JP2022528230A - Il-5に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:16、17、18に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:19、20および21に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる。
(ii)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:22、23、24に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:25、26、27に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(iii)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:28、29、30に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなり、
軽鎖可変領域はアミノ酸配列SEQ ID NO:31、32、33に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(iv)重鎖可変領域は、SEQ ID NO:34、35、36に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38および39に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる。
(v)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:40、41、42に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:43、44、45に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
(vi)重鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:34、82、36に示すように、HCDR1、HCDR2、HCDR3からなり、
軽鎖可変領域は、アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38、39に示すように、LCDR1、LCDR2、LCDR3からなる。
(a)抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント約1mg/ml~約120mg/m、(b)pH約10mM~約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、約5.0~6.5、および(c)ポリソルベート80約0.1mg/ml~約0.6mg/mlである。
(a)抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント約80mg/ml~約100mg/m、(b)pH約10mM~約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、約5.0~約6.0、および(c)ポリソルベート80約0.1mg/ml~約0.4mg/mlである。
(d)約80mg/ml~約120mg/mlのIL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、(e)約10mM~約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、pHは約5.0~約5.8、(f)約0.2mg/ml~約0.6mg/mlのポリソルベート80、および(g)約70mg/ml~約75mg/mlのショ糖、好ましくは、医薬組成物は、好ましくは、含む。
(h)約100mm/mlのIL-5OOC又はそれらの抗原結合フラグメント、(i)約30mMの酢酸ナトリウム・酢酸緩衝液、pHは約5.5、(j)約0.4mm/mlのポリソルベート80及び(k)約72mm/mlのスクロースである。
(i)SEQ ID NO:49に示されるように重鎖可変領域のS49T、V93TおよびK98Sからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種
(ii)SEQ ID NO:57に示される重鎖可変領域のS49T、V93T、およびK98Tからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変わり
(iii)SEQ ID NO:63に示されるように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74KおよびL83Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種
(iv)重鎖可変領域のF29I、R38K、V48I、R72A、およびT97Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・変異からなる変形例であり、SEQ ID NO:69および/またはCDRにおけるN55Vの変性、又は
(v)SEQ ID No:75に示されているように重鎖可変領域において、R38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83FおよびD89Eからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・変異からなる変種
SEQ ID NO:50又は51に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:58又は59に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:64、65及び66からなる群から選択したいずれかの群から選択したような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:70又は71に示すような重鎖可変領域、又は
SEQ ID NO:76、77、78及び79からなる群から選択したいずれかの群から選択した重鎖可変領域。
(i)SEQ ID NO:46に示される軽鎖可変領域のA43S、L47V、G66R、T69S、F71YおよびY87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種
(ii)SEQ ID NO:54に示される軽鎖可変領域のA43S、L47M、F71Y、Y87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種
(iii)SEQ ID NO:60に示されている軽鎖可変領域のE1D、I2T、I57V、V84TおよびY86Fからなる群から選択されたアミノ酸のバック突然変わり、またはそれらの組合せ
(iv)SEQ ID NO:67に示される軽鎖可変領域で、M4L、A42S、L45PおよびL46Wからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・突然変わりおよび、
(v)SEQ ID NO:72に示されているように、軽鎖可変領域でA43S、I48VおよびF71Yから成るグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・突然変異
SEQ ID NO:47または48に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:55または56に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:61または62に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:68に示された軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:73または74に示された軽鎖可変領域
(i)SEQ ID NO:49、50、51のいずれかに示されるように、重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:49、50、51のいずれかで95%の配列同一性を持ち、および
SEQ ID NO:46、47、48のいずれかで示されるように、軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:46、47、48のいずれかで示されるように、95%の配列同一性を持ち、
(ii)SEQ ID NO: 57、58、59のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:57、58、59のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような重鎖可変領域、および
SEQ ID NO:54、55および56のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:54、55および56のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような軽鎖可変領域、
(iii)配列番号63、64、65および66のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域、または配列番号63、64、65および66のいずれか1つと95%の配列同一性を有し、および
配列番号60、61および62のいずれか1つに示されるような軽鎖可変領域、または配列番号60、61および62のいずれか1つと95%の配列同一性を有し、
(iv)SEQ番号69、70、71のいずれかに示されるような重鎖可変領域、あるいはSEQ番号69、70、71のいずれか1つのいずれかとの95%の配列同一性を持つ領域、および
SEQ ID NO:67と68のどれかに示されているような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:67と68のどれか1つとの95%の配列同一性を持つ領域、または
(v)SEQ番号75、76、77、78および79のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ番号75、76、77、78および79のいずれかのいずれかとの95%の配列同一性を有し、および
SEQ ID NO:72、73、74のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:72、73、74のいずれか1つとの95%の配列同一性を有し、できれば、人間化された抗IL-5は
(a)SEQ ID NO:51に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:47に示すような軽鎖可変領域
(b)SEQ ID NO:65に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:62に示すような軽鎖可変領域
(c)SEQ ID NO:58に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:56に示すような軽鎖可変領域
(d)SEQ ID NO:71に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:68に示すような軽鎖可変領域、または
(e)SEQ ID NO:79に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:73に示すような軽鎖可変領域
(i)SEQ ID NO:83に示すような重鎖とSEQ ID NO:84に示すようなL鎖
(ii)SEQ ID NO:85に示すような重い鎖とSEQ ID NO:86に示すようなL鎖
(iii)SEQ ID NO:87に示すような重い鎖とSEQ ID NO:88に示すようなL鎖
(iv)SEQ ID NO:89に示すような重鎖とSEQ ID NO:90に示すような軽鎖、または
(v)SEQ ID NO:91に示すような重い鎖とSEQ ID NO:92に示すようなL鎖
本開示をより容易に理解するために、以下に特定の技術及び科学的用語を定義する。ここで使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、本開示が別途明確に定義されない限り、本技術分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。
本開示は、以下の実施例とあわせてさらに説明されるが、これらの実施例は、本開示の範囲を限定しない。本開示の実施例において特定の条件を備えていない実験方法は、通常、A Laboratory Manual, Molecular Cloning by Cold Spring Harbor Laboratory、または、材料または製品の製造者によって推奨される条件に従うような、従来の条件に従ったものである。特定の供給源以外の試薬は、市販されている従来の試薬を使用している。
1.1IL-5抗原の設計と式
His-tagを有するヒトIL-5、His-tagを有するアカゲザルIL-5、His-tagを有するマウスIL-5、His-tagを有するラットIL-5、ヒトIgG1-Fcフラグメントを含むヒトIL-5Rα受容体細胞外領域融合タンパク質をコードする配列を、phrベクトルにクローン化し、発現プラスミドを構築し、次いでHEK293にトランスフェクトした。トランスフェクション後6日目に試料を採取し、4500rpmで10分間の遠心分離により細胞上清を回収した。組み換えIL-5およびIL-5αレセプタータンパク質からなる上層部をニッケルカラムを用いて精製し、組み換えヒトIL-5-Fc融合タンパク質をプロテインA親和クロマトグラフィーカラムを用いて精製した。精製タンパク質はその後の実験で使うことができる。特定のタンパク質抗原の配列は次のとおりである。
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESHHHHHH
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
SEQ ID NO:1
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPASALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIGGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESHHHHHH
SEQ ID NO:2
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEGHHHHHH
SEQ ID NO:3
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
MEIPMSTVVKETLIQLSTHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEILFQNLSLIKKYIDGQKEKCGEERRKTRHFLDYLQEFLGVMSTEWAMEVHHHHHH
SEQ ID NO:4
注:斜体の部分はHis6タグを表している。
DLLPDEKISLLPPVNFTIKVTGLAQVLLQWKPNPDQEQRNVNLEYQVKINAPKEDDYETRITESKCVTILHKGFSASVRTILQNDHSLLASSWASAELHAPPGSPGTSIVNLTCTTNTTEDNYSRLRSYQVSLHCTWLVGTDAPEDTQYFLYYRYGSWTEECQEYSKDTLGRNIACWFPRTFILSKGRDWLAVLVNGSSKHSAIRPFDQLFALHAIDQINPPLNVTAEIEGTRLSIQWEKPVSAFPIHCFDYEVKIHNTRNGYLQIEKLMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWIEGRMDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5
注:斜体の部分は、人間のIgG1-Fc-tag を表している。
本開示は、機能性抗物質をスクリーニングするために、IL-5αを発明CHO-S/IL-5αセルライン、およびIL-5αとIL-5αを発明CHO-S/IL-5α/IL-5αセルラインを構築した。
組み換えタンパク質rhIL-5-his(Sigma、Lot#SLBQ1109V)とIFA(Sigma、Lot#SLBJ2845V)、(100g/50g/50g(高)と25g/12.5g/12.5g(低))の2つの用量をBalb/cマウス(5つのマウス/グループ)とSJLマウス(5つのマウス/グループ)の2つのグループに予防接種した。IL-5に対する特異的免疫応答は、ELISAによる血清力価の検出、配位子-レセプターブロッキングアッセイおよびTF-1増殖の阻害アッセイによって測定した。固有の良い反応を示すマウスを選択し、犠牲にし、スプリーン電池を収集し、ミエローマ電池と融合させた。
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:6
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLQDKEFPRTFGGGTRLELK
配列番号7
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATETLRESLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:8
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSASNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQHKQFPRTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:9
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVKQSQGRSLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKFSSTAYMEFRRLTFEDSAIYYCARDGGYSDPLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:10
DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQQPKLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:11
EVQLQQSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKHGPKFQGKATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIYYCFRYGIYPDHWGQGTPLTVSS
SEQ ID NO:12
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTATLASGVPARFSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE
SEQ ID NO:13
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATLTADKSSSTAYLEFSRVTSEDSAIYYCGRRIAWDHWYFDFWGPGTMVTVSS
SEQ ID NO:14
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDVAWYQQKSGRSPQLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTRYFFKISGMQPEDEADYFCQQGYKTPLTFGSGTKLEIK
配列番号15
[表2]
4.1IL-5-Flag-His組み換えタンパク質の精製工程
試料は高速で遠心分離して不純物を取り除き、適宜に集中させた。NI‐NTA親和性列(QIAGEN, Cat No.30721)をPBSと平衡させ、2‐5折り目の柱体積で洗った。不純物を除去した後、細胞表現上性試料を柱に積み込んだ。コラムはPBSで洗浄し、A280の読み取り値がベースラインに減少した。カラムをPBSで洗浄して汚染タンパク質を除去し、試料を収集した。目的タンパク質を洗濯緩衝剤(20mMイミダゾール)と溶出緩衝液剤(300mMイミダゾール)で順次溶出させ、溶出ピークを収集した。
4.2ハイブリドーマ発現抗体およびFc融合タンパク質の精製
当該技術における多くの参考文献で開示されているように、ネズミの抗ヒトIL-5モノクローナル抗菌の人為化を行った。簡単に言うと、ネズミの抗原の定常領域はヒトの定常領域に置き換えられ、ネズミの抗原のCDRは最高の相同を持つFRヒトテンプレートに接ぎ木され、FR領域のアミノ酸の背中突然変性が行われた。
得られたネズミAbid VH/VL CDRの典型的な構造に基づいて、ヒトゲルムラインデータベースから軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)ホモロゴシークエンスを検索し、FR相同(上から下へ)に従ってランク付けし、最高FR相同のゲルムラインを主要テンプレートとして選択した。ヒトテンプレートにネズミのCDR領域を接ぎ木し、その後FR残基を交代させ、アミノ酸残基を最適化して最終的に人類化された分子を得ることができた。
5.1ハイブリドーマクローンmAb1705のヒト化フレームワークの選択
備考:「接ぎ木」は、ネズミの抗原CDRがヒトゲルムラインFR領域配列に接ぎ木されたことを表しており、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の43番目のAを表すA43Sは、Sに戻された。
[表4]
注:この表は、様々な組合せで得られた配列を示している。h1705-007によって示されるように、人間化された殺人顔料h1705-007は、2つのミュータント、すなわちL鎖h1705_VL.1Aを含む。重鎖h1705_VH.1A、等々。
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:52
注:下線部分はM252Y、S254T、T256Eの突然変異を示す。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号53
5.2ハイブリドーマクローンmAb1706のヒト化フレームワークの選択
[表5]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の自然数によれば、「接ぎ木」の43番目にAを表すA43SをSに戻した。
[表6]
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETLRESLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
5.3ハイブリドーマクローンmAb1780のヒト化フレームワークの選択
[表7]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の1番目のEを表すE1DをDに戻した。
[表8]
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVKQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
5.4ハイブリドーマクローンmAb1773のヒト化フレームワークの選択
[表9]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングによれば、「接ぎ木」の4番目のMを表すM4LをLに戻した。
[表10]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKAPKLLIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
5.5ハイブリドーマクローンmAb1779のヒト化フレームワークの選択
[表11]
(注)「接ぎ木」は、ヒトゲルムラインFR領域に接ぎ木したものであり、例えば、アミノ酸配列の自然数によれば、「接ぎ木」の43番目にAを表すA43SをSに戻した。
[表12]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:83
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:84
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:85
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:86
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:87
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:88
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:89
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:90
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:91
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:92
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSAIKSRFTISRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:80
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号81
1. 組換えキメラ抗体の分子クローニング
Hybridomasをスクリーニングした結果、検出された遺伝子分子が可変領域をエンコードした後、配列決定により得られた。得られた配列に基づいて順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計し、配列決定された遺伝子を鋳型として用い、PCRにより各抗体VH/VK遺伝子断片を構築した後、相同組換えにより発現ベクターpHr (シグナルペプチドおよびhIgG1/hκ定常領域遺伝子(CH1-Fc/CL)断片を有する)に挿入し、組換えキメラ抗体全長発現プラスミドVH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHrを構築し、5つのキメラ抗体Ch1705、Ch1706、Ch1780、Ch1773およびCh1779を得た。
2. ヒト化抗体の分子クローニング
抗体光または重鎖を表す遺伝子を別々にHEK293E電池にトランスフェクトした。6日後、式上生剤を採取し、高速で遠心分離して不純物を除去し、Aタンパク質柱で精製した。A280の読み取りがベースラインに減少するまで、このコラムはPBSで洗浄された。目的タンパク質を酸性溶出緩衝液、pH3.0-pH3.5で溶出させ、1Mトリス‐HCL、pH 8.0‐9.0で中和した。溶出した試料は適切に濃縮され、さらにPBSで予め平衡化されたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)によって精製され、集合体を除去し、一量体ピークを収集し、使用のために引用された。
in vitroにおける活性の生物学的評価
Biacoreアッセイによる異なる種のIL-5に対するマウスIL-5抗体の結合
[表13]
Biacoreアッセイによる異なる種のIL-5に対するヒト化IL-5抗体の親和性
[表14]
IL-5のIL-5αレセプターへの結合をブロックするためのマウスIL-5抗体のELISAベースのアッセイ
[表15]
IL-5のIL-5レセプターへの結合を阻止するIL-5抗体のFACSベースのアッセイ
[表16]
IL-5 TF1細胞のIL-5誘導性増殖を阻害する抗体
[表17]
IL5誘導好酸球接着を阻害するIL5抗体の試験
[表18]
Th2サイトカインによるヒト化IL-5抗体の特異性の評価
in vivo活性の生物学的評価
OVA誘発マウス喘息モデルにおけるIL-5抗体の有効性の評価
外因性ヒトIL-5によるモルモット急性喘息モデルにおけるIL-5抗体のin vivo効果の評価
配合成分の選定・安定性評価
緩衝系のスクリーニング
[表19]
注: N/A は検出されず、D は曜日、T0 は曜日を表す。
製剤中の賦形剤のスクリーニング
1) ポリソルベート20(PS20)0.1mg/ml
2) ポリソルベート80(PS80)0.1mg/ml
3) 50mg/ml ショ糖+0.1mg/ml PS80
4) 50mg/ml トレハロース+0.1mg/ml PS80
5) 50mg/ml マンニトール+0.1mg/ml PS80
6) 50mg/ml ソルビトール+0.1mg/ml PS80
7) アルギニン(アルギン)8mg+PS80 0.1mg/ml
8) 8mg/ml リジン(Lys) + 0.1mg/ml PS80
9) グライシン(グレイ)+0.1mg/ml PS80 8mm/ml
10) 8mg/ml メチオニン(Met) + 0.1mg/ml PS80
11) プロリン(プロ)8mg+PS80 0.1mg/ml
12) 8mg/ml塩化ナトリウム(NaCl) +0.1mg/mL PS80。
各製剤はろ過され、積み込まれ、ストッパーとキャップで覆われ、使用された。試料を40℃で強制劣化実験を行った結果(表20)、各試料群の間でSEC、CE、およびiCIEFの試験結果に有意な差はなく、Arg/Lys/NaClグループの外観はより悪く、他のグループ間の有意な差はなかった。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、プロリン、およびメチオニンは、タンパク質安定性に好影響を及ぼす。
[表20]
注:D は曜日を表わす。
界面活性剤のスクリーニング
[表21]
(注)Mはヶ月、N/Aは検出されない。
DOE配合の設計とスクリーニング
[表22]
[表23]
注:D は曜日を表わす。
安定性試験
[表24]
(注)Mはヶ月を表わす。
イオン強度のスクリーニング
[表25]
糖類濃度のスクリーニング
[表26]
製剤の安定性試験
[表27]
備考:Mはヶ月、Tは時間、N/Aは確定されていない。
追加の任意配合
(1)1mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/mlポリソルベート80、pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝液10mM
(2)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝液20mM
(3)120mm/ml 抗IL-5(h1705-008)、72mm/ml スクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液
(4)pH 5.0で100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、80mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80、および30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(5)pH 5.4で80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、75mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(6)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、80mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液30mM
(7)pH 5.6で90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、74mg/mlのスクロース、0.5mg/mlのポリソルベート80、および25mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(8)pH 5.4で90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、76mg/mlのスクロース、0.3mg/mlのポリソルベート80、および35mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(9)pH 5.6で80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80、および30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液
(10)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、72mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5 酢酸ナトリウム緩衝液
(11)100mm/ml抗IL-5(h1705-008)、80mm/mlスクロース、0.4mm/ml ポリソルベート80、40mM pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝剤
実験結果は、上述のようなIL-5製剤は良好な安定性を有し、IL-5製剤の準備に適用できることを示した。
抗IL-5抗体製剤の凍結乾燥
[表28]
注: N/Aは、表が適用されなかったことを表す。
(i) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:16、17及び18に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:19、20及び21に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み;
(ii) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:22、23及び24に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:25、26及び27に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み;
(iii) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:28、29及び30に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:31、32及び33に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み;
(iv) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:34、35及び36に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:37、38及び39に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み;
(v) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:40、41及び42に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:43、44及び45に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み;又は、
(vi) 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:34、82及び36に示されたHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号:37、38及び39に示されたLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、
医薬組成物を提供する。
(a) 約1mg/ml~約120mg/mlの抗IL-5抗体又はその抗原結合性フラグメント;(b) pH約5.0~6.5の約10mM~約30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;及び(c) 約0.1mg/ml~約0.6mg/mlのポリソルベート80
を含む。
(a) 約80mg/ml~約100mg/mlの抗IL-5抗体又はその抗原結合性フラグメント;(b) pH約5.0~約6.0の約10mM~約30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;及び(c) 約0.1mg/ml~約0.4mg/mlのポリソルベート80
を含む。
(d) 約80mg/ml~約120mg/mlのIL-5抗体又はその抗原結合性フラグメント;(e) pH約5.0~約5.8の約10mM~約30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;(f) 約0.2mg/ml~約0.6mg/mlのポリソルベート80;及び(g) 約70mg/ml~約75mg/mlのスクロース
を含み;好ましくは、本医薬組成物は好ましくは、
(h) 約100mg/mlのIL-5抗体又はその抗原結合性フラグメント、(i) pH約5.5の約30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー、(j) 約0.4mg/mlのポリソルベート80及び(k) 約72mg/mlのスクロース
を含む。
(i) 配列番号:49に示された重鎖可変領域中にあるS49T、V93T及びK98Sからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(ii) 配列番号:57に示された重鎖可変領域中にあるS49T、V93T及びK98Tからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(iii) 配列番号:63に示された重鎖可変領域中にあるR38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74K及びL83Fからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(iv) 配列番号:69に示された重鎖可変領域中にあるF29I、R38K、V48I、R72A及びT97Fからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異及び/若しくはCDR中にあるN55V変異を含む、バリアント;又は、
(v) 配列番号:75に示された重鎖可変領域中にあるR38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83F及びD89Eからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか1つに示されたバリアントである。
配列番号:50若しくは51に示された重鎖可変領域;又は、
配列番号:58若しくは59に示された重鎖可変領域;又は、
配列番号:64、65及び66からなる群より選択されるいずれか1つに示された重鎖可変領域;又は、
配列番号:70若しくは71に示された重鎖可変領域;又は、
配列番号:76、77、78及び79からなる群より選択されるいずれか1つに示された重鎖可変領域
を含む。
(i) 配列番号:46に示された軽鎖可変領域中にあるA43S、L47V、G66R、T69S、F71Y及びY87Fからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(ii) 配列番号:54に示された軽鎖可変領域中にあるA43S、L47M、F71Y及びY87Fからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(iii) 配列番号:60に示された軽鎖可変領域中にあるE1D、I2T、I57V、V84T及びY86F又はこれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;
(iv) 配列番号:67に示された軽鎖可変領域中にあるM4L、A42S、L45P及びL46Wからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント;並びに、
(v) 配列番号:72に示された軽鎖可変領域中にあるA43S、I48V及びF71Yからなる群より選択される1種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか1つに示されたバリアントである。
配列番号:47若しくは48に示された軽鎖可変領域;又は、
配列番号:55若しくは56に示された軽鎖可変領域;又は、
配列番号:61若しくは62に示された軽鎖可変領域;又は、
配列番号:68に示された軽鎖可変領域;又は、
配列番号:73若しくは74に示された軽鎖可変領域
を含む。
(i) 配列番号:49、50及び51のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:49、50及び51のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、重鎖可変領域;並びに、
配列番号:46、47及び48のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:46、47及び48のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、軽鎖可変領域;
(ii) 配列番号:57、58及び59のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:57、58及び59のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、重鎖可変領域;並びに、
配列番号:54、55及び56のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:54、55及び56のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、軽鎖可変領域;
(iii) 配列番号:63、64、65及び66のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:63、64、65及び66のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、重鎖可変領域;並びに、
配列番号:60、61及び62のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:60、61及び62のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、軽鎖可変領域;
(iv) 配列番号:69、70及び71のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:69、70及び71のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、重鎖可変領域;並びに、
配列番号:67及び68のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:67及び68のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、軽鎖可変領域;又は、
(v) 配列番号:75、76、77、78及び79のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:75、76、77、78及び79のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、重鎖可変領域;並びに、
配列番号:72、73及び74のいずれか1つに示された、若しくは配列番号:72、73及び74のいずれか1つとの間に95%の配列相同性を有する、軽鎖可変領域を含み;好ましくは、ヒト化抗IL-5抗体は、
(a) 配列番号:51に示された重鎖可変領域及び配列番号:47に示された軽鎖可変領域;
(b) 配列番号:65に示された重鎖可変領域及び配列番号:62に示された軽鎖可変領域;
(c) 配列番号:58に示された重鎖可変領域及び配列番号:56に示された軽鎖可変領域;
(d) 配列番号:71に示された重鎖可変領域及び配列番号:68に示された軽鎖可変領域;又は、
(e) 配列番号:79に示された重鎖可変領域及び配列番号:73に示された軽鎖可変領域
を含む。
(i) 配列番号:83に示された重鎖及び配列番号:84に示された軽鎖;
(ii) 配列番号:85に示された重鎖及び配列番号:86に示された軽鎖;
(iii) 配列番号:87に示された重鎖及び配列番号:88に示された軽鎖;
(iv) 配列番号:89に示された重鎖及び配列番号:90に示された軽鎖;又は、
(v) 配列番号:91に示された重鎖及び配列番号:92に示された軽鎖
を含む。
本開示をより容易く理解するために、特定の専門用語及び科学技術用語が、以下に厳密に規定されている。本明細書において使用されているすべての他の専門用語及び科学技術用語は、そうではないと明示的に規定されていない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
以下、例と組み合わせて本開示をさらに説明するが、これらの例は、本開示の範囲を限定しない。本開示の例において特定の条件を採用していない実験方法は通常、Cold Spring Harbor Laboratory制作のAntibodies:A Laboratory Manual、Molecular Cloningという刊行物を参考にする等、慣用的な条件によるものであり;又は、材料若しくは製品の製造業者によって推奨されている条件によるものである。特定の供給源が示されていない試薬は、市場から購入した慣用的な試薬である。
IL-5抗原の調製、及びその検出に使用されたタンパク質
1.1 IL-5抗原の設計及び発現
Hisタグ付きのヒトIL-5と、Hisタグ付きのアカゲザルIL-5と、Hisタグ付きのマウスIL-5と、Hisタグ付きのラットIL-5と、ヒトIgG1-Fcフラグメントを含むヒトIL-5Rα受容体細胞外領域融合タンパク質とをコードする配列を、cphrベクターにクローニングし、発現プラスミドを構築し、次いで、HEK293にトランスフェクションした。トランスフェクションから6日目に、サンプルを収集し、4500rpmでの10分間の遠心分離によって細胞上清を収集した。組換えIL-5及びIL-5α受容体タンパク質を含む上清を、ニッケルカラムの使用によって精製し、組換えヒトIL-5-Fc融合タンパク質を、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーカラムの使用によって精製した。精製されたタンパク質は、後続の実験に使用することができる。特異的なタンパク質抗原の配列は、以下のとおりである。
組換えIL-5α受容体及びIL-5α/β受容体細胞株の構築及び同定
機能的抗体をスクリーニングするために、本開示は、IL-5αを発現させるCHO-S/IL-5α細胞株、及び、IL-5αとIL-5βとの両方を発現させるCHO-S/IL-5α/IL-5β細胞株を構築した。
抗ヒトIL-5マウスモノクローナル抗体の調製
2種の用量の組換えタンパク質rhIL-5-his、フロイントアジュバントCFA(Sigma、ロット番号SLBQ1109V)及びIFA(Sigma、ロット番号SLBJ2845V)(100g/50g/50g(高用量)及び25g/12.5g/12.5g(低用量))を使用して、それぞれ2つのBalb/cマウス群(5マウス/群)及び4つのSJLマウス群(5マウス/群)を免疫化した。ELISA、リガンド-受容体遮断アッセイ及びTF-1増殖阻害アッセイによって血清力価を検出することにより、IL-5に対する特異的免疫反応を測定した。良好な特異的免疫反応が良好だったマウスを選択して屠殺し;脾臓細胞を収集し、骨髄腫細胞と融合させた。
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGVMVTVSS
配列番号:6
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLQDKEFPRTFGGGTRLELK
配列番号:7
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATETLRESLDYWGQGVMVTVSS
配列番号:8
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSASNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQHKQFPRTFGGGTKLELK
配列番号:9
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVKQSQGRSLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKFSSTAYMEFRRLTFEDSAIYYCARDGGYSDPLDYWGQGVMVTVSS
配列番号:10
DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQQPKLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK
配列番号:11
EVQLQQSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKHGPKFQGKATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIYYCFRYGIYPDHWGQGTPLTVSS
配列番号:12
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTATLASGVPARFSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE
配列番号:13
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATLTADKSSSTAYLEFSRVTSEDSAIYYCGRRIAWDHWYFDFWGPGTMVTVSS
配列番号:14
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDVAWYQQKSGRSPQLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTRYFFKISGMQPEDEADYFCQQGYKTPLTFGSGTKLEIK
配列番号:15
4.1 IL-5-Flag-His組換えタンパク質の精製ステップ:
サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去し、適切な体積になるまで濃縮した。NI-NTAアフィニティカラム(QIAGEN、カタログ番号30721)をPBSによって平衡させ、カラム容積の2~5倍で洗浄した。不純物の除去後、細胞発現上清サンプルをカラムにロードした。A280測定値が低下してベースラインに至るまで、PBSによってカラムを洗浄した。PBSによってカラムを洗浄して、汚染タンパク質を除去し、サンプルを収集した。標的タンパク質を、洗浄バッファー(20mMイミダゾール)及び溶出バッファー(300mMイミダゾール)によって順次溶出させ、溶出ピークを収集した。
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去した。ハイブリドーマ発現上清をプロテインGカラムによって精製し、Fc融合タンパク質発現上清をプロテインAカラムによって精製した。A280測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをPBSによって洗浄した。pH3.0の100mM酢酸によって標的タンパク質を溶出させ、pH8.0の1M Tris-HClによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、PBSによって平衡させたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)によってサンプルをさらに精製し、凝集物を含まないピークを収集した後、アリコート化して使用に供した。
当技術分野における数多くの参考文献において開示されているようにして、マウス抗ヒトIL-5モノクローナル抗体のヒト化を実施した。簡単に言うと、マウス抗体の定常領域をヒト定常領域によって置きかえ、マウス抗体のCDRを、最も高い相同性を有するFRヒトテンプレートにグラフト化し、FR領域中のアミノ酸に復帰変異を発生させた。
得られたマウス抗体VH/VL CDRの典型的な構造に基づいて、軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)相同配列をヒト生殖細胞系列データベースから検索し、FR相同性に応じて(降順に)ランク付けし;FR相同性が最も高い生殖細胞系列を、主要なテンプレートとして選択した。マウス抗体のCDR領域をヒトテンプレートにグラフト化した後、FR残基を変異させ、アミノ酸残基を最適化すると、最終的なヒト化分子が得られた。
h1705に関しては、IGHV3-23*04をVH用のテンプレートとして選択し、IGKV1-12*01をVL用のテンプレートを選択した。mAb1705のCDRをヒトテンプレートにグラフト化し;組み込まれた残基と、CDR領域(ソフトウェアによって発見された)と直接相互作用した残基とを復帰変異させた。表3に示されているように、様々なヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
>h1705_VL.1(配列番号:46)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号:52
注記:アンダーライン部分は、M252Y、S254T、T256E変異を表す。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:53
h1706に関しては、IGHV3-23*04をVH用のテンプレートとして選択し、IGKV1-12*01をVL用のテンプレートを選択した。マウス抗体mAb1706のCDRを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し;FRアミノ酸を復帰変異させた。表5に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
>h1706_VL.1(配列番号:54)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETLRESLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS。
h1780に関しては、IGHV1-2*02をVH用のテンプレートとして選択し、IGKV3-11*01をVL用のテンプレートを選択した。マウス抗体mAb1780のCDRを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し;FRアミノ酸を復帰変異させた。表7に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
>h1780_VL.1(配列番号:60)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVKQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS。
h1773に関しては、IGHV3-73*01をVH用のテンプレートとして選択し、IGKV1-39*01をVL用のテンプレートを選択した。マウス抗体mAb1773のCDRを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し;アミノ酸を復帰変異させた。表9に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。さらに、h1773 HCDR2(RIDPANGDTK HGPKFQG)中のNをVに変異させて(すなわち、N55V)、重鎖可変領域HCDR2バリアントを形成した(変異したHCDR2の配列は、配列番号:82:RIDPAVGDTKHGPKFQGに示されたとおりである。)。
>h1773_VL.1(配列番号:67)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKAPKLLIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
h1779に関しては、IGHV1-2*02をVH用のテンプレートとして選択し、IGKV1-33*01をVL用のテンプレートを選択した。マウス抗体h1779のCDRを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し;アミノ酸を復帰変異させた。表11に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
>h1779_VL.1(配列番号:72)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
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EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
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EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
h1705-008重鎖:
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配列番号:83
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配列番号:84
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配列番号:85
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:86
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配列番号:87
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配列番号:88
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配列番号:89
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配列番号:90
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配列番号:91
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配列番号:92;
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配列番号:80
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:81。
1.組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマのスクリーニングによって陽性抗体分子を得た後、可変領域をコードする遺伝子配列をシーケンシングによって得た。得られた配列をベースにして、フォワードプライマー及びリバースプライマーを設計し、シーケンシングされた遺伝子をテンプレートとして使用して、PCRによって各抗体VH/VK遺伝子フラグメントを構築した後、相同組換によって(シグナルペプチド及びhIgG1/hκ定常領域遺伝子(CH1-Fc/CL)フラグメントを有する)発現ベクターpHrに挿入して、組換えキメラ抗体完全長発現プラスミドVH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHrを構築して、5種のキメラ抗体Ch1705、Ch1706、Ch1780、Ch1773及びCh1779を得た。
ヒト化抗体配列にコドン最適化を施した後には、ヒトコドン選好性を有するコーディング遺伝子配列が得られ;プライマーを設計して、PCRによって各抗体VH/VK遺伝子フラグメントを構築し、次いでこれを、相同組換えによって(シグナルペプチド及びhIgG1/hκ定常領域遺伝子(CH1-Fc/CL)フラグメントを有する)発現ベクターpHrにして、ヒト化抗体完全長発現プラスミドVH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHrを構築した。
抗体軽鎖又は重鎖を発現したプラスミドを、HEK293E細胞に別々にトランスフェクションした。6日後、発現上清を収集し、高速で遠心分離して、不純物を除去し、プロテインAカラムによって精製した。A280測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをPBSによって洗浄した。pH3.0~pH3.5の酸性溶出バッファーによって標的タンパク質を溶出させ、pH8.0~9.0の1M Tris-HClによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBSによってあらかじめ平衡させたゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)によってさらに精製して、凝集物を除去し、モノマーピークを収集し、アリコート化して使用した。
試験例1.Biacoreアッセイによる異なる種のIL-5へのマウスIL-5抗体の結合
試験すべきマウスIL-5抗体とヒトIL-5とのアフィニティを、Biacore T200(GE)機器によって測定した。
試験すべきヒト化IL-5抗体とヒトIL-5とのアフィニティを、Biacore T200(GE)機器によって測定した。
組換え発現したIL-5α受容体タンパク質の細胞外領域へのIL-5の結合を遮断するIL-5抗体の能力を確認するために、IL-5(PBS中の5μg/ml)をELISAプレートに塗り、37℃で1時間インキュベートし;液体を取り除き、PBSによって希釈した200μl/wellの5%脱脂乳ブロッキング溶液を加え、ブロッキングのためにお37℃のインキュベーター内で2.5時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをPBSTバッファー(0.05%Tween-20を含むpH7.4のPBS)によって5回洗浄し;ビオチン標識キット(Tojin Chemical、LK03)によって標識された10μg/mlのIL-5Rα(1%BSA中)25μlを加えた後、勾配希釈された25μlの抗体を加え(抗体は、IL-5との結合に関してはIL-5Rαと競合した。)、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイタープレート中の反応溶液を取り除き、プレートをPBSTによって5回洗浄し、サンプル希釈溶液によって1:600に希釈された50μl/wellのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼポリマー(Sigma、S2438-250UG)を加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTによって5回洗浄し、50μl/wellのTMB発色基質(KPL、52-00-03)を加え、室温で3~10分間インキュベートし;50μl/wellの1M H2SO4を加えて、反応を停止させ;NOVOStarマイプロプレートリーダーを使用して、450nmにおける吸光度の値を読み取り;IL-5RαへのIL-5の結合を遮断するIL-5抗体のIC50値を計算した。その結果は、表15に示されている。本開示の抗体は、IL-5受容体へのIL-5の結合を効果的に阻害することができる。
細胞表面上のIL-5受容体を遮断することができるスクリーニングされたIL-5抗体を確認するために、IL-5Rα/βという2種の受容体を高発現させるCHOS組換え細胞株を構築した。この実験により、IL-5抗体はそれぞれ、それぞれCHOS細胞株の表面上の組換えIL-5α/β受容体へのIL-5の結合を遮断できることが実証された。
IL-5は、TF-1細胞の増殖を誘導することが可能であり、IL-5抗体は、IL-5が、TF-1細胞の増殖を刺激しないようにすることができる。
具体的には、TF-1細胞(TCC、CRL-2003)を、10%FBS及び2ng/mLのrhGM-CSF(LINKBio、カタログ番号96-AF-300-03-20)を含むRPMI1640中で培養し、37℃、5%CO2インキュベーターに入れたが、細胞密度は、1×106細胞/mlを超えない。抗体を検出するために、対数増殖期の細胞をPBSによって3回洗浄し、800rpmで5分間遠心分離し;RPMI1640(FBS:2%、組換えヒトIL-5:10ng/ml)を用いて、細胞密度を6000細胞/well/90μlに調整し;勾配希釈された試験すべき抗体10μlを、培養するために96ウェルプレートに加え、培養から3日後、30μlの細胞タイター溶液を加え、検出のために混合し、IC50を測定値によって計算した。試験結果は、以下の表17に示されている。
IL5は、好酸球の分化、成熟、遊走及び活性化を誘導し、呼吸器の炎症を起こし、ぜんそくを発症させる可能性がある。この実験は、IL-5サイトカインが好酸球の接着及び活性化を促進できる原理に基づいている。ヒト末梢血から好酸球を収集し、精製して、IL-5経路に対するIL-5特異的抗体の遮断効果を試験し、インビトロでIL5によって媒介される好酸球の接着に対するIL-5抗体の遮断効果を検出した。
IL-5は、Th2サイトカインのうちの1つだった。IL-5抗体がIL-5のみを特異的にターゲッティングし、他のサイトカインとの間で交差反応しないことを確認するために、Fortebioして、IL-5との間でα受容体を共有する、IL2(R&D、202-IL-010/CF)、IL4(R&D、204-IL-050/CF)、IL-5(R&D、205-IL-025/CF)、IFNgamma、IL6(R&D、7270-IL-025/CF)、IL9(R&D、209-IL-010/CF)、IL10(R&D、217-IL-025/CF)、IL13(R&D、213-ILB-025/CF)、IL25(R&D、8134-IL-025/CF)、IL31(R&D、2824-IL-010/CF)及びIL3(203-IL-050/CF)並びにGMCSF(R&D、215-GM-010/CF)を含む12種類のTh2及び関連サイトカインを検出した。
試験例8.OVA誘導性マウスぜんそくモデルにおけるIL-5抗体の有効性の評価
この試験は、気道炎症反応及び気道リモデリングに基づいて、オバルブミン(OVA)エアロゾルによって誘導されたBALB/cマウスぜんそくモデルにおけるIL-5抗体の有効性を評価する。
この実験においては、雄モルモットを選択して、ヒトIL-5によって誘導された急性ぜんそくモデルを確立し、これにより、ヒトIL-5によって誘導されたモルモット肺の気管支洗浄液(BALF)中における好酸球の増加に対する、本開示の5種のIL-5ヒト化mAbの阻害効果を評価したが;hu39D10を陽性抗体として使用した。モルモットは、それぞれが8~10匹の動物を含む9つの群に分けられた:正常コントロール群、モデル群、hu39D10(1mg/kg)群、h1705-008(1mg/kg)群、h1706-009(1mg/kg)群、h1780-017(1mg/kg)群、h1773-007(1mg/kg)群及びh1779-014(1mg/kg)群。モデル群及び投与群のモルモットのそれぞれには、1日目に刺激のために100μlのヒトIL5(5μgのIL5抗原を含む)を気管経由で注入し;正常コントロール群には、PBSを気管経由で注入した。投与群には、刺激の2時間前に5ml/kgの投与量になるように、1mg/kgの上記IL5モノクローナル抗体を腹腔内注射し;モデル群には、対応するIgG抗体を投与し;正常コントロール群には、PBS溶媒を腹腔内投与した。モルモットには、気管への注入から24時間後に麻酔をかけ、肺気管支洗浄液を抜き出した。細胞濃度を5^106/mlに調整し、15μlをスライドに滴下し、乾燥させて固定し;HE染色を実施し、全細胞の数及び好酸球の数を400倍の顕微鏡下でカウントし、好酸球の百分率を計算した。その結果は、図5A及び図5Bに示されおり、本開示の5種のヒト化抗体が、BALF中における好酸球のレベルを有意に低下させることが示されている。
抗体の医薬組成物(製剤)のための例示的な調製プロセス:
ステップ1:
ある特定の量の精製済みの抗IL-5抗体溶液をとり、抗体不含バッファー(pH5.5の30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー等)を使用して、(好ましくは限外ろ過によって)溶媒交換を置きかえ;少なくとも6倍の体積を限外ろ過膜によって交換し、タンパク質を約120mg/mLに濃縮した。スクロースの最終濃度が72mg/mLになるように、ある特定の体積のスクロースストック溶液を加え、混合した。ポリソルベート80の最終濃度が0.4mg/mLになるように、ある特定の体積のポリソルベート80ストック溶液を加え、混合した。ある特定の体積になるまで、pH5.5の10mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファーを加えることにより、タンパク質濃度を100mg/mLにした(試験すべき他の製剤又は安定な製剤も、同様のステップに従って調製した。)。
体積を1.2mlに調整し、栓を装着した2mlバイアルにろ液を充填し、チャレンジの開始時、中頃及び終了時に集中管理方式のサンプリングを実施して、チャレンジ体積の差を検出した。
フタ付け機を始動させて、アルミニウム製のフタを装着し、フタ付けを実施した。
目視検査を実施して、不正確な充填等の欠陥が生産物にないことを確認した。バイアルラベルを印刷して貼り付け;カートンラベルを印刷し;カートンを折りたたんで梱包し;箱のラベルを貼り付けた。
タンパク質濃度が100mg/mLのh1705-008製剤を、pH5.0~6.5の一連のバッファー中に調製したが、振とう用サンプルは、0.2mg/mlのポリソルベート80(PS80)を含み、他のサンプルは、0.05mg/mLのPS80を含んでいた。バッファー系は、次のとおりだった:pH5.0、5.5の10mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー(AA);pH5.0、5.5、6.0の10mMコハク酸-コハク酸ナトリウムバッファー(SA);pH5.5、6.0、6.5の10mMクエン酸-クエン酸ナトリウムバッファー(CA);pH5.5、6.0、6.5の10mMヒスチジン-塩酸塩バッファー(His);pH6.0、6.5の10mM リン酸バッファー(PB)。各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけた。サンプルを強制分解実験に供し;外観、SEC、iCIEFは、評価指標として採用した。
タンパク質濃度が100mg/mLのh1705-008製剤を、下記の様々な種類の賦形剤を含む10mM SA(pH5.0)バッファー中に調製した。特に、賦形剤は、以下のとおりだった:
1) 0.1mg/mLのポリソルベート20(PS20)
2) 0.1mg/mLのポリソルベート80(PS80)
3) 50mg/mLのスクロース+0.1mg/mLのPS80
4) 50mg/mLのトレハロース+0.1mg/mLのPS80
5) 50mg/mLのマンニトール+0.1mg/mLのPS80
6) 50mg/mLのソルビトール+0.1mg/mLのPS80
7) 8mg/mlのアルギニン(Arg)+0.1mg/mLのPS80
8) 8mg/mlのリシン(Lys)+0.1mg/mLのPS80
9) 8mg/mlのグリシン(Gly)+0.1mg/mLのPS80
10) 8mg/mlのメチオニン(Met)+0.1mg/mLのPS80
11) 8mg/mlのプロリン(Pro)+0.1mg/mLのPS80
12) 8mg/mlの塩化ナトリウム(NaCl)+0.1mg/mLのPS80。
各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけて使用に供した。サンプルは、40℃における強制分解実験に供したが、その結果により、次のことが示されている(表20)。各サンプル群間には、SEC、CE及びiCIEFの試験結果に有意差がなく、Arg/Lys/NaCl群は外観が劣っているが、他の群間には有意差がない。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、プロリン及びメチオニンは、タンパク質の安定性に好ましい影響を与える。
pH5.5の10mM SA、70mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのPS20又はPS80を含むh1705-008製剤を、タンパク質濃度が100mg/mlになるように調製した。
DOE(実験計画法)は、10mM酢酸バッファー(AA)のpH、タンパク質濃度及びTween濃度を変数として用いて実施され;一連の製剤は、次の因子及びレベルに基づいて設計した:pHは、5.0~5.8であり、PS80の濃度は、0.2~0.6mg/mLであり、抗体h1705-008の濃度は、80~120mg/mLである。製剤は、表22に示されている。サンプルを40℃の高温で強制分解した。外観、SEC、非還元型CE及びiCIEFを、評価指標として使用した。その結果は、表23に示されている。
pH5.5の10mM AA、70mg/mlのスクロース及び0.4mg/mlのPS80を含むh1705-008製剤を、タンパク質濃度が100mg/mlになるように調製し;サンプルは、4℃及び25℃で安定性の調査に供した。その結果は、表24に示されている。
100mg/mLのタンパク質濃度を有し、70mg/mLのスクロース及び0.4mg/mLのPS80を含むh1705-008製剤を、イオン強度が異なる(ナトリウム)酢酸バッファー中に調製し;交換のために使用されたバッファーのpH及び最終的な製剤のpHを測定した。その結果は、表25に示されている。この結果により、イオン強度が高いほど、pHのずれが減少することが示されている。イオン強度が30mMである場合、pHのずれは、0.1未満である。
100mg/mLのタンパク質濃度を有し、pH5.5の30mM AAと、0.4mg/mlのPS80とを含むh1705-008製剤を、濃度が異なるスクロースを含む後述のバッファー中に調製した。浸透圧を測定した。その結果は、表26に示されている。
100mg/mLのタンパク質濃度を有し、pH5.5の30mM AAと、72mg/mlのスクロースと、0.4mg/mlのPS80とを含むh1705-008製剤を調製して、4℃及び25℃における安定性を調査した。その結果は、表27に示されている。その結果により、高温条件下においては、h1705-008製剤のSEC、CE及びIECがわずかに低下しているが、この低下は許容範囲内であり;4℃条件ではすべての指標に有意な変化がないことが示されており、このことは、製剤が好ましい安定性を有することを示している。
さらに、本開示は、抗IL-5抗体医薬製剤のためのさらなる配合も提供し、限定されるわけではないが、以下のものを含む:
(1) 1mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の10mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(2) 100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の20mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(3) 120mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の40mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(4) 100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、80mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80及びpH5.0の30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(5) 80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、75mg/mlのスクロース、0.6mg/mlのポリソルベート80及びpH5.4の20mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(6) 100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、80mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(7) 90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、74mg/mlのスクロース、0.5mg/mlのポリソルベート80及びpH5.6の25mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(8) 90mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、76mg/mlのスクロース、0.3mg/mlのポリソルベート80及びpH5.4の35mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(9) 80mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.6の30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(10) 100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の40mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー;
(11) 100mg/mlの抗IL-5抗体(h1705-008)、80mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及びpH5.5の40mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー。
72mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80及び100mg/mlの濃度の抗IL-5抗体を含むh1705-008抗体製剤を、pH5.5の30mM酢酸-酢酸ナトリウムバッファー中に調製した。抗体を2.15mL/バイアルで6mLバイアルに充填し、凍結乾燥のために凍結乾燥チャンバに入れた。凍結乾燥プロセスは、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。凍結乾燥プロセスが終わったら、バイアルを真空を適用し、栓を装着した。復元したサンプルは、凍結乾燥前の対応物と比較した。その結果により、復元溶液は、液体製剤の性能と同様の好ましい性能を維持できることが示されている。
Claims (27)
- 抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、緩衝液および界面活性剤を含み、緩衝液が、酢酸-酢酸ナトリウム、コハク酸-コハク酸ナトリウム、ヒスチジン-塩酸塩およびクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液、好ましくは酢酸-酢酸ナトリウムまたはコハク酸-コハク酸ナトリウム緩衝液からなる群から選択されるいずれか1つであり、抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域およびi)~vi)からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、医薬組成物。
i)アミノ酸配列SEQ ID NO:16、17、18に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、および、
アミノ酸配列SEQ ID NO:19、20および21に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
ii)アミノ酸配列SEQ ID NO:22、23、24に示されるように、HCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、および、
アミノ酸配列SEQ ID NO:25、26および27に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
iii)アミノ酸配列SEQ ID NO:28、29、30に示されるように、HCDR1、HCDR2、HDR3からなる重鎖可変領域、および、
アミノ酸配列SEQ ID NO:31、32および33に示されるように、LCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
iv)アミノ酸配列SEQ ID NO:34、35、36に示されるように、HCDR1、HCDR2、HCDR3からなる重鎖可変領域、および
アミノ酸配列SEQ ID NO:37、38、39に示されるように、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。
v)SEQ ID NO:40、41、42に示されるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3からなる重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:43、44、および45に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域、ならびに
vi)それぞれのアミノ酸配列SEQ ID NO:34、82および36に示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3からなる重鎖可変領域、ならびに、
それぞれのアミノ酸配列SEQ ID NO:37、38および39に示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3からなる軽鎖可変領域。 - 緩衝液のpHが約5.0~約6.5、好ましくは約5.0~約5.8、最も好ましくは約5.5である請求項1の医薬組成物。
- 前記緩衝液の濃度が約10mMから約40mMであり、好ましくは約20mMから約30mMである請求項1又は2の医薬組成物。
- 前記抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度が、約1mg/ml~約120mg/ml、好ましくは約80mg/ml~約120mg/ml、最も好ましくは約100mg/mlである、請求項1~3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 表面剤がポリソルベート80である請求項1~4のいずれかに記載された医薬組成物。
- ポリソルベート80の濃度は、約0.1mg/mlから約0.6mm、好ましくは約0.2mg/mlから約0.6mg/ml、より好ましくは約0.4mm/mlである請求項5の医薬品組成物。
- 安定剤をさらに含み、安定剤が糖類またはアミノ酸であり、糖類がスクロース、トレハロース、マンニトールおよびソルビトール、好ましくはスクロースからなる群から選択され、アミノ酸がグリシン、メチオニンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記糖類の濃度が、約50mg/ml~約80mg/ml、好ましくは約70mg/ml~約75mg/ml、最も好ましくは約72mg/mlである、請求項7に記載の医薬組成物。
- アミノ酸の濃度が約8mg/mlであることを特徴とする請求項7に記載の医薬組成物。
- 請求項1~9のいずれか1つに記載の医薬組成物であり、以下の組成からなる。
約1mm/ml~約120mg/ml、抗IL-5、又はその抗原結合断片であり、
約10mMから約40mMの酢酸ナトリウム・酢酸緩衝液であり、pHは約5.0から約6.5であり、
ポリソルベート80は約0.1mg/mlから約0.6mm/mlである。 - 請求項1~9のいずれかによる医薬組成物であり、
約80mg/ml~約120mg/mlの抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメント、
約10mM~約30mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液であり、pHは約5.0~約5.8、
約0.2mg/ml~約0.6mg/mlのポリソルベート80、および
約70mg/ml~約80mg/mlのスクロース、
望ましくは、製薬組成物は構成され、
約100mm/ml 抗IL-5 OOC又は抗原結合断片、
約30mM 酢酸ナトリウム緩衝剤であり、pHは約5.5、
約0.4mm/mlのポリソルベート80、
約72mm/mlのシュクロス。 - 抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントが、ネズミ抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1~11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- ヒューマン化された抗IL-5抗菌液が、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるような重鎖可変領域を含む請求項12の医薬組成物であり、その変形例は、SEQ ID NO:49、57、63、69または75に示されるような重鎖可変領域における1~10のアミノ酸バック・突然性を含む。
- 当該変形例が、以下のいずれかに示される変形例であることを特徴とする請求項13に記載された医薬品組成物。
i)SEQ ID NO:49に示されるように重鎖可変領域のS49T、V93TおよびK98Sからなる群から選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
ii)SEQ ID NO:57に示される重鎖可変領域のS49T、V93T、およびK98Tからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変種。
iii)SEQ ID NO:63に示されるように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74KおよびL83Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種。
iv) SEQ ID NO:69および/またはHCDR2における重鎖可変領域のF29I、R38K、V48I、R72AおよびT97Fからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸の背中突然変異、または
v)SEQ ID NO: 75に示されているように重鎖可変領域のR38K、M48I、R67K、V68A、R72A、T74K、M81L、L83FおよびD89Eからなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸の背中突然変異からなる変種。 - ヒューマン化された抗IL-5抗菌を含む請求項14に記載された医薬組成物であり、
配列番号 NO:50又は51に示すような重鎖可変領域、又は
配列番号 NO:58又は59に示すような重鎖可変領域、又は
配列番号 NO:64、65及び66からなる群から選択したいずれかの群から選択したような重鎖可変領域、又は
配列番号 NO:70又は71に示すような重鎖可変領域、又は
配列番号 NO76、77、78及び79からなる群から選択したいずれかの群から選択した重鎖可変領域。 - ヒューマナイズされた抗IL-5抗菌剤が、SEQ ID NO:46、54、60、67または72に示されるように軽鎖可変領域を含んでいること、またはそれらの変形例は、SEQ ID NO:46、54、60、67または72に示されるように、軽鎖可変領域の1~10のアミノ酸バック・突然性を含んでいることを特徴とする請求項12による医薬品組成。
- 当該変形例が、以下のいずれかに示される変形例である請求項16に記載された医薬組成物。
i)SEQ ID NO:46に示される軽鎖可変領域のA43S、L47V、G66R、T69S、F71YおよびY87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
ii)SEQ ID NO: 54に示される軽鎖可変領域のA43S、L47M、F71Y、Y87Fからなるグループから選抜された1つ以上のアミノ酸バック・突然変異からなる変種。
iii)SEQ ID NO: 60に示されている軽鎖可変領域でE1D、I2T、I57V、V84TおよびY86Fからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸バック・シグネーションからなる変種。
iv)SEQ ID NO:67に示されているような軽鎖可変領域で、M4L、A42S、L45PおよびL46Wからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸の背中突然変性からなる派生型、または
v)SEQ ID NO:72に示されているような軽鎖可変領域で、A43S、I48VおよびF71Yからなるグループから選ばれた1つ以上のアミノ酸の背中突然変性からなる派生型。 - ヒューマン化された抗IL-5抗菌が構成する請求項17による医薬品組成であり、
SEQ ID NO:47または48に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:55または56に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:61または62に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:68に示された軽鎖可変領域、または
SEQ ID NO:73または74に示された軽鎖可変領域。 - ヒューマン化された抗IL-5抗菌が構成する請求項12による医薬品組成。
i)SEQ ID NO:49、50、51のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:49、50、51のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを有するような重鎖可変領域、および
SEQ ID NO:46、47、48のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:46、47、48のいずれかとの95%シークエンスアイデンティティを持つような軽鎖可変領域。
ii)SEQ ID NO:57、58、59のいずれかに示されるような重鎖可変領域、またはSEQ ID NO:57、58、59のどれか1つとの95%のシークエンスアイデンティティを有すること、および
SEQ ID NO:54、55および56のいずれかに示されるような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:54、55および56のどれか1つとの95%シークエンスアイデンティティを有すること。
iii)配列番号63、64、65および66のいずれか1つに示されるか、または配列番号63、64、65および66のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、および
配列番号60、61および62のいずれか1つに示されるか、または配列番号60、61および62のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
iv)配列番号:69、70および71のいずれか1つに示されるか、または配列番号:69、70および71のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、または
配列番号: 67および68のいずれか1つに示されるか、または配列番号:67および68のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
v)配列番号:75、76、77、78および79のいずれか1つに示されるか、または配列番号:75、76、77、78および79のいずれか1つと95%の配列同一性を有する重鎖可変領域、および配列番号:72、73および74のいずれか1つに示されるか、または配列番号: 72、73および74のいずれか1つと95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域であり、
好ましくは、人間化された抗IL-5抗菌は、以下を含む。
a)SEQ ID NO:51に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:47に示すような軽鎖可変領域。
b)SEQ ID NO:65に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:62に示すような軽鎖可変領域。
c)SEQ ID NO:58に示すような重鎖可変領域とSEQ ID NO:56に示すような軽鎖可変領域。
d)SEQ ID NO:71に示すような重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:68に示すような軽鎖可変領域、またはSEQ ID NO:79に示すような重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:73に示すような軽鎖可変領域。 - 抗IL-5抗菌作用が、人間の抗菌作用の一定領域を含む請求項1~19のいずれかに記載される医薬品組成物であり、好ましくは以下のものを含む。
SEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:53に示されているように、ヒトAd重鎖不変領域およびヒトAd軽鎖定常領域。 - 抗IL-5抗菌を含む請求項20に記載の医薬組成物であり、
i)SEQ ID NO:83に示すような重鎖とSEQ ID NO:84に示すようなL鎖。
ii)SEQ ID NO:85に示すような重い鎖とSEQ ID NO:86に示すようなL鎖。
iii)SEQ ID NO:87に示すような重い鎖とSEQ ID NO:88に示すようなL鎖。
iv)SEQ ID NO:89に示すような重鎖とSEQ ID NO:90に示すような軽鎖、またはSEQ ID NO:91に示すような重鎖とSEQ ID NO:92に示すような軽鎖。 - 抗IL-5抗体が、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗IL-5抗体またはその抗原結合フラグメントとヒトIL-5との結合を競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1~21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1~22のいずれかによれば、緩衝剤が好ましくは酢酸ナトリウム・酢酸ナトリウム緩衝剤である緩衝剤である、抗IL-5のストックソリューションまたはその抗原結合フラグメントを緩衝剤に置き換えるステップを含む、医薬品組成を準備するための方法。
- 請求項1~22のいずれかによれば、当該医薬品組成物の親和性により得られる、抗IL-5抗原、又はその抗原結合フラグメントからなる親和性製剤は、好ましくは、親和性化は、凍前乾燥、一次乾燥及び二次乾燥の段階を順次含む。
- 請求項24によれば、再構成された液体が、親和性配合の再構成によって得られる、抗IL-5抗原結合フラグメントまたはその抗原結合フラグメントからなる再構成された液体。
- 請求項1~22のいずれかの請求項による医薬品組成物、又は請求項24によるフィロフィライズ製剤、又は請求項25による再構成されたソリューションを含む容器からなるアーティクル。
- 請求項1~22のいずれかの請求項による医薬品組成の治療効果を有する治療法、または請求項25または請求項26に基づく再構成された解決法からなるIL-5仲介病を、好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性ブロンチパルモナリアアスペルギリア、エゾシノフィリア、チョルグ-ストロス病、アトピック皮膚炎、断続的アンギオデマ、エゾシノフィリック胃腸炎、ワーム感染、ホジキンポリプス、ロフラーポリプス、ウルチカリア、ハイパーオシノフィリックブロンチス、ノイズノフィリック食道炎からなる群から選ばれる、アレルギー性食道炎、アレルギー性結核症、内臓症、ステロイド依存性エオシン・ブロンチティス。
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