JP7189211B2 - 血清中のタンパク質の半減期を増加させるための組成物及び方法 - Google Patents

血清中のタンパク質の半減期を増加させるための組成物及び方法 Download PDF

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Description

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体を参照により本明細書に援用する：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６８８０９６．９６ＷＯ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ、作成日：２０１７年９月２８日、サイズ：１２５ｋｂ）。
発明の分野
本発明は、トランスフェリンを特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及びそれを作製及び使用する方法に関する。
薬物候補の薬物動態は重要なパラメーターであり、多くの場合、薬物候補をさらに薬物に開発するか、または治療用途に使用するかどうかを大きく決定する。特に、抗体を含むタンパク質ベース及びペプチドベースの治療薬の薬物動態研究は、こうした治療薬がさまざまな血清半減期を有し、有望な治療可能性を有しているが、血清半減期が短いそのようなペプチド及びタンパク質が、それによって、多くの場合、さらなる薬物の開発には適していないということを実証している。例えば、アルブミン及びガンマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、２０日間までの非常に長い血清半減期を有することが知られている［１］。さらに、血清半減期を延長する方法として、他のＩｇＧのＦｃドメインを操作して、それらの結合相互作用を新生児Ｆｃ受容体に対するものに変化させることができる［２］。しかしながら、インスリンなどの多くの天然ヒトタンパク質、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメント、及び短いペプチドは、通常、数分から約１時間にすぎない範囲の非常に短い血清半減期を有する。したがって、これらの分子が治療薬、診断ツールなどになるには、半減期が短いタンパク質及びペプチドの血清半減期を延長する効率的で費用効果が高く安全な方法が重要である。
血清中の短命であるタンパク質及び他のペプチド分子の血清半減期を延長して、循環中のそのような治療用または診断用タンパク質のクリアランスを回避する試みとして、いくつかの戦略が開発されてきた。タンパク質及びペプチド分子の血清半減期の延長を促進するために使用されるいくつかの技術には、ポリエチレングリコールなどの化学的結合との結合（すなわち、ペグ化）［３］、抗体のＦｃ領域への融合［４］、及びアルブミンなどの天然で血清半減期が長いタンパク質への融合［５］が含まれる。残念ながら、これらの技術は、複雑な製造及び特性評価プロセス、低発現レベル、ならびに生成された分子の望ましくない機能などの厄介な問題を有する。
タンパク質及び他のペプチド分子の血清半減期を延長するために、より最近開発された別のアプローチは、血清タンパク質に対する抗体フラグメントの使用を採用する。アルブミンは、主にその高い血清濃度と長い血清半減期により、この目的のために最も選択された標的となっている。ヒトアルブミンに対する単離ドメイン抗体は、２つの分子が遺伝子レベルで融合され、融合タンパク質として発現された後、インターフェロン（ＩＦＮ）－α２ｂの血清半減期を延長することが示された［６、７］。新たに生成された融合タンパク質分子の血清半減期は、ＩＦＮ－α２ｂのものよりも長いだけでなく、アルブミンとＩＦＮ－α２ｂの融合タンパク質のものよりも長くなっている。
ＶＨＨまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）として知られるラクダ科動物の重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の重鎖可変ドメインも、この目的のために利用されている。例えば、ヒトアルブミンに対するｓｄＡｂは、抗ＴＮＦαｓｄＡｂフラグメントの血清半減期を１時間未満から２日間を超えるまで延長することが示された［８］。
半減期が長い別の血清タンパク質はトランスフェリンである。トランスフェリンは、鉄イオンを伝達する血漿糖タンパク質であり、約３ｇ／Ｌの血清濃度、及び７～８日の血清半減期を有する。したがって、トランスフェリンは、薬物動態が不十分なペプチド分子の血清半減期を延長するための理想的な融合パートナーである。トランスフェリンとの融合によりグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）［９］とアセチルコリン受容体［１０］の両方の血清半減期が大幅に延長されることが、研究により示されている。
タンパク質の血清半減期を増加し、血清半減期を改善し、効率的で費用効果が高く、そのようなタンパク質を高収率で産生するための新しい方法は、新規タンパク質ベースの診断薬または治療薬の開発を促進するであろう。本発明の実施形態は、そのような方法に関する。
Sleep,D.,J.Cameron,and L.R.Evans,Albumin as a versatile platform for drug half-life extension.Biochim Biophys Acta Kontermann,R.E.,Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics.Curr Opin Biotechnol.22(6):p.868-76 Lee,L.S.,et al.,Prolonged circulating lives of single-chain Fv proteins conjugated with polyethylene glycol:a comparison of conjugation chemistries and compounds.Bioconjug Chem,1999.10(6):p.973-81 Tuettenberg,J.,et al.,Pharmacokinetics,pharmacodynamics,safety and tolerability of APG101,a CD95-Fc fusion protein,in healthy volunteers and two glioma patients.Int Immunopharmacol.13(1):p.93-100 5.Nolte,M.W.,et al.,Improved kinetics of rIX-FP,a recombinant fusion protein linking factor IX with albumin,in cynomolgus monkeys and hemophilia B dogs.J Thromb Haemost.10(8):p.1591-9 6.Holt,L.J.,et al.,Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs.Protein Eng Des Sel,2008.21(5):p.283-8 7.Walker,A.,et al.,Anti-serum albumin domain antibodies in the development of highly potent,efficacious and long-acting interferon.Protein Eng Des Sel.23(4):p.271-8 8.Stork,R.,D.Muller,and R.E.Kontermann,A novel tri-functional antibody fusion protein with improved pharmacokinetic properties generated by fusing a bispecific single-chain diabody with an albumin-binding domain from streptococcal protein G.Protein Eng Des Sel,2007.20(11):p.569-76 9.Matsubara,M.,et al.,Single dose GLP-1-Tf ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury.J Surg Res.165(1):p.38-45 Keefe,D.,et al.,In vitro characterization of an acetylcholine receptor-transferrin fusion protein for the treatment of myasthenia gravis.Autoimmunity.43(8):p.628-39
本発明は、トランスフェリンに対する新規抗体、特にトランスフェリンに対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。本発明はまた、トランスフェリンの存在下で、トランスフェリンに特異的と結合して、標的タンパク質の半減期を増加させる抗体を使用する方法及び組成物、ならびにトランスフェリンの存在下で増加した半減期を有する標的タンパク質を含む新規融合タンパク質に関する。
一般的な一態様において、本発明は、ヒト及びカニクイザルの血清トランスフェリンタンパク質及びプロテインＡ樹脂と特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むポリペプチドに関し、ここでｓｄＡｂはプロテインＡカラムによって精製でき、半減期の短いタンパク質またはフラグメントの半減期延長フラグメントとして使用できる。
一般的な一態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上のフレームワークを含む：
(ａ）配列番号１～配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク１、
(ｂ）配列番号９１～配列番号１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク２、
(ｃ）配列番号１８１～配列番号２１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク３、及び
(ｄ）配列番号２７１～配列番号３０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク４。
一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンに特異的と結合する単離ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上のフレームワークを含む：
(ａ）配列番号３８～配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク１、
(ｂ）配列番号１２８～配列番号１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク２、
(ｃ）配列番号２１８～配列番号２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク３、及び
(ｄ）配列番号３０８～配列番号３１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク４。
一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：
(ａ）配列番号４６～配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
(ｂ）配列番号１３６～配列番号１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び
(ｃ）配列番号２２６～配列番号２６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：
(ａ）配列番号８３～配列番号９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
(ｂ）配列番号１７３～配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び
(ｃ）配列番号２６３～配列番号２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
好ましくは、抗体またはそのフラグメントは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。より好ましくは、抗体またはその抗体フラグメントは、配列番号３１６～配列番号３５２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂである。
一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合するヒト化抗体またはそのフラグメントに関し、抗体またはそのフラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上のフレームワークを含む：
(ａ）配列番号３８または配列番号４５のアミノ酸配列を有するフレームワーク１、
(ｂ）配列番号１２８または配列番号１３５のアミノ酸配列を有するフレームワーク２、
(ｃ）配列番号２１８または配列番号２２５のアミノ酸配列を有するフレームワーク３、及び
(ｄ）配列番号３０８または配列番号３１５のアミノ酸配列を有するフレームワーク４。
一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合するヒト化抗体またはそのフラグメントに関し、抗体またはそのフラグメントは、以下からなる群から選択される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：
(ａ）配列番号８３または配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
(ｂ）配列番号１７３または配列番号１８０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び
(ｃ）配列番号２６３または配列番号２７０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
好ましくは、抗体またはそのフラグメントはヒト化単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。より好ましくは、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、配列番号３５３または配列番号３６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂである。
本発明はまた、本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含む融合タンパク質に関し、抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する。
本発明はまた、本発明の実施形態による抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ、または融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸分子、ならびに関連する発現ベクター及び宿主細胞に関する。
一般的な別の態様では、本発明は、標的タンパク質の半減期を増加させる方法に関する。本方法は、以下を含む：
(１）融合タンパク質を取得することであって、当該融合タンパク質は、本発明の実施形態によるトランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含み、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する、取得することと、
(２）当該融合タンパク質を、トランスフェリンに対して曝すことであって、当該トランスフェリンが、標的タンパク質単独と比較して、融合タンパク質中の標的タンパク質の半減期を増加させる、曝すこと。
本発明の一実施形態によれば、融合タンパク質は、以下を含む方法によって取得される：
(ａ）融合タンパク質をコードする発現ベクターを取得すること、
(ｂ）当該発現ベクターを細胞に導入して組換え細胞を取得すること、
(ｃ）当該組換え細胞を当該融合タンパク質の発現を可能にする条件下で増殖させること、及び
（ｄ）当該組換え細胞から当該融合タンパク質を取得すること。
本発明の別の一般的な態様は、有効量の融合タンパク質を含む組成物に関し、当該融合タンパク質は、本発明の実施形態によるトランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含み、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する。好ましくは、組成物はトランスフェリンをさらに含む。
本発明はまた、本発明の実施形態による組成物をトランスフェリンに曝し、それによって融合タンパク質中の標的タンパク質の半減期を増加させることを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、標的タンパク質の半減期を増加させるためのシステムに関し、当該システムは以下を含む：
(１）本発明の実施形態によるトランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、及び必要に応じてリンカーをコードする第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、第１及び第２のヌクレオチド配列が作動可能に連結されている、発現ベクター、
(２）宿主細胞、及び
(３）トランスフェリン。
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、本発明の詳細な説明及びその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかになるであろう。
前述の概要、及び以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は、示された正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
抗原で免疫した後のヒトトランスフェリンに対するラマの免疫応答を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるヒトトランスフェリン（上パネル）とカニクイザルトランスフェリン（下パネル）の結合物質スクリーニングを示す。各列は、出力ファージから選択された１つのクローンを表す。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから単離された精製ｓｄＡｂ、ＡＳ０２６３０、ＡＳ０１３１３、ＡＳ０１２９９、ＡＳ０１２９０、ＡＳ０１２８４、及びＡＳ０１２７４のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの画像であり、そのアミノ酸配列を表１に示す。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００によるヒトトランスフェリンに結合するトランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで７．８１２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１２５ｎＭ、５００ｎＭ、及び２００００ｎＭでヒトトランスフェリン（ＴｆＲ）に結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００によるヒトトランスフェリンに結合するトランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで７．８１２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１２５ｎＭ、５００ｎＭ、及び２００００ｎＭでヒトトランスフェリン（ＴｆＲ）に結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００によるカニクイザルトランスフェリンに結合するトランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで３．９０６２６ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、２５０ｎＭ、及び１０００ｎＭでカニクイザルトランスフェリン（ＴｆＲ）に結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００によるカニクイザルトランスフェリンに結合するトランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで３．９０６２６ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、２５０ｎＭ、及び１０００ｎＭでカニクイザルトランスフェリン（ＴｆＲ）に結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＥＬＩＳＡによるＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの熱安定性評価のグラフを示す。ヒトトランスフェリンに対する熱処理ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの結合である。 ＥＬＩＳＡによるＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの熱安定性評価のグラフを示す。カニクイザルトランスフェリンに対する熱処理ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの結合である。 カニクイザルへの注射後のＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質の血清クリアランスを示す。示された時点で血液試料を採取し、ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４及びｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９の濃度を酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから単離された精製ｓｄＡｂのＡＳ０１２７４ＶＨａ、ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７、ＡＳ０１２９９ＶＨ４、ＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７、及びＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの画像であり、そのアミノ酸配列を表１に示す。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａのＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示すｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、及び３ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａのＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａのＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、１２ｎＭ、及び２４ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、１２ｎＭ、及び２４ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ３ａ－Ｌ４７のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ３ａ－Ｍ７８のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、ヒトトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、１２ｎＭ、及び２４ｎＭでヒトトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ４－Ｌ４７のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａのＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、６ｎＭ、及び１２ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ３ａ－Ｌ４７のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ３ａ－Ｍ７８のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ４のＳＰＲセンサーグラムである。 ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００による、カニクイザルトランスフェリンに結合するヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの親和性決定を、対応する親抗体とともに示す。ｓｄＡｂのさまざまな濃度、すなわち、プロットの上部から下部まで０．１８７５ｎＭ、０．３７５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１．５ｎＭ、３ｎＭ、及び６ｎＭでカニクイザルトランスフェリンに結合するｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨ４－Ｌ４７のＳＰＲセンサーグラムである。 カニクイザルへの注射後のＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂ融合タンパク質の血清クリアランスを示す。示された時点で血液試料を採取し、ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７及びｓｄＡｂ ＡＳ０１２９９ＶＨ４の濃度を酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。
様々な出版物が背景及び本明細書全体で引用または記載されており、これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に包含される文献、行為、材料、手段、物品等の考察は、本発明に環境を提供する目的のものである。そのような考察は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または特許請求されたいずれかの発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別に定義されない限り、本明細書で使用される、全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が関連する当業者に一般的に理解されるものと同様の意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記述されている意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、明らかに別段に解される場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
当業者は、抗体の構造に精通しているであろう。軽鎖と重鎖はそれぞれ、標的抗原との結合を担う可変領域を含む。可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。軽鎖及び重鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本明細書で使用されるとき、「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、抗原の特異的認識及び結合特異性に寄与する抗体の重鎖または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる。本発明の実施形態によれば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列の少なくとも１つは、トランスフェリン、好ましくはヒトトランスフェリンに対する抗体またはそのフラグメントの特異的認識及び結合特異性に寄与する。
本明細書で使用されるとき、「抗体フラグメント」には、任意の適切な抗原結合抗体フラグメントが含まれる。例えば、抗体フラグメントは単鎖可変領域を含むことができる。本発明の実施形態によれば、抗体は好ましくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。
本明細書で使用されるとき、「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、自然で軽鎖を欠いている、ラクダ、ラマ、及びアルパカなどのラクダ科動物、ならびにサメの、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の抗原結合部位を指す。ラクダ科動物のＨＣＡｂの抗原結合部位は、ＶＨＨと呼ばれる単一の可変ドメインによって形成される。ｓｄＡｂｓは通常、比較的小さなサイズを有する単量体タンパク質として存在する。本発明によるｓｄＡｂは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を有する。
本明細書で使用されるとき、「トランスフェリンに対する抗体またはそのフラグメント」、「トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント」、及び「トランスフェリン抗体」は、全て同一の意味を有し、トランスフェリンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを指す。
本明細書で使用されるとき、「トランスフェリンに対するｓｄＡｂ」、「トランスフェリンと特異的に結合するｓｄＡｂ」、及び「トランスフェリンｓｄＡｂ」は、全て同一の意味を有し、トランスフェリンに特異的に結合する単一ドメイン抗体を指す。
「プロテインＡ」は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの細胞壁に最初に見いだされた４０～６０ｋＤａの表面タンパク質である。プロテインＡは、そのＩｇＢＤ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）の２つのαヘリックスとＩｇ分子のＦｃフラグメント内のＣＨ２及びＣＲ３ドメインとの相互作用により、多くの哺乳類種由来の免疫グロブリン、特にＩｇＧと結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２ならびにマウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂに高い親和性で結合するが、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ、ならびにマウスＩｇＧ３及びＩｇＧ１にも中程度の親和性でのみ結合する。プロテインＡは、ヒトＶＨ３ファミリーの場合、抗体可変領域にも結合する。
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、ラマまたはラクダ科動物）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来の残基を、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、アルパカ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基で置き換えたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基を、対応する非ヒト残基に置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含む場合がある。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行われる場合がある。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでは、非ヒト免疫グロブリン配列の超可変ループに対応する全てまたは実質的に全ての超可変ループ、及び全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体性能を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含む場合がある。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、通常、Ｈ鎖では６以下、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。
本明細書で使用されるとき、抗体またはそのフラグメント及びトランスフェリンに関連して使用されるとき、「～に特異的に結合する」または「～に対する」は、ｓｄＡｂなどの抗体またはそのフラグメントとトランスフェリンとの間の結合または相互作用を指す。本発明によるｓｄＡｂなどの抗体またはそのフラグメントは、１０－６～１０－９Ｍ、またはそれ未満の解離定数（ＫＤ）、好ましくは１０－９Ｍ未満の解離定数でトランスフェリンに結合する。「ＫＤという用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）で表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野の方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるなど表面プラズモン共鳴を使用して、またはＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤー干渉測定技術を使用して、決定できる。
例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、スキャッチャード分析及び／または放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイのような競合結合アッセイ、及び当該技術分野で公知のそれらの異なる変形、ならびに本明細書で言及される他の技術を含む、当該技術分野で公知の任意の方法を、特異的な抗原－抗体結合を決定するために使用できる。結合親和性または解離定数を決定する方法は、当業者に公知である。
ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、円偏光二色性（ＣＤ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）など、当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明による抗体またはｓｄＡｂの特性評価のために使用できる。タンパク質を特性評価する方法、すなわち、オリゴマー状態、融解温度、分子量、純度などを決定する方法は、当業者に公知である。
本明細書で使用されるとき、タンパク質またはポリペプチドの「半減期」とは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されるアッセイにおいてポリペプチドの濃度が５０％減少するのにかかる時間を指す。減少は、アッセイにおけるポリペプチドの分解、クリアランス、または隔離によって引き起こされ得る。ポリペプチドの半減期は、薬物動態分析などによって、本開示を考慮して当該技術分野で公知の任意の方法で決定することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質またはポリペプチドの半減期を測定するために、適切な用量のポリペプチドを温血動物（すなわち、ヒトまたはマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、もしくは霊長類などの別の適切な哺乳動物）に投与し、動物から血液試料または他の試料を収集し、試料中のタンパク質またはポリペプチドのレベルまたは濃度を決定して、ポリペプチドのレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を、測定データに基づいて計算する。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９９６）を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「半減期の増加」または「より長い半減期」は、例えばｔ１／２－α、ｔ１／２－β、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などのタンパク質の半減期を説明するために使用されるパラメーターのいずれか１つ、これらのパラメーターのいずれか２つ、またはこれらのパラメーターの本質的に全てにおける、対照と比較するときの増加を指す。
本明細書で使用されるとき、「融合タグ」は、発現、精製、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分析、ならびにタンパク質の特性評価、または診断または治療用途などのその後の操作を容易にするために、標的タンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結されて融合タンパク質を生成できるポリペプチド配列である。融合タグは、１つ以上の特性を示してもよい。例えば、融合タグは、融合タグの結合パートナーを含む精製媒体に選択的に結合し、作動可能に連結された標的タンパク質または融合タンパク質の容易な精製を可能にし得る。融合タグは、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧタグ、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、キチン結合ドメイン、細胞受容体のリガンド、抗体のＦｃ領域、緑色蛍光タンパク質などであり得る。
本発明は、トランスフェリンに対する抗体またはそのフラグメント、及びトランスフェリンに対する抗体またはそのフラグメントを使用して、標的タンパク質の半減期を増加させる方法、すなわち、標的タンパク質との融合タンパク質を取得して、融合タンパク質を、例えば、血清中のトランスフェリンにさらすことによる方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、トランスフェリンに対する新規ｓｄＡｂ及びその使用に関する。
したがって、一般的な一態様において、本発明は、ヒト及びカニクイザルの血清トランスフェリンタンパク質及びプロテインＡ樹脂に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むポリペプチドに関し、ここでｓｄＡｂはプロテインＡカラムによって精製でき、半減期の短いタンパク質またはフラグメントの半減期延長フラグメントとして使用できる。
したがって、一般的な一態様では、本発明は、配列番号３１６～配列番号３６０のアミノ酸配列を含むトランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体またはフラグメント及びヒト化抗体またはそのフラグメントに関する。
したがって、一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体またはフラグメント、及びヒト化抗体またはそのフラグメントを提供し、抗体またはそのフラグメントは以下を含む：
(ａ）配列番号１～配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク１、
(ｂ）配列番号９１～配列番号１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク２、
(ｃ）配列番号１８１～配列番号２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク３、及び
(ｄ）配列番号２７１～配列番号３１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク４。
したがって、一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体もしくはフラグメント、またはヒト化抗体もしくはそのフラグメントを提供し、抗体またはそのフラグメントは以下を含む：
(ａ）
(１）配列番号１～配列番号４５、及び
(２）配列番号１～配列番号４５のアミノ酸配列と、４、３、２、または１のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク１、
(ｂ）
(１）配列番号９１～配列番号１３５、及び
(２）配列番号９１～配列番号１３５のアミノ酸配列と、４、３、２、または１のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク２、
(ｃ）
(１）配列番号１８１～配列番号２２５、及び
(２）配列番号１８１～配列番号２２５のアミノ酸配列と、４、３、２、または１のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク３、ならびに
(ｄ）
(１）配列番号２７１～配列番号３１５、及び
(２）配列番号２７１～配列番号３１５のアミノ酸配列と、４、３、２、または１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク４。
したがって、一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体またはフラグメント、及びヒト化抗体またはそのフラグメントを提供し、抗体またはそのフラグメントは以下を含む：
(ａ）配列番号４６～配列番号９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、
(ｂ）配列番号１３６～配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び
(ｃ）配列番号２２６～配列番号２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
したがって、一般的な別の態様では、本発明は、トランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体またはフラグメント、及びヒト化抗体またはそのフラグメントを提供し、抗体またはそのフラグメントは以下を含む：
(ａ）
(１）配列番号４６～配列番号９０、及び
(２）配列番号４６～配列番号９０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ならびに／または
(ｂ）
(１）配列番号１３６～配列番号１８０、及び
(２）配列番号１３６～配列番号１８０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに／または
(ｃ）
(１）配列番号２２６～配列番号２７０、及び
(２）配列番号２２６～配列番号２７０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
本発明の実施形態によれば、単離された抗体、好ましくはｓｄＡｂ、またはそのフラグメントは、上述のフレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４を含む。
本発明の実施形態によれば、トランスフェリンと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントは、トランスフェリンに対して１０－６～１０－９Ｍまたはそれ未満の親和性（ＫＤ）を有し、好ましくは１０－９Ｍより低い親和性を有する。最も好ましい実施形態では、本発明による単離された抗体またはそのフラグメントは、ナノモル濃度未満の範囲、例えば、１～１０ｐＭ、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｐＭなどのピコモル濃度範囲のトランスフェリンに対するＫＤを有する。
好ましくは、本発明の実施形態による単離された抗体またはそのフラグメントは、配列番号４６のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２２６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。さらに別の特定の実施形態では、本発明の実施形態による単離された抗体またはそのフラグメントは、配列番号６２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１５２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号２４２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
本発明の実施形態によれば、トランスフェリンと特異的に結合するｓｄＡｂなどの抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１６～３５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントはｓｄＡｂである。例えば、トランスフェリンと特異的に結合する本発明によるｓｄＡｂは、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体であり得る。
本発明の特に好ましい実施形態では、トランスフェリンと特異的に結合するｓｄＡｂは、ＡＳ０１２７４（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＱＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１６））のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、またはＡＳ０１２９９（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３３２））のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の特に好ましい実施形態では、プロテインＡと特異的に結合するｓｄＡｂは、ＡＳ０１２９０（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＳＩＳＴＬＲＦＭＡＷＹＲＱＡＰＧＥＱＲＥＬＶＡＡＥＴＳＡＧＲＬＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＤＴＩＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＡＲＧＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３２５））、ＡＳ０１２７４（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＱＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１６））、ＡＳ０１２８４（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＲＰＬＲＦＭＡＷＹＲＱＡＰＧＮＱＲＧＬＶＡＡＥＴＳＧＧＴＩＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＤＬＤＤＹＷＧＱＧＩＱＶＴＶＳＳ（配列番号３２１））、ＡＳ０１２９９（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３３２））、ＡＳ０１３１３（ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＨＴＭＧＷＦＲＱＰＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＨＷＳＧＡＳＴＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＥＶＰＶＳＴＷＰＰＴＥＹＳＷＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３４３））、及びＡＳ０２３６０（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＮＴＭＡＷＹＲＱＳＰＧＫＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＬＧＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３４９））からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の特に好ましい実施形態では、ｓｄＡｂはヒト化ｓｄＡｂであり、当該ヒト化ｓｄＡｂは、トランスフェリンと特異的に結合し、ＡＳ０１２７４ＶＨａ（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５３））のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、またはＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５５））のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本発明の特に好ましい実施形態では、ｓｄＡｂはヒト化ｓｄＡｂであり、当該ヒト化ｓｄＡｂは、トランスフェリンと特異的に結合し、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５４））のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、または、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５６））と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、または、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５７））と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、または、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５８））と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、または、ＡＳ０１２９９ＶＨ４（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５９））と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列、または、ＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３６０））と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメントをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含む核酸を提供する。また、核酸分子を含むベクター、特に発現ベクター、及びその後の発現、精製などの下流の用途に使用できるベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。核酸分子、ベクター、及び宿主細胞は、本開示を考慮して当該技術分野で公知の方法を使用して取得できる。
本発明の実施形態によれば、核酸分子は、配列番号３１６～３６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を含む。
本明細書で使用されるとき、「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」は、ヌクレオチド配列及びＤＮＡ分子の物理的または化学的特性の少なくとも一つにおいて天然に存在するＤＮＡ分子とは異なるＤＮＡ分子を指す。例えば、「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」は、天然のゲノムＤＮＡ配列に存在する１つ以上のイントロンを含まないことにより、ヌクレオチド配列において天然のＤＮＡと異なり得る。「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」は、「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」が、天然に存在するＤＮＡと同一かまたは異なるヌクレオチド配列を含むかどうかに関係なく、異なるＤＮＡ修飾を有するなど、１つ以上の物理的または化学的性質が天然に存在するＤＮＡと異なっていてもよい。
本明細書で使用するとき、「ＤＮＡ修飾」とは、ＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドに１つ以上の生化学的官能基（メチル基、リン酸基など）を独立して結合させるなどによるＤＮＡへの任意の修飾を指す。異なる宿主細胞は異なるＤＮＡ修飾系を有することができるため、ＤＮＡ分子は同一のヌクレオチド配列を有することがきるが、異なるＤＮＡ分子を生成する。
「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」は、得られる「ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ」が天然に存在するＤＮＡ分子と区別できる限り、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの任意の方法で作成することができる。例えば、「ｃＤＮＡ」は、酵素である、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応においてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）テンプレートから作成することができる。一実施形態では、「ｃＤＮＡ」は、所望のｍＲＮＡテンプレート及びＤＮＡプライマーによる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって作成及び増幅することができる。「合成ＤＮＡ」は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで作製され得る。「合成ＤＮＡ」は、「合成ＤＮＡ」と同一のヌクレオチド配列を有する核酸分子を天然に含まない宿主細胞でｉｎ ｖｉｖｏで作製することもでき、その結果、宿主細胞により作製される「合成ＤＮＡ」が、ＤＮＡメチル化などの少なくとも１つ以上の物理的または化学的特性において、任意の天然に存在するＤＮＡ配列と区別できるようになる。
本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメントは、本開示を考慮して当該技術分野で公知の方法を使用して、組換え宿主細胞から組換えにより産生することができる。
組換えにより産生された抗体またはそのフラグメントは、例えばアミノ酸の翻訳後修飾において、天然に存在する抗体またはそのフラグメントと異なっていてもよい。本明細書で使用されるとき、「アミノ酸の翻訳後修飾」とは、例えば、１つ以上のアミノ酸に独立して１つ以上の生化学的官能基（アセテート、ホスフェート、さまざまな脂質、及び糖など）を結合させることによる、アミノ酸の化学的性質を変更することによる（例えば、シトルリン化）、または構造を変化させることによる（例えば、ジスルフィド架橋の形成）、アミノ酸の翻訳後のアミノ酸への任意の修飾を指す。
本発明の実施形態はまた、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを組換えにより発現及び精製する方法に関する。本発明の実施形態によれば、当該方法は、本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメントをコードする発現ベクターを取得すること、発現ベクターを宿主細胞に導入して組換え細胞を取得すること、抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で組換え細胞を増殖させること、及び、組換え細胞から抗体またはそのフラグメントを取得することを含む。トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、トランスフェリンを伴うアフィニティーカラムに、抗体またはそのフラグメントを含む組換え細胞の溶解物、上清、または周辺質抽出物を適用することにより単離できる。
別の実施形態では、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、融合タグの結合パートナーを伴うアフィニティーカラムに、抗体またはそのフラグメントを含む、組換え細胞の溶解物、上清、または周辺質抽出物を適用することにより、組換え細胞からの抗体またはそのフラグメントの精製を促進する融合タグをさらに含む。
トランスフェリンと特異的に結合する本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメント、及び特にｓｄＡｂは、トランスフェリンに対して高い親和性（例えば、ピコモル濃度範囲）及びトランスフェリンが補充されていない血清中の半減期と比較してトランスフェリンを補充した血清中でのより長い半減期を有する。理論に拘束されることを望まないが、ｓｄＡｂなどの抗体またはそのフラグメントとトランスフェリンとの間の結合相互作用が、血清中の抗体またはそのフラグメントのより長い半減期に寄与すると考えられる。したがって、そのような抗体またはそのフラグメントを使用して、トランスフェリンを含む血清または組成物中で抗体またはフラグメントに融合した標的タンパク質の半減期を増加させることができる。
したがって、一般的な別の態様では、本発明は、血清中で標的タンパク質の半減期を増加させる方法に関する。方法は、（１）融合タンパク質を取得することであって、当該融合タンパク質は、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含み、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する、取得することと、（２）当該融合タンパク質を、トランスフェリンに対して曝すことと、を含み、当該トランスフェリンが、標的タンパク質単独と比較して、融合タンパク質中の標的タンパク質の半減期を増加させる。
本発明の実施形態によれば、曝すステップで使用されるトランスフェリンは、血清またはｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された緩衝組成物を含む任意の組成物中に存在するものであってよい。好ましくは、融合タンパク質は、トランスフェリンを含む血清にトランスフェリンを投与することによりトランスフェリンに曝される。
本発明の実施形態によれば、トランスフェリンに曝されると、融合タンパク質は、例えば標的タンパク質単独と比較して、半減期を測定することにより判定されるとき、増加した半減期を有する。融合タンパク質は、標的タンパク質を抗体またはそのフラグメントに融合し、抗体またはそのフラグメントから標的タンパク質を分離する機能も果たすリンカーを必要に応じて含むことができる。２つのタンパク質分子を一緒に融合するために使用することができるリンカーは、本開示を考慮して当業者に周知であろう。
抗体またはそのフラグメントは、本開示を考慮して、例えば遺伝子融合または共有結合によるなど、当該技術分野で公知の任意の方法によって標的タンパク質に融合させることができる。抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに連結することができる。
好ましくは、融合タンパク質は、本発明の実施形態による抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４６～配列番号９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１のアミノ酸配列、配列番号１３６～配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び配列番号２２６～配列番号２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、融合タンパク質の抗体またはそのフラグメントは、ｓｄＡｂであり、さらにより好ましくは、ＡＳ０１２７４（配列番号３１６）またはＡＳ０１２９９（配列番号３３２）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂである。もっとも好ましくは、融合タンパク質の抗体またはそのフラグメントは、ＡＳ０１２７４ＶＨａ（配列番号３５３）、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ（配列番号 ３５４）、ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９（配列番号３５５）、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９（配列番号３５６）、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７（配列番号３５７）、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８（配列番号３５８）、ＡＳ０１２９９ＶＨ４（配列番号３５９）、またはＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７（配列番号３６０）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｄＡｂである。
本発明の実施形態によれば、標的タンパク質は、治療用ポリペプチド、診断目的に使用できるポリペプチド、または構造活性研究用のポリペプチドなどのペプチドまたはポリペプチドである。例えば、標的タンパク質は、抗体、ペプチド、あるいは治療もしくは診断目的で開発もしくは使用された、または開発もしくは使用される他のポリペプチド、あるいは構造及び／または機能解析の対象となるポリペプチドであり得る。好ましくは、標的タンパク質は、血清中で不安定であり、治療、診断などの目的のために使用される血清半減期の増加を必要とする治療用ペプチドまたはポリペプチドである。
本発明の実施形態による融合タンパク質は、本開示を考慮して当該技術分野で公知の方法を使用して様々な目的に使用することができる。例えば、融合タンパク質は、例えば、薬物スクリーニングまたは標的同定の目的で、結合パートナーに対する標的タンパク質の親和性をアッセイするために使用することができる。また、特に方法が血清への標的タンパク質の投与が含まれる場合、それは診断方法にも使用できる。さらに、特に標的タンパク質が血清中で不安定であることが知られている場合、それは治療目的に使用できる。
本発明の別の一般的な態様は、有効量の融合タンパク質を含む組成物に関し、当該融合タンパク質は、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含み、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する。好ましくは、組成物は組成物中の融合タンパク質の半減期を増加させるトランスフェリンをさらに含む。組成物は、薬学的または診断目的に適した任意の担体を含み得る薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。用途に応じて、有効量は、融合の一部として標的タンパク質の治療的または診断的使用を提供するのに有効な融合タンパク質の量であり得る。
本発明の実施形態による組成物は、任意の目的のためにｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。本発明は、本発明の実施形態による組成物をトランスフェリンに曝し、それによって融合タンパク質中の標的タンパク質の半減期を増加させることを含む方法に関する。
一実施形態では、本発明は、例えば、診断薬または治療薬を同定するために、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェリンを含む血清に組成物を投与することにより、本発明の実施形態による組成物を融合タンパク質に使用されるトランスフェリンに曝すことを含む方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の実施形態による組成物を、標的タンパク質による治療を必要とする対象に投与することを含む方法に関し、組成物は、ヒトトランスフェリン及び標的タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質の治療有効量を含む。
さらに別の実施形態では、本発明は、標的タンパク質による診断を必要とする対象に組成物を投与することを含む方法に関し、組成物は診断有効量の融合タンパク質を含む。
本発明の実施形態はまた、本発明による融合タンパク質を含む組成物、及び組成物中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法にも関する。組成物中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法は、トランスフェリンに対する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じたリンカーを含む融合タンパク質、好ましくは単離された融合タンパク質を取得することであって、抗体またはそのフラグメントは標的ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、必要に応じたリンカーは抗体またはそのフラグメントと標的ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端とを分離する、取得することと、組成物中のトランスフェリンに融合タンパク質を曝すことと、を含み、融合タンパク質は、組成物中の標的タンパク質単独よりも長い半減期を有する。
理論に拘束されることを望まないが、融合タンパク質中の抗体またはそのフラグメントと組成物または血清中のトランスフェリンとの間の特異的結合が、標的タンパク質の半減期の増加に寄与すると考えられる。
本発明の実施形態は、増加した血清半減期を有する標的タンパク質を取得する方法、トランスフェリン及び標的タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質を発現及び精製する方法も提供する。
本発明の実施形態によれば、増加した血清半減期有する標的タンパク質を取得する方法は以下を含む：
(ａ）トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じたリンカーを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターを取得することであって、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及び必要に応じたリンカーは、抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを分離する、取得することと、
(ｂ）ステップ（ａ）の発現ベクターを細胞に導入して組換え細胞を取得することと、
(ｃ）当該組換え細胞を前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で増殖させることと、
(ｄ）当該組換え細胞から当該融合タンパク質を取得すること。
融合タンパク質をコードする発現ベクター及び融合タンパク質を発現する組換え細胞は、本開示を考慮して当該技術分野で公知の方法を使用して構築することができる。哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、または細菌細胞などの融合タンパク質の組換え生産に適した任意の宿主細胞を使用することができる。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを含むがこれに限定されない組換え細胞から融合タンパク質を得るための任意の方法を、本開示を考慮して使用することができる。
一実施形態では、融合タンパク質は組換え細胞から得られ、トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質の部分とトランスフェリンとの間の特異的相互作用を利用して精製し、組換え細胞から融合タンパク質を取得することができる。
別の実施形態では、融合タンパク質は、組換え細胞からの融合タンパク質の取得及び精製を促進するために、融合タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に融合タグをさらに含むことができる。例えば、融合タンパク質を含む組換え細胞の溶解物、周辺質抽出物、または上清を取得し、融合タグの適切な結合パートナーを伴うカラムに適用することができる。特定の非限定的な例では、融合タンパク質はＨｉｓタグをさらに含むことができ、融合タンパク質を含む組換え細胞の溶解物、周辺質抽出物、または上清を取得し、ニッケルカラムに適用して組換え細胞から融合タンパク質を取得することができる。その後、カラムを洗浄し、適切な緩衝条件下で融合タンパク質をカラムから溶離させて、融合タンパク質を取得することができる。
本発明の一般的な別の態様は、以下を含む、標的タンパク質の半減期を増加させるためのシステムに関する：
(１）トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、及び必要に応じてリンカーをコードする第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、第１及び第２のヌクレオチド配列が作動可能に連結されている、発現ベクター、
(２）宿主細胞、及び
(３）トランスフェリン。
トランスフェリンと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じてリンカーを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターのための発現ベクターを構築するのに発現ベクターを使用することができ、当該抗体またはそのフラグメントは、標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、及びリンカーは、必要に応じて抗体と標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを分離する。
宿主細胞を使用して、例えば、本発明を考慮して当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、融合タンパク質のための発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、融合タンパク質を発現するための組換え細胞を構築できる。
トランスフェリンは、融合タンパク質を安定化するために使用できる。それは、アフィニティークロマトグラフィーにより融合タンパク質を単離するためにも使用できる。
本発明の実施形態によれば、システムは、融合タンパク質中の抗体またはそのフラグメントと固体支持体に結合しているトランスフェリンとの特異的結合、または融合タンパク質上の融合タグと固体支持体に結合している融合タグの結合パートナーとの特異的結合によって、融合タンパク質を捕捉するための固体支持体をさらに含むことができる。
システムは、融合タンパク質の発現及び／または単離に有用な１つまたは複数の緩衝液をさらに含むことができる。
本発明の以下の特定の例は、本発明の性質をさらに例示するものであり、本発明がそれに限定されないことを理解する必要がある。
材料及び方法
ラマ免疫ファージディスプレイライブラリーからのトランスフェリンｓｄＡｂの単離
雄のラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）に、それぞれ１、２２、３６、５０、及び６４日目に５０μｇのヒトトランスフェリンと５０μｇのカニクイザルトランスフェリンを皮下注射した［１１］。完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を一次免疫に使用し、不完全なフロイントアジュバントを後続の免疫２～４に使用した。アジュバントは最終免疫には使用しなかった。ラマは各免疫の１週間後に採血し、ヘパリン化された血液を末梢血白血球の即時分離のために収集し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。
ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×１０８個の白血球から総ＲＮＡを単離した。プライマーとしてｐｄ（Ｎ）６を、テンプレートとして５６６ｎｇの総ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成した。４つのフォワードプライマー、Ｐ４４１＿ＶＨＨＦ１（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＳＭＢＧＴＲＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＫＴＣＴＧＧＧＧＧＡ）（配列番号３６１）、Ｐ４４２＿ＶＨＨＦ２（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ）（配列番号 ３６２）、Ｐ７５９＿ＶＨＨＦ３（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴ）（配列番号３６３）、及びＰ４４４＿ＶＨＨＦ４（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧ）（配列番号３６４）と２つのリバースプライマー、Ｐ４４５＿ＣＨ２Ｒ（ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ）（配列番号３６５）及びＰ４４６＿ＣＨ２ｂ３Ｒ（ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡ）（配列番号３６６）を使用して、従来の免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ）のＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２領域または重鎖抗体のＶＨＨ－ヒンジ－ＣＨ２を増幅した。Ｐ４４５＿ＣＨ２Ｒとのプライマーの組み合わせからの約６００ｂｐの増幅されたＶＨＨ産物を１％アガロースゲルから抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、Ｐ４４６＿ＣＨ２Ｒから増幅された産物をＰＣＲ精製した。２番目のＰＣＲ反応では、Ｐ４４０＿ＶＨＨＦ（ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ）（配列番号３６７）及びＰ４４７＿ＶＨＨＲ（ＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧ）（配列番号３６８）の２つのプライマーを使用してＳｆｉＩ制限部位を導入し、組み合わせた増幅産物から最終的なｓｄＡｂフラグメントを増幅した。最終ＰＣＲ産物をＳｆｉＩで消化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．で構築された従来のファージミドベクターに連結し、エレクトロポレーションによりＥ． ｃｏｌｉＴＧ１に形質転換した。ファージをレスキューし、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で増幅した。
ラマ免疫ファージディスプレイライブラリーを、Ｍ－２８０ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にコンジュゲートしたヒト及びカニクイザルのトランスフェリンに対してパニングした。約３×１０１１個のファージをビーズに添加し、抗原結合のために３７℃で２時間（ｈｒ）インキュベートした。非結合ファージの廃棄後、１ラウンド目では、ビーズを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で６回洗浄し、１ラウンドごとに洗浄を１回ずつ増加した。ファージを１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンとの１０分間のインキュベーションにより溶離し、溶離液をその後２００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和した。次いで、溶離液を、プロテインＡビーズを使用したプロテインＡ結合によって選択し、上述のように溶離した。次いで、ファージを上述のように増幅したが、より小規模であった。２ラウンドのパニングの後、溶離したファージを使用して、指数関数的に増殖するＥ． ｃｏｌｉＴＧ１に感染させた。個々のコロニーを、ファージ酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）で使用した。
ファージＥＬＩＳＡでは、９６ウェルマイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリンまたはカニクイザルで一晩コーティングし、４％修飾リン酸緩衝生理食塩水（ＭＰＢＳ）によって３７℃で２時間ブロッキングした。個々のクローンからのファージを４％ＭＰＢＳで一晩事前にブロッキングし、事前にブロッキングしたウェルに添加して１時間インキュベートした。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してファージＥＬＩＳＡを実施し、陽性のファージクローンを配列決定した。
抗トランスフェリンｓｄＡｂの発現
ヒトのトランスフェリン及びカニクイザルの全ての結合物質を表１に示す。ｓｄＡｂの発現及び精製のために、６個のｓｄＡｂ（ＡＳ０２３６０、ＡＳ０１３１３、ＡＳ０１２９９、ＡＳ０１２９０、ＡＳ０１２８４、及びＡＳ０１２７４）を選択した。発現したｓｄＡｂは、カルボキシル（Ｃ）末端に６×ヒスチジン精製タグを有する。これらのｓｄＡｂは周辺質に発現し、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した［１３］。簡潔に述べると、クローンを２５ｍｌのＬＢ－アンピシリン（Ａｍｐ）に播種し、３７℃で２００回転／分（ｒｐｍ）で一晩振とうした。翌日、２０ｍｌの培養物を使用して、０．４％カザミノ酸、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１、及び２００μｇ／ｍｌのＡｍｐを補充した１ＬのＭ９培地（０．２％グルコース、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、０．０５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）に播種し、２４時間培養した。１００ｍｌの１０×ＴＢ栄養素（１２％トリプトン、２４％酵母エキス、及び４％グリセロール）、２ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌ Ａｍｐ、１ｍｌの１Ｍイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養物に添加し、２００ｒｐｍで振とうしながら２８℃でさらに６５～７０時間インキュベーションを続けた。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を遠心分離により回収し、リゾチームで溶解した。細胞溶解物を遠心分離し、透明な上清をＨｉｇｈ－Ｔｒａｐ（商標）キレートアフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製した。
ＥＬＩＳＡによる熱安定性評価
ＳｄＡｂを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１．０μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌに希釈した。試料を、水浴で５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、及び７５℃で３０分間加熱した。全ての試料をベンチトップで室温まで冷却した。試料を遠心分離して、凝集した物質をペレット化した。残りの可溶性タンパク質を、ＥＬＩＳＡを使用して結合活性についてアッセイした。ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルマイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリンまたはカニクイザルで一晩コーティングし、４％修飾リン酸緩衝生理食塩水（ＭＰＢＳ）によって３７℃で２時間ブロッキングした。熱処理したｓｄＡｂ試料を事前にブロッキングしたウェルに添加し、１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートｓｄＡｂ抗体を、二次試薬として使用した。プレートを発色させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００光学センサープラットフォームと研究グレードのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実験を実施した。ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂを、標準的なアミンカップリングによりセンサーチップ表面に固定化した。全ての実験は、２５℃でＨＥＰＥＳ緩衝液［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０］中で実施した。ヒトトランスフェリン及びカニクイザルトランスフェリンを、特に明記しない限り、３．９ｎＭ～２０００ｎＭの範囲の連続希釈で３０μｌ／分の流速で注入した。ブランクの対照表面から差し引いた後の結合分析物の量を、相対応答単位（ＲＵ）として示す。各一連の注入の二重参照センサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合動態について分析した。実験データを１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｃｈｉ２＜１）にグローバルフィッティングすることで決定して、解離定数（ＫＤ）を、オン及びオフレート（それぞれｋｏｎ及びｋｏｆｆ）から計算した。
血清半減期の測定
ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂを、血清半減期測定に選択した。上述の２つのｓｄＡｂを、非常に短い半減期（数分から数時間）を有する別のｓｄＡｂ（抗ＩＬ６Ｒ ｓｄＡｂ）に融合し、ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質とＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質を作製した。この実験の陽性対照は、抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ融合タンパク質である。体重４～５ｋｇの３頭のカニクイザルに、それぞれ３０ｍｇのＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質、ＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質、及び抗ＨＳＡ融合タンパク質を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。示される時点でガラス毛細管によって目から血液を採取した。血清を分離し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。上述で収集された試料中の注入された抗体分子の濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質の血清半減期を決定するために、抗ｓｄＡｂポリクローナル抗体をマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，９０１８）に２μｇ／ｍｌの濃度にて４℃で一晩コーティングした。陽性対照の抗ＨＳＡ融合タンパク質は、２つの抗トランスフェリンｓｄＡｂ融合タンパク質と同一の方法で実施した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、プレートをＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡにて３７℃で２時間ブロッキングした。希釈した血清（希釈剤として０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡを使用した）をウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ｓｄＡｂポリクローナル抗体（０．１μｇ／ｍｌ）（Ａｂｃａｍ，ａｂ９５３８）をウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢ基質で１０分間発色させ、１ＭのＨＣｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、分光計を使用して４５０ｎｍで測定した。ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡ中の精製ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質の連続希釈を使用して、血清濃度分析の標準曲線を作成した。
抗トランスフェリンｓｄＡｂのヒト化
ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４及びＡＳ０１２９９のタンパク質配列を、それぞれ最高度の相同性を共有する５つの最も近いヒト生殖系列配列とアライメントした。最良のヒト生殖系列配列をヒトアクセプターとして選択した。相同性モデルを作成した。モデル分析データに従って、抗原結合または抗体足場形成に潜在的に重要な残基をそのまま残し、残りを人間の対応物への変換のために選択した。最初に、４つの配列最適化バリアントのパネルを生成した（ステージ１）。これらのバリアントをいくつかのパラメーターについて分析し、得られた結果を使用して第２の組のｓｄＡｂを設計した（ステージ２）。ＡＳ０１２７４の上位２つのヒト化ｓｄＡｂ（ＡＳ０１２７４ＶＨａ及びＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９）を、結合、安定性、及び機能的活性データに基づいて選択した。それらの配列を表１に示す。ＡＳ０１２９９の上位６つのヒト化ｓｄＡｂ（ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８、ＡＳ０１２９９ＶＨ４、及びＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７）を、結合、安定性、及び機能的活性データに基づいて選択した。それらの配列を表１に示す。
ヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの特性評価
ヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの発現
ｓｄＡｂの発現と精製には、８つのｓｄＡｂｓ（ＡＳ０１２７４ＶＨａ、ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７、ＡＳ０１２９９ＶＨ４、ＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７、及びＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８）を選択した。発現したｓｄＡｂは、カルボキシル（Ｃ）末端に６×ヒスチジン精製タグを有する。これらのｓｄＡｂは周辺質に発現し、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製された［１３］。発現及び精製手順は、ラクダ科動物のｓｄＡｂの産生で述べたものと同一である。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００光学センサープラットフォームと研究グレードのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して実験を実施した。ヒトトランスフェリンを、標準的なアミンカップリングによりセンサーチップ表面に固定化した。全ての実験は、２５℃でＨＥＰＥＳ緩衝液［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０］中で実施した。ヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂを、特に明記しない限り、０．３７５ｎＭ～２４ｎＭの範囲の連続希釈で３０μｌ／分の流速で注入した。ブランクの対照表面から差し引いた後の結合分析物の量を、相対応答単位（ＲＵ）として示す。各一連の注入の二重参照センサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合動態について分析した。実験データを１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｃｈｉ２＜１）にグローバルフィッティングすることで決定して、解離定数（ＫＤ）を、オン及びオフレート（それぞれｋｏｎ及びｋｏｆｆ）から計算した。
抗トランスフェリンｓｄＡｂとプロテインＡとの結合能分析
静的結合能力の決定
２つのヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂ（ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９及びＡＳ０１２９９ＶＨ４）ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する１つのｓｄＡｂ対照をｓｄＡｂとプロテインＡとの結合能力分析に使用した。３つのｓｄＡｂを全て１つの抗ＩＬ－６Ｒ ｓｄＡｂに融合し、３つのｓｄＡｂ融合タンパク質を得た。ｓｄＡｂ融合タンパク質は、２．１～２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、ｐＨ７．４のＰＢＳで調製し、０．２２μｍの低タンパク質結合ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して濾過した。プロテインＡ樹脂をＰＢＳで３０分間平衡化し、濾過して湿ったペーストを得た。１ｍＬのｓｄＡｂ融合タンパク質を１００μＬの湿った樹脂に添加した。スラリーを、室温で５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、及び１００分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。樹脂を９ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質の溶離を、４ｍＬの１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５を樹脂に添加し、スラリーを室温で１５分間穏やかに振とうしてインキュベートすることで実施した。全ての画分、すなわちフロースルー、洗浄、及び溶離を収集し、λ＝２８０ｎｍでの分光光度計によって分析して、ｓｄＡｂ融合タンパク質の含有量を決定した。
動的結合容量の決定
１００μＬのプロテインＡ樹脂を３０ｍｍ×内径２．１ｍｍカラムのマイクロボアに詰めた。アセトンパルス（０．０１Ｍ）をカラムに適用して、カラムの総空隙容量を決定した。ｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化した後、１ｍＬのｐＨ７．４ＰＢＳ中の３．５ｍｇ／ｍＬ ｓｄＡｂ融合タンパク質を、０．５ｍｌ／分の線形流速でカラムにロードした。フロースルーのｓｄＡｂ融合タンパク質濃度が供給濃度の１０％に達した時点で、ブレークスルー体積を決定した。このフロースルー体積を、空隙容量を差し引くことにより補正し、この補正体積に基づいて、プロテインＡ樹脂の動的結合能力を決定した。
血清半減期の測定
ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂを、血清半減期測定に選択した。上述の２つのｓｄＡｂを、非常に短い半減期（数分から数時間）を有する別のｓｄＡｂ（抗ＩＬ６Ｒ ｓｄＡｂ）に融合し、ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７ ｓｄＡｂ融合タンパク質とＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂ融合タンパク質を作製した。体重４～５ｋｇの２匹のカニクイザルに、それぞれ３０ｍｇのＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７ ｓｄＡｂ融合タンパク質、及びＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂ融合タンパク質を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。示される時点でガラス毛細管によって目から血液を採取した。血清を分離し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。上述で収集された試料中の注入された抗体分子の濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４７ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂ融合タンパク質の血清半減期を決定するために、抗ｓｄＡｂポリクローナル抗体をマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，９０１８）に２μｇ／ｍｌの濃度にて４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、プレートをＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロッキングした。希釈した血清（希釈剤として０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡを使用した）をウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ｓｄＡｂポリクローナル抗体（０．１μｇ／ｍｌ）（Ａｂｃａｍ，ａｂ９５３８）をウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢ基質で１０分間発色させ、１ＭのＨＣｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、分光計を使用して４５０ｎｍで測定した。ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡ中の精製ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質の連続希釈を使用して、血清濃度分析の標準曲線を作成した。
結果
ｓｄＡｂの単離と特性評価
トランスフェリン特異的ｓｄＡｂｓの単離を、ヒトトランスフェリン及びカニクイザルのトランスフェリンによるラマ免疫、ラマからの免疫ファージディスプレイライブラリーの構築、及びその後のパニングによって達成した。
ヒトのトランスフェリンとカニクイザルのトランスフェリンは、ラマに中程度の免疫反応を引き起こした。５回目の免疫後の血清の約２５，０００倍希釈は、まだ陽性として検出された（図１）。このレベルの反応は、ラマの免疫で通常達成されるものと一致している。
約２×１０８個のラマ白血球をｍＲＮＡの単離に使用し、それをファージライブラリの構築に使用した。取得されたライブラリーのサイズは２×１０９個の独立した形質転換体で、９２％の陽性挿入率を有した。固定されたトランスフェリンで２ラウンドのファージディスプレイパニングを実施し、パニング中にファージの濃縮が観察された（データ示さず）。ファージＥＬＩＳＡは、分析されたクローンの約８８％がトランスフェリンに結合したことを示した（図２）。ファージクローンに提示されたｓｄＡｂのコード配列の分析により、３７の異なるｓｄＡｂアミノ酸配列（表１のＡＳ０１２７４～ＡＳ０２３６５に対応する配列番号３１６～３５２）を明らかにした。単離された３７の異なるｓｄＡｂには、フレームワーク領域１～４（表２）及び相補性決定領域１～３（表３）が含まれる。
Figure 0007189211000001
Figure 0007189211000002
Figure 0007189211000003
Figure 0007189211000004
Figure 0007189211000005
Figure 0007189211000006
Figure 0007189211000007
Figure 0007189211000008
６つのｓｄＡｂであるＡＳ０２３６０、ＡＳ０１３１３、ＡＳ０１２９９、ＡＳ０１２９０、ＡＳ０１２８４、及びＡＳ０１２７４を、Ｅ． ｃｏｌｉ周辺質発現ベクターｐＳＪＦ２Ｈ［１２］にサブクローニングした。Ｃ末端に６×ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグでそれぞれタグ付けされた６つのｓｄＡｂを、Ｅ． ｃｏｌｉで産生させ、ＩＭＡＣによって精製した（図３）。ＡＳ０２３６０、ＡＳ０１３１３、ＡＳ０１２９９、ＡＳ０１２９０、ＡＳ０１２８４、及びＡＳ０１２７４は、それぞれＴＧ１培養液１リットルあたり２０．２９、１５．７１、２２．２０、６．８７、１５．０３、及び１９．５３ｍｇで精製した。
２つのトランスフェリンｓｄＡｂｓ ＡＳ０１２７４及びＡＳ０１２９９を、ＳＰＲベースのバイオセンサーを使用して、ヒトトランスフェリン及びカニクイザルのトランスフェリンへの結合について分析した。
結果を表４に示す。ＡＳ０１２７４の解離定数（ＫＤ）は、ヒトトランスフェリンでは１６ｎＭ、カニクイザルのトランスフェリンでは１．６ｎＭと計算された（図４Ａ）。ＡＳ０１２９９の解離定数（ＫＤ）は、ヒトトランスフェリンでは１４０ｎＭ、カニクイザルのトランスフェリンでは８．８ｎＭと計算された（図４Ｂ）。
Figure 0007189211000009
ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの熱安定性を、ＥＬＩＳＡによって測定した。このアッセイでは、３つのｓｄＡｂ濃度を使用した：１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、及び０．０４μｇ／ｍｌ。精製されたＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂを上述の３つの濃度に希釈し、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、及び７５℃にて３０分間水浴で加熱した。全ての試料をベンチトップで室温まで冷却した。試料を遠心分離して、凝集した物質をペレット化した。残りの可溶性タンパク質を一次抗体として、ＥＬＩＳＡを使用して結合活性についてアッセイした。９６ウェルのマイクロタイタープレートを、それぞれ２μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリンと２μｇ／ｍｌのカニクイザルトランスフェリンでコーティングした。結合の評価のために、加熱したｓｄＡｂ試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。図５Ａはヒトトランスフェリンの結合活性を示し、図５Ｂはカニクイザルトランスフェリンの結合活性を示す。
ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４及びＡＳ０１２９９の血清クリアランス
ＡＳ０１２７４及びＡＳ０１２９９を、トランスフェリン結合活性、プロテインＡ結合活性、及び高い熱安定性に基づいて血清半減期を試験するために選択した。通常、ｓｄＡｂは急速に血液から除去され、血清半減期は数分から数時間である。選択した２つのｓｄＡｂの血清半減期を調べるために、２つのｓｄＡｂを非常に短い血清半減期を有する別のｓｄＡｂ（抗ＩＬ－６Ｒ ｓｄＡｂ）と融合し、それぞれｓｄＡｂ融合タンパク質として産生した。
ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂ融合タンパク質を、血清クリアランス分析のために４～５ｋｇのカニクイザルに注射した。ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂは、トランスフェリンに結合することにより、ｓｄＡｂ融合タンパク質の血清半減期を数分から２～３日まで顕著に増加させることができた。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はヒト血清に豊富であり、ＨＳＡドメインまたはフラグメントは血清半減期延長に広く使用されている。この実験では、ＡＳ０１２７４ ｓｄＡｂ融合タンパク質は、抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ融合タンパク質に匹敵する血清半減期を有する。一方で、ＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂの血清半減期は、抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ融合タンパク質よりも短い（図６）。血清半減期を表５に列挙する。
Figure 0007189211000010
ヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの特性評価
ヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの発現
ＡＳ０１２７４及びＡＳ０１２９９ ｓｄＡｂｓを、ヒト化用のために選択した。８つのヒト化ｓｄＡｂバリアントを、相同体モデルと復帰変異に基づいて生成した。ヒト化ｓｄＡｂバリアントには、フレームワーク領域１～４（表６）及び相補性決定領域１～３（表７）が含まれる。
Figure 0007189211000011
Figure 0007189211000012
８つのｓｄＡｂであるＡＳ０１２７４ＶＨａ、ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９、ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７、ＡＳ０１２９９ＶＨ４、ＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７、及びＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８を、Ｅ． ｃｏｌｉ周辺質発現ベクターｐＳＪＦ２Ｈ［１２］にサブクローニングした。Ｃ末端に６×ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグでそれぞれタグ付けされた８つのｓｄＡｂを、Ｅ． ｃｏｌｉで産生させ、ＩＭＡＣによって精製した（図７）。１ＬのＴＧ１培地から取得したｓｄＡｂ量を表８に列挙した。
Figure 0007189211000013
親和性決定
上述の８つのヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂを、ＳＰＲベースのバイオセンサーを使用して、その親ｓｄＡｂｓとともに、ヒトトランスフェリン及びカニクイザルトランスフェリンへの結合について分析した。結果を図８と９に示した。結合（ｋｏｎ）速度、解離（ｋｏｆｆ）速度、及び解離定数（ＫＤ）を、表９（ヒトトランスフェリン）及び表６（カニクイザルのトランスフェリン）に列挙した。
Figure 0007189211000014
Figure 0007189211000015
プロテインＡ結合能分析
２つのヒト化ｓｄＡｂの静的及び動的プロテインＡ結合能力を、１つのプロテインＡ結合抗ＨＳＡ ｓｄＡｂとともに分析した。パラメーターを表１１に列挙した。データは、２つのヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂのプロテインＡ結合能力が、抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ融合タンパク質と同様の静的及び動的タンパク質結合能力の挙動を有することを示した。
Figure 0007189211000016
ｓｄＡｂ ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９及びＡＳ０１２９９ＶＨ４の血清クリアランス
ＡＳ０１２７４ＶＨａ－Ａ４９ｓｄＡｂ融合タンパク質及びＡＳ０１２９９ＶＨ４ ｓｄＡｂ融合タンパク質を、血清クリアランス分析のために４～５ｋｇのカニクイザルに注射した。最初の投与後の血清ｓｄＡｂ融合タンパク質濃度を図１０に示した。計算された血清半減期を表１２に列挙した。データは、２つのヒト化抗トランスフェリンｓｄＡｂの血清半減期がヒト化後に影響を受けなかったことを示唆する。
Figure 0007189211000017
参考文献
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本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ヒト及びカニクイザルの血清トランスフェリンタンパク質及びプロテインＡ樹脂と特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含むポリペプチドであって、前記ｓｄＡｂはプロテインＡカラムによって精製でき、半減期の短いタンパク質またはフラグメントの半減期延長フラグメントとして使用できる、前記ポリペプチド。
[２] 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、以下を含む、実施形態１に記載の単離されたｓｄＡｂ：
（ａ）
ａ．配列番号４６～配列番号９０、及び
ｂ．配列番号４６～配列番号９０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、
ならびに／または
（ｂ）
ａ．配列番号１３６～配列番号１８０、及び
ｂ．配列番号１３６～配列番号１８０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸（複数可）の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ならびに／または
（ｃ）
ａ．配列番号２２６～配列番号２７０、及び
ｂ．配列番号２２６～配列番号２７０のアミノ酸配列と、４、３、２、もしくは１のアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
[３] 単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、実施形態１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[４] 配列番号３１６～配列番号３６０からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[５] ＡＳ０１２７４（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＱＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１６））、またはＡＳ０１２９９（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３３２））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５４））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５６））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５７））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５８））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ４（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５９））、またはＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３６０））のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[５] １０ －７ Ｍ以下の解離定数（Ｋ Ｄ ）を有する、実施形態１～４のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[６] 前記トランスフェリンがヒトトランスフェリンである、実施形態１～５のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[７] 前記トランスフェリンがカニクイザルトランスフェリンである、実施形態１～６のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[８] 前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、プロテインＡ樹脂に結合する、実施形態１～７のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[９] 前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、組換えにより産生される、実施形態１～８のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[１０] 実施形態１～９のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じたリンカーを含む、融合タンパク質であって、前記抗体またはそのフラグメントが、前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、前記リンカーは、前記抗体と前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを必要に応じて分離する、前記融合タンパク質。
[１１] 有効量の実施形態１０に記載の融合タンパク質及びトランスフェリンを含む組成物。
[１２] 実施形態１～１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質であって、プロテインＡ樹脂により精製できる、前記融合タンパク質。
[１３] 前記融合タンパク質中の前記標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、実施形態１０または１２に記載の融合タンパク質をカニクイザル血清中のトランスフェリンに曝し、それにより前記融合タンパク質中の前記標的タンパク質の半減期を増加させることを含む、前記方法。
[１４] 以下を含む、実施形態１０または１２に記載の融合タンパク質を産生する方法：
（ａ）前記融合タンパク質をコードする発現ベクターを取得すること、
（ｂ）前記発現ベクターを細胞に導入して組換え細胞を取得すること、
（ｃ）前記組換え細胞を前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で増殖させること、及び
（ｄ）前記組換え細胞またはその上清から前記融合タンパク質を取得すること。
[１５] 標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、
（１）融合タンパク質を取得することであって、前記融合タンパク質が、実施形態１～９のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、標的タンパク質、及び必要に応じたリンカーを含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合し、前記リンカーが、前記抗体と前記標的タンパク質のカルボキシルまたはアミノ末端とを必要に応じて分離する、前記取得することと、
（２）前記融合タンパク質をトランスフェリンに曝すことと、を含み、
前記トランスフェリンが、前記標的タンパク質単独と比較して、前記融合タンパク質中の前記標的タンパク質の半減期を増加させる、前記方法。
[１６] 前記曝すステップが、カニクイザルのトランスフェリンを含む血清に前記融合タンパク質を投与することを含む、実施形態１５に記載の方法。
[１７] 標的タンパク質の半減期を増加させるシステムであって、
（ａ）実施形態１～９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、及びリンカーをコードする第２のヌクレオチド配列をであって、前記第１及び第２のヌクレオチド配列が作動可能に連結されている、前記第１及び第２のヌクレオチド配列と、
（ｂ）宿主細胞と、
（ｃ）前記トランスフェリンと、を含む、前記システム。

Claims (15)

  1. ヒト及びカニクイザルの血清トランスフェリンタンパク質及びプロテインＡ樹脂と特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメントであって、前記ｓｄＡｂはプロテインＡカラムによって精製でき、半減期の短いタンパク質またはフラグメントの半減期延長フラグメントとして使用でき、前記ｓｄＡｂは、
    ＡＳ０１２７４（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＳＩＡＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＱＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＧＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＲＫＹＹＱＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３１６））、または
    ＡＳ０１２９９（ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３３２））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５４））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ａ４９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５６））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５７））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ３ａ－Ｍ７８（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＡＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５８））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ４（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＬＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５９））、または
    ＡＳ０１２９９ＶＨ４－Ｌ４７（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＡＴＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＲＳＧＳＴＮＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＤＹＳＳＲＹＹＨＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３６０））
    のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、
    ただし、前記ｓｄＡｂのＣＤＲ配列は改変されていない、
    前記単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. １０－７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１に記載の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメント。
  3. 請求項１又は２に記載の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
  4. 前記単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメントが、組換えにより産生される、請求項１～３のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメント。
  5. 請求項１、２および４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメント、及び標的タンパク質を含む、融合タンパク質であって、前記単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメントが、前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合されている、前記融合タンパク質。
  6. 前記融合タンパク質がさらにリンカーを含み、前記リンカーは、前記単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端とを分離する、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 請求項５又は６に記載の融合タンパク質であって、プロテインＡ樹脂により精製できる、前記融合タンパク質。
  8. 有効量の請求項５又は６に記載の融合タンパク質及びトランスフェリンを含む、組成物。
  9. 請求項５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、前記融合タンパク質をカニクイザル血清中のトランスフェリンに曝し、それにより前記融合タンパク質中の前記標的タンパク質の半減期を増加させることを含む、前記方法。
  10. 以下を含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法：
    （ａ）前記融合タンパク質をコードする発現ベクターを取得すること、
    （ｂ）前記発現ベクターを細胞に導入して組換え細胞を取得すること、
    （ｃ）前記組換え細胞を前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で増殖させること、及び
    （ｄ）前記組換え細胞またはその上清から前記融合タンパク質を取得すること。
  11. 標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、
    （１）請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント及び標的タンパク質を含む融合タンパク質を取得すること、ここで前記単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記標的タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に融合されている、並びに
    （２）前記融合タンパク質をトランスフェリンに曝すこと、
    を含み、前記トランスフェリンが、前記標的タンパク質単独と比較して、前記融合タンパク質中の前記標的タンパク質の半減期を増加させる、前記方法。
  12. 前記融合タンパク質が、さらにリンカーを含み、前記リンカーが、前記単一ドメイン抗体と前記標的タンパク質のカルボキシルまたはアミノ末端とを分離するものである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記曝すステップが、カニクイザルのトランスフェリンを含む血清に前記融合タンパク質を投与することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 標的タンパク質の半減期を増加させるシステムであって、
    （ａ）請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする第１の核酸と、
    （ｂ）宿主細胞と、
    （ｃ）前記トランスフェリンと、を含む、前記システム。
  15. （ａ）リンカーをコードする第２の核酸をさらに含み、前記第１及び第２の核酸が作動可能に連結されている、請求項１４に記載のシステム。
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