JP2023120208A - 補体成分c5または血清アルブミンと結合するポリペプチドおよびその融合タンパク質 - Google Patents
補体成分c5または血清アルブミンと結合するポリペプチドおよびその融合タンパク質 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2017年7月11日に出願された米国仮出願第62/531,215号の優先日の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体を本明細書に援用する。前述のASCIIコピーは2018年7月24日に作成され、ファイル名がAXJ-251PC_SL.txtであり、大きさは376,575バイトである。
本開示に従って用いる場合、以下の用語は、特に明記しない限り以下の意味を有すると理解されるものとする。文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。
域が複数の単一アミノ酸の変化(体細胞変異または超変異と呼ばれる)によってさらに修飾され、外来抗原に対する抗体の親和性が増す場合がある。定常領域は、抗原に対してさらに応答して変化することになる(すなわち、アイソタイプスイッチ)。したがって、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列および体細胞変異した核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を持たない場合があるが、実質的に同一または類似になる(すなわち、少なくとも80%の同一性を持つ)。
補体系は、体の他の免疫系と連動して、細胞性およびウイルス性病原体の侵入を防ぐ。補体タンパク質は少なくとも25種類存在し、これらは血漿タンパク質と膜補因子の複雑な集合である。血漿タンパク質は、脊椎動物の血清に含まれるグロブリンの約10%を占めている。補体成分は、複雑ではあるが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントで相互作用することにより、免疫防御機能を発揮する。こうして生じる補体カスケードは、オプソニック、免疫調節および溶解機能を備えた産物の産生につながる。
; Kroshus, T. et al., Transplantation, 60:1194-202, 1995; Homeister, J. et al., J. Immunol., 150:1055-64, 1993; Weisman, H. et al., Science, 249:146-51, 1990; Amsterdam, E. et al., Am. J. Physiol., 268:H448-57, 1995; and Rabinovici, R. et al., J. Immunol., 149:1744-50, 1992)。
ヒト血清アルブミン(HSA)に結合して治療関連タンパク質の半減期を延長できるポリペプチドが説明されている(国際公開第WO91/01743号、同第WO01/45746号、同第WO02/076489号)。しかしながら、記載のあるペプチド部分は細菌または合成起源のものであり、ヒトの治療薬に使用するには好ましくない。国際公開第WO04/041865号には、他のタンパク質(所望の標的に対する1つ以上の他の単一ドメイン抗体など)に結合して半減期を延長できる、血清アルブミン(特にHSA)に対する単一ドメイン抗体(sdAbまたはNanobodies(登録商標))について記載されている。
本明細書に記載されるのは、補体成分C5または血清アルブミンに結合するか、そうでなければ会合することができるIg配列、例えばIg可変ドメイン配列を有する改変ポリペプチドである。本明細書に記載の改変ポリペプチドは、改変ポリペプチドが血清アルブミン分子に結合またはそうでなければ会合する場合、FcRnへの血清アルブミン分子の結合が、ポリペプチドが結合していない場合の血清アルブミン分子のFcRnへの結合と比較して大幅に低減または阻害されることがないような状態で、血清アルブミンに特異的に結合することができる。本実施形態では、「大幅に低減または阻害することがない」とは、(例えば、SPRなどの適切なアッセイを使用して測定される)FcRnに対する血清アルブミンの結合親和性が、50%を超えて、あるいは30%を超えて、あるいは10%を超えて、あるいは5%を超えて減ることがないか、まったく減らないことを意味する。本実施形態において、「大幅に低減または阻害することがない」とは、血清アルブミン分子の半減期が大幅に短縮されないことも意味する。特に、改変ポリペプチドは、血清アルブミンのFcRnへの結合に関与しない血清アルブミン上のアミノ酸残基にすることができる。具体的には、改変ポリペプチド、例えば、ドメインIおよび/またはドメインIIの一部を形成する血清アルブミンのアミノ酸残基または配列に結合できる改変ポリペプチドは、血清アルブミンのドメインIIIの一部を形成しない血清アルブミンのアミノ酸残基または配列に結合できる。
本明細書に記載されるのは、アルブミンおよび補体成分C5に特異的に結合する改変ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ここでの改変ポリペプチドは直接融合されるか、1つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して結合される。本明細書で使用する場合、「ペプチドリンカー」という用語は、融合タンパク質の改変ポリペプチド間に挿入または含まれる1つ以上のアミノ酸残基をいう。ペプチドリンカーは、例えば、融合タンパク質の改変ポリペプチド間の分節部分に、配列レベルで挿入または含めることができる。リンカーにおけるアミノ酸残基の同一性と配列は、望ましい二次構造によって異なる。例えば、グリシン、セリン、アラニンは、最大限の柔軟性を持つリンカーに有用である。どのアミノ酸残基も、所望の特性によって必要に応じてより大きなペプチドリンカーを構築するために他のアミノ酸残基と同一であっても異なっていてもよい1つ以上の他のアミノ酸残基と組み合わせたリンカーと見なすことができる。他の実施形態では、リンカーは、GGGGAGGGGAGGGGS(配列番号102)である。他の実施形態では、リンカーは、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号103)である。本明細書に記載の融合タンパク質の作製に適した別のペプチドリンカーとして、例えば、G4S(配列番号104)、(G4S)2(配列番号105)、(G4S)3(配列番号106)、(G4S)4(配列番号107)、(G4S)5(配列番号108)、(G4S)6(配列番号109)、(EAAAK)3(配列番号110)、PAPAP(配列番号111)、G4SPAPAP(配列番号112)、PAPAPG4S(配列番号113)、GSTSGKSSEGKG(配列番号114)、(GGGDS)2(配列番号115)、(GGGES)2(配列番号116)、GGGDSGGGGS(配列番号117)、GGGASGGGGS(配列番号118)、GGGESGGGGS(配列番号119)、ASTKGP(配列番号120)、ASTKGPSVFPLAP(配列番号121)、G3P(配列番号122)、G7P(配列番号123)、PAPNLLGGP(配列番号124)、G6(配列番号125)、G12(配列番号126)、APELPGGP(配列番号127)、SEPQPQPG(配列番号128)、(G3S2)3(配列番号129)、GGGGGGGGGSGGGS(配列番号130)、GGGGSGGGGGGGGGS(配列番号131)、(GGSSS)3(配列番号132)、(GS4)3(配列番号133)、G4A(G4S)2(配列番号134)、G4SG4AG4S(配列番号135)、G3AS(G4S)2(配列番号136)、G4SG3ASG4S(配列番号137)、G4SAG3SG4S(配列番号138)、(G4S)2AG3S(配列番号139)、G4SAG3SAG3S(配列番号140)、G4D(G4S)2(配列番号141)、G4SG4DG4S(配列番号142)、(G4D)2G4S(配列番号143)、G4E(G4S)2(配列番号144)、G4SG4EG4S(配列番号145)および(G4E)2G4S(配列番号146)があげられる。当業者は、例えば、翻訳後修飾、例えばグリコシル化、例えばキシロシル化を低減または排除するために、リンカーを選択することができる。実施形態によっては、融合タンパク質は、少なくとも2つのsdAb、Dab、VHH抗体、VHH抗体フラグメントまたはそれらの組み合わせを含み、sdAb、Dab、VHH抗体またはVHH抗体フラグメントの少なくとも1つはアルブミンに対するものであり、sdAb、Dab、VHH抗体またはVHH抗体フラグメントのうちの1つは補体成分C5に対するものであるため、得られる融合タンパク質は多価または多重特異性になる。結合ドメインまたは部分は、例えば、HSA、カニクイザル血清アルブミン、ヒトC5および/またはカニクイザルC5に対するものにすることができる。
もうひとつの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するか、そのようなアミノ酸配列からなる改変ポリペプチドを提供する。もうひとつの実施形態では、本開示は、任意に1つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して、少なくとも1つの治療部分または標的部分に結合される本開示の少なくとも1つの改変ポリペプチドを含むか、少なくとも1つのそのような改変ポリペプチドからなる融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質を提供する。
注射による一次注射から開始し、続いて二次のブーストを起こしてラマを免疫した。簡単に説明すると、ヒト補体タンパク質C5を500μg用いて一次免疫を開始し、その後、2週目(追加免疫1)、4週目(追加免疫2)、8週目(追加免疫3)、12週目(追加免疫4)に、ヒト補体タンパク質C5抗原500μgでの追加免疫を施した。血清力価をELISAで測定したところ、力価は追加免疫3の後が最大で、1:1,000,000希釈で採血前シグナルよりも10倍大きいことが明らかになった。追加免疫3の後の血液試料から、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。トリパンブルー染色により、細胞生存率が98%であることが明らかになった。PBMCの単離直後に、RNA溶解バッファーで細胞を溶解した。全RNAをPBMCから単離し、ラマ重鎖特異的プライマーを使用してcDNAを合成した。ゲル電気泳動でVH(従来の重鎖)フラグメントからVHH(重鎖のみ)フラグメントを分離した。これらのVHHフラグメントをpADL-10b(Antibody Design Labs,カリフォルニア州サンディエゴ)にクローニングし、DNAライブラリーでTG1細胞を形質転換した。114のコロニーを無作為に配列決定したところ、101(89%)の正しい配列が得られた。このライブラリーを掻爬し、25%グリセロールに懸濁後、-80℃で保存した。
抗ヒト補体タンパク質C5 VHHドメインライブラリーを含むTG1細胞を、カルベニシリン100μg/mLおよび2%グルコースを含む2×YT培地で、37℃で対数期(OD600=0.4~0.8)まで増殖させた。これらの細胞に、振盪ありまたは振盪なしで、37℃で30分間、M13K07ヘルパーファージを感染させた。感染細胞を4000×gで10分間処理してペレット化し、カルベニシリン100μg/mL、カナマイシン50μg/mLおよび1mM IPTGを含む2×YT培地に再懸濁し、30℃および250rpmでの一晩培養によってバクテリオファージを増殖させた。この一晩培養物を4℃で10分間、9000×gで遠心し、氷上で1時間インキュベーションすることにより、ファージを1/5容量のPEG NaCl溶液[20%ポリエチレングリコール6000、1.5M NaCl]で沈降させた。ファージ粒子を4℃で15分間、9000×gで遠心してペレット化し、上清を廃棄した。ファージ粒子をスーパーブロックブロッキングバッファーに再懸濁し、マイクロ遠心チューブにて7500×gで10分間の遠心によって細胞片をペレット化した。ファージ粒子を含む上清を新しいチューブに移し、上述したようにしてファージを再沈殿させた。濃縮されたファージ粒子を70℃で1時間加熱を試みた。加熱前後のファージの力価を、対数期のTG1細胞による感染と、カルベニシリン100μg/mL、カナマイシン50μg/mLおよび2%グルコースを含有する2×YT寒天培地への播種によって決定した。
代表的な抗C5 VHHドメインを哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングし、Expi293F細胞においてVHH-Hisタグ融合体として発現させた。細胞生存率が50~60%に低下したら、培養上清を回収した。この上清をSDS-PAGEで還元条件下にて分析した後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Octet(ForteBioInc.)装置でバイオレイヤー干渉法を使用して、発現レベルを計算した。AKTA(GE Healthcare)での固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)によって、His-タグを付加したVHHドメインを培養上清から精製した。
補体成分C5に対する結合分析 Octet(ForteBio Inc.)装置でバイオレイヤー干渉法を使用して、代表的な抗C5 VHHドメインの配列を決定し、特徴を解析し、ヒト
、カニクイザル(cyno)およびマウスのC5タンパク質への結合について評価した。発現させたVHH-Hisドメインの細胞培養上清を2×カイネティクス緩衝液で濃度20μg/mLに標準化し、抗ペンタHIS(HIS1K)バイオセンサーチップ(ForteBio Inc.)に300秒間かけて捕捉して、センサーチップを完全に飽和させた。次に、飽和したチップを、別々の実験でそれぞれ600秒間、2×カイネティクス緩衝液に50nMの可溶性C5(ヒト、カニクイザルまたはマウス)を加えた溶液に曝露した後、600秒間かけて2×カイネティクス緩衝液に解離させた。ヒトのC5(hC5)またはカニクイザルのC5(cC5)に対する結合が認められたVHHドメインには、表1に「+」の印を示してある。
((A415試料-A415溶血なし)/(A415完全溶血-A415溶血なし))×100
式中、A415試料は試料抗体の415nmでの吸光度であり、A415溶血なしは溶血なしの対照(20mM EDTA)の415nmでの吸光度であり、A415完全溶血は完全溶血対照の415nmでの吸光度である。結果を図1に示す。
カニクイザルC5との交差反応性に基づいて抗C5 VHHドメインに優先順位を付け、8例の精製抗C5 VHHドメインをBiacoreによるアフィニティ分析の対象とした。最初の候補8例のヒトC5とカニクイザルC5への結合の動力学的パラメーターを表2に示す。8例のアフィニティ分析候補から、5つの抗C5ドメイン(LCP0115、LCP0143、LCP0146、LCP0296およびLCP0302)を選択し、ヒトC5およびカニクイザルC5に対する適合した親和性に基づく以後の分析用に優先順位を付けた。
優先順位を付けた5つの抗C5 VHHドメイン(LCP0115、LCP0143、LCP0146、LCP0296およびLCP0302)を、ラマ配列との配列類似性を持つヒト生殖細胞へのCDR移植によってヒト化した。CDRは、IMGTとKabatでの定義の中で、より高いアミノ酸位置の一致率に基づく。VHHドメインの安定性を維持するために、ラマFR2ホールマーク残基には復帰突然変異を起こさせた。ヒト化バリアントをExpi293細胞で発現させ、バイオレイヤー干渉法を用いてヒトC5への結合を試験した。
アルブミンは、血清に豊富に含まれるタンパク質であり、糸球体濾過バリアによる濾過によって除去されないだけの十分な分子量を持つ。細胞内分解による血清からのアルブミン除去は、低pHで生じるFcRnとアルブミンとの相互作用によって阻害される。この相互作用により、アルブミンFcRn複合体が形質膜に戻され、形質膜で血液の中性寄りのpHに曝露されると、アルブミンが放出されて血中に戻る。
抗C5 VHHドメインおよび抗HSA VHHドメインについて、免疫したラマのB細胞から免疫バイアスVHH抗HSAファージディスプレイライブラリを作製した。HSAに対するエンドポイント力価が1,000,000を超えたら、PBMCを回収し、RNAを単離し、VHH領域を遺伝的に単離した。実施例2~4の抗C5 VHHドメインで詳細に説明したように、これらの抗HSA VHH配列をpIII融合ファージミドにクローニングし、6×108個の独立したクローンのライブラリーを得た。標準的なファージディスプレイパニング技術を使用して、HSAおよびCSA(カニクイザル血清アルブミン)に対して反応性のVHHドメインを選択した。3ラウンドのパニングの出力を、ELISAおよびサンガーシーケンスで分析した。並行して、次世代シーケンシング(NGS)を使用して、元のライブラリー内の配列の集団、またはパニングによって富化された配列の集団を調べた。合計約1000個のクローンを分離し、これらの方法を使用して分析した。
を得た。PBMCの全RNAをフェノール/クロロホルム抽出で精製した後、シリカスピンカラムで精製し、RNaseフリー水で全RNAを溶出した。OD260/280比を決定し、アガロースゲル電気泳動により、RNAの品質を評価した。ラマ重鎖特異的リバースプライマーを使用してcDNAを合成した。ゲル電気泳動により、VH(従来の重鎖)フラグメントからVHH(重鎖のみ)フラグメントを分離した。
上記の方法論を使用して選択されたVHH配列を、N末端シグナルペプチドおよびC末端6×Hisタグ(配列番号324)で合成し、哺乳動物の発現コンストラクトにクローニングした。GeneBlocks(Integrated DNA Technologies)の合成および標準的な哺乳動物発現ベクターへの挿入クローニングによって、公開されたMSA21 VHHドメイン(国際公開第WO2004/062551号A2)および個々のクローンの遺伝子修飾バージョン(脱グリコシル化またはヒト化)を調製した。これらのコンストラクトを293expi細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの96時間後に上清を回収した。上清をPBSで透析し、標準的なクロマトグラフィー法を使用してVHH-Hisタンパク質を精製した。精製タンパク質をPBSに緩衝液交換し、ODおよび吸光係数を使用して定量化した。
293 expi発現系で産生されたタンパク質および112のVHH配列について、哺乳動物の発現ベクターを作製した。まず、VHH配列をSDS PAGEおよびクーマシー染色によって分析し、既知の標準に対するおおよその濃度を決定した。次に、上清濃度を標準化し、Octet HTX(Pall/ForteBio)でバイオレイヤー干渉測定を行った。ペンタHisセンサーをカイネティクス緩衝液に60秒間曝露し、ベースライン測定値を確立した。次に、センサーにVHH-His含有上清を300秒間ロードした後、カイネティクス緩衝液中120秒間で2番目のベースラインを確立した。次に、チップをカイネティクス緩衝液中100nM HSAまたはCSAとともに600秒間インキュベーションし、さらに600秒間で解離を測定した。
Biacore 3000装置でSPRを使用して、HSAまたはCSAに対するVHHドメインHAS040およびHAS041の結合動態を決定した。デオキシリボオリゴヌクレオチドを含むビオチンCAPture試薬で飽和したCAPチップ(GE Healthcareから入手)にビオチン化アルブミンを捕捉した。精製VHHドメインの濃縮物を、流量50μL/分で5分間注入した。VHHドメイン1つあたり3つの濃縮物を評価した。結合した検体を600秒間で解離させた。濃縮のつど、6M塩酸グアニジン/0.25M NaOHを10μL/分で2分間注入することにより、チップ表面を再生した。1:1のラングミュアモデル(ローカルRmaxおよび定数RI)および二重参照減算(試料濃縮サイクルからの緩衝液濃縮サイクルの減算および並行参照フロー細胞の減算)を使用して、HBS-EP緩衝液中pH7.4およびpH6.0で反応動態を決定した)。MSA21 VHHドメイン(国際公開第WO2004/062551号A2)(配列:
LEQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVSGISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLNPGGQGTQVTVSS(配列番号322)
を調製し、これらのアッセイにおけるコンパレーターとして使用した。
エンドサイトーシス小胞からのアルブミンのリサイクルは、FcRnとの相互作用によってなされる。したがって、VHHがHSAとFcRnの相互作用を妨げるか否かを判断することが重要であった。HAS040およびHAS041 VHHドメインがFcRnと同一のエピトープに結合するか否かを判断するために、抗HSA VHHドメインで飽和したHSAへのFcRnの結合を、HBS-EP緩衝液中pH6.0でBiacore 3000装置にて分析した。HSAをCM5チップに直接固定して、アミンカップリングを使用して250RU(共鳴ユニット)の目標密度に達した。VHHドメインを約1~10μg/mLに希釈し、注入して飽和状態にした(50μL/分で3分間)。ある濃度のFcRnをHSA:VHH表面に注入し、50μL/分で5分間の反応動態を得た。再生前に180秒間、解離させた。100μL/分で25mM NaOHを20μL注入することで、チップ表面を再生した。1:1のラングミュアモデル(ローカルRmaxおよび定数RI)および二重参照減算(試料濃縮サイクルからの緩衝液濃縮サイクルの減算および並行参照フロー細胞の減算)を使用して、反応動態を決定した。
抗C5 VHHドメインを抗アルブミンドメインに融合し、二重特異性分子を作製した。4通りのリンカー長(G4S)3(配列番号106)、(G4S)4(配列番号107)、(G4S)5(配列番号108)および(G4S)6(配列番号109)および抗アルブミンドメインの2つの異なる向き(N末端またはC末端)を評価した。コンストラクトをHEK293F細胞で発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の融合分子を、Biacore実験で評価した。ヒトC5をビオチン化してbiacoreチップに固定し、精製後の二重特異性分子を注入してチップを飽和させた後、3通りの濃度のヒト血清アルブミンを注入して反応動態を求めた。ヒト血清アルブミンに対する実測親和性を、異なるリンカー長を比較するためのプロキシとして使用した。(G4S)3(配列番号106)を、二重特異性融合を生成する最適なリンカー長として選択した。N末端またはC末端の抗アルブミン融合体も同じ実験で評価した。異なる向きが、異なる抗C5 VHHドメインに最適であることが明らかになった。表9では、コンストラクトのN対C末端の向きをコンストラクト名の下に記載し、(C5/HSA)は抗C5ドメインが抗HSAドメインのN末端に位置することを示す。同様に、(HSA/C5)は、抗HSAドメインが抗C5ドメインのN末端に位置することを示す。
カニクイザルに精製タンパク質を10mg/kgで静脈内投与または皮下投与した。被験物質ごとに各用量群3匹のサルを使用した。各コンストラクトに対するシグネチャペプチドを使用したLC MSベースの定量によって、二重特異性分子の薬物動態特性を測定した。PKプロファイルを図6に示し、パラメーターを表11に記載しておく。
HAS042(配列番号26)アルブミン結合ドメインおよびCRL0305(配列番号11)ヒト化抗C5 VHHを使用して、コンストラクトを作製した。評価したコンストラクトを表13にあげておく。
抗C5 VHHドメインLCP0115、LCP0143、LCP0146、LCP0302のすべてのCDRでヒスチジンスキャンを実施した。CDRの各位置で、単一のヒスチジン置換を行った(太字の下線付きテキストで表示)。バリアントをExpi293細胞培養でトランスフェクトし、pH7.4、6.0および5.5でのpH依存性結合を評価した。抗体ごとにいくつかのバリアントがpH依存性の結合を示した。これらのバリアントを表16に列挙し、それらのpH依存性結合応答を図11A~図11Dに示す。
抗C5 VHHドメインを抗アルブミンドメインに融合し、二重特異性分子を作製した。4通りのリンカー長(G4S)3(配列番号106)、(G4S)4(配列番号107)、(G4S)5(配列番号108)および(G4S)6(配列番号109)および抗アルブミンドメインのおよび抗アルブミンドメインの2つの異なる向き(N末端またはC末端)を評価した。作製した分子の配列を表18に示す。コンストラクトをHEK293F細胞で発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の融合分子を、Biacore実験で評価した。ヒトC5をビオチン化してbiacoreチップに固定し、精製後の二重特異性分子を注入してチップを飽和させた後、3通りの濃度のヒト血清アルブミンを注入して反応動態を求めた。ヒト血清アルブミンに対する実測親和性を、異なるリンカー長を比較するためのプロキシとして使用した。(G4S)3(配列番号106)を、二重特異性融合を生成する最適なリンカー長として選択した。N末端またはC末端の抗アルブミン融合体も同じ実験で評価した。異なる向きは、異なる抗C5 VHHドメインに最適であることが明らかになった。
カニクイザルに精製タンパク質を10mg/kgで静脈内投与または皮下投与した。被験物質ごとに各用量群3匹のサルを使用した。各コンストラクトに特異的なシグネチャペプチドを使用したLC MSベースの定量アッセイによって、二重特異性分子の薬物動態を測定した。PKプロファイルを図6Aおよび図6Bに示し、パラメーターを表20に記載しておく。
本出願で引用した参考文献を、いずれも明示的に本明細書に援用する。
Claims (31)
- ヒト補体成分C5に特異的に結合する改変ポリペプチドと、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、
ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記改変ポリペプチドが、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドに、直接またはペプチドリンカーを介して融合されている、融合タンパク質。 - ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドのC末端残基は、ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記ポリペプチドのN末端残基に直接またはリンカーを介して融合される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記ポリペプチドのC末端残基は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドのN末端残基に、直接またはリンカーを介して融合される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号1~12およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号22~34およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記ポリペプチドは配列番号11のアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは配列番号26のアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 配列番号102または103のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをさらに含む、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーは、配列番号102のアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 配列番号96~101からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一の配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 配列番号96~101からなる群から選択される配列からなる、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 配列番号96のポリペプチド配列からなる、請求項9に記載の融合タンパク質。
- ヒト補体成分C5に特異的に結合する前記ポリペプチドは、3つの相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1は配列番号13~17のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含み、CDR2は配列番号18または19のアミノ酸配列を含み、CDR3は配列番号20または21のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは、3つの相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1は配列番号35~43のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含み、CDR2は配列番号44~51のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含み、CDR3は配列番号52~63のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒト補体成分C5またはアルブミンに結合する前記ポリペプチドのうちの一方または両方は、pH依存的な形で結合する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 治療有効量の、請求項1~13のいずれか1項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
- ヒアルロニダーゼをさらに含む、請求項14に記載の医薬組成物。
- 請求項1~13のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子。
- 請求項16に記載の前記核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項16に記載の前記核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
- 請求項17に記載の前記発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項19に記載の単離された宿主細胞。
- 配列番号1~12からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する、ヒト補体成分C5に結合する改変ポリペプチド。
- 配列番号1~12およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項21に記載の改変ポリペプチド。
- 配列番号22~34のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチド。
- 前記改変ポリペプチドは、配列番号22~34およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項23に記載の改変ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、3つの相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1は配列番号35~43からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CDR2は配列番号44~51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CDR3は配列番号52~63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の改変ポリペプチド
- 前記ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン上のAlb1と同じエピトープに特異的に結合する、請求項22に記載の改変ポリペプチド
- 請求項1~13のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも1つの核酸分子を宿主細胞で発現させることを含む、前記融合タンパク質を作製するための方法。
- (a)ラベルを含む容器と、
(b)請求項1~13のいずれか1項に記載の前記融合タンパク質を含む組成物と、を含み、
前記ラベルは、前記組成物が補体による障害のある患者またはそのような障害が疑われる患者に投与される組成物であることを示す、治療用キット。 - ヒアルロニダーゼをさらに含む、請求項28に記載のキット。
- 補体による障害を有する患者を治療するための方法であって、請求項1~13のいずれか1項に記載の融合タンパク質を治療有効量で前記患者に投与することを含む、方法。
- 前記補体による障害は、関節リウマチ、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流障害、非定型溶血性尿毒症症候群、膜性増殖性糸球体腎炎II型、発作性夜間血色素尿症、黄斑変性、HELLP症候群、ギランバレー症候群、CHAPLE症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管障害症(HSCT後TMA)、骨髄移植後TMA(BMT後TMA)、デゴス病、ゴーシェ病、糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自然流産、寡免疫性の血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症(MS)、外傷性脳損傷および心筋梗塞、心肺バイパス、血液透析に起因する損傷からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
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