CN117343168A - 冠状病毒结合分子及医药用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及冠状病毒结合分子及医药用途。具体而言，本公开涉及冠状病毒结合分子及其用于治疗、预防冠状病毒介导的相关疾病。

Description

冠状病毒结合分子及医药用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，涉及冠状病毒结合分子及其用于治疗、预防冠状病毒介导的相关疾病。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情，自2019年底开始在人群中发现，目前已经成为流行病史上规模最大的流行病之一。在全球范围内，新型管状病毒感染的累计确诊病例数超过5亿例，引起的死亡人数超过600万。世界卫生组织(WHO)将SARS-CoV-2引起的疾病被命名为“COVID-19”。
新型冠状病毒流行早期，疾病症状早期主要以发热、乏力、干咳、呼吸困难为主，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官受累。随着疫苗的逐步普及，曾接种过疫苗者以无症状及轻症为主，但少数儿童、部分老年人以及有基础疾病的人群，病情仍有可能在短期内急剧恶化。但是由于SARS-CoV-2的快速突变造成的疫苗保护效果降低、病毒基本传染数R0增加，造成国内新冠疫情阶段性控制并时有反复，同时欠发达地区的疫情仍旧持续恶化的局面，是全球公共卫生安全额度极大挑战。根据国家卫健委的诊疗方案，目前针对新型管状病毒感染的常规治疗手段为肺炎基础疗法结合抗病毒和抗炎治疗，并依照患者病情进展和疾病临床分型进行分级治疗。
SARS-CoV-2与重症急性呼吸综合征(SARS)的冠状病毒(SARS-CoV)及引发中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)的冠状病毒(MERS-CoV)一样，均为β属冠状病毒。SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒，有包膜结构，主要经空气飞沫、相对封闭环境的气溶胶及密切接触传播。研究表明，SARS-CoV-2与SARS-CoV基因组序列相似度为79.5％。其致病原理均为通过病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)的识别和结合来感染宿主细胞。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，宿主细胞的受体蛋白ACE2与S1亚基的受体结合结构域(receptor-binding domain，RBD)相结合会触发S2亚基的构象改变，进而将病毒与宿主细胞拉近促进膜融合而侵入细胞(Wrapp等，Science，2020)。针对S1亚基RBD上不同表位的中和抗体能够抑制病毒与细胞受体的结合，在体外和体内均具有强大的抗冠状病毒活性(Zost等，Nature，2020)，在临床上同时具有治疗和预防的双重效果。同时，相比小分子药物和康复病人血浆疗法，具有明确靶点和分子结构的中和抗体，其临床使用的特异性和安全性更好。目前，全球范围内获得EUA授权的针对SARS-CoV-2的中和抗体，均为康复病人来源的单克隆抗体或“鸡尾酒”疗法，占据RBD与ACE2识别的1-2个经典表位。但是由于病毒的快速突变，目前除LY-CoV1404外的其他中和抗体疗法，几乎全部因为新的突变株出现而失去病毒中和功能，从而停止使用。
驼科动物(如骆驼和羊驼)会产生一种独特的缺失轻链的重链抗体(HcAb)，源于这种抗体的可变区片段(VHH)称为单域抗体(single domain antibody，sdAb)。单域抗体的分子量只有12-15kDa，是传统抗体(包含四条链)的十分之一，其结构直径2.5nm、长4nm，是目前已知的最小的具有完整抗原结合活性的抗体。单域抗体同样含有3个CDR，其中CDR3对亲合力起到主要作用。与人抗体VH相比，单域抗体的CDR3更长，可以形成凸环(buLge loop)结构，能够深入抗原内部，从而更好地结合抗原。因而，VHH具有高亲合力和高特异性的特点。此外，单域抗体中FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性更好，不易形成聚集体。与传统抗体相比，单域抗体具有高结合力、高特异性、高溶解度、高稳定性和高表达量等诸多优点。
本公开提供了针对SARS-CoV-2的新结构的单域抗体，并将多个单域抗体组合制备分子，不仅能够有效中和SARS-CoV-2，还能有效中和SARS-CoV，具有临床预防、治疗包括SARS-CoV和SARS-CoV-2在内的冠状病毒引发的相关疾病的高潜力。针对SARS-CoV-2变异性极高的情况，本公开提供的方案能有效避免病毒逃逸，因此可用于防范潜在的新冠病毒大流行。同时，本公开多个单域抗体组合的方式解决了联合抗体疗法需要多套细胞株以及多套生产工艺的问题，大大降低了开发和生产成本。
发明内容
本公开提供一种病毒结合分子、其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、试剂盒，其用于治疗或预防病毒(例如冠状病毒、新型冠状病毒等)相关疾病的方法和制药用途，其用于检测病毒(例如冠状病毒、新型冠状病毒等)的方法和用途。
病毒结合分子
本公开提供一种病毒结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含：
1)SEQ ID NO：4、30-35任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
2)SEQ ID NO：7、38-43任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
3)SEQ ID NO：9、52-61任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
4)SEQ ID NO：8、46-51任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
5)SEQ ID NO：5任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
6)SEQ ID NO：6任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
所述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的，一些实施方案中，所述CDR是根据Kabat编号系统定义。
本公开提供一种病毒结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自如下的CDR1、CDR2和CDR3：
1)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
2)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20、45所示；
3)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示；
4)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；
5)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示；
6)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17、18所示；
一些实施方案中，
1-1)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、36任一所示；
2-1)CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示；
3-1)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；
3-2)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示。
本公开提供一种病毒结合分子，其包含前述CDR1、CDR2、CDR3中的任意一个。
一些实施方案中，前述病毒结合分子中，所述免疫球蛋白单一可变结构域为骆驼源或人源化的。
一些实施方案中，前述病毒结合分子中，所述人源化免疫球蛋白单一可变结构域中的框架区源自人重链可变区种系基因IGHV3-23或IGHV3-66。
本公开提供一种病毒结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列包含或为如下任一项所示：
1)SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列；
2)SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列；
3)SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列；
4)SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列；
5)SEQ ID NO：5或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列；
6)SEQ ID NO：6或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列。
本公开中，“至少90％”涵盖至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％及以上。
本公开提供了一种病毒结合分子，其包含至少一个前述免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述病毒结合分子包含一个前述免疫球蛋白单一可变结构域。在另一些实施方案中，所述病毒结合分子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个前述免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述病毒结合分子包含两个或更多个相同的前述本公开提供的免疫球蛋白单一可变结构域。在另一些实施方案中，所述病毒结合分子包含两个或更多个不同的前述本公开提供的免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述两个或更多个免疫球蛋白单一可变结构域直接连接。在另一些实施方案中，所述两个或更多个特异性结合病毒的免疫球蛋白单一可变结构域通过连接子相连接。所述连接子可以包含1-20或更多个氨基酸，且不包含二级或三级结构的非功能性氨基酸序列。一些实施方案中，所述连接子是柔性连接子，例如GS、GAP、ASGS、(GmSn)x、(GGNGT)x、(YGNGT)x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)等连接子，例如(G4S)x，其中，x为1-8(例如，2、3、4、5、6)之间的整数。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子中还包含免疫球蛋白Fc区。一些具体实施方案中，前述免疫球蛋白单一可变结构域可以位于所述Fc区的N端和/或C端。
本公开提供一种病毒结合分子，其包含多肽链，所述多肽链从N端到C端含有：
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-linker3-[第四免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区；
Fc区-[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]；
Fc区-[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]；
Fc区-[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-linker3-[第四免疫球蛋白单一可变结构域]；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区-linker3-[第四免疫球蛋白单一可变结构域]；
[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-linker3-[第四免疫球蛋白单一可变结构域]；
所述Fc区可以存在或不存在；
所述linker1、linker2、linker3可以存在或不存在，当存在时，其可以选自前述本公开提及的连接子，且可以相同或不同，例如，linker1、linker2、linker3均为(G4S)4(SEQID NO：88)。；
所述第一、第二、第三、第四免疫球蛋白单一可变结构域选自前述本公开任意的免疫球蛋白单一可变结构域，可以相同或不同。
示例性的一些实施方案为：
1)[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区，其中：
1-1)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：22、23、24所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
1-2)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：26、63-68任一所示，或第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：22、23、24所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、36任一所示；
1-3)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
1-4)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：61或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
2)[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区，其中：
2-1)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：22、23、24所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示；
2-2)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：26、63-68任一所示，或第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：26、63-68任一所示，或第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、36任一所示；
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：11、36任一所示；
第一疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：22、23、24所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、36任一所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：26、63-68任一所示，或第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；
2-3)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
2-4)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：61或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：61或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：61或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
3)[第一免疫球蛋白单一可变结构域]-linker1-[第二免疫球蛋白单一可变结构域]-linker2-[第三免疫球蛋白单一可变结构域]-linker3-[第四免疫球蛋白单一可变结构域]-Fc区，其中：
3-1)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示，第四疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
3-2)第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：21、44任一所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ IDNO：26、63-68任一所示，或第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：26、63-68任一所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；第四疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：11、36任一所示；
3-3)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第四免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
3-4)第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：61或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第四免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中，所述病毒结合分子包含两条多肽链，所述多肽链是相同的或不同的。
一些实施方案中，前述Fc区选自人IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的Fc区。一些实施方案中，前述Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区，例如IgG1的Fc区。一些具体实施方案中，前述Fc区具有突变或修饰，所述突变或修饰能增加Fc与FcRn的亲和力，从而避免或降低降解，延长病毒结合分子的半衰期。一些具体实施方案中，前述Fc区是具有M252Y/S254T/T256E(即，YTE)或M428L/N434S的人IgG1的Fc区。
本公开提供一种病毒结合分子，其包含选自如SEQ ID NO：71-77任一所述或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中，前述免疫球蛋白单一可变结构域为VHH。
一些实施方案中，前述病毒结合分子为抗体或其抗原结合片段，例如，为中和抗体或其抗原结合片段。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子结合β属冠状病毒。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子结合β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子与SARS-CoV交叉反应；另一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子不与SARS-CoV交叉反应。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子结合冠状病毒(SARS-CoV)和/或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
一些实施方案中，前述本公开的病毒结合分子结合SARS-CoV和/或SARS-CoV-2的S蛋白，例如S蛋白的S1亚基，例如S蛋白的S1亚基的受体结合结构域(receptor-bindingdomain，RBD)。
一些实施方案中，前述SARS-CoV-2为野生型、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株或Omicron突变株。
一些实施方案中，前述SARS-CoV-2的亚系为A亚系、B.1.1.7亚系、B.1.351亚系、B.1.617.2亚系、B.1.1.529(BA.1)亚系、BA.4亚系、BA.5亚系。
一些实施方案中，提供病毒结合分子，其与本公开的病毒结合分子结合或竞争结合相同的表位。
多核苷酸和载体
本公开提供经分离的多核苷酸，其编码本公开的病毒结合分子。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。根据本公开的一些实施方案，本公开的多核苷酸是基本上分离或经分离的多核苷酸。
本公开提供含有如上所述的多核苷酸的表达载体，或者说，本公开的多核苷酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒、YAC或病毒载体。载体可尤其为表达载体，即可提供病毒结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体，表达载体可以是真核表达载体、原核表达载体、病毒载体，例如质粒、粘粒、噬菌体。该表达载体通常包含至少一种本公开的多核苷酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本公开的病毒结合分子的表达有用或必需的调控元件及其他元件例如为启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。
本公开的多核苷酸可基于本公开的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得。
宿主细胞
本公开提供表达前述任意一种的病毒结合分子，和/或含有前述任意一种的多核苷酸或载体的宿主细胞。一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞
细菌细胞例如包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。
真菌细胞例如包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
哺乳动物细胞例如包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。
然而，本公开也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本公开的细胞不能发育成完成的植株或动物个体。
生产或制备方法
本公开提供制备前述任意一种的病毒结合分子的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本公开的病毒结合分子的条件下，培养本公开的宿主细胞；及
-从培养物中回收由所述宿主细胞表达的目的蛋白；及
-任选的，包括进一步纯化和/或修饰本公开的目的蛋白。
本公开的病毒结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本公开的蛋白的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。作为一个示例，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
然而，本公开的病毒结合分子也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。
组合物
本公开提供组合物，例如药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的病毒结合分子，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
在一些具体实施方式中，所述药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的前述本公开的病毒结合分子，或药物组合物单位剂量中含前述本公开的病毒结合分子的量为0.1-2000mg，在一些具体实施方式中为1-1000mg。
预防、治疗疾病的方法和制药用途
本公开提供了前述任意一种的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
本公开提供了前述任意一种的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在制备中和病毒的药物中的应用。
本公开提供了前述任意一种的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在制备阻断或抑制病毒与ACE2结合的药物中的应用。
本公开提供了前述任意一种的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在制备预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用。
本公开提供了前述任意一种的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在制备降低体内病毒载量的药物中的应用。
本公开提供了本公开的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在预防和/或治疗疾病中用途和方法。
本公开提供了本公开的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物用于中和病毒的用途和方法。
本公开提供了本公开的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物用于阻断或抑制病毒与ACE2的用途和方法。
本公开提供了本公开的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在预防和/或治疗病毒感染中的用途和方法。
本公开提供了本公开的病毒结合分子、多核苷酸、药物组合物在降低体内病毒载量中的用途和方法。
一些实施方案中，所述疾病为β属冠状病毒介导的相关疾病。
一些实施方案中，所述疾病为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒介导的相关疾病。
一些具体实施方案中，所述冠状病毒为冠状病毒(SARS-CoV)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
一些具体实施方案中，所述SARS-CoV-2为野生型、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株或Omicron突变株。
一些具体实施方案中，所述SARS-CoV-2的亚系为A、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2、B.1.1.529(BA.1)、BA.4、BA.5。
一些实施方案中，所述疾病为病毒感染性疾病或病毒感染相关的呼吸系统疾病。
一些具体实施方案中，所述病毒感染相关呼吸系统疾病包括单纯性感染、发热、咳嗽、咽痛、肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染(SARI)、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)。
试剂盒和检测
本公开提供试剂盒，包含本公开的病毒结合分子。一些实施方案中，还提供包含上述多核苷酸的诊断试剂，以及提供相关诊断用途。
本公开提供检测用途的组合物，所述组合物包含本公开的病毒结合分子。本公开还提供用于体内或体外病毒的方法、系统或装置，其包括用本公开的病毒结合分子处理样品。
一些实施方案中，体外检测方法、系统或装置可能例如包括：
(1)使样品与本公开的病毒结合分子接触；
(2)检测在本公开的病毒结合分子和样品之间形成的复合物；和/或
(3)使参比样品(例如，对照样品)与抗体接触；和
(4)通过与参比样品比较，确定复合物形成的程度。例如，与参比样品相比，来自受试者的样品复合物形成的变化(例如，统计学上的显著变化)表示样品中存在病毒。
检测可以包括确定形成复合物的位置或时间。用可检测物质对病毒结合分子，通过对所述标记检测以实现对病毒结合分子的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。可以通过测量与病毒结合或不结合的病毒结合分子(或使其可视化)，检测在病毒和病毒结合分子之间的复合物形成。可以使用常规检测测定法，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。出于检测目的，本公开的病毒结合分子可以用荧光团发色团标记。
一些实施方案中，还提供试剂盒，所述试剂盒包含病毒结合分子，还可以包含诊断使用说明。试剂盒还可以含有至少一种额外的试剂，如标记物或额外的诊断剂。
一些实施方案中，前述病毒为β属冠状病毒，例如，冠状病毒(SARS-CoV)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。一些实施方案中，所述SARS-CoV-2为野生型、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株或Omicron突变株。一些实施方案中，所述SARS-CoV-2的亚系为A、B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.2、B.1.1.529(BA.1)、BA.4、BA.5。
附图说明
图1A至图1C为单域抗体ELISA中和实验结果，分别阻断SARS-CoV野生型RBD蛋白、UK特征突变S1蛋白和SA特征突变S1蛋白与ACE2蛋白的结合。
图2A至图2D为单域抗体体外抑制刺突蛋白与靶细胞结合实验结果，分别阻断SARS-CoV野生型RBD蛋白、野生型S1蛋白、UK特征突变S1蛋白和SA特征突变S1蛋白与转染ACE2-EGFP的靶细胞的结合。
图3A至图3C为单域抗体假病毒中和实验结果，分别为中和SARS-CoV-2野生型、SARS-CoV-2Alpha突变株和SARS-CoV-2Beta突变株的假病毒。
图4A至图4D为多价抗体ELISA中和实验结果，分别阻断UK特征突变S1蛋白、SA特征突变S1蛋白、Delta特征突变S1蛋白、Omicron BA.1特征突变S1蛋白与ACE2蛋白的结合。
图5A至图5D为多价抗体体外细胞结合实验结果，分别为结合表达SARS-CoV野生型、SARS-CoV-2的野生型、SARS-CoV-2Beta突变株和SARS-CoV-2OmicronBA.1突变株的刺突蛋白的细胞。
图6A至图6D为多价抗体抑制ACE2与细胞表面SARS-CoV的刺突蛋白结合实验结果，分别为抑制ACE2与细胞表面的SARS-CoV野生型、SARS-CoV-2的野生型、SARS-CoV-2Beta突变株和SARS-CoV-2Omicron BA.1突变株的刺突蛋白的结合。
图7A为多价抗体抑制ACE2与细胞表面SARS-CoV-2Omicron BA.1的刺突蛋白结合实验结果；图7B为多价抗体抑制ACE2与细胞表面SARS-CoV-2OmicronBA.2的刺突蛋白结合实验结果。
图8A至图8D为多价抗体假病毒中和实验结果，分别为中和SARS-CoV-2的野生型、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Delta突变株和SARS-CoV-2Omicron BA.1突变株的假病毒。
图9A至图9C为多价抗体活病毒中和实验结果，分别为中和SARS-CoV-2的野生型、SARS-CoV-2Delta突变株和SARS-CoV-2Omicron BA.1突变株的活病毒。
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“抗体”或“免疫球蛋白”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗原结合片段”包括但不限于：Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如VH/VL或VHH)、scFv、二价或三价或四价抗体、Bis-scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一种的表位结合片段(参见例如Holliger andHudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug DesignReviews-Online 2(3),209-217)。
多肽或蛋白的“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
“免疫球蛋白结构域”是指抗体链的球形区域。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的折叠特征。
“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”、“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”组成的免疫球蛋白结构域。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予其对抗原的特异性。
“抗体框架(FR)”，是指可变结构域的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。
“免疫球蛋白单一可变结构域”通常用于指可以在不与其他可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规四链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。“免疫球蛋白单一可变结构域”的实例包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，例如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的免疫球蛋白单一可变结构域通常是优选的。免疫球蛋白单一可变结构域的一个具体实例为如下文定义的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段、VHH抗体、纳米抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of lightchains”；Nature363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规四肽链结构抗体中的重链可变结构域(其在本公开中称为“VH结构域”)以及轻链可变结构域(其在本公开中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规四肽链结构抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”、以及““结构域””(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。“VHH结构域”包括但不限于经骆驼科动物产生的天然抗体，也可以是骆驼科动物产生的抗体后再经人源化的，也可以是经噬菌体体展示技术筛选获得的。
例如Riechmann及Muyldermans，J.Immunol.Methods 231，25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH结构域所应用的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”，US PublicHealthServices，NIH Bethesda，MD，公开案第91号)。根据该编号法，
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而应当注意，如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
对于“CDR”的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域(参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28:214-8)。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。(参见例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196:901-17；Chothia等人，1989，Nature，342:877-83)。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford MolecuLar Group生产的计算机程序集成套件(参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86:9268-9272；“AbMTM，A Computer Program forModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford MolecuLar，Ltd)。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构(参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3:194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchicalApproach”描述的那些)。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析(参见例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5:732-45)。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283:1156-1166)。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本文使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文使用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。对于包含超过一个CDR的任何给定实施例，可根据Kabat、Chothia、AbM、IMGT、接触和/或构象定义中的任一个来定义CDR。在未特殊指明的情况下，本公开的抗体通常使用Kabat编号系统。Kabat中的EU编号一般也用于恒定结构域和/或Fc结构域。
VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本公开所述的目的。
VHH结构域(单独或作为较大多肽的一部分)提供许多优于使用常规VH及VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势:
-仅需要单一结构域以高亲合力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scFv一般需要使用经特别设计的接头)；
-VHH结构域可由单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域可容易地改造成多价及多特异性格式；
-VHH结构域高度可溶且无聚集趋势；
-VHH结构域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；
-VHH结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；
-VHH结构域与常规四肽链结构抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，因此相比于常规四肽链结构抗体及其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；
-VHH结构域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规VH结构域相比其延长的CDR3环)，从而可到达常规四肽链结构抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中:R.van derLinden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，JBiol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal ofBiotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
“人源化”的例子包括可将源自骆驼科的VHH结构域通过以人常规四肽链结构抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而“人源化”(本公开中亦称为“序列优化”或“序列改造”，除人源化外，“序列优化”或“序列改造”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一些具体实施方案中，可含IGHV3的人框架区序列。人源化方法例如蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)及抗体人源化通用框架移植法(CDR grafting to auniversal framework)，即将CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲合力成熟后的人源化抗体。此外，为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
“亲合力成熟”的病毒结合分子，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对抗原的亲合力相比于其亲本抗体有所增加。亲合力成熟的抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备:Marks等人，1992，Biotechnology 10:779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91:3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169:147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155:1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及REHawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，OxfordUniversity Press 1996。
“结合亲合力”在本文中用作两个分子(例如抗体或其部分与抗原)之间的非共价相互作用的强度量度，用于描述单价相互作用(固有活性)。两个分子之间的结合亲合力可通过确定解离常数(KD)来量化。可通过使用例如表面等离子共振(SPR)方法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来确定KD。对应于单价复合物的结合和解离的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过方程KD＝kd/ka与ka和kd有关。解离常数的值可通过众所周知的方法直接确定(参见Caceci等人，1984，Byte 9:340-362；Wong&Lohman，1993，PNAS 90:5428-5432)。评估抗体针对靶抗原的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如SPR测定、ELISA、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)和流式细胞术分析等。类似地，相互作用的特异性可通过确定和比较目的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与非目的相互作用(例如已知不结合的对照抗体)的KD值进行评价。通常，本公开的病毒结合分子将以如于Biacore或KinExA或Fortibio测定中测量的优选10-7至10-10摩尔/升(M)、更优选10-8至10-10摩尔/升、甚至更优选10-9至10-10或更低的解离常数(KD)结合所要结合的抗原(即SARS-CoV或SARS-CoV-2)。任何大于10-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本公开实施例4中的亲和力测定方法。
“抗原”指用于免疫接种免疫活性的脊椎动物的分子，以产生识别抗原的抗体，或筛选表达文库(例如尤其是噬菌体、酵母或核糖体展示文库)。在本文中，抗原被更广义地定义，并且一般预期包括由抗体特异性识别的靶分子，因此包括用于产生抗体的免疫接种过程或用于选择抗体的文库筛选中使用的分子的一部分或模拟物。
“表位”或可互换使用的“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位(例如Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecuLar Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)，US4708871)。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体(高通量筛选方法如参见WO03/48731)。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本公开的抗体分子竞争结合COVID-19上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。
“保守修饰”或“保守取代”适用于氨基酸和核苷酸序列。对于特定的核苷酸序列，保守修饰或保守取代是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸的相互置换，或在核苷酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的核苷酸序列。对于氨基酸序列，保守修饰或保守取代是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换多肽中的氨基酸，使得可频繁进行改变且对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)MolecμLarBiology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。
上述保守氨基酸替换在本领域中是公知的，例如保守氨基酸替换优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代:
(i)较小脂族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；
(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺:Asp、Asn、Glu及Gln；
(iii)极性带正电残基:His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基:Met、Leu、Ile、Val及Cys；及
(v)芳族残基:Phe、Tyr及Trp。
特别优选地保守氨基酸取代如下:Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
“氨基酸突变”包括氨基酸取代、缺失、插入、修饰及其任意组合，以实现最终构建体，使得最终构建体拥有期望的特性，例如增强的稳定性、提高的活性。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如对冠状病毒的结合特性，可以将非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变，包括定点诱变、PCR、基因合成、化学修饰等方法。氨基酸突变可以发生在抗体的CDR区、FR区或Fc区。
“回复突变”是指将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基，通常是为了避人源化抗体引起的免疫原性下降的同时，引起的活性下降，对所述的人源化抗体可变区可进行最少反向突变，以保持抗体的活性。
对于Fc区的氨基酸突变，可以在本公开的抗体野生型的Fc序列上引入突变用于改变Fc介导的相关活性，所述突变包括但不限于:a).改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变FcRn介导的体内半衰期的突变(参见Leonard GPresta，Current Opinion in Immunology 2008，20:460-470；Esohe E.Idusogie et al.，J Immunol 2000，164:4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4:443-446；PauL R.Hinton et al.，J Immunol，2006，176:346-356)。具体地，包括:对CH1的铰链区进行修饰以使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量发生改变，例如增加或减少(参见US5,677,425，此处全文引入)。引入使得与FcγRIIIa的结合增强的突变(以引起增强的ADCC)，使得与FcγRIIb的结合减弱的突变，例如236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、299T以及297N(参见US11/124,620、US6,737,056，此处全文引入)。进行Fc修饰以增加其生物半衰期，例如可以引入以下突变中的一种或多种:T252L、T254S、T256F(参见US6,277,375)；为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的挽救受体结合表位(参见US5,869,046、US6,121,022)；用于增加血清半衰期的额外突变，包括428L、434A、434S和428L/434S(参见US8,883,973号、US6,737,056、US7,371,826，此处全文引入)。通过将至少一个氨基酸残基替换来改变Fc区，从而改变抗体的效应子功能，例如可以将一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸替换，以使得抗体对效应配体的亲合力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲合力改变了的效应配体可以是例如补体的Fc受体或C1组分(参见US5,624,821、US5,648,260，此处全文引入)。改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力(参见WO 94/29351，此处全文引入)。通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲合力:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439(参见WO00/42072，全文引入)。此外，人类IgG1上关于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经映射并且具有改良结合的变异体已有描述(参见Shields，R.L.等人(2001)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变显示可改良与FcyRIII的结合。另外，以下组合突变体显示可改良FcγRIII结合:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S等突变改良了与FcRn的结合并且增加了抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)《自然综述免疫学(Nature Rev Immunol)》10:301-316)。
本公开的“病毒结合分子”可以例如缀和的方式包含一个或多个效应分子。所述“效应分子”包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱分析检测的化合物。在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本公开需要进一步限定的解释。
“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸链，包括DNA和RNA，可以是单链或双链的，优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“宿主细胞”包括各个细胞或细胞培养物，其可为或已是用于掺入多核苷酸插入片段的载体的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、偶然或有意的突变，子代可不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补体中)。宿主细胞包括用本公开的多核苷酸在体内转染和/或转化的细胞。“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
“治疗”意指给予受试者治疗剂(例如本公开的任一种病毒结合分子或其药物组合物)，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种病毒介导的疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。
“任选地”或“可选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
本公开所用的“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.抗原及检测蛋白的制备
SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD蛋白(UniProtKB-P0DTC2)和hACE2-Fc(UniProtKB-Q9BYF1，SARS冠状病毒受体)作为本公开涉及的抗原及检测用蛋白，均通过常规方法制备获得，序列如下。
>SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His的氨基酸序列:
(注释:双横线部分为信号肽(Signal peptide)；斜体部分为GS linker；曲线为his tag，虚线为Avi tag，单横线为SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD)
SEQ ID NO：1
同时使用商品化试剂盒(货号:21955，Thermo)制备生物素偶联的SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His-biotin蛋白用于噬菌体库筛选，具体操作步骤按照试剂盒的使用说明书进行。
>SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-camel Fc的氨基酸序列:
(注释:双横线部分为信号肽(Signal peptide)；单横线为SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD；虚线为Camel-Fc)
SEQ ID NO:2
>hACE2(1-740)-Fc的氨基酸序列:
(注释:双横线部分为信号肽(Signal peptide)；单横线为hACE2(1-740)；曲线为hIgG1 Fc)
SEQ ID NO:3
本公开其他涉及到的检测用S变体蛋白均购自于义翘神州，见表1。
表1.SARS-CoV-2(2019-nCoV)S变体
实施例2.特异性结合SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD的单域抗体(VHH)的筛选
使用SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-camel Fc蛋白免疫健康双峰骆驼。取免疫前的骆驼血清5mL并分离血清。将弗氏完全或不完全佐剂与抗原按体积1:1混合后，对骆驼进行皮下多点免疫(免疫剂量为100μg蛋白/只/每次)。每两周进行一次加强免疫，免疫四次后进行效价测定。用1μg/mL SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-camel Fc蛋白包被平板(Costar,9018),100μL/孔，4℃放置过夜。第二天使用PBST(0.05％Tween20)洗涤三次，300μL/孔，洗涤后加入含4％脱脂奶粉的PBS溶液进行封闭，37℃孵育2h。PBST洗涤三次后加入梯度稀释的免疫骆驼血清，37℃孵育1h。阴性对照免疫前血清和空白PBS溶液。孵育后用PBST洗涤三遍，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗羊驼Fc的多抗(Thermo,A16060)1:5000稀释，37℃孵育1小时。再次洗涤后加入TMB显色液进行显色，用1M硫酸进行终止，使用SpectraMaxM5酶标仪在OD450nm波长读取吸收值。第四次免疫后1:656100倍稀释后检测到效价。第五次免疫后，1:1771470倍稀释后检测到效价，效价合格，采集骆驼外周血。分离外周血淋巴细胞(PBMC)，抽取RNA，逆转录得到cDNA，构建噬菌体文库。
通过噬菌体库的筛选来获得与SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His抗原蛋白具有高亲和力的单域抗体，用10μg的SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His-biotin蛋白结合1mg Dynabeads MyOne Streptavidin T1(Invitrogen,11206D)，37℃放置1小时后用2％脱脂奶室温封闭2小时，加入骆驼单域抗体噬菌展示文库，在室温下作用1小时。用PBST(0.05％Tween-20)溶液洗10遍，去除不结合的噬菌体。用1mg/mL的Trypsin将与SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His-biotin特异性结合的噬菌体洗脱下来，并侵染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。相同筛选过程重复2-3轮后，阳性的克隆被富集。
从筛选富集的阳性克隆中挑取96个单克隆菌落包装成噬菌体单链抗体，用于噬菌体ELISA测试。ELISA板上分别包被1μg/mL的SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD-Avi-His-biotin蛋白，加入4％BSA封闭液稀释的噬菌体上清，用抗M13 HRP抗体进行检测。将ELISA结合测试到中OD450值大于2的克隆进行测序，得到64个特异性VHH序列。
实施例3.单域抗体的构建
将实施例2通过噬菌体库筛选得到64个特异性VHH序列构建完整抗体，之后通过ELISA结合实验，SPR蛋白质互作实验和细胞抑制实验，确定其中6个抗体结合力强并能抑制SARS-CoV-2(2019-nCoV)RBD活性。其完整的VHH序列如下:
>0020
EVQLVESGGGSVQVGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKGREGVAAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISHNNRTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)
>0029
DVQLVESGGGSVQAGGSLKLSCSPSGYTYSLSSLMGWFRQAPGKEREEVARVNAYGFVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAMYYCAAGYRDTFNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)
>0035
HVQLVESGGGSVQAGETLRLSCAASGFAFDGTDMAWYRQAPGNECEMVSRISSDGNTYYKDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYFCGVANYGYSMYDECWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:6)
>0039
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSSGYVGWFRQAPGKEREGVATIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAMYYCAATAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:7)
>0041
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVAGIYFGASGSTDYADSVKGRFTVSHDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)
>0049
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVAIIDSNGSANYPDSMKGRFTISKDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)
以上序列SEQ ID NO:4-9中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，下划线分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。本公开的抗体编号规则均为Kabat。将CDR序列总结如表2。
表2.单域抗体的CDR序列
将VHH序列融合hIgG1-Fc(CH2-CH3)段序列，并构建到pTT5表达载体中，所连接的IgG1的序列可以如下所示：
>hIgG1 Fc
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:28)
本公开VHH与hIgG1 Fc融合后的序列示例如下:
>0020-IgG1 Fc
EVQLVESGGGSVQVGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKGREGVAAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISHNNRTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTQVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:29)
以同样的方法，将0029、0035、0039、0041、0049与hIgG1 Fc融合，制备获得0029-IgG1 Fc、0035-IgG1 Fc、0039-IgG1 Fc、0041-IgG1 Fc、0049-IgG1 Fc。
实施例4.单域抗体对SARS-CoV-2RBD的结合能力检测
用Protein A生物传感芯片(29127556,GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的SARS-CoV-2RBD(内部制备)，利用Biacore仪器(BiacoreT200,GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(BR-1003-54,GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(BR-1006-69,GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，部分抗体测试结果见表3。
表3.部分单域抗体对SARS-CoV-2 RBD的亲和力测定
抗体名称 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
0001 SARS-CoV-2 RBD 1.04E+05 2.68E-03 2.59E-08
0002 SARS-CoV-2 RBD 6.16E+05 7.46E-03 1.21E-08
0007 SARS-CoV-2 RBD 4.40E+04 5.15E-03 1.17E-07
0008 SARS-CoV-2 RBD 4.67E+03 2.27E-03 4.86E-07
0020 SARS-CoV-2 RBD 3.59E+05 2.48E-04 6.90E-10
0029 SARS-CoV-2 RBD 2.49E+05 5.88E-05 2.37E-10
0035 SARS-CoV-2 RBD 8.58E+05 2.62E-04 3.05E-10
0039 SARS-CoV-2 RBD 4.80E+05 3.00E-04 6.25E-10
0041 SARS-CoV-2 RBD 1.29E+06 1.98E-04 1.53E-10
0049 SARS-CoV-2 RBD 9.83E+04 1.02E-05 1.04E-10
0051 SARS-CoV-2 RBD 3.94E+05 1.12E-03 2.84E-09
实施例5.单域抗体ELISA中和实验
本实验中所用到的四种SARS-CoV-2S1变体蛋白及RBD蛋白见实施例1。
ELISA中和实验方案:96孔ELISA板(Corning,9018)包被hACE2-Fc蛋白(SEQ IDNO:3)，浓度1ug/mL,100uL/孔，4度过夜孵育；洗板，4％ BSA溶液封闭，37度1h；洗板，配制spike S1(或RBD)蛋白与抗体的反应液，具体如下:S1蛋白用PBS稀释到2.64ug/mL浓度(或RBD蛋白用PBS稀释到1ug/mL浓度)，抗体配制2倍稀释浓度梯度溶液(30,15,7.5,3.75,1.875,0.94,0.47,0.234ug/mL)。取等体积S1蛋白溶液与抗体溶液混合室温孵育30min结合后加入封闭过的96孔板，100uL/孔，室温孵育30min；洗板，二抗(streptavidin-HRP(Abcam,ab7403)和Anti-His tag Antibody HRP(SinoBiological,105327-MM02T-H))室温孵育1h，洗板，TMB显色(100uL),1M H2SO4(50uL)终止。中和实验结果见表4，图1A至图1C。
结果表明，所有测试分子均可阻断SARS-CoV野生型RBD蛋白与ACE2蛋白的结合，功能显著强于ACE2-hIgG1 Fc蛋白；0020-hIgG1 Fc、0041-hIgG1 Fc和0049-hIgG1 Fc可以阻断UK及SA特征突变S1蛋白与ACE2蛋白的结合，0029-hIgG1 Fc可以阻断UK特征突变S1蛋白与ACE2蛋白的结合，0035-hIgG1 Fc和0039-hIgG1 Fc可以阻断SA特征突变S1蛋白与ACE2蛋白的结合。
表4.ELISA中和实验结果
NA代表未获得合适的IC50值。
实施例6.单域抗体体外抑制刺突蛋白与靶细胞结合实验
收集处于对数生长期的HEK293细胞系，按照293fectinTM转染试剂(Gibco，1234019)的方法，转染ACE2-EGFP真核表达质粒(SinoBiological,HG10108-ACG)。转染48小时后，收集细胞并用PBS漂洗。在96孔板中加入梯度稀释的抗体，0.1ug/mL RBD-avi-Biotin或0.26ug/mL表1所示的S1蛋白，以及每孔5×105细胞，充分混匀后冰上孵育1小时。冰上孵育1小时后再用PBS漂洗，每孔加入100uL荧光标记的链霉亲和素(Biolegend,405207)或小鼠抗his抗体(Biolegend,362605)，冰上避光孵育1小时。孵育完成后用PBS漂洗，每孔加入100uL PBS重悬，在BD C6 Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Flowjo和GraphpadPrism9软件对RBD-avi-Biotin结合的阳性细胞百分比进行分析，并与抗体处理浓度做曲线拟合并作图，以定量分析抗体与相应突变株的刺突蛋白的结合。阻断实验结果如表5和图2A至图2D所示。
结果表明，所有测试分子均可阻断SARS-CoV-2野生型RBD或S1与细胞表面的ACE2的结合，功能显著强于ACE2-hIgG1 Fc蛋白；0020-hIgG1 Fc和0049-hIgG1Fc可以阻断UK及SA特征突变S1蛋白与细胞表面的ACE2的结合，0029-hIgG1 Fc和0041-hIgG1 Fc可以阻断UK特征突变S1蛋白与细胞表面的ACE2的结合，0035-hIgG1 Fc和0039-hIgG1 Fc可以阻断SA特征突变S1蛋白与细胞表面的ACE2的结合。
表5.细胞阻断实验结果
实施例7.单域抗体假病毒中和实验
收集处于对数生长期的HEK293T-ACE2稳转细胞系(GeneWiz，PSEUV03)，按照每孔1×104细胞接种到96孔板，分别加入表6所示的假病毒和梯度稀释后的抗体，置于37℃5％CO2培养。48小时后，移除部分上清并加入Steady-试剂(Promega，E2520)，充分混匀裂解细胞，静置5分钟后，通过Tecan Spark多功能酶标仪读取化学发光水平。使用GraphpadPrism9软件，对假病毒感染的百分比进行分析，并与抗体处理浓度做曲线拟合并作图，以定量分析抗体中和相应假病毒侵染的能力。假病毒中和实验结果如表7和图3A至3C所示。
表6.假病毒中和实验测试毒株信息
结果表明，0020-hIgG1 Fc、0039-hIgG1 Fc、0041-hIgG1 Fc和0049-hIgG1 Fc，均可以完全中和SARS-CoV-2野生型、及包含UK和SA特征突变株的假病毒侵染靶细胞，IC50在pM水平。
表7.假病毒中和实验结果
实施例8.单域抗体的人源化改造与糖基化位点改造
通过对选定的特异性单域抗体分子进行三维结构同源建模，结合与V-base人种系序列数据库，IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库进行比对的结果，挑选与筛选出来的抗体同源性高的重链可变区种系基因IGHV3-23或IGHV3-66作为模板，将骆驼来源单域抗体的CDR移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。对移植后的单域抗体再次进行三维结构模拟并分析，将FR区中影响CDR区结构形态的特定位点进行回复突变。热点回复突变位点如表8所示。
表8.单域抗体人源化热点回复突变位点
其中，单域抗体0049系列分子在CDR2中有糖基化位点，为提高蛋白分子的均一性与可开发性，在其人源化序列的CDR2区进行了一系列单点突变改造或优化以获得单域抗体部分无糖基化且维持活性的分子。
人源化与糖基化位点优化具体序列示例如下，CDR区用下划线表示。
0020人源化后序列为：
>0020-Hu1
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKEREGVSAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
>0020-Hu7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKEREGVSAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31)
>0020-Hu8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKEREGVSAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISHNNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)
>0020-Hu9
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKGREGVSAIYTDYSRTFYADSVEGRFTISHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
>0020-Hu10
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKEREGVSAIYTDYSRTFYGDSVEGRFTISHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
>0020-Hu11
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASDNSAYSMGWFRQAPGKEREGVSAIYTDYSRTFYGDSVEGRFTISHNNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARWGSSWAPLLPNEYTFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
0020在人源化过程中获得了新结构CDR2：
AIYTDYSRTFYGDSVEG(SEQ ID NO:36)
即，0020具有如下的CDR结构：
CDR1：AYSMG(SEQ ID NO:10)
CDR2：AIYTDYSRTFYX1DSVEG，其中，X1为A或G(SEQ ID NO:37)
CDR3：RWGSSWAPLLPNEYTF(SEQ ID NO:12)。
0039人源化后序列为：
>0039-Hu1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)
>0039-Hu2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)
>0039-Hu4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)
>0039-Hu5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGATAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)
>0039-Hu6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGTAATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:42)
>0039-Hu7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSGYVGWFRQAPGKEREGVSTIYTRTGNTAYGDSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATGATWIHNWLGAGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:43)
0039在人源化过程中获得了新结构CDR3：
TGATWIHNWLGAGNFDY(SEQ ID NO:44)
即，0039具有如下的CDR结构：
CDR1：SGYVG(SEQ ID NO:19)
CDR2：TIYTRTGNTAYGDSVKG(SEQ ID NO:20)
CDR3：TX2ATWIHNWLGAGNFDY，其中，X2为A或G(SEQ ID NO:45)。
0041人源化后序列为：
>0041-Hu1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)
>0041-Hu2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTISHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:47)
>0041-Hu3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTVSHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:48)
>0041-Hu4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTVSHDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)
>0041-Hu5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTVSHDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)
>0041-Hu6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGNCMGWFRQAPGKEREGVSGIYFGASGSTDYADSVKGRFTISHDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAEGGPDPTIATMCPGGNPTGFGYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)
0049人源化后序列为：
>0049-Hu1
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSNGSANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)
>0049-Hu2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSNGSANYPDSMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)
>0049-Hu4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSNGSANYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)
>0049-Hu5
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMGWFRQAPGKEREAVSIIDSNGSANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)
0049人源化序列进一步糖基化优化后序列为：
>0049-Hu1-N54Q
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSQGSANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)
>0049-Hu1-N54G
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSGGSANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:57)
>0049-Hu1-N54D
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSDGSANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)
>0049-Hu1-S56A
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSNGAANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:59)
>0049-Hu1-S56G
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSNGGANYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)
>0049-Hu2-N54G
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNTAIRYSMAWFRQAPGKEREAVSIIDSGGSANYPDSMKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADTLWGRLWRGSAPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)
0049在人源化和糖基化过程中获得了新结构CDR1和CDR2：
CDR1：RYSMG(SEQ ID NO:62)
CDR2：IIDSNGSANYADSMKG(SEQ ID NO:63)
IIDSQGSANYPDSMKG(SEQ ID NO:64)
IIDSGGSANYPDSMKG(SEQ ID NO:65)
IIDSDGSANYPDSMKG(SEQ ID NO:66)
IIDSNGAANYPDSMKG(SEQ ID NO:67)
IIDSNGGANYPDSMKG(SEQ ID NO:68)
即，0049具有如下的CDR结构：
CDR1：RYSMX3，其中，X3为G或A(SEQ ID NO:69)
CDR2：IIDSX4GX5ANYX6DSMKG，其中，X4为N、Q、G或D，X5为S、A或G，X6为A或P(SEQ IDNO:70)
CDR3：DTLWGRLWRGSAPY(SEQ ID NO:27)。
实施例9.人源化及糖基化位点优化后单域抗体对SARS-CoV-2RBD的结合能力检测
参考实施例4中的测试方法，对改造后的单域抗体对RBD的亲和力进行检测。部分抗体亲和力测试结果见表9。
表9.优化后单域抗体对SARS-CoV-2RBD的亲和力测定
抗体名称 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
0020 SARS-CoV-2 RBD 3.13E+05 5.13E-04 1.64E-09
0020-Hu1 SARS-CoV-2 RBD 4.35E+05 3.21E-03 7.38E-09
0020_Hu7 SARS-CoV-2 RBD 3.97E+05 1.35E-03 3.39E-09
0020_Hu8 SARS-CoV-2 RBD 4.20E+05 1.46E-03 3.47E-09
0020_Hu9 SARS-CoV-2 RBD 3.42E+05 1.43E-03 4.19E-09
0020_Hu10 SARS-CoV-2 RBD 3.52E+05 1.27E-03 3.61E-09
0020_Hu11 SARS-CoV-2 RBD 3.94E+05 1.34E-03 3.40E-09
0039 SARS-CoV-2 RBD 6.48E+05 4.48E-04 6.91E-10
0039-Hu1 SARS-CoV-2 RBD 8.00E+05 6.82E-04 8.52E-10
0039-Hu2 SARS-CoV-2 RBD 8.01E+05 7.02E-04 8.75E-10
0039-Hu4 SARS-CoV-2 RBD 9.40E+05 6.75E-04 7.18E-10
0039_Hu5 SARS-CoV-2 RBD 6.55E+05 6.79E-04 1.04E-09
0039_Hu6 SARS-CoV-2 RBD 6.52E+05 4.88E-04 7.48E-10
0039_Hu7 SARS-CoV-2 RBD 5.70E+05 7.67E-04 1.35E-09
0041 SARS-CoV-2 RBD 1.36E+06 2.38E-04 1.74E-10
0041-Hu1 SARS-CoV-2 RBD 9.58E+05 3.11E-04 3.24E-10
0041-Hu2 SARS-CoV-2 RBD 1.31E+06 2.40E-04 1.83E-10
0041-Hu3 SARS-CoV-2 RBD 1.29E+06 1.94E-04 1.51E-10
0041-Hu4 SARS-CoV-2 RBD 1.27E+06 1.18E-04 9.00E-11
0041-Hu5 SARS-CoV-2 RBD 1.26E+06 1.45E-04 1.15E-10
0041-Hu6 SARS-CoV-2 RBD 1.16E+06 3.96E-03 3.43E-09
0049 SARS-CoV-2 RBD 2.30E+05 4.19E-05 1.82E-10
0049-Hu1 SARS-CoV-2 RBD 2.06E+05 7.35E-05 3.57E-10
0049-Hu2 SARS-CoV-2 RBD 2.27E+05 3.74E-05 1.65E-10
0049-Hu4 SARS-CoV-2 RBD 2.90E+05 5.94E-04 2.05E-09
0049_Hu5 SARS-CoV-2 RBD 1.88E+05 1.94E-04 1.03E-09
0049-Hu1-N54Q SARS-CoV-2 RBD 1.70E+05 7.83E-05 4.61E-10
0049-Hu1-N54G SARS-CoV-2 RBD 1.93E+05 5.22E-05 2.71E-10
0049-Hu1-N54D SARS-CoV-2 RBD 2.58E+05 1.53E-04 5.93E-10
0049-Hu1-S56A SARS-CoV-2 RBD 1.56E+05 5.15E-04 3.30E-09
0049-Hu1-S56G SARS-CoV-2 RBD 2.60E+05 1.63E-03 6.27E-09
0049-Hu2-N54G SARS-CoV-2 RBD 6.85E+04 4.02E-05 5.87E-10
实施例10.抗体与SARS-CoV-2 RBD表位竞争研究
本实施例对四个单域抗体0020-Hu10，0039-Hu6，0041-Hu2，0049-Hu2-N54G与SARS-CoV-2RBD表位的竞争结合关系进行研究，阴性对照为HBS-EP，阳性对照为AZ-2130(AstraZeneca plc，WO2022034044)，AZ-2196(AstraZeneca plc，WO2022034044)，S309(VirBiotechnology,Inc.，US2021371504)，S2K146(PDB 7TAS，EMD-25783)和Bebtelovimab(PDB7MMO)。通过Biacore T200(GE Healthcare)仪器测定每一个抗体与SARS-CoV-2RBD的表位竞争。使用芯片Series S sensor chip CM5(GE Healthacare,Br100530)偶联抗组氨酸标签抗体，所用试剂盒为His捕获试剂盒(GE Healthcare,28-9950-56)。将抗原蛋白SARS-CoV-2RBD捕获至芯片表面，然后于芯片表面依次流过相同摩尔浓度(200nM)的抗体。利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得表位竞争曲线。实验使用溶液为HBS-EP溶液。每个实验循环结束时，将芯片再生。抗体的表位竞争测定结果见表10。
表10.抗体与SARS-CoV-2RBD的表位竞争的测定
(注:“√”表示完全竞争；“×”表示完全不竞争)
结果显示，0020-Hu10与0039-Hu6部分竞争，与Bebtelovimab完全竞争；0039-Hu6与0041-Hu2部分竞争，与0020-Hu10有竞争，与S2K146部分竞争；0041-Hu2与0039-Hu6部分竞争，与0049-Hu2-N54G、AZ-2196、S2K146有竞争；0049-Hu2-N54G与0041-Hu2、AZ-2196、S2K146有竞争。
结合表位竞争研究结果，结合文献(Piccoli et al.,2020,Cell 183,1024–1042；bioRxiv.2022Mar 24；2021.04.30.442182)进行表位分析如下:0041-Hu2和0049-Hu2-N54G，与AZ-2196、S2K146的表位相近，为I或II类；0020-Hu10的表位与Bebtelovimab相近，为IV类；0039-Hu6的表位在I和IV中间，相应表位的氨基酸在不同毒株中较为保守。4个具有广谱中和作用的单域抗体覆盖了RBD结合大部分表位，同时相互竞争较少，因此分子间具备较好的协同作用，协同或串联使用时可以极大程度上避免病毒逃逸引起的抗体失效。
本实施例中的阳性抗体序列如下:
>AZ-2130抗体重链序列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRDVWMSWVRQAPGKGLEWVGRIK
SKIDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLTEDTAVYYCTTAGSYYYDTVGPGLPEGKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:78)
>AZ-2130抗体轻链序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLMYWASTRESGVPDRFSGSGSGAEFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSTLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:79)
>AZ-2196抗体重链序列:
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFMSSAVQWVRQARGQRLEWIGWIVIGSGNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAPYCSSISCNDGFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:80)
>AZ-2196抗体轻链序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSRGWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:81)
>S309抗体重链序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:82)
>S309抗体轻链序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSTSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHDTSLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:83)
>S2K146抗体重链序列
QVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFHDHTMHWVRQAPGKGLEWVSLITWNGGTIHYSDSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDLGRGGWYLPSDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:84)
>S2K146抗体轻链序列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSANIGSNTVNWYQHLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLKGVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:85)
>Bebtelovimab抗体重链序列
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWLRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKMTNIDPVDTATYYCAHHSISTIFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:86)
>Bebtelovimab抗体轻链序列
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTATSSDVGDYNYVSWYQQHPGKAPKLMIFEVSDRPSGISNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSSAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO:87)
实施例11.多价串联单域抗体构建和制备
从以上候选分子中选择0020-Hu10(SEQ ID NO:34)，0039-Hu6(SEQ ID NO:42)，0041-Hu2(SEQ ID NO:47)，0049-Hu2-N54G(SEQ ID NO:61)进行组合构建，获得系列多价串联单域抗体分子，序列如下:
>0025-0016(39-49-YTE Fc)
(注释:双横线部分为不同的单域抗体序列；虚线为人IgG1-Fc(YTE突变)段序列，单横线为G4Slinker。下同。)
>0025-0017(41-20-YTE Fc)
>0025-0018(39-49-41-YTE Fc)
>0025-0019(39-49-20-YTE Fc)
>0025-0020(39-41-20-YTE Fc)
>0025-0021(41-20-49-YTE Fc)
>0025-0022(39-49-41-20-YTE Fc)
将以上本公开的抗体使用哺乳动物细胞体系表达，按照1μg DNA/mL转染细胞的量比使用ExpiCHO Expression System(货号:A29133)进行转染。操作按照试剂说明书进行，采用high titre方法，放置于32℃摇床震荡培养(5％ CO2)，第10～12天收取细胞培养液，4000rpm离心，取上清并使用0.45μM的滤膜过滤。
用MabSelectSure LX柱(GE Healthcare 17547402)进行第一步亲和纯化。将培养液上清流过PBS平衡的MabSelectSure LX柱，经PBS洗涤后，用pH 3.0的0.1MGlycine酸性洗脱液洗脱目的蛋白后用1M Tris-HCl pH 8.0中和，最后用HiTrap Q HP离子柱精细纯化。经检测，获得了目的抗体。
实施例12.多价抗体对SARS-CoV-2Spike S1的结合能力检测
用Protein A生物传感芯片(29127556,GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的SARS-CoV-2Spike S1或trimer，利用Biacore仪器(Biacore T200,GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(BR-1003-54,GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(BR-1006-69,GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)模型进行拟合，得出亲和力数值，部分抗体测试结果见下表11。
表11.多价抗体的亲和力测定
结果说明，以上示例的本公开的抗体均能以高亲合力结合SARS-CoV-2野生型Spike S1或带有Omicron特征突变的Spike三聚体蛋白。
实施例13.多价抗体ELISA中和实验
参考实施例5的方法，使用实施例1中的SARS-CoV-2S1变体蛋白，测试抗体在分子水平阻断S1蛋白与ACE2相互作用的功能。在每个测试中，抗体的质量浓度梯度相同，拟合分析后计算阻断功能IC50的摩尔浓度。ELISA中和实验结果见表12，图4A至图4D。
表12.ELISA中和实验结果
中和实验结果显示，针对UK，SA，Delta三种新冠S1变体，本公开中的所有抗体都优于阳性抗体AZ-2130和AZ-2196及其1:1组合。针对Omicron BA.1S1变体，如表12和图4D所示，0025-0016，0025-0018，0025-0019均没有降低中和活性，0025-0020也优于两个阳性抗体及其组合。
实施例14.多价抗体体外细胞结合实验
收集处于对数生长期的HEK293细胞系，按照293fectinTM转染试剂(Gibco,1234019)的方法，转染表13中不同突变株对应的全长刺突蛋白特征序列表达质粒。转染48小时后，用PBS漂洗，按照每孔5×105细胞加入96孔板中，并加入梯度稀释的抗体或对照蛋白。冰上孵育1小时后再用PBS漂洗，每孔加入100uL荧光标记的羊抗人IgG抗体(Jackson,109-545-098)，冰上避光孵育1小时。孵育完成后用PBS漂洗，每孔加入100uL PBS重悬，在BDC6 Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Flowjo和Graphpad Prism9软件进行对抗体结合阳性细胞百分比进行分析，并与抗体处理浓度做曲线拟合并作图，以定量分析抗体与相应突变株的刺突蛋白的结合。部分抗体测试结果参见表14，图5A至图5D。每个测试中，抗体的总摩尔数相同。
表13.抗体体外细胞结合实验的病毒信息
病毒类型 突变株 亚系 基因来源
SARS-CoV WT / SinoBio VG40150-G-N
SARS-CoV-2 WT A SinoBio VG40589-UT
SARS-CoV-2 Beta B.1.351 SinoBio VG40772-UT
SARS-CoV-2 Omicron BA.1 B.1.1.529(BA.1) Genescript MC_0101274
SARS-CoV-2 Omicron BA.2 B.1.1.529(BA.2) SinoBio VG40844-UT
表14.抗体体外细胞结合能力
以上结果说明，针对SARS-CoV以及SARS-CoV-2的野生型和特征突变株，本公开中的所有抗体都可以与其表达在细胞表面的刺突蛋白结合，且结合能力都不弱于ACE2-hIgG1Fc。
实施例15.多价抗体体外细胞结合阻断试验
使用实施例14的方法进行转染并漂洗，并按照DyLight 650胺反应性染料(Thermo，62265)的方法，对ACE2-Fc蛋白进行荧光标记。在96孔板中加入梯度稀释的抗体、4nM或8nM ACE2-Fc-Dylight650以及每孔5×105细胞，充分混匀后冰上孵育1小时。孵育完成后用PBS漂洗，每孔加入100uL PBS重悬，在BD C6 Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Flowjo和Graphpad Prism9软件对抗体结合阳性细胞百分比进行分析，并与抗体处理浓度做曲线拟合并作图，以定量分析抗体与相应突变株的刺突蛋白的结合。结果如表15和图6A至6D所示，以及，表16和图7A至7B所示。每个测试中，抗体的总摩尔数相同。
表15.抗体体外抑制ACE2与细胞表面的SARS-CoV的刺突蛋白结合结果
表16.抗体体外抑制ACE2与细胞表面的SARS-CoV刺突蛋白结合结果
以上结果说明，针对SARS-CoV-2的野生型和特征突变株，本公开中的所有抗体都可以阻断ACE2与表达在细胞表面的刺突蛋白结合，针对不同突变株的功能降低都在3倍以内。同时，0025-0016、0025-0018、0025-0019、0025-0020、0025-0022还可以阻断ACE2与表达在细胞表面的SARS-CoV的刺突蛋白结合，进一步显示了多价抗体的广谱中和功能。
实施例16.多价抗体假病毒中和实验
参考实施例7中所述测试方法和假病毒，测试抗体阻断SARS-CoV-2各个特征突变株侵染靶细胞的能力，结果如表17和图8A至8D所示。以AZ-2130与AZ-2196以1:1混合作为阳性对照。每个测试中，抗体的总摩尔数相同。
表17.抗体中和假病毒感染能力结果
以上结果说明，针对SARS-CoV-2的野生型和特征突变株，本公开中的所有抗体都可以中和相应的假病毒对靶细胞的侵染，IC50均在pM水平，且针对不同突变株的功能降低在10倍以内，广谱中和能力显著优于阳性对照。
实施例17.多价抗体活病毒中和实验
收集处于对数生长期的Vero细胞，按照每孔8,000个细胞接种到96孔板中。将表18所示的病毒和梯度稀释后的抗体混合，置于37℃5％ CO2孵育1小时。移除细胞培养上清，加入病毒和抗体的混合物，持续培养6小时。移除病毒抗体混合上清，PBS漂洗一次，用4％多聚甲醛固定后，进行免疫荧光染色，并分析病毒感染的细胞百分比，通过与抗体处理浓度做曲线拟合，定量分析抗体中和相应活病毒侵染的能力。结果如表19和图9A至9C所示。以AZ-2130与AZ-2196以1:1混合作为阳性对照。每个测试中，抗体的总摩尔数相同。
表18.活病毒中和实验测试毒株信息
病毒类型 突变株 亚系 货号批次
SARS-CoV-2 WT(England/02/2020) A BEI Resources NR-52359
SARS-CoV-2 Delta B.1.617.2 NIBSC 101030
SARS-CoV-2 Omicron BA.1 B.1.1.529(BA.1) BEI Resources NR-56461
表19.抗体中和活病毒感染能力
以上结果说明，针对SARS-CoV-2的野生型和特征突变株，本公开中的所有抗体都可以中和相应的活病毒对靶细胞的侵染，IC50均在pM水平，且针对不同突变株的中和功能相近，未发现显著的功能降低，广谱中和能力显著优于阳性对照。

Claims (20)

1.冠状病毒结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含：
1)SEQ ID NO：4、30-35任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
2)SEQ ID NO：7、38-43任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
3)SEQ ID NO：9、52-61任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
4)SEQ ID NO：8、46-51任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
5)SEQ ID NO：5任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
6)SEQ ID NO：6任一所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
所述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的，优选根据Kabat编号系统定义。
2.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自如下的CDR1、CDR2和CDR3：
1)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
2)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20、45所示；
3)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：69、70、27所示；
4)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；
5)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示；
6)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17、18所示；
优选地，
1-1)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、12所示，CDR2的氨基酸序列为SEQID NO：11、36任一所示；
2-1)CDR1、CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20所示，CDR3的氨基酸序列为SEQID NO：21、44任一所示；
3-1)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQID NO：26、63-68任一所示；
3-2)CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62、27所示，CDR2的氨基酸序列为SEQID NO：26、63-68任一所示。
3.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变结构域为骆驼源或人源化的。
4.如权利要求3所述的冠状病毒结合分子，所述人源化免疫球蛋白单一可变结构域中的框架区源自人重链可变区种系基因IGHV3-23或IGHV3-66。
5.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，所述免疫球蛋白单一可变结构域的氨基酸序列包含或为如下任一项所示：
1)SEQ ID NO：4、30-35任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
2)SEQ ID NO：7、38-43任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
3)SEQ ID NO：9、52-61任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
4)SEQ ID NO：8、46-51任一或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
5)SEQ ID NO：5或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
6)SEQ ID NO：6或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，所述免疫球蛋白单一可变结构域为至少2个，其可以是相同的或不同的。
7.如权利要求6所述的冠状病毒结合分子，所述免疫球蛋白单一可变结构域为3个，
第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20、45所示，第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：22、23、24所示，第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、37、12所示；
优选的，第一免疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO：19、20、21所示；第二疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；第三疫球蛋白单一可变结构域中CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、36、12所示；
更优选的，第一免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：42或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：47或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第三免疫球蛋白单一可变结构域包含或为SEQ ID NO：34或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的冠状病毒结合分子，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域之间通过连接子相连接；
优选地，所述连接子为具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数；
更优选地，所述连接子为(G4S)4所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，所述免疫球蛋白单一可变结构域为VHH。
10.如权利要求1-9任一项所述的冠状病毒结合分子，其还包含人免疫球蛋白Fc区；
优选地，所述Fc区是人IgG1、IgG2、IgG4的Fc区；
更优选地，所述Fc区是具有M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S人IgG1的Fc区。
11.如权利要求1所述的冠状病毒结合分子，其包含选自如SEQ ID NO：71-77任一所述或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；
优选的包含如SEQ ID NO：75所述或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
12.多核苷酸，其编码权利要求1-11任一项中所述的冠状病毒结合分子。
13.载体，其包含权利要求12所述的多核苷酸；优选地，所述载体用于表达权利要求12所述的多核苷酸。
14.宿主细胞，其包含权利要求13所述的载体；优选地，所述宿主细胞用于表达或生产权利要求1-11任一项所述的冠状病毒结合分子。
15.制备权利要求1-11任一项中所述冠状病毒结合分子的方法，包括：
培养权利要求14所述的宿主细胞，回收所述病毒结合分子；
可选的，包含纯化和/或分离所述冠状病毒结合分子的步骤。
16.药物组合物，其包含：
权利要求1-11任一项中所述的冠状病毒结合分子和/或权利要求12所述的多核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
17.权利要求1-11任一项中所述的病毒结合分子、权利要求12所述的多核苷酸或权利要求16所述的药物组合物在制备预防或治疗疾病的药物中应用，
优选地，所述疾病为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒介导的相关疾病；
更优选的，所述冠状病毒为冠状病毒(SARS-CoV)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)；
最优选地，所述SARS-CoV-2为野生型、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株或Omicron突变株。
18.权利要求1-11任一项中所述的病毒结合分子、权利要求12所述的多核苷酸或权利要求16所述的药物组合物在制备中和病毒或降低病毒载量的药物中应用，
优选地，所述病毒为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒；
更优选的，所述冠状病毒为冠状病毒(SARS-CoV)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)；
最优选地，所述SARS-CoV-2为野生型、Alpha突变株、Beta突变株、Delta突变株或Omicron突变株。
19.试剂盒，其包含权利要求1-11任一项中所述的病毒结合分子或权利要求12所述的多核苷酸。
20.一种检测病毒的方法，包括使用权利要求1-11任一项中所述的病毒结合分子、权利要求12所述的多核苷酸或权利要求19所述的试剂盒。
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