CN106519031B - 一种与旁路途径相关的cfh抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与旁路途径相关的CFH抗体，所述抗体为全人源的CFH单克隆抗体TRN1005，该抗体能够特异性的结合抗原CFH。本发明提供了包含所述抗体的药物及其在增生、炎症或免疫相关的疾病或病症中的用途。

Description

一种与旁路途径相关的CFH抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫领域，涉及一种与旁路途径相关的CFH抗体，具体的涉及一种CFH全人源的单克隆抗体TRN1005。

背景技术

补体系统是抵抗微生物感染的先天免疫的重要成分，含有多种血浆和膜结合型的蛋白质。补体广泛参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学意义的效应系统和效应放大系统。

补体因子H是一种重要的补体调节物质，它决定补体C3b的命运，不论是在血管内或在细胞表面，控制C3转化酶的生成和稳定性。此外它还具有补体调控以外的功能，可以作为黏附蛋白，成为细胞整合素受体CR3(CD11b/CD18)的配体，显示趋化活性。另外，某些癌细胞通过表达补体因子H从而逃逸补体介导的细胞杀伤。

补体因子H(CFH)分子量150kD，由20个SCRs结构域(短的一致重复片段)组成，而每个SCR由大约60个氨基酸组成，形成球状结构，含有四个保守的半胱氨酸残基(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，在Ⅰ～Ⅲ和Ⅱ～Ⅳ间形成二硫键。其存在多个与配体如C3b、肝素/糖氨聚糖相互作用的结构域：CFH至少有3个与C3b结合的部位，位于SCR1-4，5-8，20；3个与肝素结合的部位，位于SCR7，5-12，20(Zipf el PF，2001,27(3):191-199)；提示了这个血浆蛋白功能的复杂性。

CFH是一个调节蛋白，它能够通过阻止补体介导的细胞裂解的旁路激活途径保护宿主避免遭受攻击和损毁。CFH可以通过几种机制阻止补体C3b沉积在细胞表面。C3b沉积能够启动细胞溶膜攻击复合体的形成来介导细胞溶解。所以，CFH阻止C3b沉积，保护细胞不被溶解。肿瘤细胞利用CFH的这种保护作用来逃避补体系统的攻击。

最近的研究表明补体旁路在几种动物疾病模型的发病机理中起着重要的作用。I/R后肾脏内的补体激活基本仅受旁路途径的介导(Thurman)，同时旁路途径在关节炎的进展中起着关键作用。尤其令人吃惊的是，已表明缺失旁路途径的小鼠在狼疮肾炎MRL/lpr模型中不会患肾炎(Watanabe)，并且不会引起抗磷脂介导的胎儿丢失(Girardi)。PCT公开的公布文本WO01/47963描述了来自外寄生水蛭的多肽，它在体外抑制补体激活的旁路途径，并且它对通过经典途径的补体激活基本没有影响。已表明这些肽结合D因子，但是，未说明这些多肽在体内应用。

随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的研制为人们提供了解决问题的新思路。已经有研究完成了人源抗CFH抗体片段Fab和scFv的表达，只是这些小分子抗体还无法完全替代自体抗体在体内综合作用，包括抗体依赖的细胞毒性作用和抗体介导的细胞裂解作用等，因此完整的全人源抗CFH抗体的生产成为了进一步研究的目标。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种与旁路途径CFH相关的全人源的单克隆抗体。

本发明的目的之二，提供一种治疗增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的药物组合物和手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种全人源小分子单克隆抗体TRN1005，所述抗体包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3氨基酸序列；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

进一步，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步，所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步，所述抗体分子选自具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段。

本发明的抗体分子可包括具有全长重链和轻链的完全抗体分子或其结合片段并且可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')²、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双特异性-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和以上任何抗体的表位结合片段。

本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上面所述的抗体的重链和/或轻链。

本发明提供了一种克隆或表达载体，所述克隆或表达载体包含一种或多种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码上述所述的抗体的重链和/或轻链。本发明的多核苷酸序列可包括例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。

本发明还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含一种或多种编码本发明所述单克隆抗体的多核苷酸序列。

本发明公开的抗体和片段从宿主细胞以良好水平表达。因此，抗体和/或结合片段的性质适合用于商业规模的表达。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上面所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

本发明提供了上面所述的单克隆抗体或药物组合物的用途，其用于制备治疗增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的药物。

本发明提供了上面所述的单克隆抗体或药物组合物的用途，其用于制备抑制增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的CFH活性的药物。在本发明中，抗体分子可以是药学或诊断组合物中的唯一活性成分。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种全新的全人源的CFH抗体，该抗体具有特异性强、亲和力、稳定性好、无免疫原性、完全人源性蛋白结构的特点。

本发明提供了一种治疗增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物满足了相关疾病的治疗和预防的需求，尤其对补体H因子引起的疾病或病症的预防和治疗具有显著的功效。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是SDS-PAGE鉴定表达纯化后的TRN1005抗体图；

图2是抗体TRN1005结合位点验证试验图；

图3是利用BiaCore检测TRN1005抗体的亲和活性图。

具体的实施方式

本发明利用单细胞RT-PCR与抗体筛选平台直接从有抗体的病人体内单个B细胞分离出来高亲和力人抗CFH抗体，并构建了该抗体的表达载体，表达了高纯度的全人源抗体蛋白。制备具CFH抗原结合活性的全人源化抗体，以满足研究需求，并为相关病症的治疗与预防大量提供这类抑制剂。

本发明中，术语“抗体”包括保持与抗原特异性结合的任何同种型的抗体或免疫球蛋白、抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scAb)、单结构域抗体(dAb)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，和包含抗体和非抗体蛋白的抗原结合(在本文中也被称为抗原结合)部分的融合蛋白。抗体可例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等可检测地标记。抗体可进一步缀合至其它部分，诸如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。抗体还可结合至固体支撑物，包括(但不限于)聚苯乙烯板或珠粒等。所述术语还涵盖Fab'、Fv、F(ab')²和或保持与抗原特异性结合的其它抗体片段，和单克隆抗体。如本文所用，单克隆抗体是由一组相同的细胞产生的抗体，其全部是由单细胞通过重复的细胞复制而产生。也就是说，细胞的克隆只产生单一抗体种类。虽然单克隆抗体可使用杂交瘤制备技术来制备，但还可以使用本领域技术人员已知的其它制备方法(例如，源自抗体噬菌体展示文库的抗体)。抗体可以是单价的或二价的。抗体可以是Ig单体，其为由以下四条多肽链组成的“Y形”分子：通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。

术语“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')²和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata et al，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；结构域抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残余的“Fc”片段，这是反映容易结晶的能力的名称。胃蛋白酶处理得到F(ab')²片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

“Fv”是含有完全的抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总的来说，六个CDR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含三个对抗原具特异性的CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力相比于整个结合位点较低。

“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含在VH与V L结构域之间的多肽连接子，其能够使sFv形成抗原结合所需的结构。

在本发明中，本领域技术人员还将理解的是，抗体可以进行各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的缺失。

本发明的抗体还包括将抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成所得到的包括人源与非人源抗体，并具有与TRN1005抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

本发明的CDR可包括变体，例如当将本文中所公开的CDR回复突变为不同的框架区时。通常，个体变体CDR与本文所述序列的氨基酸同一性为至少70％或80％，更典型地具有优选至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的渐增的同一性。

如本发明所用，“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。

在本发明中，“框架”指除去被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由CDR分隔的连续区域(FRl、FR2、FR3和FR4)。可变区框架通常是长度为约100-120个氨基酸的不连续氨基酸序列，但旨在仅参考CDR外部的那些氨基酸。如本文所用，术语“框架区”旨在是指由CDR隔开的框架的各结构域。本发明的抗体包括在单克隆抗体或其CDR移植的抗体片段上利用单点突变或多点组合突变对抗体恒定区/CDR区部分氨基酸/进行改造及优化后的抗体片段或scFv抗体。

在本发明中，全人源化的抗体具有包含人受体框架区以及本发明具体提供的一个或多个CDR的可变域。框架区不需要具有与受体抗体的框架区完全相同的序列。例如，可将不常见的残基改变成对于该受体链种类或类型更常见的残基。备选地，可改变在受体框架区中的选定残基以使得它们对应于供体抗体中相同位置处所发现的残基。

如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂(例如，抗体和抗原)的可逆结合的平衡常数并以解离常数(KD)表示。亲和力可能是抗体对于不相关氨基酸序列的亲和力的至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更多倍。抗体对目标蛋白的亲和力可能是例如约100纳摩尔浓度(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔浓度(pM)、或约100nM至约1飞摩尔浓度(fM)或更小。如本文所用，术语“亲和力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后解离的抗性。

本文中，“分离的”抗体是已经鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，抗体将被纯化(1)至重量比大于90％、大于95％或大于98％的抗体，如通过Lowry法所测定，例如，大于99％，(2)至足以获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，通过使用转杯式测序仪，或(3)至均质性，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝或银染色剂。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体的天然环境的至少一种组分。在一些情况下，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。

在本发明中，所述连接子区域的长度可为约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约5个aa至约10个aa、约10个aa至约15个aa、约15个aa至约20个aa、约20个aa至约25个aa、约25个aa至约30个aa、约30个aa至约35个aa、约35个aa至约40个aa、约40个aa至约45个aa、或约45个aa至约50个aa。

适用于本发明的抗体的连接子还包括“柔性连接子”。连接子分子通常具有足够长度以允许连接的区域之间的一些柔性移动。在一些实施方案中，连接子分子通常为约6-50个原子长。所述连接子分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。根据本公开可使用可结合多肽的其它连接子分子。

可容易地选择合适的连接子并且其可具有多种合适长度中的任一种，诸如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

在本发明中，编码本发明的抗体分子的多核苷酸序列可由本领域技术人员熟知的方法来获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的多核苷酸序列可按需要从确定的多核苷酸序列或基于对应的氨基酸序列来合成。

编码受体框架序列的DNA对于本领域技术人员是广泛可得的并且可基于其已知的氨基酸序列来容易地合成。分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。所需DNA序列可完全或部分地利用寡核苷酸合成技术合成。可适当地采用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

编码本发明的抗体的核酸分子可以可操作地连接至一种或多种调控元件，诸如启动子和增强子，其允许核苷酸序列在预期目标细胞(例如，经过遗传修饰以合成所编码抗体的细胞)中表达。

在本发明中，任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统，或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。

表达载体通常具有位于启动子序列附近以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入的方便的限制位点。可存在在表达宿主中有效的可选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体。

本发明公开的宿主细胞(例如体外细胞)，其用核酸分子遗传修饰。在一些实施方案中，分离的经遗传修饰的主题宿主细胞可产生主题抗体。这种细胞被称为重组细胞。重组细胞包含编码本发明抗体的重组分子。

合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，诸如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；和原核细胞，诸如细菌细胞。可例如通过磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知方法来实现主题核酸向宿主细胞中的引入。

合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。

在本发明中，抗体分子可仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。对于产生包含重链和轻链的产物，可使用两种载体(编码轻链多肽的第一载体以及编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。或者，可使用单一载体，载体包括编码重链和轻链多肽的序列。

本发明提供的组合物，包括包含上面所述的抗体的药物组合物，一般来说，药物组合物(在本文也称为制剂)包含有效量的抗体。“有效量”意指足以产生所需结果的剂量，所需结果例如与增生、炎症或免疫相关的疾病或病症相关的不良症状的减少、改善，减缓增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的进展等。所需结果通常至少是增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的症状相比于对照的减少。在一些实施方案中，抗体经过配制和/或修饰以使得所述抗体能够穿越血脑屏障。在一些实施方案中，以避免血脑屏障的方式递送抗体。在一些实施方案中，本公开的CFH抗体是与促进穿越血脑屏障的药剂一起配制。在一些实施方案中，所述抗体直接地或通过连接子与促进穿越血脑屏障的化合物融合。

本发明的药物可使用能够产生所需治疗作用或诊断作用的任何方便的方式将单克隆抗体施用至宿主。因此，可将药剂掺入多种制剂中以供治疗施用。更具体地，单克隆抗体可通过与适当的药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂或其它药学上可接受的赋形剂组合而配制成药物组合物，并且可配制成呈固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。在一些实施方案中，药物组合物包含抗体和药学上可接受的赋形剂。

在药物剂型中，本发明的抗体可以其药学上可接受的盐形式施用，或者它们还可以单独地或以适当缔合，以及与其它药学活性化合物组合使用。

本发明中，术语“C3b”用于指C3转化酶切割(自C3α链的氨基末端释放过敏毒素C3a片段并留下C3b)后自C3生成的天然序列C3b多肽。

术语“小分子”在本文中定义为具有低于约600，优选低于约200道尔顿的分子量。

术语“有活性的”或“活性”或“生物学活性”在本发明CFH抑制剂(如CFH抗体)的语境中指抑制(部分或完全抑制)C3b生物学活性的能力。CFH抑制剂的一种优选生物学活性是在CFH相关疾病或疾患(诸如例如HUS、MPGN相关病症)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善的能力。所述活性可在体外或在体内测试中测定，包括结合测定法，使用有关动物模型，或人体临床试验。

术语“增生、炎症或免疫相关的疾病或病症”在本文中以最广义使用，包括其发病机制牵涉补体系统激活异常的所有疾病和病理性状况，诸如例如补体缺陷。该术语明确包括受益于C3转变酶抑制的疾病和病理性状况。该术语另外包括受益于补体旁路抑制，包括选择抑制的疾病和病理性状况。增生、炎症或免疫相关的疾病或病症包括但不限于年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、过敏反应、嗜银颗粒痴呆、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、非典型溶血性尿毒综合征、自身免疫疾病、Barraquer-Simons综合征、白塞氏病、英国型淀粉样血管病、大疱性天疱疮、伯格氏病、癌症、灾难性抗磷脂综合征、脑淀粉样血管病、冷凝集素病、皮质基底节变性、克雅氏病、克罗恩病、冷球蛋白血症血管炎、拳击员痴呆、路易体痴呆、伴有钙化的弥漫性神经原纤维缠结、盘状红斑狼疮、唐氏综合征、局灶性节段性肾小球硬化、形式思维障碍、额颞叶痴呆(FTD)、伴有与染色体17有关的帕金森症的额颞叶痴呆、额颞叶变性、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、格林-巴利综合征、哈勒沃登-施帕茨病、溶血性尿毒综合征、遗传性血管性水肿、低磷酸酯酶症、特发性肺炎综合征、免疫复合物疾病、包涵体肌炎、感染性疾病(例如，由细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌或链球菌)、病毒(例如，人免疫缺陷病毒或其它感染原造成的疾病)、炎症性疾病、局部缺血/再灌注损伤、轻度认知损伤、免疫血小板减少性紫癜(ITP)、A型钼辅因子缺乏(MoCD)、I型膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN)(致密物沉积病)、膜性肾炎、多发梗塞性痴呆、狼疮(例如，全身性红斑狼疮)、肾小球肾炎、川崎病、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩、重症肌无力、心肌梗塞、强直性肌营养不良、视神经脊髓炎、C型尼曼-皮克病、伴有神经纤维缠结的非Guamanian运动神经元疾病、帕金森氏病、伴有痴呆的帕金森氏病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、寻常型天疱疮、皮克氏病、脑炎后帕金森症、多肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、牛皮癣、败血症、志贺毒素大肠杆菌(Shiga-toxin E coli，STEC)-HuS、脊髓性肌萎缩症、中风、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、移植排斥、血管炎(例如，ANCA相关性血管炎)、韦格纳氏肉芽肿、镰状细胞病、冷球蛋白血症、混合性冷球蛋白血症、原发性混合性冷球蛋白血症、II型混合性冷球蛋白血症、III型混合性冷球蛋白血症、肾炎、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、后天性大疱性表皮松解、延迟性溶血性输液反应和血小板输注无效。

术语“炎性疾病”和“炎性病症”可互换使用，指其中哺乳动物免疫系统的成分引起、介导或以其它方式促成炎症应答(其促成在该哺乳动物中发病)的疾病和病症。还包括其中炎症应答的降低对疾病的进展具有改善效果的疾病。此定义内包括免疫介导的炎性疾病，包括自身免疫性疾病。

术语“治疗”指旨在预防病症发展或改变病症病理而实施的干预。因而，“治疗”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可直接改变免疫应答的成分的应答程度，或者使得疾病对其它治疗剂(例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等)的治疗更敏感。

术语“表位”一般被定义为与抗体有关的大分子的一部分或其上的位点，抗体或其抗原结合片段将结合该部分或位点，并且针对该部分或位点可产生抗体。其可与给定蛋白或抗原的术语“抗原决定簇”“抗体结合位点”或“保守结合表面”互换使用。更具体而言，“表位”可被定义为参与抗体结合的氨基酸残基，还可被定义为三维空间的构象(如构象表位或保守结合表面)。“表位”可包含于小至约4-6个氨基酸残基的肽中，或可包含于蛋白的较大片段中，并且在指表位的三维结构、特别是指抗体结合表位时，表位无需由连续氨基酸残基构成。抗体结合表位通常为构象表位，而不是顺序表位(即线性表位)，换句话说，即抗体与之结合的、蛋白或多肽表面上三维排列的氨基酸残基所确定的表位。如上所述，构象表位不由氨基酸残基的连续序列构成，但是取而代之的是，该残基可能在一级蛋白序列中被广泛分隔，通过蛋白折叠形成三维天然构象，该残基一起形成结合表面。TRN1005抗体所识别的表位为构象表位，而非线性表位。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖但不限于识别CFH抗原表位SCR19的PIDNGDIT(SEQ ID NO：9)片段的CFH单克隆抗体，和具有多表位特异性的抗体组合物。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。

本发明公开的单克隆抗体TRN1005可以单独地(例如，呈单一疗法形式)；或以与一种或多种其它治疗剂的组合疗法施用至有需要的个体。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 PBMC分离和单个记忆性B细胞分选

样本的获取：11例表达CFH自身抗体的病人，合并其外周血单个核细胞(PBMC)。

记忆性B细胞的分选：

用亲和素标记CFH 15-mer多肽(序列如SEQ ID NO：10所示)作为钓饵，利用流式分选仪从合并的PBMC中分选到了单个记忆B细胞。

依次选取P1(淋巴细胞门)→P2(IgG+)→P3(CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL)。选择P1&P2&P3门(IgG+/CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27 ALL)，细胞计数(5000个细胞/孔)，分选多孔。流式细胞仪分选出CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27 ALL细胞群。为了使假阳性最小化，用Alexa标记链霉抗生物素蛋白Fluor647和Brilliant Violet 421。每个荧光团用链霉亲和素进行标记在单独的等分试样上，然后将其混合在一起然后与生物素化的抗原肽相互作用。显示升高荧光的两种荧光团细胞分选到单一96孔板的孔中。

实施例2单个记忆性B细胞RT-PCR分离抗体可变区基因

合成cDNA第一条链：

将含有单个B细胞的96孔板加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与Superscript III反转录酶，37℃孵育1h；按以下条件进行PCR扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min。产物cDNA在-20℃保存。

Nest-PCR分离抗体基因

每个单细胞分别扩增重链、轻链序列。50μL体系中含有5μL的RT反应产物，HotStarTaq酶，dNTPs，及0.5μM的各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行35个PCR循环：95℃30s，55℃60s，72℃90s，最后用72℃延伸7min。PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

实施例3 PCR产物克隆鉴定和抗体表达

PCR产物纯化克隆鉴定：

取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，将凝胶电泳鉴定为阳性，且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上(已经改造并含有抗体leader与恒定区)，将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，随即挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min；取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。

抗体表达：

将表达阳性抗体重链和轻链基因的质粒在大肠杆菌DH5α中大量扩增，进行重组质粒快速提取。在T75细胞培养瓶中用转染试剂PolyFect共转染293细胞，具体操作参见说明书。转染后6-8h换新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养72h，收集细胞上清进行检测。

实施例4 ELISA筛选检测表达抗体

以CFH 15-mer多肽为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μL 4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。将100μL的瞬时转染上清作为一抗常温孵育2个小时，用抗-IgGγ链-HRP(Millipore)为二抗(1:2000)作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μL/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色。

实施例5抗体大量表达与纯化

抗体大量表达与纯化：

将TRN1005抗体重链与轻链的表达载体用PolyFect(Qiagen)转染试剂盒共转染生长于175cm²细胞培养瓶的293T细胞，转染后6-8h换含有2％FCS新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养72h。收集转染上清，4000rpm离心1h，采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清。

SDS-PAGE检验：

利用SDS-PAGE检验抗体TRN1005的表达及纯化情况。

结果：

结果如图1所示，证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链。

实施例6抗体验证试验

1、结合位点检测：

标有生物素的CFH抗原包含了15个氨基酸，对每个氨基酸分别进行突变，再加野生型多肽作为阳性对照以及序列打乱的多肽作为阴性对照，同18个多肽抗原，用Elisa检测TRN1005抗体在不同浓度下分别与18个多肽的结合情况，绘制曲线并且计算出Area UnderCurve(AUC)，分析抗体与多肽的关键结合位点。

结果：

结果如图2显示，其中1(多肽序列如SEQ ID NO：10)和18(多肽序列如SEQ ID NO：11所示)为阳性对照，17为阴性对照，TRN1005抗体与CFH抗原多肽关键结合位点是6、7、8、9、12、13，证明能与抗原多肽特异性结合。

2、亲和实验：先进行SA芯片偶联捕获分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以进样时间确定偶联量。最后利用SA芯片捕获分子捕获配体：将制备的全人源CFH抗体作为配体，以计算得到的信号值确定单抗的进样浓度及接触时间。单抗与CFH 15-mer多肽(抗原)结合的亲和力和动力学分析：CFH 15-mer多肽用HBS-EP缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用10mmol/L的甘氨酸－盐酸再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用BiaCore X-100System软件进行分析。

结果：

结果如图3所示，TRN1005抗体的亲和力为1.17*10^-8KD，具体见下表。

表1 TRN1005的抗体亲和力

实施例7 TRN1005抗原表位测定

丙氨酸扫描定点突变：为了明确重组CFH单抗的氨基酸印记，本发明分析了重组单抗和丙氨酸替代多肽(包含最初描述的那8个氨基酸结合域，序列如SEQ ID NO：9所示)的结合情况。

结果：

异亮氨酸1120突变为丙氨酸后跟所有单抗都完全不结合。天冬酰胺1117突变后有0％-35％的野生型结合。苏氨酸1121突变后有1％-66％的野生型结合。多肽的上游四个残基或下游三个残基的改变对于单抗没影响。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州泰诺迪生物科技有限公司 珠海泰诺麦博生物技术有限公司

暨南大学

<120> 一种与旁路途径相关的CFH抗体

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 105

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Gly Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys

1 5 10 15

Ser Arg Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Val Ala

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp

35 40 45

Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp

65 70 75 80

Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ala Pro Phe Thr Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Trp Ala Ser

1

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ala Pro Phe Thr

1 5

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr

1 5 10 15

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Leu Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln

20 25 30

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val Gly Val Ile Ser Tyr Asp Gly

35 40 45

Lys Thr Lys His Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

50 55 60

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg

65 70 75 80

Gly Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Thr Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Asn Leu Tyr Gly

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Ile Ser Tyr Asp Gly Lys Thr Lys

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Ala Arg Gly Ser Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 9

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人源

<400> 10

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人源

<400> 11

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly

Claims (10)

1.一种与旁路途径CFH相关的全人源单克隆抗体TRN1005，其特征在于，所述抗体包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3氨基酸序列；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体分子选自具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项所述的抗体的重链和轻链。

6.一种克隆或表达载体，其特征在于，所述克隆或表达载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项所述的抗体的重链和轻链。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求5所述的多核苷酸序列或权利要求6所述的克隆或表达载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-4任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

9.权利要求1-4任一项所述的抗体或权利要求8所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗增生、炎症或免疫相关的疾病或病症的药物。

10.权利要求1-4任一项所述的抗体或权利要求8所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备抑制增生、炎症或免疫相关的疾病或病症中CFH活性的药物。

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