JP2022528230A - Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用 - Google Patents

Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022528230A
JP2022528230A JP2021557128A JP2021557128A JP2022528230A JP 2022528230 A JP2022528230 A JP 2022528230A JP 2021557128 A JP2021557128 A JP 2021557128A JP 2021557128 A JP2021557128 A JP 2021557128A JP 2022528230 A JP2022528230 A JP 2022528230A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
chain variable
variable region
antibody
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021557128A
Other languages
English (en)
Inventor
ティンティン ウー
ハオ リー
シュン リウ
ウェイカン タオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd, Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Publication of JP2022528230A publication Critical patent/JP2022528230A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本出願は、IL-5に対する抗体を含む医薬組成物及びその使用を開示する。特に、本出願は、緩衝液中にIL-5抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を開示する。さらに、医薬組成物は、糖類及び非イオン性界面活性剤をさらに含む。【選択図】なし

Description

本開示は、薬品配合の分野に属し、特に、抗IL-5抗原結合断片を含む医薬組成物及びIL-5関連病気のための診断的及び治療剤と同様の使用に係る。
本明細書は、本開示に関連する背景情報のみを提供するものであり、必ずしも先行技術を構成するものではない。
インターロイキン‐5(IL‐5)は、T細胞置換因子(TRF)、B細胞増殖因子‐II(BCGF‐II)、IgA増強因子(IgA‐EF)、または主にヘルパーT細胞2(Th2)によって分泌されるホモ二量体糖蛋白質である好酸球分化因子(EDF)としても知られるインターロイキン家庭の重要なメンバーの1つである。ヒトIL-5は、22のアミノ酸から構成されるシグナルペプチドと2つのグリコシル化部位を含む134のアミノ酸残基から構成されている。活発なIL-5はオリゴダイマーの形成であり、反平行配置における2つのペプチド鎖はジスルフィド結合によって結合される。
一方、IL-5モノマーは生物学的活性を持たない(Adv Immunol. 1994; 57:145-90)。
好酸球(EOS)は、アレルギー反応に関係するアレルギー疾患を含む、肺の様々な炎症性疾患に関係する。喘息は慢性呼吸器炎症性疾患である。世界中に約3億人の患者がおり、発生率は10%である。喘息の病因は様々なサイトカインに関連している。IL‐5とレセプターIL‐5Rは、喘息の病因において重要な役割を果たしている。現在、喘息を治療する最も効果的な方法は、鼻または経口経路によりステロールを投与し、喘息に関与するいくつかの重要なメディエーター(IL-5を含む)の式を阻害し、それにより肺の炎症を減少させることである。しかし、長期にわたるステロイド剤の使用は多くの副作用を持つ。したがって、喘息治療のための新規な医薬標的を見出すことが必要である。抗IL-5抗体の投与により、IL-5のレセプターへの結合が阻害されること、肺への好酸球の集積が有意に抑制されること、血液、組織及び喀痰中の好酸球量が低下すること、好酸球を介した炎症反応が低下すること、肺機能が改善すること、厳しい好酸球性喘息及び再発性喘息に対して良好な効果を示すことが試験で示されている(Drugs. 2017年5月、77(7)、777-784)。
反ボディエージェントは、大きな分子重量と複雑な構造を持っている。製造、輸送、保管の過程で、しばしば、変性、集積、汚染および粒子の形成による問題に遭遇する。このような効果を維持するためには、製造、浄化、輸送、貯蔵の際にも、その生物学的活性を維持しなければならない。現在、多くの高度に精製されたモノクローナル抗生物質を製造するために、製造と精製のための新しい技術が開発されている。しかしながら、輸送・保管時の安定化や、行政に適した量を提供する方法は常に課題となっている。
抗IL-5抗体については、GSKのメポリズマブおよびテバファーマのレスリズマブのみが現在市販承認されている。関連特許は、WO2018119016、WO2017033121、WO2014141149、WO2016040007、WO2015095539、WO2012138958、及びWO9535375等を含む。
本開示は、緩衝剤またはその抗原結合フラグメントを、IL-5抗菌またはその抗原結合フラグメントから成る医薬品組成を提供する。緩衝剤は、酢酸ナトリウム、スクシニン酸ナトリウム、ヒスチジン酸ナトリウム、塩酸塩とクエン酸ナトリウム緩衝剤から成る群から選択されるものであり、好ましくは酢酸ナトリウム・酢酸ナトリウムまたはスクシニン酸ナトリウム・サクシネート緩衝剤から成る群から選ばれたものであり、ここで、抗IL-5抗菌または抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、以下のようなものを提供する。
(i)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:16、17、18に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:19、20および21に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる。
(ii)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:22、23、24に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:25、26、27に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(iii)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:28、29、30に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなり、
軽鎖可変領域はアミノ酸配列SEQ ID NO:31、32、33に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(iv)重鎖可変領域は、SEQ ID NO:34、35、36に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38および39に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる。
(v)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:40、41、42に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:43、44、45に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(vi)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:34、82、36に示すように、HCDR1、HCDR2、HCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38、39に示すように、LCDR1、LCDR2、LCDR3からなる。
別の実施態様において、医薬品組成の緩衝剤のpHは、約5.0～6.5、好ましくは約6.5～6.5、好ましくは約5.0～6.0、好ましくは5.5～6.0、好ましくは5.0～5.5、好ましくは5.0～5.8、好ましくは5.2～5.8、緩衝剤の非限定的なpHの例は、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、好ましくは5.5、約6.5、好ましくは5.6、約5.7、約5.8、好ましくは6.0、約6.5、好ましくは5.5である。
別の実施態様において、薬組成の緩衝剤の濃度は、約10mMから約40mM、約10mMから約30mM、好ましくは、約25mMから約30mM、好ましくは、約10mMから約25mM、好ましくは、約15mMから約25mM、好ましくは、約20mMから約25mM、好ましくは、約20mMから約25mM、好ましくは、約10mMから約15mM、好ましくは、約10mMから約15mM、好ましくは、約15m15mM、緩衝液の濃度の無制限例は、約10mM、約12mM、約16mM、約18mM、約20mM、約22mM、約24mM、約26M、約28mM、約30mM、約34mMである。
代替の実施形態では、医薬組成物中の抗IL-5抗体またはその抗原結合断片の濃度は、約1mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約1mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約10mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約20mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約30mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約40mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約50mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約60mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約80mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約90mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約100mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約110mg/ml～約120mg、約30mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約30mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約40mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約60mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約80mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約90mg/ml～約100mg/mlである。
非限定的な例として、抗IL-5抗体またはその抗原結合断片の濃度は、約80mg/ml、約85mg/ml、約90mg/ml、約90mg/ml、約91mg/ml、約92mg/ml、約93mg/ml、約94mg/ml、約95mg/ml、約96mg/ml、約97mg/ml、約98mg/ml、約99mg/ml、約100mg/、約101mg/ml、約102mg/ml、約103mg/ml、約104mg/ml、約105mg/ml、約106mg/ml、約107mg/ml、約108mg/ml、約109mg/ml、約110mg/ml、約115mg/ml、約120mg/ml、および最も好ましくは約100mg/mlである。
別の実施例では、ポリソルベート20、ポリオキシアルキレン、タウリル・スルベタイン、ナトリウム・ラウリル・スルベタイン、リリル・スルベタイン、ステアリル・スルフォベタイン、ラリル・スルベタイン、ラリル・スルボベタイン、ミリリル・サリシン、ステアリル・サリシン、リノリル・ベタイン、セチル・ベタイン、コカミドロピル・ベタイン、ミリスタミドロピル・ベタイン、パリミタミドロピル・ベタイン、イソステアミドロピル・ベタインからなる群から選ぶことができるパルマミドプロピル・ジメルアミン、アルコールナトリウム、アルコール・オレオイル・タウラン、ポリプロピレン・グリコール、エチレン・プロピレン・グリコールなどである。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80又はポリソルベート20であり、より好ましくはポリソルベート80である。
代替的な実施形態では、医薬組成物中のポリソルベート80の濃度は、非限定的な例として、約0.05mg/ml～約0.6mg/ml、好ましくは約0.1mg/ml～約0.6mg/ml、好ましくは約0.2mg/ml～約0.6mg/ml、好ましくは約0.3mg/ml～約0.6mg/ml、好ましくは約0.4mg/ml～約0.6mg/ml、好ましくは約0.5mg/ml～約0.2mg/ml、好ましくは約0.3mg/ml～約0.5mg/ml、好ましくは約0.3mg/ml～約0.5mg/ml、好ましくは約0.4mg/ml～約0.5mg/mlであり、0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、約0.45mg/ml、約0.5mg/ml、約0.55mg/ml、約0.6mg/ml、および最も好ましくは約0.4mg/mlである。
さらに、代替の実施形態において、医薬組成物は、賦形剤をさらに含み、賦形剤は、安定剤から選択される。
スタビライザーが糖類又はアミノ酸から選択される別の実施例において、糖類をスクロース、トレハロース、マンニトール及びソルビトール、好んでスクロースからなる群から選択することができる。アミノ酸は、グリシン、メチオニン、プロリンからなるグループから選ばれている。
代替的な実施形態において、糖類の濃度は、約50mg/ml～約80mg/ml、好ましくは約60mg/ml～約80mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約80mg/ml、好ましくは約75mg/ml～約80mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約75mg/mlであり、非限定的な例として、医薬組成物中の安定剤の濃度は、約70mg/ml、約71mg/ml、約72mg/ml、約73mg/ml、約74mg/ml、約75mg/ml、約76mg/ml、約77mg/ml、約78mg/ml、約79mg/ml、約80mg/ml、およびより好ましくは約72mg/mlである。
代替の実施形態では、アミノ酸の濃度は約8mg/mlである。
別の実施態様において、医薬品組成は、以下を構成する。
(a)抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント約1mg/ml～約120mg/m、(b)pH約10mM～約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、約5.0～6.5、および(c)ポリソルベート80約0.1mg/ml～約0.6mg/mlである。
別の実施態様において、医薬品組成は、以下を構成する。
(a)抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント約80mg/ml～約100mg/m、(b)pH約10mM～約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、約5.0～約6.0、および(c)ポリソルベート80約0.1mg/ml～約0.4mg/mlである。
別の実施態様において、医薬品組成は、以下を構成する。
(d)約80mg/ml～約120mg/mlのIL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、(e)約10mM～約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、pHは約5.0～約5.8、(f)約0.2mg/ml～約0.6mg/mlのポリソルベート80、および(g)約70mg/ml～約75mg/mlのショ糖、好ましくは、医薬組成物は、好ましくは、含む。
(h)約100mm/mlのIL-5OOC又はそれらの抗原結合フラグメント、(i)約30mMの酢酸ナトリウム・酢酸緩衝液、pHは約5.5、(j)約0.4mm/mlのポリソルベート80及び(k)約72mm/mlのスクロースである。
いくつかの好ましい態様において、本開示の医薬組成物中の抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントは、ネズミ抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
代替の実施例では、薬品組成中の人間化された抗IL-5型は、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるように、重鎖可変領域を含んでおり、その変形は、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるように、重鎖可変領域における1～10のアミノ酸バック・突然性を含んでいる。
代替の実施例において、変形は、以下から構成される群から選ばれたものに示されるような変形である。
(i)SEQ ID NO:49に示されるように重鎖可変領域のS49T、V93TおよびK98Sからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種
(ii)SEQ ID NO:57に示される重鎖可変領域のS49T、V93T、およびK98Tからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変わり
(iii)SEQ ID NO:63に示されるように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74KおよびL83Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種
(iv)重鎖可変領域のF29I、R38K、V48I、R72A、およびT97Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・変異からなる変形例であり、SEQ ID NO:69および/またはCDRにおけるN55Vの変性、又は
(v)SEQ ID No:75に示されているように重鎖可変領域において、R38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83FおよびD89Eからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・変異からなる変種
別の実施態様において、医薬品組成中の人間化された抗IL-5抗菌液は、以下を含む。
SEQ ID NO:50又は51に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:58又は59に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:64、65及び66からなる群から選択したいずれかの群から選択したような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:70又は71に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:76、77、78及び79からなる群から選択したいずれかの群から選択した重鎖可変領域。
代替の実施例では、薬品組成中の人間化された抗IL-5抗異性体は、SEQ ID NO:46、54、60、67又は72に示されるように軽鎖可変領域を含み、その変形は、SEQ ID NO:46、54、60、67又は72に示されるように軽鎖可変領域中の1～10のアミノ酸バック・突然性を含んでいる。
当該変形例が、構成される群から選択されたものに示される変形例である代替実施において、当該変形例は変形例である。
(i)SEQ ID NO:46に示される軽鎖可変領域のA43S、L47V、G66R、T69S、F71YおよびY87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種
(ii)SEQ ID NO:54に示される軽鎖可変領域のA43S、L47M、F71Y、Y87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種
(iii)SEQ ID NO:60に示されている軽鎖可変領域のE1D、I2T、I57V、V84TおよびY86Fからなる群から選択されたアミノ酸のバック突然変わり、またはそれらの組合せ
(iv)SEQ ID NO:67に示される軽鎖可変領域で、M4L、A42S、L45PおよびL46Wからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・突然変わりおよび、
(v)SEQ ID NO:72に示されているように、軽鎖可変領域でA43S、I48VおよびF71Yから成るグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・突然変異
別の実施態様において、医薬品組成中の人間化された抗IL-5抗菌液は、以下を含む。
SEQ ID NO:47または48に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:55または56に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:61または62に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:68に示された軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:73または74に示された軽鎖可変領域
別の実施態様において、医薬品組成中の人間化された抗IL-5抗菌液は、以下を含む。
(i)SEQ ID NO:49、50、51のいずれかに示されるように、重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:49、50、51のいずれかで95%の配列同一性を持ち、および
SEQ ID NO:46、47、48のいずれかで示されるように、軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:46、47、48のいずれかで示されるように、95%の配列同一性を持ち、
(ii)SEQ ID NO: 57、58、59のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:57、58、59のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような重鎖可変領域、および
SEQ ID NO:54、55および56のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:54、55および56のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような軽鎖可変領域、
(iii)配列番号63、64、65および66のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域、または配列番号63、64、65および66のいずれか1つと95%の配列同一性を有し、および
配列番号60、61および62のいずれか1つに示されるような軽鎖可変領域、または配列番号60、61および62のいずれか1つと95%の配列同一性を有し、
(iv)SEQ番号69、70、71のいずれかに示されるような重鎖可変領域、あるいはSEQ番号69、70、71のいずれか1つのいずれかとの95%の配列同一性を持つ領域、および
SEQ ID NO:67と68のどれかに示されているような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:67と68のどれか1つとの95%の配列同一性を持つ領域、または
(v)SEQ番号75、76、77、78および79のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ番号75、76、77、78および79のいずれかのいずれかとの95%の配列同一性を有し、および
SEQ ID NO:72、73、74のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:72、73、74のいずれか1つとの95%の配列同一性を有し、できれば、人間化された抗IL-5は
(a)SEQ ID NO:51に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:47に示すような軽鎖可変領域
(b)SEQ ID NO:65に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:62に示すような軽鎖可変領域
(c)SEQ ID NO:58に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:56に示すような軽鎖可変領域
(d)SEQ ID NO:71に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:68に示すような軽鎖可変領域、または
(e)SEQ ID NO:79に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:73に示すような軽鎖可変領域
上記のような少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、より好ましくは97%、98%または99%以上の配列同一性を有し、最も好ましくは少なくとも99%以上の配列同一性を有し、上記のような少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、突然変異によって得られた1つ以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含む。
代替の実施形態では、医薬組成物中の抗IL-5抗体は、ヒト抗体定常領域、好ましくは配列番号52に示されるようなヒト抗体重鎖定常領域および配列番号53に示されるようなヒト抗体軽鎖定常領域を含む。
代替実施例において、医薬組成物中の抗IL-5抗菌剤は、以下を含む。
(i)SEQ ID NO:83に示すような重鎖とSEQ ID NO:84に示すようなL鎖
(ii)SEQ ID NO:85に示すような重い鎖とSEQ ID NO:86に示すようなL鎖
(iii)SEQ ID NO:87に示すような重い鎖とSEQ ID NO:88に示すようなL鎖
(iv)SEQ ID NO:89に示すような重鎖とSEQ ID NO:90に示すような軽鎖、または
(v)SEQ ID NO:91に示すような重い鎖とSEQ ID NO:92に示すようなL鎖
別の実施形態では、医薬組成物中の抗IL-5抗体は、抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントとのIL-5への結合を競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。
好ましい実施の形態では、本開示の薬品組成中の抗原結合フラグメントは、Fab、F(ab')2、シングルチェーン(scFv)、ジメライズされたV領域(ディア発明)、およびジスルフィド結合安定化されたV領域(dsFv)からなる群から選択される。
本開示は、上述したような、抗IL-5のストックソリューションを緩衝剤に置き換える工程を含む、医薬組成物を準備するための方法を更に提供する。代替の実施例では、好ましくは緩衝液は酢酸ナトリウム酢酸緩衝液である。緩衝液のpHは約5.0～6.5、好ましくは約5.5～6.5、好ましくは6.0～6.5、好ましくは5.0～6.0、好ましくは5.5～6.0、好ましくは5.0～5.5、好ましくは5.2～5.8、緩衝液pH値の無限の実施例は約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、好ましくは5.6、好ましくは5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.5、好ましくは5.5である。別の実施形態において、薬組成中の緩衝液の濃度は、約10mM～約30mM、好ましくは、約15mM～約30mM、好ましくは、約20mM～30mM、好ましくは、約25mM～30mM、好ましくは、約5mM～25mM、好ましくは、約10mM～25mM、好ましくは、約15mM～25mM、好ましくは、20mM～25mM、好ましくは、約5mM～20mM、好ましくは、好ましくは、約10mM～15mMである。緩衝液の濃度の無限の実施例は、、約10mM、約12mM、約14mM、約16mM、約18mM、約20mM、約22mM、約24mM、約26mM、約28mM、約30mM、好ましくは約30mMである。
幾つかの実施例では、医薬品組成は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム、pH 5.5及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例では、医薬品組成は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸ナトリウム、pH 5.5及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸、pH 5.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸、pH 5.5および0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウム、pH 6.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、100mg/ml抗IL-5抗体h1705-008、10mMコハク酸-コハク酸ナトリウム、pH 5.0および0.05mg/mLポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸、pH 5.5および0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、100mg/ml抗IL-5抗体h1705-008、10mMコハク酸-コハク酸ナトリウム、pH 6.0および0.05mg/mLポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 6.5及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 5.5及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 6.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 6.5及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 abid h1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 5.5及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 6.0及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 6.5及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMクエン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム、pH 5.5及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMヒスチジン塩酸、pH 6.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMヒスチジン塩酸、pH 6.5及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMヒスチジン塩酸、pH 5.5及び0.05mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、100mg/ml抗IL-5抗体h1705-008、10mMヒスチジン-塩酸、pH 6.0および0.05mg/mLポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸、pH 5.0及び0.1mm/mlポリソルベート20を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸、pH 5.0及び0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、50mm/mlスクロース及び0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、50mm/mlトレハロース及び0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、50mm/ml mannitol、0.1mm/ml polysorbate 80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、50mm/mlソルビトール及び0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、100mg/ml抗IL-5抗体h1705～008、10mMコハク酸-コハク酸ナトリウムpH 5.0、8mg/mLグリシンおよび0.1mg/mLポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMスクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、8mm/mlメチオニン及び0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.0、8mm/mlプロリン、0.1mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mMサクシン酸ナトリウムサクシン酸pH 5.5、70mm/mlスクロース、0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、80mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウムpH 5.8および0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.4及び0.6mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、80mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.4及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、80mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.4及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、80mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH5.8および0.6mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例では、医薬品組成は、120mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mM酢酸ナトリウムpH 5.0及び0.2mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、80mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウムpH 5.0及び0.6mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、120mm/mlの抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酸pH 5.8および0.6mm/mlのポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例では、医薬品組成は、120mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.4及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.4及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、120mg/ml抗IL-5抗体h1705～008、10mM酢酸-酢酸ナトリウムpH 5.0および0.6mg/mLポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、120mm/mlの抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酸pH 5.8および0.2mm/mlのポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.0及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5抗H1705-008、10mM酢酸ナトリウムpH 5.8および0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、10mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.5、70mm/mlスクロース及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、20mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.5、70mm/mlスクロース及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、30mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.5、70mm/mlスクロース及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、30mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.5、73mm/mlスクロース及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施形態では、医薬品組成物は、100mm/ml抗IL-5 andity h1705-008、30mM酢酸ナトリウム酢酸pH 5.5、75mm/mlスクロース及び0.4mm/mlポリソルベート80を含む。
幾つかの実施例において、本開示の医薬組成物は、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも18ヶ月、少なくとも24ヶ月において、少なくとも2～8℃安定である。医薬組成物は少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月間は25℃で安定することができる。
本開示はさらに、抗IL-5抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法を提供し、これは、上記のような医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む。
代替の実施形態において、抗IL-5抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法における凍結乾燥は、連続して、予備凍結、一次乾燥および二次乾燥の工程を含む。凍結乾燥は、製剤を凍結し、続いて一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって実施される。このような条件下では、生成物の温度は、配合化物の樹冠点または分解温度よりも低い。適切な圧力(通常約50～250mTorrの範囲)では、一次乾燥のための貯蔵温度は通常-30～25℃程度である(一次乾燥の間、製品が凍ったままであると仮定する)。製剤、試料容器(ガラス瓶など)のサイズと種類、液体の量によって、乾燥に要する時間が決まる。また、時間は数時間から数日(例えば40～60時間)に及ぶことがある。二次乾燥は0～40℃程度で行うことができるが、これは主に容器の型大きさ、使用するタンパク質の種類によって異なる。二次乾燥の所要時間は、製品の残留湿度によって決まり、通常5時間以上かかる。一般的に、低圧下で調製された親水剤中の水分量は約5%未満であり、望ましくは約3%未満である。一次乾燥時の圧力と同じで、二次乾燥時の圧力が一次乾燥時の圧力より低いのが望ましい。親和性の条件は、製剤やバイアルの大きさによって異なることがある。
本開示は、上述したように、抗IL-5抗菌を含むフィロフィライズ配合を調製するための方法により調製されたIL-5抗菌剤からなるフィロフィライズ配合をさらに提供する。
幾つかの実施形態では、低温調剤は少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも18ヶ月、少なくとも24ヶ月間、少なくとも2～8℃で安定している。いくつかの実施形態では、凍結剤は少なくとも7日間、少なくとも14日間又は少なくとも28日間、少なくとも40℃で安定している。
本開示はさらに、抗IL-5抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製するための方法を提供し、ここで、それは、上記のように凍結乾燥製剤を再構成する工程を含み、再構成のために使用される溶液は、注射用水、通常の生理食塩水またはグルコース溶液を含むが、これらに限定されない。
本開示はさらに、上記の抗IL-5抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製するための方法によって調製されたIL-5抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を提供する。
本開示は、本分野における安定した医薬品組成物のどれかを含むコンテナを構成するアーティクルまたはキットをさらに提供する。いくつかの実施例において、容器は中性ボロシリケートガラスで作られた注入バイアルである。
本開示はさらに、上記のような医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を含む容器を含む物品を提供する。
本開示は、IL-5媒介疾患を治療有効量の医薬組成物または凍結乾燥製剤またはそれを必要とする製造物を被検者に投与する工程をさらに提供し、ここで、IL-5媒介疾患は、喘息、慢性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ-ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋肉痛症候群、虫感染、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性気管支炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎からなる群より選択することが好ましい。アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、ステロイド依存性好酸球性気管支炎である。
本開示はさらに、IL-5媒介疾患を治療するための医薬組成物または凍結乾燥製剤の溶解溶液、または前記の製造物の使用を提供する。ここで、IL-5媒介疾患は、好ましくは、喘息、慢性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ-ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋肉痛症候群、虫感染、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性気管支炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎からなる群より選択される。アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、ステロイド依存性好酸球性気管支炎である。
本開示は、さらに、IL-5媒介疾患を治療するための、上記の凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を提供し、ここで、IL?5媒介疾患は、好ましくは、喘息、慢性肺炎、アレルギー性気管支アスペルギルス症、好酸球増加症、Churg-Strauss症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症候群、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球性胃腸炎、虫感染症、ホジキン病、鼻ポリープ症候群、じん麻疹、過好酸球性気管支炎、結節性動脈炎を含む群から選択される。好酸球性食道炎、アレルギー性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症性皮膚炎、子宮内膜症、ステロイド依存性好酸球性気管支炎である。
当業者によく知られているように、本開示における各実施形態の特徴の一部または全部を、本開示の他の実施形態を形成するためにさらに結合することができる。上述した本開示の実施態様及び組み合わせにより得られた追加の実施態様は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
図1は、IL-5とIL-5レセプターとの結合を阻止する抗IL-5抗物質が、FACS実験の結果を表している。 図2は、Th2サイトキンに対するアンチIL-5の結合特殊性の検出結果を表している。 図3は、Anti-IL-5の検出により断続的呼吸器(Penh)の葉が強まることを表している。G1:正常対照群(PBS)、G2:モデル群(IgG)、G3:h1705-008抗体10mpk群、G4:h1705-008抗体2mpk群、G5:h1706-009抗体10mpk群、G6:h1706-009抗体2mpk群、G7: Hu39D10 10mpk群、ここで、*p<0.05、**<0.01(ANOVA/BonferroniによるG2群との比較)である。 図4Aは、喘息マウスの肺におけるBALF好酸球のレベルを示す。図4Bは、喘息マウスの気管粘膜厚スコアを示す。G1:正常対照群、G2:モデル群、G3:h1705-008抗体10mpk群、G4:h1705-008抗体2mpk群、G5:h1706-009抗体10mpk群、G6:h1706-009抗体2mpk群、G7:Hu39D10 10mpk群である。図4Cは喘息マウスの肺におけるBALF好酸球の割合を示す。 図5Aと図5Bは、BALF中のエオシノフィルのレベルを減少させるIL5モノクローン・イノクローン・イノベーションの能力を表している。
用語
本開示をより容易に理解するために、以下に特定の技術及び科学的用語を定義する。ここで使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、本開示が別途明確に定義されない限り、本技術分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。
「緩衝液」とは、酸塩基共役成分の作用によってpHが変化しにくい緩衝液剤のことである。適当な範囲のpHを制御する緩衝液の実施例としては、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グリシル-グリシンおよび他の有機酸緩衝液が挙げられる。
「ヒスチジン塩緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン塩緩衝液の実施例は、ヒスチジン塩酸、ヒスチジン酢酸、ヒスチジン硫酸緩衝液等を含み、好ましくは、ヒスチジン酢酸緩衝液又はヒスチジン塩化緩衝液を、ヒスチジン酢酸緩衝液をヒスチジン及び酢酸によって調製し、ヒスチジン塩緩衝液をヒスチジン及びHCLによって調製した。
「クエン酸緩衝液」は、クエン酸イオンを含む緩衝液である。クエン酸緩衝液としては、クエン酸・クエン酸ナトリウム、クエン酸・クエン酸カリウム、クエン酸・クエン酸カルシウム、クエン酸・クエン酸マグネシウム等が挙げられる。好ましいクエン酸緩衝液はクエン酸ナトリウムクエン酸である。
「コハク酸緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液である。コハク酸緩衝液としては、コハク酸-コハク酸ナトリウム、コハク酸-コハク酸カリウム、コハク酸-コハク酸カルシウム等が挙げられる。好まれるサクシネート緩衝液は、サクシニン酸-サクシネートナトリウムである。
「リン緩衝剤」はリンイオンを含む緩衝剤である。リン酸塩緩衝液としては、リン酸水素二ナトリウム・リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム・リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム・クエン酸等が挙げられる。好ましいリン酸緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム-リン酸二水素ナトリウムである。
「酸性緩衝液」は酢酸イオンを含む緩衝液である。酢酸緩衝液の実施例としては、酢酸ナトリウム酢酸、ヒスチジン酢酸、酢酸カリウム酢酸、酢酸カルシウム酢酸、酢酸マグネシウム酢酸等がある。好ましい酢酸緩衝液は、酢酸ナトリウム酢酸である。
「医薬品組成物」とは、本書に記載されている、1種類以上の化合物(または生理学的/薬学的に容認可能な塩またはプロドラッグ)とその他の化学成分(生理学的/薬学的に容認可能なキャリアおよび補助剤など)を含む混合物を意味する。医薬品組成の目的は、活性成分の吸収及び生物活動を容易にするために、活性成分の安定性を維持し、有機体への投与を容易にすることである。
ここでいう「医薬組成物」と「製剤」とは、同義である。
本開示における「糖」には、従来の(CH2O)n及び単糖、無糖、三糖、多糖類、砂糖、アルコール、還元糖、非還元糖等を含むそれらの派生物が含まれる。糖類は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリスリトール、グリセリン、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メリトリオース、メリトリオース、マンノトリオース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース等からなる群から選択することができる。好ましい糖類は、非還元性二糖、より好ましいショ糖である。
本明細書によれば、特に記載のない限り、医薬品組成物の液状に含まれる溶剤は水である。
「リョウフィルイズ配合」とは、液体を真空中で凍結したもの、又は医薬品組成物又は配合の解決法により得た配合又は医薬品組成物をいう。
本開示における親和性は、凍前乾燥、一次乾燥および二次乾燥からなる。予備凍結の目的は、結晶性固体を得るために製品を凍結することである。凍結前温度と凍結前速度は2つの重要な工程パラメータである。発明開示では、事前凝固点温度は-45℃に設定されており、事前凍結速度は1℃/分である。一次乾燥は、メイン乾燥とも呼ばれ、試料の親水の主要な段階である。製品の形状を維持しながら、製品から氷を取り除き、製品へのダメージを最小限に抑えることを目的としている。一次乾燥温度と真空度が適切に選択されていないと、製品が壊れてしまう。温度が高く、真空度が高くなると、親和性が高まるが、製品の倒壊の危険性も高くなる。本発明における一次乾燥の温度は、-30℃から0℃のような分野の通常の温度であることができる。二次乾燥は、真空乾燥とも呼ばれ、最終真空(0.01mbar)を汲み上げ、温度(20～40℃)を上げることで、製品から結ばれた水を取り除く主要なステップである。生物製品の多くは温度に敏感であるため、二次乾燥温度は25℃の下限とする。凍結乾燥の時間は、冷凍庫、凍結乾燥される製剤の用量、及び凍結乾燥される製剤の容器に関係する。当業者は、このような時間の長さを調整する方法をよく知っている。
ここで用いられるように、「about」及び「約」という用語は、値が、当業者によって測定された許容可能な範囲内の誤差範囲内であることを意味する。値は、部分的には、その値がどのように測定され、決定されるか(すなわち測定システムの上限)に依存する。例えば、アートにおける全ての実践において、「about」は、1以上の範囲内の標準偏差を意味する。代替として、「about」又は「実質的に構成される」は、最高20%の範囲を意味する。例えば、pHが約5.5であるとすると、pHは5.5××1.1である。また、特に生物学的系又は処理においては、用語は、最大1桁または最大5倍の値を意味する。特に特別な規定がない限り、本申請及びクレームにおいて特定の値が示された場合、「about」又は「実質的に構成される」の意味は許容できる特定値の誤差範囲内であるべきである。
本開示の医薬品組成は、安定効果を達成することが可能である。すなわち、医薬品組成中に含まれる抗生物質は、貯蔵後、物理的安定性及び/又は化学的安定性及び/又は生物学的活性を実質的に保持する。好ましくは、医薬組成物は、貯蔵後に物理的安定性および化学的安定性ならびに生物学的活性を実質的に保持する。保管期限は、薬品成分の所定の賞味期限に基づいて決定されるのが一般的である。タンパク質の安定性を測定する分析技術は、現在、いくつか存在する。これは、一定の温度で一定期間保存された後、安定性を測定するために使用される。
安定した医薬品製剤とは、低温(2～8℃)で少なくとも3ヶ月、望ましくは6ヶ月、望ましくは1年、さらに望ましくは2年以下の条件下で、物理的および/または化学的および/または生物学的な変化が著しく見られない製剤をいう。さらに、安定した液体調合物には、1ヶ月、3ヶ月または6ヶ月の間25℃で貯蔵された後の望ましい特性を示すものが含まれる。通常、製剤の安定性の基準としては、SEC-HPLCで測定したように、分解されるモノマーは一般的には約10%以下、目視検査では、淡黄色、ほとんど無色、無色、または透明～わずかに淡色であり、製剤の濃度、pH、浸透度は、おおむね10%以下、望ましくは5%以下、一般的には、約10%以下、望ましくは、約10%以下、望ましくは、約5%以下、望ましくは、低下凝集度の5%以下である。
また、目視による色や明瞭性の検査、またはUV光散布、サイズ除外クロマトグラフィー(SEC)および動的光散乱（DLS)を用いて測定することにより、抗菌剤が集積、析出、および/または変性が著しく増加しない場合には、製剤に「その物理的安定性を保持する」とみなされる。タンパク質構造の変化は、タンパク質の第三次構造を決定する蛍光分光法と、タンパク質の第二次構造を決定するFTIR分光法で評価できる。
このように、化学的な変化がない場合には、薬品配合において「化学的安定性を保持する」とされる。化学的安定性は、化学的に変化したタンパク質の形成を検出し定量化することによって評価することができる。タンパク質の化学構造を頻繁に変化させる分解プロセスには、加水分解または切断(サイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEなどの方法によって評価される)、酸化(質量分析またはMALDI/TOF/MSと組み合わせたペプチド分光法などの方法によって評価される)、脱アミド化(イオン交換クロマトグラフィー、毛細管等電点電気泳動、ペプチド分光法、イソアスパラギン酸測定などの方法によって評価される)および異性化(イソアスパラギン酸の含有量の測定などの方法によって評価される)が含まれる。
一定の時点での抗菌剤の生物学的活性が、製剤が最初に準備された時点で示された生物学的活性の所定の範囲内である場合、抗菌剤は製剤において「その生物学的活性を保持する」とみなされる。例えば、抗原結合アッセイによって、抗原の生物学的活性を決定することができる。
本開示におけるアミノ酸の三文字コード及び一文字コードは、J. biolに記載されている。ケム。243, p3558 (1968)。
本開示で使用する「抗菌」は、イムグロブリンを指し、完成抗菌作用は、2つの同一重鎖と2つの同一L鎖がチェーン間ジスルフィド結合によって結合したテトラペプチド連鎖構造である。
本開示では、本開示の「液体ライトチェーン」は更に光チェーン軽鎖定常領域、ヒト又はムリンカッパチェーン又はそれらの変形例を含んでいる。
本開示において、本開示の重鎖はさらに重鎖定常領域、ヒト又はムリンIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はそれらの変形物を含む。
重鎖とL鎖のNターミナルに隣接する約110のアミノ酸は、可変領域(Fv領域)として知られており、非常に変化に富んでいる。Cターミナルに近い残りのアミノ酸配列は、定常領域として知られている比較的安定である。可変領域は3つの超可変領域(HVRs)と4つの比較的保守的なフレームワーク領域(FRs)を含んでいる。抗体の特異性を決定する3つの超可変領域は、相補性決定領域(CDR)としても知られている。軽鎖可変領域(LCVR、VL)と重鎖可変領域(HCVR、VH)はそれぞれ3つのCDR領域と4つのFR領域から成り、アミノ端からカーボキシル終末、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4の順である。L鎖の3つのCDR領域は、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3であり、重鎖の3つのCDR領域は、HCDR1、HCL2およびHDR3である。本開示に記載されている、LCVR領域およびHCVR領域のCDRアミノ酸残留物の数と位置、またはそれらの抗原結合フラグメントは、既知のカバトナンバリング基準(LCDR1～3、HDR1～3)に適合する。
本開示の抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および好ましくはヒト化抗体を含む。
本開示において、「抗原結合フラグメント」又は「機能フラグメント」は、Fabフラグメント、Fabのフラグメント、抗原結合活動を有するF(ab')2フラグメント、及びFvフラグメント、ScFvフラグメントを意味する。Fvフラグメントは、重鎖可変領域と、抗原結合部位を有する軽鎖可変領域を含むが、一定領域を持たない。Fvフラグメントは、すべての抗原結合部位を有する最小の抗原断片である。一般に、Fv抗体はまた、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。異なるリンカーはまた、ポリペプチド鎖を形成するために、2つの多様な領域を結合するために使用することができる。これは、単一の鎖または単一の鎖Fv(sFv)と名づけられている。
本開示の「抗原結合フラグメントサイト」という用語は、本開示の抗原又は抗原結合フラグメント断片によって認識される抗原上の連続的又は不連続的な立体空間サイトを指す。
本開示における「殺人抗菌」という用語は、当該技術の知識及び技能に基づき調製されたヒトIL-5に対するモノクローン抗菌物を指す。準備の間、試験被検者にIL-5抗原を注入し、続いて、望ましい配列または機能的特徴を有する遺伝子を表現するハイブリドマを分離する。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、これは、マウス抗体によって誘導される免疫反応を低下させる。キメリックな抗菌を確立するには、まず、雑種母系ベクトルのモノクローン性抗菌を確立し、次に、可変領域遺伝子をマウスハイブリドマ電池からクローン化し、それから、必要に応じてヒト抗菌の恒常領域遺伝子をクローン化し、ムリン可変領域遺伝子をヒトの恒常領域遺伝子と結合して、キメリック遺伝子を作り、それをヒトベクターに挿入し、最終的にキメリック抗菌を真核産業システムまたは原核産業システムで表現することが必要である。本開示の好ましい実施の形態では、IL-5キメリック・コンディションのライトチェーンは、さらに、人間のカッパチェーンの軽鎖定常領域それらの変形例(s)を含む。IL-5キメリック・バイオレンスの重鎖は、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの変形物の重鎖不変領域を構成する。ヒトの一定領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の鎖定常領域から選ぶことができ、好ましくはヒトIgG2またはIgG4鎖定常領域から選ぶことができるか、または、アミノ酸突然変わった後にADCCの有毒性(自己依存細胞細胞サイト毒)を持たないIgG4から選ぶことができる。
用語「ヒト化抗体」は、CDRグラフト化抗体としても知られ、ヒト抗体可変領域フレームワーク、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系抗体フレームワーク配列において産生される抗体にマウスCDR配列をグラフトすることによって産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、多数のネズミタンパク質成分を担持するキメラ抗体によって誘導される強い不均一応答を回避する。そのようなフレームワーク配列は、ゲルムラインの遺伝子配列または公表された引用文献を対象とする公共のDNAデータベースから得ることができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のゲルムラインDNA配列配列は、「VBase」のヒトゲルムライン配列データベース(www.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能)およびKabat, EA, et al. 1991 Sequences of Immunological Interest, 5th Edで見ることができる。免疫原性の低下に起因する活性の低下を避けるため、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列を最小限の復帰突然変異又は復帰突然変異にさらし、活性を維持できるようにすることができる。本開示のヒト化抗体はまた、CDR親和性成熟がファージディスプレイによって行われるヒト化抗体を指す。
本開示では、「ADCC」(すなわち、自己依存性細胞サイト毒)とは、標的細胞が、Fcレセプターを発明細胞によって、直接殺害されることを意味し、これは、抗菌のFcセグメントを認識することを意味する。IgGのFcセグメントを修正することにより、ADCCエフェクター機能を低減または排除することができる。この修飾は、IgG1上のN297A、L234A、L235A、IgG2/4キメラ、IgG4上のF234A/L235A変異からなる群から選択されるような、上記の重鎖定常領域で行われる変異を言及する。
本開示における変異配列における「置換」は、「バック・変異」、「保守的な置換または置換」を含むが、それに限らない。本開示において使用される「保守的な置換または置換」は、タンパク質中のアミノ酸の代わりに、タンパク質の生物学的活性を変えることなく頻繁に代替することができるように、類似の特徴(電荷、側鎖サイズ、好水性/水親水性、背骨の配合および硬さなど)を有する他のアミノ酸を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非不可欠な領域における単一のアミノ酸代替が生物活動を実質的に変化させないことを知っている(例えば、Watsonら(1987)、遺伝子の分子生物学、The Benjamin/Cummings Pubを参照)。224ページ(第4版).また、アミノ酸が同じような構造や機能をもっているとしても、生物学的な活性を破壊することはないだろう。
本開示における「発明配列」は、本開示の核酸配列及び/又はアミノ酸配列が、本開示の核酸配列及び/又はアミノ酸配列と異なる配列同一性割合を有する核酸配列及び/又はアミノ酸配列を得るために、変性(例えば、置換、挿入又は削除)によって適切に変形されることを意味する。本開示において、配列同一性は、少なくとも85%、90%、または95%であり得るし、少なくとも95%であることが望ましい。非限定的な例は、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%を指す。National Center For Biotechnology Instituteのウェブサイトに掲載されているBLASTN/BLASTPアルゴリズムのデフォルト設定により、2つの配列間の順序並べとアイデンティティパーセンテージの判定を行うことができる。
「IL-5への拘束力」という用語は、IL-5との相互作用を意味し、できればヒトのIL-5との相互作用を意味する。
「抗IL-5抗体」および「IL-5抗体」という用語は、互換的に使用され、両方とも、IL-5に結合する抗体を指す。
本開示において、融合タンパク質は、DNA組換えを介して2つの遺伝子を共表現することにより得られるたんぱく質産物である。遺伝子組み換えIL-5の細胞外領域-Fc融合タンパク質は、DNA組み換えを通してIL-5の外細胞領域とヒトのAbdFcフラグメントを共表現することによって得られる融合タンパク質である。IL-5細胞外領域とは、細胞膜外で表現されるIL-5タンパク質の一部を指し、その配列はSEQ ID NO:1に示すとおりである。
抗物質及び抗原結合フラグメントの製造及び精製の方法はよく知られており、先行技術で入手可能である。例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, Chapter 5-8及び15である。例えば、マウスにヒトIL-5またはそのフラグメントをワクチン接種することができ、その結果得られた抗菌は改良され精製されることができ、また、アミノ酸配列決定は通常の方法を用いて行うことができる。抗原結合フラグメントも従来の方法で作ることができる。本開示によれば、ヒト又は抗原結合フラグメントは、ヒト以外のCDR領域に1つ以上のヒトFR領域を接木するように遺伝的に工夫されている。ヒトFRゲルムライン配列は免疫遺伝学(IMGT)ウェブサイトhttp://imgt.cines.frから得られるか、又はThe Immunoglobulin Journal, 2001ISBN012441351から得られる。
エンジニアド・バイオレンス又はそれの抗原結合フラグメントは、従来の方法により調製し、精製することができる。たとえば、重鎖とL鎖をエンコードするcDNA配列をクローンし、GS式ベクトルに組み換えることができる。遺伝子組み換えイムグロブリンの表現ベクトルは、安定してCHO細胞に変換することができる。推奨先行技術として、哺乳動物の表現系は、特にFc領域の極めて保守的なN-端子位置において、抗物質のグリコシル化を導くことができる。ヒトIL-5に特に結合する抗物質を表現することで安定したクローンを得ることができる。ポジティブクローンは、バイオリアクターの無液体培養媒体で展開され、抗毒素を生成する。抗生物質を秘密にしている文化媒体は、従来の方法で精製することができる。例えば、調整緩衝液を含むタンパク質Aまたはタンパク質GセファロースFFカラムを精製に使用することができる。非具体的に結合した成分は、洗い流される。次に、結合した抗生物質をpH傾きで溶出し、SDS-PAGEで検出し、収集した。抗生物質は、従来の方法でフィルタリングし、濃縮することができる。水溶性混合物および多量体はまた、従来の方法、例えば、モレキュラーシーブおよびイオン交換によって除去することができる。出来上がった製品は-70℃など、直ちに冷凍するか、親水する。
「オプション」または「オプション」とは、用語に従うが発生しなくてもよい事象または環境を意味し、また、その事象または環境が発生した、または発生しなかった場合を含む記述である。例えば、「任意に、1～3本の抗原の重鎖CDR領域(s)からなる」とは、特定のシークエンスを有するが、必ずしもではない、抗原の重鎖CDR領域が存在することを意味する。
動物、ヒト、実験例被検者、電池、組織、臓器、または生物流体に適用する場合、「投与」および「治療」とは、外生薬、治療薬剤、治療薬剤、動物、被検者、電池、組織、組織、臓器または生物流体との接触を指す。「投与」および「治療」は、例えば、治療、薬局学、診断、調査および実験例方法を指すことができる。電池と液体が電池と接触する試薬および液体との接触を含む試薬の治療を意味する。例えば、「投与」および「治療」は、電池と液体が接する流体との触れ合いを意味する。また、「治療」および「治療」は、電池を試薬、診断剤、結合成分または体内および生体外で別の電池による処理を意味する。「治療」は、ヒト、獣医または研究被検者に適用される場合、治療、予防または予防措置、研究および診断アプリケーションを意味する。
「治療」とは、内部又は外的な治療薬剤を、例えば、治療効果があることが知られている1つ以上の病気の徴候を有する患者に、本開示の結合剤のうちの1つを含む組成物を適用することを意味する。一般に、治療薬は、治療された患者または集団における1つ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で与えられ、そのような症状の退縮を誘導するか、または臨床的に検出可能な程度のいずれかの症状の発現を阻害する。特定の病気の兆候を緩和するのに効果的な治療薬剤(「治療効果のある量」とも呼ばれる)の量は、患者の病状、年齢、体重、および患者の希望する治療効果を生み出す薬の能力など、様々な要因によって変化する。疾患の症状が軽減したかどうかは、症状の重症度や進行を評価するために医師や他の医療専門家が一般的に用いているあらゆる臨床検査法によって評価することができる。本開示の実施形態(例えば、処理方法又は製造物)は、各標的病気の徴候を緩和するのに効果的ではないかもしれないが、生徒・t-test、チ-スクエア・テスト、マン&ホイットニーのUテスト、クラスカル-ワリス・テスト(Hテスト)、ジョンシーア-テルプストラ・テスト、ウィルコクソン・テストのような、当該技術で知られるあらゆる統計的なテスト方法により決定されるように、統計的に有意な数の患者において、標的病気の徴候を緩和するべきである。
IL-5に関連した疾患である限り、IL-5に関連した疾患に対する制限はない。例えば、本開示の分子によって引き起こされた治療反応は、ヒトIL-5に結合し、その後、エオシンオフィルの刺激効果を遮断または抑制することによって生じることができる。したがって、治療適用に適した調製および調製に適用する場合、本開示の医薬組成物は、喘息、喘息の悪化、悪性開始、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ-ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球性胃腸炎、虫感染、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球増加性気管支炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎などの好酸球に関係する反応に極めて有用である。アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症、子宮内膜症、ステロイド依存性好酸球性気管支炎など好ましい実施の形態では、処理により、肺組織へのエオシノフィルの浸透を抑制または緩和することができる。医薬組成物の投与頻度は、1日3回から6ヶ月に1回までである。投与経路は、静脈、皮下、筋肉内、親のルート、あるいは外用ルートである。
本開示の定式化は、IL-5媒介病の治療に使用することができる。例えば、この製剤は、IL-5媒介炎症反応および好酸球の成熟、活性化、脱顆粒または組織浸潤を、インビボおよびインビトロで阻害または軽減すること、IL-5によって引き起こされる平滑筋肉の過剰ストレスを阻害することができる。肺臓、気道または血中のIL-5の濃度を低下させること、これらに限定されるものではないが、使用することができる。好ましくは、本開示の配合は、IL-5媒介疾患を治療するために使用することができ、好ましくは、IL5媒介疾患は、喘息、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、Churg-Strauss症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球性胃腸炎、虫感染、ホジキン病、鼻茸、Loeffler症候群、蕁麻疹、好酸球増加性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症およびステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される。
「有効量」とは、医療病の症状または条件を改善または予防するのに十分な量を含む。また、有効量とは、診断を可能にし、容易にするのに十分な量を指す。患者や獣医学被検者の効果額は、治療の条件、患者の全般的な状態、治療のルートや量、副作用の重大さなどによって異なる。有効用量は、重大な副作用や有毒な影響を回避するための、最大用量や服用スケジュールであることができる。
「エクスチェンジ」とは、抗タンパク質を溶かすために用いられる溶媒系の交換をいう。例えば、抗体タンパク質を含む高塩または高張溶媒系は、物理的操作によって、安定な製剤の緩衝系で置き換えられ、その結果、抗体タンパク質は、安定な製剤中に存在するであろう。物理的操作には、限外濾過、透析または遠心分離後の再構成が含まれるが、これらに限定されない。
実施例と試験例
本開示は、以下の実施例とあわせてさらに説明されるが、これらの実施例は、本開示の範囲を限定しない。本開示の実施例において特定の条件を備えていない実験方法は、通常、A Laboratory Manual, Molecular Cloning by Cold Spring Harbor Laboratory、または、材料または製品の製造者によって推奨される条件に従うような、従来の条件に従ったものである。特定の供給源以外の試薬は、市販されている従来の試薬を使用している。
検出に用いるIL-5抗原およびタンパク質の調製
1.1IL-5抗原の設計と式
His-tagを有するヒトIL-5、His-tagを有するアカゲザルIL-5、His-tagを有するマウスIL-5、His-tagを有するラットIL-5、ヒトIgG1-Fcフラグメントを含むヒトIL-5Rα受容体細胞外領域融合タンパク質をコードする配列を、phrベクトルにクローン化し、発現プラスミドを構築し、次いでHEK293にトランスフェクトした。トランスフェクション後6日目に試料を採取し、4500rpmで10分間の遠心分離により細胞上清を回収した。組み換えIL-5およびIL-5αレセプタータンパク質からなる上層部をニッケルカラムを用いて精製し、組み換えヒトIL-5-Fc融合タンパク質をプロテインA親和クロマトグラフィーカラムを用いて精製した。精製タンパク質はその後の実験で使うことができる。特定のタンパク質抗原の配列は次のとおりである。
his-tag (rhIL-5-his)をもつヒトIL-5のアミノ酸配列
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESHHHHHH
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
SEQ ID NO:1
his-tagをもつcyno IL-5のアミノ酸配列
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPASALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIGGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESHHHHHH
SEQ ID NO:2
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
his-tagをもつマウスIL-5のアミノ酸配列
MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEGHHHHHH
SEQ ID NO:3
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
his-tagをもつラットIL-5のアミノ酸配列
MEIPMSTVVKETLIQLSTHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEILFQNLSLIKKYIDGQKEKCGEERRKTRHFLDYLQEFLGVMSTEWAMEVHHHHHH
SEQ ID NO:4
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
ヒトFcフラグメントに融合したヒトIL-5αレセプターのアミノ酸配列
DLLPDEKISLLPPVNFTIKVTGLAQVLLQWKPNPDQEQRNVNLEYQVKINAPKEDDYETRITESKCVTILHKGFSASVRTILQNDHSLLASSWASAELHAPPGSPGTSIVNLTCTTNTTEDNYSRLRSYQVSLHCTWLVGTDAPEDTQYFLYYRYGSWTEECQEYSKDTLGRNIACWFPRTFILSKGRDWLAVLVNGSSKHSAIRPFDQLFALHAIDQINPPLNVTAEIEGTRLSIQWEKPVSAFPIHCFDYEVKIHNTRNGYLQIEKLMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWIEGRMDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5
注:斜体の部分は、人間のIgG1-Fc-tag を表している。
組換えIL-5α受容体及びIL-5α/β受容体細胞株の構築と識別
本開示は、機能性抗物質をスクリーニングするために、IL-5αを発明CHO-S/IL-5αセルライン、およびIL-5αとIL-5αを発明CHO-S/IL-5α/IL-5αセルラインを構築した。
具体的には、ヒトIL-5α全長遺伝子(Q01344)を哺乳類細胞表現ベクトルpTargeTにクローン化し、直線化プラスミドをCHO-S細胞に電気的に変換し、2週間G418の存在下でスクリーニングし、限定希釈を2回行った。FACSにより細胞表面にIL-5α遺伝子が検出され、高いIL-5α発現レベルのCHO-S/IL-5αセルラインを選択した。これに基づいて、直線化したpcDNA3.1-IL-5SQLをエレクトロトランスフェクトし、2週間G418とゼオシンの前でスクリーニングし、その後限定希釈を2回行った。FACSにより細胞表面にIL-5αおよびIL-5β遺伝子を検出し、IL-5αおよびIL-5βの発現量の高いCHO-S/IL-5α/IL-5β細胞株を選択した。
抗ヒトIL-5マウスモノクローナル抗体の調製
組み換えタンパク質rhIL-5-his(Sigma、Lot#SLBQ1109V)とIFA(Sigma、Lot#SLBJ2845V)、(100g/50g/50g(高)と25g/12.5g/12.5g(低))の2つの用量をBalb/cマウス(5つのマウス/グループ)とSJLマウス(5つのマウス/グループ)の2つのグループに予防接種した。IL-5に対する特異的免疫応答は、ELISAによる血清力価の検出、配位子-レセプターブロッキングアッセイおよびTF-1増殖の阻害アッセイによって測定した。固有の良い反応を示すマウスを選択し、犠牲にし、スプリーン電池を収集し、ミエローマ電池と融合させた。
一次スクリーニングは、ヒトIL-5に対するELISA結合アッセイにより実施した。ハイブリドーマ細胞を24ウェルプレートに移した後、ヒト、シノモルグスザルおよびマウスIL-5に対するELISA結合アッセイ、IL-5に対するELISAベースのレセプターブロックアッセイ、およびTF-1拡散の抑制アッセイを用いて、上位物質を再度スクリーニングした。陽性クローンを2ラウンドのサブクローニングに付した後、ハイブリドーマクローンを得て抗体産生に使用し、得られた抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
浄化された抗生物質は以下の対象とした。SEC-HPLC、エンドトキシン含量の検出、種々のIL-5に対するビアコア親和性アッセイ、IL-5に対するFACSベースのレセプターブロックアッセイ、TF-1拡散の抑制アッセイ、エオシンオフィルの密着性試験、およびin vivoにおけるモルモットのぜん息モデルおよび中和モデルにおける有効性評価、モノクローナルハイブリドマ細胞のAbm1705、mAb1706、mAbm1780、Abm1773およびmAbm1779で、良好な生体およびin vitroでの活動を示すモノクローンハイブリドマ細胞を選んだ。
正ハイブリドマからのクローン配列の過程は、対数成長段階のハイブリドマ電池を採取し、キットの指示に従ってトリゾル(Invitrogen, Cat No.15596-018)を用いて、逆転写にPrimeScriptTM逆・トランスクリプターズ・キットを使用した(Takara, Cat No. 2680A)。逆転写により得られたcDNAを、マウスIg-Primer Set (Novagen,TB326 Rev. B503)を用いたPCR法により増幅した後、塩基配列を決定した。mAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773およびmAb1779の重鎖および軽鎖可変領域DNA配列に対応するアミノ酸配列を得た(VH/VL CDRのアミノ酸残基を決定し、カバトナンバリング基準により注釈した)。
mAb1705のムリン重鎖可変領域の配列
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:6
mAb1705ネズミの軽鎖可変領域の配列
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLQDKEFPRTFGGGTRLELK
配列番号7
mAb1706ネズミ重鎖可変領域の配列
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATETLRESLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:8
mAb1706ネズミの軽鎖可変領域の配列
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSASNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQHKQFPRTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:9
mAb1780マウス重鎖可変領域の配列
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVKQSQGRSLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKFSSTAYMEFRRLTFEDSAIYYCARDGGYSDPLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:10
mAb1780ネズミの軽鎖可変領域の配列
DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQQPKLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:11
mAb1773マウス重鎖可変領域の配列
EVQLQQSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKHGPKFQGKATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIYYCFRYGIYPDHWGQGTPLTVSS
SEQ ID NO:12
mAb1773ネズミの軽鎖可変領域の配列
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTATLASGVPARFSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE
SEQ ID NO:13
mAb1779マウス重鎖可変領域の配列
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATLTADKSSSTAYLEFSRVTSEDSAIYYCGRRIAWDHWYFDFWGPGTMVTVSS
SEQ ID NO:14
mAb1779ネズミの軽鎖可変領域の配列
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDVAWYQQKSGRSPQLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTRYFFKISGMQPEDEADYFCQQGYKTPLTFGSGTKLEIK
配列番号15
各抗原の軽鎖と重鎖のCDR配列を表1に示す。
[表１]
Biacoreのアクティビティ検出結果は表2に記載されている。
IL-5マウス抗体のin vitro活性
[表２]
結果は、本開示のネズミ抗物質が抗原に対して高い親和性を持つことを示した。
IL-5関連組み換えたんぱく質の浄化、ハイブリドマ抗生物質と組み換えたんぱく質の浄化
4.1IL-5-Flag-His組み換えタンパク質の精製工程
試料は高速で遠心分離して不純物を取り除き、適宜に集中させた。NI‐NTA親和性列(QIAGEN, Cat No.30721)をPBSと平衡させ、2‐5折り目の柱体積で洗った。不純物を除去した後、細胞表現上性試料を柱に積み込んだ。コラムはPBSで洗浄し、A280の読み取り値がベースラインに減少した。カラムをPBSで洗浄して汚染タンパク質を除去し、試料を収集した。目的タンパク質を洗濯緩衝剤(20mMイミダゾール)と溶出緩衝液剤(300mMイミダゾール)で順次溶出させ、溶出ピークを収集した。
採取したエリュエートはイオン交換(Hiload 16/600 superdex 200カラム)によりさらに浄化した。この柱はPBSの約2列体積と平衡させて、pHを7.4とした。同定された目的タンパク質を含む溶出緩衝液を濃縮し、負荷し、試料を収集し、SDS-PAGEおよびLC-MS同定によって検証し、使用のためにアリコートした。
4.2ハイブリドーマ発現抗体およびFc融合タンパク質の精製
細胞式上質試料を高速で遠心分離して不純物を除去した。ハイブリドーマ式上澄みをProtein Gカラムで精製し、Fc融合タンパク質式上澄みをProtein Aカラムで精製した。A280の読み取りがベースラインに減少するまで、このコラムはPBSで洗浄された。目的タンパク質を100mMの酢酸pH 3.0で溶出し、1MのTris-HCL,pH 8.0で中和した。溶解した標本が適切に濃縮された後、標本はPBS平衡ジェルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)によってさらに浄化され、集合体のないピークを収集し、その後、使用のためにアリクテートされた。
抗ヒトIL-5モノクローナル液の人為的設計
当該技術における多くの参考文献で開示されているように、ネズミの抗ヒトIL-5モノクローナル抗菌の人為化を行った。簡単に言うと、ネズミの抗原の定常領域はヒトの定常領域に置き換えられ、ネズミの抗原のCDRは最高の相同を持つFRヒトテンプレートに接ぎ木され、FR領域のアミノ酸の背中突然変性が行われた。
mAb-1705、mAb-1706、mAb1780、mAb1773およびmAb1779の各アミノ酸配列とアイデンティティの高い重鎖および軽鎖可変領域ゲルムラインをIMGTのヒトの可変領域遺伝子データベースと整合させることにより、キツネのCDRを、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に対応するヒトテンプレート上に接ぎ木し、可変領域を形成した。アミノ酸残基をKabatナンバリング基準により測定し、注釈を付けた。
ヒトFR領域の選択とアミノ酸の復帰突然変異
得られたネズミAbid VH/VL CDRの典型的な構造に基づいて、ヒトゲルムラインデータベースから軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)ホモロゴシークエンスを検索し、FR相同(上から下へ)に従ってランク付けし、最高FR相同のゲルムラインを主要テンプレートとして選択した。ヒトテンプレートにネズミのCDR領域を接ぎ木し、その後FR残基を交代させ、アミノ酸残基を最適化して最終的に人類化された分子を得ることができた。
5.1ハイブリドーマクローンmAb1705のヒト化フレームワークの選択
h1705では、VHのテンプレートにIGHV3-23*04が選択され、VLのテンプレートにIGKV1-12*01が選択された。mAb1705のCDRをヒトテンプレート上に接ぎ木し、CDR領域(ソフトウェアを通して発見された)と直接的に相互作用する埋め込み残渣および残渣をバック・突然変性を受けた。表3に示すように、人間化された抗生物質の各種軽鎖および重鎖の可変領域が得られた。
[表３]
備考:「接ぎ木」は、ネズミの抗原CDRがヒトゲルムラインFR領域配列に接ぎ木されたことを表しており、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の43番目のAを表すA43Sは、Sに戻された。
h1705人工抗原重鎖可変領域の組合せ
[表４]
注:この表は、様々な組合せで得られた配列を示している。h1705-007によって示されるように、人間化された殺人顔料h1705-007は、2つのミュータント、すなわちL鎖h1705_VL.1Aを含む。重鎖h1705_VH.1A、等々。
ヒト化された抗原h1705の可変領域の特定の配列は以下のとおりである。
>h1705_VL.1(問い合わせ番号:46)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
>h1705_VL.1A(問い合わせ番号:47)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
>h1705_VL.1B(SEQ ID NO:48)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
> h1705_VH.1(SEQ ID NO:49)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
> h1705_VH.1A(SEQ ID NO:50)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
> h1705_VH.1B(SEQ ID NO:51)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
上記のような軽鎖可変領域は、それぞれ軽鎖定常領域結合して軽鎖配列を形成し、重鎖可変領域はそれぞれ重鎖不変領域と結合して重鎖配列を形成した。例示的なヒト化抗体定常領域配列を以下に示す。
>H鎖定常領域:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:52
注:下線部分はM252Y、S254T、T256Eの突然変異を示す。
>L鎖カッパ定常領域:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号53
5.2ハイブリドーマクローンmAb1706のヒト化フレームワークの選択
h1706では、VHのテンプレートにIGHV3-23*04が選択され、VLのテンプレートにIGKV1-12*01が選択された。マウス抗体mAb1706のCDRを選択したヒト化テンプレートに移植し、FRアミノ酸を逆変異させた。表5に示すように、人間化された抗生物質の軽鎖および重鎖の可変領域が得られた。
h1706のテンプレート選択とバック変異設計
[表５]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の自然数によれば、「接ぎ木」の43番目にAを表すA43SをSに戻した。
図表6に示すように、人間化された分子を組み合わせて、次の表に示すような異なる抗生物質を作った。
h1706ヒト化抗体重症領域と軽鎖可変領域の組合せ
[表６]
h1706人工抗原の可変領域の特定の配列は、以下のとおりである。
>h1706_VL.1(SEQ ID NO:54)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VL.1A(SEQ ID NO:55)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VL.1B(問い合わせ番号:56)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VH.1(SEQ ID NO:57)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETLRESLDYWGQGTMVTVSS
>h1706_VH.1A(SEQ ID NO:58)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
>h1706_VH.1B(SEQ ID NO:59)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
上述したようなライトチェーン可変領域の各々をライトチェーン定常領域と結合してライトチェーン配列を形成した。各重鎖可変領域は重鎖不変領域と結合して重鎖配列を形成した。
5.3ハイブリドーマクローンmAb1780のヒト化フレームワークの選択
h1780では、VHのテンプレートにIGHV1-2*02が選択され、VLのテンプレートにIGKV3-11*01が選択された。マウス抗体mAb1780のCDRを選択したヒト化テンプレートに移植し、FRアミノ酸を逆変異させた。表7に示すように、人間化された抗生物質の軽鎖および重鎖の可変領域が得られた。
h1780のためのテンプレート選択とバック変異設計
[表７]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の1番目のEを表すE1DをDに戻した。
図表8に示すように、人間化された分子を組み合わせて、別の分子を作った。
h1780 人為化されたAID 重量および軽鎖可変領域の組み合わせ
[表８]
h1780の人工抗原の可変領域の特定の配列は、以下のとおりである。
>h1780_VL.1(SEQ ID NO:60)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VL.1A(SEQ ID NO:61)
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VL.1B(SEQ ID NO:62)
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VH.1(SEQ ID NO:63)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1A(SEQ ID NO:64)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1B(SEQ ID NO:65)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1C(SEQ ID NO:66)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVKQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
上述したようなライトチェーン可変領域の各々をライトチェーン定常領域と結合してライトチェーン配列を形成した。各重鎖可変領域は重鎖不変領域と結合して重鎖配列を形成した。
5.4ハイブリドーマクローンmAb1773のヒト化フレームワークの選択
h1773では、VHのテンプレートにIGHV3-73*01が選択され、VLのテンプレートにIGKV1-39*01が選択された。マウス抗体mAb1773のCDRを選択したヒト化テンプレートに移植し、アミノ酸を逆変異させた。表9に示すように、人間化された抗生物質の軽鎖および重鎖の可変領域が得られた。さらに、h1773 HCDR2(RIDPANGDTK GPKFQG)のNはV(すなわちN55V)に変形し、重鎖可変領域HCDR2変形例を形成した(変形HCDR2の配列はSEQ ID NO:82: RIDPAVGDTKHGPKFQGに示されている)。
h1773のテンプレート選択とバック変異設計
[表９]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の4番目のMを表すM4LをLに戻した。
図表10に示すように、人間化された分子を組み合わせて、別の分子を作った。
h1773ヒト化抗体重量領域と軽鎖可変領域との組み合わせ
[表１０]
h1773の人工抗原の可変領域の特定の配列は、以下のとおりである。
>h1773_VL.1(SEQ ID NO:67)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKAPKLLIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
>h1773_VL.1A(SEQ ID NO:68)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
>h1773_VH.1(SEQ ID NO:69)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
>h1773_VH.1A(SEQ ID NO:70)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
>h1773_VH.1B(問い合わせ番号:71)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
上記の軽鎖定常領域可変領域の各々は、SEQ ID NO:53に示されているように、軽鎖定常領域定常領域配列と結合され、最終的な完成軽鎖定常領域配列を形成した。各重鎖可変領域と重鎖不変領域とを結合し、最終的な全重鎖配列を形成した。これは、SEQ ID NO:52に示すとおりである。
5.5ハイブリドーマクローンmAb1779のヒト化フレームワークの選択
h1779では、VHのテンプレートにIGHV1-2*02が選択され、VLのテンプレートにIGKV1-33*01が選択された。マウス抗体h1779のCDRを選択したヒト化テンプレートに移植し、アミノ酸を逆変異させた。表11に示すように、人間化された抗生物質の軽鎖および重鎖の可変領域が得られた。
h1779のテンプレート選択とバック変異設計
[表１１]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の自然数によれば、「接ぎ木」の43番目にAを表すA43SをSに戻した。
図表12に示すように、人間化された分子を組み合わせて、別の分子を作った。
h1779 人口化された、重・軽鎖可変領域の組み合わせ
[表１２]
h1779人工抗原の可変領域の特定の配列は次のとおりである。
>h1779_VL.1(SEQ ID NO:72)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VL.1A(SEQ ID NO:73)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VL.1B(SEQ ID NO:74)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VH.1(SEQ ID NO:75)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1A(SEQ ID NO:76)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1B (SEQ ID NO:77)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1C (SEQ ID NO:78)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1D (SEQ ID NO:79)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
上記のような軽鎖定常領域可変領域の各々は、SEQ ID NO:53に示されるように、軽鎖定常領域定常領域配列と結合され、軽鎖定常領域配列を形成した。各重鎖可変領域は、SEQ ID NO:52に示されているように重鎖不変領域と結合され、重鎖配列を形成した。
模範的な人間化された抗生物質の全長配列は次のとおりである。
h1705-008 重鎖:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:83
h1705-008 L鎖:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:84
h1706-009 重鎖:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:85
h1706-009 L鎖:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:86
h1780-017 重鎖:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:87
h1780-017 L鎖:
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:88
h1773-007 重鎖:
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:89
h1773-007 L鎖:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:90
h1779-014 重鎖:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:91
h1779-014 L鎖:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:92
本開示では、WO2012083370A1におけるIL5に対するHu39D10の検出をポジティブ・コントロールとして用い、重鎖および軽鎖配列をそれぞれSEQ ID NO:80およびSEQ ID NO:81に示した。
Hu39D10重鎖の配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSAIKSRFTISRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:80
Hu39D10L鎖の配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号81
組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の調製
1. 組換えキメラ抗体の分子クローニング
Hybridomasをスクリーニングした結果、検出された遺伝子分子が可変領域をエンコードした後、配列決定により得られた。得られた配列に基づいて順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計し、配列決定された遺伝子を鋳型として用い、PCRにより各抗体VH/VK遺伝子断片を構築した後、相同組換えにより発現ベクターpHr (シグナルペプチドおよびhIgG1/hκ定常領域遺伝子(CH1-Fc/CL)断片を有する)に挿入し、組換えキメラ抗体全長発現プラスミドVH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHrを構築し、5つのキメラ抗体Ch1705、Ch1706、Ch1780、Ch1773およびCh1779を得た。
2. ヒト化抗体の分子クローニング
人為化された遺伝子配列をコードン最適化に従い、その後、ヒトのコードン選好によるコード化遺伝子配列を得た;プライマーは、PCRによって各々のAbid VH/VK遺伝子断片を構築するように設計され、それは、ヒト化された全長式プラスミドVH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHrを構築するために、ホモロゴ再結合により式ベクトルpHr (シグナルペプチドとhIgG1/hkappaコンスタント領域(CH1-Fc/CL)断片を有する)に挿入された。
3. 組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の発現および精製
抗体光または重鎖を表す遺伝子を別々にHEK293E電池にトランスフェクトした。6日後、式上生剤を採取し、高速で遠心分離して不純物を除去し、Aタンパク質柱で精製した。A280の読み取りがベースラインに減少するまで、このコラムはPBSで洗浄された。目的タンパク質を酸性溶出緩衝液、pH3.0-pH3.5で溶出させ、1Mトリス‐HCL、pH 8.0‐9.0で中和した。溶出した試料は適切に濃縮され、さらにPBSで予め平衡化されたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)によって精製され、集合体を除去し、一量体ピークを収集し、使用のために引用された。
以下の試験法を用いて、本開示の抗生物質の性能及び有益な効果を検証した。
in vitroにおける活性の生物学的評価
試験例1
Biacoreアッセイによる異なる種のIL-5に対するマウスIL-5抗体の結合
ヒトIL-5で試験するネズミIL-5の親和性をBiacore T200(GE)機器により測定した。
タンパク質Aバイオセンサチップを用いて検査対象分子の親和性捕捉を行い、次に、抗原(実施例1で準備したヒトおよびシノIL-5)がチップの表面を流れ、反応信号をリアルタイムでBiacore T200器具で検出し、結合および解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了した後、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン塩酸再生液(pH 1.5)で再生した。(1:1) Langmuirモデルに対するデータを当てはめるために、version 4.1 GEソフトウェアを使用し、親和性値を得て表13に示した。
BIAcoreアッセイによる異なる種のIL-5とマウスIL-5抗体との親和性の結果
［表１３］
この実施例では、本開示のmAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773およびmAb1779が、異なる種(ヒト、サル)のIL-5に高い親和性を持つことが証明された。
試験例2
Biacoreアッセイによる異なる種のIL-5に対するヒト化IL-5抗体の親和性
ヒトIL-5で試験されるヒトジドIL-5の親和性をBiacore T200(GE)機器により測定した。
プロテインバイオセンサチップを用いて検査タンパク質分子の親和性を捕捉し、次に、抗原(実施例1で作成した)がチップの表面を流し、反応信号をリアルタイムでBiacore T200器具で検出し、結合および解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了した後、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン塩酸再生液(pH 1.5)で再生した。(1:1) Langmuirモデルに対するデータを当てはめるために、version 4.1 GEソフトウェアを使用し、親和性値を得て表14に示した。
BIAcoreアッセイによるヒトIL-5に対するヒト化IL-5抗体の親和性の結果
[表１４]
その結果、すべての人工IL-5抗毒素はヒト化IL-5に高い親和性を持つことが示された。
試験例3
IL-5のIL-5αレセプターへの結合をブロックするためのマウスIL-5抗体のELISAベースのアッセイ
再結合されたIL-5αレセプタータンパク質、IL-5(PBSで5マイクログラム/ml)をELISAプレート上に被覆し、37℃で1時間インキュベートしたIL-5の結合からIL-5を遮断する能力を確認するため、液体を除去し、PBSで希釈した5%スキムミルクブロック液の200マイクロウェル/ウェルを加え、ブロックのために37℃インキュベーターで2.5時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをPBST緩衝液(0.05% Tween-20を含むpH 7.4 PBS)で5回洗浄し、ビオチン標識キット(東神化学、LK03)で標識した10μg/mlのIL-5Rα (1% BSA中)25μlを添加し、次いで傾き希釈抗体25μlを添加し(IL-5と結合するためにIL-5Rαと競合した抗体)、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイター板中の反応溶液を除去し、板をPBSTで5回洗浄し、1:600のサンプル希釈溶液で希釈した50μl/ウェルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼポリメラーゼ(Sigma,S2438-250UG)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄し、TMB発色性基質(KPL、52-00-03)の50mm/wellを加え、室温で3-10分間インキュベートした。反応を止めるために1M H2SO4の50mm/wellを追加した。NOVOStarマイクロプレートリーダーを450nmの吸光度値を読み取るために使用し、IL-5とIL-5Rαの結合を遮断するためのIL-5のIC50値を計算した。結果を表15に示す。本開示の抗物質は、IL-5のレセプターへの結合を効果的に抑制することができる。
IL-5のIL-5αレセプターへの結合を阻止するためのマウスIL-5抗体のELISA結果
[表１５]
試験例4
IL-5のIL-5レセプターへの結合を阻止するIL-5抗体のFACSベースのアッセイ
細胞表面のIL‐5レセプターをブロックできるスクリーニングIL‐5抗体を同定するため、IL‐5Rα/βの2つのレセプターを高発現するCHOS組み換え細胞株を構築した。この実験は、IL-5抗体がCHOS細胞系の表面上の組換えIL-5α/βレセプターへのIL-5の結合をそれぞれ阻止できることを実証した。
具体的な方法は、100ng/mlのG418と25ng/mlのozinを含むCD‐CHOをCHO‐S‐IL‐5Rαとに対し培養した。細胞内では、3×106細胞/mlを超えてはならない。良好な状態のIL-5R/α-CHOS細胞を遠心分離(1000rpm、5分)し、PBSで10% FBSで一度洗浄し、細胞濃度を4×10セル6/mlに調整し、25mmを取り出し、丸底96ウェルプレートに加えた。試験すべき抗体を10% FBSを含むPBS溶液で希釈した。最初の濃度は200mmug/mlで、傾き希釈で8回1:10に希釈した。ビオチンラベルキット(東神化学、LK03)でラベルした100ng/mlのIL-5(25mm)をそれぞれの濃度で50mmの希釈した液体と完全に混ぜ合わせ、細胞と一緒に加えた96wellのプレートに加え、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を4°C (400g、5分)で遠心分離し、メッキを取り除き、遠心分離により200mmの予冷PBSで2回繰り返し、1:1333で希釈したPE-アビジンの二次反応を4°Cで40分間、4°Cで遠心分離し(400g、5分)、電池物質を取り除き、予冷PBSを200mmのPipetteに加え、プレートを4°Cで3回遠心分離して洗浄し、PBS100mmを加え、プレートを機械で読み上げ、IL-5とIL-5Rα/βの結合を阻止するIC50値を蛍光信号値に従って計算した。その結果を表16と図1に示す。
IL-5のIL-5Rα/βへの結合を阻止するIL-5抗体の検査結果
[表１６]
その結果、H1705-008、h1706-009、h1780-017、およびh1779-014は、細胞表面上のIL-5レセプターへのIL-5の結合を遮断する強い能力を示すことが示された。
試験例5
IL-5 TF1細胞のIL-5誘導性増殖を阻害する抗体
IL-5はTF-1細胞の増殖を誘導することができ、IL-5抗体はIL-5がTF-1細胞の増殖を刺激するのを妨げることができる。
特に、TF-1細胞(ATCC、CRL-2003)は、10% FBSと2ng/ml rhGM-CSF (リンクバイオ、カタログNo.96-AF-300-03-20)からなるRPMI1640で37℃、5% CO2インキュベーターに置かれ、細胞密度は1×106細胞/mlを超えない。抗毒素を検出するために、対数成長相の細胞をPBSで3回洗浄し、800rpmで5分間遠心分離し、細胞密度をRPMI1640(FBS:2%、再結合ヒトIL-5: 10ng/ml)で6000セル/well/90マイクロルに調整し、試験するガディアント希釈の10マイクロルを培養のための96ウェルプレートに加え、3日間の培養後、30マイクロルの細胞タイターを加え、検出のために混合した後、IC50を測定した。試験結果を以下の表17に示す。
IL-5誘導TF1細胞増殖を阻害するIL-5ヒト化抗体の試験結果
[表１７]
試験例6
IL5誘導好酸球接着を阻害するIL5抗体の試験
IL5は好酸球の分化、成熟、マイグレーションおよび活性化を誘導し、呼吸器の炎症を引き起こし、喘息につながる可能性がある。この実験は、IL-5サイトカインが好酸球の接着と活性化を促進できるという原理に基づいている。ヒト末梢血より好酸球を採取・精製し、IL-5特異抗体のIL-5経路に対する遮断作用を検討するとともに、IL-5抗体のIL-5を介した好酸球接着に対する遮断作用をin vitroで検出した。
特にヒト末梢血は2mM EDTAからなるPBSで5倍に薄められ、PercolTM(密度1.088の傾き)を単細胞と孫細胞を分離するのに用いた。粒状細胞からなる赤色血球層を注意深く吸引し、赤色血球分解液を用いて赤色血球を除去し、残りの細胞を数え、CD16の分離磁気ビーズ(Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-045-701)を比例して加え、30分間インキュベートし、磁気ビード柱を通して流れ、柱を通して直接流れる亜集団(主にエオシンフィル)を負の選択によって採集した。隔離されたエオシンオフィルを数え、IgG bidをコーティングした96枚の電池板に、1ウェル当たり約1×10電池4、ヒトIL-5(20ng/ml)と異なった濃度のIL-5(10mmug/mlから始まり、3倍の希釈、10濃度ポイントから始まる)を加え、電池板を37℃に置き、5%のCO2インキュベーターと1時間インキュベートした後、カルチャー板を取り出し、0.3%のCTABを電池を溶かすために加え、最後にペルオキシダー反応基質TMBを発色のために加え、マイクロ板リーダーでOD450の吸収値を読み取った。IL-5だけを加えた井戸の読み取り値は最大吸収値であり、IL-5および抗菌剤のない井戸を背景技術制御として、最大吸着値に対する各濃度での抗菌剤の抑制値を計算し=(最大吸着値-[抗菌剤])/(最大吸着値-背景技術制御値)×100%、IC50を計算した。その結果を表18に示す。
IL-5 IL-5誘導性好酸球接着を阻害する抗体
[表１８]
その結果、本開示の人間化抗物質は、IL5‐媒介のエオシノフィル接着を抑制する強い能力を示すことが示された。
試験例7
Th2サイトカインによるヒト化IL-5抗体の特異性の評価
IL‐5はTh2サイトカインの1つであった。IL-5抗体がIL-5のみを特異的に標的とし、他のサイトカインと交差反応しないことを検証するため、Fortebioを用いてIL2(R&D, 202-IL-010/CF)、IL4(R&D, 204-IL-050/CF)、IL5(R&D, 205-IL-025/CF)、IFNγ、IL6(R&D、7270-IL-025/CF)、IL10(R&D, 213-ILB-025/CF)、IL31(R&D, 2824-IL-010/CF)、IL3(203-IL-050/CF)を測定した。215-GM- 010/CF)、IL-5とα受容体を共有する。
特に、タンパク質Aバイオセンサ(PALL Fortebio, 18-5010)を用いて、抗菌を捕獲し、捕獲信号を記録し、その後、各サイトキンを40nM注入し、新しい結合信号を記録した。最後に、IL-5との結合シグナルは100%と定義された。他のサイトキンの結合シグナルと抗生物質を観察し、その結果を図2に示した。
その結果、関連する12のサイトキンの中で、ヒト化IL-5抗H1705-008およびh1706-009は、IL-5に特別に結合し、他のTh2サイトキンとの交差反応性を持たないことが示された。
in vivo活性の生物学的評価
試験例8
OVA誘発マウス喘息モデルにおけるIL-5抗体の有効性の評価
この試験は、卵白アルブミン(OVA)エアロゾルにより誘導したBALB/cマウス喘息モデルにおけるIL‐5抗体の有効性を評価するために、気道炎症反応と気道リモデリングに基づいた。
マウスを体重に応じて無作為に7群に分け、各群10匹のマウスを用いた。正常対照群(G1)、モデル群(G2)、試験される2つの抗体の2つの用量(10mpkおよび2mpk)でh1705-008(G3およびG4)およびh1706-009(G5およびG6)および陽性抗体Hu39D10対照群(G7、10mpk)である。1日目と14日目に、全てのマウスをアレルゲン溶液の腹腔内注射により感作した。28日目、29日目、および30日目に、6群のマウス(第1群を除く)に30分間、エアロゾルOVA負荷溶液を投与した。課題の2時間前に、2番目のグループ(G2)は胸内にリン酸緩衝を注入し、7番目のグループ(G3-G7)の3番目のグループ(G3-G7)のマウスは、違う量の異なった抗毒素(1日1回、3日連続)を腹内に注入した。各射出前に被験抗体を新たに調製し、抗体調製後30分以内に投与を終了した。第1群(正常対照群と同様)のマウスにPBSエアロゾルを30分間投与し、負荷リン酸緩衝液の2時間前に1日1回、連続3日間腹腔内注射した。
31日目に、WBPシステムを用いて、動物の気道過敏性を試験した。全動物をメタコリン摂取量2倍(1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50mg/ml)でエアロゾルで管理し、それに対応する濃度で呼吸増強休止値を測定した。
31日目、WBPシステムによる気道反応検出1時間後、直径1.2mmの気管を気管に挿入し、固定し、1% BSAと0.6mM EDTAからなる0.8mlのリン酸緩衝を用いて、2回、肺チューブを行った。トイレ流体の回収量を記録した。
BALFを4℃で300gで5分間遠心分離した。上清をサイトカイン分析のために維持した。遠心分離の後、細胞数を測定するために、1.5mlのPBS (1% BSAと0.6mM EDTAからなる)に再度消費した。BALFの細胞の総数を数えるためにヘモサイトメーターとトリパンブルー染料実験を用いた。電池をサイルド上に塗抹し、Wright染色溶液で1分間染色し、次いでギムザで7分間染色して、好酸球、好中球、マクロファージおよびリンパ球を識別した。計数は光顕微鏡で行った。
洗面後、肺組織を収集し、10%中性のホルムアルデハイド液で汚れ、その後、10%中性のホルムアルデハイド液で固定した。固定組織をパラフィンに埋め込み、トリミングし、H&Eによって汚れ、得点した。試験結果を図3、図4A、図4Bに示す。
結果は、本開示物のH1705-008およびH1706-009の抗菌分子が、用量依存モードで肺機能を大幅に改善する一方、正複合体の高用量(10mpk)は肺機能を改善できないことを示した(図3を参照)。一方、2種類の抗体は同量(10mpk)で好酸球レベルと粘膜の厚さを有意に減少させ、陽性抗体よりも強い好酸球減少能を示す(図4A、4B参照)。同じタイプのマウスぜん息モデルでは、繰り返しの実験により、1mm/ml h1705-008、h1706-009およびh1780-017が、BalFのエオシンオフィルのレベルを、正検出のレベルよりも大幅に減少させることが確認された(図4Cを参照)。
試験例9
外因性ヒトIL-5によるモルモット急性喘息モデルにおけるIL-5抗体のin vivo効果の評価
本実験では、ヒトIL-5により誘発される急性喘息モデルを確立するために、ヒトIL-5により誘発されるモルモット肺の気管支洗浄液(BALF)中の好酸球増加に対する本開示の5種のIL-5ヒト化mAbの抑制効果を評価するために、雄モルモットを選択し、hu39D10を陽性抗体として用いた。モルモットは9群に分けられ、各群は8～10頭の動物:普通対照群、モデル群、hu39D10(1mg/kg)群、h1705-008(1mg/kg)群、h1706-009(1mg/kg)群、h1780-017(1mg/kg)群、h1773-007(1mg/kg)群、h1779-014(1mg/kg)群に分けられた。モデル群と投与群のモルモットに、それぞれ、刺激のためにDay1にヒトIL5(5mmugのIL5抗原からなる)100mmlを気管内注入し、正常対照群にPBSを気管内注入した。投与群には、刺激の2時間前に、1mg/kgのIL5モノクローナル抗体を5ml/kgの投与量で腹腔内注射し、モデル群には対応するIgG抗体を投与し、正常対照群にはPBS溶媒を腹腔内投与した。気管内注入24時間後にモルモットを麻酔し、肺気管支洗浄液を抽出した。細胞濃度を5^106/mlに調整し、スライドに15mmを落とし、固定乾燥させ、HE汚染を行い、400倍の顕微鏡で細胞とエオシンオフィルの数を数え、エオシンオフィルの割合を計算した。結果は図5Aと図5Bに示されており、発明開示の5つの人間化抗物質が、BALFにおけるエオシンオフィルのレベルを大幅に減少させることを示している。
配合成分の選定・安定性評価
医薬組成物(製剤)のための模範的な準備工程
ステップ1:ある量の精製抗IL-5抗体溶液を採取し、無抗体緩衝液(30mM、pH5.5酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液など)を用いて溶媒交換(好ましくは限外濾過)を行い、少なくとも6倍量を限外濾過膜で交換し、タンパク質を約120mg/mLに濃縮した。ショ糖原液を一定量加え、混ぜて最終濃度72mg/mlとした。ポリソルベート80原液を一定量添加・混合し、最終濃度0.4mg/mLのポリソルベート80.10mM pH 5.5酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液を加え、一定量に達し、タンパク濃度100mg/mLで再開した(試験すべき他の調合物又は類似の工程に従って安定した調合物を調製した)。
製品はフィルタリングされ、その後、病原性物質を含まない中央制御サンプリングによってテストされた。原液は0.22mmのPVDFフィルタを通過し、ろ過液を採取した。
ステップ2:1.2mlに体積を調整し、2mlの瓶にストッパーを入れてろ過し、中央制御で初め、途中、最後にサンプルを採取し、負荷量の差を検出した。
ステップ3:キャッピングマシンがアルミキャップを塗布し、キャッピングを行うために開始された。
ステップ4:目視検査を行い、負荷が間違っているなど不具合がないことを確認した。瓶標識が印刷され、カートン標識が印刷され、カートンが折りたたまれ、梱包され、箱の標識が貼られた。
試験例10
緩衝系のスクリーニング
h1705-008は、たんぱく質濃度100mg/mlの標本をpH5.0～6.5の緩衝剤で調製し、これを振り回した標本は0.2mg/ml polysorbate 80(PS80)であり、その他の標本は0.05mg/ml PS80であった。緩衝系は、10mM酢酸‐酢酸ナトリウム(AA) pH5.0,5.5、 10mMコハク酸‐コハク酸ナトリウム(SA) pH5.0,5.5,6.0、10mMクエン酸‐クエン酸ナトリウム(CA) pH5.5,6.0,6.5、10mMヒスチジン‐塩酸塩(His) pH5.5,6.0,6.5、10mMリン酸塩(PB) pH6.0,6.5であった。各製剤を濾過し、充填し、ストッパーを適用し、キャップした。試料を強制劣化実験を行い、外観、SEC、iCIEFを評価指標とした。
結果を表19に示す。外観データは、試料が揺れ(300rpm、25°C)を経験し、40°Cの試料が異なった粒子形成度を示すことを示した。全体的に見たところ、pHが低いほど外観が良く、緩衝系の酢酸ナトリウム・酢酸ナトリウム・サクシン酸ナトリウムのほうが良い。SECデータによると、AA pH 5.5群は40°Cではやや良い。iCIEFデータによると、AA pH 5.5、His pH 5.5、CA pH 6.5群は40°Cではやや良い。物理学的および化学的安定性を総合的に考慮すると、AA pH 5.5が好ましい。
pH・緩衝系の審査結果
[表１９]
注: N/A は検出されず、D は曜日、T0 は曜日を表す。
試験例11
製剤中の賦形剤のスクリーニング
h1705-008は、10mM SA (pH 5.0)緩衝剤(以下、異なったタイプの賦形剤)で、たんぱく質濃度100mg/mlの配合を調製した。特に、次のとおりであった。
1) ポリソルベート20(PS20)0.1mg/ml
2) ポリソルベート80(PS80)0.1mg/ml
3) 50mg/ml ショ糖+0.1mg/ml PS80
4) 50mg/ml トレハロース+0.1mg/ml PS80
5) 50mg/ml マンニトール+0.1mg/ml PS80
6) 50mg/ml ソルビトール+0.1mg/ml PS80
7) アルギニン(アルギン)8mg+PS80 0.1mg/ml
8) 8mg/ml リジン(Lys) + 0.1mg/ml PS80
9) グライシン(グレイ)+0.1mg/ml PS80 8mm/ml
10) 8mg/ml メチオニン(Met) + 0.1mg/ml PS80
11) プロリン(プロ)8mg+PS80 0.1mg/ml
12) 8mg/ml塩化ナトリウム(NaCl) +0.1mg/mL PS80。
各製剤はろ過され、積み込まれ、ストッパーとキャップで覆われ、使用された。試料を40℃で強制劣化実験を行った結果(表20)、各試料群の間でSEC、CE、およびiCIEFの試験結果に有意な差はなく、Arg/Lys/NaClグループの外観はより悪く、他のグループ間の有意な差はなかった。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、プロリン、およびメチオニンは、タンパク質安定性に好影響を及ぼす。
添加剤のスクリーニング結果
[表２０]
注:D は曜日を表わす。
試験例12
界面活性剤のスクリーニング
h1705-008製剤は、10mM SA pH5.5、70 mml ショ糖、0.4 mml PS20またはPS80からなる製剤を、たんぱく質濃度100mm/mlで調製した。
試料を4℃に置き、安定性を調べた。結果を表21に示す。結果は、PS80群が4°Cで4か月間、明確な外観を示し、SEC、CE、およびiCIEFに有意な変化を示さないことを示し、良好な安定性を示したが、PS20群では大量の粒子が観察された。したがって、PS80はPS20より優れている。加えて、定式化にPS80を加えるとh1705-008に対してより良い安定化効果を持ち、定式化の安定性がより良いことがわかる。
h1705-008 の4℃での安定性の結果
[表２１]
(注)Mはヶ月、N/Aは検出されない。
試験例13
DOE配合の設計とスクリーニング
DOE(実験の設計)は、pH10mMの酢酸バッファー(AA)、タンパク量、Tween量を変数として、pH5.0～5.8、PS80の量0.2～0.6、H1705-008の量80～120 mg/ml、を基に一連の定式化を行った。表22に示す。試料は40℃の高温で強制劣化を受けた。外観、SEC、非低減CE、およびiCIEFを評価指標として使用した。結果を表23に示す。
DOE策定のための審査実験と設計
[表２２]
DOE製剤のスクリーニング実験結果
[表２３]
注:D は曜日を表わす。
その結果、各製剤の外観は明らかであり、SEC、CE、iCIEFはそれぞれ<2%、<2%、約14%の許容範囲内で減少し、製剤の安定性は良好であり、80-120mg/ml、0.2-0.6mg/ml PS80、pH 5.0-5.8となっている。最適な調合方法は、100mg/mlたんぱく質、0.4mg/ml PS80、pH 5.5である。
試験例14
安定性試験
10mM AA pH 5.5、70mg/mlスクロース、および0.4mg/ml PS80を含むh1705～008配合を調製し、タンパク質濃度を100mg/mlとし、試料を4℃および25℃で安定性検討に供した。結果を表24に示す。
その結果、高温条件下では、SEC、CE、およびiCIEFはh1705-008の定式ではわずかに減少したが、その減少は許容範囲内であり、他の条件下ではすべての指標に著しい変化はないことが示された。製剤は良好な安定性を有し、6ヶ月以内に4℃でh1705-008の安定性を確保することができる。
25℃及び4℃におけるh1705-008の安定性結果
[表２４]
(注)Mはヶ月を表わす。
試験例15
イオン強度のスクリーニング
異なるイオン強度を有する酢酸(ナトリウム)緩衝液中で、100mg/mL、70mg/mLショ糖および0.4mg/mL PS80のタンパク濃度を含むh1705～008配合を調製し、交換に使用する緩衝液のpHおよび最終配合のpHを測定した。結果を表25に示す。結果は、イオン強度が高いほど、pHドリフトが低いことを示した。イオン強度が30mMであれば、pHドリフトは0.1以下である。
イオン強度の異なる製剤のpH結果
[表２５]
試験例16
糖類濃度のスクリーニング
異なる濃度のスクロースを含む次の緩衝液中で、100mg/mL、30mM AA pH 5.5、0.4mg/ml PS80のタンパク質濃度を含むh1705～008配合を調製した。浸透圧を測定した。結果を表26に示す。
その結果、糖類濃度が70～75mg/mlであれば290～310mosm、浸透圧力70mg/ml及び73mg/mlであれば、糖類濃度が72mg/mlであれば、300 mosm/mlの最良値に達する浸透圧力が得られることがわかった。
糖度の異なるh1705-008製剤における浸透圧力の比較
[表２６]
試験例17
製剤の安定性試験
4℃および25℃での安定性を調べるために、100mg/mL、30mM AA pH 5.5、72mg/mlショ糖、0.4mg/ml PS80のタンパク濃度を含むh1705～008配合を調製した。結果を表27に示す。その結果、高温条件下のh1705-008製剤では、SEC、CE、IECがわずかに減少したが、その減少は許容範囲内であり、4℃条件下のすべての指標に有意な変化はなく、製剤が良好な安定性を持っていることを示した。
h1705-008公式の安定性
[表２７]
備考:Mはヶ月、Tは時間、N/Aは確定されていない。
試験例18
追加の任意配合
さらに、本開示は、以下に限定されないが、を含む抗IL-5抗薬剤のための追加の製剤も提供する。
(1)1mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/mlポリソルベート80、pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝液10mM
(2)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝液20mM
(3)120mm/ml 抗IL-5(h1705-008)、72mm/ml スクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液
(4)pH 5.0で100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、80mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80、および30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(5)pH 5.4で80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、75mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(6)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、80mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液30mM
(7)pH 5.6で90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、74mg/mlのスクロース、0.5mg/mlのポリソルベート80、および25mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(8)pH 5.4で90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、76mg/mlのスクロース、0.3mg/mlのポリソルベート80、および35mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(9)pH 5.6で80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80、および30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(10)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液
(11)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、80mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝剤
実験結果は、上述のようなIL-5製剤は良好な安定性を有し、IL-5製剤の準備に適用できることを示した。
試験例19
抗IL-5抗体製剤の凍結乾燥
pH 5.5の30mMの酢酸ナトリウム緩衝液中で、72mg/mlスクロース、0.4mg/mlポリソルベート80および100mg/ml抗IL-5の濃度からなるh1705-008の液体製剤を調製した。抗体を2.15mL/瓶で6mL瓶に充填し、凍結乾燥のために凍結乾燥室に入れた。凍結前乾燥、一次乾燥、二次乾燥からなる。フィロフィリエーション処理が終わると、バイアルは真空にさらされ、ストッパーで適用された。再構成された試料は、親和性を得る前に反対側と比較された。その結果、再構成された解は液体配合のそれと同じように良好な性能を維持できることを示した。
製剤のリョフィリゼーション工程
[表２８]
注: N/Aは、表が適用されなかったことを表す。
本開示は、医薬製剤の分野に属し、特には、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物と、ＩＬ－５関連疾患のための診断用薬及び治療薬としての、この医薬組成物の使用とに関する。
本明細書における記載事項は、本開示に関連付けられた背景情報を提供するにすぎず、必ずしも従来技術を校正するとは限らない。
インターロイキン－５（ＩＬ－５）は、インターロイキンファミリーの重要なメンバーの１つであるが、主にヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）によって分泌されるホモダイマー型糖タンパク質であるＴ細胞代行因子（ＴＲＦ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ細胞増殖因子－ＩＩ（ＢＣＧＦ－ＩＩ）、ＩｇＡ増強因子（ＩｇＡ－ＥＦ）又は好酸球分化因子（ＥＤＦ）としても公知である。ヒトＩＬ－５は、１３４個のアミノ酸残基から構成され、２２個のアミノ酸及び２つのグリコシル化部位から構成されるシグナルペプチドを含む。活性ＩＬ－５は、逆平行構成になった２本のペプチド鎖がジスルフィド結合によって連結されたオリゴダイマーであるが；ＩＬ－５モノマーは、生物活性を有さない（Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；５７：１４５～９０）。
好酸球（ＥＯＳ）は、アレルギー性反応に関連付けられたアレルギー性疾患を含む、様々な肺の炎症性疾患に関連付けられている。ぜんそくは、慢性炎症性呼吸器疾患である。世界中で約３億人の患者が存在し、発症率は１０％である。ぜんそくの発病機序は、様々なサイトカインに関連付けられている。ＩＬ－５及び受容体ＩＬ－５Ｒは、ぜんそくの発病機序において、重要な役割を担う。現在、ぜんそくを処置する最も効果的な方法は、ぜんそくに関与するいくつかの重要なメディエーター（ＩＬ－５を含む）の発現を阻害し、これにより、肺の炎症を低減するようにステロールを経鼻又は経口投与することである。しかしながら、ステロイド剤の長期的な施用には、数多くの副作用がある。したがって、ぜんそくの処置のための新規な創薬ターゲットを見つけ出すことが必要である。研究により、抗ＩＬ－５抗体の投与は、ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を阻害し；肺における好酸球の蓄積を有意に低減し、血液、組織及び喀痰中における好酸球のレベルを低下させ；好酸球によって媒介され得る炎症反応を低減し；肺機能を改善し；好酸球性ぜんそく及び再発性ぜんそくに好ましい影響を与えることが示されている（Ｄｒｕｇｓ．２０１７年５月；７７（７）：７７７～７８４）。
抗体剤は、高い分子量及び複雑な構造を有する。製造、輸送及び貯蔵のプロセスにおいて、抗体にはしばしば、粒子の変性、凝集、汚染及び形成を原因とする課題がつきまとう。抗体を効果的なものに保つためには、製造中、精製、中輸送中及び貯蔵中に抗体の生物活性が維持されなければならない。現在、高度に精製された多数のモノクローナル抗体を製造すべく、製造及び精製のための新技術が開発されている。しかしながら、どのようにしてこれらの抗体を輸送及び貯蔵中に安定させるか、及びどのようにして投与に適した剤形の抗体を用意するかが常に課題となってきた。
抗ＩＬ－５抗体に関しては、ＧＳＫのメポリズマブ及びＴｅｖａ Ｐｈａｒｍａのレスリズマブのみが、現在、市販を承認されている。関連特許は、国際公開第２０１８／１１９０１６号、国際公開第２０１７／０３３１２１号、国際公開第２０１４／１４１１４９号、国際公開第２０１６／０４０００７号、国際公開第２０１５／０９５５３９号、国際公開第２０１２／１３８９５８号及び国際公開第９５／３５３７５号等を含む。
国際公開第２０１８／１１９０１６号 国際公開第２０１７／０３３１２１号 国際公開第２０１４／１４１１４９号 国際公開第２０１６／０４０００７号 国際公開第２０１５／０９５５３９号 国際公開第２０１２／１３８９５８号 国際公開第９５／３５３７５号
Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；５７：１４５～９０ Ｄｒｕｇｓ．２０１７年５月；７７（７）：７７７～７８４
本開示は、ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、バッファー及び界面活性剤を含む、医薬組成物であって、バッファーが、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー、ヒスチジン－塩酸塩バッファー及びクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファーからなる群より選択されるいずれか１つであり、好ましくは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー又はコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーであり；抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：１６、１７及び１８に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：１９、２０及び２１に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２２、２３及び２４に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２５、２６及び２７に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｉｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２８、２９及び３０に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３１、３２及び３３に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３４、３５及び３６に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３７、３８及び３９に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｖ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：４０、４１及び４２に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：４３、４４及び４５に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；又は、
（ｖｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３４、８２及び３６に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３７、３８及び３９に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
医薬組成物を提供する。
代替的な実施形態において、医薬組成物中におけるバッファーのｐＨは、約５．０～約６．５、好ましくは約５．５～約６．５、好ましくは約６．０～約６．５、好ましくは約５．０～約６．０、好ましくは約５．５～約６．０、好ましくは約５．０～約５．５、好ましくは約５．０～約５．８、好ましくは約５．２～約５．８であり；バッファーのｐＨの非限定的な例は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．５を含み、最も好ましくは約５．５が最も好ましい。
代替的な実施形態において、医薬組成物中におけるバッファーの濃度は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約１５ｍＭであり；バッファーの濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３２ｍＭ、約３４ｍＭを含み、約３０ｍＭが最も好ましい。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中における抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約９０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１１０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約９０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌであり；非限定的な例として、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約９１ｍｇ／ｍｌ、約９２ｍｇ／ｍｌ、約９３ｍｇ／ｍｌ、約９４ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ、約９６ｍｇ／ｍｌ、約９７ｍｇ／ｍｌ、約９８ｍｇ／ｍｌ、約９９ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０１ｍｇ／ｍｌ、約１０２ｍｇ／ｍｌ、約１０３ｍｇ／ｍｌ、約１０４ｍｇ／ｍｌ、約１０５ｍｇ／ｍｌ、約１０６ｍｇ／ｍｌ、約１０７ｍｇ／ｍｌ、約１０８ｍｇ／ｍｌ、約１０９ｍｇ／ｍｌ、約１１０ｍｇ／ｍｌ、約１１５ｍｇ／ｍｌ、約１２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物に含まれる界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリヒドロキシアルキレン、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホン酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミタミドプロピルベタイン、イソステアミドプロピルベタイン（ｉｓｏｓｔｅａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａｉｎｅ）、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パームアミドプロピルジメチルアミン（ｐａｌｍａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｃｏｃｏｙｌ）、メチルオレオイルタウリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー等からなる群より選択することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０又はポリソルベート２０であり、より好ましくはポリソルベート８０である。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中におけるポリソルベート８０の濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例として、本医薬組成物中における界面活性剤の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌである。
さらに、代替的な実施形態において、本医薬組成物は、賦形剤をさらに含み、賦形剤は、安定剤から選択される。
代替的な実施形態において、安定剤は、糖又はアミノ酸から選択され；糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール及びソルビトールからなる群より選択することができ、好ましくはスクロースである。アミノ酸は、グリシン、メチオニン及びプロリンからなる群より選択される。
代替的な実施形態において、糖の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７５ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約７５ｍｇ／ｍｌであり；非限定的な例として、本医薬組成物中における安定剤の濃度は、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７１ｍｇ／ｍｌ、約７２ｍｇ／ｍｌ、約７３ｍｇ／ｍｌ、約７４ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約７６ｍｇ／ｍｌ、約７７ｍｇ／ｍｌ、約７８ｍｇ／ｍｌ、約７９ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約７２ｍｇ／ｍｌを含む。
代替的な実施形態において、アミノ酸の濃度は、約８ｍｇ／ｍｌである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ａ） 約１ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｂ） ｐＨ約５．０～６．５の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；及び（ｃ） 約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ａ） 約８０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｂ） ｐＨ約５．０～約６．０の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；及び（ｃ） 約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ｄ） 約８０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌのＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｅ） ｐＨ約５．０～約５．８の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；（ｆ） 約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；及び（ｇ） 約７０ｍｇ／ｍｌ～約７５ｍｇ／ｍｌのスクロース
を含み；好ましくは、本医薬組成物は好ましくは、
（ｈ） 約１００ｍｇ／ｍｌのＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、（ｉ） ｐＨ約５．５の約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、（ｊ） 約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び（ｋ） 約７２ｍｇ／ｍｌのスクロース
を含む。
一部の好ましい実施形態によれば、本開示の医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、配列番号：４９、５７、６３、６９若しくは７５に示された重鎖可変領域又はそのバリアントを含み；バリアントは、それぞれ配列番号：４９、５７、６３、６９又は７５に示された重鎖可変領域配列中に１～１０個のアミノ酸復帰変異を含む。
代替的な実施形態において、バリアントは、
（ｉ） 配列番号：４９に示された重鎖可変領域中にあるＳ４９Ｔ、Ｖ９３Ｔ及びＫ９８Ｓからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉ） 配列番号：５７に示された重鎖可変領域中にあるＳ４９Ｔ、Ｖ９３Ｔ及びＫ９８Ｔからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉｉ） 配列番号：６３に示された重鎖可変領域中にあるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ及びＬ８３Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｖ） 配列番号：６９に示された重鎖可変領域中にあるＦ２９Ｉ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ４８Ｉ、Ｒ７２Ａ及びＴ９７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異及び／若しくはＣＤＲ中にあるＮ５５Ｖ変異を含む、バリアント；又は、
（ｖ） 配列番号：７５に示された重鎖可変領域中にあるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｍ８１Ｌ、Ｌ８３Ｆ及びＤ８９Ｅからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか１つに示されたバリアントである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
配列番号：５０若しくは５１に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：５８若しくは５９に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：６４、６５及び６６からなる群より選択されるいずれか１つに示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：７０若しくは７１に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：７６、７７、７８及び７９からなる群より選択されるいずれか１つに示された重鎖可変領域
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、配列番号：４６、５４、６０、６７若しくは７２に示された軽鎖可変領域又はそのバリアントを含み；バリアントは、配列番号：４６、５４、６０、６７又は７２に示された軽鎖可変領域中にある１～１０個のアミノ酸復帰変異を含む。
代替的な実施形態において、バリアントは、
（ｉ） 配列番号：４６に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｖ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉ） 配列番号：５４に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｍ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉｉ） 配列番号：６０に示された軽鎖可変領域中にあるＥ１Ｄ、Ｉ２Ｔ、Ｉ５７Ｖ、Ｖ８４Ｔ及びＹ８６Ｆ又はこれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｖ） 配列番号：６７に示された軽鎖可変領域中にあるＭ４Ｌ、Ａ４２Ｓ、Ｌ４５Ｐ及びＬ４６Ｗからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；並びに、
（ｖ） 配列番号：７２に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｉ４８Ｖ及びＦ７１Ｙからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか１つに示されたバリアントである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
配列番号：４７若しくは４８に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：５５若しくは５６に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：６１若しくは６２に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：６８に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：７３若しくは７４に示された軽鎖可変領域
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
（ｉ） 配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｉ） 配列番号：５７、５８及び５９のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：５７、５８及び５９のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：５４、５５及び５６のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：５４、５５及び５６のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ） 配列番号：６３、６４、６５及び６６のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６３、６４、６５及び６６のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：６０、６１及び６２のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６０、６１及び６２のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｖ） 配列番号：６９、７０及び７１のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６９、７０及び７１のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：６７及び６８のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６７及び６８のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；又は、
（ｖ） 配列番号：７５、７６、７７、７８及び７９のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：７５、７６、７７、７８及び７９のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：７２、７３及び７４のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：７２、７３及び７４のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域を含み；好ましくは、ヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
（ａ） 配列番号：５１に示された重鎖可変領域及び配列番号：４７に示された軽鎖可変領域；
（ｂ） 配列番号：６５に示された重鎖可変領域及び配列番号：６２に示された軽鎖可変領域；
（ｃ） 配列番号：５８に示された重鎖可変領域及び配列番号：５６に示された軽鎖可変領域；
（ｄ） 配列番号：７１に示された重鎖可変領域及び配列番号：６８に示された軽鎖可変領域；又は、
（ｅ） 配列番号：７９に示された重鎖可変領域及び配列番号：７３に示された軽鎖可変領域
を含む。
上記少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有し、より好ましくは、９７％、９８％又は９９％以上の配列相同性を有し、最も好ましくは、少なくとも９９％以上の配列相同性を有し、上記少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列は、変異によって得られた１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、ヒト抗体定常領域、好ましくは、配列番号：５２に示されたヒト抗体重鎖定常領域及び配列番号：５３に示されたヒト抗体軽鎖定常領域を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、
（ｉ） 配列番号：８３に示された重鎖及び配列番号：８４に示された軽鎖；
（ｉｉ） 配列番号：８５に示された重鎖及び配列番号：８６に示された軽鎖；
（ｉｉｉ） 配列番号：８７に示された重鎖及び配列番号：８８に示された軽鎖；
（ｉｖ） 配列番号：８９に示された重鎖及び配列番号：９０に示された軽鎖；又は、
（ｖ） 配列番号：９１に示された重鎖及び配列番号：９２に示された軽鎖
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５への結合に関しては上記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントと競合する、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
好ましい一実施形態において、本開示の医薬組成物中の抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイマー化Ｖ領域（二重特異性抗体）及びジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）からなる群より選択される。
本開示は、抗ＩＬ－５抗体のストック溶液をバッファーによって置きかえるステップを含む、上記医薬組成物を調製するための方法をさらに提供する。代替的な実施形態において、好ましくは、バッファーは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファーである。バッファーのｐＨは、約５．０～約６．５、好ましくは約５．５～約６．５、好ましくは約６．０～約６．５、好ましくは約５．０～約６．０、好ましくは約５．５～約６．０、好ましくは約５．０～約５．５、好ましくは約５．２～約５．８であり、バッファーのｐＨ値の非限定的な例は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．５を含み、約５．５が最も好ましい。代替的な実施形態において、本医薬組成物中におけるバッファーの濃度は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約１５ｍＭであり；バッファーの濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭを含み、最も好ましくは約３０ｍＭが最も好ましい。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのトレハロース及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのソルビトール及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのメチオニン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのプロリン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７３ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間又は少なくとも２４か月間２～８℃で安定である。本医薬組成物は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間２５℃で安定であり得る。
本開示は、上記医薬組成物を凍結乾燥させるステップを含む、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法をさらに提供する。
代替的な一実施形態において、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法における凍結乾燥は、予備凍結ステップ、一次乾燥ステップ及び二次乾燥ステップを順次含む。凍結乾燥は、製剤を凍結させた後、一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって実施される。このような条件下では、生産物の温度は、製剤の共晶点又は分解温度より低い。一般的に約５０～２５０ｍＴｏｒｒの範囲である適切な圧力下では、一次乾燥のための貯蔵温度は通常、約－３０～２５℃である（一次乾燥中には生産物が凍結状態のままであると仮定する）。製剤、サンプル容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズ及び種類並びに液体の体積が、乾燥に必要な期間を決定するが、この期間は、数時間～数日の範囲（例えば、４０～６０時間）であり得る。二次乾燥は、約０～４０℃で実施することができるが、これは主に、容器の種類及びサイズ及び使用されるタンパク質の種類に左右される。二次乾燥の期間は、生産物の望ましい残留湿分レベルによって決定されるが、通常、少なくとも約５時間を必要とする。一般に、低圧下で調製された凍結乾燥製剤の含水量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。二次乾燥の圧力は、一次乾燥ステップにおいて適用された圧力と同じであってもよく；好ましくは、二次乾燥において使用される圧力は、一次乾燥において使用される圧力より低い。凍結乾燥のための条件は、製剤及びバイアルのサイズに応じて変化し得る。
本開示は、上記抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法によって調製された、ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤をさらに提供する。
一部の実施形態において、凍結乾燥製剤は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間又は少なくとも２４か月間２～８℃で安定である。一部の実施形態において、凍結乾燥製剤は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間又は少なくとも２８日間４０℃で安定である。
本開示は、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を復元するステップを含む、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製するための方法であって、復元のために使用される溶液が、限定されるわけではないが注射用水、生理食塩水又はグルコース溶液を含む、方法をさらに提供する。
本開示は、上記抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液を調製するための方法によって調製された、ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液をさらに提供する。
本開示は、本明細書における安定な医薬組成物のいずれかを含む容器を含む、物品又はキットをさらに提供する。一部の実施形態において、容器は、中性ホウケイ酸ガラス製の注射用バイアルである。
本開示は、上記医薬組成物又は凍結乾燥製剤又は凍結乾燥製剤の復元溶液を含む容器を含む、物品をさらに提供する。
本開示は、治療有効量の上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記復元溶液又は上記製造物を、それを必要としている対象に投与することを含む、ＩＬ－５媒介疾患を処置するための方法であって、ＩＬ－５媒介疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、方法をさらに提供する。
本開示は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するための医薬品の調製における、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物の使用であって、ＩＬ－５媒介性疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、使用をさらに提供する。
本開示は、ＩＬ－５媒介性疾患の処置用の治療用医薬品としての使用のための、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物であって、ＩＬ－５媒介性疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物をさらに提供する。
当業者には周知のように、本開示における各実施形態の特徴のうちの１つ、いくつか又はすべてをさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成することもできる。上記本開示の実施形態及び組合せによって得られたさらなる実施形態については、以下の詳細な説明によってさらに説明する。
抗ＩＬ－５抗体がＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を阻止する、ＦＡＣＳ実験の結果を示す、図である。 Ｔｈ２サイトカインに対する抗ＩＬ－５抗体の結合特異性の検出結果を示す、図である。 抗ＩＬ－５抗体が間欠呼吸（Ｐｅｎｈ）のレベルを向上させることを示す、図である。Ｇ１：正常コントロール群（ＰＢＳ）；Ｇ２：モデル群（ＩｇＧ）；Ｇ３：ｈ１７０５－００８抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５－００８抗体２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６－００９抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６－００９抗体２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０ １０ｍｐｋ群；＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１（ＡＮＯＶＡ／ＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉによるＧ２群との比較）。 ぜんそくマウスの肺におけるＢＡＬＦ好酸球のレベルを示す、図である。 ぜんそくマウスの気管粘膜厚さのスコアを示す、図である。Ｇ１：正常コントロール群；Ｇ２：モデル群；Ｇ３：ｈ１７０５－００８抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５－００８抗体２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６－００９抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６－００９抗体２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０ １０ｍｐｋ群。 ぜんそくマウスの肺におけるＢＡＬＦ好酸球の百分率を示す、図である。 ＢＡＬＦにおける好酸球のレベルを低下させるＩＬ５モノクローナル抗体の能力を示す、図である。 ＢＡＬＦにおける好酸球のレベルを低下させるＩＬ５モノクローナル抗体の能力を示す、図である。
用語
本開示をより容易く理解するために、特定の専門用語及び科学技術用語が、以下に厳密に規定されている。本明細書において使用されているすべての他の専門用語及び科学技術用語は、そうではないと明示的に規定されていない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「バッファー」は、酸－塩基共役成分の作用により、ｐＨの変化に耐性のあるバッファーを指す。ｐＨを適切な範囲に制御するバッファーの例には、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジン塩バッファー、シュウ酸バッファー、乳酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グリシル－グリシンバッファー及び他の有機酸バッファーが挙げられる。
「ヒスチジン塩バッファー」は、ヒスチジンイオンを含むバッファーである。ヒスチジン塩バッファーの例には、ヒスチジン－塩酸塩バッファー、ヒスチジン－酢酸バッファー、ヒスチジン－リン酸バッファー及びヒスチジン－硫酸バッファー等が挙げられるが；ヒスチジン－酢酸バッファー又はヒスチジン－塩酸塩バッファーが好ましく；ヒスチジン－酢酸バッファーは、ヒスチジン及び酢酸によって調製され、ヒスチジン塩バッファーは、ヒスチジン及びＨＣｌによって調製される。
「クエン酸バッファー」は、クエン酸イオンを含むバッファーである。クエン酸バッファーの例には、クエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カルシウムバッファー及びクエン酸－クエン酸マグネシウムバッファー等が挙げられる。好ましいクエン酸バッファーは、クエン酸－クエン酸ナトリウムバッファーである。
「コハク酸バッファー」は、コハク酸イオンを含むバッファーである。コハク酸バッファーの例には、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー、コハク酸－コハク酸カリウムバッファー及びコハク酸－コハク酸カルシウムバッファー等が挙げられる。好ましいコハク酸バッファーは、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーである。
「リン酸バッファー」は、リン酸イオンを含むバッファーである。リン酸バッファーの例には、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファー、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウムバッファー及びリン酸水素二ナトリウム－クエン酸バッファー等が挙げられる。好ましいリン酸バッファーは、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファーである。
「酢酸バッファー」は、酢酸イオンを含むバッファーである。酢酸バッファーの例には、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、ヒスチジン酢酸バッファー、酢酸－酢酸カリウムバッファー、酢酸－酢酸カルシウムバッファー及び酢酸－酢酸マグネシウムバッファー等が挙げられる。好ましい酢酸バッファーは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファーである。
「医薬組成物」は、本明細書に記載された化合物（又は生理学的な／薬学的に許容されるその塩若しくはプロドラッグ）の１種以上と、他の化学成分（生理学的な／薬学的に許容されるキャリア及び賦形剤等）とを含む、混合物を意味する。医薬組成物の目的は、活性成分の吸収及び生物活性を増進するように、抗体活性成分の安定性を維持し、生物への投与を容易にすることである。
本明細書において使用されているとき、「医薬組成物」及び「製剤」は、互換的に使用されている。
本開示における「糖」は、従来の（ＣＨ２Ｏ）ｎと、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元性のある糖、還元性のない糖等を含む、（ＣＨ２Ｏ）の誘導体とを含む。糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセロール、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メリトリオース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース等からなる群より選択することができる。好ましい糖は、非還元性二糖、より好ましくはスクロースである。
本開示によれば、本医薬組成物の溶液形態に含まれる溶媒は、そうではないと指定されていない限り、水である。
「凍結乾燥製剤」は、医薬組成物又は製剤の液体又は溶液形態を真空凍結乾燥することによって得られた、製剤又は医薬組成物を意味する。
本開示における凍結乾燥は、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。予備凍結の目的は、生産物を凍結させて、結晶性の固体を得ることである。予備凍結温度及び予備凍結速度は、２つの重要なプロセスパラメータである。本開示において、予備凍結温度は、－４５℃に設定されており、予備凍結速度は、１℃／ｍｉｎである。一次乾燥は、乾燥とも呼ばれ、サンプルを凍結乾燥させるための主要段階である。一次乾燥の目的は、生産物への損傷を最小レベルに限定するように、生産物の形状を維持しながら生産物から氷を除去することである。一次乾燥温度及び真空度が適切に選択されていない場合、生産物は崩壊する。温度及び真空度を高めると、凍結乾燥の効率が加速的に高まるが、生産物崩壊の危険性も増大する。本発明における一次乾燥の温度は、－３０℃～０℃等、当技術分野における慣用的な温度であってよい。二次乾燥は真空乾燥とも呼ばれ、最高真空（ｕｌｔｉｍａｔｅ ｖａｃｕｕｍ）（０．０１ｍｂａｒ）を引き、温度（２０～４０℃）を上げることによって生産物から結合水を除去する、主要ステップである。大部分の生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）は温度に対して鋭敏であるため、選択された二次乾燥温度は、温度範囲の下限である２５℃にすべきである。凍結乾燥の期間、冷凍機、凍結乾燥すべき製剤の用量及び凍結乾燥すべき製剤の容器に関連付けられている。当業者ならば、どのようにしてこのような期間を調整するかについてはよく知っている。
本明細書において使用されているとき、「約」及び「およそ」という用語は、ある値が、当業者によって測定された特定の値の許容誤差範囲内であることを意味する。前述の特定の値は、どのようにして値が測定又は決定されるか（すなわち、測定システムの限界）に部分的に依存する。例えば、当技術分野におけるいかなる慣行においても、「約」は、標準偏差が１以内又は１超であることを意味する。一代替形態として、「約」又は「実質的に含む」は、最大±２０％の範囲を意味し、例えば、約５．５のｐＨは、ｐＨ５．５±１．１を意味する。さらに、特に生物系又は生物学的プロセスに関しては、「約」という用語は、ある値の最大１０倍又は最大５倍を意味する。そうではないと指定されていない限り、特定の値が本出願及び特許請求の範囲に示されている場合、「約」又は「実質的に含む」の意味は、特定の値の許容誤差範囲内であるべきである。
本開示の医薬組成物は、安定な効果をもたらすことができ、すなわち、本医薬組成物に含まれる抗体は、貯蔵後でも物理的安定性及び／若しくは化学的安定性、並びに／又は、生物活性を実質的に保持している。好ましくは、本医薬組成物は、貯蔵後でも、物理的安定性及び化学的安定性並びに生物活性を実質的に保持している。一般に、貯蔵期間は、本医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて決定される。現在、タンパク質の安定性を測定するための分析法は複数存在するが、これらの分析法を使用して、選定された期間にわたって選択された温度で貯蔵された後の安定性を測定することができる。
安定な抗体の医薬製剤は、低温（２～８℃）で少なくとも３か月間、好ましくは６か月間、より好ましくは１年間、さらにより好ましくは最大２年間貯蔵されるという条件下において、有意な物理的及び／又は化学的及び／又は生物学的変化が観察されない製剤である。さらに、安定な液体製剤は、２５℃の温度で１か月間、３か月間又は６か月間貯蔵された後に望ましい特性を示す液体製剤を含む。一般的に、安定な製剤に関する基準は、次のとおりである：ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したときに、分解される抗体モノマーが一般的には約１０％以下、好ましくは約５％以下であること；目視検査によると、抗体の医薬製剤が、明るい黄色であり、ほぼ無色透明な液体であり、若しくは無色であり、又は透明～わずかに淡い色がついたものであること；製剤の濃度、ｐＨ及び質量オスモル濃度のバラつきが±１０％以下であること；観察される減少が一般に約１０％以下、好ましくは約５％以下であること；形成される凝集が一般に約１０％以下、好ましくは約５％以下であること。
色及び／又は透明性についての目視検査により、又は紫外光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたときに、抗体が有意に増大した凝集、沈殿及び／又は変性を示さない場合、抗体は、医薬製剤中で「物理的安定性を保持している」と考えられる。タンパク質立体構造の変化は、タンパク質の三次構造を決定する蛍光分光法、及びタンパク質の二次構造を決定するＦＴＩＲ分光法によって評価することができる。
抗体が有意な化学的修飾を示さない場合、抗体は、医薬製剤中で「化学的安定性を保持している」と考えられる。化学的安定性は、化学的に改変されたタンパク質の形態を検出及び定量化することによって、評価することができる。タンパク質の化学的構造を高頻度で改変する分解プロセスは、加水分解又はトランケーション（サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の方法によって評価される）、酸化（質量分析又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチド分光法等の方法によって評価される）、脱アミド（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチド分光法、イソアスパラギン酸測定等の方法によって評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含量の測定、ペプチド分光法等の方法によって評価される）を含む。
所与の時間が経ったときの抗体の生物活性が、依然として、医薬製剤が最初に調製されたときの時点において示された生物活性に対して所定の範囲に収まっている場合、抗体は、医薬製剤中で「生物活性を保持している」と考えられる。抗体の生物活性は、例えば、抗原結合アッセイによって測定することができる。
本開示において使用されているアミノ酸に関する３文字のコード及び１文字のコードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２４３、ｐ３５５８（１９６８）で説明されている。
本開示において使用されている「抗体」は、免疫グロブリンを指し；完全な抗体は、鎖間ジスルフィド結合によって結合した２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖から構成される、テトラペプチド鎖構造である。
本開示において、本開示の抗体軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含み、軽鎖定常領域は、ヒト又はマウスκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントを含む。
本開示において、本開示の抗体重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、ヒト又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントを含む。
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸は可変性が高く、可変領域（Ｆｖ領域）として知られており；Ｃ末端に近いアミノ酸配列の残り部分は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）及び４つの比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ、ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ、ＶＨ）のそれぞれは、３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端までの順番は、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。本開示に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメント中のＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域に属するＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、公知のＫａｂａｔ式ナンバリング基準（ＬＣＤＲ１～３、ＨＣＤＲ１～３）に従っている。
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体が好ましい。
本開示において、「抗体の抗原結合性フラグメント」又は「機能的フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメントと、Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び、抗体に結合するＦｖフラグメントとｓｃＦｖフラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域を有さず、Ｆｖフラグメントは、すべての抗原結合部位を有する最も小さい抗体フラグメントである。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに備え、抗原結合に必要な構造を形成することができる。異なるリンカーを使用して、２つの抗体可変領域を連結し、これにより、一本鎖抗体及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれるポリペプチド鎖を形成することもできる。
本開示の「抗原結合部位」という用語は、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントによって認識される抗原における、連続的又は非連続的な三次元空間の部位を指す。
本開示における「マウス抗体」という用語は、当技術分野における知識及び技能に従って調製された、ヒトＩＬ－５に対するモノクローナル抗体を指す。調製中には、試験対象にＩＬ－５抗原を注射した後、所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現させるハイブリドーマを単離する。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域と、マウス抗体によって誘導される免疫反応を低減するヒト抗体の定常領域とを融合させることによって形成された、抗体である。キメラ抗体を樹立するためには、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを新たに樹立し；次いで、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし；次いで、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし；マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と組み合わせて、キメラ遺伝子を形成し、このキメラ遺伝子をヒトベクターに挿入し、最後に、キメラ抗体分子を、工業的な真核生物系又は工業的な原核生物系中で発現させる。本開示の好ましい一実施形態において、ＩＬ－５キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。ＩＬ－５キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域からなる群より選択することが可能であり、好ましくは、ヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域、又は、アミノ酸の変異後にＡＤＣＣ毒性（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）を有さないＩｇＧ４を含む。
ＣＤＲグラフト化抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域フレームワークへのマウスＣＤＲ配列のグラフト化によって生成された抗体、すなわち、異なる種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において生成された抗体を指す。ヒト化抗体は、多数のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘導される、異種性による強い反応を回避する。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を収載した公開ＤＮＡデータベース又は公開されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）で確認することもできるし、さらには、Ｋａｂａｔ，ＥＡら １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版で確認することもできる。免疫原性の低下によって起きる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域中のフレームワーク配列には、活性を維持するように最小限の逆変異（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は復帰変異を発生させてもよい。本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲアフィニティ成熟がファージディスプレイによって実施された、ヒト化抗体も指す。
本開示において、「ＡＤＣＣ」（すなわち、抗体依存性細胞介在性細胞傷害）は、Ｆｃ受容体を発現した細胞が、抗体のＦｃセグメントを認識することにより、抗体で覆われた標的細胞を直接死滅させることを意味する。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの修飾によって低下させ、又はなくすことができる。修飾は、ＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異からなる群より選択されるもの等の変異が、抗体の重鎖定常領域に発生することを指す。
本開示における変異配列中の「変異」は、限定されるわけではないが、「復帰変異」、「保存的修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「保存的置きかえ（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）若しくは保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」を含む。本開示において使用されている「保存的修飾」又は「保存的置きかえ若しくは保存的置換」は、タンパク質の生物活性を変化させることなく高頻度で置きかえを実施できるように、類似の特性（電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造及び剛直性等）を有する他のアミノ酸を使用して、タンパク質中のアミノ酸を置きかえることを指す。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの必須でない領域における単一のアミノ酸置換が、生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁、（第４版）を参照されたい。）。さらに、類似の構造又は機能によるアミノ酸の置換は、生物活性を乱す可能性が低い。
本開示における「変異配列」は、本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列とは異なる配列相同性の百分率を有するヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が得られるように、本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が変異（置換、挿入又は欠失等）によって適切に修飾されていることを指す。本開示において、配列相同性は、少なくとも８５％、９０％又は９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が挙げられる。配列アラインメント及び２種の配列間の同一性の百分率の決定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定によって実施することができる。
「ＩＬ－５への結合」という用語は、ＩＬ－５、好ましくはヒトＩＬ－５との相互作用を指す。
「抗ＩＬ－５抗体」及び「ＩＬ－５抗体」という用語は、互換的に使用されており、これらは両方とも、ＩＬ－５に結合する抗体を指す。
本開示において、融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えによる２つの遺伝子の共発現によって得られた、タンパク質生成物である。組換えＩＬ－５細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えによるＩＬ－５細胞外領域と、ヒト抗体Ｆｃフラグメントとの共発現によって得られた、融合タンパク質である。ＩＬ－５細胞外領域は、細胞膜の外部に発現したＩＬ－５タンパク質を指し、ＩＬ－５細胞外領域の配列は、配列番号：１に提示のとおりである。
抗体及び抗原結合性フラグメントを生成及び精製するための方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ、第５～８章及び１５章等の従来技術においても提供されている。例えば、マウスは、ヒトＩＬ－５又はそのフラグメントによって免疫化することが可能であり、得られた抗体は、復元及び精製されてもよく、従来の方法を用いることによってアミノ酸シーケンシングを実施することもできる。抗原結合性フラグメントは、従来の方法を用いることによって調製することもできる。本開示による抗体又は抗原結合性フラグメントは、１つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域にグラフト化するよう遺伝子操作されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから得ることもできるし、又はＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることもできる。
人工抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクター内に組み換えることができる。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクションすることができる。推奨される一従来技術として、ほ乳類発現系により、抗体を、特に、Ｆｃ領域に属する高度に保存的なＮ末端位をグリコシル化することができる。安定なクローンは、ヒトＩＬ－５に特異的に結合する抗体を発現させることによって、得られる。陽性クローンをバイオリアクターの無血清培地中で増やして、抗体を産生する。抗体が分泌された培地は、慣用的な技法によって精製することができる。例えば、調整済みのバッファーを含むプロテインＡ又はプロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムが、精製のために使用されてもよい。非特異的に結合した成分は、洗い流される。次いで、結合した抗体をｐＨグラジエントによって溶出させ、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出し、収集する。抗体は、慣用的な方法によってろ過及び濃縮することができる。可溶性の混合物及びマルチマーは、慣用的な方法、例えば分子ふるい及びイオン交換によって除去することもできる。得られた生成物は、－７０℃等で直ちに凍結し、又は凍結乾燥させるべきである。
「任意選択による」又は「任意選択により」は、これらの用語の後に続く事象又は環境が発生してもよいし、発生しなくてもよいことを意味するが、その記載には、事象又は環境が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。例えば、「任意選択により、抗体の１～３つの重鎖ＣＤＲ領域を含んでもよい」は、特異的配列を有する抗体の重鎖ＣＤＲ領域が存在してもよいが、必ずしも存在するとは限らないことを意味する。
動物、人間、実験対象、細胞、組織、器官又は生物体液に適用された場合、「投与する」及び「処置する」は、外因性医薬品、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、人間、対象、細胞、組織、器官又は生物体液との接触を指す。「投与する」及び「処置する」は、例えば処置、薬物動態、診断、研究及び実験方法を指し得る。細胞の処置は、試薬と細胞との接触及び試薬と流体との接触を含み、この場合、流体は、細胞と接触している。「投与する」及び「処置する」は例えば、インビトロ及びエクスビボでの試薬、診断薬、結合作用のある組成物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）又は別の細胞による細胞の処置も意味する。ヒト、獣医学的対象又は研究対象に適用された場合の「処置する」は、治療処置、予防又は予防的措置、研究及び診断の適用を指す。
「処置」は、内用又は外用治療剤、例えば、本開示の結合作用のある化合物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のいずれか１種を含む組成物を、それに対して治療剤が治療効果を有することが知られている１種以上の疾患症状のある患者に施用することを意味する。一般に、治療剤は、処置された患者又は集団の１種以上の疾患症状を緩和するのに効果的な量で与えられ、これによって、臨床的に検出できる任意の程度までこのような症状の後退を誘導し、又はこのような症状の発症を阻害する。何らかの特定の疾患症状を緩和するのに効果的な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、様々な因子、例えば患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに、望ましい治療効果を患者に生じさせる治療剤の能力に応じて変化し得る。疾患症状が緩和されたかどうかは、症状の重症度又は進行を評価するために医師又は他の医療専門家によって一般的に使用されている任意の臨床検査法によって、評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、処置方法又は製造物）は、ターゲットとする各疾患症状を緩和するのに有効ではないこともあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ検定及びウィルコクソン検定等の当技術分野において知られた任意の統計学的な試験方法によって判定されたときに、統計学的に有意な数の患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するはずである。
その疾患がＩＬ－５に関連付けられた疾患である限り、ＩＬ－５に関連付けられた疾患に制限はない。例えば、本開示の分子によって誘導される治療反応は、ヒトＩＬ－５への結合後に好酸球の刺激効果を遮断又は阻害することによって、発生させることができる。したがって、治療用途に適した調製物及び製剤に応用された場合、本開示の医薬組成物は、アレルギー及び／若しくはアトピー反応に苦しんでいる、又は、限定されるわけではないがぜんそく、ぜんそくの増悪、悪性のぜんそくの発症、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症若しくはステロイド依存性好酸球性気管支炎等の好酸球に関連付けられた反応に苦しんでいる対象にとっては、非常に有用である。好ましい一実施形態において、処置は、肺組織への好酸球の浸潤を阻害又は緩和することができる。本医薬組成物の投与頻度は、１日当たり３回から、６か月ごとに１回までとすることができる。投与経路は、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路又は局所的経路であってよい。
本開示の製剤は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するために使用することができる。例えば、製剤は、限定されるわけではないが、インビボ及びインビトロにおけるＩＬ－５によって媒介される炎症反応及び好酸球の成熟、活性化、脱顆粒又は組織浸潤を阻害又は緩和し；ＩＬ－５によって引き起こされる平滑筋の過剰なストレスを抑制し；肺、気道又は血液におけるＩＬ－５のレベルを低下させるために使用することができる。好ましくは、本開示の製剤は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するために使用することができ、好ましくは、ＩＬ－５媒介性疾患は、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される。
「有効量」は、医学的疾患の症状又は状態を改善又は予防するのに十分な量を含む。有効量は、診断を可能にし、又は容易にするのに十分な量も指す。特定の患者又は獣医学的対象に関する有効量は、次の因子に応じて変化し得る：例えば、処置すべき状態、患者の全身状態、投与経路及び投薬量、並びに副作用の重症度。有効量は、有意な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与スケジュールであり得る。
「交換」は、抗体タンパク質を溶解させるために使用される溶媒系の交換を指す。例えば、抗体タンパク質を含む高塩濃度の又は高張性の溶媒系が、物理的な操作により、安定な製剤のバッファー系によって置きかえられ、この結果、抗体タンパク質は、安定な製剤中に存在することになる。物理的操作には、限定されるわけではないが、限外ろ過、透析又は遠心分離後の復元が挙げられる。
（実施例及び試験例）
以下、例と組み合わせて本開示をさらに説明するが、これらの例は、本開示の範囲を限定しない。本開示の例において特定の条件を採用していない実験方法は通常、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ制作のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇという刊行物を参考にする等、慣用的な条件によるものであり；又は、材料若しくは製品の製造業者によって推奨されている条件によるものである。特定の供給源が示されていない試薬は、市場から購入した慣用的な試薬である。
（実施例１）
ＩＬ－５抗原の調製、及びその検出に使用されたタンパク質
１．１ ＩＬ－５抗原の設計及び発現
Ｈｉｓタグ付きのヒトＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのアカゲザルＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのマウスＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのラットＩＬ－５と、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃフラグメントを含むヒトＩＬ－５Ｒα受容体細胞外領域融合タンパク質とをコードする配列を、ｃｐｈｒベクターにクローニングし、発現プラスミドを構築し、次いで、ＨＥＫ２９３にトランスフェクションした。トランスフェクションから６日目に、サンプルを収集し、４５００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって細胞上清を収集した。組換えＩＬ－５及びＩＬ－５α受容体タンパク質を含む上清を、ニッケルカラムの使用によって精製し、組換えヒトＩＬ－５－Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムの使用によって精製した。精製されたタンパク質は、後続の実験に使用することができる。特異的なタンパク質抗原の配列は、以下のとおりである。
ｈｉｓタグ（ｒｈＩＬ－５－ｈｉｓ）付きのヒトＩＬ－５のアミノ酸配列
Figure 2022528230000009
ｈｉｓタグ付きのカニクイザルＩＬ－５のアミノ酸配列
Figure 2022528230000010
 注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ｈｉｓタグ付きのマウスＩＬ－５のアミノ酸配列
Figure 2022528230000011
 注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ｈｉｓタグ付きのラットＩＬ－５のアミノ酸配列
Figure 2022528230000012
 注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ヒトＦｃフラグメントに融合したヒトＩＬ－５α受容体のアミノ酸配列
Figure 2022528230000013
 注記：イタリック体の部分は、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃタグを表す。
（実施例２）
組換えＩＬ－５α受容体及びＩＬ－５α／β受容体細胞株の構築及び同定
機能的抗体をスクリーニングするために、本開示は、ＩＬ－５αを発現させるＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α細胞株、及び、ＩＬ－５αとＩＬ－５βとの両方を発現させるＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α／ＩＬ－５β細胞株を構築した。
具体的には、ヒトＩＬ－５α完全長遺伝子（Ｑ０１３４４）をほ乳類細胞発現ベクターｐＴａｒｇｅＴにクローニングし、直線化したプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞にエレクトロトランスフェクションし、Ｇ４１８の存在下で２週間スクリーニングした後、限界希釈を２回実施した。ＦＡＣＳによって細胞表面上のＩＬ－５α遺伝子を検出し、ＩＬ－５α発現レベルが高いＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α細胞株を選択した。これをベースにして、直線化したｐｃＤＮＡ３．１－ＩＬ－５βをエレクトロトランスフェクションし、Ｇ４１８及びｚｅｏｃｉｎの存在下で２週間スクリーニングした後、限界希釈を２回実施した。ＦＡＣＳによって細胞表面上のＩＬ－５α及びＩＬ－５β遺伝子を検出し、ＩＬ－５α及びＩＬ－５βの発現レベルが高いＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α／ＩＬ－５β細胞株を選択した。
（実施例３）
抗ヒトＩＬ－５マウスモノクローナル抗体の調製
２種の用量の組換えタンパク質ｒｈＩＬ－５－ｈｉｓ、フロイントアジュバントＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ、ロット番号ＳＬＢＱ１１０９Ｖ）及びＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ、ロット番号ＳＬＢＪ２８４５Ｖ）（１００ｇ／５０ｇ／５０ｇ（高用量）及び２５ｇ／１２．５ｇ／１２．５ｇ（低用量））を使用して、それぞれ２つのＢａｌｂ／ｃマウス群（５マウス／群）及び４つのＳＪＬマウス群（５マウス／群）を免疫化した。ＥＬＩＳＡ、リガンド－受容体遮断アッセイ及びＴＦ－１増殖阻害アッセイによって血清力価を検出することにより、ＩＬ－５に対する特異的免疫反応を測定した。良好な特異的免疫反応が良好だったマウスを選択して屠殺し；脾臓細胞を収集し、骨髄腫細胞と融合させた。
一次スクリーニングを、ヒトＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイによって実施した。ハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートに移したらすぐに、ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイ、ＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡベース受容体遮断アッセイ及びＴＦ－１増殖の阻害アッセイを用いることにより、上清を再びスクリーニングした。陽性クローンを２回サブクローニングした後には、ハイブリドーマクローンが得られたが、これを抗体の製造のために使用し；得られた抗体を、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
精製済みの抗体には、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、エンドトキシン含量の検出、様々な種ＩＬ－５に対するＢｉａｃｏｒｅアフィニティアッセイ、ＩＬ－５に対するＦＡＣＳベース受容体遮断アッセイ、ＴＦ－１増殖の阻害アッセイ、好酸球の接着試験、並びに、インビボでのぜんそくのマウスモデル及びモルモットの中和モデルにおける有効性評価を施し；インビボ及びインビトロで好ましい活性を示したモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９を選択した。
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするためのプロセスは、次のとおりだった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番１５５９６－０１８）を用いて、キットの取扱説明書に従ってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）を使用して逆転写した。逆転写によって得られたｃＤＮＡを、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ０５０３）を使用したＰＣＲによって増幅した後、シーケンシングした。ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列が得られた（ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。）。
ｍＡｂ１７０５マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：６
ｍＡｂ１７０５マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＩＡＲＳＰＫＬＶＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＮＴＬＥＳＥＤＴＧＩＹＦＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＲＬＥＬＫ
配列番号：７
ｍＡｂ１７０６マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＶＴＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：８
ｍＡｂ１７０６マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＬＧＫＳＰＫＬＭＩＨＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＮＴＬＥＳＥＤＰＧＩＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号：９
ｍＡｂ１７８０マウス重鎖可変領域の配列
ＱＶＫＬＬＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＤＳＶＫＭＳＣＫＡＳＤＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＫＱＳＱＧＲＳＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＦＳＳＴＡＹＭＥＦＲＲＬＴＦＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：１０
ｍＡｂ１７８０マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＬＡＶＳＰＧＥＲＶＳＩＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＱＰＫＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号：１１
ｍＡｂ１７７３マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＱＱＳＬＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＩＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＦＳＳＬＴＳＥＤＴＡＩＹＹＣＦＲＹＧＩＹＰＤＨＷＧＱＧＴＰＬＴＶＳＳ
配列番号：１２
ｍＡｂ１７７３マウス軽鎖可変領域の配列
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＬＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＲＳＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＥ
配列番号：１３
ｍＡｂ１７７９マウス重鎖可変領域の配列
ＱＶＫＬＬＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＤＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＥＦＳＲＶＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＧＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号：１４
ｍＡｂ１７７９マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＧＥＴＶＳＩＥＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＳＧＲＳＰＱＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＲＹＦＦＫＩＳＧＭＱＰＥＤＥＡＤＹＦＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号：１５
各抗体の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ配列は、表１に示されている。
Figure 2022528230000014
Ｂｉａｃｏｒｅによる活性の検出結果は、表２で確認することができる。
Figure 2022528230000015
上記結果により、本開示のマウス抗体が、抗原に対する高いアフィニティを有することが示されている。
（実施例４）ＩＬ－５関連組換えタンパク質の精製並びにハイブリドーマ抗体及び組換え抗体の精製
４．１ ＩＬ－５－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製ステップ：
サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去し、適切な体積になるまで濃縮した。ＮＩ－ＮＴＡアフィニティカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号３０７２１）をＰＢＳによって平衡させ、カラム容積の２～５倍で洗浄した。不純物の除去後、細胞発現上清サンプルをカラムにロードした。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、ＰＢＳによってカラムを洗浄した。ＰＢＳによってカラムを洗浄して、汚染タンパク質を除去し、サンプルを収集した。標的タンパク質を、洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール）及び溶出バッファー（３００ｍＭイミダゾール）によって順次溶出させ、溶出ピークを収集した。
収集された溶出液を、イオン交換（Ｈｉｌｏａｄ１６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）によってさらに精製した。カラム容積の約２倍のＰＢＳによってカラムを平衡させて、ｐＨが確実に７．４になるようにした。同定された標的タンパク質を含む溶出バッファーを濃縮してロードし、サンプルを収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ－ＭＳによる同定によって確認し、アリコート化して使用した。
４．２ ハイブリドーマ発現抗体及びＦｃ融合タンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去した。ハイブリドーマ発現上清をプロテインＧカラムによって精製し、Ｆｃ融合タンパク質発現上清をプロテインＡカラムによって精製した。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをＰＢＳによって洗浄した。ｐＨ３．０の１００ｍＭ酢酸によって標的タンパク質を溶出させ、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳによって平衡させたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によってサンプルをさらに精製し、凝集物を含まないピークを収集した後、アリコート化して使用に供した。
（実施例５）抗ヒトＩＬ－５モノクローナル抗体のヒト化の設計
当技術分野における数多くの参考文献において開示されているようにして、マウス抗ヒトＩＬ－５モノクローナル抗体のヒト化を実施した。簡単に言うと、マウス抗体の定常領域をヒト定常領域によって置きかえ、マウス抗体のＣＤＲを、最も高い相同性を有するＦＲヒトテンプレートにグラフト化し、ＦＲ領域中のアミノ酸に復帰変異を発生させた。
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースに対して整合させることにより、ｍＡｂ－１７０５、ｍＡｂ－１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９抗体のアミノ酸配列のそれぞれに対して高い同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域生殖細胞系列を、テンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを、対応するヒトテンプレートにグラフト化して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順番の可変領域を形成した。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。
ヒトＦＲ領域及びアミノ酸復帰変異の選択
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲの典型的な構造に基づいて、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）相同配列をヒト生殖細胞系列データベースから検索し、ＦＲ相同性に応じて（降順に）ランク付けし；ＦＲ相同性が最も高い生殖細胞系列を、主要なテンプレートとして選択した。マウス抗体のＣＤＲ領域をヒトテンプレートにグラフト化した後、ＦＲ残基を変異させ、アミノ酸残基を最適化すると、最終的なヒト化分子が得られた。
５．１ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０５に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０５に関しては、ＩＧＨＶ３－２３＊０４をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－１２＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。ｍＡｂ１７０５のＣＤＲをヒトテンプレートにグラフト化し；組み込まれた残基と、ＣＤＲ領域（ソフトウェアによって発見された）と直接相互作用した残基とを復帰変異させた。表３に示されているように、様々なヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 2022528230000016
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
Figure 2022528230000017
 注記：この表は、様々な変異の組合せによって得られた配列を示している。ｈ１７０５－００７によって示されているように、ヒト化マウス抗体ｈ１７０５－００７は、２種の変異体、すなわち、軽鎖ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａ及び重鎖ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａ等を含む。
ヒト化抗体ｈ１７０５の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１（配列番号：４６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：４７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：４８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＶＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１（配列番号：４９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：５０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：５１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成し、重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。例示的なヒト化抗体定常領域配列が、以下に示されている。
＞重鎖ＩｇＧ１定常領域：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：５２
注記：アンダーライン部分は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ変異を表す。
＞軽鎖κ定常領域：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：５３
５．２ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０６に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０６に関しては、ＩＧＨＶ３－２３＊０４をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－１２＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７０６のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；ＦＲアミノ酸を復帰変異させた。表５に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 2022528230000018
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
表６に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な抗体を形成した。
Figure 2022528230000019
ｈ１７０６ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１（配列番号：５４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：５５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：５６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＭＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１（配列番号：５７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：５８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：５９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
５．３ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７８０に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７８０に関しては、ＩＧＨＶ１－２＊０２をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ３－１１＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７８０のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；ＦＲアミノ酸を復帰変異させた。表７に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 2022528230000020
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ｅ１Ｄは、「グラフト化」の１位のＥが変異して、Ｄに戻ったことを表す。
表８に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 2022528230000021
ｈ１７８０ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１（配列番号：６０）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：６１）
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：６２）
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１（配列番号：６３）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：６４）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：６５）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号：６６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
５．４ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７３に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７３に関しては、ＩＧＨＶ３－７３＊０１をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－３９＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７７３のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；アミノ酸を復帰変異させた。表９に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。さらに、ｈ１７７３ ＨＣＤＲ２（ＲＩＤＰＡＮＧＤＴＫ ＨＧＰＫＦＱＧ）中のＮをＶに変異させて（すなわち、Ｎ５５Ｖ）、重鎖可変領域ＨＣＤＲ２バリアントを形成した（変異したＨＣＤＲ２の配列は、配列番号：８２：ＲＩＤＰＡＶＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧに示されたとおりである。）。
Figure 2022528230000022
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ｍ４Ｌは、「グラフト化」の４位のＭが変異して、Ｌに戻ったことを表す。
表１０に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 2022528230000023
ｈ１７７３ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１（配列番号：６７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：６８）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１（配列番号：６９）
Figure 2022528230000024
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：７０）
Figure 2022528230000025
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：７１）
Figure 2022528230000026
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５３に示された軽鎖定常領域配列と組み合わせて、最終的な完全軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５２に示された重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な完全重鎖配列を形成した。
５．５ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７９に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７９に関しては、ＩＧＨＶ１－２＊０２をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－３３＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｈ１７７９のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；アミノ酸を復帰変異させた。表１１に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 2022528230000027
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
表１２に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 2022528230000028
ｈ１７７９ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１（配列番号：７２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：７３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：７４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１（配列番号：７５）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：７６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＶＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：７７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号：７８）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｄ（配列番号：７９）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５３に示された軽鎖定常領域配列と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５２に示された重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
例示的なヒト化抗体の完全長配列は、以下のとおりである。
ｈ１７０５－００８重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８３
ｈ１７０５－００８軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８４
ｈ１７０６－００９重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８５
ｈ１７０６－００９軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＭＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８６
ｈ１７８０－０１７重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８７
ｈ１７８０－０１７軽鎖：
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８８
ｈ１７７３－００７重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳＮＴＹＩＨＷＶＫＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＶＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧＲＦＴＩＳＡＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＦＲＹＧＩＹＰＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８９
ｈ１７７３－００７軽鎖：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：９０
ｈ１７７９－０１４重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：９１
ｈ１７７９－０１４軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：９２；
国際公開第２０１２／０８３３７０号におけるＩＬ５に対する抗体Ｈｕ３９Ｄ１０を、本開示においてはポジティブコントロールとして使用したが、その重鎖配列及び軽鎖配列が、それぞれ配列番号：８０及び配列番号：８１に示されている。
Ｈｕ３９Ｄ１０重鎖の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＬＳＬＴＳＮＳＶＮＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＷＳＮＧＤＴＤＹＮＳＡＩＫＳＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＹＹＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号：８０
Ｈｕ３９Ｄ１０軽鎖の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＮＳＬＱＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＡＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＫＦＰＮＴＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８１。
（実施例６）組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の調製
１．組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマのスクリーニングによって陽性抗体分子を得た後、可変領域をコードする遺伝子配列をシーケンシングによって得た。得られた配列をベースにして、フォワードプライマー及びリバースプライマーを設計し、シーケンシングされた遺伝子をテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築した後、相同組換によって（シグナルペプチド及びｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒに挿入して、組換えキメラ抗体完全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築して、５種のキメラ抗体Ｃｈ１７０５、Ｃｈ１７０６、Ｃｈ１７８０、Ｃｈ１７７３及びＣｈ１７７９を得た。
２．ヒト化抗体の分子クローニング
ヒト化抗体配列にコドン最適化を施した後には、ヒトコドン選好性を有するコーディング遺伝子配列が得られ；プライマーを設計して、ＰＣＲによって各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築し、次いでこれを、相同組換えによって（シグナルペプチド及びｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒにして、ヒト化抗体完全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。
３．組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の発現及び精製
抗体軽鎖又は重鎖を発現したプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に別々にトランスフェクションした。６日後、発現上清を収集し、高速で遠心分離して、不純物を除去し、プロテインＡカラムによって精製した。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをＰＢＳによって洗浄した。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶出バッファーによって標的タンパク質を溶出させ、ｐＨ８．０～９．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳによってあらかじめ平衡させたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によってさらに精製して、凝集物を除去し、モノマーピークを収集し、アリコート化して使用した。
次の試験方法を使用して、本開示の抗体の性能及び有益な効果を確認した。
インビトロ活性の生物学的評価
試験例１．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる異なる種のＩＬ－５へのマウスＩＬ－５抗体の結合
試験すべきマウスＩＬ－５抗体とヒトＩＬ－５とのアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）機器によって測定した。
プロテインＡバイオセンサチップを使用して、試験すべき分子をアフィニティ捕捉した後、抗原（実施例１において調製された組換えヒト及びカニクイザルＩＬ－５）がチップの表面を流れて通過したら、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によって反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合曲線及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了したら、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン－塩酸再生溶液（ｐＨ１．５）によって再生した。ＢＩＡ評価バージョン４．１ ＧＥソフトウェアを使用して、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに対してデータを当てはめ、アフィニティ値を得て表１３に示した。
Figure 2022528230000029
この例は、本開示の抗体ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９が、異なる種のＩＬ－５（ヒト、サル）に対する高いアフィニティを有することを実証している。
試験例２．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる異なる種のＩＬ－５に対するヒト化ＩＬ－５抗体のアフィニティ
試験すべきヒト化ＩＬ－５抗体とヒトＩＬ－５とのアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）機器によって測定した。
プロテインＡバイオセンサチップを使用して、試験すべき分子をアフィニティ捕捉した後、抗原（例１において調製）がチップの表面を流れて通過したら、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によって反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合曲線及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了したら、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン－塩酸型再生溶液（ｐＨ１．５）によって再生した。ＢＩＡ評価バージョン４．１ ＧＥソフトウェアを使用して、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに対してデータを当てはめ、アフィニティ値を得て表１４に示した。
Figure 2022528230000030
上記結果により、すべてのヒト化ＩＬ－５抗体は、ヒトＩＬ－５に対する高いアフィニティを有することが示されている。
試験例３．ＩＬ－５α受容体へのＩＬ－５の結合を遮断するマウスＩＬ－５抗体のＥＬＩＳＡベースアッセイ
組換え発現したＩＬ－５α受容体タンパク質の細胞外領域へのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体の能力を確認するために、ＩＬ－５（ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに塗り、３７℃で１時間インキュベートし；液体を取り除き、ＰＢＳによって希釈した２００μｌ／ｗｅｌｌの５％脱脂乳ブロッキング溶液を加え、ブロッキングのためにお３７℃のインキュベーター内で２．５時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）によって５回洗浄し；ビオチン標識キット（Ｔｏｊｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＬＫ０３）によって標識された１０μｇ／ｍｌのＩＬ－５Ｒα（１％ＢＳＡ中）２５μｌを加えた後、勾配希釈された２５μｌの抗体を加え（抗体は、ＩＬ－５との結合に関してはＩＬ－５Ｒαと競合した。）、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイタープレート中の反応溶液を取り除き、プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、サンプル希釈溶液によって１：６００に希釈された５０μｌ／ｗｅｌｌのストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、５２－００－０３）を加え、室温で３～１０分間インキュベートし；５０μｌ／ｗｅｌｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させ；ＮＯＶＯＳｔａｒマイプロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度の値を読み取り；ＩＬ－５ＲαへのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＩＣ５０値を計算した。その結果は、表１５に示されている。本開示の抗体は、ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を効果的に阻害することができる。
Figure 2022528230000031
試験例４．ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＦＡＣＳベースアッセイ
細胞表面上のＩＬ－５受容体を遮断することができるスクリーニングされたＩＬ－５抗体を確認するために、ＩＬ－５Ｒα／βという２種の受容体を高発現させるＣＨＯＳ組換え細胞株を構築した。この実験により、ＩＬ－５抗体はそれぞれ、それぞれＣＨＯＳ細胞株の表面上の組換えＩＬ－５α／β受容体へのＩＬ－５の結合を遮断できることが実証された。
特定の方法は、次のとおりだった。１００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８及び２５ｎｇ／ｍｌのｚｅｏｚｉｎを含むＣＤ－ＣＨＯを使用して、ＣＨＯ－Ｓ－ＩＬ－５Ｒα及びβを培養した。細胞培養中、濃度は、３×１０６細胞／ｍｌを超えるべきではない。良好な状態のＩＬ－５Ｒα／β－ＣＨＯＳ細胞を（１０００ｒｐｍで５分間）遠心分離し、ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳによって１回洗浄し、細胞をカウントし、細胞濃度を４×１０６細胞／ｍｌに調整し、２５μｌを取り出し、丸底９６ウェルプレートに加えた。試験すべき抗体を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ溶液によって希釈した。初期濃度は２００μｇ／ｍｌだったが、８種の勾配希釈物になるように１：１０に希釈した。ビオチン標識キット（Ｔｏｊｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＬＫ０３）によって標識された１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－５ ２５μｌを加え、各濃度の希釈抗体５０μｌと完全に混合したら、細胞を加えておいた９６ウェルプレートに加え、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを４℃で遠心分離（４００ｇ、５分間）し、上清を取り除き、プレートを、あらかじめ冷却した２００μｌのＰＢＳを用いた遠心分離によって洗浄し、これを２回繰り返し；１：１３３３に希釈されたＰＥ－Ａｖｉｄｉｎ二次抗体を加え、暗所において４℃で４０分間インキュベートし、４℃（４００ｇ、５分）で遠心分離し；上清を除去し、あらかじめ冷却した２００μｌのＰＢＳを加えて、細胞をピペッティングし；プレートを遠心分離によって４℃で３回洗浄し；１００μｌのＰＢＳを加え、プレートを機械で読み取り；ＩＬ－５Ｒα／βへのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＩＣ５０値を、蛍光シグナル値によって計算した。その結果は、表１６及び図１に示されている。
Figure 2022528230000032
上記結果により、抗体ｈ１７０５－００８、ｈ１７０６－００９、ｈ１７８０－０１７及びｈ１７７９－０１４は、細胞表面上のＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を遮断する強力な能力を呈することが示されている。
試験例５．ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５によって誘導されるＴＦ１細胞の増殖を阻害する
ＩＬ－５は、ＴＦ－１細胞の増殖を誘導することが可能であり、ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５が、ＴＦ－１細胞の増殖を刺激しないようにすることができる。
具体的には、ＴＦ－１細胞（ＴＣＣ、ＣＲＬ－２００３）を、１０％ＦＢＳ及び２ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ－ＣＳＦ（ＬＩＮＫＢｉｏ、カタログ番号９６－ＡＦ－３００－０３－２０）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れたが、細胞密度は、１×１０６細胞／ｍｌを超えない。抗体を検出するために、対数増殖期の細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し；ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ：２％、組換えヒトＩＬ－５：１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、細胞密度を６０００細胞／ｗｅｌｌ／９０μｌに調整し；勾配希釈された試験すべき抗体１０μｌを、培養するために９６ウェルプレートに加え、培養から３日後、３０μｌの細胞タイター溶液を加え、検出のために混合し、ＩＣ５０を測定値によって計算した。試験結果は、以下の表１７に示されている。
Figure 2022528230000033
試験例６．ＩＬ５によって誘導される好酸球の接着を阻害するＩＬ５抗体の試験
ＩＬ５は、好酸球の分化、成熟、遊走及び活性化を誘導し、呼吸器の炎症を起こし、ぜんそくを発症させる可能性がある。この実験は、ＩＬ－５サイトカインが好酸球の接着及び活性化を促進できる原理に基づいている。ヒト末梢血から好酸球を収集し、精製して、ＩＬ－５経路に対するＩＬ－５特異的抗体の遮断効果を試験し、インビトロでＩＬ５によって媒介される好酸球の接着に対するＩＬ－５抗体の遮断効果を検出した。
具体的には、ヒト末梢血を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳによって５倍希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（１．０８８の密度勾配）を使用して、単球及び顆粒球を単離した。顆粒球を含む赤血球層を慎重に吸引し、赤血球溶解溶液を使用して、赤血球を除去し；残存の細胞をカウントし、ＣＤ１６抗体を備える分離用磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０４５－７０１）を相応に加え、３０分間インキュベートし、磁性ビーズカラムに流して通過させ、分集団（主に好酸球）はカラムに直接流して通過させ、負の選択によって収集した。単離された好酸球をカウントし、ＩｇＧ抗体をあらかじめ塗っておいた９６ウェル細胞培養プレートに、ウェル１個当たり約１×１０４個の細胞になるように加え；異なる濃度（１０μｇ／ｍｌから出発で、３倍希釈、１０点の濃度点）のヒトＩＬ－５（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－５抗体分子を加え；細胞培養プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１時間インキュベートした後、培養プレートを取り出し、０．３％ＣＴＡＢを加えて、細胞を溶解させ、最後に、ペルオキシダーゼ反応基質ＴＭＢを加えて発色させ、ＯＤ４５０吸収値をマイプロプレートリーダーによって読み取った。ＩＬ－５のみを加えられたウェルの測定値は、最大吸収値であり；ＩＬ－５及び抗体型作用物質を不含のウェルは、バックグラウンドコントロールとして採用し；最大吸着値に対する各濃度における抗体型作用物質の阻害値を計算し＝（最大吸着値－［抗体型作用物質］）／（最大吸着値－バックグラウンドコントロール値）×１００％、ＩＣ５０を計算した。その結果は、表１８に示されている。
Figure 2022528230000034
上記結果により、本開示のヒト化抗体は、ＩＬ５によって媒介される好酸球の接着を遮断する強力な能力を呈することが示されている。
試験例７．Ｔｈ２サイトカインに対するヒト化ＩＬ－５抗体の特異性の評価
ＩＬ－５は、Ｔｈ２サイトカインのうちの１つだった。ＩＬ－５抗体がＩＬ－５のみを特異的にターゲッティングし、他のサイトカインとの間で交差反応しないことを確認するために、Ｆｏｒｔｅｂｉｏして、ＩＬ－５との間でα受容体を共有する、ＩＬ２（Ｒ＆Ｄ、２０２－ＩＬ－０１０／ＣＦ）、ＩＬ４（Ｒ＆Ｄ、２０４－ＩＬ－０５０／ＣＦ）、ＩＬ－５（Ｒ＆Ｄ、２０５－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＦＮｇａｍｍａ、ＩＬ６（Ｒ＆Ｄ、７２７０－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ９（Ｒ＆Ｄ、２０９－ＩＬ－０１０／ＣＦ）、ＩＬ１０（Ｒ＆Ｄ、２１７－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ、２１３－ＩＬＢ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ２５（Ｒ＆Ｄ、８１３４－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ３１（Ｒ＆Ｄ、２８２４－ＩＬ－０１０／ＣＦ）及びＩＬ３（２０３－ＩＬ－０５０／ＣＦ）並びにＧＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、２１５－ＧＭ－０１０／ＣＦ）を含む１２種類のＴｈ２及び関連サイトカインを検出した。
具体的には、プロテインＡバイオセンサー（ＰＡＬＬ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５０１０）を使用して、抗体を捕捉し、捕捉シグナルを記録した後、４０ｎＭ サイトカインのそれぞれを注入し、結合シグナルを記録した。最後に、ＩＬ－５との結合シグナルを１００％として規定した。他のサイトカインと抗体との結合シグナルを観察したが、その結果は、図２に示されている。
上記結果により、１２種の関連サイトカインの中でも、ヒト化ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８及びｈ１７０６－００９のみは、ＩＬ－５に特異的に結合し、他のＴｈ２サイトカインとの交差反応性を有さないことが示されている。
インビボ活性の生物学的評価
試験例８．ＯＶＡ誘導性マウスぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体の有効性の評価
この試験は、気道炎症反応及び気道リモデリングに基づいて、オバルブミン（ＯＶＡ）エアロゾルによって誘導されたＢＡＬＢ／ｃマウスぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体の有効性を評価する。
マウスは体重に応じて、各群が１０匹のマウスを含むように７つの群にランダムに分けられた：正常コントロール群（Ｇ１）；モデル群（Ｇ２）；試験すべき抗体のそれぞれが２種の用量（１０ｍｐｋ及び２ｍｐｋ）のときの、試験すべき２種の抗体の処置群ｈ１７０５－００８（Ｇ３及びＧ４）及びｈ１７０６－００９（Ｇ５及びＧ６）；並びに、陽性抗体Ｈｕ３９Ｄ１０コントロール群（Ｇ７、１０ｍｐｋ）。１日目及び１４日目には、すべてのマウスを、アレルゲン溶液の腹腔内注射によって感作した。２８日目、２９日目及び３０日目には、エアロゾルＯＶＡ惹起溶液により、６つのマウス群（第１の群を除く）に３０分間チャレンジした。チャレンジの２時間前に、第２の群（Ｇ２）にリン酸バッファーを腹腔内注射し、第３の群～第７の群（Ｇ３～Ｇ７）のマウスに異なる用量の異なる抗体を（１日１回、３日間連続で）腹腔内注射した。試験すべき抗体は、毎回の注入前に新しく調製し、投与は、抗体の調製から３０分以内に終了させた。（正常コントロール群である）第１の群のマウスには、ＰＢＳエアロゾルを３０分間チャレンジしたが、このチャレンジの２時間前には、リン酸バッファーを１日１回３日間連続で腹腔内注射した。
３１日目には、ＷＢＰシステムを使用して、動物の気道過敏性を試験した。すべての動物には、２倍に増えていく濃度（１．５６２５ｍｇ／ｍＬ、３．１２５ｍｇ／ｍＬ、６．２５ｍｇ／ｍＬ、１２．５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬ）のメタコリンを摂取するように、エアロゾルによって投与し、対応する濃度における呼吸休止期の延長（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）の値を測定した。
３１日目には、ＷＢＰシステムによる気道過敏性の検出から１時間後、直径１．２ｍｍの気管チューブを気管に挿入して固定し、肺洗浄を２回実施したが、毎回、１％ＢＳＡ及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．８ｍｌリン酸バッファーを用いて実施した。洗浄液の回収体積を記録した。
ＢＡＬＦを、３００ｇにおいて４℃で５分間遠心分離した。上清は、サイトカイン分析のために維持した。遠心分離後には、細胞を１．５ｍｌのＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に再懸濁させて、細胞をカウントした。血球計数機及びトリパンブルー染色実験を用いて、ＢＡＬＦ中の細胞の総数をカウントした。細胞をスライドになすりつけ、ライト染色溶液によって１分間染色し、次いで、ギムザ染色によって７分間染色して、好酸球、好中球、マクロファージ及びリンパ球を識別した。光学顕微鏡下でカウントした。
洗浄後、肺組織を収集し、１０％中性ホルムアルデヒド溶液によって染色した後、１０％中性ホルムアルデヒド溶液中に固定した。固定組織をパラフィンに包埋し、トリミングし、Ｈ＆Ｅによって染色し、スコア付けした。試験結果は、図３、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。
上記結果により、本開示の抗体分子ｈ１７０５－００８及びｈ１７０６－００９は、用量依存的に肺機能を有意に改善することができるが、高用量（１０ｍｐｋ）の陽性化合物は、肺機能を改善できないことが示されている（図３を参照されたい。）。一方、２種の抗体は、同じ用量（１０ｍｐｋ）で好酸球のレベル及び粘膜の厚さを有意に減少させており、陽性抗体のものより強力な好酸球減少能力を示している（図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。）。同じ種類のマウスぜんそくモデルにおいて、繰返し実験により、１ｍｇ／ｍｌのｈ１７０５－００８、ｈ１７０６－００９及びｈ１７８０－０１７が、陽性抗体の場合に比べてＢａｌＦ中における好酸球のレベルを有意に低下させることも確認した（図４Ｃを参照されたい。）。
試験例９．外因性ヒトＩＬ－５によって誘導されたモルモット急性ぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体のインビボ有効性の評価
この実験においては、雄モルモットを選択して、ヒトＩＬ－５によって誘導された急性ぜんそくモデルを確立し、これにより、ヒトＩＬ－５によって誘導されたモルモット肺の気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）中における好酸球の増加に対する、本開示の５種のＩＬ－５ヒト化ｍＡｂの阻害効果を評価したが；ｈｕ３９Ｄ１０を陽性抗体として使用した。モルモットは、それぞれが８～１０匹の動物を含む９つの群に分けられた：正常コントロール群、モデル群、ｈｕ３９Ｄ１０（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０５－００８（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０６－００９（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７８０－０１７（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７７３－００７（１ｍｇ／ｋｇ）群及びｈ１７７９－０１４（１ｍｇ／ｋｇ）群。モデル群及び投与群のモルモットのそれぞれには、１日目に刺激のために１００μｌのヒトＩＬ５（５μｇのＩＬ５抗原を含む）を気管経由で注入し；正常コントロール群には、ＰＢＳを気管経由で注入した。投与群には、刺激の２時間前に５ｍｌ／ｋｇの投与量になるように、１ｍｇ／ｋｇの上記ＩＬ５モノクローナル抗体を腹腔内注射し；モデル群には、対応するＩｇＧ抗体を投与し；正常コントロール群には、ＰＢＳ溶媒を腹腔内投与した。モルモットには、気管への注入から２４時間後に麻酔をかけ、肺気管支洗浄液を抜き出した。細胞濃度を５＾１０６／ｍｌに調整し、１５μｌをスライドに滴下し、乾燥させて固定し；ＨＥ染色を実施し、全細胞の数及び好酸球の数を４００倍の顕微鏡下でカウントし、好酸球の百分率を計算した。その結果は、図５Ａ及び図５Ｂに示されおり、本開示の５種のヒト化抗体が、ＢＡＬＦ中における好酸球のレベルを有意に低下させることが示されている。
製剤中における成分の選択及び安定性評価
抗体の医薬組成物（製剤）のための例示的な調製プロセス：
ステップ１：
ある特定の量の精製済みの抗ＩＬ－５抗体溶液をとり、抗体不含バッファー（ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー等）を使用して、（好ましくは限外ろ過によって）溶媒交換を置きかえ；少なくとも６倍の体積を限外ろ過膜によって交換し、タンパク質を約１２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。スクロースの最終濃度が７２ｍｇ／ｍＬになるように、ある特定の体積のスクロースストック溶液を加え、混合した。ポリソルベート８０の最終濃度が０．４ｍｇ／ｍＬになるように、ある特定の体積のポリソルベート８０ストック溶液を加え、混合した。ある特定の体積になるまで、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファーを加えることにより、タンパク質濃度を１００ｍｇ／ｍＬにした（試験すべき他の製剤又は安定な製剤も、同様のステップに従って調製した。）。
上記生産物をろ過した後、病原性作用物質が存在しないように集中管理方式のサンプリングによって試験した。ストック溶液を０．２２μｍ ＰＶＤＦフィルターに通し、ろ液を収集した。
ステップ２：
体積を１．２ｍｌに調整し、栓を装着した２ｍｌバイアルにろ液を充填し、チャレンジの開始時、中頃及び終了時に集中管理方式のサンプリングを実施して、チャレンジ体積の差を検出した。
ステップ３：
フタ付け機を始動させて、アルミニウム製のフタを装着し、フタ付けを実施した。
ステップ４：
目視検査を実施して、不正確な充填等の欠陥が生産物にないことを確認した。バイアルラベルを印刷して貼り付け；カートンラベルを印刷し；カートンを折りたたんで梱包し；箱のラベルを貼り付けた。
試験例１０．バッファー系のスクリーニング
タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬのｈ１７０５－００８製剤を、ｐＨ５．０～６．５の一連のバッファー中に調製したが、振とう用サンプルは、０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、他のサンプルは、０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含んでいた。バッファー系は、次のとおりだった：ｐＨ５．０、５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー（ＡＡ）；ｐＨ５．０、５．５、６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー（ＳＡ）；ｐＨ５．５、６．０、６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー（ＣＡ）；ｐＨ５．５、６．０、６．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩バッファー（Ｈｉｓ）；ｐＨ６．０、６．５の１０ｍＭ リン酸バッファー（ＰＢ）。各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけた。サンプルを強制分解実験に供し；外観、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦは、評価指標として採用した。
上記の結果は、表１９に示されている。外観データにより、振とう（３００ｒｐｍ、２５℃）されたサンプル及び４０℃のサンプルは、様々な度合いの粒子形成を呈することが示されている。概して、外観は、ｐＨが低下するほど良化し、酢酸－酢酸ナトリウム及びコハク酸－コハク酸ナトリウムのバッファー系は良化しており；ＳＥＣデータにより、ＡＡ ｐＨ５．５群は、４０℃ではわずかに良化していることが示されており；ｉＣＩＥＦデータにより、ＡＡ ｐＨ５．５群、Ｈｉｓ ｐＨ５．５群、ＣＡ ｐＨ６．５群は、４０℃ではわずかに良化していることが示されているが；物理的及び化学的安定性を総合的に考慮すると、ｐＨ５．５のＡＡが好ましい。
Figure 2022528230000035
Figure 2022528230000036
 注記：Ｎ／Ａは、検出なしを表し、Ｄは、日数を表し、Ｔ０は、０日目を表す。
試験例１１．製剤中の賦形剤のスクリーニング
タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬのｈ１７０５－００８製剤を、下記の様々な種類の賦形剤を含む１０ｍＭ ＳＡ（ｐＨ５．０）バッファー中に調製した。特に、賦形剤は、以下のとおりだった：
１） ０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０（ＰＳ２０）
２） ０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）
３） ５０ｍｇ／ｍＬのスクロース＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
４） ５０ｍｇ／ｍＬのトレハロース＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
５） ５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
６） ５０ｍｇ／ｍＬのソルビトール＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
７） ８ｍｇ／ｍｌのアルギニン（Ａｒｇ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
８） ８ｍｇ／ｍｌのリシン（Ｌｙｓ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
９） ８ｍｇ／ｍｌのグリシン（Ｇｌｙ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１０） ８ｍｇ／ｍｌのメチオニン（Ｍｅｔ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１１） ８ｍｇ／ｍｌのプロリン（Ｐｒｏ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１２） ８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０。
各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけて使用に供した。サンプルは、４０℃における強制分解実験に供したが、その結果により、次のことが示されている（表２０）。各サンプル群間には、ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦの試験結果に有意差がなく、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／ＮａＣｌ群は外観が劣っているが、他の群間には有意差がない。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、プロリン及びメチオニンは、タンパク質の安定性に好ましい影響を与える。
Figure 2022528230000037
 注記：Ｄは、日数を表す。
試験例１２．界面活性剤のスクリーニング
ｐＨ５．５の１０ｍＭ ＳＡ、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０又はＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
サンプルを４℃に置いて、安定性を調査した。その結果は、表２１に示されている。その結果により、ＰＳ８０群は、４℃においては４か月間にわたって透明な外観を呈し、ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦの有意な変化を呈さないことが示されており、このことは、好ましい安定性を示しているが；ＰＳ２０群においては、大量の粒子が観察されている。したがって、ＰＳ８０は、ＰＳ２０より良好である。さらに、製剤へのＰＳ８０の添加は、より良好な安定化効果をｈ１７０５－００８に及ぼしており、製剤の安定性が良化していることも分かる。
Figure 2022528230000038
 注記：Ｍは、月数を表し；Ｎ／Ａは、検出なしを表す。
試験例１３．ＤＯＥ製剤の設計及びスクリーニング
ＤＯＥ（実験計画法）は、１０ｍＭ酢酸バッファー（ＡＡ）のｐＨ、タンパク質濃度及びＴｗｅｅｎ濃度を変数として用いて実施され；一連の製剤は、次の因子及びレベルに基づいて設計した：ｐＨは、５．０～５．８であり、ＰＳ８０の濃度は、０．２～０．６ｍｇ／ｍＬであり、抗体ｈ１７０５－００８の濃度は、８０～１２０ｍｇ／ｍＬである。製剤は、表２２に示されている。サンプルを４０℃の高温で強制分解した。外観、ＳＥＣ、非還元型ＣＥ及びｉＣＩＥＦを、評価指標として使用した。その結果は、表２３に示されている。
Figure 2022528230000039
Figure 2022528230000040




注記：Ｄは、日数を表す。
上記結果により、各製剤の外観は、透明であり；ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦは、それぞれ２％未満、２％未満及び約１４％低下しているが許容範囲内であり；製剤の安定性は、好ましいものであることが示されており；したがって、製剤は、８０～１２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有し、０．２～０．６ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０を含み、５．０～５．８のｐＨを有する。最適な製剤は、次のものである：１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０、ｐＨ５．５。
試験例１４．安定性試験
ｐＨ５．５の１０ｍＭ ＡＡ、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように調製し；サンプルは、４℃及び２５℃で安定性の調査に供した。その結果は、表２４に示されている。
上記結果により、高温条件下においては、ｈ１７０５－００８製剤のＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦがわずかに低下しているが、この低下は許容範囲内であり；他の条件下ではすべての指標に有意な変化がないことが示されている。製剤は、好ましい安定性を有し、６か月以内までの４℃におけるｈ１７０５－００８の安定性を確実なものにすることができる。
Figure 2022528230000041
注記：Ｍは、月数を表す。
試験例１５．イオン強度のスクリーニング
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、イオン強度が異なる（ナトリウム）酢酸バッファー中に調製し；交換のために使用されたバッファーのｐＨ及び最終的な製剤のｐＨを測定した。その結果は、表２５に示されている。この結果により、イオン強度が高いほど、ｐＨのずれが減少することが示されている。イオン強度が３０ｍＭである場合、ｐＨのずれは、０．１未満である。
Figure 2022528230000042
試験例１６．糖の濃度のスクリーニング
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、ｐＨ５．５の３０ｍＭ ＡＡと、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０とを含むｈ１７０５－００８製剤を、濃度が異なるスクロースを含む後述のバッファー中に調製した。浸透圧を測定した。その結果は、表２６に示されている。
上記結果により、糖濃度が７０～７５ｍｇ／ｍｌである場合、浸透圧は、２９０～３１０ｍｏｓｍの最適な等張範囲であり；７０ｍｇ／ｍｌ群及び７３ｍｇ／ｍｌ群の浸透圧データによれば、糖濃度が７２ｍｇ／ｍｌである場合、浸透圧は、約３００ｍｏｓｍの最も良い値になることが示されている。
Figure 2022528230000043
試験例１７．製剤の安定性試験
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、ｐＨ５．５の３０ｍＭ ＡＡと、７２ｍｇ／ｍｌのスクロースと、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０とを含むｈ１７０５－００８製剤を調製して、４℃及び２５℃における安定性を調査した。その結果は、表２７に示されている。その結果により、高温条件下においては、ｈ１７０５－００８製剤のＳＥＣ、ＣＥ及びＩＥＣがわずかに低下しているが、この低下は許容範囲内であり；４℃条件ではすべての指標に有意な変化がないことが示されており、このことは、製剤が好ましい安定性を有することを示している。
Figure 2022528230000044
 注記：Ｍは、月数を表し、Ｔは、時間を表し、Ｎ／Ａは、検出なしを表す。
試験例１８．さらなる任意選択による製剤
さらに、本開示は、抗ＩＬ－５抗体医薬製剤のためのさらなる配合も提供し、限定されるわけではないが、以下のものを含む：
（１） １ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（２） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（３） １２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（４） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．０の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（５） ８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．４の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（６） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（７） ９０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７４ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．６の２５ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（８） ９０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７６ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．４の３５ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（９） ８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．６の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（１０） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（１１） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー。
上記実験結果により、上記ＩＬ－５抗体製剤は、好ましい安定性を有し、ＩＬ－５抗体型作用物質の調製に応用することができることが示されている。
試験例１９．抗ＩＬ－５抗体製剤の凍結乾燥
７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び１００ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＬ－５抗体を含むｈ１７０５－００８抗体製剤を、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー中に調製した。抗体を２．１５ｍＬ／バイアルで６ｍＬバイアルに充填し、凍結乾燥のために凍結乾燥チャンバに入れた。凍結乾燥プロセスは、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。凍結乾燥プロセスが終わったら、バイアルを真空を適用し、栓を装着した。復元したサンプルは、凍結乾燥前の対応物と比較した。その結果により、復元溶液は、液体製剤の性能と同様の好ましい性能を維持できることが示されている。
Figure 2022528230000045
 注記：Ｎ／Ａは、上記表が適用不可であることを表す。

Claims (27)

  1. 抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、緩衝液および界面活性剤を含み、緩衝液が、酢酸-酢酸ナトリウム、コハク酸-コハク酸ナトリウム、ヒスチジン-塩酸塩およびクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液、好ましくは酢酸-酢酸ナトリウムまたはコハク酸-コハク酸ナトリウム緩衝液からなる群から選択されるいずれか1つであり、抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域およびi)～vi)からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、医薬組成物。
    i)アミノ酸配列SEQ ID NO:16、17、18に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、および、
    アミノ酸配列SEQ ID NO:19、20および21に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
    ii)アミノ酸配列SEQ ID NO:22、23、24に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、および、
    アミノ酸配列SEQ ID NO:25、26および27に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
    iii)アミノ酸配列SEQ ID NO:28、29、30に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなる重鎖可変領域、および、
    アミノ酸配列SEQ ID NO:31、32および33に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
    iv)アミノ酸配列SEQ ID NO:34、35、36に示されるように、HCDR1、HCDR2、HCDR3からなる重鎖可変領域、および
    アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38、39に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
    v)SEQ ID NO:40、41、42に示されるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3からなる重鎖可変領域、ならびに
    SEQ ID NO:43、44、および45に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域、ならびに
    vi)それぞれのアミノ酸配列SEQ ID NO:34、82および36に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、ならびに、
    それぞれのアミノ酸配列SEQ ID NO:37、38および39に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
  2. 緩衝液のpHが約5.0～約6.5、好ましくは約5.0～約5.8、最も好ましくは約5.5である請求項1の医薬組成物。
  3. 前記緩衝液の濃度が約10mMから約40mMであり、好ましくは約20mMから約30mMである請求項1又は2の医薬組成物。
  4. 前記抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度が、約1mg/ml～約120mg/ml、好ましくは約80mg/ml～約120mg/ml、最も好ましくは約100mg/mlである、請求項1～3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 表面剤がポリソルベート80である請求項1～4のいずれかに記載された医薬組成物。
  6. ポリソルベート80の濃度は、約0.1mg/mlから約0.6mm、好ましくは約0.2mg/mlから約0.6mg/ml、より好ましくは約0.4mm/mlである請求項5の医薬品組成物。
  7. 安定剤をさらに含み、安定剤が糖類またはアミノ酸であり、糖類がスクロース、トレハロース、マンニトールおよびソルビトール、好ましくはスクロースからなる群から選択され、アミノ酸がグリシン、メチオニンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項1～6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記糖類の濃度が、約50mg/ml～約80mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約75mg/ml、最も好ましくは約72mg/mlである、請求項7に記載の医薬組成物。
  9. アミノ酸の濃度が約8mg/mlであることを特徴とする請求項7に記載の医薬組成物。
  10. 請求項1～9のいずれか1つに記載の医薬組成物であり、以下の組成からなる。
    約1mm/ml～約120mg/ml、抗IL-5、又はその抗原結合断片であり、
    約10mMから約40mMの酢酸ナトリウム・酢酸緩衝液であり、pHは約5.0から約6.5であり、
    ポリソルベート80は約0.1mg/mlから約0.6mm/mlである。
  11. 請求項1～9のいずれかによる医薬組成物であり、
    約80mg/ml～約120mg/mlの抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、
    約10mM～約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液であり、pHは約5.0～約5.8、
    約0.2mg/ml～約0.6mg/mlのポリソルベート80、および
    約70mg/ml～約80mg/mlのスクロース、
    望ましくは、製薬組成物は構成され、
    約100mm/ml 抗IL-5 OOC又は抗原結合断片、
    約30mM 酢酸ナトリウム緩衝剤であり、pHは約5.5、
    約0.4mm/mlのポリソルベート80、
    約72mm/mlのシュクロス。
  12. 抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントが、ネズミ抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1～11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. ヒューマン化された抗IL-5抗菌液が、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるような重鎖可変領域を含む請求項12の医薬組成物であり、その変形例は、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるような重鎖可変領域における1～10のアミノ酸バック・突然性を含む。
  14. 当該変形例が、以下のいずれかに示される変形例であることを特徴とする請求項13に記載された医薬品組成物。
    i)SEQ ID NO:49に示されるように重鎖可変領域のS49T、V93TおよびK98Sからなる群から選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
    ii)SEQ ID NO:57に示される重鎖可変領域のS49T、V93T、およびK98Tからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変種。
    iii)SEQ ID NO:63に示されるように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74KおよびL83Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種。
    iv) SEQ ID NO:69および/またはHCDR2における重鎖可変領域のF29I、R38K、V48I、R72AおよびT97Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸の背中突然変異、または
    v)SEQ ID NO: 75に示されているように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83FおよびD89Eからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸の背中突然変異からなる変種。
  15. ヒューマン化された抗IL-5抗菌を含む請求項14に記載された医薬組成物であり、
    配列番号 NO:50又は51に示すような重鎖可変領域、又は
    配列番号 NO:58又は59に示すような重鎖可変領域、又は
    配列番号 NO:64、65及び66からなる群から選択したいずれかの群から選択したような重鎖可変領域、又は
    配列番号 NO:70又は71に示すような重鎖可変領域、又は
    配列番号 NO76、77、78及び79からなる群から選択したいずれかの群から選択した重鎖可変領域。
  16. ヒューマナイズされた抗IL-5抗菌剤が、SEQ ID NO:46、54、60、67または72に示されるように軽鎖可変領域を含んでいること、またはそれらの変形例は、SEQ ID NO:46、54、60、67または72に示されるように、軽鎖可変領域の1～10のアミノ酸バック・突然性を含んでいることを特徴とする請求項12による医薬品組成。
  17. 当該変形例が、以下のいずれかに示される変形例である請求項16に記載された医薬組成物。
    i)SEQ ID NO:46に示される軽鎖可変領域のA43S、L47V、G66R、T69S、F71YおよびY87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
    ii)SEQ ID NO: 54に示される軽鎖可変領域のA43S、L47M、F71Y、Y87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種。
    iii)SEQ ID NO: 60に示されている軽鎖可変領域でE1D、I2T、I57V、V84TおよびY86Fからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
    iv)SEQ ID NO:67に示されているような軽鎖可変領域で、M4L、A42S、L45PおよびL46Wからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸の背中突然変性からなる派生型、または
    v)SEQ ID NO:72に示されているような軽鎖可変領域で、A43S、I48VおよびF71Yからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸の背中突然変性からなる派生型。
  18. ヒューマン化された抗IL-5抗菌が構成する請求項17による医薬品組成であり、
    SEQ ID NO:47または48に示された軽鎖可変領域、または
    SEQ ID NO:55または56に示された軽鎖可変領域、または
    SEQ ID NO:61または62に示された軽鎖可変領域、または
    SEQ ID NO:68に示された軽鎖可変領域、または
    SEQ ID NO:73または74に示された軽鎖可変領域。
  19. ヒューマン化された抗IL-5抗菌が構成する請求項12による医薬品組成。
    i)SEQ ID NO:49、50、51のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:49、50、51のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような重鎖可変領域、および
    SEQ ID NO:46、47、48のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:46、47、48のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを持つような軽鎖可変領域。
    ii)SEQ ID NO:57、58、59のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:57、58、59のどれか1つとの95%のシークエンスアイデンティティを有すること、および
    SEQ ID NO:54、55および56のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:54、55および56のどれか1つとの95%シークエンスアイデンティティを有すること。
    iii)配列番号63、64、65および66のいずれか1つに示されるか、または配列番号63、64、65および66のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
    配列番号60、61および62のいずれか1つに示されるか、または配列番号60、61および62のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
    iv)配列番号:69、70および71のいずれか1つに示されるか、または配列番号:69、70および71のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、または
    配列番号: 67および68のいずれか1つに示されるか、または配列番号:67および68のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
    v)配列番号:75、76、77、78および79のいずれか1つに示されるか、または配列番号:75、76、77、78および79のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号:72、73および74のいずれか1つに示されるか、または配列番号: 72、73および74のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域であり、
    好ましくは、人間化された抗IL-5抗菌は、以下を含む。
    a)SEQ ID NO:51に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:47に示すような軽鎖可変領域。
    b)SEQ ID NO:65に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:62に示すような軽鎖可変領域。
    c)SEQ ID NO:58に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:56に示すような軽鎖可変領域。
    d)SEQ ID NO:71に示すような重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:68に示すような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:79に示すような重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:73に示すような軽鎖可変領域。
  20. 抗IL-5抗菌作用が、人間の抗菌作用の一定領域を含む請求項1～19のいずれかに記載される医薬品組成物であり、好ましくは以下のものを含む。
    SEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:53に示されているように、ヒトAd重鎖不変領域およびヒトAd軽鎖定常領域。
  21. 抗IL-5抗菌を含む請求項20に記載の医薬組成物であり、
    i)SEQ ID NO:83に示すような重鎖とSEQ ID NO:84に示すようなL鎖。
    ii)SEQ ID NO:85に示すような重い鎖とSEQ ID NO:86に示すようなL鎖。
    iii)SEQ ID NO:87に示すような重い鎖とSEQ ID NO:88に示すようなL鎖。
    iv)SEQ ID NO:89に示すような重鎖とSEQ ID NO:90に示すような軽鎖、またはSEQ ID NO:91に示すような重鎖とSEQ ID NO:92に示すような軽鎖。
  22. 抗IL-5抗体が、請求項1～21のいずれか一項に記載の抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントとヒトIL-5との結合を競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1～21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 請求項1～22のいずれかによれば、緩衝剤が好ましくは酢酸ナトリウム・酢酸ナトリウム緩衝剤である緩衝剤である、抗IL-5のストックソリューションまたはその抗原結合フラグメントを緩衝剤に置き換えるステップを含む、医薬品組成を準備するための方法。
  24. 請求項1～22のいずれかによれば、当該医薬品組成物の親和性により得られる、抗IL-5抗原、又はその抗原結合フラグメントからなる親和性製剤は、好ましくは、親和性化は、凍前乾燥、一次乾燥及び二次乾燥の段階を順次含む。
  25. 請求項24によれば、再構成された液体が、親和性配合の再構成によって得られる、抗IL-5抗原結合フラグメントまたはその抗原結合フラグメントからなる再構成された液体。
  26. 請求項1～22のいずれかの請求項による医薬品組成物、又は請求項24によるフィロフィライズ製剤、又は請求項25による再構成されたソリューションを含む容器からなるアーティクル。
  27. 請求項1～22のいずれかの請求項による医薬品組成の治療効果を有する治療法、または請求項25または請求項26に基づく再構成された解決法からなるIL-5仲介病を、好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性ブロンチパルモナリアアスペルギリア、エゾシノフィリア、チョルグ-ストロス病、アトピック皮膚炎、断続的アンギオデマ、エゾシノフィリック胃腸炎、ワーム感染、ホジキンポリプス、ロフラーポリプス、ウルチカリア、ハイパーオシノフィリックブロンチス、ノイズノフィリック食道炎からなる群から選ばれる、アレルギー性食道炎、アレルギー性結核症、内臓症、ステロイド依存性エオシン・ブロンチティス。
JP2021557128A 2019-03-29 2020-03-27 Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用 Pending JP2022528230A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910249953.4 2019-03-29
CN201910249953 2019-03-29
PCT/CN2020/081701 WO2020200099A1 (zh) 2019-03-29 2020-03-27 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022528230A true JP2022528230A (ja) 2022-06-09

Family

ID=72664562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021557128A Pending JP2022528230A (ja) 2019-03-29 2020-03-27 Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220144937A1 (ja)
EP (1) EP3939611A4 (ja)
JP (1) JP2022528230A (ja)
KR (1) KR20210145187A (ja)
CN (2) CN113507938B (ja)
AU (1) AU2020251627A1 (ja)
BR (1) BR112021019272A2 (ja)
CA (1) CA3134401A1 (ja)
MX (1) MX2021011530A (ja)
WO (1) WO2020200099A1 (ja)
ZA (1) ZA202106721B (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202228776A (zh) * 2020-12-03 2022-08-01 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 抗tslp抗體藥物組合物及其用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096704A (en) * 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
JP3202029B2 (ja) * 1991-02-27 2001-08-27 サントリー株式会社 インターロイキン５の微量定量
AU1289795A (en) * 1993-11-19 1995-06-06 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
AU708951B2 (en) * 1994-12-23 1999-08-19 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
KR101941514B1 (ko) 2010-12-22 2019-01-23 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 개선된 반감기를 가지는 변형된 항체
KR20140018966A (ko) 2011-04-07 2014-02-13 글락소스미스클라인 엘엘씨 점도가 감소된 제제
WO2014141149A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Formulations with reduced viscosity
JP7325166B2 (ja) 2013-12-20 2023-08-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二重特異性抗体
WO2016040007A1 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Cephalon, Inc. Use of reslizumab to treat moderate to severe eosinophilic asthma
AU2016311385C1 (en) * 2015-08-24 2019-08-22 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Biopharmaceutical compositions
AU2017379853A1 (en) 2016-12-23 2019-07-04 Cephalon, LLC Anti-IL-5 antibodies
JP7295038B2 (ja) * 2017-06-06 2023-06-20 グラクソスミスクライン エルエルシー 小児患者のための生物薬剤組成物及び方法
EP3689906A4 (en) * 2017-09-29 2021-04-07 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. IL-5 ANTIBODIES, ANTIGIBINDING FRAGMENT THEREOF, AND MEDICAL USES THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021019272A2 (pt) 2022-01-04
US20220144937A1 (en) 2022-05-12
TW202102204A (zh) 2021-01-16
MX2021011530A (es) 2021-10-22
EP3939611A4 (en) 2022-12-21
AU2020251627A1 (en) 2021-11-11
CA3134401A1 (en) 2020-10-08
WO2020200099A1 (zh) 2020-10-08
ZA202106721B (en) 2022-05-25
KR20210145187A (ko) 2021-12-01
CN113507938B (zh) 2024-04-16
EP3939611A1 (en) 2022-01-19
CN113507938A (zh) 2021-10-15
CN118340881A (zh) 2024-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111744007B (zh) 一种抗tigit抗体药物组合物及其用途
JP5931442B2 (ja) 操作された抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体の凍結乾燥製剤
RU2771384C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение
EP4257604A1 (en) Anti-tslp antibody pharmaceutical composition and use thereof
US20220356239A1 (en) Il-5 antibody, antigen binding fragment thereof, and medical application therefor
EP4190353A1 (en) Anti-pd-1 antibody pharmaceutical composition and use thereof
JP2022528230A (ja) Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用
JP2022513671A (ja) Ｃｄ４０抗体医薬品組成物およびその使用
EP4375298A1 (en) Pharmaceutical composition of anti-angptl3 antibody or antigen binding fragment thereof and its application
EP4257603A1 (en) Pharmaceutical composition comprising anti-connective tissue growth factor antibody
EP4104858A1 (en) Pharmaceutical composition containing anti-il-4r antibody and use thereof
WO2021190582A1 (zh) 一种抗ox40抗体药物组合物及其用途
KR20230029781A (ko) 폴리오마바이러스 중화 항체의 투여
TWI853912B (zh) 包含抗il-5抗體的醫藥組成物及其用途
RU2824390C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против il-5, и ее применение
EP4393949A1 (en) Pharmaceutical composition containing fusion protein
RU2778572C1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе антител к cd40 и ее применение
EP4393506A1 (en) Pharmaceutical composition of anti-il4r antibody and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20211227

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230314

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240402

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240702

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20241001