CN113980135B - 一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用。所述抗药抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中各功能区的序列详见本发明。本发明筛选得到的抗药抗体具有较高的结合亲和力和特异性。

Description

一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用。
背景技术
自2002年重症急性呼吸综合征冠状病毒 (severe acute respiratorysyndromes coronavirus (SARS-CoV) 爆发以来，冠状病毒 (CoV) 成为了一种引起主要公共卫生问题的RNA病毒。目前，全世界都在关注2019新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)。该病毒可以在人与人之间传播，而且感染该病毒的患者可表现为严重的病毒性肺炎和呼吸系统疾病。从那时起，感染SARS-CoV-2的病例数量一直在增加。
研究显示此类冠状病毒通过刺突蛋白 (Spike蛋白) 与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶Ⅱ (angiotensin converting enzyme Ⅱ，也称为ACE2) 结合，介导病毒进入宿主细胞 (Ashour HM等人，Insights into the Recent 2019 Novel Coronavirus(SARS-CoV-2) in Light of Past Human Coronavirus Outbreaks，Pathogens，2020年3月4日; 9(3). pii: E186. doi: 10.3390/pathogens9030186；Roujian Lu等人，Genomiccharacterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications forvirus origins and receptor binding，www.thelancet.com，2020年1月29日网上公开，https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)。因此，本领域需要开发出针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与宿主细胞上的ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，来有效预防和治疗此类冠状病毒 (例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV病毒) 感染。
经过一年多的努力，全球已有多款针对此类冠状病毒的疫苗上市使用，针对此病毒的单克隆抗体中，Regeneron和Eli Lilly开发的单抗获得FDA批准紧急使用。而现阶段面临的新问题是SARS-CoV-2在不断突变，因病毒突变带来的疫苗保护力下降或失效，以及单克隆抗体结合的病毒表位有限而导致突变体逃逸，失去中和效果。
2021年1月发表的一项针对英国出现的突变株 (B.1.1.7) 和南非出现的突变株(B.1.351) 研究显示，Eli Lilly和君实开发的LY-CoV555和CB6已失去针对B.1.351突变株中和活性，Regeneron和Brii Biosciences公司开发的单抗鸡尾酒疗法对针对B.1.351突变株的中和活性也下降了5-10倍；Moderna和Pfizer开发的疫苗免疫后的血清，对B.1.351突变株的中和活性也下降了10倍以上 (Increased Resistance of SARS-CoV-2 VariantsB.1.351 and B.1.1.7 to Antibody Neutralization, bioRxiv 2021 Jan 26;2021.01.25.428137. doi: 10.1101/2021.01.25.428137.)。因为病毒的不断突变，期待通过疫苗来获得群体免疫的难度再次增大。巴西玛瑙斯 (Manaus) 新冠病毒的再次大规模感染也印证了获得群体免疫的难度，早在2020年9月，经历7个多月新冠病毒肆虐后，玛瑙斯的感染率达到76%，被认为已达到群体免疫的感染率，然而2021年1月，玛瑙斯再次大规模感染，而此次感染的毒株为突变毒株P1.，科学家推测，P1.比普通的新冠病毒高出50%的传染性 (Three-quarters attack rate of SARS-CoV-2 in the Brazilian Amazon during alargely unmitigated epidemic, Science 2021 Jan 15;371(6526):288-292. doi:10.1126/science.abe9728.)。
因此，针对SARS-CoV-2病毒存在的不断突变情况，以及突变可能带来的耐药逃逸、疫苗保护力下降或丢失问题。开发针对多种突变株仍然有治疗效果的药物具有极大价值，具有迫切的需求。本司开发了一种靶向新冠病毒Spike蛋白的双特异性抗体BsAb17 (参见发明专利申请CN202011300574.2)，其中的双特异性抗体分别由靶向SARS-CoV-2病毒Spike蛋白结合结构域 (RBD) 的全人源IgG抗体R15-F7分子和人源化羊驼纳米抗体P14-F8-35分子构成，两个抗体可互不影响地识别RBD蛋白不同的抗原表位，且分别能够同时阻断Spike蛋白与ACE2受体的结合，从而高效中和新冠病毒感染入侵细胞。
发明内容
在BsAb17双抗临床前研究及临床研究中，BsAb17产生抗药抗体的情况 (ADA,anti-drug antibody)为必要研究项。为定量研究BsAb17的ADA，需要制备ADA的标准品，因此，本发明中使用BsAb17双特异性抗体作为抗原免疫动物、基于噬菌体展示技术进行抗体文库的构建及筛选等工作，最终获得了多个特异性结合BsAb17、而不结合人血清IgG的鼠单克隆抗体，作为评价ADA的阳性标准品。
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的技术方案之一为：一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 46或者SEQ ID NO: 56所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 42、SEQ IDNO: 44、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 55或者SEQ ID NO: 57所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 48、SEQ IDNO: 50~54以及SEQ ID NO: 58中任一所示的序列；
所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 81、SEQID NO: 83、SEQ ID NO: 85或者SEQ ID NO: 87所示的序列；所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79或者SEQ ID NO: 82所示的序列；所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 80、SEQID NO: 84或者SEQ ID NO: 86所示的序列。
较佳地，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ IDNO: 39所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 43所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 45所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 46所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:47所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 48所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:47所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 51所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 52所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 50所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 53所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 54所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:55所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 56所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:57所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 58所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:39所示的序列，且所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列。
在本发明一较佳实施方案中，所述重链可变区含有如SEQ ID NO: 1~16中任一所示的序列。
本发明中，LCDR的较佳组合如下：
所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:63所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 64所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 65所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 66所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:67所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 68所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 69所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:70所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 71所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 72所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:70所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 73所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 74所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 75所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 76所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:77所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 64所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 78所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:79所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 80所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 81所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:82所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 83所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 84所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 85所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 86所示的序列；
或者，所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 87所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 66所示的序列。
较佳地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 17~34中任一所示的序列。
在本发明一更佳实施方案中，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO: 39所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ ID NO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ ID NO: 61所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 43所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 63所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 46所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:47所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 48所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 63所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 65所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 66所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:39所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 67所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQID NO: 68所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:39所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQID NO: 61所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 50所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 69所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 70所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 71所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:47所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 51所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 72所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 70所示的序列，且所述LCDR3包含如SEQID NO: 73所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 52所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 74所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 75所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 45所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 76所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 77所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 50所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 78所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 79所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 80所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 53所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 63所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 81所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 82所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 61所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 41所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:42所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 54所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO:62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:63所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:55所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 83所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 84所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:44所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 45所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 85所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 61所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 56所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:57所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 58所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 62所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 63所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 64所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:49所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 59所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 86所示的序列；
或者，所述HCDR1包含如SEQ ID NO: 38所示的序列，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:39所示的序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO: 40所示的序列，和所述LCDR1包含如SEQ IDNO: 87所示的序列，所述LCDR2包含如SEQ ID NO: 60所示的序列，所述LCDR3包含如SEQ IDNO: 66所示的序列。
在本发明一更佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列。
本发明中，所涉及的双特异性抗体优选专利申请CN202011300574.2中制备得到的BsAb17双特异性抗体，其第一结合表位包含序列如SEQ ID NO: 88所示的HCDR1、序列如SEQID NO: 89所示的HCDR2、序列如SEQ ID NO: 90所示的HCDR3、序列如SEQ ID NO: 91所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO: 92所示的LCDR2以及序列如SEQ ID NO: 93所示的LCDR3；第二结合表位包含序列如SEQ ID NO: 98所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO: 99所示的HCDR2以及序列如SEQ ID NO: 100所示的HCDR3；较佳地，所述第一结合表位包含序列如SEQ ID NO: 94所示的重链可变区和序列如SEQ ID NO: 95所示的轻链可变区；所述第二结合表位包含序列如SEQ ID NO: 101所示的VHH；更佳地，所述第一结合表位包含序列如SEQ ID NO: 96所示的重链和序列如SEQ ID NO: 97所示的轻链。
本发明中所述的抗药抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或多特异性抗体。
当为全长抗体时，其重链恒定区可为鼠源或者人源重链恒定区；其轻链恒定区为鼠源或者人源轻链恒定区。
本发明的技术方案之二为：一种分离的核酸，其编码如技术方案之一所述的抗药抗体。
本发明的技术方案之三为：一种抗体组合物，其包含如技术方案之一所述的抗体药物中的一种或多种。
本发明的技术方案之四为：一种重组表达载体，其包含如技术方案之二所述的分离的核酸。
本发明的技术方案之五为：一种转化体，其在宿主细胞中包含如技术方案之四所述的重组表达载体。
本发明的技术方案之六为：一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体的制备方法，其包括：培养如技术方案之五所述的转化体，从培养物中获得所述结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、完整抗体和抗体片段。
术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环（“超变环”）和/或含有抗原接触残基（“抗原接触点”）的区域。CDR主要负责与抗原表位结合，从N-端开始顺序编号依次包括CDR1、CDR2和CDR3。在一个给定的重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia（Chothia等人.（1989）Nature342: 877-883，Al-Lazikani等人, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948（1997））、基于抗体序列可变性的Kabat（Kabat等人, U.S. Department of Health andHuman Services, National Institutes of Health（1987））、AbM（University of Bath）,Contact （University College London）、国际ImMunoGeneTics database（IMGT）（万维网imgt.cines.fr/），以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类（affinity propagationclustering）的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区（例如可变区）的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。
如本文中所使用的，术语“分离的”指的是从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离的”物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9 等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明筛选得到的抗药抗体具有较高的结合亲和力和特异性。
附图说明
图1A-1B显示了抗体库海选1-3轮噬菌体池富集的结果。图1A显示了噬菌体池结合BsAb17的结果；图1B显示了噬菌体池结合人血清IgG的结果。
图2A-2D为候选抗体在变性条件和非变性条件下的SDS-PAGE图。图2A为抗体A3、A5、A8、A9、A14和A20的SDS-PAGE图；图2B为抗体A21、A24、A45、A48和A50的SDS-PAGE图；图2C为抗体A55、A57、A58、A74、A77和A81的SDS-PAGE图；图2D为抗体A82、A96和A105的SDS-PAGE图。
图3A-3B显示了基于ELISA检测的候选抗体和抗体混合物与BsAb17 的结合活性。图3A显示了抗体A3、A5、A8、A9、A14、A20、A21、A24、A45、A48和抗体混合物与BsAb17的结合活性；图3B显示了抗体A50、A55、A57、A58、A74、A77、A81、A82、A96、A105和抗体混合物与BsAb17的结合活性。
图4A-4B显示了基于ELISA检测的候选抗体和抗体混合物与人血清IgG的结合活性。图4A显示了抗体A3、A5、A8、A9、A14、A20、A21、A24、A45、A48和抗体混合物与人血清IgG的结合活性；图4B显示了抗体A50、A55、A57、A58、A74、A77、A81、A82、A96、A105和抗体混合物与人血清IgG的结合活性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 动物免疫
用于抗体制备的免疫原蛋白为BsAb17双特异性抗体，BsAb17双特异性抗体的产生和制备过程参考专利申请CN202011300574.2。将BsAb17抗体作为免疫原用于免疫Balb/C小鼠 (上海灵畅生物科技有限公司) ，共免疫4只，免疫时采取皮下多点免疫的方式，每次皮下免疫50 μg，每两星期免疫一次，共免疫四次。免疫四次后通过ELISA测定免疫的效价。测定结果显示免疫效价达到1:1458000，效价检测结果详见表1，此时采用100 μg BsAb17进行加强免疫，2-3天后取脾脏。BsAb17的序列如表2所示。
表1 BsAb17小鼠免疫效价检测数据
Figure 867138DEST_PATH_IMAGE001
表2 BsAb17双抗的氨基酸序列
Figure 987541DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 免疫库构建和抗体筛选
2.1 噬菌体展示免疫抗体库构建
分离实施例1所述经免疫的小鼠脾脏中的B淋巴细胞，抽取其RNA，并通过反转录试剂盒 (TaKaRa，6210A) 反转录成cDNA。设计引物分别扩增轻链可变区和重链可变区以及第一个恒定区 (CL和CH1) 的编码序列，并且在CH1的编码序列的3’端连接M13噬菌体GIII蛋白的编码序列，然后克隆至噬菌体展示用载体上。然后通过电转仪 (Bio-Rad，MicroPulser) 将载体转化至感受态大肠杆菌SS320细胞 (Lucigen，MC1061 F) 中，复苏1小时后，涂布于具有氨苄抗性的2-YT固体平板。通过梯度稀释铺板，测定此免疫库的库容为8.45×108 cfu。采用辅助噬菌体M13KO7 (NEB) 进行包装，最终构建的免疫库以Fab的形式展示在M13噬菌体的外壳蛋白上。
2.2 抗体筛选
2.2.1 磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库
磁珠法筛选是基于将抗原蛋白 (BsAb17) 进行生物素标记后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程。通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的BsAb17蛋白用于噬菌体展示文库筛选，以人血清来源IgG(Merck, I4506-50MG) 作为负筛抗原，经过3轮淘选后进行针对BsAb17蛋白而不结合人血清IgG的单克隆抗体初筛。
抗体筛选的具体实施方法如下：
首先用生物素标记的BsAb17与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的BsAb17蛋白结合到磁珠上，同时将文库的噬菌体与0.5 mg/mL负筛抗原人血清来源IgG孵育1 h，将结合于磁珠的BsAb17与文库的噬菌体室温下孵育2 h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入胰酶 (Gibco，25200072) 轻轻混匀并反应20 min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数生长期的SS320菌体(Lucigen, MC1061 F) 并静置30 min，然后在220 rpm条件下培养1 h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30 min，继续在220 rpm条件下培养1 h，离心并置换至C+/K+ 2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的淘选。
2.2.2 免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库
免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个相互补充和验证的实验方法。
免疫管法筛选的原理是将BsAb17包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。
具体实施方法如下：
第一轮筛选时，在免疫管中加入1 mL 100 μg/mL的BsAb17蛋白，4℃包被过夜。第二天弃去包被液，加入含5%牛奶的PBS封闭2 h，与此同时，将文库噬菌体与0.5 mg/mL负筛抗原人血清来源IgG孵育1 h，PBS润洗两次免疫管后加入负筛完成的文库噬菌体，孵育2 h，用PBS润洗8遍，然后用PBST润洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体。然后向免疫管中加入0.8 mL含 0.05% EDTA的胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体。接着将其侵染对数生长期的SS320菌体 (Lucigen，60512-1) ，37℃静置30 min，然后220 rpm条件下培养1 h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30 min，继续在220 rpm条件下培养1 h，离心并置换至C+/K+ 2-YT培养基中，并于30℃，220 rpm环境下继续培养过夜。第二天沉淀噬菌体，用于后续1-2轮的筛选。
对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从2轮和3轮筛选的噬菌体池中随机挑选20-24个克隆富集阳性率分析。结果显示在图1A- 1B和表3中。结果表明，第三轮筛选后抗体序列富集明显，且结合BsAb17特异性很高，因此，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆筛选。
2.2.3 单克隆的挑选
通过单克隆铺板、诱导的单克隆Fab上清表达，以BsAb17或人血清IgG作为抗原，ELISA检测单克隆Fab上清的结合信号，选择阳性克隆进行测序分析，获得120个序列独特的阳性抗体，这些抗体特异性结合BsAb17而不结合人血清IgG蛋白，然后通过序列相似性分析和修饰位点分析，选择了20个抗体进行全长制备。
表3 2-3轮噬菌体池单克隆结合BsAb17和人血清IgG数据分析
Figure 236120DEST_PATH_IMAGE003
实施例3 抗体的构建、表达和纯化
将实施例2中获得的20个鼠源抗体构建为鼠IgG1亚型，抗体的轻重链可变区氨基酸序列见表4-3 (SEQ ID NO:1-34)。
3.1 质粒构建
从筛选获得的含有候选单克隆菌株中，PCR扩增获取编码抗体重链和轻链的DNA片段。通过同源重组方法，将编码各个重链和轻链的DNA片段分别构建至含有鼠IgG1 Fc片段(SEQ ID NO:35) 的真核表达载体质粒pcDNA3.4 (Invitrogen) 上，分别获得包含完整重链和轻链全长基因的重组质粒，其中完整重链含有抗体重链可变区、鼠CH1片段 (SEQ IDNO: 36) 和鼠IgG1 Fc片段，完整轻链含有抗体轻链可变区和轻链恒定区 (SEQ ID NO:37)片段。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中并提取质粒用于真核细胞系统表达。
3.2 抗体的表达和纯化
抗体通过ExpiCHO瞬转表达系统 (Thermo Fisher，A29133) 表达，具体方法如下：转染当天，确认细胞密度为7×106至1×107个活细胞/mL左右，细胞存活率>98%，此时，用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPROTMSFM稀释目的质粒 (向1 mL所述培养基中加入1 μg质粒) ，同时，用OptiPROTMSFM稀释 ExpiFectamineTMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5 min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、8% CO2条件下培养。
在转染后18-22 h，向培养液中添加ExpiCHOTMEnhancer和ExpiCHOTMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5% CO2条件下继续培养。在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHOTMFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染7-15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000 g高速离心10 min，所得上清用MabSelect SuRe LX (GE，17547403) 进行亲和纯化，然后用100 mM 乙酸钠 (pH 3.0) 洗脱目的蛋白，接着用1 MTris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管 (Millipore，UFC901096) 将所得蛋白换液至PBS缓冲液中。
本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区 (例如可变区) 的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。以下CDR区域通过AbM来定义。
表4-1 候选抗体HCDR区域的氨基酸序列
Figure 100170DEST_PATH_IMAGE004
表4-2 候选抗体LCDR区域的氨基酸序列
Figure 117805DEST_PATH_IMAGE005
表4-3 候选抗体重、轻链可变区的氨基酸序列
Figure 409109DEST_PATH_IMAGE006
实施例4 抗体的理化性质鉴定
4.1 抗体SDS-PAGE鉴定
非还原 (非变性) SDS-PAGE样品准备：将1 µg的抗体或质控品IPI (即伊匹木单抗(Ipilimumab) ，制备方法参见专利申请CN202011300574.2) 加入5×SDS上样缓冲液(含有终浓度为40 mM的碘代乙酰胺) 中，75℃干浴加热10 min，冷却到室温后，12000 rpm离心5 min，取上清。还原 (变性) SDS-PAGE样品准备：将2 µg的重链抗体或质控品IPI加入5×SDS上样缓冲液 (含有终浓度为5 mM的DTT) 中，100℃干浴加热10 min，冷却到室温后，12000 rpm离心5min，取上清。将上清加入Bis-tris 4-15%梯度胶 (金斯瑞) 进行凝胶电泳并通过考马斯亮蓝染色使蛋白条带显色。使用EPSON V550彩色扫描仪扫描带有显色蛋白条带的蛋白凝胶 (脱色液脱色至凝胶背景透明) ，通过ImageJ按照峰面积归一法计算还原和非还原条带纯度。
结果显示在图2A-2D：抗体和质控品IPI非还原胶的条带的表观相对分子量150 kD左右，抗体还原胶的条带的表观相对分子量在55 kD左右和25 kD左右。通过还原和非还原SDS-PAGE分析的抗体的分子量符合预期大小，并且在变性条件下纯度均大于90%。
5.2 抗体的SEC-HPLC单体纯度鉴定
材料准备：1、流动相：150 mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4；2、样品制备：抗体以及质控品IPI均用流动相溶液稀释到0.5 mg/mL。Agilent HPLC 1100色谱柱 (XBridge BEH SEC3.5 µm，7.8 mm I.D.×30 cm，Waters) 流速设为0.8 mL/min，进样体积20 µL，VWD检测器波长为280 nm和214 nm。
抗体的SEC-HPLC分析结果如下：按照面积归一法计算样品中高分子聚集物，抗体单体和低分子聚集物百分比，70%的抗体SEC单体纯度大于90.0%。
实施例5 基于ELISA方法测定候选抗体的亲和力及结合特异性
基于ELISA的方法验证了抗体对BsAb17的亲和活性，还基于ELISA的方法验证了抗体对人血清IgG混合物的结合活性，从而筛选出特异性结合BsAb17而不结合人血清IgG的抗体。
用BsAb17和人血清IgG分别包被96孔板 (2 μg/mL、30 μL/孔) ，4℃过夜；次日，将96孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2 h；用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的待测抗体(20个候选抗体、阴性同型对照无关鼠单抗) 或者仅PBS (空白对照) 并孵育1 h；之后，用PBST清洗3次后加入抗鼠Fc二抗，Anti-mouse-IgG-Fc-HRP (abcam, ab97265) ，并孵育1h；孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB (SurModics，TMBS-1000-01) 显色；根据显色结果，加入2 M HCl终止反应，通过酶标仪 (Molecular Devices，SpecterMax 190) 在OD450下读板。
表5 亲和力较优抗体EC50值
Figure 144984DEST_PATH_IMAGE007
实验结果显示在图3A- 3B和图4A- 4B，结果表明，除了A8抗体会同时结合BsAb17和人血清IgG，其它抗体都特异性结合BsAb17，其中A5、A9、A55、A57、A58、A74、A81、A82抗体展示出较高的结合亲和力，将20个抗体混合后其和BsAb17亲和力及信号值最高 (如作为抗体混合物使用可剔除具有非特异性结合的A8分子) ，这些亲和力较好的抗体及抗体混合物与BsAb17结合的EC50值详见表5。
SEQUENCE LISTING
<110> 三优生物医药（上海）有限公司
上海之江生物科技股份有限公司
<120> 一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用
<130> P21017998C
<160> 101
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A3、A20、A21 VH
<400> 1
Glu Val Lys Val Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ser Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A5
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Thr Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Ile His Trp Gly Lys Gln Ser His Gly Glu Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Ser Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Phe Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Trp Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A8、A50、A81 VH
<400> 3
Glu Val Lys Val Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Thr Thr Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A9 VH
<400> 4
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Gly Leu Leu Arg Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A14 VH
<400> 5
Glu Val Lys Val Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A24 VH
<400> 6
Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Leu Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A45 VH
<400> 7
Glu Val Lys Val Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gly Tyr Gln Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A48 VH
<400> 8
Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120
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<213> Artificial Sequence
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<400> 9
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50 55 60
Lys Asp Glu Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
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Gly Arg Val Ser Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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<213> Artificial Sequence
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
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Gly Arg Ile Ser Pro Asn Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 19
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<213> Artificial Sequence
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
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<400> 22
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1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
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<400> 24
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65 70 75 80
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100 105
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
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<400> 25
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1 5 10 15
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20 25 30
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Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
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<400> 26
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 28
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 31
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A82 VH
<400> 32
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
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100 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A96 VH
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
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100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> A105 VH
<400> 34
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50 55 60
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35
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225
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 37
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 39
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<211> 14
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<213> Artificial Sequence
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<400> 40
Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
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<211> 10
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<213> Artificial Sequence
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<211> 10
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Tyr Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Phe Thr Tyr
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Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Phe Thr Tyr
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Gly Tyr Ser Phe Thr Asp His Tyr Met His
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<400> 59
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
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<212> PRT
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Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 11
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
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Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 11
<212> PRT
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Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Phe Val Ala
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR3
<400> 66
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Thr
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<211> 7
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1 5
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<211> 11
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR2
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Gln Thr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
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<211> 11
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Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 11
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<400> 74
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Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr
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<211> 11
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<213> Artificial Sequence
<223> LCDR1
<400> 76
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR2
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1 5
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<212> PRT
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR3
<400> 80
Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Ala
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR1
<400> 81
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
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<211> 7
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<400> 82
Ser Ala Ala Tyr Arg Tyr Ser
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
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Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 11
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
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<213> Artificial Sequence
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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
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<400> 90
Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR1
<400> 91
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LCDR2
<400> 92
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> VH
<400> 94
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> VL
<400> 95
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HC
<400> 96
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 97
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> LC
<400> 97
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HCDR1
<400> 98
Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HCDR2
<400> 99
Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg
1 5 10
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HCDR3
<400> 100
Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 101
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> VHH
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (13)

1.一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其特征在于，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 56所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 57所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 58所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 62所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 63所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 64所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 41所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 42所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 43所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 62所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 63所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 64所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 46所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 47所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 48所示，和所述LCDR1的序列包如SEQ ID NO: 62所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 63所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 64所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 38所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 44所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 50所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 78所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 79所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 80所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 41所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 42所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 53所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 62所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 63所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 64所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 38所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 49所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 40所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 81所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 82所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 61所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 41所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO:42所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 54所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO:62所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO:63所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 64所示；
或者，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO: 38所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO: 44所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO: 45所示，和所述LCDR1的序列如SEQ ID NO: 85所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO: 60所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO: 61所示。
2.如权利要求1所述的抗药抗体，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列；
或者，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列。
3. 如权利要求1或2所述的抗药抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的第一结合表位包含序列如SEQ ID NO: 88所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO: 89所示的HCDR2、序列如SEQID NO: 90所示的HCDR3、序列如SEQ ID NO: 91所示的LCDR1、序列如SEQ ID NO: 92所示的LCDR2以及序列如SEQ ID NO: 93所示的LCDR3；第二结合表位包含序列如SEQ ID NO: 98所示的HCDR1、序列如SEQ ID NO: 99所示的HCDR2以及序列如SEQ ID NO: 100所示的HCDR3。
4. 如权利要求3所述的抗药抗体，其特征在于，所述第一结合表位包含序列如SEQ IDNO: 94所示的重链可变区和序列如SEQ ID NO: 95所示的轻链可变区；所述第二结合表位包含序列如SEQ ID NO: 101所示的VHH。
5. 如权利要求4所述的抗药抗体，其特征在于，所述第一结合表位包含序列如SEQ IDNO: 96所示的重链和序列如SEQ ID NO: 97所示的轻链。
6.如权利要求1所述的抗药抗体，其特征在于，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv。
7.如权利要求6所述的抗药抗体，其特征在于，当为全长抗体时，其重链恒定区为鼠源或者人源重链恒定区；
和/或，其轻链恒定区为鼠源或者人源轻链恒定区。
8.一种抗体组合物，其包含如权利要求1~7任一项所述的抗药抗体。
9.如权利要求8所述的抗体组合物，其特征在于，其同时包含如权利要求1中所定义的8种抗体。
10.一种分离的核酸，其编码如权利要求1~7任一项所述的抗药抗体。
11.一种重组表达载体，其包含如权利要求10所述的分离的核酸。
12.一种转化体，其在宿主细胞中包含如权利要求11所述的重组表达载体。
13.一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体的制备方法，其包括：培养如权利要求12所述的转化体，从培养物中获得所述结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体。
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