CN112625136A - 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途，提供针对冠状病毒S蛋白并阻断其与ACE2受体结合的中和抗体来预防和治疗冠状病毒。具体涉及特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或多肽复合物，其包含(a)第一表位结合部分，包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中VH和VL形成特异性结合S蛋白的第一表位的抗原结合结构域，和(b)第二表位结合部分，包含特异性结合S蛋白的第二表位的单域抗体或其VHH片段，第一、第二表位结合部分彼此融合且互不相同。还涉及编码抗体或多肽复合物的多核苷酸及包含其的宿主细胞、制备抗体或多肽复合物的方法。所述抗体或多肽复合物可用于预防、治疗、诊断和/或检测冠状病毒。

Description

针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
技术领域
本公开一般地涉及抗体及其用途。更具体地，本公开涉及特异性识别冠状病毒刺突蛋白 的双特异性抗体、其制备方法及用途。
背景技术
自2002年重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromescoronavirus(SARS-CoV))爆发以来，冠状病毒(CoV)成为了一种引起主要公共卫生问题的RNA 病毒。目前，全世界都在关注2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。该病毒可以在人与人之间传 播，而且感染该病毒的患者可表现为严重的病毒性肺炎和呼吸系统疾病。从那时起，感染 SARS-CoV-2的病例数量一直在增加。截止2020年7月24日，全球累计确诊感染该新型冠 状病毒的患者超1560万例，死亡超63万例而且全球确诊病例在不断攀升，形势非常严峻。
针对此类冠状病毒在临床上以对症支持治疗为主。考虑到此类冠状病毒持续危及人类健 康，且具有高传播性和致死率等特点，很有可能引起更多的公共卫生问题，因此需要针对此 类冠状病毒的致病机制开发出具有抑制或阻断病毒感染的预防和治疗性抗病毒剂，为未来在 人群中出现流行或甚至大范围地出现此类冠状病毒感染时提供针对它们的预防和早期治疗。
研究显示此类冠状病毒通过刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞上的受体血管紧张素转换酶 Ⅱ(angiotensin converting enzymeⅡ，也称为ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞(Ashour HM 等人，Insights into the Recent 2019 Novel Coronavirus(SARS-CoV-2)inLight of Past Human Coronavirus Outbreaks，Pathogens，2020年3月4日；9(3).pii:E186.doi: 10.3390/pathogens9030186；Roujian Lu等人，Genomic characterisationand epidemiology of 2019 novel coronavirus:implications for virus origins andreceptor binding，www.thelancet.com，2020 年1月29日网上公开，https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)。因此，本领域需要开 发出针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与宿主细胞上的ACE2受体结合的高亲和力中和抗体， 来有效预防和治疗此类冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV病毒)感染。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种特异性结合冠状病毒S蛋白的多肽复合物，所述多肽复 合物包含：(a)第一表位结合部分，其特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第一表位；和(b)第 二表位结合部分，所述第二表位结合部分包含特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第二表位的 单域抗体或其VHH片段；其中所述第一表位结合部分和所述第二表位结合部分彼此融合， 并且其中所述第一表位不同于所述第二表位。
在一些实施方案中，所述第一表位结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其 中VH和VL一起形成特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第一表位的抗原结合位点。在一些 实施方案中，所述第一表位结合部分与所述第二表位结合部分互不竞争表位。在一些实施方 案中，所述第一表位结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，第一表位结合部分或VH包含：
SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR1(HCDR1)或其不超过2 个氨基酸变化的变体，SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链 CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体，和SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基 酸序列中的第一重链CDR3(HCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，第一表位结合部分或VL包含：SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨 基酸序列中的轻链CDR1(LCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体，SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR2(LCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体，和SEQ IDNO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3(LCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，所述第一HCDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成； 所述第一HCDR2包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；所述第一HCDR3包含或由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成；所述LCDR1包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基 酸序列组成；所述LCDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/或所述LCDR3 包含或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述VH包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:1所示的序列或与其 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或所述VL包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一表位结合部分包含含有所述VH的重链和含有所述VL的 轻链，并且其中所述重链包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:22所示的序列或与其具有至 少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或所述轻链包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:23所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述单域抗体包含VHH片段或由VHH片段组成。
在一些实施方案中，所述单域抗体包含：SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:5、6或7所示 的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体；和SEQ IDNO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR3(HCDR3)或其不超过2个氨基 酸变化的变体。
在一些实施方案中，所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:14、18或20所示的氨基酸序列组成；所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15或21所示的氨基酸序列组成；和/或所 述第二HCDR3包含或由SEQ ID NO:16、17或19所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成； 所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；且所述第二HCDR3包含或由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述第二HCDR1包含或 由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成；所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的 氨基酸序列组成；且所述第二HCDR3包含或由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成。在 其他一些实施方案中，所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成； 所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成；且所述第二HCDR3包含 或由SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述单域抗体或其VHH片段包含或由下列序列组成：SEQ IDNO:5、 6或7所示的VHH氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一 个重链的C-末端融合；所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一个 轻链的C-末端融合；所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个重 链的N-末端融合；所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个轻链 的N-末端融合；和/或所述第二表位结合部分包含至少2个相同或不同的VHH片段，所述 VHH片段以串联的方式与所述第二表位结合部分融合或分别与所述第二表位结合部分融合。
在一些实施方案中，所述第一表位结合部分包含Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区 为IgG1 Fc或IgG4 Fc。在一些实施方案中，所述Fc区为具有L234A和L235A的IgG1 Fc或具有S228P突变的IgG4 Fc。
在一些实施方案中，所述第一表位结合部分和所述第二表位结合部分经由肽键或肽接头 彼此融合。在一些实施方案中，所述肽接头具有不超过约30个氨基酸的长度。在一些实施方 案中，所述肽接头包含选自SEQ ID NO：42-50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述单域抗体为骆驼科单域抗体或人源化单域抗体。
在一些实施方案中，所述多肽复合物包含SEQ ID NO:29、30或31所示的氨基酸序列或 与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多肽复合物是双特异性抗体复合物，所述双特异性抗体复合物 由2条重链和2条轻链组成，所述重链由SEQ ID NO:29、30或31所示的氨基酸序列组成， 并且所述轻链由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列组成。
在一个方面，本公开还提供了一种特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体，其可单独用于结 合和抑制冠状病毒S蛋白，也可作为本公开的多肽复合物的一个表位结合部分，如下文所详 细描述。
在一个方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，其编码本公开所述的抗体或多肽复合 物。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包括SEQ ID NO:33所示的序列和/或SEQID NO: 39、40或41所示的序列。
在一个方面，本公开提供了一种分离的载体，其包含本公开所述的多核苷酸。
在一个方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本公开所述的多核苷酸或载体。
在一个方面，本公开提供了一种表达本公开所述的抗体或多肽复合物的方法，所述方法 包括在适于表达所述抗体或多肽复合物的条件下培养本公开所述的宿主细胞，以及任选地从 所述宿主细胞或从培养基回收所述的抗体或多肽复合物。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本公开所述的抗体或多肽复合物和 药学上可接受的载体。
在一个方面，本公开提供了一种检测试剂盒，其包含本公开所述的抗体或多肽复合物。
在一个方面，本公开提供了一种治疗和/或预防冠状病毒相关疾病例如冠状病毒感染诸如 COVID-19的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本公开的抗体或多肽复合物。
在一个方面，本文还涉及本公开所述的抗体或多肽复合物在制备用于治疗和/或预防受试 者中的冠状病毒感染的药物中的用途。在一些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病 毒，所述冠状病毒感染是COVID-19。
在一个方面，本文还涉及本公开所述的抗体或多肽复合物在制备用于检测冠状病毒或诊 断冠状病毒感染的诊断剂或试剂盒中的用途。在一些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒，所述冠状病毒感染是COVID-19。
在一个方面，本文还涉及本公开的抗体或多肽复合物，其用于治疗和/或预防冠状病毒相 关疾病例如冠状病毒感染诸如COVID-19。
在一个方面，本公开提供了一种体外检测环境中冠状病毒污染的方法，其包括：提供环 境样品；使所述环境样品与本公开所述的抗体或多肽复合物或本公开所述的检测试剂盒接触； 以及检测本公开所述的抗体或多肽复合物与冠状病毒S蛋白之间的复合体的形成。在一些实 施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
在一个方面，本公开提供了一种特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段， 其包含：
(a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含：SEQ ID NO:1所示的重链 可变区氨基酸序列中的第一重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体，SEQID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化 的变体，和SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR3(HCDR3)或其不 超过2个氨基酸变化的变体；并且其中所述VL包含：SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR1(LCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体，SEQ ID NO:2所示的轻 链可变区氨基酸序列中的轻链CDR2(LCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体，和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3(LCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变 体；或
(b)VHH片段，所述VHH片段包含：SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中 的第二重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:5、6或7所示的 VHH氨基酸序列中的第二重链CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体；和SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR3(HCDR3)或其不超过2个氨基酸变 化的变体。
在一些实施方案中，所述第一HCDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成； 所述第一HCDR2包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；所述第一HCDR3包含或由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成；所述LCDR1包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基 酸序列组成；所述LCDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/或所述LCDR3 包含或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述VHH片段包含：如式GFRFGSYX1MS所示的氨基酸序列的第二HCDR1，其中X1为Y、T或V；如式DINTRGX2X3TR所示的氨基酸序列的第二HCDR2， 其中X2为E或I，且X3为T或V；以及如式AASX4X5TFX6GRSDPDY所示的氨基酸序列的 第二HCDR3，其中X4为G或P，X5为D或A，且X6为E或F。
附图说明
图1描述本公开靶向SARS-CoV-2(2019-nCoV)冠状病毒S蛋白的全人抗体、纳米抗体和 双表位双特异性抗体产生和活性检测的实验流程。
图2A显示人ACE2-huFc与S蛋白RBD-mFc的结合活性。
图2B显示人ACE2-His与S蛋白S1-huFc(也称为Spike S1-huFc)或S蛋白RBD-mFc(也 称为Spike RBD-mFc)的结合活性。
图3A显示抗体在第一轮和第二轮淘选中输出(Output)的噬菌体于ELISA测定法中与S蛋 白RBD-mFc的结合能力,使用VSCM13辅助噬菌体作为阴性对照。
图3B显示了抗体在第二轮和第三轮淘选中输出的噬菌体于ELISA测定法中与S蛋白 RBD-mFc的结合能力。
图4显示R15-F7制备成全长抗体后，SDS-PAGE鉴定抗体的纯度结果。
图5显示R15-F7制备成全长抗体后，HPLC-SEC鉴定抗体单体纯度的结果。
图6A-图6B显示R15-F7抗体采用差式扫描荧光法(DSF)测定的热稳定性的荧光曲线和 Tm值。
图7显示通过ELISA方法测定R15-F7抗体结合抗原蛋白RBD的亲和活性。
图8A显示通过Fortebio方法测定R15-F7抗体结合抗原蛋白RBD的亲和活性的结合模 式图。
图8B显示R15-F7与RBD蛋白结合亲和力的曲线图。
图9显示通过ELISA方法检测抗体R15-F7阻断RBD与受体蛋白ACE2结合的结果。
图10显示通过FACS方法检测抗体R15-F7阻断RBD与ACE2-HEK293细胞的结合。
图11A显示抗体在第一轮和第二轮淘选中输出(Output)的噬菌体于ELISA测定法中与S 蛋白RBD-mFc的结合能力，使用VSCM13辅助噬菌体作为阴性对照。
图11B显示了抗体在第二轮和第三轮淘选中输出的噬菌体于ELISA测定法中与S蛋白 RBD-mFc的结合能力。
图12显示P14-F8制备成全长抗体后，SDS-PAGE鉴定抗体的纯度结果。
图13显示P14-F8制备成全长抗体后，HPLC-SEC鉴定抗体单体纯度的结果。
图14显示通过ELISA方法测定P14-F8抗体结合抗原蛋白RBD的亲和活性。
图15显示通过Fortebio检测P14-F8与RBD蛋白结合亲和力的曲线图。
图16显示通过ELISA方法检测抗体P14-F8阻断RBD与受体蛋白ACE2结合的结果。
图17显示通过FACS方法检测抗体P14-F8阻断RBD与ACE2-HEK293细胞的结合。
图18A-图18B显示通过ELISA方法测定P14-F8及其人源化抗体结合抗原蛋白RBD的亲和活性。
图19A-图19B显示通过ELISA方法测定P14-F8及其人源化抗体阻断抗原蛋白RBD与受体ACE2结合的效果。
图20显示通过ELISA方法测定P14-F8-hVH8及其亲和力改造优选分子与RBD抗体结合 活性。
图21显示通过ELISA方法测定P14-F8-hVH8及其亲和力改造优选分子阻断RBD-ACE2 结合活性。
图22显示通过ELISA方法测定双抗及对应单抗和RBD抗体结合活性。
图23显示通过ELISA方法测定双抗及对应单抗阻断RBD-ACE2结合活性。
图24A-图24G显示通过Fortebio方法测定双抗及对应单抗和RBD-His抗原的亲和力常 数，其中图24A为BsAb16，图24B为BsAb17，图24C为BsAb18，图24D为R15-F7，图 24E为P14-F8-43，图24F为P14-F8-35，图24G为P14-F8-38。
图25A-图25C显示通过FACS方法检测双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗R15-F7、P14-F8-35、P14-F8-38、P14-F8-43、单抗联合R15-F7+P14-F8-35、R15-F7+P14-F8-38 和R15-F7+P14-F8-43阻断RBD与ACE2-HEK293细胞的结合。
图26A-图26M显示通过FACS方法检测双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗R15-F7、P14-F8-35、P14-F8-38、P14-F8-43、单抗联合R15-F7+P14-F8-35、R15-F7+P14-F8-38 和R15-F7+P14-F8-43与HEK293细胞非特异性结合的结果，其中图26A为结果汇总，图26B 为BsAb16，图26C为BsAb17，图26D为BsAb18，图26E为P14-F8-35，图26F为P14-F8-38，图26G为P14-F8-43，图26H为R15-F7，图26I为R15-F7+P14-F8-35，图26J为 R15-F7+P14-F8-38，图26K为R15-F7+P14-F8-43，图26L为同种型对照，图26M为仅细胞 阴性对照。
图27A-图27M显示通过FACS方法检测双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗R15-F7、P14-F8-35、P14-F8-38、P14-F8-43、单抗联合R15-F7+P14-F8-35、R15-F7+P14-F8-38 和R15-F7+P14-F8-43与Jurkat细胞非特异性结合的结果,其中图27A为结果汇总，图27B为 BsAb16，图27C为BsAb17，图27D为BsAb18，图27E为P14-F8-35，图27F为P14-F8-38，图27G为P14-F8-43，图27H为R15-F7，图27I为R15-F7+P14-F8-35，图27J为 R15-F7+P14-F8-38，图27K为R15-F7+P14-F8-43，图27L为同种型对照，图27M为仅细胞 阴性对照。
图28A-图28B显示抗体样品BsAb16、BsAb17、BsAb18、R15-F7和P14-F8中和2019-nCoV 冠状病毒的中和效果，其中图28A为假病毒中和试验，图28B为真病毒中和试验。
具体实施方式
虽然本公开可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本公开原理的其具体的 举例说明性实施方式。应该强调的是，本公开不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本 文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通 常所理解的含义相同的含义。为了本公开的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定 数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项 中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任 意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则 也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体 可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“冠状病毒(Coronaviruses，CoV)”在本文中是指属于冠状病毒科(Coronaviridae)β冠状 病毒属的病毒，病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约60～220nm。病毒为单股正链RNA(+ssRNA) 病毒。在几种对人类有致病性的冠状病毒中，大多数与轻度的临床症状有关(SuS,Wong G,Shi W等人，Epidemiology,genetic recombination,andpathogenesis ofcoronaviruses.Trends Microbiol 2016；24:490–502)，但有两种冠状病毒是值得注意的例外：一种是SARS-CoV，其 在2002年到2003年间在37个国家和地区造成8000多例人类感染和774例死亡(Chan-Yeung M,Xu RH.SARS:epidemiology.Respirology2003；8(suppl):S9–14)；另一种是引起人类新型冠 状病毒疾病(Corona Virus Disease2019，COVID-19)的2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，具有 强烈的在人群中传播的能力，大多数感染患者发高烧，有些患有呼吸困难，胸部X光片显示 双肺都有浸润性病变。世界卫生组织(WHO)最近将所述2019-nCoV命名为SARS-CoV-2。在 本文中，“2019-nCoV”和“SARS-CoV-2”可互换地使用。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特 异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。抗体可以是任 何型和亚型(例如，IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例 如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)。完整抗体的单体是由二硫键连接两个全长的轻 链和两个全长的重链形成的一个四肽链分子，也称为Ig分子的单体。抗体单体是构成抗体的 基本结构。
本文所用的“分离的抗体”旨在指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体(Ab)的抗体(例 如，分离的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段基本不含特异性结合冠状病 毒S蛋白以外的抗原的Ab)。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述 纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或 反相HPLC)来确定。
本文所用的“阻断抗体”、“中和性抗体”、“具有中和活性的抗体”或“中和抗体”在本文中可 互换地使用，指这样的抗体，其与靶抗原结合或与之相互作用并阻止靶抗原与结合配偶体如 受体结合或缔合，因而抑制或阻断本将因靶抗原与结合配偶体如受体的相互作用而产生的生 物学反应。在本公开的情况下，指所述抗体与冠状病毒S蛋白的结合导致冠状病毒的至少一 种生物活性被抑制。例如，本公开的中和抗体可以阻止或阻断冠状病毒S蛋白与ACE2结合。
“表位”或“抗原决定子”指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合部位相互 作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不 同区域，并可以具有不同的生物学效应。表位可以由连续氨基酸或经蛋白质的三级折叠并接 的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级 折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个， 并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部 分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。 可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片 段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单链Fab、双体抗体(diabody)、单 结构域抗体或单域抗体(sdAb，纳米抗体)、骆驼科Ig、Ig NAR、F(ab)'3片段、双-scFv、(scFv)2、 微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。所述术 语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特 异性抗体)和其抗原结合片段。更详细的描述也请参见：皮尔斯目录与手册(PierceCatalog and Handbook),1994-1995(皮尔斯化学公司(PierceChemicalCo.),罗克福德(Rockford),伊利诺伊州 (IL))；Kuby,免疫学杂志,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二 硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中 缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻 链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)组成。轻链恒定区由一个 结构域CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、 δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形 成“Y”形状。Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合 在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig结 构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构 成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结 合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责 抗原结合。
轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的 “构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换 使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗 原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常 被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR 被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、 LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨 基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统 包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342: 877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))、基于抗体序列可变性的 Kabat(Kabat等人,Sequences of ProteinsofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,NationalInstitutes of Health(1987))、AbM(University of Bath)、 Contact(University College London)、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)、以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的 North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所 差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat 和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。
表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围
Figure BDA0002786692770000091
Figure BDA0002786692770000101
因此，在涉及用本公开定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样 的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的 指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本公开所定义的具体CDR边界不同。
本公开抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有 说明，否则在本公开中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其 是成分轻链和重链的组合构架区)用以在三维空间中定位和比对CDR。CDR主要负责结合到 抗原的表位。具有不同特异性(即针对不同抗原有不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管 抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR 内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染单个抗体的轻链和重链基因 的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤 细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实例中，双链Fv种类由一个重链 可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中， 一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重 链可以按类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变结构域的三个高变 区(HVR)相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同地赋予对 抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR 的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。
Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的 第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1结构域的羧基末端增 添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′的名称， 其中恒定结构域的半胱氨酸残基携有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为其间具有铰链 半胱氨酸的Fab′片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
当谈及抗原/表位和抗体时使用的术语“特异性结合”或“结合”意指抗体与生理条件下相对 稳定的抗原形成复合物。用于确定抗体是否与抗原/表位特异性结合的方法是本领域熟知的并 且例如包括表面等离振子共振测定法、MSD测定法(Estep,P.等人,Highthroughputsolution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning,MAbs, 2013.5(2):p.270-278)、ForteBio亲和力测定法(Estep,P等人，Highthroughput solution basedmeasurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.MAbs,2013.5(2):p.270-8) 等。
在一个实施方案中，本公开的“特异性结合”冠状病毒S蛋白的抗体例如双特异性抗体如 ForteBio亲和力测定法中测量，以至少约10-8M，优选10-9M；更优选10-10M，进一步优选 10-11M，更优选10-12M的KD与S蛋白结合，由此阻断或抑制冠状病毒S蛋白与其受体ACE2结合以及随后的膜融合。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共 价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例 如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可 用结合解离平衡常数(KD)来表述。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，包括现有技 术已知以及本文中所描述的那些。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一种或多种改变的抗体，其与不具 有那些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在一个实施方案中， 亲和力成熟的抗体具有对靶抗原的纳米摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体通过本 领域中已知的程序来制备。例如Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH- 结构域和VL-结构域混编的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变例如由以下文献描述： Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)； Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)； 以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的 情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待 检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋 白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如S蛋白或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性 结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接 放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等， 1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。通常所述测定法涉及使用结合带有未标记的检测 抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量 在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗 原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与 参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位 的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提 供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。
在一个实施方案中，可根据如下规则判断两个抗体之间是否会存在表位竞争：
竞争百分比＝实验组信号值/对照组信号值×％
实验组信号值：固化抗原后加入抗体1，待抗体1结合平衡后，加入抗体2，观测抗体2 加入产生的信号值；对照组信号值：固化抗原后加如缓冲液，缓冲液和实验组抗体1孵育时 间一致，然后加入抗体2，观测抗体2加入产生的信号值；其中，“竞争百分比＜20％”表示“表位完全竞争”；“20％＜竞争百分比＜60％”表示“表位部分竞争”；“竞争百分比＞ 60％”表示“表位完全不竞争”。
如本文所用，术语“变体”是指具有至少一个，例如1、2或3个氨基酸变化例如氨基酸取 代、缺失或添加的多肽或片段如重链可变区或轻链可变区。包含重链或轻链变体的经修饰的 抗原/表位结合多肽/部分基本上保留修饰前抗原/表位结合多肽/部分的生物学特征。在一个实 施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原/表位结合多肽/部分保留修饰前抗原 结合多肽的60％、70％、80％、90％、100％或以上的生物学特征。应当理解，可以单独或在 与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。在一个实施方案 中，本公开的抗原/表位结合多肽/部分包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨 基酸序列。在一个实施方案中，本公开的抗原/表位结合多肽/部分包含与本文描述的轻链可变 区氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或 99％同源的轻链可变区氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开的抗原/表位结合多肽/部分包 含与本文描述的单域抗体VHH片段氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的单域抗体VHH片段。同源性百分比可以在整 个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于构架区，而对应于CDR 的序列与重链可变区和/或轻链可变区和/或VHH片段内本文中公开的CDR具有100％同一 性。
如本文所用，术语“CDR变体”是指具有至少一个，例如1、2或3个氨基酸变化例如取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原/表位结合多肽/部分基本上保留修饰前抗原/表位结合多肽/部分的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原/表位结合多肽/部分保留修饰前抗原/表位结合多肽/部分的至少60％、70％、80％、90％、100％ 或以上的生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR可以单独或与另一个CDR组合修饰。 在一个实施方案中，修饰或变化是取代，特别是保守取代。
“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR，而该人源 化抗体的剩余免疫球蛋白部分来源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，构架支持残基可以 改变以保留结合亲和力(参见例如Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人接受抗体可以 是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常规数据库例如Los Alamos数据库和Swiss蛋白质数据库选择的抗体。以与供体抗体的构架区的同源性(基于氨基酸)表征的人抗体 可以适合于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变构架区。可以以类似的方式 选择能够提供轻链恒定或可变构架区的合适受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链 不需要来源于相同的受体抗体。
“人抗体”是指具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用如本文公开的用于制 备人抗体的技术中的任一种所制备的抗体。人抗体的该定义明确地排除了包含非人抗原结合 残基的人源化抗体。可使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示文库来制备人抗体。
如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链， 并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、 和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
如下进行序列之间序列同一性的计算。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性 百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸 序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实 施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地 至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在 对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中 对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。可以利 用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使 用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol. 48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空 位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之 间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在 http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80 和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4 和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地， 可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检 索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送 入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、 裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA 表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
在本公开中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且可包 括已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”， 其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细 胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具 有相同功能或生物学活性的突变子代。
在本文中，“受试者”、“个体”或“对象”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感 染的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠 物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有冠状病毒感染或处于具有冠状病毒 感染风险的人受试者。在本公开中，向有此需要的受试者施用本公开所述的抗体或本公开所 述的药物组合物或制品是指给予有效量的所述抗体或药物组合物或制品等。
如本公开所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动 物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受 该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或 者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的 量。
II.本公开抗体所针对的冠状病毒、其结构和进入宿主细胞的方式
冠状病毒(包括SARS-CoV和新近发现的SARS-CoV-2)是球形单股正链RNA病毒，其特 征是，具有从病毒体表面突出的刺突蛋白(Barcena,M.等人，Cryo-electrontomography ofmouse hepatitis virus:Insights into the structure of the coronavirion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009,106, 582–587)。病毒颗粒的球形形态以及刺突突起使得冠状病毒在电子显微镜下看起来像冠冕而 被命名为冠状病毒。
冠状病毒是被包膜的病毒(所被包膜衍生自宿主细胞膜的脂质双层)，具有主要由病毒结 构蛋白(例如刺突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、包膜蛋白(Envelope，E)和核衣壳 蛋白(Nucleocapsid，N))形成的病毒结构，其中S蛋白、M蛋白和E蛋白均嵌入在病毒包膜中， N蛋白与病毒RNA相互作用，位于病毒颗粒的核心，形成核衣壳(Fehr,A.R.等人，Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis.MethodsMol.Biol.2015,1282,1–23)。S蛋白是 一种高度糖基化的蛋白，可在病毒颗粒表面形成同源三聚体的刺突，并介导病毒进入宿主细 胞。SARS-CoV-2是具有膜结构的、大小为80-120nm的单股正链RNA病毒，基因组长度约 为29.9kb，该病毒与同属于冠状病毒科β冠状病毒属的SARS-CoV的基因组序列之间的同源 性为80％。病毒基因组的可读框(Open readingframe，ORF)ORF1a和ORF1b占基因组的2/3， 表达水解酶以及与复制、转录相关的酶，例如，半胱氨酸蛋白酶(PLpro)和丝氨酸蛋白酶 (3CLpro)、RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)和解旋酶(Hel)；后面的基因组1/3区域主要负责编 码结构蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)等主要结构蛋白， 其中N蛋白包裹病毒基因组形成核蛋白复合体，E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程， S蛋白则主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒的宿主特异性。经序列比 对，发现SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV病毒的S蛋白具有75％的相似度，据报道称多株SARS-CoV冠状病毒分离株中位于S蛋白与ACE2受体(在人体中主要分布于呼吸道上皮细胞、 肺脏、心脏、肾脏和消化道等位置)复合物界面的442、472、479、487和491位点的氨基酸 残基是高度保守的。与SARS-CoV的S蛋白相比较，在所述5个位点处，SARS-CoV-2蛋白 仅第491位氨基酸相同，其它4处氨基酸都发生了突变。尽管如此，通过蛋白质3D结构模 拟预测发现，虽然SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2受体结合的所述4个关键氨基酸都发生了 替换，但是相对于SARS-CoV的S蛋白，SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)的三维结构几乎不变，由此SARS-CoV-2的S蛋白与人体ACE2仍然 具有较高的亲和力。最近的文章(WrappD等人，Cryo-EMStructure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation，Science,2020年2月19日，网上公开，pii:eabb2507.doi: 10.1126/science.abb2507)以及(Xiaolong Tian等人，Potent binding of 2019novel coronavirus spike protein by aSARScoronavirus-specific human monoclonal antibody,Emerging Microbes&Infections，2020,9:1,p382-385,DOI:10.1080/22221751.2020.1729069)通过Fortebio检测发现， SARS-CoV-2的S蛋白结合人类ACE2的亲和力(KD)约为15nM，与SARS-CoV的S蛋白结合人类ACE2的亲和力相当，由此可见，ACE2也是SARS-CoV-2感染人体进入细胞内部的 受体蛋白。预期针对冠状病毒S蛋白并且阻断其与ACE2受体结合的高亲和力中和抗体，能 够有效预防和治疗冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV)感染。
III.针对冠状病毒S蛋白的多肽复合物
术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、“冠 状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用，是指这样 的本公开的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白(例如，SARS-CoV-2S 蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒S蛋白的诊断剂、预防剂和/ 或治疗剂。
在一个方面，本公开提供了一种新的特异性结合冠状病毒S蛋白的多肽复合物，所述多 肽复合物包含：(a)第一表位结合部分，所述第一表位结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可 变区(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第一表位的抗原结合位 点，和(b)第二表位结合部分，所述第二表位结合部分包含特异性结合所述冠状病毒S蛋白的 第二表位的单域抗体(sdAb)或其VHH片段，其中所述第一表位结合部分和所述第二表位结合 部分彼此融合，并且其中所述第一表位不同于所述第二表位。在一些实施方案中，所述第一 表位结合部分与所述第二表位结合部分互不竞争表位。在一些实施方案中，sdAb是骆驼科 sdAb或人源化sdAb。在一些实施方案中，第一表位结合部分包含含有VH的重链和含有VL 的轻链。在一些实施方案中，第二表位结合部分在第一表位结合部分的重链N-末端、轻链 N-末端、Fc区C-末端、重链C-末端或轻链C-末端处与第一表位结合部分融合。在一些实施 方案中，第一表位结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二表位结合部分与第 一表位结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分经由肽键或肽接头与 第一表位结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头具有不超过约30个(诸如不超过约25个、 20个、或15个中任一个)的氨基酸长度。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区， 诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
本申请的发明人出乎意料地发现，特异性结合冠状病毒S蛋白的不同表位的多肽复合物 能够以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白。相比于单独的特异性结合冠状病毒S蛋白单独 表位，本公开的多肽复合物以协同的方式结合冠状病毒S蛋白并阻断冠状病毒S蛋白与ACE2 的结合。在一些实施方案中，本公开的多肽复合物可以用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠 状病毒感染的个体。
本公开的多肽复合物具有至少两个表位/抗原结合部分，其可特异性结合冠状病毒S蛋白 上的至少两个不同的表位。本公开的多肽复合物可以是对称的或非对称的。例如，本公开的 多肽复合物可包含第一表位/抗原结合部分的一个或两个拷贝，和第二表位/抗原结合部分的一 至八个拷贝。
第一表位/抗原结合部分
术语“表位结合部分”和“抗原结合部分”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，第一 表位结合部分包含结合所述冠状病毒S蛋白的第一表位的抗原结合位点。在一些实施方案中， 第一表位结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结 合所述冠状病毒S蛋白的第一表位的抗原结合位点。在一些实施方案中，第一表位结合部分 是全长抗体或其抗原结合片段诸如F(ab)2。
在一些实施方案中，在本公开的第一表位结合部分中，重链可变区(VH)可包含：SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化 的变体；SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR2(HCDR2)或其不超 过2个氨基酸变化的变体；和/或SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链 CDR3(HCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，在本公开的第一表位结合部分中，轻链可变区(VL)可包含：SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR1(LCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变 体；SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR2(LCDR2)或其不超过2个氨 基酸变化的变体；和/或SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3(LCDR3) 或其不超过2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方案中，氨基酸变化可以是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，氨基酸变化 是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第一HCDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成； 所述第一HCDR2包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；和/或所述第一HCDR3包含或由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述LCDR1包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；所述LCDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/或所述LCDR3包含或由SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的第一表位结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中重 链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:1的序列或与其具有至少80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或轻链可变区包 含或由下列序列组成：SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，氨基酸变化 不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本公开的第一表位结合部分包含重链和轻链，其中重链包含或由下 列序列组成：SEQ ID NO:22所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或轻链包含或由下列序列组成：SEQID NO:23所 示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同 一性的序列。在一些实施方案中，氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本公开的第一表位结合部分包含Fc区。在一些实施方案中，Fc区 来自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，Fc区来自IgG1或IgG4。 在一些实施方案中，Fc区来自人IgG1或人IgG4。在一些更具体的实施方案中，Fc区为具有 L234A和L235A的IgG1 Fc或具有S228P突变的IgG4 Fc。
在本公开的一些实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。 在一些实施方式中，本文所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。保守取代是指 一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代， 一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性 的取代如下表B所示：
表B.示例的氨基酸取代
Figure BDA0002786692770000171
Figure BDA0002786692770000181
在一些实施方案中，本公开所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。在 一些实施方案中，本公开所述的氨基酸变化发生在Fc区。在一些实施方案中，提供了包含含 有一个或多个突变的Fc结构域的抗体或表位结合部分，该突变增强或减弱抗体或表位结合部 分例如与中性pH相比在酸性pH下与FcRn受体的结合。例如，本公开包括在Fc结构域的 CH2或CH3区中含有突变的抗冠状病毒S蛋白抗体或结合冠状病毒S蛋白表位的表位结合部 分，其中该一个或多个突变提高Fc结构域在酸性环境(例如在pH在约5.5至约6.0范围内的 内体中)中与FcRn的亲和力。这种突变可以导致对动物施用时抗体血清半衰期的提高。这类 Fc修饰的非限制性实例包括，例如：250位(例如E或Q)、250位和428位(例如L或F)、252 位(例如L/Y/F/W或T)、254位(例如S或T)和256位(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或428位和/或433位(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434位(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、 N434H、N434F或N434Y])的修饰；或250位和/或428位的修饰；或307位或308位(例如 308F、V308F)和434位的修饰。在一个实施方案中，该修饰包括428L(例如M428L)和434S(例 如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434 (例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例 如T250Q和M428L)；及307和/或308修饰(例如308F或308P)。还在另一实施方案中，该 修饰包括265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)修饰。例如，本公开包括含有Fc结构 域的抗冠状病毒S蛋白抗体或表位结合部分，该Fc结构域包含选自以下的一对(组)或多对(组) 突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和 T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和 434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A (例如T307A、E380A和N434A)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。在一个实施方 案中，本公开包括含有Fc结构域的抗冠状病毒S蛋白抗体或表位结合部分，该Fc结构域包 含IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变和本文公开的抗 体可变结构域内的其他突变的任意可能的组合都包含在本公开的范围之内。
在一些实施方案中，本文中所提供的冠状病毒S蛋白抗体或表位结合部分经改变以增加 或降低其糖基化的程度。对冠状病毒S蛋白抗体或表位结合部分的糖基化位点的添加或缺失 可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。当冠状病毒S 蛋白抗体或表位结合部分包含Fc区时，可以改变与Fc区连接的糖类。在一些应用中，除去 不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细 胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷 化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方案中，可在本文中所提供冠状病毒S 蛋白抗体或表位结合部分的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便 增强例如本公开的冠状病毒S蛋白抗体预防和/或治疗冠状病毒感染的有效性。在一些实施 方案中，适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和 IgG4，优选人IgG1。在一些实施方案中，通过突变人IgG1Fc的L234A和L235A，去除或降 低ADCC效应和CDC效应。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到 某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR) 上，使得这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合到携带抗原的靶细胞，并且随后利用细胞 毒素杀死靶细胞。为评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专 利5,500,362或5,821,337中所述的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典补体途径的 激活通过补体体系的第一组分(C1q)与结合到其同源抗原的抗体(合适的亚类)结合而引发。为 了评估补体激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的。具有改变的Fc区氨基酸序列以及增加或减小的C1q结合能力的抗体 变体描述于美国专利6,194,551B1和WO99/51642中。那些专利公布的内容具体地以引用方式 并入本文。还可参见，Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一个方面，本公开提供了一种特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段， 其可单独或作为本公开的多肽复合物的一个表位结合部分，用于预防冠状病毒感染和/或治 疗冠状病毒感染的个体。
在一些实施方案中，本公开的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体包含重链可变区(VH)和 轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)可包含：SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸 序列中的重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:1所示的重链 可变区氨基酸序列中的重链CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体；和/或SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的重链CDR3(HCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变 体；和/或所述轻链可变区(VL)可包含：SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR1(LCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序 列中的轻链CDR2(LCDR2)或其不超过2个氨基酸变化的变体；和/或SEQ ID NO:2所示的轻 链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3(LCDR3)或其不超过2个氨基酸变化的变体。在一些进一 步的实施方案中，所述HCDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成；所述HCDR2 包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；和/或所述HCDR3包含或由SEQ IDNO:10 所示的氨基酸序列组成。在一些进一步的实施方案中，所述LCDR1包含或由SEQ IDNO:11 所示的氨基酸序列组成；所述LCDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/ 或所述LCDR3包含或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成。
在一些进一步的实施方案中，特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体包含重链可变区和轻链 可变区，其中重链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:1的序列或与其具有至少80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或 轻链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中， 氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些进一步的实施方案中，本公开的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体包含重链和轻 链，其中重链包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:22所示的序列或与其具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或轻链包含或由下列序 列组成：SEQ ID NO:23所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些进一步的实施方案中，本公开的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体是本公开的 R15-F7抗体。
第二表位结合部分
在一些实施方案中，本公开的多肽复合物包含(a)第一表位结合部分和(b)第二表位结合 部分，所述第二表位结合部分包含特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第二表位的单域抗体或 其VHH片段。
在一些实施方案中个，第二表位结合部分包含特异性结合所述冠状病毒S蛋白的VHH 片段。在一些实施方案中，VHH片段是天然的、人源化的和/或经亲和力成熟的。
术语“单结构域抗体”、“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结 合多肽。单独的sdAb能够与抗原结合，但不与相应的含CDR多肽配对。在一些情况下，sdAb 从骆驼科HCAb工程化，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”。骆驼科sdAb是最小 的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-8(1993)； Greenberg等人，Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。
本文公开的单域抗体可由本领域技术人员根据本领域已知的方法或任何未来的方法制备。 例如，可以使用本领域已知的方法获得VHH，例如通过免疫骆驼科动物并从中获得与靶抗原 结合并中和靶抗原的VHH，或者通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆本公开的VHH 的文库，然后通过使用噬菌体展示进行选择。在一些实施方案中，本公开的单域抗体在骆驼 科动物中天然产生，即，使用本文对于其它抗体描述的技术，用冠状病毒S蛋白或其片段免 疫骆驼科动物来生产。
在一些实施方案中，通过用所需抗原免疫美洲驼或羊驼并随后分离编码重链抗体的 mRNA来获得单域抗体。通过逆转录和聚合酶链反应，产生含有数百万克隆的单域抗体的基 因文库。筛选技术如噬菌体展示和核糖体展示有助于鉴定结合抗原的克隆。其中噬菌体展示 是在噬菌体上合成抗体文库，用感兴趣的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原 的噬菌体，从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所 周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗 体系统，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。 还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88:7978-7982(1991))。当最有效的克隆被鉴定时，可通过例如亲和力成熟或人源化优 化其DNA序列，以防止人体对抗抗体的免疫反应。因此，可通过以下方式获得本公开的单 域抗体：(1)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结 构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过表达编码这种人源 化VHH结构域的核酸；(4)通过来自任何动物物种，特别是哺乳动物物种，例如来自人的天 然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过表达编码这种骆驼化VH结构域的核酸；(5)通过 “结构域抗体”或“dAb”的“骆驼化”(参见例如Ward等人，1989，Nature341：544-546)， 或通过表达编码这种骆驼化VH结构域的核酸；(6)通过使用合成或半合成技术制备蛋白质、 多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用用于核酸合成的技术制备编码VHH的核酸，然后表达 由此获得的核酸；和/或(8)通过前述的任何组合。基于本文的公开内容，用于执行前述内容的 合适方法和技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且包括例如下文更详细描述的方法和技 术。单域抗体通常通过从免疫动物获得的血液、淋巴结或脾淋巴细胞的cDNA经PCR克隆可 变结构域库至噬菌体展示载体中而产生。通常通过在固定化抗原(例如涂布在试管塑料表面的 抗原，固定在链霉抗生物素蛋白珠上的生物素化抗原或细胞表面上表达的膜蛋白)上淘选相应 文库来选择抗原特异性单域抗体。通过体外模拟该策略可以提高sdAb的亲和力，例如通过 CDR区的定点诱变和在增加的严格条件(更高温度，高或低盐浓度，高或低pH和低抗原浓度) 下对固定化抗原进行进一步的淘选(Wesolowski等人.，Single domain antibodies:promising experimental andtherapeutic tools ininfection and immunity.Med Microbiol Immunol(2009)198: 157-174)。用于制备特异性结合抗原或表位的VHH的方法描述于参考文献中，参见例如：R. van der Linden等人.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li等人.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar等人.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645， 17June，2009和WO94/04678。
在一些实施方案中，本公开的的多肽复合物包含至少一个包含sdAb的表位结合部分。示 例性的sdAb包括，但不限于，仅来自重链抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、来源于常规4-链抗体的单结构域(诸如，VH或VL)、仅人源化重链抗体、以及由表达人重链段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。本领域已知或由发明人开 发的任何sdAb均可用于构建本申请的多肽复合物。sdAb可来源于任何物种，其包括但不限 于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文设想的单域抗 体还包括来自不是骆驼科和鲨鱼的物种的天然存在的sdAb分子。
在一些实施方案中，sdAb来源于天然存在的单域抗原结合分子，其被称为缺乏轻链的重 链抗体(本文中也称为“仅重链抗体”)。此类单域分子例如公开于WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature 363:446-448中。为清楚起见，来源于天然缺乏轻链的 重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开来。 此类VHH分子可以来源于骆驼科物种中产生的抗体，例如，骆驼、美洲驼、骆马、单峰驼、 羊驼和原驼。除了骆驼科之外的其它物种可产生天然缺乏轻链的重链分子，并且此类VHH 在本申请的范围内。
来自羊驼的VHH分子比IgG分子小约10倍，其是单一多肽并且可以是非常稳定的、耐 极端pH和温度条件。此外，其可抵抗蛋白酶的作用，常规抗体则不是这种情况此外，VHH的体外表达产生高收率，正确折叠的功能性VHH。此外，在羊驼中产生的抗体可识别除了由抗体识别的那些表位之外的表位，所述抗体通过使用抗体文库或经由对不是羊驼的哺乳动物 进行免疫而在体外产生(参见，例如，WO9749805)。因此，包含一个或更多个的VHH结构域的多肽复合物可比常规抗体更有效地与靶相互作用。因为已知VHH结合到“异常”表位诸 如空腔或凹槽中，因此包含此类VHH的多肽复合物的亲和力可能比常规多特异性多肽更适 用于治疗性治疗。
在一些实施方案中，sdAb来源于存在于软骨鱼类中的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb 可来源于存在于鲨鱼血清中的被称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。制备来源于 NAR的可变区的单域分子(“IgNARs”)的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
在一些实施方案中，sdAb是重组的、CDR接枝的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外生成的(例如，通过噬菌体展示选择)。在一些实施方案中，sdAb是由表达人类重链片段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见，例如，US20090307787A1、美国专利8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1、和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb为亲 和力成熟的。
包含VHH结构域的sdAb可被人源化以具有人样序列。在一些实施方案中，本文所用的 VHH结构域的FR区包含与人VH框架区至少约下列中任一者的氨基酸序列同一性：50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多种。一类示例性人源化VHH结构域的特征在于VHH 在根据Kabat编号的位置45，如L45处，携带选自下列的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬 酰胺或谷氨酰胺，并且在位置103处携带色氨酸。因此，属于这种类型的多肽示出与人VH 框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述多肽可直接施用于人，但不由此预期到不希望的免 疫应答，并且没有进一步人源化的负担。
另一类示例性人源化骆驼科sdAb已在WO 03/035694中有所描述，并且含有通常存在于 人来源或其它物种的常规抗体中的疏水性FR2残基，但其通过103位上的带电精氨酸残基来 补偿这种亲水性损失，所述带电精氨酸残基取代存在于来自双链抗体的VH中的保守色氨酸 残基。因此，属于这种两类型的肽示出与人VH框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述肽 可直接施用于人，但不由此预期到不希望的免疫应答，并且没有进一步人性化的负担。
在一些实施方案中，多肽复合物包含自然产生的sdAb或其VHH片段或其衍生物，诸如 骆驼sdAb或其VHH片段，或来源于骆驼sdAb的人源化sdAb或其VHH片段。在一些实施 方案中，sdAb得自美洲驼。在一些实施方案中，进一步工程化sdAb以移除不通常存在于人 抗体中的序列(诸如CDR区或CDR-FR接合点)。
在一些实施方案中，本公开的多肽复合物包含第二表位结合部分，其包含对冠状病毒S 蛋白表位具有适当亲和力的sdAb或其VHH片段。例如，sdAb或其VHH片段的亲和力可影 响多肽复合物对冠状病毒S蛋白的亲合力，这可能进一步影响多肽复合物的功效。在一些实 施方案中，sdAb或其VHH片段以高亲和力结合其表位。高亲和力sdAb或其VHH片段以低纳米摩尔(10-9M)范围内的离解常数(Kd)结合其表位，诸如不超过约下列中的任一者：5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.02nM、0.01nM、5pM、2pM、 1pM或更少。
在一些实施方案中，本公开的sdAb或其VHH片段包含：SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR1(HCDR1)或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR2(HCDR2)或其不超过2个氨基酸变化 的变体；和SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR3(HCDR3)或其 不超过2个氨基酸变化的变体。所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:14、18或20所示的 氨基酸序列组成；所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15或21所示的氨基酸序列组成； 和/或所述第二HCDR3包含或由SEQ ID NO:16、17或19所示的氨基酸序列组成。在进一步 的一些实施方案中，所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成；所 述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；且所述第二HCDR3包含或 由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成；所述第二HCDR1包含或由SEQ ID NO:18所示的 氨基酸序列组成；所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；且所 述第二HCDR3包含或由SEQID NO:19所示的氨基酸序列组成；或所述第二HCDR1包含或 由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成；所述第二HCDR2包含或由SEQ ID NO:21所示的 氨基酸序列组成；且所述第二HCDR3包含或由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的sdAb或其VHH片段包含：HCDR1，其包含或由SEQ IDNO: 14、18或20所示的氨基酸序列组成；HCDR2，其包含或由SEQ ID NO:15或21所示的氨基酸序列组成；HCDR3，其包含或由SEQ ID NO:16、17或19所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开的sdAb或其VHH片段包含或由下列序列组成：SEQ IDNO: 5、6或7所示的VHH氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，氨基酸变化不发生在VHH 片段的CDR中。
在一些实施方案中，本公开的sdAb或其VHH片段包含：
i)如式GFRFGSYX1MS所示的氨基酸序列的CDR1，其中X1为Y、T或V；
ii)如式DINTRGX2X3TR所示的氨基酸序列的CDR2，其中X2为E或I，且X3为T或V； 和/或
iii)如式AASX4X5TFX6GRSDPDY所示的氨基酸序列的CDR3，其中X4为G或P，X5为D或A，且X6为E或F。
在一个方面，本公开的sdAb可单独或作为本公开的多肽复合物的一个表位结合部分，用 于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染的个体。
在一些实施方案中，本公开的sdAb单独用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染 的个体。在一些实施方案中，本公开提供了一种sdAb，其包含SEQ ID NO:3、4、5、6或7(优 选地，SEQ ID NO:5、6或7)所示的VHH氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，本公 开提供了一种sdAb，其包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:24、25、26、27或28(优选地， SEQ ID NO:26、27或28)所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，氨基酸变化 不发生在VHH片段的CDR中。在一些实施方案中，本公开的sdAb是本文所描述的单域抗体P14-F8、P14-F8-hVH8、P14-F8-35、P14-F8-38、或P14-F8-43。
融合多肽
在一些实施方案中，本公开的多肽复合物的第一表位结合部分和第二表位结合部分彼此 融合(即，共价连接)。因此，本公开的多肽复合物包含一种或多种融合多肽。
如本文所使用，术语“融合”是指本公开的多肽复合物的第一表位结合部分和第二表位 结合部分通过共价连接的方式直接或间接连接在一起。在一些实施方式中，融合包括但不限 于经由肽键或非肽键直接融合或经由接头例如肽接头间接融合。本领域技术人员将理解，本 领域中已知或将来可能发现的可用于将多肽连接在一起的直接或间接连接方式均可用于本公 开的“融合”。
第一表位结合部分和第二表位结合部分可通过单一化学键(诸如肽键)或经由肽接头直接 连接。第二表位结合部分可在第一表位结合部分的任一个(包括每个)多肽的N-末端或C-末端 处融合，或可以在第一表位结合部分的任一个(包括每个)多肽的内部位置处，诸如在第一表 位结合部分的重链中的Fc区的N-末端处融合。融合多肽可重组获得或化学获得。在一些实 施方案中，第二表位结合部分的C-末端经由化学键(诸如肽键)或肽接头与第一表位结合部分 的任何(包括每个)多肽的N-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端经由 化学键(诸如肽键)或肽接头与第一表位结合部分的任何(包括每个)多肽的C-末端融合。在一些 实施方案中，第二表位结合部分经由不是涉及氨基酸的主链化学基团的肽的化学键与第一表 位结合部分融合。
在一些实施方案中，第一表位结合部分包含单链抗体片段，其包含VH和VL。在一些实 施方案中，第一表位结合部分包含scFv。在一些实施方案中，多肽复合物包含融合多肽，所 述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：包含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分、 任选的肽接头、VH结构域和VL结构域；在一些实施方案中，多肽复合物包含融合多肽，所 述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：包含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分、 任选的肽接头、VL结构域和VH结构域。在一些实施方案中，多肽复合物包含融合多肽，所 述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：VH结构域、VL结构域、任选的肽接头和包含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分。在一些实施方案中，多肽复合物包含融合多肽， 所述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：VL结构域、VH结构域、任选的肽接头和包 含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分。
在一些实施方案中，所述多肽复合物包含特异性识别第一表位的scFv，以及特异性识别 第二表位的第一sdAb或其VHH片段和第二sdAb或其VHH片段，其中第一sdAb和第二sdAb 可以相同或不同。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的 C-末端与scFv的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与scFv的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段 串联，并且串联片段的N-末端与scFv的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb 或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并且串联片段的C-末端与scFv的N- 末端融合。
在一些实施方案中，第一表位结合部分包含含有VH结构域的重链和含有VL结构域的 轻链。在一些实施方案中，重链还包含一个或多个重链恒定结构域，例如CH1、CH2、CH3和CH4、和/或铰链区(HR)。在一些实施方案中，轻链还包含轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端与重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C-末端与重链的N-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端与轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C-末端与轻链的N-末端融合。在一些实施方案中，多肽复合物包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：重链、任选的肽接头、以及包含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分；和第二多肽，所 述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，多肽复合物包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端至C-末端包含：包含sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分、任选的肽接头和重链；以 及第二多肽，所述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，多肽复合物包含第一多肽，所述 第一多肽从N-末端到C-末端包含：轻链、任选的肽接头、以及包含sdAb或其VHH片段的 第二表位结合部分；以及第二多肽，所述第二多肽包含重链。在一些实施方案中，多肽复合 物包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端至C-末端包含：包含sdAb或其VHH片段的第二 表位结合部分、任选的肽接头和轻链；以及第二多肽，所述第二多肽包含重链。
在一些实施方案中，第一表位结合部分包含全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个 轻链组成。在一些实施方案中，全长抗体为全长单克隆抗体，其由两个相同的重链和两个相 同的轻链组成。在一些实施方案中，多肽复合物包含两个相同的第一多肽，所述第一多肽从 N-末端到C-末端各自包含：重链、任选的肽接头、以及包含sdAb或其VHH片段的第二表位 结合部分；和两个相同的第二多肽，所述第二多肽各自包含轻链。在一些实施方案中，多肽 复合物包含两个相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：包含sdAb或 其VHH片段的第二表位结合部分、任选的肽接头和重链；和两个相同的第二多肽，所述第 二多肽各自包含轻链。在一些实施方案中，多肽复合物包含两个相同的第一多肽，所述第一 多肽从N-末端到C-末端各自包含：轻链、任选的肽接头、以及包含sdAb或其VHH片段的 第二表位结合部分；和两个相同的第二多肽，所述第二多肽各自包含重链。在一些实施方案 中，多肽复合物包含两个相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：包含 sdAb或其VHH片段的第二表位结合部分、任选的肽接头和轻链；和两个相同的第二多肽， 所述第二多肽包含重链。
在一些实施方案中，多肽复合物包含：(a)全长抗体，其由两个重链和两个轻链组成，其 中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb或其VHH片段和 第二sdAb或其VHH片段，其中第一sdAb和第二sdAb可以相同或不同。在一些实施方案中， 所述第一sdAb或其VHH片段的C-末端与每个重链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其 VHH片段的N-末端与每个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH 片段的C-末端与一个重链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的C-末端与另 一个重链的N-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的N-末端与一个重链的C-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与另一个重链的C-末端 融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的C-末端与一个轻链的N-末端融 合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的C-末端与另一个轻链的N-末端融合。在一些实施 方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的N-末端与一个轻链的C-末端融合，并且所述第二 sdAb或其VHH片段的N-末端与另一个轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一 sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并且串联片段的N-末端与重链或 轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或 其VHH片段串联，并且串联片段的C-末端与重链或轻链的N-末端融合。
在一些实施方案中，在多肽复合物中，第一表位结合部分包含Fab或Fab’，而第二表位 结合部分包含sdAb或其VHH片段。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端与Fab 或Fab’重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端与Fab或Fab’ 轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C-末端与Fab或Fab’重链的 N-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C-末端与Fab或Fab’轻链的N-末端 融合。
在一些实施方案中，所述多肽复合物包含特异性识别第一表位的Fab或Fab’，以及特异 性识别第二表位的第一sdAb或其VHH片段和第二sdAb或其VHH片段，其中第一sdAb和第二sdAb可以相同或不同。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的C-末端与 Fab或Fab’重链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’ 重链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的C-末端与Fab或 Fab’轻链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’轻链的 C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’轻 链的C-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’重链的C-末端 融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’重链的C- 末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与Fab或Fab’轻链的C-末端融合。 在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并 且串联片段的N-末端与Fab或Fab’重链或轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一 sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并且串联片段的C-末端与Fab 或Fab’重链或轻链的N-末端融合。
在一些实施方案中，在多肽复合物中，第一表位结合部分包含(Fab)2或(Fab’)2，而第二表 位结合部分包含sdAb或其VHH片段。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端与 (Fab)2或(Fab’)2的一个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的N-末端 与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C-末 端与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链的N-末端融合。在一些实施方案中，第二表位结合部分的C- 末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的N-末端融合。
在一些实施方案中，所述多肽复合物包含特异性识别第一表位的(Fab)2或(Fab’)2，以及特 异性识别第二表位的第一sdAb或其VHH片段和第二sdAb或其VHH片段，其中第一sdAb 和第二sdAb可以相同或不同。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片段的C-末端 与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段的N-末端与 (Fab)2或(Fab’)2的一个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb或其VHH片 段的C-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的N-末端融合，并且所述第二sdAb或其VHH片段 的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一sdAb 或其VHH片段的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的C-末端融合，并且所述第二sdAb或 其VHH片段的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，所 述第一sdAb或其VHH片段的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链的C-末端融合，并且所述 第二sdAb或其VHH片段的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个轻链的C-末端融合。在一些实施 方案中，所述第一sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并且串联片段 的N-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链或轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，所述第一 sdAb或其VHH片段与所述第二sdAb或其VHH片段串联，并且串联片段的C-末端与(Fab)2或(Fab’)2的一个重链或轻链的N-末端融合。
在一些实施方案中，本公开的抗体或多肽复合物结合哺乳动物冠状病毒S蛋白，例如人 冠状病毒S蛋白、猴冠状病毒S蛋白。例如，本公开的抗体或多肽复合物与冠状病毒S蛋白 上的一个或多个表位(例如，线性或构象表位)特异性结合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种多肽复合物，其包含SEQ ID NO:29、30或31所 示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在进一步的一些实施方案中，本公开提供了一种多肽复合物，其中所述多肽复合物是双 特异性抗体复合物，所述双特异性抗体复合物由2条重链和2条轻链组成，所述重链包含或 由SEQ ID NO:29、30或31所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列组成，并且所述轻链包含或由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的序列组成。在一些实施方案中，氨基酸变化不发生在VHH 片段的CDR中。在进一步的一些实施方案中，本公开的多肽复合物是本文描述的双特异性抗 体复合物BsAb16、BsAb17、或BsAb18。
肽接头
本文所述的多肽复合物可包含位于第一表位结合部分与第二表位结合部分之间的一个或 多个肽接头。在一些实施方案中，第一表位结合部位和第二表位结合部分彼此直接融合但其 间不设置肽接头。
多肽复合物的各表位结合部分可经由肽接头彼此融合。连接不同表位结合部分的肽接头 可以相同或不同。每个肽接头可以单独优化。肽接头可具有任何适合的长度。在一些实施方 案中，肽接头为至少约下列中的任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头的长度 为下列中的任一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1 个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基 酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、或约10个氨基酸至约30个氨基酸长。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，仅来源于抗体重链铰链区的 序列可用作接头。参见，例如，WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头为柔性接头。示 例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n(n为至少1的整数)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如 (GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、 丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其它柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含 GGGGSGGGS(SEQ ID NO:42)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列。在一 些实施方案中，肽接头包含IgG的铰链区，诸如人IgG1的铰链区。在一些实施方案中，肽接 头包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:44)。在一些实施方案中，肽接头包含来 源于IgG的铰链区的修饰序列，诸如人IgG1的铰链区。例如，IgG的铰链区中的一个或多个 半胱氨酸可被丝氨酸取代。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列 EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO:45)。
IV.本公开的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本公开提供了编码本文的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或多肽复合物或 其任一条链或其功能片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实 施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。 在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺 乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或多肽复合物的其它细胞。在另一 个实施方案中，宿主细胞是原核的。例如，本公开的核酸包含编码选自SEQID NO:1-7和22-31 中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:1-7和22-31中任一项所示的氨 基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同一性的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，本公开的核酸包含SEQ ID NO:32-41 中任一项所示的序列。
在一个实施方案中，本公开的核酸包含编码选自SEQ ID NO:23、29、30和31中任一项 所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:23、29、30和31中任一项所示的氨基酸 序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，本公开的核酸包含SEQ ID NO:33、39、40或41所示的序列。
本公开还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸相比编码具有一个或 多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸：包含编码选自SEQ IDNO:1-7和22-31中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO:1-7和22-31中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。
本公开还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸相比编码具有一个或 多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸：包含编码选自SEQ IDNO: 23、29、30和31中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO: 23、29、30和31中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。
在一个实施方案中，提供包含本公开的核酸或多核苷酸的一个或多个载体。在一个实施 方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬 菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一些实施方案中，提供了包含本公开的表达载体的宿主细 胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细 胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真 菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可 以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括 SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾 细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞 (MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠 卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞或293细胞。一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体 分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法， 根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已 转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标 记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性 等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。 也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、 增强子和终止信号。
V.本公开的抗体或多肽复合物的生产和纯化
在一个实施方案中，本公开提供了制备本公开的抗体或多肽复合物的方法，其中所述方 法包括在适于表达所述抗体或多肽复合物的的条件下培养包含编码所述抗体或多肽复合物的 核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或多肽复合物。在一 些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体或多肽复 合物。
为了重组产生本公开的抗体或多肽复合物，首先获得本编码公开的抗体或多肽复合物的 核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用 常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本公开的抗体或多肽复合物的核酸特异性结 合的寡核苷酸探针进行。
如本文所述制备的本公开的抗体或多肽复合物可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、 离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条 件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可 以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本公开的抗体或多肽复合物的纯度，包括大小 排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
VI.本公开的抗体或多肽复合物的活性测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体或多肽复合物进行鉴定、筛选、 或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本公开的抗体或多肽复合物测试其抗原 结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法 来测定对冠状病毒S蛋白的结合。在一些实施方案中，使用SPR或生物膜层干涉测定本公开 的抗体或多肽复合物对冠状病毒S蛋白的结合。本公开还提供了用于鉴定具有生物学活性的 抗体或多肽复合物的测定法。生物学活性可以包括例如阻断对细胞表面ACE2的结合。
VII.药物组合和药物制剂
在一些实施方案中，本公开提供包含本文所述的任何抗体或多肽复合物的组合物，优选 地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体例如药 用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本公开的药学上可接受的载体， 以及一种或多种其它治疗剂(例如抗感染活性剂、小分子药物)的组合。适合于本公开的抗感 染活性剂、小分子药物可以是用来治疗、预防或缓解受试者中冠状病毒感染的任何抗感染活 性剂、小分子药物，包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干 扰素-α2b、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。在本公开的上下文中，冠状病毒感染包括由冠 状病毒(包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV)引起的感染。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例 如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本文所用，“药学上 可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延 迟剂等。适用于本公开的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物 或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是 优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注 射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版, R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述 组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮 液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标 准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有 所需纯度的本公开的抗体或多肽复合物与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的药物制剂 或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本公开的药物组合物或制剂还可以包含 超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此 影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗 体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合 适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本公开的抗体或多 肽复合物的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VIII.组合产品或试剂盒
在一些实施方案中，本公开还提供了组合产品，其包含至少一种本公开的抗体或多肽复 合物，或者还包含一种或多种其它治疗剂(例如，抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂 等)。
在一些实施方案中，本公开的组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合 施用给受试者。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含本公开的抗体或多肽复合物、药物组合物或组 合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。在一些实施方案中，本公开还提供了包 含本公开的抗体或多肽复合物、药物组合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品 还包括指导施用的包装插页。
IX.本公开的抗体或多肽复合物的预防和/或治疗用途
本公开提供了一种用于预防受试者中冠状病毒相关疾病或病患例如冠状病毒感染(优选 COVID-19)的方法，其包括向受试者施用本公开的抗体或多肽复合物。具有冠状病毒相关疾 病风险的受试者包括与感染者接触的受试者或以一些其他方式暴露于冠状病毒的受试者。预 防剂的施用可以在表现出冠状病毒相关疾病的症状特征之前施用，以便阻止疾病，或可选择 地延迟疾病的进展。
本公开还提供了治疗患者中冠状病毒相关疾病例如冠状病毒感染(优选COVID-19)的方 法。在一个实施方案中，该方法涉及将中和冠状病毒的本公开的抗体、抗体组合或多特异性 抗体施用至患所述疾病的患者。
在一些实施方案中，提供了治疗患者中冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用本公开 的抗体或多肽复合物。在一个优选的实施方案中，将本公开的抗体或多肽复合物的两种一起 施用给所述患者。在一些实施方案中，本公开的抗体或多肽复合物可以交叉中和人和动物传 染性冠状病毒分离株。在一些实施方案中，本公开的抗体或多肽复合物在冠状病毒感染后的 最初24小时内施用。
本公开的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不 限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、气管内、口腔、腹膜内、皮内、局部、经皮和鞘内或者通过吸入。本公开的药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、注射剂、吸 入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。施用频率可以 在治疗过程中确定和调整。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本公开的用于治疗的药物组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。 本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平 与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定 抗体或多肽复合物的活性、施用途径、施用时间、清除速率、治疗持续时间、其他联合使用 的药物、病症的严重程度、以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以 前的病史等。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以 达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。通常， CL本公开的抗体或多肽复合物可以以各种剂量范围施用。在一些实施方案中，本文提供的抗 体或多肽复合物可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg,约0.5mg/kg,约1 mg/kg,约2mg/kg,约5mg/kg,约10mg/kg,约15mg/kg,约20mg/kg,约25mg/kg,约30 mg/kg,约35mg/kg,约40mg/kg,约45mg/kg,约50mg/kg,约55mg/kg,约60mg/kg,约65 mg/kg,约70mg/kg,约75mg/kg,约80mg/kg,约85mg/kg,约90mg/kg,约95mg/kg,或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方案的某些中，抗体或多肽复合物以约50mg/kg 或更低的剂量施用，并且在这些实施方案中的某些中，剂量为10mg/kg或更低，5mg/kg或更低，1mg/kg或更低，0.5mg/kg或更低，或者0.1mg/kg或更低。在某些实施方案中，施用 剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方案中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在治疗过程中变化。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。在某些优选的实施方案中，涉及本公开的抗体或多肽复合物的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物。 更具体地说，本公开的抗体或多肽复合物可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两 周、每三周或更长间隔施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改 变剂量或者调整间隔。
X.用于诊断和检测冠状病毒的方法和组合物
在一些实施方案中，本文中提供的任何抗体或多肽复合物可以用于检测冠状病毒在生物 样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。示例性的检测方法可以涉 及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA 测定法。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体 或多肽复合物。在另一个方面中，提供检测冠状病毒在生物样品中的存在或环境中冠状病毒 污染的方法。在某些实施方案中，所述方法包括检测冠状病毒S蛋白在生物样品或环境中的 存在。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品或环境样品与如本文所述的抗体或多肽 复合物在允许所述抗体或多肽复合物与冠状病毒S蛋白结合的条件下接触，并检测在抗体或 多肽复合物和冠状病毒S蛋白之间是否形成复合体。复合体的形成表示存在冠状病毒。该方 法可以是体外或体内方法。
用于冠状病毒的示例性诊断测定包括例如使用本公开的抗体或多肽复合物接触从患者获 得的样品，其中使用可检测的标记或报告分子标记本公开的抗体或多肽复合物或用作捕获配 体以选择性地从患者样品分离冠状病毒。备选地，未标记的本公开的抗体或多肽复合物可与 本身被可检测地标记的第二抗体组合在诊断应用中使用。可检测的标记或报告分子可以是放 射性同位素、如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光的部分如荧光素异硫氰酸酯 或罗丹明，或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或 测量样品中冠状病毒的具体的示例性测定包括酶连接的免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定 (RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可在根据本公开的冠状病毒诊断测定中使用的样品包括从患者可获得的任何生物样品， 其包含在正常或生理条件下可检测量的冠状病毒刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，生 物样品是血液、血清、咽拭子、下呼吸道样本(如气管分泌物、气管吸取物、肺泡灌洗液)或 生物来源的其他样品。一般而言，将测量从健康患者获得的特定样品中的冠状病毒刺突蛋白 水平(例如未受与冠状病毒相关的疾病所扰的患者)以初始性地建立基线或标准冠状病毒水平。 该冠状病毒基线水平可随后与从疑似具有冠状病毒相关病况或与该病况相关的症状的个体获 得的样品中测量的冠状病毒水平进行比较。特异性针对冠状病毒刺突蛋白的抗体或多肽复合 物可不包含其他标记物，或其可包含N-末端或C-末端的标记物。在一个实施方案中，标记物 是生物素。在结合测定中，标记物(如果存在的话)的位置可确定肽相对于所结合的表面的方 向。例如，如果表面以抗生物素蛋白包被，包含N-末端生物素的肽将被定向，使得肽的C- 末端部分远离表面。
本公开的抗体或多肽复合物可有效抑制冠状病毒的感染，有望成为针对此类冠状病毒的 预防和治疗的有效药物。本公开的抗体或多肽复合物能够以小于约1nM，例如约0.8nM、0.6 nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM的结合解离平衡常数KD结合冠状病毒S蛋白。本公开的抗体或多肽复合物还能够以小于约1nM，例如小于约0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.15nM、0.12nM的IC50阻断冠状病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白的结合或细胞表 面表达受体ACE2的结合。本公开的抗体或多肽复合物与冠状病毒S蛋白具有高的亲和力， 例如具有小于0.1nM例如小于0.05nM、甚至低至0.04nM的结合EC50。此外，本公开的抗 体或多肽还具有高的热稳定性，例如可达50℃、55℃、65℃或以上例如70或72℃以上的熔 解温度Tm。
更令人惊讶的是，本公开的多肽复合物相比于单独的多肽或组合的多肽，进一步以协同 的方式显著改善了抑制冠状病毒S蛋白的效果，例如显著改善结合冠状病毒S蛋白的Kd值(表 12)和阻断冠状病毒S蛋白与细胞表面表达受体ACE2的结合的IC50值(表13)。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本公开，这些实施例是以举例说 明的方式提供的，并且不旨在限制本公开的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全 部或仅进行的实验。
实施例1冠状病毒S蛋白抗原的制备和检测用ACE2的制备
实施例中共用到如下抗原和ACE2蛋白：S蛋白RBD-His(319Arg-532Asn)、S蛋白S1-huFc(14Gln-685Arg)、人ACE2-huFc(18Gln-740Ser)、人ACE2-His(18Gln-740Ser)、S蛋白 RBD-mFc(购自Sinobio，40592-V05H)，其中前四种蛋白的具体制备方法如下。
1.1质粒构建
从NCBI获取各蛋白序列，其中人ACE2序列获自NCBI Gene ID:59272，S蛋白序列获自NCBI Gene ID:43740568，分别按照上述氨基酸片段位置获得各蛋白序列，转化成基因序列后由金斯瑞生物科技股份有限公司进行目的片段基因合成。PCR扩增各目的片段，然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)，用于后续重组蛋白的表 达。
1.2质粒制备
将构建好的各重组蛋白表达载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，然后利 用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的各质粒以供 真核表达使用。
1.3各蛋白的表达纯化
S蛋白RBD-His(319Arg-532Asn)、S蛋白S1-huFc(14Gln-685Arg)、人 ACE2-huFc(18Gln-740Ser)和人ACE2-His(18Gln-740Ser)均通过Expi293瞬转表达系统(ThermoFisher，A14635)表达，具体方法如下：
转染当天，确认细胞密度为每毫升4.5×106至5.5×106个活细胞左右，细胞存活率>95％， 此时用37℃预温的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为每毫升3×106个细胞。用 4℃预冷的Opti-MEMTM稀释目的质粒(1mL Opti-MEMTM中加入1μg质粒)，同时用Opti-MEMTM稀释ExpiFectamineTM293试剂，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTM293试剂/质粒DNA混合液，室温孵育10-20min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO2条件下培养。
在转染后18-22h内添加ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer 1和ExpiFectamineTM293 Transfection Enhancer 2，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO2条件下继续培养。 在转染5-7天后，将细胞表达上清于15000g高速离心10min，所得Fc标签蛋白表达上清用 MabSelectSuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋 白，接着用1M Tris-HCl中和；所得His标签蛋白表达上清用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人 和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后用梯度浓度的咪唑洗脱目的蛋白。洗脱 下来的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)置换至PBS缓冲液中。经 SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后于-80℃冻存待用。
1.4各蛋白的质量检测
将上述1.3制备的S蛋白S1-huFc(也称为Spike-S1-huFc；或S1-huFc)和S蛋白RBD-mFc(也 称为Spike-RBD-mFc；或RBD-mFc)与人ACE2-huFc、人ACE2-His通过ELISA测定法进行 相互结合测定。结果显示在图2A和图2B中，人ACE2-huFc和RBD-mFc有良好的结合活性；S蛋白S1-huFc和商品化的S蛋白RBD-mFc分别与人ACE2-his有良好的结合活性，且活性 相当。
实施例2天然的人抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
在本实施例中，构建了抗体基因噬菌体展示文库，并用重组的2019-nCoV冠状病毒RBD 蛋白(即，Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)为筛选抗原对该文库进行筛选，获得了多 个具有特异性结合2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白的抗体分子。
2.1构建人抗体的基因文库
取Ficoll-Paque密度梯度分离液(购自GE公司，目录号：17144003S)15mL缓缓加入50mL 离心管中。将离心管倾斜并分批次沿管壁缓慢加入15mL采集的正常人血液，使得Ficoll-Paque 密度梯度分离液与正常人血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心 管于15℃左右离心20min，其中将离心机设置为400g，加速度为3，减速为0的参数。离心 之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll-Paque 液体，其中在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC细胞层。用无 菌巴氏吸管小心地吸去上层的血浆混合物，然后再用新的无菌巴氏吸管吸取PBMC，获得分 离的PBMC。将分离的PBMC先用PBS润洗两遍，再在4℃下以1500rpm的转速离心10min， 最后用1.5mL的PBS重悬，并通过细胞计数仪(CountStar，CountStar Altair)计数。
通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒(购自TaKaRa公司, 目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。基于重链和轻链种系基因的序列相似度， 分别在重链和轻链的V区前端和第一个恒定区后端设计简并引物(李晓琳，大容量非免疫人源 性Fab噬菌体抗体库的构建及初步筛选，《中国协和医科大学》硕士学位论文，2007年6月)， PCR后得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段。回收抗体的重链可变区基因 片段和轻链可变区基因片段后，通过融合PCR方法扩增得到含有抗体的轻链和重链可变区的 片段。接着，对该PCR产物和噬菌体展示用载体进行酶切、回收和连接。连接产物通过回收 试剂盒(Omega，目录号：D6492-02)回收，具体材料和方法参见上文李晓琳的论文。最后，通 过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将 经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板(固体平板由1.5％ 的胰蛋白胨、1％的酵母提取物、0.5％的NaCl和1.5％的琼脂，按质量体积g/mL配制而成)。
2.2抗体基因库容的计算
取经转化的大肠杆菌SS320菌液用无抗生素的2YT培养液以1:50的体积进行接菌，37℃， 220rpm培养1.5-2h至OD600达到0.5-0.6后取出至室温。将菌液按照90μL/孔添加到96孔 圆底稀释板中，每个菌液样品进行10倍梯度稀释，共12个稀释梯度。将稀释好的样品使用 8道10μL量程移液器，吸取2μL的液体按照稀释梯度从低到高的顺序加到羧苄青霉素和四 环素浓度分别为50μg/mL和50μg/mL的2YT(下文中也简称为C+/T+2YT)平板上，正置5min 后倒置放在37℃培养过夜。第二天观察克隆生长的情况，并计算库容。库容的计算方法如下， 从A行开始，依次标记为1、2、3、4、5、6、7、8到X行。首先选择计数孔，先将克隆数 目在3-20个克隆的计数孔选出，得出行数X，并数出对应孔中的克隆数n，计算公式为 5×100×10X×n，经计算，获得了每毫升菌液库容大小为3×1011cfu，即3×1011个抗体基因的抗体基因库。
2.3抗体基因噬菌体展示文库的制备
基于抗体基因库容容量，吸取50个OD(1个OD为5×108cfu)的全人抗体基因库的菌液加 入到新鲜的2-YT液体培养基中，使得初始OD值为0.1。将所得物置于37℃，220rpm的摇床中培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)，再以50倍于细菌数的数量(即，感染复数(MOI)为 大约50)加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min后在220rpm的摇床中继续培养1小时。随后，将培养物以10000rpm的转速离心5min后，弃上清，将培 养液替换为羧苄青霉素50μg/mL/卡那霉素40μg/mL双抗性的2-YT培养基(下文也称为 C+/K+2-YT培养基)，并于30℃，220rpm继续培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min， 收集上清后加入20％PEG/NaCl(由体积浓度为20％的PEG6000和2.5M NaCl配制而成)使得PEG/NaCl最终浓度为4％，混匀，并置于冰上1小时，再以13000g的转速离心10min，将 沉淀的噬菌体用PBS润洗后保存并用于后续噬菌体筛选。
2.4抗体基因噬菌体展示文库的筛选
2.4.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库
磁珠法筛选是基于将抗原蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)进行生物素标记 后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库 进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程。通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆 抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白用于噬菌 体展示文库筛选，经过3轮淘选后进行针对RBD蛋白的单克隆抗体初筛。
抗体筛选的具体实施方法如下：
首先用生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的RBD蛋白结合到磁珠上。将结合RBD蛋白的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特 异性吸附的噬菌体，加入Trypsin(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结 合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen,MC1061F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min， 继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继 续用于下一轮的淘选。
2.4.2免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库
免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个相互补充和验证的实 验方法。
免疫管法筛选的原理是将2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并 和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终 将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。
具体实施方法如下：
第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL 100μg/mL的RBD-mFc，4℃包被过夜。第二天弃去包被液，加入5％牛奶的PBS封闭2h。PBS润洗两次后加入构建的全人抗体基因的噬菌体库，孵育2h，用PBS润洗8遍，然后用PBST润洗2遍，以去除非特异性结合的噬菌体。 然后向免疫管中加入0.8mL 0.05％EDTA胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌 体。接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置30min，然后220rpm 条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在220rpm条件下培养1h， 离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下继续培养过夜。第二天沉淀 噬菌体，用于后续2-4轮的筛选。通常用于第二轮、第三轮和第四轮噬菌体筛选的抗原包被 浓度依次递减，分别为30μg/mL，10μg/mL和3μg/mL；除此之外，PBS润洗强度也逐渐加 大，PBS洗脱次数依次为12次、16次和20次。
对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的噬菌体 池中随机挑选10个克隆进行序列分析。结果显示在图3A和图3B中，从图中可见，每一轮 都有更好的富集，且富集最好的是3rd-4(即，第三轮淘选中的4号样品)。
结果表明，第三轮筛选后抗体序列富集明显，因此，选择第三轮所得的克隆进行ELISA 的阳性克隆筛选。
2.5单克隆的挑选
在共四轮筛选后，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。最终，在2304个克隆中共筛选到88个能够与RBD蛋白结合的阳性克隆。经测序分析、ELISA结合 和Fab水平的FACS阻断检测后，选取了多个克隆的序列构建全长抗体以进行进一步的实验，其中R15-F7克隆编号抗体为本发明优选分子。
实施例3候选人源抗体全长构建、表达和纯化
在本实施例中，将实施例2中获得的R15-F7抗体构建为人IgG1亚型，其中轻链均为κ 亚型，抗体类型为全人抗体。R15-F7和RBD抗原的结合活性以及阻断RBD和ACE2结合的 活性都较优。
3.1质粒构建
从筛选获得的含有Fab抗体菌株中，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片段。通过同源 重组方法，分别构建至经过改造的含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上，组成完整的抗体轻、重链全长基因。SEQ ID NO：1-2、8-13、22-23和32-33所示序列分别为编码抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列、CDR氨基酸序列、抗体全长氨基酸酸序列和抗体全长核苷酸序列。
3.2质粒制备
将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养。 利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体轻重 链质粒以供真核表达使用。
3.3抗体的表达纯化
候选抗体R15-F7是通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达的，具体 方法如下：
转染当天，确认细胞密度为7×106至1×107个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，此时， 用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预 冷的OptiPROTM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，同时，用OptiPROTMSFM稀释ExpiFectamineTMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO2条件下培养。
在转染后18-22h，向培养液中添加ExpiCHOTMEnhancer和ExpiCHOTMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO2条件下继续培养。在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHOTMFeed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染7-15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清 于15000g高速离心10min，所得上清用MabSelectSuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
3.4抗体的浓度测定
将经纯化的抗体蛋白用经验证过的超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，Nano-300) 进行浓度测定，将经测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为后续研究的抗体 浓度值，质检合格后，分装并保存于-80℃。
实施例4候选人源抗体的理化性质鉴定
在本实施例中，用SDS-PAGE、SEC-HPLC、DSF检测候选抗体R15-F7的相对分子量和纯度。
4.1候选抗体SDS-PAGE鉴定
4.1.1样品溶液制备
非还原溶液制备：候选抗体、对照抗体以及质控品IPI(所述IPI是伊匹木单抗(Ipilimumab) 的缩写，用作每次SDS-PAGE、SEC-HPLC等理化性质的质控品)1μg加入5×SDS上样缓冲液 和40mM碘代乙酰胺，75℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min，取上 清。
还原溶液制备：候选抗体、对照抗体以及质控品IPI 2μg加入5×SDS上样缓冲液和5mM DTT，100℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min，取上清。
4.1.2实验流程
Bis-tris 4-15％梯度胶(购于金斯瑞)，恒压110V电泳，当考马斯亮蓝迁移到凝胶底部，停 止运行，取出凝胶片置考马斯亮蓝染色液中1-2h，弃去染色液，加入脱色液，根据需要更换 2-3次脱色液，脱色至凝胶背景透明后保存在去离子水中。
4.1.3实验结果
结果显示在图4中，结果表明，候选抗体和质控品IPI非还原胶的条带为150kD左右， 还原胶的条带分别是55kD左右和25kD左右，符合预期大小，且纯度均大于95％，R15-F7本批次样品纯度为95.40％。
4.2候选抗体单体纯度鉴定
在本实施例中，用SEC-HPLC检测候选抗体R15-F7的单体纯度。
4.2.1材料准备
流动相：150mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4。
样品制备：候选抗体、对照抗体以及质控品IPI均用流动相溶液稀释到0.5mg/mL。
4.2.1实验流程
Agilent HPLC 1100色谱柱(XBridge BEH SEC 3.5μm,7.8mm I.D.×30cm,Waters)流速设 为0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、 IPI质控品溶液和样品溶液。
4.2.3实验结果
按照面积归一法计算样品中高分子聚合物，抗体单体和低分子物质百分比，结果显示在 图5。结果表明，候选抗体R15-F7本批次样品中单体纯度为99.5％。
4.3候选抗体热稳定性检测
差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能够根据蛋白质图谱中的荧光变化 过程提供有关蛋白质结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化，获得蛋白质的熔解温度(Tm)。
在本实施例中，采用DSF法检测了候选抗体R15-F7的Tm值。
4.3.1实验流程
制备抗体溶液，0.2mg/mL，19μL/孔，每个供试品在96孔板(Nunc)中设置三个平行孔， 并以PBS和IPI(Ipilimlumab)作为参比，然后在每个孔中加入1μL浓度为100×的SYPROorange 染料，用移液枪吹打混匀，准备上机。样品热稳定测试采用ABI 7500FAST RT-PCR仪器， 试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平 衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择“ROX”，淬灭基团选择“None”，反应体积 20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为候选抗体的熔解温度Tm，峰图 显示详见图6A-图6B，结果显示R15-F7具有良好的热稳定性。
4.3.2实验结果
实验结果显示在表1中，结果表明，抗体R15-F7的热稳定性在本批次样品中为72℃左 右，具有较好的热稳定性。
表1候选抗体和对照抗体的熔解温度
抗体名称 Tm(℃)
R15-F7 72.60
实施例5候选人源抗体的亲和力测定
在本实施例中，通过ELISA和Fortebio方法检测了候选抗体R15-F7对2019-nCoV冠状 病毒S蛋白的亲和活性。
5.1基于ELISA检测候选抗体的亲和活性
在96孔ELISA板上，包被重组的2019-nCoV冠状病毒Spike-RBD-mFc，2μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后， 加入梯度稀释的候选抗体R15-F7或阴性对照抗体IPI，并孵育1h。之后，用PBST清洗3次 后加入100μL/孔1:5000稀释的HRP标记的抗人Fc第二抗体(Abcam，ab98624(山羊抗人IgG Fc(HRP)预吸附抗体))并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics， TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M的HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax190)在OD450下读板，结果显示在图7中。结果表明，候选抗体R15-F7 表现出较优的S蛋白亲和活性，结合EC50值在0.05nM左右。
5.2基于Fortebio检测候选抗体的亲和力
在本实施例中，采用FortebioBLItz仪器，检测了候选抗体R15-F7与2019-nCoV冠状病 毒S蛋白RBD-his的亲和力。
5.2.1材料准备
称取10g的BSA，量取5mL的Tween 20，加入到1000mL的10×PBS，混匀，制成10×KB缓冲液。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M且pH＝2.0的甘氨酸溶液加入至0.9mL的超纯 水中，混匀，制成传感器再生缓冲液。作为抗原的S蛋白RBD-His以10×KB稀释成10μg/mL， 抗体以10×KB进行2倍梯度稀释，依次为62.5、31.25、15.63nM。
5.2.2实验流程
避光条件下，采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS，HIS1K,Fortebio,CA)，至 少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。首先采 用抗原S蛋白RBD-His进行结合300s,结合完毕在10×KB缓冲液中继续平衡30s后，将结 合有抗原的传感器转移至不同浓度抗体稀释液中结合300s，待信号稳定后，再转移到10×KB 缓冲液中，解离时间为900s，最后通过不同浓度抗体的结合解离数据拟合得到KD、Kon和 Koff。抗原抗体结合模式图和结合解离的曲线图分别详见图8A和图8B，结果显示，R15-F7 与抗原蛋白RBD结合的亲和力约为5.69nM，亲和力较优。
5.2.3结果分析
结果显示在表2中，候选抗体R15-F7的亲和力为5.69nM，亲和力较优。
表2基于Fortebio设备测定抗体对2019-nCoV S蛋白RBD-his的亲和力
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) koff(1/s)
R15-F7 5.69E-09 1.60E+05 9.12E-04
实施例6候选人源抗体的阻断功能检测
在本实施例中，采用ELISA的方法和FACS的方法，分别在蛋白水平和细胞水平检测候 选人源抗体R15-F7阻断2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD-his与受体结合的效果。
6.1基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性
用人ACE2-huFc蛋白，8μg/mL，30μL/孔，4℃过夜包被96孔板。次日，将96孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后将候选抗体R15-F7梯度稀释，并与生物素标记 的上述Spike-RBD-His提前预混1.0h，在封闭完成并洗板结束后转移至96孔ELISA板中， 孵育1h。用PBST清洗3次后加入100μL/孔1:5000稀释的第二抗体NeutrAvidin-HRP(Thermofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加入TMB(SurModics， TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。用PrismTM软件(GraphPad)内的S形剂量-反应模型进行数据分析。用计算的IC50值(定义为使病毒S蛋白与ACE2的结合减少50％所需的抗体浓度)作为阻断效力的指示。经计算，候选抗体R15-F7具有0.96nM的IC50值，表明了候选抗体R15-F7具有优异的阻断病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白结合的能力，结果如图9所示。
6.2基于FACS方法检测候选抗体的阻断活性
本实施例中，基于FACS方法评价候选抗体阻断病毒S蛋白RBD结构域和细胞表面表达 受体ACE2的结合活性。本实施例中使用的人ACE2-HEK293细胞系，属于人源ACE2稳转 细胞株。
6.2.1 ACE2-HEK293细胞制备
表达人ACE2(18Gln-805Phe)全长的质粒的构建：通过基因合成技术合成含有人源ACE2 蛋白的DNA片段，并将其克隆至表达载体。通过化转的方法导入大肠杆菌。挑取大肠杆菌 单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认。电转：使用Gibco的DMEM无血清培养基(货号：12634010)培养HEK293细胞。电转前一天，将细胞传代至 2×105/mL，次日使用Invitrogen的电转试剂盒(货号：MPK10096)和电转仪(货号：MP922947) 将构建好的质粒导入HEK293细胞中。将电转后的细胞移至DMEM培养基中，放置于37℃ 细胞培养箱中培养48h。电转后细胞铺板：将电转后的HEK293细胞按1000个细胞/孔铺到 96孔板中，加入终浓度2μg/mL的嘌呤霉素，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，14天后 补充加入2μg/mL的嘌呤霉素的培养基。克隆挑选、细胞扩培和FACS鉴定：挑取96孔板中 长出的单细胞克隆，转移至24孔培养板中继续扩大培养，之后通过FACS鉴定人ACE2稳转 成功的细胞株。
6.2.2实验流程
配制FACS缓冲液(1X PBS+2％FBS)，使用FACS缓冲液将候选抗体和对照抗体进行梯 度稀释，将抗体稀释液按100μL每孔加入96孔圆底板中。同样使用FACS缓冲液将RBD-mFc蛋白稀释至1μg/mL，向对应96孔板中加入100μL，用排枪轻轻吹打混匀并将96孔板放置 于4℃孵育1h。
将传代2-4次且生长状态良好的ACE2-HEK293细胞用于实验，胰酶消化后重悬细胞，4℃、 300g离心去除上清，随后将细胞用FACS缓冲液重悬，计数后将细胞密度调整为2×106个细 胞/mL，以每孔100μL加至新的96孔圆底板中，4℃、300g离心并去除上清。向对应96孔 板对应位置的细胞中加入预先孵育的抗体/RBD-mFc混合液，每孔180μL，用排枪轻轻吹打 混匀，并于4℃孵育30min。
将孵育后的细胞混合液于4℃、300g离心并去除上清，随后向对应孔中各加入200μL 的FACS缓冲液并重悬细胞，4℃、300g离心去上清；重复此步骤2次。使用FACS缓冲液 将PE标记的抗小鼠IgG-Fc流式抗体(Jackson,115-115-164)以1:200配制成第二抗体稀释液，使用排枪向对应细胞中加入200μL/孔的该第二抗体稀释液并轻轻吹打重悬细胞，随后将细胞 放置于4℃避光孵育30min，孵育结束后将细胞于4℃、300g离心去除上清，加入FACS缓冲液重悬细胞，重复该步骤两次。最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
6.2.3实验结果
实验结果显示在表3和图10中。结果表明，IC50值约为0.32nM，具有较好的阻断效果。 候选抗体R15-F7显示出了剂量依赖的受体结合阻断活性。
表3 R15-F7候选抗体IC50
抗体名称 IC50(nM)
R15-F7 0.32
实施例7候选人源抗体中和2019-nCoV冠状病毒功能检测
本实施例中，以抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituxmab)作为阴性同种型对照(IsotypeIgG)， 测试评价了候选抗体R15-F7对2019-nCoV冠状病毒的中和效果。2019-nCoV冠状病毒S蛋 白结合细胞表面上的受体ACE2是病毒感染宿主细胞的第一步。本实施例中使用的VeroE6 细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。因为绿猴ACE2与人ACE2的序列同源性达到95％， Vero E6细胞常用于抗冠状病毒候选药物的体外药效评价，因此使用Vero E6细胞用于候选抗 体的病毒中和活性测定。
7.1材料准备
7.1.1配制细胞培养基
在MEM培养基(Invitrogen,41500-034)中，添加谷氨酰胺(终浓度2mM)、青霉素(终浓度 100U/mL)、链霉素(终浓度100μg/mL)、灭活FBS(终浓度10％)。
7.1.2配制病毒培养基
在MEM培养基(Invitrogen,41500-034)中，添加谷氨酰胺(终浓度2mM)、青霉素(终浓度 100U/ml)、链霉素(终浓度100μg/mL)、灭活FBS(终浓度5％)。
7.1.3配制抗体稀释液
使用无血清培养基稀释测试抗体和阴性同种型对照(Isotype IgG)，初始浓度为60μg/mL， 2倍梯度稀释，共稀释12个稀释度(配制的抗体浓度为60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、 0.469、0.234、0.117、0.059、0.029μg/mL)。每个抗体浓度各取50μL至96孔细胞培养板中， 并设置3个复孔。
7.2实验流程
7.2.1病毒和抗体混合孵育
获得2019-nCoV病毒(BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020，其基因组序列号分别为GWHACAX01000000，稀释于无血清MEM中，感染Vero E6细胞。感染6天后，用Karber 法计算50％组织培养物(在本实施例中为细胞)感染剂量(TCID50)。
向各抗体稀释液中加入等体积50μL含有100TCID50的所述2019-nCoV病毒(BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020，稀释在无血清MEM中)，混匀，并置于室温中孵育60min。此 时，抗体终浓度为：30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117、0.059、0.029、0.015μg/mL。
7.2.2病毒和抗体混合物感染细胞
收集新鲜培养的Vero E6细胞，用实施例7.1.2配制的病毒培养基(5％FBS-MEM)配制细 胞浓度为2×105个细胞/mL，取100μl加入至上述含病毒抗体混合物的培养板中并混匀，放置 于35℃、5％CO2细胞培养箱中。
7.2.3观察细胞病变和计算抗体的中和效应
接种后的第2天起显微镜下观察细胞生长情况，第4天观察细胞病变效应(cytopathic effect (CPE))情况，并记录。第6天最终判定结果。
CPE分级标准：“+”为少于25％的细胞出现CPE；“++”为大于25％、少于50％细胞出现 CPE；“+++”为50％－70％的细胞出现CPE；“++++”为大于75％的细胞出现CPE。
判定标准：抗体组本身无明显细胞毒性，仅培养基的正常细胞对照组显示为细胞生长， 仅加入病毒的病毒对照组显示为CPE达++++。
用Karber法计算抗体对病毒的中和终点(将抗体稀释度转化为对数)，即能够保护50％细 胞不受100TCID50攻击病毒液感染的抗体最高稀释浓度就是该抗体的滴度。
7.2.4实验结果
实验结果显示在表4中。结果表明，候选抗体R15-F7能够显著抑制2019-nCoV病毒对 Vero E6细胞的感染，其保护50％细胞不受100TCID50病毒液感染的抗体滴度8.30ng/mL， 即55.36pM。
表4抗体对2019-nCoV冠状病毒的中和作用
抗体名称 抗病毒滴度(ng/mL) 抗病毒滴度(pM)
R15-F7 8.30 55.36
同种型IgG 无中和活性 无中和活性
实施例8驼源天然纳米抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
在本实施例中，构建了纳米抗体基因噬菌体展示文库，并用重组的2019-nCoV冠状病毒 RBD蛋白(即，Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)为筛选抗原对该文库进行筛选，获得 了多个具有特异性结合2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白的纳米抗体分子。
8.1构建驼源纳米抗体的基因文库
取Ficoll-Paque密度梯度分离液(购自GE公司，目录号：17144003S)15mL缓缓加入50mL 离心管中。将离心管倾斜并分批次沿管壁缓慢加入15mL采集的未经免疫的羊驼血液，使得 Ficoll-Paque密度梯度分离液与羊驼血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的 50mL离心管于15℃左右离心20min，其中将离心机设置为400g，加速度为3，减速为0的 参数。离心之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为 Ficoll-Paque液体，其中在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC 细胞层。用无菌巴氏吸管小心地吸去上层的血浆混合物，然后再用新的无菌巴氏吸管吸取 PBMC，获得分离的PBMC。将分离的PBMC先用PBS润洗两遍，再在4℃下以1500rpm的 转速离心10min，最后用1.5mL的PBS重悬，并通过细胞计数仪(CountStar，CountStar Altair)计数。
通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒(购自TaKaRa公司, 目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。基于VHH抗体germline的情况，在VHH 抗体V区前端和第二个恒定区(CH2)中间设计简并引物，PCR扩增后得到抗体的VHH-CH2 片段和VH-CH1-CH2片段，通过两个片段的长度差异，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定， 并回收VHH-CH2片段。回收的VHH-CH2片段，通过二次PCR的方法，采用VHH的扩增 的正向和反向引物、以VHH-CH2为模板扩增VHH抗体片段(Sabir JS,El-Domyati FM等人. Construction of
Figure BDA0002786692770000451
camelids VHH repertoire in phage display-based library.C R Biol.2014年3月20日；337(4):244-249.doi:10.1016/j.crvi.2014.02.004)。接着，对该PCR产物和噬菌体展示 用载体进行酶切、回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：D6492-02)回收， 具体材料和方法参见上文李晓琳的论文。最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感 受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有 氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板(固体平板由1.5％的胰蛋白胨，1％的酵母提取物，0.5％的 NaCl，1.5％的琼脂，按质量体积g/mL配制而成)。
8.2抗体基因库容的计算
取经转化的大肠杆菌SS320菌液用无抗生素的2YT培养液以1:50的体积进行接菌，37℃， 220rpm培养1.5-2h至OD600达到0.5-0.6后取出至室温。将菌液按照90μL/孔添加到96孔 圆底稀释板中，每个菌液样品进行10倍梯度稀释，共12个稀释梯度。将稀释好的样品使用 8道10μL量程移液器，吸取2μL的液体按照稀释梯度从低到高的顺序加到羧苄青霉素和四 环素浓度分别为50μg/mL和50μg/mL的2YT(下文中也简称为C+/T+2YT)平板上，正置5min 后倒置放在37℃培养过夜。第二天观察克隆生长的情况，并计算库容。库容的计算方法如下， 从A行开始，依次标记为1,2,3,4,5,6,7,8到X行。首先选择计数孔，先将克隆数目在3-20 个克隆的计数孔选出，得出行数X，并数出对应孔中的克隆数n，计算公式为5×100×10X×n， 经计算，获得了每毫升菌液库容大小为3×1011cfu，即3×1011个抗体基因的抗体基因库。
8.3抗体基因噬菌体展示文库的制备
基于抗体基因库容容量，吸取50个OD(1个OD为5×108cfu)的全人抗体基因库的菌液加 入到新鲜的2-YT液体培养基中，使得初始OD值为0.1。将所得物置于37℃，220rpm的摇床中培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)，再以50倍于细菌数的数量(即，感染复数(MOI)为 大约50)加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)，充分混匀，静置30min后在220rpm的摇床中继续培养1小时。随后，将培养物以10000rpm的转速离心5min后，弃上清，将培 养液替换为羧苄青霉素50μg/mL/卡那霉素40μg/mL双抗性的2-YT培养基(下文也称为 C+/K+2-YT培养基)，并于30℃，220rpm继续培养过夜。次日，菌液于13000g离心10min， 收集上清后加入20％PEG/NaCl(由体积浓度为20％的PEG6000和2.5M NaCl配制而成)使得 PEG/NaCl最终浓度为4％，混匀，并置于冰上1小时，再以13000g的转速离心10min，将 沉淀的噬菌体用PBS润洗后保存并用于后续噬菌体筛选。
8.4抗体基因噬菌体展示文库的筛选
8.4.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库
磁珠法筛选是基于将抗原蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)进行生物素标记 后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库 进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆 抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白用于噬菌 体展示文库筛选，经过3轮淘选后进行针对RBD蛋白的单克隆抗体初筛。
抗体筛选的具体实施方法如下：
首先用生物素标记的2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得生物素标记的RBD蛋白结合到磁珠上。将结合RBD蛋白的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特 异性吸附的噬菌体，加入Trypsin(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结 合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen,MC1061F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min， 继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继 续用于下一轮的淘选。
8.4.2免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库
免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个相互补充和验证的实 验方法。
免疫管法筛选的原理是将2019-nCoV冠状病毒RBD蛋白(Spike-RBD-mFc，Sinobio，40592-V05H)包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并 和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终 将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。
具体实施方法如下：
第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL 100μg/mL的RBD-mFc，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入5％牛奶的PBS封闭2h，PBS润洗两次后加入构建的总量为200只羊驼的纳 米抗体基因的噬菌体库，孵育2h，用PBS润洗8遍，然后用PBST润洗2遍，以去除非特 异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入0.8mL 0.05％EDTA胰酶消化液，用于洗脱特异性 结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置 30min，然后220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30min，继续在 220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下 继续培养过夜。第二天沉淀噬菌体，用于后续2-4轮的筛选。通常用于第二轮、第三轮和第 四轮噬菌体筛选的抗原包被浓度依次递减，分别为30μg/mL、10μg/mL和3μg/mL；除此之 外，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次、16次和20次。
对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的噬菌体 池中随机挑选10个克隆进行序列分析，富集结果显示在图11A和图11B中。
结果表明，第三轮筛选后抗体序列富集明显，每一轮都有更好的富集，且富集最好的是 3rd-1(即，第三轮淘选中的1号样品)。因此，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆 筛选。
8.5单克隆的挑选
在共四轮筛选后，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。经测序 分析、ELISA结合和Fab水平的FACS阻断检测后，选取了多个克隆的序列构建全长抗体以进行进一步的实验，经全长构建分子验证，选择其中P14-F8克隆编号抗体为本发明优选分子。
实施例9候选驼源纳米抗体全长构建、表达和纯化
在本实施例中，将实施例8中获得的P14-F8抗体构建为人IgG1亚型的VHH-Fc。进行抗体制备，用于抗体的理化性质和功能分析。
9.1质粒构建
从筛选获得的含有VHH纳米抗体菌株中，PCR扩增获取抗体VHH片段，通过同源重组方法，构建至含有重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上，组成 完整的VHH-Fc基因，SEQ ID NO：3、14-16、24和34分别为所示抗体的重链可变区(VHH)氨基酸序列、CDR氨基酸序列、融合Fc的抗体全长氨基酸酸序列和全长核苷酸序列。
9.2质粒准备
9.3抗体的表达纯化
9.4抗体的浓度测定
9.2-9.4具体的实验操作参考实施例3中“质粒准备、抗体的表达纯化、抗体的浓度测定”。
实施例10候选驼源纳米抗体的理化性质鉴定
在本实施例中，用SDS-PAGE、SEC-HPLC、DSF检测候选抗体P14-F8以及对照抗体IPI的相对分子量和纯度(所述IPI是伊匹木单抗(Ipilimumab)的缩写，用作每次SDS-PAGE、SEC-HPLC等理化性质的质控品)。
10.1候选抗体SDS-PAGE鉴定
10.1.1实验流程
具体的实验操作参考实施例4中“4.1候选抗体SDS-PAGE鉴定”。
10.1.2实验结果
结果显示在图12中。结果表明，候选抗体和质控品IPI非还原胶的条带分别为80kD和 150kD左右，还原胶的条带分别是40kD和55kD、25kD左右，符合预期大小，P14-F8纯度 为90.30％。
10.2候选抗体单体纯度鉴定
在本实施例中，用SEC-HPLC检测候选抗体P14-F8的单体纯度。
10.2.1材料准备和实施流程
具体的实验操作参考实施例4中“4.2候选抗体单体纯度鉴定”。
10.2.2实验结果
按照面积归一法计算样品中高分子聚合物，抗体单体和低分子物质百分比，结果显示在 图13。结果表明，候选抗体P14-F8的单体纯度88.73％，有一个占比11.37％的高分子聚体， 如图13箭头所指。后续对抗体分子进行改造和优化。
10.3候选抗体热稳定性检测
差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能够根据蛋白质图谱中的荧光变化 过程提供有关蛋白质结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化，获得蛋白质的熔解温度(Tm)。 在本实施例中，采用DSF法检测了候选抗体P14-F8的Tm值。
10.3.1实验流程
具体的实验操作参考实施例4中“4.3候选抗体热稳定性检测”。
10.3.2实验结果
实验结果显示在表5中。结果表明，抗体P14-F8的热稳定性不够理想，后面进行改造来 提高热稳定性。Tm1和Tm2分别为抗体在热稳定性测定中检测到的2个熔解温度。
表5候选抗体的熔解温度
抗体名称 T<sub>m1</sub>(℃) T<sub>m2</sub>(℃)
P14-F8 44.62 65.07
实施例11候选驼源纳米抗体的亲和力测定
在本实施例中，通过ELISA和Fortebio方法检测了候选抗体P14-F8对2019-nCoV冠状 病毒S蛋白的亲和活性。
11.1基于ELISA检测候选抗体的亲和活性
具体的实验操作参考实施例5中“5.1基于ELISA检测候选抗体的亲和活性”。结果显示 在图14中。结果表明，P14-F8结合RBD的EC50值约为0.09nM，亲和力较优。候选抗体P14-F8表现出较优的S蛋白亲和活性。
11.2基于Fortebio检测候选抗体的亲和力
在本实施例中，采用FortebioBLItz仪器，检测了候选抗体P14-F8与2019-nCoV冠状病 毒S蛋白RBD-his的亲和力。
11.2.1材料准备和实验流程
具体的实验操作参考实施例5中“5.2基于Fortebio检测候选抗体的亲和力”。抗体以10 ×KB稀释成系列浓度梯度，依次为62.5、31.25、15.63nM，结果显示在图15中。结果表明， P14-F8与抗原蛋白RBD结合的亲和力约为18.20nM，亲和力较好。候选抗体P14-F8表现出 相当的S蛋白亲和活性。后续对亲和力进行进一步改造。
11.2.3结果分析
结果显示在表6中，候选抗体P14-F8的亲和力为18.2nM。
表6基于Fortebio设备测定抗体对2019-nCoV S蛋白RBD-his的亲和力
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) koff(1/s)
P14-F8 1.82E-08 1.38E+05 2.51E-03
实施例12候选驼源纳米抗体的阻断功能检测
在本实施例中，采用ELISA的方法和FACS的方法，分别在蛋白水平和细胞水平检测候 选驼源抗体P14-F8阻断2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD和受体结合的效果。
12.1基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性
具体的实验操作和计算参考实施例6中“6.1基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性”。 经计算，候选抗体P14-F8具有1.89nM的IC50值，表明了候选抗体P14-F8具有优异的阻断 病毒S蛋白与分离的ACE2蛋白结合的能力。结果如图16所示。
12.2基于FACS方法检测候选抗体的阻断活性
本实施例中，基于FACS方法评价候选抗体阻断病毒S蛋白RBD结构域和受体ACE2的结合活性。本实施例中使用的ACE2稳转过表达的ACE2-HEK293细胞。
ACE2-HEK293细胞株制备和FACS操作具体实验流程参考实施例6中“6.2基于FACS方 法检测候选抗体的阻断活性”。实验结果显示P14-F8具有优异的阻断病毒S蛋白与分离的 ACE2蛋白结合的能力。结果如图17所示，结果显示，IC50值约为0.47nM，具有较好的阻断效果。
实施例13候选驼源纳米抗体中和2019-nCoV冠状病毒功能检测
本实施例中，以抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituxmab)作为阴性同种型对照(IsotypeIgG)， 测试评价了候选抗体P14-F8对2019-nCoV冠状病毒的中和效果。2019-nCoV冠状病毒S蛋 白结合细胞表面上的受体ACE2是病毒感染宿主细胞的第一步。本实施例中使用的VeroE6 细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。因为绿猴ACE2与人ACE2的序列同源性达到95％， Vero E6细胞常用于抗冠状病毒候选药物的体外药效评价，因此使用Vero E6细胞用于候选抗 体的病毒中和活性测定。
13.1材料准备和实验流程
具体的实验操作和计算参考实施例7“候选人源抗体中和2019-nCoV冠状病毒功能检测”。
13.2实验结果
实验结果显示在表7中。结果表明，候选抗体P14-F8能够抑制2019-nCoV病毒对Vero E6 细胞的感染，其保护50％细胞不受100TCID50病毒液感染的抗体滴度1.17μg/mL，即14.58nM。
表7 P14-F8抗体对2019-nCoV冠状病毒的中和作用
抗体名称 抗病毒滴度(μg/mL) 抗病毒滴度(nM)
P14-F8 1.17 14.58
同种型IgG 无中和活性 无中和活性
实施例14候选驼源纳米抗体人源化改造
本实施例中，为降低驼源纳米抗体P14-F8可能引起的免疫原性，将纳米抗体的VHH的 构架区(Frame work)进行人源化突变设计，通过回复突变成为人源化抗体。
14.1纳米抗体人源化改造过程
将P14-F8的抗体序列和人源抗体胚系基因(Germline)数据库进行比对，找到和P14-F8同 源性比较高的1-3条胚系基因germline，同时兼顾胚系基因Germline的成药性，选择合适的 Germline模板进行比对，最终选择IGHV3-23胚系基因Germline，统计P14-F8框架区的非人 源位点共11个。对P14-F8进行同源建模，同源建模参考PDB数据库(http://www.rcsb.org/)的 纳米抗体结果模型。结合P14-F8的结构模型和非人源位点情况，进行组合回复突变设计，回 复突变设计避免引入潜在翻译后修饰位点，针对P14-F8共设计了11条人源化程度不同的抗 体序列。通过理化性质、Elisa的亲和阻断检测，具体的检测方法参考实施例4-5中的“4.候 选人源抗体的理化性质鉴定”和“5.候选人源抗体的亲和力测定”。
14.2纳米抗体人源化改造结果
选择P14-F8-hVH8分子作为人源化改造的候选分子，其人源化程度达到98.39％，理化性 质和亲和阻断效果都优于母本。表8显示了设计的抗体人源化程度；图18A和图18B以及图 19A和图19B显示了人源化抗体亲和阻断效果。SEQ ID NO：4、14-16、25和35所示的序列 分别编码抗体P14-F8-hVH8的重链可变区氨基酸序列、CDR氨基酸序列、融合Fc的抗体全 长氨基酸酸序列和全长核苷酸序列。共9个人源化抗体，结合抗体人源化程度亲和力和阻断 效果，选择P14-F8-hVH8作为候选分子。
表8 P14-F8抗体框架区非人源化位点数量和人源化程度统计
克隆编号 人源化比例 非人源位点数量
P14-F8-Parental 91.13％ 11
P14-F8-hVH1 91.94％ 10
P14-F8-hVH2 91.94％ 10
P14-F8-hVH3 92.74％ 9
P14-F8-hVH4 92.74％ 9
P14-F8-hVH5 93.55％ 8
P14-F8-hVH6 93.55％ 8
P14-F8-hVH7 96.77％ 4
P14-F8-hVH8 98.39％ 2
P14-F8-hVH9 100.00％ 0
实施例15候选驼源纳米抗体亲和力成熟
本实施例中，主要阐述对人源化后的纳米抗体分子P14-F8-hVH8进行亲和力成熟改造。 前面实施例11-13对P14-F8的亲和力、阻断效果和病毒中和效果进行了评价。由于与R15-F7 分子比较，P14-F8的亲和、阻断和病毒中和效果都不如R15-F7的效果好(R15-F7数据参考实 施例5-7)，因此对人源化的P14-F8-hVH8进行亲和力改造，以提高改造后的抗体的亲和力和 阻断效果，从而改善该分子中和病毒的功能。亲和力改造方法基于噬菌体展示技术，包括文 库设计和构建、筛选、候选分子功能验证和分子选择。
15.1亲和力成熟文库设计和构建
抗体工程文库设计为针对抗体CDR区进行突变设计，突变方式包含单点饱和突变和2-3 点连续突变策略，将不同CDR的突变进行组合，构建突变组合文库。
具体的建库方法如是：首先，合成包含点突变的引物(合成公司：金唯智生物科技有限公 司)；其次以待改造的P14-F8-hVH8为PCR扩增模板，扩增CDR包含设计突变的序列，通过 桥连PCR的方法，将包含不同突变的片段进行组合，组合的完整VHH抗体通过酶切连接的 方式插入纳米抗体噬菌体展示载体，进行电转、库容计算和噬菌体文库制备，操作过程详见 实施例8文库构建部分。
15.2亲和力成熟文库的筛选
文库的筛选的具体操作方法详见实施例8中文库筛选部分内容，进行文库的海选、初筛 和亲和力排序和序列分析，选择了42个克隆菌表达VHH上清进行亲和力排序。结合亲和力 排序和序列分析数据，选择18个优选的候选抗体进行样品制备和功能筛选。
15.3亲和力改造候选分子制备、理化性质评估、亲和力和阻断效果检测
18个候选抗体的制备、理化性质评估、亲和力和阻断效果检测，具体的操作方法详见实 施例3-6。
15.4亲和力改造候选分子选择
亲和力改造候选分子各项指标评估的数据详见如下表格。根据抗体的理化性质、亲和力 和阻断RBD-ACE2结合的效果，选择P14-F8-35、P14-F8-38和P14-F8-43分子作为双抗构建 的候选分子。数据汇总详见表9，ELISA亲和力排序和阻断结果详见图20和图21，结果显示， 优选的改造抗体亲和力活性和阻断活性均优于母本分子P14-F8-hVH8。序列SEQID NO：5-7、 14-21、26-28和36-38分别编码P14-F8-35、P14-F8-38和P14-F8-43抗体的重链可变区氨基酸 序列、CDR氨基酸序列、融合Fc的抗体全长氨基酸酸序列和全长核苷酸序列。
表9亲和力改造候选分子评估数据
Figure BDA0002786692770000521
Figure BDA0002786692770000531
实施例16人源抗体和驼源纳米抗体结合表位分析
在本实施例中，为明确进行双抗组合的R15-F7和P14-F8抗体表位差异，基于Fortebio 的方法，采用FortebioBLItz仪器对R15-F7和P14-F8进行了抗体表位的判定。
16.1实验流程
避光条件下，采用10×KB缓冲液预湿传感器(Anti-Penta-HIS，HIS1K,Fortebio,CA)，至 少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。固化抗 原S蛋白RBD-His，300s，在10×KB缓冲液中平衡30s后和200nM浓度的第一抗体结合 300s，待信号稳定后，记录其信号强度，再转移到200nM的第二抗体溶液中，并观察其结合 强度，此时如果结合信号值在第一抗体基础上明显增强，说明了两个抗体的结合表位不一样， 如果结合信号值相较于第一抗体没有增强，说明了两个抗体的结合表位相同。
16.2结果分析
16.2.1结果计算方法
根据如下规则判断两个抗体质检是否会存在表位竞争：
竞争百分比＝实验组信号值/对照组信号值×％
实验组信号值：固化抗原RBD-His后加入抗体1，待抗体1结合平衡后，加入抗体2，观 测抗体2加入产生的信号值；
对照组信号值：固化抗原RBD-His后加入缓冲液，缓冲液和实验组抗体1孵育时间一致， 然后加入抗体2，观测抗体2加入产生的信号值；
表位完全竞争：竞争百分比＜20％；
表位部分竞争：20％＜竞争百分比＜60％；
表位完全不竞争：竞争百分比＞60％。
16.2.2实验结果
实验结果显示在表10。结果表明，候选抗体R15-F7和P14-F8结合RBD蛋白的表位完全不同，而P14-F8和R15-F7自身具有很强的竞争效果。因此，这两个抗体进行双抗的组合后能够结合不同的抗原表位，在接下来的实施例中将进行双抗的制备和功能验证。
表10抗体结合表位竞争分析
抗体编号 R15-F7 P14-F8
R15-F7 12％ 113％
P14-F8 104％ 15％
实施例17双抗(双表位双特异性抗体)的设计和构建、表达和纯化
在本实施例中，将R15-F7与P14-F8经人源化及亲和力成熟改造后获得的3个分子P14-F8-35、P14-F8-38和P14-F8-43进行双抗的设计和制备。
17.1双抗的设计
双抗的设计依托于含轻、重链的全人源抗体R15-F7和纳米抗体P14-F8改造后的抗体进 行组合。选取的分子模式为纳米抗体构建在R15-F7重链的C端，双抗分子的IgG亚型为人 源IgG1，并通过突变Fc的L234A和L235A，去除ADCC效应和CDC效应(Hezareh M,ParrenPW等人.Effector function activities of a panel of mutants of a broadlyneutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1.JVirol.2001；75(24):12161-12168. doi:10.1128/JVI.75.24.12161-12168.2001)。
17.2质粒构建
采用R15-F7和P14-F8单抗序列为模板序列，经PCR扩增R15-F7的重链和P14-F8-43、 P14-F8-35和P14-F8-38的VHH序列，通过同源重组方法将含有R15-F7重链和VHH的序列构建至真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上，组成完整的双抗重链全长基因，分 别为BsAb16、BsAb17和BsAb18。序列SEQ ID NO：29-31、39-41、23和33分别编码所示 抗体的重链全长和轻链全长氨基酸和核苷酸序列。
17.3质粒准备
将构建好的含双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18轻重链全长基因的载体分别转化到大肠 杆菌SS320中，37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒 提取，得到无内毒素的抗体轻重链质粒以供真核表达使用。
17.4抗体的表达纯化和浓度测定
候选双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133) 表达，具体操作方法参考实施例3。
实施例18双抗的理化性质检测
本实施例中，对BsAb16、BsAb17、BsAb18进行了SDS-PAGE、HPLC-SEC和DSF检测。 具体的操作方法参考实施例4。检测结果数据展示在表11。结果表明，3个双抗的各项理化 性质均符合常规抗体标准。Tm1和Tm2分别为抗体在热稳定性测定中检测到的2个熔解温度。
表11双抗理化性质检测数据汇总
Figure BDA0002786692770000551
实施例19双抗的亲和力测定
在本实施例中，通过Elisa和Fortebio方法检测了候选双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18 以及对应的单抗R15-F7以及P14-F8-43、P14-F8-35和P14-F8-38对2019-nCoV冠状病毒S 蛋白的亲和活性。
19.1基于ELISA检测候选抗体的亲和活性
具体的实验方法参考实施例5中“基于ELISA检测候选抗体的亲和活性”。数据详见图22。 结果显示基于ELISA检测R15-F7单抗分子的亲和力最好，这可能是因为抗原包被在ELISA 板上导致的部分双抗结合表位被隐藏。后续进一步通过Fortebio测定亲和力以及通过阻断实 验和病毒中和实验评价双抗的功能。
19.2基于Fortebio检测候选抗体的亲和力
具体的实验方法参考实施例5中“基于Fortebio检测候选抗体的亲和力”。数据汇总详见表 12，Fortebio检测图详见图24A-图24G。结果表明双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18的亲和 力显著优于对应的单抗R15-F7、P14-F8-43/35/38。双抗分子和抗原结合力比相应的单抗分子 都高，主要是解离速率koff(1/s)变慢。
表12 Fortebio检测双抗和RBD抗原的亲和力
Figure BDA0002786692770000552
Figure BDA0002786692770000561
实施例20双抗的阻断功能测定
在本实施例中，采用ELISA的方法和FACS的方法，分别在蛋白水平和细胞水平检测候 选双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗R15-F7、P14-F8-35、P14-F8-38和P14-F8-43 阻断2019-nCoV冠状病毒S蛋白RBD与配体结合的效果。
20.1基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性
具体的实验方法参考实施例6中“基于ELISA方法检测候选抗体的阻断活性”。数据详见 图23。结果表明，双抗分子BsAb17和BsAb18阻断效果优于单抗分子，BsAb16和R15-F7阻断效果相似。
20.2基于FACS方法检测候选抗体的阻断活性
本实施例中，基于FACS方法评价候选抗体阻断病毒S蛋白RBD结构域和受体ACE2的结合活性。本实施例中使用的人ACE2-HEK293细胞系，属于人源ACE2稳转细胞株。
ACE2-HEK293细胞株制备和FACS操作具体实验流程参考实施例6中“6.2基于FACS方 法检测候选抗体的阻断活性”。图25A-图25C显示双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗R15-F7、P14-F8-35、P14-F8-38、P14-F8-43、单抗联合R15-F7+P14-F8-35、 R15-F7+P14-F8-38和R15-F7+P14-F8-43阻断RBD与ACE2-HEK细胞的结合。结果显示，3 个双抗的阻断效应都优于单抗分子或者2个单抗分子联合的效果。表13提供了阻断IC50值。
表13双抗分子FACS阻断RBD蛋白与ACE2-HEK293细胞结合IC50
抗体名称 BsAb17 R15-F7 P14-F8-35 R15-F7+P14-F8-35
IC50(nM) 0.1227 0.2261 0.2907 0.2823
抗体名称 BsAb16 R15-F7 P14-F8-43 R15-F7+P14-F8-43
IC50(nM) 0.1657 0.2261 0.2738 0.2684
抗体名称 BsAb18 R15-F7 P14-F8-38 R15-F7+P14-F8-38
IC50(nM) 0.167 0.2261 0.2717 0.3034
实施例21双抗与细胞的非特异性结合检测
本实施例中，基于FACS方法评价候选抗体和无2019-nCoV冠状病毒Spike蛋白表达的 人源细胞系HEK293和Jurkat是否有非特异性结合，以此方法来初步评价抗体和抗原结合的 特异性。所检测的抗体包括候选双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18，对应的单抗R15-F7和P14-F8-35、P14-F8-38、P14-F8-43，以及单抗联合R15-F7+P14-F8-35、R15-F7+P14-F8-38和R15-F7+P14-F8-43。
21.1实验过程
收集指数生长期的人HEK293和Jurkat细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS 缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106/mL。随后，将HEK293和Jurkat细胞以每 孔100μL加入96孔圆底板中，300g离心去上清。分别向对应孔中加入4倍梯度稀释的候选 抗体和阴性对照抗体稀释液，首孔抗体浓度为800nM，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃下孵 育30min。将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL的FACS缓冲液并使用排枪重悬细胞；重复两次，300g离心去上清；加入PE标记的抗-人-IgG-Fc流式抗体(Abcam,98596)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃下孵育30min，300g离心去上清。随后，加入FACS缓冲液并重悬细胞，重复两次后向孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细 胞。最后，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
21.2实验结果
基于FACS的数据，分别分析了最高抗体浓度800nM条件下，抗体和细胞结合的平均荧 光强度(MFI)和阳性细胞比例，800nM抗体浓度对应质量浓度：双抗为142.4μg/ml、人源单 抗和同型对照为120.0μg/ml、纳米单抗为64.0μg/ml、二抗体联合为184.0μg/ml。根据平均 荧光强度分析，各个双抗和单抗在高浓度条件下和细胞非特异性结合的平均荧光强度和对照 抗体相似，二抗联合的非特异性结合平均荧光强度略高，为对照的2-4倍；高浓度抗体条件 下，抗体和细胞非特异性结合的细胞比例在HEK293中最高为3.24％、在Jurkat细胞中最高 为1.44％，属于实验误差范围内，因此候选双抗和细胞的非特异性结合几乎为阴性。对应的 数据统计详见表14，实验数据结果详见图26A-图26M和图27A-图27M。
表14双抗分子FACS检测与HEK293和Jurkat细胞非特异性结合
Figure BDA0002786692770000571
Figure BDA0002786692770000581
实施例22双抗在细胞水平中和2019-nCoV冠状病毒假病毒的功能检测
本实施例中，测试评价了候选BsAb16、BsAb17和BsAb18以及对应的单抗对2019-nCoV 冠状病毒假病毒的中和效果。
22.1材料准备
将保存于2～8℃的试剂(胰酶、DMEM完全培养基)取出，置于室温平衡30min以上；将 待检测的血清(或血浆)于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min，将上清转移至1.5mL离心 管中待用；用DMEM完全培养基(1％双抗，20mM HEPES，10％FBS)将血清进行稀释(通常起始稀释度为1:30，然后以3倍为稀释梯度将待测血清进行倍比稀释，共6个稀释度)；用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.33×104TCID50/mL备用。
22.2实验过程
血清与假病毒共孵育，将不同稀释度的血清加入96孔板，加入体积为100μL/孔，每个稀 释度做3个复孔,然后将稀释好的假病毒加到含有血清的孔中，加入体积为50μL/孔，同时做 6孔假病毒对照(100μL/孔完全培养基和50μL/孔假病毒)，将上述96孔板置于细胞培养箱中 (37℃，5％CO2)孵育1h。当孵育时间40min后，取出培养箱中事先准备好的Huh-7细胞(汇 合率达80％～90％)，经消化后用完全培养基重悬细胞，采用细胞计数仪进行细胞计数，用 DMEM完全培养基将细胞稀释至2×105个/mL。孵育1h，向96孔板中每孔加100μL细胞， 使每孔细胞为2×104个，同时做6孔细胞对照(每孔含有150μL的完全培养基和100μL的细胞), 将96孔板放入细胞培养箱中，37℃和5％CO2培养20h。20h后从细胞培养箱中取出96孔 板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μL上清，然后加入预先在室温平衡30min的荧光 素酶检测试剂(britelite plus，PerkinElmer)，加入体积为100μL/孔，室温避光反应2min。
22.3实验结果
反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每 孔中吸出100μL液体，加于对应96孔化学发光检测板(Nunc，236108)中，置于GLOMAX化学发光检测仪中读取发光值。计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－细胞 对照组均值)/(病毒对照组的发光强度均值－细胞对照组均值)]×100％。利用Graphpad Prism 7 软件对中和抑制率进行S拟合分析，计算出待测血清的IC50。
2019-nCoV冠状病毒假病毒实验结果如表15所示，BsAb16、BsAb17和BsAb18的病毒中和效应显著优于对应的单抗分子。
表15双抗细胞水平中和2019-nCoV冠状病毒假病毒结果
Figure BDA0002786692770000591
实施例23双抗在细胞水平中和2019-nCoV冠状病毒真病毒的功能检测
本实施例中，测试评价了候选双抗BsAb16、BsAb17和对应单抗R15-F7以及P14-F8对 2019-nCoV冠状病毒的中和效果。2019-nCoV冠状病毒S蛋白结合细胞表面上的受体ACE2是病毒感染宿主细胞的第一步，本实施例中使用的Vero E6细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。因为绿猴ACE2与人ACE2的序列同源性达到95％，Vero E6细胞常用于抗冠状病 毒候选药物的体外药效评价，因此使用Vero E6细胞用于候选抗体的病毒中和活性测定。检测方法采用的蚀斑减少测定，蚀斑减少中和试验是检测抗体的金标准方法，试验以使蚀斑数 减少90％(PRNT90)或50％(PRNT50)的抗体浓度作为其效价。
23.1材料准备
非洲绿猴肾细胞(Vero)购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，由军事医学研究院微生物 流行病研究所病毒学研究室保存。SARS-CoV-2新型冠状病毒北京分离株 BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020和BetaCoV/Beijing/IMEBJ08/2020，其基因组序列号分别为GWHACAX01000000和GWHAMKA01000000，由军事医学研究院微生物流行病研究所病毒 学研究室分离并保存。病毒原液滴度分别为5×105pfu/mL和1×107pfu/mL。
23.2实验过程
Vero细胞培养：在75cm2培养瓶中加入DMEM完全培养基12mL，于5％CO2培养箱中 37℃培养，3天传代一次。传代时移除旧培养基，用PBS洗细胞1次，加入2mL 0.25％胰 酶-EDTA在培养箱中消化3min。光学显微镜下观察到细胞变圆，弃去胰酶，然后加入9mL 培养基终止消化，用移液管将细胞吹打成单细胞，按1：3的比例取出细胞液加入新的培养瓶， 再在新的培养瓶中补加新的培养基至12mL，混匀，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培 养。
用细胞维持液将抗体按3倍倍比稀释，与等体积的新型冠状病毒的混合，37℃孵育1h； 将病毒-抗体混合液(200μL/孔)加入含单层致密Vero细胞的24孔培养板中，37℃培养1h， 其间轻轻摇动数次；弃病毒抗体混合液，每孔加入适当体积预热的营养琼盖，37℃、5％CO2培养箱继续培养，在感染后第2天加入适当体积的固定液，室温固定1h，弃固定液和营养琼 盖，用固定液清洗1次；加入适当体积的1.0％结晶紫溶液，室温染色1h，弃结晶紫溶液，用固定液清洗1次，计数出斑数。并按照公式计算抑制率(抑制率＝(1-抗体组/对照组)*100％)。
23.3实验结果
在Excel中整理数据，所有试验的均数、标准差等均在Graphpad Prism 7软件完成并绘制 相关的统计图表，结果显示BsAb17显示出了优于单抗的病毒中和效应，结果如表16和图28A- 图28B所示，结果显示BsAb17的病毒中和效果最好。
表16双抗细胞水平中和2019-nCoV冠状病毒真病毒结果
Figure BDA0002786692770000601
Figure BDA0002786692770000611
实施例24抗体序列分析
基于上述实施例选定了抗体R15-F7、P14-F8、以及改造后P14-F8-hVH8、P14-F8-35、 P14-F8-38、P14-F8-43和双抗BsAb16、BsAb17和BsAb18，对它们进行了分析和测序。基于 IMGT数据库(http://www.imgt.org/)对人抗体序列可变区进行定义，确定本发明抗体轻链和重 链可变区的序列(SEQ ID NO:1-7)；针对可变区序列进行分析，采用AbM定义CDR的方式， 确定了抗体重链和轻链的互补决定区序列(SEQ ID NO:8-21)，并确定全长抗体序列(SEQ ID NO:22-41)。具体序列信息详见序列表17、表18、表19和表20。
序列表概述
表17抗体可变区氨基酸序列
Figure BDA0002786692770000612
Figure BDA0002786692770000621
表18抗体互补决定区(CDR)氨基酸序列
Figure BDA0002786692770000622
表19全长抗体氨基酸序列
Figure BDA0002786692770000623
Figure BDA0002786692770000631
Figure BDA0002786692770000641
Figure BDA0002786692770000651
Figure BDA0002786692770000661
表20全长抗体核苷酸序列
Figure BDA0002786692770000662
Figure BDA0002786692770000671
Figure BDA0002786692770000681
Figure BDA0002786692770000691
Figure BDA0002786692770000701
Figure BDA0002786692770000711
Figure BDA0002786692770000721
Figure BDA0002786692770000731
Figure BDA0002786692770000741
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本公开可以以 其他具体形式来实施。由于本公开的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是， 其他变化被认为是在本公开的范围内。因此，本公开不限于在此详细描述的特定实施方案。 相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 三优生物医药（上海）有限公司
上海之江生物科技股份有限公司
<120> 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
<130> GWHWW204114DI
<141> 2020-11-18
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Phe Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Phe Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Ile Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg Thr
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Phe Gly Arg Ser Asp Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr Val Met Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Asn Thr Arg Gly Ile Val Thr Arg
1 5 10
<210> 22
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Phe Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 25
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 26
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 27
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Phe Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 28
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Ile Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg Ser Asp Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
115 120 125
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 29
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
465 470 475 480
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg
485 490 495
Phe Gly Ser Tyr Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Glu Trp Val Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Ile Val Thr Arg Tyr
515 520 525
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
530 535 540
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
545 550 555 560
Val Tyr Tyr Cys Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Glu Gly Arg
565 570 575
Ser Asp Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 30
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
465 470 475 480
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg
485 490 495
Phe Gly Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Glu Trp Val Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr
515 520 525
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
530 535 540
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
545 550 555 560
Val Tyr Tyr Cys Ala Val Ala Ala Ser Pro Ala Thr Phe Glu Gly Arg
565 570 575
Ser Asp Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 31
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
465 470 475 480
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg
485 490 495
Phe Gly Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Pro Glu Trp Val Ser Asp Ile Asn Thr Arg Gly Glu Thr Thr Arg Tyr
515 520 525
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
530 535 540
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
545 550 555 560
Val Tyr Tyr Cys Ala Val Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Phe Gly Arg
565 570 575
Ser Asp Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 32
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcggtgct 300
ttttactatg gttcggggag ttatcccttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcatcag cttccaccaa gggcccctcc gtgttccccc tggctccctc ttccaagagc 420
accagcggcg gcaccgctgc tctgggatgt ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg 480
accgtgtcct ggaattccgg cgccctgacc tccggcgtgc acacattccc tgctgtgctg 540
cagtcctccg gcctgtatag cctgtcctcc gtggtgacag tgcctagctc cagcctgggc 600
acccagacct atatctgcaa cgtgaaccac aagcctagca ataccaaggt ggacaagaag 660
gtggagccta agagctgcga caagacccac acctgtcctc catgtcctgc tccagaagct 720
gctggcggac cttccgtgtt cctgtttcct ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc 780
agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggatcc cgaagtgaag 840
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa 900
cagtacaaca gcacctacag agtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 960
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcctgctcc tatcgagaaa 1020
accatcagca aggccaaggg ccagcctagg gaaccccagg tttacacact gcctccaagc 1080
agggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttctaccct 1140
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat ggccagcctg agaacaacta caagacaacc 1200
cctcctgtgc tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag 1260
agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320
cactacaccc agaagtccct gagcctgtct cctggcaaa 1359
<210> 33
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc gactatttaa attggtatca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tctgcaacct 240
gaagactttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtg ccccccggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aaggaccgtg gctgccccca gcgtgttcat cttccctcct 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgct agcgtggtgt gtctgctgaa taacttctat 420
cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tgcagagcgg caactcccag 480
gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgagctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ctgattatga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acaccagggc 600
ctgtccagcc ctgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642
<210> 34
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactg 60
tcctgtgcag cttctgggtt ccgctttggt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg cgcccgaatg ggtctcagat attaatacgc gtggtgagac gacaaggtat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc gccagagaca acgccaataa caccgtcttt 240
ctgttcatga accgcctgaa acctgaggac acagccgttt attactgtgc agtggctgct 300
tccggcgaca ccttcgaggg caggagcgac cctgactatt ggggccaggg caccctggtc 360
actgtctcat cagagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct 420
ccagaagctg ctggcggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 480
atgatcagca gaacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc 540
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 600
agagaggaac agtacaacag cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 660
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct 720
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg 780
cctccaagca gggacgagct gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc 840
ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 900
aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac ggctcattct tcctgtacag caagctgaca 960
gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1020
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg agcctgtctc ctggcaaa 1068
<210> 35
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc caggcggctc tctgaggctg 60
tcctgcgctg ctagcggctt ccggtttggc tcttactata tgtcctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg ctcctgagtg ggtgtctgac atcaacacca ggggcgagac cacaagatac 180
gctgacagcg tgaagggcag attcaccatc tctcgcgata acgctaagaa tacactgtat 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggccgct 300
tccggcgata catttgaggg ccgcagcgac cccgattact ggggacaggg caccctggtg 360
acagtgtcca gcgagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct 420
ccagaagctg ctggcggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 480
atgatcagca gaacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc 540
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 600
agagaggaac agtacaacag cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 660
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct 720
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg 780
cctccaagca gggacgagct gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc 840
ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 900
aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac ggctcattct tcctgtacag caagctgaca 960
gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1020
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg agcctgtctc ctggcaaa 1068
<210> 36
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctctggctt cagattcggc tcctactaca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg ctcctgaatg ggtgtccgac atcaacacca gaggcgagac aaccagatac 180
gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgttgccgct 300
tctccggcga ccttcgaggg aagatctgac cctgattact ggggccaggg caccctggtt 360
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atgatcagca gaacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc 540
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 600
agagaggaac agtacaacag cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 660
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct 720
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg 780
cctccaagca gggacgagct gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc 840
ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 900
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gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1020
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg agcctgtctc ctggcaaa 1068
<210> 37
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctctggctt cagattcggc tcctacacga tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg ctcctgaatg ggtgtccgac atcaacacca gaggcgagac aaccagatac 180
gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgttgccgct 300
tctggcgaca ccttttttgg aagatctgac cctgattact ggggccaggg caccctggtt 360
acagtgtcat ctgagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct 420
ccagaagctg ctggcggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 480
atgatcagca gaacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc 540
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 600
agagaggaac agtacaacag cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 660
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct 720
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg 780
cctccaagca gggacgagct gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc 840
ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 900
aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac ggctcattct tcctgtacag caagctgaca 960
gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1020
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg agcctgtctc ctggcaaa 1068
<210> 38
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ttggttcagc ctggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctctggctt cagattcggc tcctatgtta tgtcctggtt ccgacaggct 120
cctggcaagg ctcctgaatg ggtgtccgac atcaacacca gaggcattgt gaccagatac 180
gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgttgccgct 300
tctggcgaca ccttcgaggg aagatctgac cctgattact ggggccaggg caccctggtt 360
acagtgtcat ctgagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgtcctcc atgtcctgct 420
ccagaagctg ctggcggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 480
atgatcagca gaacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggatccc 540
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 600
agagaggaac agtacaacag cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 660
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct 720
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctaggg aaccccaggt ttacacactg 780
cctccaagca gggacgagct gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc 840
ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 900
aagacaaccc ctcctgtgct ggacagcgac ggctcattct tcctgtacag caagctgaca 960
gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1020
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg agcctgtctc ctggcaaa 1068
<210> 39
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcggtgct 300
ttttactatg gttcggggag ttatcccttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcatcag cttccaccaa gggcccctcc gtgttccccc tggctccctc ttccaagagc 420
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agggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttctaccct 1140
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat ggccagcctg agaacaacta caagacaacc 1200
cctcctgtgc tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag 1260
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gttatgtcct ggttccgaca ggctcctggc aaggctcctg aatgggtgtc cgacatcaac 1560
accagaggca ttgtgaccag atacgccgac tccgtgaagg gcagattcac catctccaga 1620
gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 1680
gtgtactatt gtgccgttgc cgcttctggc gacaccttcg agggaagatc tgaccctgat 1740
tactggggcc agggcaccct ggttacagtg tcatct 1776
<210> 40
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcggtgct 300
ttttactatg gttcggggag ttatcccttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcatcag cttccaccaa gggcccctcc gtgttccccc tggctccctc ttccaagagc 420
accagcggcg gcaccgctgc tctgggatgt ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg 480
accgtgtcct ggaattccgg cgccctgacc tccggcgtgc acacattccc tgctgtgctg 540
cagtcctccg gcctgtatag cctgtcctcc gtggtgacag tgcctagctc cagcctgggc 600
acccagacct atatctgcaa cgtgaaccac aagcctagca ataccaaggt ggacaagaag 660
gtggagccta agagctgcga caagacccac acctgtcctc catgtcctgc tccagaagct 720
gctggcggac cttccgtgtt cctgtttcct ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc 780
agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggatcc cgaagtgaag 840
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa 900
cagtacaaca gcacctacag agtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 960
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcctgctcc tatcgagaaa 1020
accatcagca aggccaaggg ccagcctagg gaaccccagg tttacacact gcctccaagc 1080
agggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttctaccct 1140
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat ggccagcctg agaacaacta caagacaacc 1200
cctcctgtgc tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag 1260
agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320
cactacaccc agaagtccct gagcctgtct cctggcaaag gaggcggagg ctctggagga 1380
ggaggatctg gcggaggagg cagcgaggtg cagctggttg aatctggcgg aggattggtt 1440
cagcctggcg gctctctgag actgtcttgt gccgcctctg gcttcagatt cggctcctac 1500
tacatgtcct gggtccgaca ggctcctggc aaggctcctg aatgggtgtc cgacatcaac 1560
accagaggcg agacaaccag atacgccgac tccgtgaagg gcagattcac catctccaga 1620
gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 1680
gtgtactatt gtgccgttgc cgcttctccg gcgaccttcg agggaagatc tgaccctgat 1740
tactggggcc agggcaccct ggttacagtg tcatct 1776
<210> 41
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcggtgct 300
ttttactatg gttcggggag ttatcccttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcatcag cttccaccaa gggcccctcc gtgttccccc tggctccctc ttccaagagc 420
accagcggcg gcaccgctgc tctgggatgt ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg 480
accgtgtcct ggaattccgg cgccctgacc tccggcgtgc acacattccc tgctgtgctg 540
cagtcctccg gcctgtatag cctgtcctcc gtggtgacag tgcctagctc cagcctgggc 600
acccagacct atatctgcaa cgtgaaccac aagcctagca ataccaaggt ggacaagaag 660
gtggagccta agagctgcga caagacccac acctgtcctc catgtcctgc tccagaagct 720
gctggcggac cttccgtgtt cctgtttcct ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc 780
agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggatcc cgaagtgaag 840
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa 900
cagtacaaca gcacctacag agtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 960
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcctgctcc tatcgagaaa 1020
accatcagca aggccaaggg ccagcctagg gaaccccagg tttacacact gcctccaagc 1080
agggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttctaccct 1140
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat ggccagcctg agaacaacta caagacaacc 1200
cctcctgtgc tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag 1260
agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320
cactacaccc agaagtccct gagcctgtct cctggcaaag gaggcggagg ctctggagga 1380
ggaggatctg gcggaggagg cagcgaggtg cagctggttg aatctggcgg aggattggtt 1440
cagcctggcg gctctctgag actgtcttgt gccgcctctg gcttcagatt cggctcctac 1500
acgatgtcct gggtccgaca ggctcctggc aaggctcctg aatgggtgtc cgacatcaac 1560
accagaggcg agacaaccag atacgccgac tccgtgaagg gcagattcac catctccaga 1620
gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 1680
gtgtactatt gtgccgttgc cgcttctggc gacacctttt ttggaagatc tgaccctgat 1740
tactggggcc agggcaccct ggttacagtg tcatct 1776
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15

Claims (49)

1.一种特异性结合冠状病毒S蛋白的多肽复合物，所述多肽复合物包含：
(a)第一表位结合部分，所述第一表位结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区一起形成特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第一表位的抗原结合结构域，和
(b)第二表位结合部分，所述第二表位结合部分包含特异性结合所述冠状病毒S蛋白的第二表位的单域抗体或其VHH片段，
其中所述第一表位结合部分和所述第二表位结合部分彼此融合，并且
其中所述第一表位不同于所述第二表位。
2.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分与所述第二表位结合部分互不竞争表位。
3.根据权利要求1所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求2所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽复合物，其中
所述重链可变区包含：
SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体，
SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体，和
SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体；和/或
所述轻链可变区包含：
SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体，
SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体，和
SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体。
6.根据权利要求5所述的多肽复合物，其中所述第一重链CDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成；所述第一重链CDR2包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；所述第一重链CDR3包含或由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成；所述轻链CDR1包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；所述轻链CDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/或所述轻链CDR3包含或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1-4和6中任一项所述的多肽复合物，其中：
所述重链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或
所述轻链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
8.根据权利要求5所述的多肽复合物，其中：
所述重链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或
所述轻链可变区包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:2所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
9.根据权利要求1-4、6和8中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分包含含有所述重链可变区的重链和含有所述轻链可变区的轻链，并且其中所述重链包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:22所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或所述轻链包含或由下列序列组成：SEQID NO:23所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
10.根据权利要求1-4、6和8中任一项所述的多肽复合物，其中所述单域抗体包含VHH片段或由VHH片段组成。
11.根据权利要求1-4、6和8中任一项所述的多肽复合物，其中所述单域抗体包含：
SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体；
SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体；和
SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体。
12.根据权利要求11所述的多肽复合物，其中所述第二重链CDR1包含或由SEQ ID NO:14、18或20所示的氨基酸序列组成；所述第二重链CDR2包含或由SEQ ID NO:15或21所示的氨基酸序列组成；和/或所述第二重链CDR3包含或由SEQ ID NO:16、17或19所示的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求12所述的多肽复合物，其中：
所述第二重链CDR1包含或由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成；所述第二重链CDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；且所述第二重链CDR3包含或由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成；
所述第二重链CDR1包含或由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成；所述第二重链CDR2包含或由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成；且所述第二重链CDR3包含或由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成；或
所述第二重链CDR1包含或由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成；所述第二重链CDR2包含或由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成；且所述第二重链CDR3包含或由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述单域抗体或其VHH片段包含或由下列序列组成：SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
15.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一个重链的C-末端融合。
16.根据权利要求14所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一个重链的C-末端融合。
17.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一个轻链的C-末端融合。
18.根据权利要求14所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的N-末端与所述第一表位结合部分的至少一个轻链的C-末端融合。
19.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个重链的N-末端融合。
20.根据权利要求14所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个重链的N-末端融合。
21.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个轻链的N-末端融合。
22.根据权利要求14所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分的C-末端与所述第一表位结合部分的至少一个轻链的N-末端融合。
23.根据权利要求1-4、6、8、12和13中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分包含至少2个相同或不同的VHH片段，所述VHH片段以串联的方式与所述第二表位结合部分融合或分别与所述第二表位结合部分融合。
24.根据权利要求14所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分包含至少2个相同或不同的VHH片段，所述VHH片段以串联的方式与所述第二表位结合部分融合或分别与所述第二表位结合部分融合。
25.根据权利要求16、18、20和22中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二表位结合部分包含至少2个相同或不同的VHH片段，所述VHH片段以串联的方式与所述第二表位结合部分融合或分别与所述第二表位结合部分融合。
26.根据权利要求1-4、6、8、12、13、16、18、20、22和24中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分包含Fc区。
27.根据权利要求26所述的多肽复合物，其中所述Fc区为IgG1 Fc或IgG4 Fc。
28.根据权利要求26所述的多肽复合物，其中所述Fc区为具有L234A和L235A的IgG1 Fc或具有S228P突变的IgG4 Fc。
29.根据权利要求1-4、6、8、12、13、16、18、20、22、24、27和28中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一表位结合部分和所述第二表位结合部分经由肽键或肽接头彼此融合。
30.根据权利要求29所述的多肽复合物，其中所述肽接头具有不超过约30个氨基酸的长度。
31.根据权利要求30所述的多肽复合物，其中所述肽接头包含选自由(G)n、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和SEQ ID NO：42-45所示的氨基酸序列组成的组，其中n为至少1的整数。
32.根据权利要求1-4、6、8、12、13、16、18、20、22、24、27、28、30和31中任一项所述的多肽复合物，其中所述单域抗体为骆驼科单域抗体或人源化单域抗体。
33.根据权利要求32所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物包含SEQ ID NO:29、30或31所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
34.根据权利要求1-4、6、8、12、13、16、18、20、22、27、28、30、31和33中任一项所述的多肽复合物，其中所述多肽复合物是双特异性抗体复合物，所述双特异性抗体复合物由2条重链和2条轻链组成，所述重链由SEQ ID NO:29、30或31所示的氨基酸序列组成，并且所述轻链由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列组成。
35.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO:33所示的序列和SEQ ID NO:39、40或41所示的序列。
37.一种分离的载体，其包含根据权利要求35或36所述的多核苷酸。
38.一种宿主细胞，其包含根据权利要求35或36所述的多核苷酸或根据权利要求37所述的载体。
39.一种表达根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物的方法，所述方法包括在适于表达所述多肽复合物的条件下培养根据权利要求38所述的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞或从培养基回收权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物和药学上可接受的载体。
41.一种检测试剂盒，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物。
42.根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物在制备用于治疗和/或预防受试者中的冠状病毒感染的药物中的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒，所述冠状病毒感染是COVID-19。
44.根据权利要求1至34中任一项所述的多肽复合物在制备用于检测冠状病毒或诊断冠状病毒感染的诊断剂或试剂盒中的用途。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒，所述冠状病毒感染是COVID-19。
46.一种体外检测环境中冠状病毒污染的方法，其包括：提供环境样品；使所述环境样品与根据权利要求1-34中任一项所述的多肽复合物或权利要求41所述的检测试剂盒接触；以及检测权利要求1-34中任一项所述的多肽复合物与冠状病毒S蛋白之间的复合体的形成。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
48.一种特异性结合冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体，SEQ ID NO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体，和SEQ IDNO:1所示的重链可变区氨基酸序列中的第一重链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体；并且其中所述轻链可变区包含：SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体，SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体，和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区氨基酸序列中的轻链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体；或
(b)VHH片段，所述VHH片段包含：SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR1或其不超过2个氨基酸变化的变体；SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR2或其不超过2个氨基酸变化的变体；和SEQ ID NO:5、6或7所示的VHH氨基酸序列中的第二重链CDR3或其不超过2个氨基酸变化的变体。
49.根据权利要求48所述的抗体或其抗原结合片段，
其中所述第一重链CDR1包含或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成；所述第一重链CDR2包含或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；所述第一重链CDR3包含或由SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列组成；所述轻链CDR1包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；所述轻链CDR2包含或由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；和/或所述轻链CDR3包含或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成；或者
其中所述VHH片段包含：如式GFRFGSYX1MS所示的氨基酸序列的第二重链CDR1，其中X1为Y、T或V；如式DINTRGX2X3TR所示的氨基酸序列的第二重链CDR2，其中X2为E或I，且X3为T或V；以及如式AASX4X5TFX6GRSDPDY所示的氨基酸序列的第二重链CDR3，其中X4为G或P，X5为D或A，且X6为E或F。
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