbmAb11 | mAbI2MAb1 | mAbI2(k)/mAb1 (1) | bsAb 49% 2 HH:L1L1 (dímero H) 41% KH:L1IL1 10% Ab parcial: H:L1, HL1+O)

[00254] A designação !|é cadeia lambda, k é cadeia capa.

[00255] —mAb3 é um anticorpo de tipo VH3, Vk1.

[00256] —mAb4 é um anticorpo de tipo VH3, Vk1.

[00257] —“mAb5 é uma versão enxertada de MAb1 (VH1, VI1).

[00258] —“mAb6 é uma versão enxertada de mAb2 (VH1 46, VkK3).

[00259] —mAb7 é um anticorpo de tipo VH3, Vk1.

[00260] —mAb8 é um anticorpo de tipo VH1 2, Vk2.

[00261] — mAb9 é um anticorpo de tipo VH5, VK6.

[00262] — mAb10 é um anticorpo de tipo VH1 46, Vk6.

[00263] —“mAb11é um anticorpo de tipo VH3, Vk3.

[00264] —“mAb12 é um anticorpo de tipo VH3, Vk2.

[00265] O bbmAb1 foi caracterizado em mais detalhe para avaliar todas as variantes de produto e impurezas formadas após as diferen- tes etapas de purificação por LC-MS usando vários métodos de prepa- ração de amostras e com outras técnicas de separação. A massa do produto purificado em 2 etapas (lambda/CEC) intato foi determinada após deglicosilação com enzima PNGaseF e injeção subsequente na montagem de RP-LC-MS. O espectro de massa deconvoluído de bbmAb1 intato confirmou a formação correta do heterodímero nó-em- buraco após coexpressão e purificação por Lambda-Select. Não foi possível detectar grandes impurezas, como homodímeros ou anticor- pos parciais, após purificação por Lambda-Select. Foi possível confir- mar a identidade das quatro cadeias de anticorpo diferentes após re- dução e deglicosilação da amostra.

[00266] Para avaliar o emparelhamento defeituoso de cadeias e ou- tras impurezas de nível baixo, a amostra purificada foi digerida por pa- paína protease para analisar os fragmentos Fab e Fc individuais. As massas medidas dos fragmentos confirmaram mais uma vez a forma- ção correta dos diferentes braços de Fab (Nó-lambda, Buraco-capa), bem como a formação correta do fragmento Fc nó-em-buraco. Foi possível observar um fragmento Fab com emparelhamento defeituoso (Fab4, Nó-capa) em níveis <1%. Foi testada uma abordagem alternati- va para gerar os fragmentos Fab com uma digestão por LysC limitada que permite uma preparação de amostras mais rápida durante a reu- nião e seleção de clones.

[00267] Foi testada outra estratégia de digestão usando a enzima IdeS (Fabricator) para gerar fragmentos Fc e F(ab')2. Nesta experiên- cia, a massa do heterodímero Fc foi observada e o F(ab')2 heterodimé- rico corretamente formado. A presença de um heterodímero Fc tam- bém é prova da formação correta da ponte dissulfeto adicional na par-

te Fc de bbmAb1, pois de outro modo apenas seria gerado um frag- mento Fc/2 de massa menor.

[00268] O mapeamento de peptídeos LysC por LC-MS pôde confir- mar a identidade da molécula com uma cobertura de sequência global dos peptídeos de 99%.

[00269] Resultados específicos das amostras purificadas são mos- trados na Figura 2. Particularmente, o cromatograma de RP-UV de mAb biespeciífico intato deglicosilado é mostrado na Figura 2A. Frag- mentos bbmAb1 digeridos com papaína são mostrados na Figura 2C. Fragmentos bbmAb1 digeridos com IdeS são mostrados na Figura 2D. Fragmentos bbmAb1 deglicosilados e reduzidos com DTT são mostra- dos na Figura 2E. O espectro de massa deconvoluído do mAb biespe- cífico deglicosilado intato bbmAb1 é mostrado na Figura 2B.

[00270] Os resultados são mostrados na Tabela 5. Tabela 5. Atribuição de massas de bbmAb1 medidas por RP-LC-MS (Da) (Da) massa (A Da) intact: Digesto com papaína Fc (H1-H2)+ beo0/bGo/0K 52570 52570 Lo | FaiCiHambianmo) —Jasos2 UU jaz oo) [o | rab2(2H2capaburaco) —Jazsos jaz a) | Digesto com IdeS o [es O o O Ab deglicosilad; -H sa a Lo neo age Pagos Lo | H2buracocmpEnK so sas

[00271] A pureza aumentada obtida após aplicação das diferentes etapas descritas acima é observada na Figura 3. A Figura 3A é um cromatograma mostrando o perfil de expressão após cultura, a Figura 3B é um cromatograma após captura por LambdaFabSelect'Y, a Figu- ra 3C é um cromatograma após captura com MabSelect'y SuRe” e a Figura 3D é um cromatograma após captura com LambdaFabSelect'Y, polimento por Fractogel"" EMD SO; e ultrafiltração.

[00272] O bbmAb1 biespecífico (lambda/CEC) purificado em 2 eta- pas final foi adicionalmente analisado por métodos listados na Tabela

6. Globalmente, o material exibe elevada pureza com nível baixo de agregados ou produtos de degradação, detectado por vários métodos de separação como cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), CE-SDS e eletroforese capilar de zona (CZE). Tabela 6. Dados analíticos da pureza de bbmAb1 purificado Método Parâmnettco = Valor Pureza por SEC Produtos de Agregação 13% Produtos de Degradação 12% CZE Espécies Ácidas 24,7% Espécies Básicas 16,6 % Pureza por CE-SDS Redutor 98,2% Não redutor 94,6 %

[00273] Também foram testadas combinações adicionais de outros anticorpos. A Tabela 4 mostra um resumo dos resultados analíticos obtidos.

6. Exemplo 2: Atividade in vitro de bomAb1

[00274] A atividade de ligação de bbmAb1 foi testada em uma vari- edade de diferentes ensaios celulares. (1) Materiais e métodos (a) Para ensaios de titulação no equilíbrio à base de solução (SET)

[00275] O seguinte material foi usado: IL-18 humano recombinante, biotinilado (BTP25828) IL-18B de macaco cynomolgus recombinante (Novartis) Anticorpo anti-lgG humano, etiquetado com SULFO-TAG (Meso Scale Discovery (MSD) té R32AJ-5)

[00276] Fab específico anti-humano de cabra, conjugado com Éster de NHS MSD SULFO-TAG (Jackson Immuno Research % 109-005- 097, MSD %&R91AN-1) BSA (Sigma * A-9647) Tampão de leitura MSD T com surfactante (MSD tfR92TC-1) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x (Teknova tHPO195) solução salina tamponada com Tris, pH 7,5 (TBS) 10x

(Teknova tT1680) Tween-20 (Fluka 493773) Placa de microtitulação (PMT) de polipropileno (Greiner 4781280) Placas de 384 poços, padrão (MSD tL21XA) (b) Para ensaios celulares e ensaios de SET mMAb2 como descrito na seção anticorpo contra IL-18.

mMAb1 como descrito na seção anticorpo contra |L-18.

bbmAb1 como descrito no Exemplo 1.

I1L-18 humano recombinante (BTP 25829) adquirido à MBL Int. Corp. (&B001-5) IL-18 de sagui recombinante (Novartis) IL-18 de sagui recombinante (Novartis) IL-12 humano recombinante (%573008) foi adquirido à Bio- legend Linhagem de células KG-1 (ATCC tCCL-246) Fibroblastos dérmicos humanos normais (HCC-2509) foram adquiridos à Lonza Fibroblastos de pele de sagui (442637F (510)) Células HEK-Blue'" IL-18/IL-1B (Hhkb-il18) foram adquiri- das à InvivoGen PBMC foram isolados de cremes leucocitários, foram obti- dos da Blutspendezentrum Bern Sangue de sagui foi obtido da SILABE, Niederhausbergen ELISA para IL-6: Humano (BioLegend, 4430503); Sagui (U- CyTech biosciences, CT974-5) ELISA para IFNy: Humano (BD555142) e sagui (U-CyTech biosciences ttCT340A) Ensaios QUANTI-Blue'"" (tHtrep-qb1) para a detecção de SEAP foram adquiridos à InvivoGen.

Meio de células: RPMI 1640 (Invitrogen 431870) suplemen- tado com Soro Fetal de Bovino 10% (Invitrogen fH10108-157), L-

Glutamina 1% (Invitrogen f425030-03), penicilina/ estreptomicina 1% (Invitrogen tt15140-148), 2-Mercaptoetanol 10 uM (Gibco f31350-010), Hepes 5 mM (Gibco *15630-080) Placas de 96 poços de fundo redondo tratadas com cultura de tecido (Costar f43799) Placas de 96 poços de fundo plano tratadas com cultura de tecido (Costar 43596) Ficoll-Pacque'Y Plus (GE Healthcare Life Sciences 417- 1440-02) PBS 1X, sem Cálcio & Magnésio (Gibco %14190094) Tubos Leucosep com barreira porosa, 50 mL, polipropileno (Greiner bio-one 4227290) tubos cônicos de polipropileno Falcon de 15 mL (BDtt352096) Tubos cônicos de polipropileno Falcon de 50 mL (BD 4352070) (c) Medições da afinidade por SET Ensaio de ligação de alvos individuais por SET

[00277] 22 diluições em série 1,6x dos antígenos (conc. mais ele- vada: hulL-18, 5 nM; marIL-18, 10 nM; hulL-16, 0,5 NM; marIL-18, 0,5 nM) foram preparadas em tampão de amostras (PBS contendo Albu- mina de soro bovino (BSA) 0,5% e Tween-20 0,02%) e uma concen- tração constante de anticorpo foi adicionada (para leitura de I1L-18 10 PM, para leitura de IL-168 1 pM). Um volume de 60 uL/poço de cada mistura antígeno-anticorpo foi distribuído em duplicado em uma placa de microtitulação (PMT) de polipropileno de 384 poços. Tampão de amostras serviu como controle negativo e uma amostra contendo ape- nas anticorpo como controle positivo (Sinal máximo de eletroquimiolu- minescência sem antígeno, Bmax). A placa foi selada e incubada duran- te a noite (d/h, pelo menos 16 h) à temperatura ambiente (TA) em um agitador.

[00278] Leitura de IL-18: Uma PMT MSD Array de 384 poços reves-

tida com estreptavidina foi revestida com 30 ul/poço de hulL-18 bioti- nilado (0,1 ug/mL, PBS) e incubada durante 1 h à TA em um agitador.

[00279] Leitura de IL-18: Uma PMT MSD Array de 384 poços pa- drão foi revestida com 30 ul/poço de hulL-1 (3 ug/mL, PBS) diluído em PBS como agente de captura e incubada durante a noite a 4 ºC.

[00280] A placa foi bloqueada com 50 ul/poço de tampão de blo- queio (PBS contendo BSA 5%) durante 1 hora (h), à temperatura am- biente (TA). Após lavagem (TBST, TBS contendo Tween 20 0,05%), um volume de 30 uL/poço da mistura antígeno-anticorpo equilibrada foi transferido da PMT de polipropileno para a placa MSD revestida e in- cubado durante 20 min à TA. Após um passo de lavagem adicional, 30 ul de anticorpo de detecção anti-lgG etiquetado com sulfo tag (0,5 ug/mL) diluído em tampão de amostras foram adicionados a cada poço e o sistema foi incubado durante 30 min à TA em um agitador. A placa MSD foi lavada e 35 ul/poço de tampão de leitura MSD foram adicio- nados e o sistema foi incubado durante 5 min à TA. Sinais de eletro- quimioluminescência (ECL) foram gerados e medidos pelo MSD Sec- tor Imager 6000. Ensaios de ligação de alvos simultâneos por SET

[00281] O ensaio SET foi realizado como descrito acima, excetuan- do o Ensaio A: O processo de equilíbrio (mistura anticorpo/antígeno) foi realizado na presença de um excesso de um alvo (500 pM de IL18 ou IL-18) enquanto é avaliada a Kp do outro alvo. Ensaio B: O processo de equilíbrio (mistura anticorpo/antígeno) foi rea- lizado com ambos os alvos em diluições em série em uma mistura si- multaneamente (concentração constante de anticorpo 10 pM, conc. mais elevada de antígeno ver acima). A mesma mistura foi então ana- lisada quanto à sua concentração de anticorpo livre em placas revesti- das com IL18 e IL-1B como descrito acima.

[00282] Os Dados de SET foram exportados para XIfit, um software de expansão de MS Excel. Sinais médios de ECL foram calculados a partir de medições em duplicado dentro de cada ensaio. Os dados fo- ram ajustados quanto à referência por subtração do valor mais baixo de todos os pontos de dados e representados graficamente contra a concentração de antígeno correspondente para gerar curvas de titula- ção. Os valores Kp foram determinados por ajustamento do gráfico com o seguinte: modelo de ligação 1:2 para o Ab monoespecífico “Tesl 2 2076] modelo de ligação 1:1 para o Ab biespecífico nó no buraco VE Bras (FE (UP) + x + Ko - VFS FAFE aF]) | em que yY sinal de ECL com branco subtraído Bmax: — sinal de ECL máximo a concentração zero do antígeno [I9G]: concentração de anticorpo aplicada [Fab]: concentração de Fab total aplicada Ko: Constante de dissociação de equilíbrio x: concentração de antígeno aplicada (d) Cultura de células

[00283] Células KG-1 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementa- do com soro fetal de bovino 10%, L-Glutamina 1% e penicilina/es- treptomicina 1% a uma densidade de 2x10º até 1x10º células viá- veis/mL.

[00284] Fibroblastos humanos e fibroblastos de sagui normais fo- ram cultivados em FBM (Clonetics, CC-3131) incluindo bFGF (1 ng/mL, CC-4065), insulina (5 ug/ml, CC-4021) e FOCS 2% (CC-4101). Como meio de privação de nutrientes, Meio Basal de Fibroblastos (LONZA * CC-3131) foi usado.

[00285] Células HEK-Blue'" |L-18/IL-1B foram cultivadas em Meio de Crescimento (DMEM, glicose 4,5 g/L, soro fetal de bovino 10% (v/v), 50 U/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 100 mg/mL de Normocin'Y, L-glutamina 2 mM suplementado com 30 ug/mL de Blasticidina, 200 ug/mL de HygroGold'Y e 100 pug/mL de ZeocinT"Y,

[00286] Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) hu- mano foram isoladas de fresco de cremes leucocitários usando tubos LeucoSep de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 13 mL de Ficoll-Paque foram pré-carregados em um tubo LeucoSep de 14 mL por centrifugação durante 30 s a 1 000 x gq. As amostras de sangue completo heparinizado foram diluídas com volumes iguais de PBS e 25 mL do sangue diluído foram adicionados a um tubo Leuco- Sep. Os tubos de separação de células foram centrifugados durante min a 800 x g sem ruptura à temperatura ambiente. A camada de suspensão de células foi recolhida e as células foram lavadas duas vezes em PBS (durante 10 min a 640 e 470 x g, respectivamente, para as duas lavagens sucessivas) e ressuspensas em meio de cultura an- tes da contagem.

[00287] Sangue de sagui foi recolhido em tubos heparinizados e filtrado usando um coletor de células de 70 um (BD Biosciences 4352350) (e) Ensaios de neutralização de IL-18

[00288] O ensaio de produção de IL-6 induzida por IL-16 em fi- broblastos foi conduzido essencialmente como descrito (Gram 2000) apenas com modificações muito pequenas. Em resumo, fibroblastos foram semeados a uma densidade de 5x10º células por poço (em 100 uL) em uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços. No dia seguinte, as células foram privadas de nutrientes durante 5 h em meio de privação de nutrientes antes da adição da mistura de so- lução de IL-18B recombinante/composto (concentração de IL-18 indica-

da na tabela). A mistura de solução de IL-18B/composto foi preparada antecipadamente por incubação de IL-18 recombinante com uma ga- ma de concentrações de composto durante 30 min a 37 ºC. Os sobre- nadantes celulares foram recolhidos após incubação d/n a 37 ºCea quantidade de IL-6 liberada foi determinada por ELISA. O ensaio de produção de IL-6 induzida por IL-18 em PBMC foi realizado de acordo com o seguinte. PBMC foram semeados a 3x10º células por poço (em 100 uL) em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços e incubados com uma mistura de solução de |L-18 recombinante/composto durante 24 h a 37 ºC (concentração de IL-18 indicada na tabela). A mistura de solução de IL-1B/composto foi preparada antecipadamente por incuba- ção de IL-18 recombinante com uma gama de concentrações de com- posto durante 30 min a 37 ºC. Os sobrenadantes celulares foram reco- lhidos após 24 h de estimulação e a quantidade de IL-6 liberada foi determinada por ELISA. (f) Ensaios de neutralização de IL-18

[00289] O ensaio foi conduzido essencialmente de acordo com o seguinte. Células KG-1 (privadas de nutrientes durante 1 h em PBS + FCS 1% antecipadamente) ou PBMC a uma densidade de 3 x10º por poço foram semeadas em placas de cultura de células de fundo re- dondo de 96 poços e incubadas com uma mistura de solução de IL-18 recombinante/IL-12 juntamente com uma gama de concentrações de compostos (concentrações de IL-18/IL-12 indicadas na tabela). Após uma incubação de 24 h a 37 ºC, sobrenadantes foram recolhidos e a quantidade de IFNy liberado foi determinada por ELISA. Para os en- saios com sangue de sagui foram usados 85 ul de sangue por poço. (g) Neutralização de IL16/IL-18 dual em células HEK-Blue Ty

[00290] O ensaio foi conduzido essencialmente como descrito nos procedimentos de manejo do fabricante. Em resumo, as células HEK- Blue'Y foram semeadas a uma densidade de 4 x10º por poço em pla-

cas de cultura de células de 96 poços e incubadas com uma mistura de solução de IL-18 e I1L-18 recombinantes (para produzir um sinal de SEAP 1:1) em conjunto com uma gama de concentrações de compos- tos. Após uma incubação de 24 h a 37 ºC, sobrenadantes foram reco- lhidos e a quantidade de SEAP liberada foi determinada usando o mé- todo QUANTI-Blue'Y de acordo com as instruções do fabricante.

[00291] Todos os Dados foram exportados para software EXCEL e valores IC50 foram calculados representando graficamente curvas de resposta à dose para as funções logísticas de ajustamento de curvas usando software EXCEL/XLfit4 ou GraphPad Prism. (2) Resultados (a) Afinidades para IL1I68 e IL-18 humanos e de sagui recombinantes

[00292] As afinidades de ligação de bbmAb1 a proteínas IL-18 e IL- 18 humanas e de sagui recombinantes foram medidas por titulação no equilíbrio à base de solução (SET) (Figura 5) e os valores Kp gerados foram comparados com os de mAb?2 para ligação a IL-18 e mAb1 para ligação a IL-18. A Figura 5 mostra curvas de titulação de determinação da afinidade à base de ECL em solução, concentração constante de anticorpo: para a leitura de 11-18 10 pM, para a leitura de IL-168 1 pM; diluições de antígenos: conc. mais elevada: hulL-18, 5 nM; marlL-18, nM; hulL-168, 0,5 nM; marlL-18, 0,5 nM. As linhas contínuas repre- sentam um ajustamento dos dados usando o modelo descrito acima. As linhas ponteadas indicam o intervalo de confiança de 95%, n=3.

[00293] “Comparando afinidades de ligação no ensaio de ligação de alvos individuais, bbmAb1 exibiu uma KD média similar em compara- ção com mAb1 para I|L-18 humano e de sagui (Tabela 7). Para a liga- ção de IL-1B humano, o valor médio de KD foi ligeiramente mais ele- vado para bbmAb1 (2,6 pM) em comparação com mAb2 (0,6 pM) mas ainda na mesma gama de baixo pM. Medições subsequentes no en- saio de ligação dual de alvos simultâneos (Tabela 8) confirmaram que os valores KD de ligação de bbmAb1 para IL-18 foram similares a va- lores de mMAb2 com o material de qualidade pré-clínica bem como com o material de qualidade clínica. Assim, bbmAb1 possui afinidades de ligação para ambos os alvos em humanos e saguis que são similares às de mAb2 e mAb1, respectivamente. Tabela 7. Afinidades para IL-18 e I1L-18 recombinantes humanos (hu) e de sagui (mar) medidas por SET (determinação da ligação de alvos individuais) Amostras | hull-18 Ko [pM] marlL-18 Ko [DM hulL-18 Ko [DM marlL-168 Ko [DM mMAb1 9+2 21+3 na n/a mAb2 na na 0,6+0,1 1,0+0,7

[00294] Para além dos resultados de ligação de alvos individuais, afinidades de ligação dual para alvos simultâneos de bbmAb1 foram pesquisadas (Tabela 8) por aplicação de excesso de um alvo durante a avaliação dos valores Kp da ligação do outro alvo (Ensaio A) ou por aplicação de uma mistura de ambos os alvos em diluições em série (Ensaio B). A determinação da afinidade simultânea para IL-18/I1L-18 não mostrou nenhuma diferença significativa entre o Ensaio A (exces- so de um antígeno) e o Ensaio B (mistura de ambos os antígenos em diluições em série), o que provou que ambos os alvos são ligados si- multaneamente sem afetar a ligação do outro alvo. Além disso, os va- lores Kp obtidos com os ensaios de ligação dual simultânea foram si- milares aos valores Kp obtidos com o ensaio padrão (Tabela 7; na au- sência do segundo antígeno), o que provou que bbmAb1 pode se ligar a ambos os antígenos independentemente. Assim, bbmAb1 se liga si- multânea e independentemente a ambos de IL-18 e IL-18 humanos e reage totalmente de modo cruzado com as proteínas de sagui corres- pondentes.

Tabela 8. Afinidades para IL-168 e IL-18 humanos (hu) e de sagui (mar) recombinantes medidas por SET (determinação da ligação simultânea a alvos) mAb1 13,5 1114 27,1 26,3 n/a Sem na Sem [ebmabt | 148 | 195 | 479 [| 42 | 3 | os | 2 | os j (b) Neutralização da atividade de bbmAb1 em ensaios de células hu- manas e de saqui

[00295] A atividade neutralizadora de bbmAb1 para ambas as cito- cinas (IL1B e I1L-18) foi avaliada (MAb2mAb1). Adicionalmente, a po- tência de bbmAb1 para a neutralização de IL-18 e IL-18 de sagui usando sistemas de ensaios de células de sagui foi avaliada (ver se- ção d).

c) Neutralização de IL-16 e I1L-18 individual e simultânea em células humanas

[00296] A atividade neutralizadora de bbomAb1 em IL-18 foi avaliada pela inibição da produção de IL-6 induzida por IL-18 recombinante em fibroblastos dérmicos humanos (IL-18 usado a 6 pM) e em PBMC hu- manas (IL-18 usado a 60 pM). A atividade neutralizadora de bbmAb1 em IL-18 foi medida pela inibição da produção de IFN-y induzida por I1L-18 recombinante em células KG-1 e PBMC humanas (ambas as cé- lulas ativadas com IL-18 humano recombinante 3 nM em conjunto com 1 ngímL de I|L-12 humano recombinante). A potência inibidora de bbmAb1 em IL-16 e IL-18 foi sempre comparada com a de mAb2 ou mMAb1, respectivamente. Dependendo dos ensaios, os valores IC50 médios de bbmAb1 se situaram nas gamas sub-nM ou nM de um úni- co dígito e até 2 a 4 vezes mais elevadas em comparação direta com mAb?2 (para IL-18) e mAb1 (para IL-18), respectivamente (Tabela 9 e Tabela 10). O formato monovalente de bbmAb1 em comparação com o formato bivalente de mMAb2/MAb1 mas também potencialmente as mutações KiH podem ser motivos para esta ligeira diferença da potên- cia de bbmAb1. Tabela 9. Valores IC50 médios para neutralização de IL-16B por bbmAb1 em comparação com mAb2 em fibroblastos dérmicos huma- nos e PBMC humanas. *Inibição da produção de IL-6 em fibroblastos dérmicos ou PBMC humanos estimulados com IL-18 humano recom- binante (6 pM para fibroblastos dérmicos e 60 pM para PBMC). São mostrados valores médios + EPM (n=3 PBMC e n=6 fibroblastos dér- micos humanos) 1Cso [NM] 1Cso [NM] Tabela 10. Valores IC50 médios para neutralização de IL-IL-18 por bbmAb1 em comparação com mAb1 em células KG-1 e PBMC huma- nas. **Inibição da produção de IFNy em células KG-1 ou PBMC esti- muladas com IL-18 humano recombinante (3 nM) e IL-12 humano (1 ng/mL). São mostrados valores médios + EPM (n=3 KG-1 e n=4 PBMC) 1Cso [nM 1C5so [nM mAb1

[00297] bbmAb1 foi capaz de neutralizar simultaneamente a bioati- vidade de ambos de IL-18 e I1L-18, demonstrado com as células repór- ter HEK Blue'"Y produtoras de SEAP em resposta a uma estimulação 1+1 com IL-168 e IL-18 recombinantes (Tabela 11). Uma inibição simi- lar de SEAP neste sistema de ensaio só foi alcançável pela combina- ção de mAb2 e mAb1 mas não pelo uso dos anticorpos individuais. Tabela 11. Valores IC50 médios para neutralização simultânea de IL- 18 e IL-18 na atividade repórter de SEAP em células HEK Blue", São mostradas médias + EPM de n=5 experiências. (d) Atividade neutralizadora de bbmAb1 em IL-168 de saqgui e I1L-18 de sagui em ensaios de células de sagui

[00298] “Para demonstrar a atividade inibidora de bbmAb1 em sagui, ensaios in vitro similares foram realizados com células de sagui como com células humanas, no entanto usando IL -18 e I1L-18 de sagui re- combinantes para a estimulação. Ao avaliar a inibição da produção de IL-6 induzida por IL-1B recombinante de sagui em fibroblastos dérmi- cos de sagui, bomAb1 exibiu potência sub-nM com valores IC50 2 até 3 vezes mais elevados em comparação com mAb2 (Tabela 12). O tes- te de bbmAb1 com fibroblastos dérmicos humanos estimulados com IL-1B de sagui gerou um perfil de inibição similar ao de IL-6 humano. Tabela 12. Inibição da produção de IL-6 induzida por IL-18 recombi- nante de sagui em fibroblastos de sagui e humanos por bbmAb1. * Ini- bição da produção de IL-6 em fibroblastos dérmicos de sagui ou hu- manos estimulados com I|L-18 recombinante de sagui (18 pM). São mostrados resultados de 3 experiências individuais (A, Be C).

[00299] “Valores IC5O nM com um único dígito até dois dígitos de bbmAb1 confirmaram a atividade neutralizadora de bbmAb1 para IL-18 de sagui testada no ensaio de produção de IFNy com células sanguí- neas de sagui (Tabela 3 -7). O teste de bbmAb1 com PBMC humanas estimuladas com IL-18 de sagui gerou um perfil de inibição similar ao medir a produção de IFNy humano.

[00300] Assim, foi mostrado que bbmAb1 reage totalmente de modo cruzado com IL-18 de sagui e IL-18 de sagui em ensaios funcionais usando células respondedoras de sagui. Tabela 13. Valores IC50 médios para a inibição da produção de IFNy induzida por IL-18 recombinante de sagui em sangue completo de sa- gui ou PBMC humanas. ** Inibição da produção de IFNy em sangue completo de sagui (n=3 cada composto/condição) ou PBMC humanas (n=6) estimuladas com IL-18 recombinante de sagui (concentração in- dicada) & IL-12 humano (10 ng/mL). São mostrados valores médios +

EPM Ema 66sO [An

[00301] Foi demonstrado que bbmAb1, um mAb biespeciífico para IL-18/I1L-18 no formato KiH, retém a ligação com elevada afinidade bem como a potência neutralizadora de citocinas para os dois alvos individuais IL-168 e IL-18 em comparação com os mAbs originais, mAb2 e mAb1, em uma variedade de diferentes ensaios de células. As pro- priedades de neutralização dual de IL-18 e I1L-18 de bbmAb1 foram demonstradas não só para as citocinas/células humanas mas também para as citocinas/células de sagui correspondentes, facilitando estudos apropriados de toxicologia. Os valores IC50 até 2 a 4 vezes mais ele- vados que foram gerados em alguns dos ensaios celulares para neu- tralização de IL-18 e IL-18 podem ser consequência da ligação mono- valente de bbmAb1 em oposição à ligação bivalente de mAb2 e mAb1, respectivamente. Ainda assim, a neutralização dual de citocinas por bbmAb1 pode resultar em atividades inibidoras aditivas ou sinérgicas in vivo que podem não estar adequadamente representadas nos nos- sos sistemas celulares in vitro.

7. Exemplo 3: Efeitos de estimulação e bloqueio de IL-168 e I1L-18 combinados em PBMC

[00302] A clivagem dependente da ativação por inflamassomos das citocinas efetoras IL-18 e IL-18 conduz à indução de mediadores pró- inflamatórios secundários e promove o recrutamento/ativação de célu- las imunes não só de modo sistêmico mas também no sítio da infla- mação. Em dois modelos diferentes de camundongo para inflamação sistêmica letal (a) modelo de injeção de LPS e (b) camundongos FCAS (mutações de sentido trocado ativadoras em NLRP3), a ausên- cia/inibição simultâneas de IL-18 e IL-18 foi mais protetora contra leta- lidade em comparação com a ausência/inibição de IL -1B isoladamente ou IL-18 isoladamente, demonstrando mecanismos aditivos ou sinérgi- cos para ativação imune (Brydges 2013, van den Berghe 2014). bbmAb1 é um mAb biespeciífico reativo com IL-18/IL-18 humanos/de sagui sem reatividade cruzada com roedores e, assim, não pode ser testado em modelos de camundongo. Em consequência, usamos LPS/IL-12 para imitar a ativação de vias dependentes de inflamasso- mos in vitro para a estimulação de PBMC humanas com o propósito de revelar efeitos inibidores aditivos ou sinérgicos de neutralização com- binada de IL-16/I1L-18 por bbmAb1 e efetuamos uma análise não dis- torcida da expressão genética usando microarranjos. Como atividade complementar também comparamos os perfis de expressão genética de PBMC de diferentes doadores estimulados com a combinação de IL-18B recombinante e IL-18 recombinante ou as citocinas únicas isola- damente. (1) Materiais e métodos (a) Cultura de células e ELISA RPMI 1640 (Invitrogen 431870 ou Gibco t61870-010) su- plementado com Soro Fetal de Bovino 10% (Invitrogen t10108-157), L-Glutamina 1% (Invitrogen f25030-03), penicilina/ estreptomicina 1% (Invitrogen tt15140-148), 2-Mercaptoetanol 10 uM (Gibco f31350-010),

Hepes 5 mM (Gibco f15630-080) IL-18 Humano Recombinante foi adquirido à Sino Biological Inc. (H£10139-HNAE-5) IL-18 humano recombinante foi adquirido à MBL (%B001-5) IL-12 humano recombinante foi adquirido à Biolegend (4573008) ELISA para IFNy: Conjunto de ELISA para IFNy humano MAX Standard, BioLegend, ft430103 ou BD OptEIA, BD tt555142 ELISA para IL-6: Conjunto MAX Standard, BioLegend, H430503 ELISA para |L-26: Cloud Clone Corp %SEB695Hu mMAb2 como descrito na seção anticorpo contra IL-1B.

mMAb1 como descrito na seção anticorpo contra |L-18.

bbmAb1 como descrito no Exemplo 1.

LPS de Salmonella enterica serótipo enterítidis, Sigma HL7770 PBMC foram isoladas de cremes leucocitários que foram obtidos da Blutspendezentrum Bern Placas de 96 poços de fundo redondo tratadas com cultura de tecidos (Costar 43799) Placas de 96 poços de fundo plano tratadas com cultura de tecidos (Costar 43596) Ficoll-Pacque "“Plus (GE Heal- thcare Life Sciences *%17-1440-02) PBS 1X, sem Cálcio & Magnésio (Gibco ft14190094) Tubos cônicos de polipropileno Falcon de 15 mL (BDtt352096) Tubos cônicos de polipropileno Falcon de 50 mL (BD 4352070) Tubos LeucosepTM com barreira porosa, 50 mL, Greiner bio-one tt227290 Extrator de células de 70 uM, BD Biosciences 352350 Azul de Tripano, Sigma tt T8154

Medições do isolamento, quantidade e qualidade de RNA e qPCR: Água sem nucleases, Ambion %AM9938 Rnase Zap, Ambion tAM9780 Tubos Eppendorf de 1,5 mL, esterilizados, sem Rnase & Dnase Tampão RLT, Qiagen 1015762 Kit Rneasy Mini, Qiagen tt74104 Conjunto de DNase sem RNase, Qiagen tft79254 Kit Agilent RNA 6000 Nano, Agilent %&5067-1511 Estação de iniciação de chips, Agilent t5065- 4401 Misturador com vórtice IKA RNaseZAPG, Ambion f9780 Bioanalisador Agilent 2100 Kit de transcrição reversa de cDNA High Capacity, Applied Biosystems, tt PN4374966 Tubos de PCR de 0,2 mL com Tampa congelada e Paredes Finas sem Nase, Ambion %AM12225 Placa reacional de 384 poços MicroAmp Optical, Applied Biosystems f%4309849 Mistura TaqMan GenEx Master, Applied Biosystems H4369514 Iniciador de PCR (Applied Biosystems) RPL27

[00303] Preparação de PBMC: PBMC foram isoladas de creme leucocitário através de centrifugações com gradiente de Ficoll-Paque em tubos Leucosep de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 15 mL de Histopaque foram colocados em tubos LeucosepTM de 50 mL e centrifugados durante 30 s a 1300 rpm à TA. Com uma pipeta, 30 mL de uma suspensão diluída do creme leucocitário foram adicionados ao topo da solução de Histopaque e centrifugados durante 15 min à TA a 1000 g sem ruptura. Plasma foi descartado (aprox. 20 mL) e o anel da interface foi recolhido (=-PBMC humanas) e transferido para um tubo Falcon de 50 mL. O tubo foi cheio com 50 mL de PBS esterilizado e centrifugado uma vez a 1200 rpm durante 5 min à TA. Esta centrifugação foi repetida 2 vezes. O sobrenadante foi suavemen- te descartado e células foram ressuspensas em 50 mL de PBS com FCS 2% e EDTA 2 mM. A suspensão de células foi filtrada usando um coletor de células de 70 um e células foram contadas usando colora- ção com azul de tripano (500 uL de azul de tripano + 200 uL de células + 300 ul de PBS).

[00304] Estimulação por LPS/IL-12 de PBMC: A produção de citoci- nas em sobrenadantes foi preparada de acordo com o seguinte. 250 000 células/poço em 100 uL de volume final foram distribuídas em pla- cas de fundo redondo de 96 poços. LPS foi usado a concentrações entre 0,3 ug/mL e 3000 ug/mL juntamente com IL-12 recombinante a ng/mL. Sobrenadantes foram recolhidos passadas 24 ha 37 “Ce 10% de CO».

[00305] A extração de RNA de péletes celulares foi realizada de acordo com o seguinte. 3x10º células/poço em um volume final de 1000 uL foram distribuídas em placas de fundo plano de 24 poços. LPS foi usado a 3 ug/mL juntamente com IL-12 recombinante a 10 ng/mL. As células foram recolhidas após 24 h a 37 ºC e 10% de CO».

[00306] Estimulação de PBMC com citocinas recombinantes: 7x10º PBMC por poço de uma placa de 12 poços foram usadas em 1,5 mL final de meio RPMI completo. Citocinas recombinantes foram adicio- nadas às seguintes concentrações finais: 10 ng/mL de IL-18 recombi-

nante, 3 nM de IL-18 recombinante, 1 ng/mL de IL-12 recombinante. Sobrenadantes bem como células foram recolhidos passadas 4 h e 24 h a 37 ºC e 10% de CO».

[00307] Avaliações do isolamento, quantidade e qualidade de RNA: Células foram peletizadas e o pélete foi lisado em 350 ul de tampão Qiagen RTL com B-mercaptoetanol 2% e congelado a -20 ºC ou -80 ºC até todas as amostras do estudo terem sido recolhidas. O isolamento de RNA foi efetuado usando o protocolo padrão da Qiagen. Em resu- mo, 350 uL de Etanol 70% foram adicionados a todas as amostras an- tes da transferência para a coluna de rotação RNeasy e centrifugados durante 15 s a 8000 g. Depois de descartar o fluxo, 350 ul de tampão RW1 foram adicionados e a coluna foi centrifugada durante 15 s a 8000 g para lavar a membrana da coluna de rotação. Solução de mis- tura de incubação de DNase | foi preparada de acordo com as instru- ções do fabricante e adicionada à coluna de rotação RNeasy e incu- bada durante 15 min à TA. Após lavagens com 350 uL e 500 ul de tampão RW1, a coluna de rotação RNeasy foi colocada em um novo tubo de recolha de 2 mL e centrifugada à velocidade máxima durante 1 min. RNA foi finalmente recolhido por adição de 35 ul. de água sem RNase diretamente à membrana da coluna de rotação e uma centrifu- gação durante 1 min a 8000 g para eluir o RNA. A quantidade de RNA foi medida usando Nanodrop ND-1000 e o RNA foi armazenado a -20 ºC. Medições de RIN foram efetuadas para avaliação da qualidade do RNA de acordo com instruções do fabricante. Em resumo, 1 ul de RNA ou marcador de tamanho escalonado foi pipetado para um chip Agilent RNA 6000 Nano e medido usando o Bioanalisador Agilent

2100.

[00308] —Análiseda expressão genética de citocinas por qPCR:

[00309] O método foi realizado correspondendo às instruções do fabricante. Em resumo, 400 ng de RNA foram transcritos de modo re-

verso de acordo com as instruções usando o Kit de Transcrição Re- versa de cDNA High-Capacity. As soluções de cDNA foram diluídas 1/10 em água sem RNA/DNA e 1 uL de cDNA foi transferido para uma placa reacional de 384 poços e então misturado com 1 ul de gene FAM-alvo 20X do TaqManO Gene Expression Assay e 10 ul de 2x Mistura TaqManO Gene Expression Master e 10 ul de água sem RNA/DNA. A placa foi carregada no Sistema de PCR em Tempo Real Applied Biosystems ViiA'"Y 7 e foram usados os seguintes parâmetros do instrumento: Ciclo (40 ciclos) 95 oo

[00310] Os genes domésticos usados para este estudo foram HPRT1 e RLP27. A seguinte fórmula foi usada para calcular os níveis de expressão relativa de genes-alvo: 1) Ct[Ref] = (Ct [HPRT1] + Ct [RLP27]) /2 2) dCt[Ref] = 40 — Ct [Ref] 3) dCt [Alvo] = Ct [Alvo] — Ct [Ref] 4) ddCt=dCt [Ref] - dCt [Alvo] 5) Expressão relativa de genes-alvo = 2ºddCt

[00311] —“Microarranjos foram conduzidos de acordo com o seguinte. Amostras foram processadas por CiToxLAB France em microarranjos Affymetrix HG U133 Plus2. Foram normalizadas quanto ao RMA e analisadas em GeneSpring 11.5.1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Foi efetuada análise de vias usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA) e Nextbio (Ilumina). Os dois conjuntos de dados foram tratados independentemente.

[00312] Inicialmente, os dados foram sujeitos a controle de qualida- de (QC) padrão por CiToxLAB, QC interno usando um script R (MA AffyQC.R) no conjunto Rstudio e em GeneSpring (PCA, controles de hibridação). Subsequentemente foram filtrados para eliminar níveis de expressão não fiáveis: Entidades (conjuntos de sondas) foram man- tidas quando pelo menos 100 por cento de amostras em qualquer 1 das condições experimentais têm valores acima do 20º percentil.

[00313] Genes diferencialmente expressos (DEG) foram identifica- dos usando a ferramenta "filter on volcano plot" em GeneSpring. Usando os genes filtrados (expressão entre os 20,0 - 100,0º percentis) com um teste T não emparelhado, conjuntos de sondas com um valor p corrigido menor do que 0,05 e uma alteração do número de vezes maior do que 2,0 foram considerados diferencialmente expressos. Quando possível, isto é, no estudo com LPS (NUID-0000-0202-4150), foi usada uma Correção de Testes Múltiplos de Benjamini-Hochberg.

[00314] Para experiências de estimulação de citocinas, a sinergia foi calculada usando a seguinte fórmula: Sinal A+B / (Sinal A + Sinal B - Controle) 21,5

[00315] As respectivas assinaturas (ou listas de DEG) foram usadas para calcular valores p com um teste exato de Fisher que representam a significância estatística de observar uma sobreposição entre a assi- natura e a lista de genes de doença' (com lesões versus sem lesões) de conjuntos de dados públicos. Para este propósito, as listas foram carregadas no lllumina Base Space Correlation Engine (anteriormente Nextbio) e comparadas usando a ferramenta Meta-Analysis e pesquisa de palavras-chave para doenças.

[00316] Todos os Dados foram exportados para software EXCEL e valores ICso foram calculados representando graficamente curvas de resposta à dose para as funções logísticas de ajustamento de curvas usando software EXCEL/XLfit4 ou GraphPad Prism. Diferenças entre grupos de tratamento foram analisadas por ANOVA de uma via segui- do de comparação múltipla de Dunnett usando software GraphPad Prism e os resultados foram considerados estatisticamente significati-

vos a p < 0,05. (2) Resultados (a) bbmAb1 é altamente eficaz na inibição da produção de IFNy indu- zida por LPS/IL-12 em sangue completo

[00317] A exposição de sangue completo humano a LPS suplemen- tado com 10 ng/mL de IL-12 resulta em uma resposta de IFNy que é largamente mas não exclusivamente dependente do IL -18 "nativo" produzido pelas células sanguíneas. A adição de |L-12 intensifica as respostas de IFNy induzidas por LPS, provavelmente por sobrerregu- lação de receptores de IL-18 em células respondedoras.

[00318] Nas condições experimentais usadas, a neutralização de IL-18 com mAb1 conduziu a uma inibição apenas incompleta da pro- dução de IFNy, ao passo que o bloqueio de I|L-18 (usando mAb2) só teve efeitos pequenos na resposta de IFNy. É interessante notar que a inibição combinada de IL-18 e I1L-18 por bbmAb1 ou pela combinação de mAb2 e mAb1 inibiu de modo mais profundo e completo a produção de IFNy em comparação com a neutralização de citocinas isoladas (Figura 6). A Figura 6 mostra inibição de IFNy induzido por LPS (0,3 uvg/mL) / IL-12 em sangue completo por bbmAb1, mAb2, mAb1 ou mMAb2 & mAb1 combinados (Combo) (curva de inibição típica mostrada na Figura 6A). Percentagem de inibição de IFNy de n=4 doadores indi- viduais em sangue completo por bbmAb1, mAb1 ou mAb2 usados a 100 nM (média e EPM mostrados na Figura 6B).

[00319] Para além de IFNy, nenhuma das outras citocinas testadas (I1L-2,-4,-6,-8,-10,-13 e TNFa) foi aditivamente inibida pela neutraliza- ção combinada de IL-18 e IL-18 no nosso ensaio de células (dados não mostrados). A potência de bbmAb1 se situou na mesma gama da potência da combinação (combo) de mAb2 e mAb1, considerando o formato monovalente da molécula biespecífica. (b) IFNy é aditivamente inibido por bbmAb1 (isto é, inibição de |IL-

168/1L-18 combinada) em comparação com inibição de I|L-168 ou IL-18 isoladamente em PBMC humanas ativadas com LPS/IL-12

[00320] Foi requerida uma avaliação transcriptômica não distorcida para revelar outros efeitos aditivos (para além de IFNy) por inibição de IL-18/I1L-18 combinada usando bbmAb1. Uma vez que sangue comple- to não é ótimo para análise transcriptômica, adaptamos as condições do ensaio de estimulação com LPS/IL-12, descrito na seção materiais e método acima, a amostras de PBMC humanas. Usando PBMC de um total de 9 doadores, pudemos confirmar que bbmAb1 inibiu aditi- vamente a secreção da proteína IFNy para os sobrenadantes das PBMC (Figura 7). Em comparação com experiências com sangue completo, a produção de IFNy foi inibida a concentrações aproxima- damente 10 vezes menores dos respectivos mAbs usados. É impor- tante notar que foi demonstrado um padrão de inibição similar ao nível do mRNA para IFNy (Figura 7), que confirmou a adequação das amos- tras para uma análise não distorcida da expressão genética baseada em microarranjos. A Figura 7 mostra a inibição da produção de proteí- na IFNy induzida por LPS (0,3 ug/mL) /IL-12 (Figura 7A) e expressão genética de IFNy (Figura 7B) por bbmAb1, mAb2 e mAb1 (a conc. 10 NM cada) em PBMC humanas. É mostrada a percentagem de inibição em n=9 doadores + EPM. ***p < 0,05 (ANOVA de uma via)

[00321] O microarranjo Affymetrix foi conduzido com n=5 doadores individuais a partir de PBMC que foram submetidas a amostragem das experiências de estimulação com LPS/IL-12 descritas na seção mate- rialis e método acima. Infelizmente, a avaliação global dos perfis de expressão genética evidenciou um forte efeito de estimulação por LPS/IL-12 e o PCA mostrou agrupamento por doador em vez de com- posto dentro dos grupos estimulados ou não estimulados. Ainda as- sim, a comparação das amostras estimuladas com LPS/IL-12 com as estimuladas mais bbmAb1 quanto a genes diferencialmente expressos revelou uma lista curta de genes que são sub-regulados pelo bloqueio combinado de IL-18/IL-18 com bbmAb1 (Tabela 14). Para além da for- te sub-regulação do gene IFNy que revalidou os nossos dados de mi- croarranjos, também o gene I|L-26 foi outro gene de citocina inibido de modo aditivo por bomAb1 em comparação com a inibição de IL-18B (por mMAb?2) ou inibição de 11-18 (por mAb1) isoladamente (ver Figura 8). À Figura 8 e Figura 9 mostram níveis de expressão genética derivados de dados de microarranjos para IFNy e 11-26 e a inibição por bbmAb1, mAb2 e mAb1 (10 nM cada) em PBMC estimuladas com LPS (0,3 ug/mL) / IL-12 às 24 h.

Os valores de doadores individuais são mos- trados na Figura 8A (IFNy) e Figura 8B (IL-26) e a percentagem de ini- bição (média + EPM) dos n=5 doadores é mostrada na Figura 9A (IFNy) e Figura 9B (IL-26). Tabela 14. Genes diferencialmente expressos (apenas genes sub- regulados entre o grupo de bbmAb1 e de controle em amostras esti- muladas com LPS/IL-12). FC= alteração em número de vezes.

Conjunto de Sondas ID ímbolo do Gene Entrez Gene Nalor p FC 1222974 at IL22 50616 0,03188 6,6 1223939 at UCNR1 56670 0,00234 4,0 211122 s at XCL11 6373 0,02954 B5 1203915 at XCL9 4283 0,02211 BA essa aa ag be B3 | Bossa at ENG O pB58 hboonoor bo | 1236003 x at OR2N1P 0,04942 4 1201860 s at PLAT 5327 0,00139 3 1205692 s at D38 952 10,04855 3 1215305 at PDGFRA 5156 0,01180 2 BBB Ta a bo4o37 bP1 | 1204533 at XCL10 B627 0,04847 1 1229915 at FAM26F 441168 0,02912 o BIOOT2 at kama ks bos bo | ese tata bos2a6 bo | (c) 11-26 é outra citocina pró-inflamatória aditivamente inibida por bbmAb1 em PBMC estimuladas com LPS/IL-12

[00322] Para confirmar adicionalmente que a expressão genética e produção de proteína IL-26 conduzida por LPS/IL-12 é muito eficien- temente inibida por bloqueio de IL-18/IL-18 combinado usando bbmAb1, o estudo foi estendido a um total de n=9 doadores de PBMC e pesquisou a expressão genética de I|L-26 por qPCR e produção da proteína 11-26 por ELISA. Como mostrado na Figura 10, confirmou amplamente a inibição da expressão genética de IL-26 obtida com a abordagem de microarranjos (Figura 10A). É interessante notar que os níveis de proteína IL-26 em sobrenadantes foram apenas parcialmente reduzidos às 24 h pela adição dos mAbs (Figura 10B). Os motivos pa- ra estas diferenças são desconhecidos, no entanto podem estar rela- cionados com diferenças cinéticas entre a expressão genética de IL-26 e produção de proteína bem como diferenças no consumo de IL-26 em comparação com IFNy. Ainda assim, bbmAb1 foi superior na redução dos níveis da proteína I1L-26 nos sobrenadantes de PBMC em compa- ração com mAb2 e mAb1. A Figura 10 mostra a inibição da expressão genética de I1L-26 induzida por LPS (0,3 ug/mL) /IL-12 (por qPCR) (Fi- gura 10A) e níveis da proteína I1L-26 (Figura 10B) por bbmAb1, mAb2 e mMAb1 (10 nM cada) em PBMC humanas. Percentagem de inibição de n=9 doadores de PBMC individuais (média e EPM). ***p < 0,05 (ANO- VA de uma via).

(d) Assinaturas de sinalização de IL1 B /IL18 estão correlacionadas com doença

[00323] As condições de cultura de PBMC previamente estabeleci- das quando a estimulação de IL-18 recombinante resultou em produ- ção de IL-6 ou estimulação de I|L-18/IL-12 recombinantes resultou em produção de IFNy foram combinadas para revelar genes-alvo ou assi- naturas a jusante aditivos ou sinérgicos (dados não mostrados). Com PBMC de n=4 doadores submetidos a amostragem em dois instantes diferentes (6 h e 24 h) foi conduzida uma avaliação de microarranjos

Affymetrix para estabelecimento não distorcido dos perfis de expres- são genética.

Foram revelados genes que foram sinergicamente so- brerregulados às 6 h e às 24 h com a estimulação combinada por IL- 18 e IL-18 (dados não mostrados). A adição de |L-12 à combinação |IL- 1B8/IL-18 aumentou amplamente a sinergia para uma série de genes sobrerregulados.

As assinaturas de sinalização geradas de estimula- ção da via de IL -18/I1L-18 isoladamente ou combinados (apenas genes sobrerregulados) foram usadas para interrogar conjuntos de dados de pacientes através de várias doenças autoimunes.

Por exemplo, a cor- relação com conjuntos de dados públicos de sarcoidose é mostrada como exemplo na Figura 11. Os valores p (calculados com um teste exato de Fisher) mostram uma correlação significativa com vários es- tudos públicos comparando tecidos saudáveis com doentes de pacien- tes com sarcoidose.

Tecidos incluem pele, bem como pulmão, glându- las lacrimais e órbita anterior.

Através de todos os conjuntos de dados, a combinação de sinalização de IL1 B /IL18 mostra a melhor correla- ção com doença, seguido de IL-18 e IL-18. Genes diferencialmente sobrerregulados (DEG) de I|L-18/IL-18 em PBMC (eixo x) em compara- ção com 5 DEG diferentes de tecido de sarcoidose “doente versus saudável". Os valores p (eixo y) representam a significância estatística da observação de uma sobreposição entre a assinatura e a “lista de genes de doença”. Barra negra representa pele de lesão cutânea de sarcoidose versus pele de pacientes saudáveis.

Barra cinzento claro representa pele de lesão cutânea de sarcoidose versus pele não lesio- nada.

Barra branca representa glândulas lacrimais de pacientes com sarcoidose versus normais.

Barra cinzento escuro representa tecidos da órbita anterior de pacientes com sarcoidose versus normais.

Barra riscada representa amostras de pulmão com sarcoidose pulmonar fi- brótica progressiva versus sarcoidose pulmonar autolimitante nodular. (e) Conclusão

[00324] LPS elL-12 recombinante foram usados para imitar ativa- ção de inflamassomos NLRP3 dependente do padrão molecular asso- ciado a patógenos (PAMP) nas primeiras 24 h de cultura in vitro.

Foi demonstrado que a inibição combinada de IL-1B e IL-18, usando bbmAb1, atua de modo aditivo para decrescer/inibir a produção de IFNy em PBMC estimuladas com LPS/IL-12. Foi previamente descrito que IL-12 atua de modo sinérgico com IL-18 para induzir produção de IFNy em células T, B, NK, macrófagos e células dendríticas (revisto por Nakanishi, 2001), mas agora foi possível demonstrar um efeito es- timulador adicional de IL-18 na produção de IFNy nas condições expe- rimentais usadas.

Assim, a coincubação de PBMC com LPS/IL-12 conduz eficientemente a produção de IL-18 e IL-18 "nativos" que con- tribui para uma resposta de IFNy forte.

Usando transcriptômica de mi- croarranjos não distorcida foram identificados genes adicionais que foram aditivamente sub-regulados por neutralização combinada de IL- 18/I1L-18 versus bloqueio de IL-18 ou I1L-18 isoladamente.

Entre aque- les esteve 11-26, um membro da subfamília de citocinas 11-20 (IL-19, I1L-20, 11-22, 11-24 e 11-26), que está conservado na maior parte das espécies de vertebrados mas ausente na maior parte das estirpes de roedores (incluindo camundongos e ratos) (Donnelly 2010). Sinaliza através de um complexo de receptor heterodimérico composto pelas cadeias IL-20R1 e IL-10R2. Receptores de |L-26 são majoritariamente expressos em tipos de células não hematopoiéticas, particularmente células epiteliais.

Níveis acrescidos de I1L-26 foram relatados em soro e particularmente no fluido sinovial de pacientes com RA (Corvaisier 2012), onde pode atuar como fator para promover o crescimento e di- ferenciação de células Th17. Infelizmente, a descoberta de outros ge- nes/vias induzidos pelo bloqueio combinado de IL-168 e 11-18 foi dificul- tada pelo forte efeito da estimulação com LPS/IL-12 das amostras de PBMC.

Ainda assim, IFNy e I1L-26 e, em alguma extensão, também |IL-

22 também estiveram entre os genes que foram sinergicamente so- brerregulados pela estimulação combinada com IL-18 e IL-18 recom- binantes em PBMC, confirmando que estes dois fatores são efetores a jusante nesta via de ativação. Assim, a subfamília IL-20 de citocinas (incluindo 11-26 e 11-22) aparenta depender fortemente dos sinais si- multâneos de IL-168 e I1L-18. Com todo o cuidado devido sobre seletivi- dade das assinaturas de sinalização individuais bem como eficácia po- tencial do bloqueio, estas comparações são úteis para mostrar que as vias respectivas são ativas em doenças como sarcoidose.

8. Exemplo 4: Uso terapêutico

[00325] A abordagem seletiva combinada de IL-18 e I1L-18 pode re- presentar uma estratégia de tratamento mais eficaz do que o bloqueio de citocinas isoladamente em afecções inflamatórias conduzidas por inflamassomos em que estão envolvidos componentes de imunidade inata e adaptativa. A neutralização simultânea de IL-18 e I1L-18 visa componentes de imunidade inata e adaptativa, incluindo neutrófilos, células Th1/Tc1 e NK, moléculas de adesão em células imunes e en- doteliais e citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-6, IFNy e IL-17). A vantagem do bloqueio de IL-18 e I1L-18 é suportada por dados obti- dos em um modelo pré-clínico em camundongo de Síndrome Familiar Autoimune Associada ao frio (FCAS) que é conduzida por ativação constitutiva de inflamassomo NIrp3 e sobreprodução de IL-18 e IL-18 (Brydges 2013). Aí foi alcançado um resgate parcial da afecção FCAS em camundongos quando a sinalização de IL-18 ou IL-18 sofreu abla- ção genética, demonstrando o envolvimento de ambas as citocinas na patogênese de doença. É importante notar que camundongos com FCAS sem sinalização de IL-18 e IL-18 desenvolveram ainda menos doença em comparação com camundongos nos quais apenas uma das duas citocinas foi inativada, demonstrando efeitos aditivos da neu- tralização dual de IL-168/I1L-18. Efeitos aditivos da neutralização de IL-

18 e I1L-18 também foram demonstrados em outro modelo de camun- dongo, em que doses elevadas de LPS foram injetadas em camun- dongos para causar choque séptico (van den Berghe 2014). Neste modelo, quer a deficiência genética de I|L-18 e IL-18 quer a neutraliza- ção combinada de ambas as citocinas por anticorpos neutralizadores preveniram completamente a letalidade de LPS, ao passo que a defi- ciência/neutralização de uma única citocina foi apenas parcialmente protetora.

[00326] A estratégia clínica global para um biespecífico, que visa IL- 18 e I1L-18 simultaneamente, pode representar um meio mais eficaz de tratamento do que opções correntemente disponíveis. Para identificar doenças candidatas, pesquisa pré-clínica e translacional foi utilizada para demonstrar o envolvimento ativo de IL-18 e IL-18 em vias a ju- sante na patofisiologia subjacente de doenças candidatas. Há novas evidências de que sarcoidose pulmonar crônica é uma doença condu- zida por inflamassomos com envolvimento de imunidade inata e adap- tativa. Além disso, descobertas iniciais indicam papéis importantes pa- ra as citocinas efetoras IL-18 e IL-18 nesta doença. Assim, sarcoidose representa uma oportunidade ideal para demonstrar as especificidades duais de bbmAb1 em uma doença com tecido inflamação tecidual crô- nica estabelecida. A eficácia de bbmAb1 em sarcoidose pode conduzir ao desenvolvimento em outras doenças pulmonares intersticialis como doenças pulmonares com hipersensibilidade (ocupacional) devido a sílica ou berílio. Outras doenças candidatas são inflamação granulo- matosa envolvendo outros tecidos de órgãos, tal como doença de Crohn.

[00327] Inflamação vascular com lesão tecidual e disfunção endote- lial também representa um alvo potencial para bbmAb1. Células endo- teliais disfuncionais podem responder a tratamento anti-inflamatório efetivo, resultando em fluxo vascular melhorado mesmo na presença de deficiências intravasculares fixas. Evidências recentes da literatura identificaram que doença de células falciformes (SCD) tem um forte componente conduzido por inflamassomos via taxas elevadas de he- mólise intravascular constitutiva. A ativação de inflamassomos devido a liberação de sinais de perigo (ácido úrico, heme/Fe3+, outros com- ponentes intracelulares) de lise crônica de eritrócitos desencadeia re- ceptores de inflamassomos, ativação dos mesmos e conduz a cascata inflamatória intravascular, originando sobrerregulação de moléculas de adesão de células endoteliais, ativação de neutrófilos e plaquetas, re- sultando em ativação crônica de células endoteliais. Esta inflamação vascular sem remissão em pacientes com SCD conduz a crises vaso- oclusivas dolorosas recorrentes e lesões teciduais agudas ou crônicas. Evidências internas preliminares proporcionam suporte para o envol- vimento de IL-18 bem como IL-18 no processo subjacente de doença de SCD. Assim, a redução da inflamação basal em pacientes com SCD por tratamento com bbmAb1 pode atenuar a inflamação crônica de fundo e prevenir crises agudas com lesões em órgãos terminais associados, prevenir crises agudas de células falciformes e lesões em órgãos terminais associadas, juntamente com melhoria da qualidade de vida geral dos pacientes por redução de dor e fadiga crônicas as- sociadas. A demonstração da eficácia terapêutica de bbmAb1 em pa- cientes com SCD pode conduzir a desenvolvimento em outros estados crônicos ou agudos em afecções inflamatórias crônicas envolvendo taxas elevadas de hemólise, tais como malária e doença crônica do rim dependente de hemodiálise. Outras indicações que podem benefi- ciar de modulação de IL-18 e IL-18 são indicações associadas a lesão tecidual de isquemia-reperfusão, tais como doenças cardiovasculares, ou cicatrização melhorada de feridas de todos os tipos, mas em parti- cular a lesão mais grave de tecidos moles de queimadura.

[00328] Assim, em uma modalidade da invenção, um método de tratamento de um distúrbio relacionado com inflamassomos compre- ende administrar a um sujeito, afetado com um distúrbio relacionado com inflamassomos, uma quantidade eficaz de um bbmAb revelado aqui, tal como bbmAb1. Distúrbios potenciais relacionados com infla- massomos são síndrome autoinflamatória associada a criopirina (CAPS), febre mediterrânica familiar (FMF), artrite idiopática juvenil sistêmica (SJIA), nefrite lúpica, nefropatia diabética, lesão aguda do rim, hipertensão renal, nefropatia por IgA, glomerulonefrite (GN), de- mência frontotemporal (FTD), doença de Alzheimer (AD), epilepsia, derrame cerebral, doença de Parkinson (PD), depressão, sarcoidose, tal como sarcoidose pulmonar, pancreatite, fibrose pulmonar idiopática (IPF), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), aterosclerose, arterite de células gigantes, vasculite associada a anticorpo citoplasmático anti- neutrófilos (ANCA), degenerescência macular relacionada com a idade (AMD), doença enxerto-versus-hospedeiro, diabetes tipo 2, acne, do- ença de células falciformes, vasculopatia, lesão de isquemia-re- perfusão, doença cardiovascular, doença de artéria periférica (PAD), aterosclerose, disfunção vascular, isquemia do músculo esquelético, fibrose, malária, doença crônica do rim dependente de hemodiálise ou doença de Crohn.

[00329] Em uma modalidade é proporcionado um método de tra- tamento de doença de células falciformes, vasculopatia, lesão de is- quemia-reperfusão, doença cardiovascular, doença de artéria periféri- ca, aterosclerose, disfunção vascular, isquemia do músculo esqueléti- co, sarcoidose pulmonar, fibrose, malária, doença crônica do rim de- pendente de hemodiálise ou doença de Crohn em um sujeito, por ad- ministração de uma quantidade eficaz de um bbmAb revelado aqui, tal como bbmAb1, ao sujeito.

9. Exemplo 5: Composições farmacêuticas

[00330] São proporcionadas aqui composições farmacêuticas com-

preendendo os anticorpos bbmAb, tais como bbmAb1, formulados jun- tamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. As com- posições podem adicionalmente conter um ou mais agentes terapêuti- cos diferentes que são adequados para o tratamento de uma afecção médica. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis intensificam ou estabilizam a composição, ou podem ser utilizados para facilitar a pre- paração da composição. Transportadores farmaceuticamente aceitá- veis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis.

[00331] Uma composição farmacêutica descrita aqui pode ser ad- ministrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. À via e/ou o modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É preferencial que a administração seja intravítrea, intrave- nosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea ou administrada próximo do sítio do alvo. O transportador farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravítrea, intravenosa, intra- muscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exem- plo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, bbmAb, pode ser revestido em um material pa- ra proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00332] A composição deve ser esterilizada e fluida. A fluidez apro- priada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, é pre- ferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio, na composição. A ab- sorção de longa duração das composições injetáveis pode ser provo- cada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[00333] Composições farmacêuticas descritas aqui podem ser pre- paradas de acordo com métodos bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Ver, por exemplo, Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", Mack Publishing Co., 20º edição, 2000; e "Sus- tained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, editor, Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1978. As composições far- macêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições GMP. Ti- picamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do bbmAb é empregue nas composições farmacêuticas descritas aqui. Os bbmAbs são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos peritos na téc- nica. Os regimes de dosagem são ajustados de modo a proporciona- rem a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêuti- ca). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formu- lar composições parentéricas em forma unitária de dosagem para faci- lidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, como usado aqui, refere-se a unidades fisicamente dis- cretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a se- rem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico deseja- do em associação com o transportador farmacêutico requerido.

[00334] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas com- posições farmacêuticas descritas aqui podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores far- macocinéticos incluindo a atividade das composições particulares des- critas aqui, ou seu éster, sal ou amida, a via de administração, o mo- mento de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregue, a duração do tratamento, outros fármacos, compos- tos e/ou materiais usados em combinação com as composições parti- culares empregues, a idade, sexo, peso, afecção, estado geral de sa- úde e histórico médico prévio do paciente sendo tratado e fatores simi- lares.

[00335] Um médico ou veterinário pode começar com doses dos anticorpos descritos aqui empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido para alcançar o efeito terapêuti- co desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito de- sejado seja alcançado. Em geral, doses eficazes das composições descritas aqui para o tratamento de distúrbios de emaciação aqui des- critos variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio-alvo, estado fisiológico do paciente, se o paci- ente é humano ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Para administração sistêmica com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e, mais habitualmente, de 0,01 a 15 mg/kg de peso corporal do hospedeiro. Para administração intravítrea com um anticorpo, a dosagem pode variar desde 0,1 mg/olho até 5 mg/olho. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração sis- têmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Um regime de tratamento exemplificativo im- plica a administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses, ou conforme necessário (PRN).

[00336] Agentes terapêuticos biológicos, tais como bbmAb1, são habitualmente administrados em múltiplas ocasiões. Os intervalos en- tre dosagens únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os in- tervalos também podem ser irregulares, como indicado por medição de níveis no sangue de bbmAb1 no paciente. Além disso, intervalos de dosagem alternativos podem ser determinados por um médico e admi- nistrados mensalmente ou conforme necessário para serem eficazes. Em alguns métodos de administração sistêmica, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 upg/mL e, em alguns métodos, 25-500 pg/mL. Alternativamente, o anti- corpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sus- tentada, caso em que é necessária administração menos frequente. À dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticor- po no paciente. Em geral, anticorpos humanos exibem meia-vida mais longa do que anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A do- sagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativa- mente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns paci- entes continuam recebendo tratamento ao longo do resto de suas vi- das. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos é por vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada e de preferência até que o paciente mostre uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, ao paciente pode ser administrado um re- gime profilático.

TABELA DE SEQUÊNCIAS

[00337] Sequências de aminoácidos e nucleotídeos úteis para pôr em prática a invenção são reveladas na Tabela 15.

Tabela 15. Sequências de acordo com modalidades da invenção

PR | EEE SEQ ID NO: 7 VA EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG

TFKSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPM TGQTYYAQKFOQGRVTITADESTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARAAYHPLVFD

NWGOGTLVTVSS SEQ ID NO: 8 VH de DNA GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCEC

CGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCG TGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGC GGCACCTTCAAGAGCTACGCCATCAGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGE GCCTGGAGTGGATGGGCAACATCATC CCCATGACCGGCCAGACCTACTACGC CCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACC ATCACCGCCGACGAGAGCACCAGCA CCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCT GAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGCCGCCTACCACC CCCTGGTGTTCGACAACTGGGCCAGG

GCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 9 Cadeia Pesada EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG

TFKSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPMT GQTYYAQKFQGRVTITADESTSTAYMEL SSLRSEDTAVYYCARAAYHPLVFDNWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKRV EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK

LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY SEQ ID NO: 10 Cadeia Pesada de GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCG- DNA CCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAG-

CGTGAAGGTG AGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCAC- CTTCAAGAGCTACGCCATCAGCTGGG- TGAGGCAGGCC CCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGA- TGGGCAACATCATCCCCATGACCGG- CCAGACCTACTAC GCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGA- CCATCACCGCCGACGAGAGCACCAG- CACCGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAG- CGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCG- CCAGGGCCGCC TACCACCCCCTGGTGTTCGACAAC- TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG- TGAGCAGCGCC AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTT- CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG- CACCAGCGGCGGC ACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGG- TGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG- TGACCGTGAGCTGG AACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCG- TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCA- GAGCAGCGGC CTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGAC- CGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC- CCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAG- CAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTG-

GAGCCCAAG AGCTGCGACAAGACCCACACCTG- CCCCCceTtGccceGccocosAaGE-

CCGCCGGCGEGCCCCE AGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAG- GACCCCCGAG GTGACCTGCGTGGTGGTGGACG- TGAGCCACGAGGACCCCGAGG- TGAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACG- CCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCA- GTACAACAGC ACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGAC- CGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGG- CCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGAC- CATCAGCAAG GCCAAGGGCCAGCCCAGGGAG- CCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAG- CAGGGAGGAGATG ACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTG- CCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAG-

CGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG- CCCGAGAACAACTACAAGACCAC- CCCCccesteCtTÇS GACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTA- CAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAG-

CAGGTGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCG- TGATGCACGAGGCCCTGCACAACCAC- TACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGG-

CAAG SEQ ID NO: 17 vL DIVLTQPPSVSGAPGORVTISCSGSSS- NIGNHYVNWYQQLPGTA- PKLLIYRNNHRPSGVPDRFSGSKSG- TSASLAITGLOSEDEADYYCQSWDYSG-

FSTVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 18 VL de DNA GATATCGTCCTGACTCAGCCCCCTAG- CGTCAGCGGCGCTCCCGGTCA- GAGAGTGACTATTAGCTGTAGCGG- CTCTAGCTCTAATATCGGTAATCAC- TACGTGAACTGGTATCAGCAGCTG- CCCGGCACCGCCCCTAAGCTG-

CTGATCTATAGAAACAATCACCGGCCT AGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGG ATCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTC TGGCTATCACCGGACTGCAGTCAGAG GACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTC CTGGGACTATAGCGGCTTTAGCACCG TGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACC

GTGCTG SEQ ID NO: 19 Cadeia Leve DIVLTQOPPSVSGAPGORVTISCSGSSSNI

GNHYVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNHRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLOSEDEA DYYCOSWDYSGFSTVFGGGTKLTVLGQO PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETT TPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 20 Cadeia Leve de | GATATCGTCCTGACTCAGCCCCCTAGC

DNA GTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGT GACTATTAGCTGTAGCGGCTCTAGCTC TAATATCGGTAATCACTACGTGAACTG GTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCC CCTAAGCTGCTGATCTATAGAAACAAT CACCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATA GGTTTAGCGGATCTAAGTCAGGCAC TAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGAC TGCAGTCAGAGGACGAGGCCGACTAC TACTGTCAGTCCTGGGACTATAGCGG CTTTAGCACCGTGTTCGGCGGAGGEC ACTAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCC TAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTG TTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTG CAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTG TGCCTGATCAGCGACTTCTACCCAGG CGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCC GACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCG- TGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCA- GAGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCA- GCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAG- TGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTG- CCAGGTGACCCACGAGGGCAGCAC- CGTGGAAAAGACCGTGGCCCCAAC- CGAGTGCAGC [E

SEQ ID NO: 27 vH QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAII- WYDGDNQYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCAR-

DLRTGPFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 28 VH de DNA CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGG- CGGCGGCETGGTEGCAGCCCGGCAG- GAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCG- CCAGCGGCTTCACCTTCAGCGTG- TACGGCATGAACTGGGTGAGGCAGG- CCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGG- TGGCCATCATCTGGTACGACGGCGA- CAACCAGTACTACGCCGACAGCG- TGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGG- GACAACAGCAAGAACACCCTGTAC- CTGCAGATGAACGGCCTGAGGG- CCGAGGACACCGCCGTGTACTACTG-

CGCCAGGGACCTG AGGACCGGCCCCTTCGACTAC- TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG-

TGAGCAGC SEQ ID NO: 29 Cadeia Pesada QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAII- WYDGDNQYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCAR- DLRTGPFDYWGQGTLVTVSSASTKG- PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC- NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD- KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK- FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSN- KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL- PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSKLTVDKSRWQQGN-

Eee TE FF SEQ ID NO: 30 Cadeia Pesada de CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGG- DNA CEGGCGGCETGGTECAGCCCGGCAG-

GAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTT- CAGCGTGTACGGCATGAACTGGG- TGAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTEGGAGTGGGTGGÇ- CCATCATCTGGTACGACGGCGACAAC- CAGTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTT- CACCATCAGCAGGGACAACAG- CAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACGGCCTGAGGG- CCGAGGACACCGCCGTGTACTACTG- CGCCAGGGACCTG AGGACCGGCCCCTTCGACTAC- TGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG- TGAGCAGCGCCAGC ACCAAGGGCCCCAGCGTGTT- CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG- CACCAGCGGCGGCACC GCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAG- GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG- TGAGCTGGAAC AGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGE- CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAG- CAGCGGCCTG TACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG- TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCA- GACCTACATC TGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAA- CACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAG-

CCCAAGAGC TGCGACAAGACCCACACCTG- CCCCCceteccocoGccococAGCTE-

CTGGGCGGCCCCAGC GTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAG- GACCCCCGAGGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAG- CCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTT- CAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCACAACG- CCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCA- GTACAACAGCACC TACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCG- TGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGG- CAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTGAGCAACAAGG- CCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGAC- CATCAGCAAGGCC AAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGG- TGTACACCCTGCCCCCCAGCAGGGA- GGAGATGACC AAGAACCAGGTGAGCCTGACCTG- CCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAG-

CGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAG- CCCGAGAACAACTACAAGACCAC- CCCCCccGTGCTGGAC AGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAG- CAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGG-

TGGCAGCAG GGCAACGTGTTCAGCTGCAGCG- TGATGCACGAGGCCCTGCACAACCAC- TACACCCAGAAG

AGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG Foro IEA SEQ ID NO: 37 VvL EIVLTOSPDFQSVTPKEKVTITCRAS- QSIGSSLHWYQQKPDOSPKLLIKYASQS- FSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAE-

DAAAYYCHOSSSLPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO: 38 VL de DNA GAGATCGTGCTGACCCAGTCACCCGA- CTTTCAGTCAGTGACCCC- TAAAGAAAAAGTGACTATCACCTG- TAGGGCCTCCCAGTCTATCGGCTC- TAGCCTGCACTGGTATCAGCAGAAG- CCCGATCAGTCACCTAAGCTGCTGAT- TAAGTACGCCTCTCAGTCCTTTAG- CGGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGCT- CAGGCTCAGGCACCGACTTCAC-

CCTGACTATCAATAGCCTGGAAG- CCGAGGACGCCGCTGCCTACTACTGT- CATCAGTCAAGTAGCCTGCCCTTCAC- CTTCGGCCCTGGCACTAAAGTGGATA-

TTAAG SEQ ID NO: 39 Cadeia Leve EIVLTOSPDFQSVTPKEKVTITCRAS- QSIGSSLHWYQQKPDOSPKLLIKYASQOS- FSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAE- DAAAYYCHOSSSLPFTFGPGTKV- DIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSKDSTYS-

LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSS

PVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 40 Cadeia Leve de) GAGATCGTGCTGACCCAGTCACCCGA- DNA CTTTCAGTCAGTGACCCC- TAAAGAAAAAGTGACTATCACCTG- TAGGGCCTCCCAGTCTATCGGCTC- TAGCCTGCACTGGTATCAGCAGAAG- CCCGATCAGTCACCTAAGCTGCTGAT- TAAGTACGCCTCTCAGTCCTTTAG- CGGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGCT- CAGGCTCAGGCACCGACTTCAC- CCTGACTATCAATAGCCTGGAAG- CCGAGGACGCCGCTGCCTACTACTGT- CATCAGTCAAGTAGCCTGCCCTTCAC- CTTCGGCCCTGGCACTAAAGTGGATA- TTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAG- CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGA- CGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCG- CCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAAC- TTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTG- CAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG- CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCG- TCACCGAGCAGGACAGCAAGGAC- TCCACCTACAGCCTGAGCAGCAC- CCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC- TACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTG- CGAGGTGACCCACCAGGGCCTG- TCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAA-

CAGGGGCGAGTGC | seganda parto derme

SEQ ID NO: 53 vH QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAII- WYDGDNQYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCAR-

DLRTGPFDYWGOQGTLVTVSS SEQ ID NO: 54 VH de DNA CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGG- CGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGTAGA- TCACTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAG- TGGCTTCACCTTTAGCGTCTACGGAA- TGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGG- GAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCAATTA- TCTGGTACGACGGCGATAATCAGTAC- TACGCCGATAGCGTGAAGGGACGGTT- CACTATCTCTAGGGATAACTCTAAGAA- CACCCTGTACCTGCAGATGAACGG- CCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTC- TACTACTGCGCTAGGGACCTGAGAAC- CGGCCCCTTCGACTACTGGGGACA-

GGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 55 Cadeia Pesada QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAII- WYDGDNQYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYLOMNGLRAEDTAVYYCAR- DLRTGPFDYWGQGTLVTVSSASTKG- PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC- NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD- KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK- FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSN-

KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL- PPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLVSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 56 Cadeia Pesada de | CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGG- DNA CGGCEGAGTGGTGCAGCCTGGTAGA- TCACTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAG- TGGCTTCACCTTTAGCGTCTACGGAA- TGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGG- GAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCAATTA- TCTGGTACGACGGCGATAATCAGTAC- TACGCCGATAGCGTGAAGGGACGGTT- CACTATCTCTAGGGATAACTCTAAGAA- CACCCTGTACCTGCAGATGAACGG- CCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTC- TACTACTGCGCTAGGGACCTGAGAAC- CGGCCCCTTCGACTACTGGGGACA- GGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAG- CGCCTCTACTAAGGGCCCAAGCGTG- TTCCCCCTGGCCCCTAGCTCTAAGTC- TACTAGCGGAGGCACCGCCG- CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC- TTCCCCGAGCCCGTGACCGTCAGCTG- GAATAGCGGCGCTCTGACTAGCGGAG- TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG- TCTAGCGGCCTGTATAGCCTGTCTAG- CGTCGTGACCGTGCCTAGCTCTAG- CCTGGGCACTCAGACCTATATCTG- TAACGTGAACCACAAGCCCTCTAACA- CTAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACC- TAAGTCCTGCGATAAGACTCACAC- CTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGG- CTGCCGGAGGACCTAGCGTGTTCCTG- TTCCCACCTAAGCCTAAAGACAC- CCTGATGATCTCTAGGACCCCCGAAG- TGACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCA- CACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTTAA- TTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG- CACAACGCTAAGACTAAGCC- TAGAGAGGAACAGTATAACTCTACCTA- TAGGGTCGTCAGCGTGCTGACAGTG- CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGA- AAGAGTATAAGTGTAAAGTGTCTAA-

CAAGGCCCTGCCAGCCCCTA- TCGAAAAGACTATCTCTAAGGC- TAAGGGGCAGCCTAGAGAACCCCAAG- TGTGCACTCTGCCCCCTAG- TAGAGAAGAGATGACTAAGAATCAGG- TGTCACTGAGCTGTGCCGTGAAGGG- CTTCTACCCTAGCGATATCGCCGTG- GAGTGGGAGAGCAACGGCCAG- CCCGAGAACAACTACAAGACCAC- CCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGG- CAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGA- CCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCA- GGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCG- TGATGCACGAGGCCCTGCACAACCAC- TACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAG-

CCCCGGCAAG [SEO 6 No cota) [SEG TD No ce foa) SEQ ID NO: 69 VvL EIVLTAOSPDFOSVTPKEKVTITCRAS- QSIGSSLHWYQQKPDOSPKLLIKYASQS- FSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAE-

DAAAYYCHOSSSLPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO: 70 VL de DNA GAGATCGTGCTGACCCAGTCACCCGA- CTTTCAGTCAGTGACCCC- TAAAGAAAAAGTGACTATCACCTG- TAGGGCCTCCCAGTCTATCGGCTC- TAGCCTGCACTGGTATCAGCAGAAG- CCCGATCAGTCACCTAAGCTGCTGAT- TAAGTACGCCTCTCAGTCCTTTAG- CGGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGCT- CAGGCTCAGGCACCGACTTCAC- CCTGACTATCAATAGCCTGGAAG- CCGAGGACGCCGCTGCCTACTACTGT-

CATCAGTCAAGTAGCCTGCCCTTCAC- CTTCGGCCCTGGCACTAAAGTGGATA-

TTAAG SEQ ID NO: 71 Cadeia Leve EIVLTOSPDFQSVTPKEKVTITCRAS- QSIGSSLHWYQQKPDOSPKLLIKYASQOS- FSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAE- DAAAYYCHOSSSLPFTFGPGTKV- DIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS- VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSKDSTYS-

LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 72 Cadeia Leve de GAGATCGTGCTGACCCAGTCACCCGA- DNA CTTTCAGTCAGTGACCCC- TAAAGAAAAAGTGACTATCACCTG- TAGGGCCTCCCAGTCTATCGGCTC- TAGCCTGCACTGGTATCAGCAGAAG- CCCGATCAGTCACCTAAGCTGCTGAT- TAAGTACGCCTCTCAGTCCTTTAG- CGGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGCT- CAGGCTCAGGCACCGACTTCAC- CCTGACTATCAATAGCCTGGAAG- CCGAGGACGCCGCTGCCTACTACTGT- CATCAGTCAAGTAGCCTGCCCTTCAC- CTTCGGCCCTGGCACTAAAGTGGATA- TTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAG- CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGA- CGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCG- CCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAAC- TTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTG- CAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG- CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCG- TCACCGAGCAGGACAGCAAGGAC- TCCACCTACAGCCTGAGCAGCAC- CCTGACCCTGAGCAAGGCCGAC- TACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTG- CGAGGTGACCCACCAGGGCCTG- TCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAA-

CAGGGGCGAGTGC [rm parto dem

SEQ ID NO: 85 VvH EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG- TFKSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPM- TGQTYYAQKFQGRVTITADES- TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA-

RAAYHPLVFDNWGOQGTLVTVSS SEQ ID NO: 86 VH de DNA GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGCG- CCGAAGTGAAGAAACCCGGCTCTAG- CGTGAAAGTCAGCTGTAAAGCTAG- TGGCGGCACCTTCAAGTCCTACGCTA- TTAGCTGGGTCAGACAGGCCCCAGGT- CAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAATAT- TATCCCTATGACCGGTCAGACCTAC- TACGCTCAGAAATTTCAGGGTAGAG- TGACTATCACCGCCGACGAGTCTAC- TAGCACCGCCTATATGGAACTGTC- TAGCCTGAGATCAGAGGACACCGCCG- TCTACTACTGCGCTAGAGCCGCCTAT- CACCCCCTGGTGTTCGATAACTGGGG- TCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTC-

TAGC SEQ ID NO: 87 Cadeia Pesada EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG- TFKSYAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPM- TGQTYYAQKFQGRVTITADES- TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA- RAAYHPLVFDNWGOQGTLVTVSSASTKG- PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC- NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD- KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK- DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK- FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSN- KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL-

PPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS- FFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 88 Cadeia Pesada de =| GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCAGGCG- DNA CCGAAGTGAAGAAACCCGGCTCTAG- CGTGAAAGTCAGCTGTAAAGCTAG- TGGCGGCACCTTCAAGTCCTACGCTA- TTAGCTGGGTCAGACAGGCCCCAGGT- CAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAATAT- TATCCCTATGACCGGTCAGACCTAC- TACGCTCAGAAATTTCAGGGTAGAG- TGACTATCACCGCCGACGAGTCTAC- TAGCACCGCCTATATGGAACTGTC- TAGCCTGAGATCAGAGGACACCGCCG- TCTACTACTGCGCTAGAGCCGCCTAT- CACCCCCTGGTGTTCGATAACTGGGG- TCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTC- TAGCGCTAGCACTAAGGGCCCCTCAG- TGTTCCCCCTGGCCCCTAGCTCTAAG- TCTACTAGCGGCGGCACCGCCG- CTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTAC- TTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCATG- GAATAGCGGCGCTCTGACTAGCGGAG- TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG- TCTAGCGGCCTGTATAGCCTGTCTAG- CGTGGTGACCGTGCCTAGCTCTAG- CCTGGGCACTCAGACCTACATCTG- TAACGTGAACCACAAGCCCTCTAACA- CTAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACC- TAAGTCCTGCGATAAGACTCACAC- CTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGG- CTGCCGGAGGACCTAGCGTGTTCCTG- TTCCCACCTAAGCCTAAGGACAC- CCTGATGATCTCTAGGACCCCCGAAG- TGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCT- CACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAA- TTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG- CACAACGCTAAGACTAAGCC- TAGAGAGGAACAGTATAACTCCACCTA- TAGAGTGGTGTCAGTGCTGACCGTG- CTGCATCAGGACTGGCTGAACGG- CAAAGAGTATAAGTGTAAAGTCTCTAA- CAAGGCCCTGCCAGCCCCTA-

TCGAAAAGACTATCTCTAAGGC- TAAGGGCCAGCCTAGAGAACCTCAGG- TGTACACCCTGCCCCCCTG- TAGAGAAGAGATGACTAAGAATCAGG- TGTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAAGG- CTTCTACCCTAGCGATATCGCCGTG- GAATGGGAGTCTAACGGCCAG- CCCGAGAACAACTATAAGACTAC- CCCCCeTGTGCTGGATAGCGACGGCT- CATTCTTCCTGTACTCTAAGCTGACCG- TGGACAAGTCTAGGTGGCAGCAGGG- CAATGTGTTTAGCTGTAGCGTGATG- CACGAGGCCCTGCATAATCACTACAC- TCAGAAGTCACTGAGCCTGAG-

CCCCGGCAAG SEQ ID NO: 101 VvL DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSS- NIGNHYVNWYQAQLPGTA- PKLLIYRNNHRPSGVPDRFSGSKSG- TSASLAITGLOSEDEADYYCQSWDYSG-

FSTVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 102 VL de DNA GATATCGTCCTGACTCAGCCCCCTAG- CGTCAGCGGCGCTCCCGGTCA- GAGAGTGACTATTAGCTGTAGCGG- CTCTAGCTCTAATATCGGTAATCAC- TACGTGAACTGGTATCAGCAGCTG- CCCGGCACCGCCCCTAAGCTG- CTGATCTATAGAAACAATCACCGGCC- TAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCG- GATCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAG- TCTGGCTATCACCGGACTGCAGTCA- GAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCA-

GTCCTGGGACTATAGCGGCTTTAG- CACCGTGTTCGGCGGAGGCACTAAG-

CTGACCGTGCTG SEQ1D NO: 103 Cadeia Leve DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNI

GNHYVNWYQQLPGTAPKLLIVRNNHRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLOSEDE ADYYCQSWDYSGFSTVFGGGTKLTVLG QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTT PSKOSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR

SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ1D NO: 104 Cadeia Leve de GATATCGTCCTGACTCAGCCCCCTAG

DNA CGTCAGCGGCGCTCCCGETCAGAGAG TGACTATTAGCTGTAGCGGCTCTAGCT CTAATATCGGTAATCACTACGTGAACT GGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCEGCC CCTAAGCTGCTGATCTATAGAAACAAT CACCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAG GTTTAGCGGATCTAAGTCAGGCACTA GCGCTAGTCTGGCTATCACCGGACTG CAGTCAGAGGACGAGGCCGACTACTA CTGTCAGTCCTGGGACTATAGCGGCTT TAGCACCGTGTTCGGCGGAGGCACTA AGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCTAA GGCTGCCCCCAGCGTGACCCTETTCCE CCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAGGCC AACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGAT CAGCGACTTCTACCCAGGCGCCGTGA CCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAG CCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACC ACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAA- CAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGA GCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAG CCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGAC CCACGAGGGCAGCACCGTGGAAAAGA CCEGTGGCCCCAACCGAGTGCAGC

[00338] —Aolongo do texto deste pedido, caso exista uma discrepân- cia entre o texto do relatório descritivo (por exemplo, Tabela 15) e a listagem de sequências, o texto do relatório descritivo prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo biespecífico adequado para coexpressão em uma célula hospedeira comum, caracterizado pelo fato de que o anti- corpo compreende a. uma primeira parte que é uma imunoglobulina com uma primeira cadeia leve variável de tipo selvagem lambda (VL1) e uma primeira cadeia pesada variável de tipo selvagem (VH1), que se liga especificamente a um primeiro alvo, e uma primeira cadeia pesada constante (CH1) com uma modificação de heterodimerização, e b. uma segunda parte que é uma imunoglobulina com uma segunda cadeia leve variável de tipo selvagem capa (VL2) e uma se- gunda cadeia pesada variável de tipo selvagem (VH2), que se liga es- pecificamente a um segundo alvo, diferente do primeiro alvo, e uma segunda cadeia pesada constante (CH2) com uma modificação de he- terodimerização que é complementar à modificação de heterodimeri- zação da primeira cadeia pesada constante, em que a primeira parte e a segunda parte, quando coex- pressas em uma célula hospedeira comum, formam um anticorpo bi- específico, em que as primeira e segunda cadeias pesadas constantes são IgA, |gD, IgE, IgG ou IgM humanas, preferencialmente IgD, IgE ou IgG, tais como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas, preferencialmente IgG1, e em que a primeira cadeia leve variável é de tipo lambda 1 e a segunda cadeia leve variável é de tipo capa 6.

2. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as primeira e segunda cadeias pesadas constantes são IgG1 e em que a. a primeira cadeia pesada constante tem mutações pon- tuais gerando uma estrutura em nó e a segunda pesada constante tem mutações pontuais gerando uma estrutura em buraco, ou b. a primeira cadeia pesada constante tem mutações pon-

tuais gerando uma estrutura em buraco e a segunda pesada constante tem mutações pontuais gerando uma estrutura em nó e opcionalmen- te, c. as primeira e segunda cadeias pesadas constantes têm mutações resultando em uma ponte dissulfeto.

3. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreen- de um primeiro domínio VH1 de imunoglobulina, um primeiro domínio VL1 de imunoglobulina, um segundo domínio VH2 de imunoglobulina e um segundo domínio VL2 de imunoglobulina, em que: a. o primeiro domínio VH1 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:76, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:77 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:78; ou ii. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:79, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:80 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:81; e b. o primeiro domínio VL1 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:92, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:93 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:94 ou ii. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:95, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:96 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:97; e c. o segundo domínio VH2 de imunoglobulina compreen- de (por exemplo, na sequência): i. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:44, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:45 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:46; ou ii. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:47, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:48 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:49; e d. o segundo domínio VL2 de imunoglobulina compreende (por exemplo, na sequência): i. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:60, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:61 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:62 ou ii. regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:63, a referida CDR?2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:64 e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:65.

4. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreen- de um primeiro domínio VH1 de imunoglobulina, um primeiro domínio VL1 de imunoglobulina, um segundo domínio VH2 de imunoglobulina e um segundo domínio VL2 de imunoglobulina, em que: a. o primeiro domínio VH1 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 85, b. o primeiro domínio VL1 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 101, c. o segundo domínio VH2 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 53, e d. o segundo domínio VL2 de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 69.

5. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreen- de uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira ca- deia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imuno- globulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina, em que: a. a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreen- de a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 87, b. a primeira cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 103, c. a segunda cadeia pesada de imunoglobulina compre- ende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 55, e d. a segunda cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71.

6. Método para selecionar um anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende; a. uma primeira etapa de selecionar a primeira parte e a segunda parte; b. uma segunda etapa de coexpressar a primeira parte e a segunda parte em uma célula hospedeira comum, resultando em um anticorpo biespecífico compreendendo a primeira parte e a segunda parte; c. uma terceira etapa de purificar o anticorpo biespecífico por remoção de fragmentos com emparelhamento defeituoso do anti- corpo biespecífico corretamente emparelhado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a terceira etapa de purificação resulta em um anticor-

po biespecífico que é pelo menos 60% (massa), 70% (massa), 80% (massa), 85% (massa) puro, tal como pelo menos 90% (massa) puro, 95% (massa), 96% (massa), 97% (massa), 98% (massa) ou 99% (massa) puro.

8. Método para a fabricação de um anticorpo biespeciífico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, por coex- pressão em uma célula hospedeira comum, o referido método caracte- rizado pelo fato de que compreende; a. uma primeira etapa de gerar pelo menos um vetor codi- ficando a primeira parte e a segunda parte; b. uma segunda etapa de introduzir o pelo menos um vetor na célula hospedeira comum; c. uma terceira etapa de selecionar células expressando especificamente o anticorpo biespeciífico; d. uma quarta etapa de cultivar as células selecionadas sob condições em que as células expressam o anticorpo biespecífico; e e. uma quinta etapa de purificar o anticorpo biespecífico que é pelo menos 60% (massa), 70% (massa), 80% (massa) ou 85% (massa) puro, tal como pelo menos 90% (massa) puro, 95% (massa), 96% (massa), 97% (massa), 98% (massa) ou 99% (massa) puro.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa compreende gerar um primeiro vetor codificando a primeira parte e um segundo vetor codificando a segun- da parte.

10. Sistema de expressão caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando a primeira parte ou a segunda parte do anticorpo biespecií- fico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um marcador selecionável.

11. Sistema de expressão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um polinucleotídeo codificando um primeiro marcador selecionável (sm |); b. um polinucleotídeo codificando um segundo marcador selecionável (sm Il), que difere do primeiro marcador selecionável (sm D.

12. Sistema de expressão, de acordo com a reivindicação ou 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro marcador selecio- nável (sm |) é um transportador de folato ou um polinucleotídeo codifi- cando um receptor de folato mutado, em que o receptor de folato mu- tado tem uma afinidade de ligação para folato decrescida em compa- ração com o receptor de folato de tipo selvagem e o segundo marca- dor selecionável (sm II) é DHFR.

13. Sistema de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro marcador selecionável (sm |) é higromicina e o segundo marcador se- lecionável (sm II) é neomicina/G418.

14. Sistema de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que compreen- de dois vetores de expressão em que: a. um primeiro vetor compreende polinucleotídeo codifi- cando pelo menos um primeiro marcador selecionável (sm |) e pelo menos polinucleotídeos codificando a primeira parte; e b. um segundo vetor compreende polinucleotídeo codifi- cando pelo menos um segundo marcador selecionável (sm |l) e pelo menos polinucleotídeos codificando a segunda parte.

15. Sistema de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que compreen- de um códon de terminação a jusante dos polinucleotídeos codificando a cadeia pesada e um polinucleotídeo codificando uma âncora de membrana de imunoglobulina localizada a jusante do códon de termi- nação.

16. Método para selecionar uma célula hospedeira comum para uso nos métodos, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende a. uma primeira etapa de proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras compreendendo o sistema de expressão, comoe definido em qualquer uma das reivindicações 10a 15; e b. cultivar a referida pluralidade de células hospedeiras sob condições seletivas para o marcador selecionável, obtendo desse modo uma célula hospedeira expressando o produto de interesse.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que é usado um meio de cultura seletivo: a. compreendendo uma concentração limitante de folato; e/ou b. compreendendo um ácido fólico em uma concentração de 500 nM ou menos; e/ou c. compreendendo um ácido fólico em uma concentração selecionada de: i. 1000 nM — 100 pM; ii. 100 NM-1nM; ii. 15 NM-1AM; iv 10nNM-1nM;e v. 10NM- 2,5 nM; e/ou d. compreendendo um inibidor de DHFR; e/ou e. compreendendo um antifolato; e/ou f.” compreendendo um antifolato em uma concentração de 500 nM ou menos; e/ou g. compreendendo MTX em uma concentração seleciona-

da de: ii. 500NM-3nM; ii. 100 NM—-10nM; ii. S0NM- 10nNM;e iv. 50 nM; e/ou h. compreendendo uma concentração de antifolato até 20 vezes a concentração de folato; e/ou i. — compreendendo uma concentração de antifolato de 10 — vezes a concentração de folato; e/ou j. compreendendo um ácido fólico em uma concentração até 15 nM e uma concentração equimolar até 20 vezes de MTX.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, carac- terizado pelo fato de que a célula hospedeira compreende o sistema de expressão, como definido na reivindicação 15, em que pelo menos uma porção da primeira ou segunda parte é expressa como um poli- peptídeo de fusão compreendendo a âncora transmembrana de imu- noglobulina ou seu fragmento e em que o referido polipeptídeo de fu- são está sendo exibido na superfície da referida célula hospedeira, compreendendo adicionalmente uma etapa de: a. contatar a pluralidade de células hospedeiras com um composto de detecção se ligando ao polipeptídeo de fusão; b. selecionar pelo menos uma célula hospedeira com base na presença ou quantidade do composto de detecção ligado à superfí- cie celular.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que o composto de detecção compreende o primeiro ou segundo alvo ou seus derivados e pelo menos uma etiqueta de de- tecção.

20. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte- rizado pelo fato de que a quinta etapa de purificar o anticorpo biespecií-

fico compreende cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de tro- ca iônica.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que a cromatografia compreende a. uma primeira etapa de captura; b. uma segunda etapa de polimento; e opcionalmente c. uma terceira etapa de polimento adicional.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que a primeira etapa de captura é realizada com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromatografia de afini- dade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromato- grafia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a ca- deia leve capa, tal como KappaSelect'Y, cromatografia de afinidade anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, cromato- grafia de afinidade baseada em um alvo, tal como cromatografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cromatografia de troca iônica, tal como Capto'“ adhere ou Fractogel"" EMD SO; e cro- matografia de interação hidrofóbica.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, carac- terizado pelo fato de que a segunda etapa de polimento é realizada com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromatografia de afinidade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'", cromatografia de afinida- de anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, croma- tografia de afinidade baseada em um alvo, tal como cromatografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cromatografia de troca iônica, tal como Capto'"Y“ adhere ou Fractogel"" EMD SO;, cro-

matografia de interação hidrofóbica e inativação por vírus.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que a terceira etapa de polimento adicional é realizada com um princípio selecionado do grupo consistindo em cromatografia de afinidade para ligação a Fc, tal como Proteína A ou Proteína G, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, cromatografia de afinidade específica para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, cromatografia de afinida- de anti-idiotípica, tal como a primeira parte ou a segunda parte, croma- tografia de afinidade baseada em um alvo, tal como cromatografia de afinidade usando o primeiro alvo ou segundo alvo, cromatografia de troca iônica, tal como Capto'"“ adhere ou Fractogel""” EMD SO;, cro- matografia de interação hidrofóbica e inativação por vírus, isoladamen- te ou em combinação.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que é selecionado de: a. uma primeira etapa de captura por Proteína A, tal como MabSelect'y SuRe'“, uma segunda etapa de cromatografia de afini- dade para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect'Y, e uma terceira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y; ou b. uma primeira etapa de Proteína A, tal como MabSe- lect'M SuRe'Y, uma segunda etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, e uma terceira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve lambda, tal como Lamb- daFabSelect'Y; ou c. uma primeira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y, e uma segunda etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve lambda, tal como Lamb- daFabSelect'Y; ou d. uma primeira etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve lambda, tal como LambdaFabSelect"Y, e uma segunda etapa de cromatografia de afinidade para a cadeia leve capa, tal como KappaSelect'Y,

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 9 ou 16 a 25, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células é selecionada do grupo consistindo em uma célula CHO, um hibridoma não produtor, tal como Sp 2/0 ou NSO, uma linhagem de cé- lulas derivadas de humano, tal como HEK ou PER.C6, um derivado de rim de hamster bebê (BHK), uma levedura ou fungos filamentosos, uma bactéria procariótica, tal como fluorescência de E. coli ou Pseu- domonas, um derivado de planta, uma alga e um ciliado.

27. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

28. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, como de- finida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

29. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, como de- finida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença relacionada com inflamassomos.

30. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, como de- finida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença relacionada com inflamassomos, como definido na reivindicação 29, em que a doença relacionada com infla- massomos é selecionada do grupo consistindo em doença de células falciformes, vasculopatia, lesão de isquemia-reperfusão, doença cardi-

ovascular, doença de artéria periférica, aterosclerose, disfunção vas- cular, isquemia do músculo esquelético, sarcoidose pulmonar, fibrose, malária, doença crônica do rim dependente de hemodiálise e doença de Crohn.

31. Método de tratamento de um distúrbio relacionado com inflamassomos, compreendendo administrar a um sujeito afligido com um distúrbio relacionado com inflamassomos uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, ou uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 29.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que o distúrbio relacionado com inflamassomos é doença de células falcifor- mes, vasculopatia, lesão de isquemia-reperfusão, doença cardiovascu- lar, doença de artéria periférica, aterosclerose, disfunção vascular, is- quemia do músculo esquelético, sarcoidose pulmonar, fibrose, malária, doença crônica do rim dependente de hemodiálise ou doença de Crohn.

TA Terminação vazante FIG 1

Intato + PNGaseF MS bbmAb1 == s 7 . — | Na - 7 bbmAb1 - ae js (2 Lys, 1pE, degiyc) = — O FIG 2A FIG 2B Digesto com papaína Fab G Digesto com IdeS io Fab2 FO NA Bro | | fo? F(ab'); | || | | a | “ | Fada || FIG 2C FIG 2D Reduzido com DTT + PNGaseF HC-nó HC-buraco À x UV | FIG 2E “rartefato de corte

- 48% bbmAb1 a —s% mAbZMAbI ainfainioro mp q. . Ao mo FIG 3A 7 ) bbmAbi h . term om mmsoio NeeTAS || T 2 FIG 3B |eomas1 mabamabt | RáBgdimero taraco é dá Í un" FIG 3C FIG3D

GR4 AN | H FIG L :

YINIRL Hd

YVININRL ! | : | FIG !

VINIL Nu mAb1 bbmAb' EE ce E, hull-18 = : E já E : E = pa e mariL-18 7 & E de É h E =. A As Ato Aa tr E A = mAb2 - ECO Emo hulL-18 : je ii - % [Eiaaia Nr e = * PP , marlL-1p 1E=Z t % FIG5

Proteína IFNy sangue completo (exemplo) 40000 "mM" E E 2 SS S : ã “ mab2 F) £ NA o E 20000 z % à Ma mai 10900 Ú . bbmADI : Combo o 01 os 1 o 100 1000 Composto em nM FIG 6A Proteína IFNy sangue completo (n=4) 100 » 80 " = 4 o 60 7"

S o 40 2

E = 20 o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 6B

Proteína IFNy PBMC (n= 9) 100 —.—UÔ.. " viv 80 ge a 3 E 4o se o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG7A Expressão genética de IFNy PBMC (n= 9) 100 » E

LAS 80 “is à xe 60 oO

F E 40 3º 20 o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 7B

Í Níveis de expressão de mRNA de IFNg

À RGB Fone eee dfr— — 11111 ai2dE EANNL WO) AA Í sis is! eat d ies ceia | So eia ie [SS ide | idSasA Esasãd Ssast Egas 2o3s j SEE is ZEE STE) ST) Ss Tea: F iRi+TIBIBIS! [R+IBEIS! [+ EEIS [RH EE) TER j Ei iria FERE LE TET LEiQITEt Ei i MIO tizia) CO tizio IB AIiAiA BO Fizis DO Fi ! SRS coS8S S72888 gua88S ag Í EETSSB SSB RES 2838. 288. | GH35S 23323 sgsois S3352 2339: Í !IRÉEBR O ERR (GERE O FERE O ERÉ Í 8343 233% E3%35 2S3%% 233%

Í j fere ieis! 1 ioio EUR io | igieidio 8 Fi.

Loud Ooadort | doador2 | doador3 | doadorá : doados FIG 8A

À 3006 $ Níveis de expressão de MRNA de 11-26

Í soo i

Í 600 - i

| ao + ne . Í

Di 1a ddr dad.

HH

| Leal aluala -s 1H. ailla QE 2

| gelo AS, SS.

AS.

Tao i E223É TF223 FERE E223É Sd i

| eZEBER FBES FBES FtEEÊ ENE j = uia: SO! 1 iuial ((Slgiciat [lmbirizial |

| ISSigadal [SS Sigla Sslgíia [Silas |

Í 2 aD88 ouS88 oo ousa oossa

Í ESSE ESSA CROSS [20288 888

Í RSS B3SS eRSSS CRSSS 33%?

Í | BEBER | EEB | EEE | EEE 2ÉEEÉ i ESTES ESTS | ESsTZTS (ESTO EE

Í Í FS FO j FS FO EARAESES

Ã in. oador1 |... doador? i.. doadorãê | doador4 —. doadorS5 FIG 8B

Expressão genética de IFNy PBMC (n=5) 100 ly 80 g 6 Ss s 40 == o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 9A Expressão genética de 11-26 PBMC (n=5) 100 80 Ss so = 2 s 4 = 20 o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 9B

Expressão genética de 11-26 PBMC (n=9) 100 er aa

EA 80 " à 1d à F e 2 Ea = o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 10A Proteína IL-26 PBMC (n=9) 100 80 o So ” M 2 —.—————— vr Rm — = ES 20 a" o mAb2 mAb1 bbmAb1 FIG 10B

1,00E-90 " e ã 1,00E-78siiincço: á p— 2 | 1005-6686 brita PA AA go | 1,00E-54 " | | 1,00E48 |) —E o 7 7 —

1.00E-36 aos Aos a | 1,00E-24 | 1,00E-18 é . | | 1,00E-12 1 " eo | 1,00E-06 em : | : — ão | 1,00E+00 - y ? WIBDEG ILISDEG ILIBILIBS ILIBDEG ILISDEG ILIBILIS |

Í DEG DEG | 6h Í 24h f | | + Pele de lesões cutâneas de sarcoidose vs pele de pacientes saudáveis | * Pele de lesões cutâneas de sarcoidose vs pele não lesionada * Glândulas lacrimais de pacientes com sarcoidose vs normal | * Tecidos da órbita anterior de pacientes com sarcoidose vs normal | | » Pulmões - sarcoidose pulmonar fibrótica progressiva vs sarcoidose pulmonar | Lisa DOUBS o oa anta a FIG 11