KR20210145187A - Il-5에 대한 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Il-5에 대한 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원에서 IL-5에 대한 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도가 개시된다. 특히, 본 출원에서 IL-5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 완충제 용액에 함유하는 약학적 조성물이 개시된다. 게다가, 약학적 조성물은 당류(saccharide) 및 비이온성 계면활성제를 추가로 함유한다.

Description

IL-5에 대한 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도
본 개시내용은 약학적 제제 분야에 속하며, 특히 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 IL-5 관련 질환(들)에 대한 진단제 및 치료약물로서의 이의 용도에 관한 것이다.
본원에서의 서술은 단지 본 개시내용과 관련된 배경 정보만 제공하며, 반드시 선행 기술을 구성하지는 않는다.
인터루킨-5(IL-5: Interleukin-5)는 T 세포 대체 인자(TRF: T cell replacing factor), B 세포 성장 인자-II(BCGF-II: B cell growth factor-II), IgA-증강 인자(IgA-EF: IgA-enhancing factor), 또는 호산구 분화 인자(EDF: eosinophil differentiation factor)로도 알려져 있는 인터루킨 패밀리의 중요한 구성원 중 하나이며, 헬퍼 T 세포 2(Th2)에 의해 주로 분비되는 동종-이량체성 당단백질(homo-dimeric glycoprotein)이다. 인간 IL-5는 22개 아미노산으로 이루어진 신호 펩타이드 및 2개의 글리코실화 부위를 포함하여 134개 아미노산 잔기로 이루어진다. 활성 IL-5는 올리고-이량체(oligo-dimer)의 형태로, 2개의 펩타이드 사슬은 이황화 결합(들)에 의해 연결되어 역평행 배치(configuration)로 존재하는 반면; IL-5 단량체는 생물학적 활성을 갖지 않는다(문헌[Adv Immunol. 1994; 57: 145-90]).
호산구(EOS: eosinophil)는 알레르기 반응과 관련된 알레르기 질환을 포함하여 폐의 여러 가지 염증성 질환과 관련이 있다. 천식은 만성 호흡기 염증 질환이다. 세계적으로 약 3억명의 환자가 존재하며, 발생률은 10%이다. 천식의 병인(pathogenesis)은 여러 가지 사이토카인과 관련이 있다. IL-5 및 이의 수용체 IL-5R은 천식의 병인에서 중요한 역할을 한다. 현재, 천식을 치료하는 가장 효과적인 방식은 스테롤을 비내(nasal) 또는 경구 경로에 의해 투여하여, 천식에 관여하는 몇몇 주요 매개자(mediator)(IL-5 포함)의 발현을 저해함으로써 폐 염증을 감소시키는 것이다. 그러나, 스테로이드 약물의 장기간 적용은 많은 부작용을 가진다. 따라서, 천식의 치료를 위한 신규 약학적 표적을 찾는 것이 필요하다. 연구에 따르면 항-IL-5 항체의 투여가 IL-5와 이의 수용체의 결합을 저해하며; 폐에서 호산구의 축적을 유의하게 감소시키고 혈액, 조직 및 가래에서 호산구의 수준을 감소시키며; 호산구에 의해 매개되는 염증 반응을 감소시키고; 폐 기능을 향상시키며; 중증 호산구성 천식 및 재발성 천식에 뛰어난 효과를 가짐이 확인된다(문헌[Drugs. 2017 May; 77(7):777-784]).
항체 약물은 큰 분자량 및 복잡한 구조를 갖는다. 생산, 수송 및 저장 과정에서, 항체는 종종 변성, 응집, 오염 및 입자의 형성으로 인한 문제점을 맞닥뜨리게 된다. 항체를 효과적으로 유지시키기 위해, 항체의 생물학적 활성은 생산, 정제, 수송 및 저장 동안 유지되어야 한다. 현재, 고도로 정제된 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위해 생산 및 정제를 위한 새로운 기술이 개발되어 왔다. 그러나, 수송 및 저장을 위해 이러한 항체를 안정화시키고 투여에 적합한 투약 형태로 항체를 제공하는 방법은 항상 과제가 되어 왔다.
항-IL-5 항체는 GSK로부터의 메폴리주맙(Mepolizumab) 및 Teva Pharma로부터의 레슬리주맙(Reslizumab)만이 현재 시판중이다. 관련 특허는 WO2018119016, WO2017033121, WO2014141149, WO2016040007, WO2015095539, WO2012138958 및 WO9535375 등이 있다.
본 개시내용은 IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 완충제 및 계면활성제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트, 숙신산-소듐 숙시네이트, 히스티딘-하이드로클로라이드 및 시트르산-소듐 시트레이트 완충제, 바람직하게는 아세트산-소듐 아세테이트 또는 숙신산-소듐 숙시네이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나이며; 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서:
(i) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16, 17 및 18로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19, 20 및 21로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
(ii) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 25, 26 및 27로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
(iii) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28, 29 및 30으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 31, 32 및 33으로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
(iv) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34, 35 및 36으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 37, 38 및 39로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나;
(v) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 40, 41 및 42로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 43, 44 및 45로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
(vi) 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34, 82 및 36으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고,
경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 37, 38 및 39로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.8, 바람직하게는 약 5.2 내지 약 5.8이며; 완충제의 pH의 비제한적인 실시예는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.5, 가장 바람직하게는 약 5.5를 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 완충제의 농도는 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 25 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 15 mM이며; 완충제의 농도의 비제한적인 실시예는 약 10 mM, 약 12 mM, 약 14 mM, 약 16 mM, 약 18 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 24 mM, 약 26 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 32 mM, 약 34 mM, 가장 바람직하게는 약 30 mM을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 90 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 100 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 110 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 90 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이며; 비제한적인 실시예로서, 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 80 mg/ml, 약 85 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 91 mg/ml, 약 92 mg/ml, 약 93 mg/ml, 약 94 mg/ml, 약 95 mg/ml, 약 96 mg/ml, 약 97 mg/ml, 약 98 mg/ml, 약 99 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 101 mg/ml, 약 102 mg/ml, 약 103 mg/ml, 약 104 mg/ml, 약 105 mg/ml, 약 106 mg/ml, 약 107 mg/ml, 약 108 mg/ml, 약 109 mg/ml, 약 110 mg/ml, 약 115 mg/ml, 약 120 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 100 mg/ml이다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물에 포함된 계면활성제는 폴리소르베이트 20(polysorbate 20), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 폴리하이드록시알킬렌(polyhydroxyalkylene), 트리톤(Triton), 소듐 도데실 설포네이트(sodium dodecyl sulfonate), 소듐 라우릴 설포네이트(sodium lauryl sulfonate), 소듐 옥틸 글리코사이드(sodium octyl glycoside), 라우릴-설포베타인(lauryl-sulphobetaine), 미리스틸-설포베타인(myristyl-sulphobetaine), 리놀레일-설포베타인(linoleyl-sulphobetaine), 스테아릴-설포베타인(stearyl-sulphobetaine), 라우릴-사르코신(lauryl-sarcosine), 미리스틸-사르코신(myristyl-sarcosine), 리놀레일-사르코신(linoleyl-sarcosine), 스테아릴-사르코신(stearyl-sarcosine), 리놀레일-베타인(linoleyl-betaine), 미리스틸-베타인(myristyl-betaine), 세틸-베타인(cetyl-betaine), 라우라미도프로필-베타인(lauramidopropyl-betaine), 코카미도프로필-베타인(cocamidopropyl-betaine), 리놀레아미도프로필-베타인(linoleamidopropyl-betaine), 미리스타미도프로필-베타인(myristamidopropyl-betaine), 팔미타미도프로필-베타인(palmitamidopropyl-betaine), 이소스테아미도프로필-베타인(isosteamidopropyl-betaine), 미리스타미도프로필-디메틸아민(myristamidopropyl-dimethylamine), 팔마미도프로필-디메틸아민(palmamidopropyl-dimethylamine), 이소스테아라미도프로필-디메틸아민(isostearamidopropyl-dimethylamine), 소듐 메틸코코일(sodium methylcocoyl), 소듐 메틸-올레오일 타우레이트(sodium methyl-oleoyl taurate), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 폴리소르베이트 80의 농도는 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.4 mg/ml이며, 비제한적인 실시예로서, 약학적 조성물 내 계면활성제의 농도는 약 0.2 mg/ml, 약 0.3 mg/ml, 약 0.4 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.6 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.4 mg/ml이다.
추가적으로, 선택적 구현예에서, 약학적 조성물은 부형제(들)를 추가로 포함하며, 여기서 부형제는 안정화제로부터 선택된다.
선택적 구현예에서, 안정화제는 당류 또는 아미노산으로부터 선택되며; 당류는 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 소르비톨, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 아미노산은 글리신, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
선택적 구현예에서, 당류의 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 80 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 약 80 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 80 mg/ml, 바람직하게는 약 75 mg/ml 내지 약 80 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 75 mg/ml이며; 비제한적인 실시예로서, 약학적 조성물 내 안정화제의 농도는 약 70 mg/ml, 약 71 mg/ml, 약 72 mg/ml, 약 73 mg/ml, 약 74 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 76 mg/ml, 약 77 mg/ml, 약 78 mg/ml, 약 79 mg/ml, 약 80 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 72 mg/ml를 수반한다.
선택적 구현예에서, 아미노산의 농도는 약 8 mg/ml이다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물은
(a) 약 1 mg/ml 내지 약 120 mg/ml의 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 약 10 mM 내지 약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.0 내지 6.5인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제; 및 (c) 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물은
(a) 약 80 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 약 10 mM 내지 약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.0 내지 약 6.0인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제; 및 (c) 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물은
(d) 약 80 mg/ml 내지 약 120 mg/ml의 IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (e) 약 10 mM 내지 약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.0 내지 약 5.8인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제; (f) 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 및 (g) 약 70 mg/ml 내지 약 75 mg/ml의 수크로스를 포함하며; 바람직하게는, 약학적 조성물은 바람직하게는
(h) 약 100 mg/ml의 IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편, (i) 약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.5인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제, (j) 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80 및 (k) 약 72 mg/ml의 수크로스를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 약학적 조성물 내 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린(murine) 항체, 키메라(chimeric) 항체 또는 인간화(humanized) 항체이다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 인간화 항-IL-5 항체는 SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 또는 75로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 변이체는 SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 또는 75로 각각 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이(back-mutation)를 포함한다.
선택적 구현예에서, 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 변이체이다:
(i) SEQ ID NO: 49로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 S49T, V93T 및 K98S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 57로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 S49T, V93T 및 K98T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 63으로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 R38K, M48I, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K 및 L83F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
(iv) SEQ ID NO: 69로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 F29I, R38K, V48I, R72A, 및 T97F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이, 및/또는 CDR에 N55V 돌연변이를 포함하는 변이체; 또는
(v) SEQ ID NO: 75로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F 및 D89E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 인간화 항-IL-5 항체는
SEQ ID NO: 50 또는 51로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 58 또는 59로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 64, 65 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 70 또는 71로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 76, 77, 78 및 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역
을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 인간화 항-IL-5 항체는 SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 또는 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하며; 변이체는 SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 또는 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이를 포함한다.
선택적 구현예에서, 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 변이체이다:
(i) SEQ ID NO: 46으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y 및 Y87F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 54로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, L47M, F71Y 및 Y87F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 60으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 E1D, I2T, I57V, V84T 및 Y86F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이(들)를 포함하는 변이체;
(iv) SEQ ID NO: 67로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 M4L, A42S, L45P 및 L46W로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체; 및
(v) SEQ ID NO: 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, I48V 및 F71Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 인간화 항-IL-5 항체는
SEQ ID NO: 47 또는 48로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 55 또는 56으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 61 또는 62로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 68로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
SEQ ID NO: 73 또는 74로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 인간화 항-IL-5 항체는
(i) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 49, 50 및 51 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 46, 47 및 48 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 46, 47 및 48 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
(ii) SEQ ID NO: 57, 58 및 59 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 57, 58 및 59 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 54, 55 및 56 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 54, 55 및 56 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
(iii) SEQ ID NO: 63, 64, 65 및 66 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 63, 64, 65 및 66 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 60, 61 및 62 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 60, 61 및 62 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
(iv) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 69, 70 및 71 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 67 및 68 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 67 및 68 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
(v) SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 및 79 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 및 79 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 72, 73 및 74 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 72, 73 및 74 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하며; 바람직하게는, 인간화 항-IL-5 항체는
(a) SEQ ID NO: 51로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 47로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역;
(b) SEQ ID NO: 65로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 62로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
(c) SEQ ID NO: 58로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 56으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역;
(d) SEQ ID NO: 71로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 68로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
(e) SEQ ID NO: 79로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 73으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖고, 상기 기재된 바와 같이 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 돌연변이에 의해 수득되는 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-5 항체는 인간 항체 불변 영역, 바람직하게는 SEQ ID NO: 52로 표시된 바와 같은 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 53으로 표시된 바와 같은 인간 항체 경쇄 불변 영역을 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-5 항체는
(i) SEQ ID NO: 83으로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 84로 표시된 바와 같은 경쇄;
(ii) SEQ ID NO: 85로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 86으로 표시된 바와 같은 경쇄;
(iii) SEQ ID NO: 87로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 88로 표시된 바와 같은 경쇄;
(iv) SEQ ID NO: 89로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 90으로 표시된 바와 같은 경쇄; 또는
(v) SEQ ID NO: 91로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 92로 표시된 바와 같은 경쇄
를 포함한다.
선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-5 항체는 IL-5에 결합하기 위해 상기 기재된 바와 같은 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 약학적 조성물 내 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 항체(single-chain antibody, scFv), 이량체화된 V 영역(dimerized V region, 디아바디(diabody)) 및 이황화 결합 안정화된 V 영역(disulfide bond stabilized V region, dsFv)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 항-IL-5 항체의 스탁 용액(stock solution)을 완충제로 대체하는 단계를 포함한다. 선택적 구현예에서, 바람직하게는 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트 완충제이다. 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.5, 바람직하게는 약 5.2 내지 약 5.8이며, 완충제 pH 값의 비제한적인 실시예는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.5, 가장 바람직하게는 약 5.5를 수반한다. 선택적 구현예에서, 약학적 조성물 내 완충제의 농도는 약 10 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 25 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 15 mM이며; 완충제의 농도의 비제한적인 실시예는 약 10 mM, 약 12 mM, 약 14 mM, 약 16 mM, 약 18 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 24 mM, 약 26 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 가장 바람직하게는 약 30 mM을 수반한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, pH 5.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트, pH 5.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 6.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.0 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 6.0 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 6.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 5.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 6.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 6.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 5.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 6.0 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 6.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트, pH 5.5 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 히스티딘-염산, pH 6.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 히스티딘-염산, pH 6.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 히스티딘-염산, pH 5.5 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 히스티딘-염산, pH 6.0 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.0 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 20을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트, pH 5.0 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 50 mg/mL 수크로스 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 50 mg/mL 트레할로스 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 50 mg/mL 만니톨 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 50 mg/mL 소르비톨 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 8 mg/mL 글리신 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 8 mg/mL 메티오닌 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.0, 8 mg/mL 프롤린 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트 pH 5.5, 70 mg/mL 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.8 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.4 및 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.4 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.4 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.8 및 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 및 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.8 및 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.4 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.4 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 및 0.6 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.8 및 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.0 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.8 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 20mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.5, 73 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mg/ml 항-IL-5 항체 h1705-008, 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 pH 5.5, 75 mg/ml 수크로스 및 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학적 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 약학적 조성물은 25℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월 동안 안정할 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 항-IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 동결건조하는 단계를 포함한다.
선택적 구현예에서, 항-IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 제조 방법에서 동결건조는 예비-냉동 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 연속적으로 포함한다. 동결건조는 제제를 냉동시키고 후속적으로 1차 건조에 적합한 온도에서 물을 승화시킴으로써 수행된다. 이러한 조건 하에, 생성물의 온도는 제제의 공융점(eutectic point) 또는 분해 온도보다 더 낮다. 적합한 압력 하에, 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위에서, 1차 건조를 위한 저장 온도는 통상 약 -30℃ 내지 25℃이다(생성물은 1차 건조 동안 냉동된 채로 있다고 가정함). 제제, 시료 용기(예를 들어, 유리 바이얼)의 크기와 유형 및 액체의 부피는 건조에 필요한 시간 연속기간(time duration)을 결정하고, 시간 연속기간은 수시간 내지 수일(예를 들어, 40시간 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 2차 건조는 약 0℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있으며, 이는 주로 용기의 유형과 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 의존한다. 2차 건조를 위한 시간 연속기간은 생성물의 요망되는 잔여 습도 수준에 의해 결정되며, 통상 적어도 약 5시간을 필요로 한다. 일반적으로, 저압 하에 제조된 동결건조된 제제 내 수분 함량은 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 1차 건조 단계에서 적용되는 압력과 동일할 수 있으며; 바람직하게는 2차 건조에 사용되는 압력은 1차 건조에 사용되는 압력보다 더 낮다. 동결건조를 위한 조건은 제제 및 바이얼 크기에 따라 다양할 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 항-IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 제조 방법에 의해 제조되는 IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 동결건조된 제제는 2℃ 내지 8℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 동결건조된 제제는 40℃에서 적어도 7일, 적어도 14일 또는 적어도 28일 동안 안정하다.
추가로, 본 개시내용은 항-IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 재구성된(reconstituted) 용액의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 기재된 바와 같이 동결건조된 제제를 재구성하는 단계를 포함하고, 재구성에 사용되는 용액은 주사용수, 생리 식염수 또는 글루코스 용액을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
추가로, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 항-IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 재구성된 용액의 제조 방법에 의해 제조되는, IL-5 항체를 포함하는 동결건조된 제제의 재구성된 용액을 제공한다.
추가로, 본 개시내용은 본원에서 임의의 안정한 약학적 조성물을 포함하는 용기(들)를 포함하는 물품(article) 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 용기는 중성 보로실리케이트 유리로 만들어진 주사 바이얼이다.
추가로, 본 개시내용은 물품을 제공하며, 이 물품은 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액을 포함하는 용기(들)를 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 IL-5 매개 질환(들)의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제 또는 재구성된 용액 또는 제조 물품을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며; IL-5 매개 질환은 바람직하게는 천식(asthma), 만성 폐렴(chronic pneumonia), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환(allergic bronchopulmonary aspergillosis disease), 호산구증가증(eosinophilia), 척-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 간헐적 맥관부종(intermittent angioedema), 호산구성 근육통 증후군(eosinophilic myalgia syndrome), 호산구성 위염(eosinophilic gastroenteritis), 벌레 감염(worm infection), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 비용종(nasal polyp), 뢰플러 증후군(Loeffler's syndrome), 두드러기(urticaria), 과호산구성 기관지염(hypereosinophilic bronchitis), 결절 동맥염(nodular arteritis), 부비동염(sinusitis), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 알레르기성 호산구성 식도염(allergic eosinophilic esophagitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 자궁내막증(endometriosis) 및 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염(steroid-dependent eosinophilic bronchitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 개시내용은 IL-5 매개 질환(들)의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액 또는 제조 물품의 용도를 제공하며; IL-5 매개 질환은 바람직하게는 천식, 만성 폐렴, 알레르기성 비염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환, 호산구증가증, 척-스트라우스 증후군, 아토피성 피부염, 사상충증 피부염, 간헐적 맥관부종, 호산구성 근육통 증후군, 호산구성 위염, 벌레 감염, 호지킨 질환, 비용종, 뢰플러 증후군, 두드러기, 과호산구성 기관지염, 결절 동맥염, 부비동염, 호산구성 식도염, 알레르기성 호산구성 식도염, 알레르기성 결막염, 사상충증 피부염, 자궁내막증 및 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 개시내용은 치료 약제로서 사용하기 위한, 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 동결건조된 제제 또는 동결건조된 제제의 재구성된 용액 또는 제조 물품을 제공하며, 약제는 IL-5 매개 질환(들)을 치료하기 위한 것이고; IL-5 매개 질환은 바람직하게는 천식, 만성 폐렴, 알레르기성 비염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환, 호산구증가증, 척-스트라우스 증후군, 아토피성 피부염, 사상충증 피부염, 간헐적 맥관부종, 호산구성 근육통 증후군, 호산구성 위염, 벌레 감염, 호지킨 질환, 비용종, 뢰플러 증후군, 두드러기, 과호산구성 기관지염, 결절 동맥염, 부비동염, 호산구성 식도염, 알레르기성 호산구성 식도염, 알레르기성 결막염, 사상충증 피부염, 자궁내막증 및 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 본 개시내용에서 각각의 구현예 중 하나의, 일부 또는 모든 특질은 추가로 조합되어 본 개시내용의 다른 구현예를 형성할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 본 개시내용의 구현예 및 조합에 의해 수득되는 추가 구현예는 하기의 상세한 설명에 의해 더 예시된다.
도 1은, 항-IL-5 항체가 IL-5와 IL-5 수용체의 결합을 차단하는 FACS 실험의 결과를 나타내며;
도 2는 Th2 사이토카인에 대한 항-IL-5 항체의 결합 특이성의 검출 결과를 나타내고;
도 3은 항-IL-5 항체가 간헐적 호흡(Penh)의 수준을 증강시킴을 나타낸다. G1: 정상 대조군(PBS); G2: 모델 그룹(IgG); G3: h1705-008 항체 10 mpk 그룹; G4: h1705-008 항체 2 mpk 그룹; G5: h1706-009 항체 10 mpk 그룹; G6: h1706-009 항체 2 mpk 그룹; G7: Hu39D10 10 mpk 그룹; 여기서, *p<0.05, **<0.01(ANOVA/본페로니(Bonferroni)에 의해 G2 그룹과 비교함);
도 4a는 천식 마우스의 폐에서 BALF 호산구의 수준을 나타내며; 도 4b는 천식 마우스의 기관 점막(tracheal mucosal) 두께 점수를 나타낸다. G1: 정상 대조군; G2: 모델 그룹; G3: h1705-008 항체 10 mpk 그룹; G4: h1705-008 항체 2 mpk 그룹; G5: h1706-009 항체 10 mpk 그룹; G6: h1706-009 항체 2 mpk 그룹; G7: Hu39D10 10 mpk 그룹; 도 4c는 천식 마우스의 폐에서 BALF 호산구의 백분율을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 BALF에서 호산구의 수준을 감소시키는 IL5 단일클론 항체의 능력을 나타낸다.
용어
본 개시내용을 더욱 쉽게 이해하기 위해, 소정의 기술적 및 과학적 용어가 하기에서 구체적으로 정의된다. 본원에서 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본원에서 분명하게 다르게 정의되지 않는 한 본 개시내용이 관련 있는 당업계의 당업자 중 하나에 의해 보편적으로 사용되는 의미를 갖는다.
"완충제"는 이의 산-염기 접합체(conjugate) 성분의 작용에 의한 pH의 변화에 저항성인 완충제를 지칭한다. 적절한 범위 내에서 pH를 제어하는 완충제의 예는 아세테이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘 염, 옥살레이트, 락테이트, 포스페이트, 시트레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글리실-글리신 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.
"히스티딘 염 완충제"는 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘 염 완충제의 예는 히스티딘-하이드로클로라이드, 히스티딘-아세테이트, 히스티딘-포스페이트, 히스티딘-설페이트 완충제 등; 바람직하게는, 히스티딘-아세테이트 완충제 또는 히스티딘-하이드로클로라이드 완충제를 포함하며; 히스티딘-아세테이트 완충제는 히스티딘 및 아세트산에 의해 제조되고, 히스티딘 염 완충제는 히스티딘 및 HCl에 의해 제조된다.
"시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 포함하는 완충제이다. 시트레이트 완충제의 예는 시트르산-소듐 시트레이트, 시트르산-포타슘 시트레이트, 시트르산-칼슘 시트레이트, 시트르산-마그네슘 시트레이트 등을 포함한다. 바람직한 시트레이트 완충제는 시트르산-소듐 시트레이트이다.
"숙시네이트 완충제"는 숙시네이트 이온을 포함하는 완충제이다. 숙시네이트 완충제의 예는 숙신산-소듐 숙시네이트, 숙신산-포타슘 숙시네이트, 숙신산-칼슘 숙시네이트 등을 포함한다. 바람직한 숙시네이트 완충제는 숙신산-소듐 숙시네이트이다.
"포스페이트 완충제"는 포스페이트 이온을 포함하는 완충제이다. 포스페이트 완충제의 예는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-시트르산 등을 포함한다. 바람직한 포스페이트 완충제는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트이다.
"아세테이트 완충제"는 아세테이트 이온을 포함하는 완충제이다. 아세테이트 완충제의 예는 아세트산-소듐 아세테이트, 히스티딘 아세테이트, 아세트산-포타슘 아세테이트, 아세트산-칼슘 아세테이트, 아세트산-마그네슘 아세테이트 등을 포함한다. 바람직한 아세테이트 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트이다.
"약학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물(또는 이의 생리학적/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물) 및 다른 화학적 구성요소(예컨대 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제)를 포함하는 혼합물을 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 항체 활성 성분의 안정성을 유지시키고, 유기체에의 투여를 용이하게 하여, 활성 성분의 흡수 및 생물학적 활성을 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물" 및 "제제"은 상호 교환적으로 사용된다.
본 개시내용에서 "당류"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당(sugar) 알코올, 환원성 당류, 비-환원성 당류 등을 포함하여 통상적인 (CH2O)n 및 이의 유도체를 포함한다. 당류는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세롤, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스(melibiose), 멜레지토스(melezitose), 멜리트리오스(melitriose), 만노트리오스(mannotriose), 스타키오스(stachyose), 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 당류는 비-환원성 이당류, 더욱 바람직하게는 수크로스이다.
본 개시내용에 따르면, 용액 형태의 약학적 조성물에 포함되는 용매는 다르게 명시되지 않는 한, 물이다.
"동결건조된 제제"은 액체 또는 용액 형태의 약학적 조성물 또는 제제의 진공 동결건조에 의해 수득되는 제제 또는 약학적 조성물을 의미한다.
본 개시내용에서 동결건조는 예비-냉동, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 예비-냉동의 목적은 생성물을 냉동시켜, 결정질 고체를 수득하는 것이다. 예비-냉동 온도 및 예비-냉동 속도는 2개의 중요한 과정 매개변수이다. 본 개시내용에서, 예비-냉동 온도는 -45℃로 설정되며, 예비-냉동 속도는 1℃/분이다. 주요 건조라고도 하는 1차 건조는 시료의 동결건조를 위한 주요 스테이지(stage)이다. 목적은 생성물의 형상을 유지하는 한편 생성물로부터 얼음을 제거하여, 생성물에의 손상을 최소 수준으로 제한하는 것이다. 1차 건조 온도 및 진공 정도가 적절하게 선택되지 않을 때, 생성물은 붕괴(collapse)될 것이다. 더 높은 온도 및 더 높은 진공 정도는 동결건조 효율을 가속화시킬 뿐만 아니라, 생성물 붕괴의 위험을 증가시킨다. 본 발명에서 1차 건조의 온도는 당업계에서의 통상적인 온도, 예컨대 -30℃ 내지 0℃일 수 있다. 2차 건조는 또한 진공 건조라고 하며, 궁극적인 진공(ultimate vacuum)(0.01 mbar)을 펌핑하고 온도를 상승(20℃ 내지 40℃)시킴으로써 결합된 물을 생성물로부터 제거하는 주요 단계이다. 대부분의 생물학적 생성물이 온도에 민감하기 때문에, 선택된 2차 건조 온도는 온도 범위의 더 낮은 지점(point)에 있어야 하며, 이는 25℃이다. 동결건조를 위한 시간 연속기간은 냉동고, 동결건조되는 제제의 용량, 및 동결건조되는 제제의 용기와 관련이 있다. 당업자는 이러한 시간 연속기간을 조정하는 방법을 잘 알고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 값이 당업자에 의해 측정된 특정 값의 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미한다. 값은 부분적으로는, 이 값이 측정되거나 결정되는 방법(즉, 측정 시스템의 한계)에 의존한다. 예를 들어, 당업계의 모든 실시에서, "약"은 1 또는 1 초과 내의 표준 편차를 의미한다. 대안으로서, "약" 또는 "실질적으로 ~을 포함하는"은 최대 ±20%의 범위를 의미하며, 예를 들어, 약 5.5의 pH는 pH 5.5 ± 1.1을 의미한다. 게다가, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 대해, 이 용어는 값의 최대 한자릿수 또는 최대 5-배를 의미한다. 다르게 명시되지 않는 한, 특정 값이 본 출원 및 청구항에서 지시될 때, "약" 또는 "실질적으로 ~을 포함하는"의 의미는 특정 값의 허용 가능한 오차 범위 내에 있어야 한다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 안정한 효과를 달성할 수 있으며: 즉, 약학적 조성물에 포함되는 항체는 저장 후 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 저장 후 물리적 안정성 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 저장 기간은 일반적으로, 약학적 조성물의 예정된 저장-수명(shelf-life)에 기초하여 결정된다. 현재 단백질의 안정성을 측정하기 위한 많은 분석 기법이 존재하며, 이는 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 저장된 후 안정성을 측정하는 데 사용될 수 있다.
항체의 안정한 약학적 제제는, 하기 조건 하에 어떠한 유의한 물리적 및/또는 화학적 및/또는 생물학적 변화가 관찰되지 않는 제제다: 냉장 온도(2℃ 내지 8℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더욱 바람직하게는 1년, 더욱 더 바람직하게는 2년 이하 동안 저장됨. 게다가, 안정한 액체 제제는 25℃의 온도에서 1개월, 3개월 또는 6개월 동안 저장된 후 바람직한 특징을 나타내는 제제를 포함한다. 전형적으로, 안정한 제제에 대한 기준은 하기와 같다: SEC-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 전형적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 항체 단량체가 분해됨; 시각적 조사에 의해, 항체의 약학적 제제는 밝은 황색, 거의 무색 투명한 액체, 또는 무색, 또는 투명 내지는 약간 옅음(pale); ±10% 이하의 변화가 제제의 농도, pH 및 삼투질 농도(osmolality)에서 발생함; 일반적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 감소가 관찰됨; 일반적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집이 형성됨.
항체가 색상 및/또는 투명도(clarity)의 시각적 조사에 의해 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography) 및 동적 광 산란(DLS: dynamic light scattering)을 통해 측정됨으로써 유의하게 증가된 응집, 침전 및/또는 변성을 나타내지 않을 때, 이러한 항체는 약학적 제제에서 "이의 물리적 안정성을 보유하는" 것으로 여겨질 것이다. 단백질 입체배좌(conformation)에서의 변화는, 단백질의 3차 구조를 결정하는 형광 분광법에 의해, 그리고 단백질의 2차 구조를 결정하는 FTIR 분광법에 의해 평가될 수 있다.
항체가 유의한 화학적 변형을 나타내지 않을 때, 이러한 항체는 약학적 제제에서 "이의 화학적 안정성을 보유하는" 것으로 여겨질 것이다. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 단백질의 화학적 구조를 빈번하게 변경시키는 분해 과정은 가수분해 또는 절단(truncation)(크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법에 의해 평가됨), 산화(질량 분광법과 조합된 펩타이드 분광법 또는 MALDI/TOF/MS와 같은 방법에 의해 평가됨), 탈아미드화(deamidation)(이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 집속법(capillary isoelectric focusing), 펩타이드 분광법, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법에 의해 평가됨) 및 이성질화(isomerization)(이소아스파르트산의 함량을 측정하는 것, 펩타이드 분광법과 같은 방법에 의해 평가됨)를 포함한다.
주어진 시간에서 항체의 생물학적 활성이, 약학적 제제가 초기에 제조되었을 때 나타난 생물학적 활성의 예정된 범위 내에 여전히 있을 때, 이러한 항체는 약학적 제제에서 "이의 생물학적 활성을 보유하는" 것으로 여겨질 것이다. 항체의 생물학적 활성은 예를 들어, 항원-결합 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용에 사용되는 아미노산에 대한 3-글자 코드 및 1-글자 코드는 문헌[J. biol. chem. 243, p3558 (1968)]에 기재되어 있다.
본 개시내용에 사용되는 "항체"는 면역글로불린을 지칭하며; 완전(complete) 항체는 사슬간 이황화 결합(들)에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 테트라-펩타이드 사슬 구조이다.
본 개시내용에서, 본 개시내용의 항체 경쇄는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 경쇄 불변 영역은 인간 또는 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체(들)를 포함한다.
본 개시내용에서, 본 개시내용의 항체 중쇄는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 중쇄 불변 영역은 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체(들)를 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 인접한 약 110개의 아미노산은 고도로 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있고; C-말단에 근접한 아미노산 서열의 나머지는 상대적으로 안정하며, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR: hypervariable region) 및 4개의 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR: framework region)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 3개의 초가변 영역은 또한 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로 알려져 있다. 경쇄 가변 영역(LCVR, VL) 및 중쇄 가변 영역(HCVR, VH)은 각각 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성되며, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단까지 순차적인 순서로 존재한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 지칭하며, 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 지칭한다. 본 개시내용에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서 LCVR 영역 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 기지의 카바트 숫자매김 기준(Kabat numbering criteria)을 따른다(LCDR 1 내지 3, HCDR 1 내지 3).
본 개시내용의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 바람직하게는 인간화 항체를 포함한다.
본 개시내용에서, "항체의 항원-결합 단편" 또는 "기능적 단편"은, 항원-결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 및 항체에 결합하는 Fv 단편, scFv 단편을 지칭한다. Fv 단편은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하지만 불변 영역을 갖지 않고, Fv 단편은 모든 항원 결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편이다. 일반적으로, Fv 항체는 또한, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 포함하며, 항원-결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 상이한 링커도 역시 2개의 항체 가변 영역을 연결하여, 폴리펩타이드 사슬, 다시 말해 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(sFv)를 형성하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 용어 "항원-결합 부위"는 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 인식되는 항원 상의 연속 또는 불연속 3-차원 공간적 부위를 지칭한다.
본 개시내용에서 용어 "뮤린 항체"는 당업계의 지식 및 기술에 따라 제조된, 인간 IL-5에 대한 단일클론 항체를 지칭한다. 제조 동안, 시험 대상체에게 IL-5 항원이 주사된 다음, 요망되는 서열 또는 기능적 특질을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다.
용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합함으로써 형성되는 항체이며, 이는 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 감소시킨다. 키메라 항체를 확립하기 위해, 우선, 뮤린 특이적 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하는 것이 필요하며; 그 후에 가변 영역 유전자가 마우스 하이브리도마 세포로부터 클로닝되고; 그 후에 인간 항체의 불변 영역 유전자가 필요에 따라 클로닝되며; 뮤린 가변 영역 유전자가 인간 불변 영역 유전자와 조합되어, 키메라 유전자를 형성하며, 이러한 키메라 유전자는 인간 벡터 내로 삽입되고, 마지막으로, 키메라 항체 분자가 진핵생물 산업적 시스템 또는 원핵생물 산업적 시스템에서 발현된다. 본 개시내용의 바람직한 구현예에서, IL-5 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체(들)의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. IL-5 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체(들)의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 인간 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 변이체(들)의 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 돌연변이 후 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 또는 ADCC 독성(항체-의존적 세포-매개 세포독성)이 없는 IgG4를 포함한다.
CDR-그래프팅됨 항체로도 알려져 있는 용어 "인간화 항체"는, 뮤린 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역 프레임워크 상으로 그래프팅함으로써 발생된 항체, 즉, 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 프레임워크 서열에서 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는, 다수의 뮤린 단백질 성분을 운반하는(carry) 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 이종성 반응을 피한다. 이러한 프레임워크 서열은, 생식계열 항체 유전자 서열 또는 공개된 기준을 망라하는 공개적인 DNA 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase 상에서 입수 가능함)에서, 뿐만 아니라 문헌[Kabat, EA, 등 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed]에서 찾을 수 있다. 저하된 면역원성에 의해 야기되는 활성의 저하를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역 내 프레임워크 서열은 최소 복귀-돌연변이(reverse-mutation) 또는 역돌연변이를 받아서, 활성을 유지시킬 수 있다. 본 개시내용의 인간화 항체는 또한, CDR 친화도 성숙이 파지 디스플레이에 의해 수행되는 인간화 항체를 지칭한다.
본 개시내용에서, "ADCC"(즉, 항체-의존적 세포-매개 세포독성)는, 항체-코팅된 표적 세포가, 항체의 Fc 분절(segment)의 인식을 통해 Fc 수용체를 발현하는 세포에 의해 직접 사멸됨을 의미한다. 항체의 ADCC 이펙터(effector) 기능은 IgG의 Fc 분절을 변형시킴으로써 감소되거나 없어질 수 있다. 변형은 항체의 중쇄 불변 영역 상에서 수행되는 돌연변이를 지칭하며, 이는 IgG1 상에서의 N297A, L234A, L235A; IgG2/4 키메라, IgG4 상에서의 F234A/L235A 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용에서 돌연변이체 서열 내 "돌연변이"는 "역돌연변이(들)", "보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 본 개시내용에서 사용되는 "보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은 유사한 특징(예컨대, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체배좌 및 강성도(rigidity) 등)을 갖는 다른 아미노산을 지칭하며, 단백질 내 아미노산을 대체하는 데 사용되어, 대체는 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 빈번하게 수행될 수 있다. 당업자는, 일반적으로, 폴리펩타이드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않음을 알고 있다(예를 들어, 문헌[Watson 등, (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (the 4th edition)] 참조). 게다가, 유사한 구조 또는 기능을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해하지 않을 것이다.
본 개시내용에서 "돌연변이화된 서열"은, 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 아미노산 서열이, 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 아미노산 서열과 상이한 서열 동일성 백분율을 갖는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 아미노산 서열을 수득하기 위해 돌연변이(들)(예컨대, 치환, 삽입 또는 결실)에 의해 대략적으로 변형됨을 지칭한다. 본 개시내용에서, 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%, 바람직하게는 적어도 95%일 수 있다. 비제한적인 실시예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 지칭한다. 2개의 서열 사이에서 서열 정렬 및 동일성 백분율의 결정은 국립 생물기술 센터 기관(National Center For Biotechnology Institute)의 웹사이트 상에서 입수 가능한 BLASTN/BLASTP 알고리즘의 디폴트 설정(default setting)에 의해 수행될 수 있다.
용어 "IL-5에의 결합"은 IL-5, 바람직하게는 인간 IL-5와의 상호작용을 지칭한다.
용어 "항-IL-5 항체" 및 "IL-5 항체"는 상호 교환적으로 사용되고, 둘 다 IL-5에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 개시내용에서, 융합 단백질은 DNA 재조합을 통해 2개의 유전자를 공동-발현함으로써 수득되는 단백질 생성물이다. 재조합 IL-5 세포외 영역-Fc 융합 단백질은 DNA 재조합을 통해, IL-5 세포외 영역 및 인간 항체 Fc 단편을 공동-발현함으로써 수득되는 융합 단백질이다. IL-5 세포외 영역은 세포막 밖에서 발현되는 IL-5 단백질의 부분을 지칭하고, 이의 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되어 있다.
항체 및 항원-결합 단편을 생성하고 정제하는 방법은 잘 알려져 있으며, 선행 기술, 예컨대 문헌[항체: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, Chapters 5-8 및 15]에서 입수 가능하다. 예를 들어, 마우스는 인간 IL-5 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있으며, 생성된 항체는 재생되고 정제될 수 있고, 아미노산 시퀀싱은 통상적인 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 항원-결합 단편은 또한, 통상적인 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 인간 FR 영역(들)을 비-인간 CDR 영역 상으로 그래프팅하기 위해 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 ImMunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr로부터 수득될 수 있거나, 문헌[The Immunoglobulin Journal, 2001ISBN012441351]로부터 수득될 수 있다.
조작된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA 서열은 클로닝되고, GS 발현 벡터 내로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린의 발현 벡터는 CHO 세포 내로 안정하게 형질주입될 수 있다. 권고된 선행 기술로서, 포유류 발현 시스템은 특히, Fc 영역의 고도로 보존적인 N-말단 위치에서 항체의 글리코실화를 유발할 수 있다. 안정한 클론은, 인간 IL-5에 특이적으로 결합하는 항체를 발현함으로써 수득된다. 양성 클론은 생물반응기의 무혈청 배양 배지에서 확장(expand)되어 항체를 생성한다. 항체가 분비되는 배양 배지는 통상적인 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 조정된 완충제를 포함하는 단백질 A 또는 단백질 G Sepharose FF 컬럼은 정제에 사용될 수 있다. 비-특이적으로 결합된 구성요소는 세척된다. 그 후에, 결합된 항체는 pH 구배에 의해 용출되며, 항체 단편은 SDS-PAGE에 의해 검출되고 수집된다. 항체는 통상적인 방법에 의해 여과되고 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 또한, 통상적인 방법, 예를 들어, 분자 체(molecular sieve) 및 이온 교환에 의해 제거될 수 있다. 생성된 생성물은 예컨대, -70℃에서 즉시 냉동되거나, 동결건조되어야 한다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는, 용어에 뒤따른 사건 또는 환경이 발생할 수 있으나 발생해야 하는 것은 아니고, 설명은 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않을 경우를 수반함을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 항체의 1 내지 3개의 중쇄 CDR 영역(들)을 포함한다"는, 특이적인 서열(들)을 갖는 항체의 중쇄 CDR 영역(들)이 존재할 수 있으나 본질적으로 그런 것은 아닐 수 있음을 의미한다.
"투여하는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체와의 접촉을 지칭한다. "투여하는" 및 "치료하는"은 예를 들어, 치료, 약물동력학(pharmacokinetic), 진단, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉, 및 시약과 유체의 접촉을 포함하며, 유체는 세포와 접촉된다. "투여하는" 및 "치료하는"은 예를 들어 또한, 시험관내에서 및 생체외에서 시약, 진단제, 결합 조성물에 의한 또는 또 다른 세포에 의한 세포의 처리를 의미한다. "치료하는"은 인간, 수의학(veterinary) 또는 연구 대상체에게 적용될 때, 치료적 치료, 방지 또는 예방적 조치, 연구 및 진단적 적용을 지칭한다.
"치료"는 내부 또는 외부 치료제, 예를 들어, 본 개시내용의 임의의 하나의 결합 화합물을 포함하는 조성물을, 하나 이상의 질환 증상을 갖고 있으며 치료제가 치료적 효과를 갖는 것으로 알려진 환자에게 적용하는 것을 의미한다. 일반적으로, 치료제는, 치료받는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 경감하여 이러한 증상의 퇴축(regression)을 유도하거나 이러한 증상의 발증(development)을 임의의 임상적으로 검출 가능한 규모(extent)까지 저해하기에 효과적인 양으로 주어진다. 임의의 특정 질환 증상을 경감하기에 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"으로도 지칭됨)은 여러 가지 인자, 예를 들어, 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 요망되는 치료 효과를 발휘하는 제제의 능력에 따라 다양할 수 있다. 질환 증상이 경감되었는지의 여부는 의사 또는 다른 건강 관리 전문가에 의해 보편적으로 사용되는 임의의 임상 시험 방법을 통해 평가되어, 증상의 중증도 또는 진행을 평가할 수 있다. 본 개시내용의 일 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 각각의 표적 질환 증상을 경감하는 데 효과적일 수 없긴 하지만, 이는 당업계에 알려진 임의의 통계학적 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정(Student t-test), 카이-제곱 검정(chi-square test), 만 및 휘트니 U 검정(Mann and Whitney's U test), 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)(H 검정), 욘히레-터프스트라 검정(Jonckheere-Terpstra test) 및 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)에 따라 결정되는 바와 같이, 통계학적으로 유의한 수의 환자에서 표적 질환 증상을 경감해야 한다.
질환이 IL-5와 관련된 질환인 한, IL-5와 관련된 질환에 어떠한 제약도 없다. 예를 들어, 본 개시내용의 분자에 의해 유도되는 치료 반응은 인간 IL-5에 결합하고 후속적으로 호산구의 자극 효과를 차단하거나 저해함으로써 발휘될 수 있다. 따라서, 치료 적용에 적합한 조제물 및 제제에 적용될 때, 본 개시내용의 약학적 조성물은, 알레르기 및/또는 아토피 반응을 앓고 있거나 호산구와 관련된 반응, 예컨대 그러나 천식, 천식의 악화, 천식의 악성 발병, 만성 폐렴, 알레르기성 비염, 통년성(perennial) 알레르기성 비염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환, 호산구증가증, 척-스트라우스 증후군, 아토피성 피부염, 사상충증 피부염, 간헐적 맥관부종, 호산구성 근육통 증후군, 호산구성 위염, 벌레 감염, 호지킨 질환, 비용종, 뢰플러 증후군, 두드러기, 과호산구성 기관지염, 결절 동맥염, 부비동염, 호산구성 식도염, 알레르기성 호산구성 식도염, 알레르기성 결막염, 사상충증 피부염, 자궁내막증, 또는 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염 등으로 제한되지 않는 것을 앓고 있는 이러한 대상체에 대해 매우 유용하다. 바람직한 구현예에서, 치료는 폐 조직 내로의 호산구의 침윤을 저해하거나 경감할 수 있다. 약학적 조성물에 대한 투여 빈도는 일일당 3회 내지 6개월마다 1회일 수 있다. 투여 경로는 정맥내, 피하, 근육내, 비경구 또는 국소 경로일 수 있다.
본 개시내용의 제제는 IL-5 매개 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제는 생체내에서 및 시험관내에서 IL-5 매개 염증 반응 및 호산구의 성숙, 활성화, 탈과립(degranulation) 또는 조직 침윤을 저해하거나 경감하며; IL-5에 의해 야기되는 평활근의 과도한 스트레스를 저해하고; 폐, 기도 또는 혈액에서 IL-5의 수준을 감소시키는 데 사용될 수 있으나 이로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본 개시내용의 제제는 IL-5 매개 질환을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 바람직하게는, IL- 5 매개 질환은 천식, 만성 폐렴, 알레르기성 비염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환, 호산구증가증, 척-스트라우스 증후군, 아토피성 피부염, 사상충증 피부염, 간헐적 맥관부종, 호산구성 근육통 증후군, 호산구성 위염, 벌레 감염, 호지킨 질환, 비용종, 뢰플러 증후군, 두드러기, 과호산구성 기관지염, 결절 동맥염, 부비동염, 호산구성 식도염, 알레르기성 호산구성 식도염, 알레르기성 결막염, 사상충증 피부염, 자궁내막증 및 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"유효량"은 의학적 질환의 증상 또는 병태를 향상시키거나 방지하기에 효과적인 양을 포함한다. 유효량은 또한, 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 지칭한다. 특정 환자 또는 수의학 대상체에 대한 유효량은 하기 인자에 따라 다양할 수 있다: 예를 들어, 치료될 병태, 환자의 일반적인 조건, 투여 경로 및 투약량, 및 부작용의 중증도. 유효량은 유의한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 스케쥴일 수 있다.
"교환"은 항체 단백질을 용해시키는 데 사용되는 용매 시스템의 교환을 지칭한다. 예를 들어, 항체 단백질을 포함하는 고(high) 염 또는 고장성(hypertonic) 용매 시스템은 안정한 제제의 완충제 시스템으로 물리적 조작에 의해 대체되어, 항체 단백질은 안정한 제제에 존재할 것이다. 물리적 조작은 원심분리 후 초여과(ultrafiltration), 투석 또는 재구성을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
실시예 및 시험예
추가로, 본 개시내용은 하기 실시예와 함께 기재되지만, 이들 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 본 개시내용의 실시예에서 구체적인 조건과 함께 제공되지 않는 실험 방법은 보통 통상적인 조건에 따른 것이며, 예컨대 문헌[항체: A Laboratory Manual, Molecular Cloning by Cold Spring Harbor Laboratory]의 공개문헌을 참조하거나; 물질 또는 생성물의 제조업체에 의해 권고된 조건에 따른 것이다. 구체적인 공급원과 함께 제공되지 않는 시약은 시중에서 구매되는 통상적인 시약이다.
실시예 1. 검출에 사용되는 IL-5 항원 및 단백질의 제조
1.1 IL-5 항원의 설계 및 발현
His-태그를 갖는 인간 IL-5, His-태그를 갖는 레수스(rhesus) IL-5, His-태그를 갖는 마우스 IL-5, His-태그를 갖는 래트 IL-5, 인간 IgG1-Fc 단편을 포함하는 인간 IL-5Rα 수용체 세포외 영역 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 phr 벡터 내로 클로닝하며, 발현 플라스미드를 제작한 다음, HEK293 내로 형질주입하였다. 형질주입 후 제6일에, 시료를 수집하고, 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포 상층액을 수집하였다. 재조합 IL-5 및 IL-5α 수용체 단백질을 포함하는 상층액을 니켈 컬럼을 사용하여 정제하였으며, 재조합 인간 IL-5-Fc 융합 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 후속적인 실험에 사용할 수 있다. 특이적인 단백질 항원에 대한 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2. 재조합 IL-5α 수용체 및 IL-5α/β 수용체 세포주의 제작 및 식별
기능적 항체를 스크리닝하기 위해, 본 개시내용은 IL-5α를 발현하는 CHO-S/IL-5α 세포주, 및 IL-5α와 IL-5β 둘 다 발현하는 CHO-S/IL-5α/IL-5β 세포주를 제작하였다.
구체적으로, 인간 IL-5α 전장 유전자(Q01344)를 포유류 세포 발현 벡터 pTargeT 내로 클로닝하였으며, 선형화된 플라스미드를 CHO-S 세포 내로 전기-형질주입하고, G418의 존재 하에 2주 동안 스크리닝한 다음, 제한된 희석을 2회 수행하였다. IL-5α 유전자를 세포 표면 상에서 FACS에 의해 검출하고, 높은 IL-5α 발현 수준을 갖는 CHO-S/IL-5α 세포주를 선택하였다. 이에 기초하여, 선형화된 pcDNA3.1-IL-5β를 전기-형질주입하고, G418 및 제오신(zeocin)의 존재 하에 2주 동안 스크리닝한 다음, 제한된 희석을 2회 수행하였다. IL-5α 및 IL-5β 유전자를 세포 표면 상에서 FACS에 의해 검출하고, IL-5α 및 IL-5β의 높은 발현 수준을 갖는 CHO-S/IL-5α/IL-5β 세포주를 선택하였다.
실시예 3. 항-인간 IL-5 뮤린 단일클론 항체의 제조
2개 용량의 재조합 단백질 rhIL-5-his, 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant) CFA(Sigma, Lot# SLBQ1109V), 및 IFA(Sigma, Lot#SLBJ2845V)(100 g/50 g/50 g(고(high)) 및 25 g/12.5 g/12.5 g(저(low)))를 사용하여, 2개 그룹의 Balb/c 마우스(5 마리 마우스/그룹) 및 4개 그룹의 SJL 마우스(5 마리 마우스/그룹)를 각각 면역화시켰다. 혈청 역가를 ELISA에 의해 검출함으로써, 리간드-수용체 차단 검정에 의해, 그리고 TF-1 증식의 저해 검정에 의해, IL-5에 대한 특이적인 면역 반응을 결정하였다. 양호한 특이적인 면역 반응을 갖는 마우스를 선택하고 희생시켰으며; 비장 세포를 수집하고 골수종 세포와 융합하였다.
인간 IL-5에 대한 ELISA 결합 검정에 의해 1차 스크리닝을 수행하였다. 일단 하이브리도마 세포가 24-웰 플레이트로 형질주입되면, 인간, 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) 및 마우스 IL-5에 대한 ELISA 결합 검정, IL-5에 대한 ELISA-기초 수용체 차단 검정, 및 TF-1 증식의 저해 검정을 사용함으로써 상층액을 다시 스크리닝하였다. 양성 클론을 2 라운드(round)의 서브-클로닝을 받게 한 후, 하이브리도마 클론을 수득하고 항체 생성에 사용하였으며; 수득된 항체를 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
정제된 항체를, SEC-HPLC, 내독소 함량의 검출, 다양한 종 IL-5에 대한 Biacore 친화도 검정, IL-5에 대한 FACS-기초 수용체 차단 검정, TF-1 증식의 저해 검정, 호산구의 접착 시험, 및 생체내에서 천식의 마우스 모델 및 기니 피그의 중화 모델에서 효능 평가를 받게 하였으며; 생체내에서 그리고 시험관내에서 선호할 만한 활성을 나타내는 단일클론 하이브리도마 세포주 mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779를 선택하였다.
양성 하이브리도마로부터 서열을 클로닝하는 과정은 하기와 같았다: 대수생장기(logarithmic growth phase)에서의 하이브리도마 세포를 수집하며, RNA를 트리졸(Invitrogen, Cat No.15596-018)로 키트 설명서에 따라 추출하고, PrimeScript™ 역전사효소 키트를 역전사(Takara, Cat No. 2680A)에 사용하였다. 역전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev. B0503)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시킨 다음, 시퀀싱하였다. mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 DNA 서열에 상응하는 아미노산 서열을 수득하였다(VH/VL CDR의 아미노산 잔기를 결정하고, 카바트 숫자매김 기준에 의해 주석을 담).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
각각의 항체에 대한 경쇄 및 중쇄의 CDR 서열은 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00010
Biacore에 의한 활성의 검출 결과는 표 2에서 찾을 수 있다.
Figure pct00011
결과는, 본 개시내용의 뮤린 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 가짐을 보여준다.
실시예 4. IL-5 관련 재조합 단백질의 정제, 및 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제
4.1 IL-5-Flag-His 재조합 단백질의 정제 단계:
시료를 고속에서 원심분리하여, 불순물을 제거하고 적절한 부피로 농축시켰다. NI-NTA 친화도 컬럼(QIAGEN, Cat No. 30721)을 PBS로 평형화시키고, 2 내지 5배의 컬럼 부피로 세척하였다. 불순물을 제거한 후, 세포 발현 상층액 시료를 컬럼 상으로 로딩하였다. A280 판독물이 기준선까지 저하될 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 컬럼을 PBS로 세척하여, 오염 단백질을 제거하며, 시료를 수집하였다. 표적 단백질을 세척 완충제(20 mM 이미다졸) 및 용출 완충제(300 mM 이미다졸)로 연속적으로 용출시키고, 용출 피크를 수집하였다.
수집된 용출물을 이온 교환(Hiload 16/600 superdex 200 컬럼)에 의해 추가로 정제하였다. 컬럼을 약 2-컬럼 부피의 PBS로 평형화시켜, pH를 7.4에서 보장하였다. 식별된 표적 단백질을 포함하는 용출 완충제를 농축시키고 로딩하였으며, 시료를 수집하고 SDS-PAGE 및 LC-MS 식별에 의해 확증하며, 사용을 위해 분취하였다.
4.2 하이브리도마 발현 항체 및 Fc 융합 단백질의 정제
세포 발현 상층액 시료를 고속에서 원심분리하여, 불순물을 제거하였다. 하이브리도마 발현 상층액을 단백질 G 컬럼으로 정제하고, Fc 융합 단백질 발현 상층액을 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독물이 기준선까지 저하될 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 100 mM 아세트산 pH 3.0으로 용출시키며, 1 M Tris-HCl, pH 8.0으로 중화시켰다. 용출된 시료를 적절하게 농축시킨 후, 시료를 PBS-평형화된 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)에 의해 추가로 정제하고, 응집물이 없는 피크를 수집한 다음, 사용을 위해 분취하였다.
실시예 5. 항-인간 IL-5 단일클론 항체의 인간화 설계
뮤린 항-인간 IL-5 단일클론 항체의 인간화를 당업계의 많은 참조문헌에 개시된 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 뮤린 항체의 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체하고, 뮤린 항체의 CDR을, 최고 상동성을 갖는 FR 인간 주형 상으로 그래프팅하였으며, 역돌연변이를 FR 영역 내의 아미노산 상에서 수행하였다.
IMGT 인간 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스에 대해 정렬함으로써, mAb-1705, mAb-1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779 항체의 아미노산 서열 각각과 높은 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계열을 주형으로서 선택하였으며, 뮤린 항체의 CDR을 상응하는 인간 주형 상으로 그래프팅하여, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 순서의 가변 영역을 형성하였다. 아미노산 잔기를 결정하고, 카바트 숫자매김 기준에 의해 주석을 달았다.
인간 FR 영역의 선택 및 아미노산 역돌연변이
수득된 뮤린 항체 VH/VL CDR의 전형적인 구조에 기초하여, 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 상동성 서열을 인간 생식계열 데이터베이스로부터 검색하였으며, FR 상동성에 따라 순위를 매기고(고(high)로부터 저(low)로); 최고 FR 상동성을 갖는 생식계열을 주요 주형으로서 선택하였다. 뮤린 항체의 CDR 영역을 인간 주형 상으로 그래프팅한 다음, FR 잔기를 돌연변이를 받게 하였고, 아미노산 잔기를 최적화시켜, 최종 인간화 분자를 수득하였다.
5.1 하이브리도마 클론 mAb1705에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1705에 대해, IGHV3-23*04를 VH에 대한 주형으로서 선택하였으며, IGKV1-12*01을 VL에 대한 주형으로서 선택하였다. mAb1705의 CDR을 인간 주형 상으로 그래프팅하였으며; 포매된(embedded) 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호작용한 잔기(소프트웨어를 통해 발견됨)를 역돌연변이를 받게 하였다. 인간화 항체의 다양한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 3에 나타낸 바와 같이 수득하였다.
Figure pct00012
Figure pct00013
인간화 항체 h1705의 가변 영역의 특이적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 기재된 바와 같은 각각의 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역과 조합하여 경쇄 서열을 형성하였으며, 각각의 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역과 조합하여 중쇄 서열을 형성하였다. 예시적인 인간화 항체 불변 영역 서열을 하기에 나타낸다:
Figure pct00017
Figure pct00018
5.2 하이브리도마 클론 mAb1706에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1706에 대해, IGHV3-23*04를 VH에 대한 주형으로서 선택하였으며, IGKV1-12*01을 VL에 대한 주형으로서 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1706의 CDR을 선택된 인간화 주형 상으로 그래프팅하였으며; FR 아미노산을 역돌연변이를 받게 하였다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 5에 나타낸 바와 같이 수득하였다.
Figure pct00019
설계된 인간화 분자를 조합하여, 표 6에 나타낸 바와 같이 하기 표에 나타낸 상이한 항체를 형성하였다.
Figure pct00020
h1706 인간화 항체의 가변 영역의 특이적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
상기 기재된 바와 같은 각각의 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역과 조합하여 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역과 조합하여 중쇄 서열을 형성하였다.
5.3 하이브리도마 클론 mAb1780에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1780에 대해, IGHV1-2*02를 VH에 대한 주형으로서 선택하였으며, IGKV3-11*01을 VL에 대한 주형으로서 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1780의 CDR을 선택된 인간화 주형 상으로 그래프팅하였으며; FR 아미노산을 역돌연변이를 받게 하였다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 7에 나타낸 바와 같이 수득하였다.
Figure pct00024
설계된 인간화 분자를 조합하여, 표 8에 나타낸 바와 같이 하기 표에 나타낸 상이한 항체를 형성하였다.
Figure pct00025
h1780 인간화 항체의 가변 영역의 특이적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
상기 기재된 바와 같은 각각의 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역과 조합하여 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역과 조합하여 중쇄 서열을 형성하였다.
5.4 하이브리도마 클론 mAb1773에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1773에 대해, IGHV3-73*01을 VH에 대한 주형으로서 선택하였으며, IGKV1-39*01을 VL에 대한 주형으로서 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1773의 CDR을 선택된 인간화 주형 상으로 그래프팅하였으며; 아미노산을 역돌연변이를 받게 하였다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 9에 나타낸 바와 같이 수득하였다. 게다가, h1773 HCDR2(RIDPANGDTK HGPKFQG)에서 N을 V(즉, N55V)로 돌연변이화하여, 중쇄 가변 영역 HCDR2 변이체(돌연변이화된 HCDR2의 서열은 SEQ ID NO: 82: RIDPAVGDTKHGPKFQG로 표시되어 있음)를 형성하였다.
Figure pct00030
설계된 인간화 분자를 조합하여, 표 10에 나타낸 바와 같이 하기 표에 나타낸 상이한 항체를 형성하였다.
Figure pct00031
h1773 인간화 항체의 가변 영역의 특이적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00032
Figure pct00033
상기 기재된 바와 같은 각각의 경쇄 가변 영역을 SEQ ID NO: 53으로 표시된 바와 같은 경쇄 불변 영역 서열과 조합하여 최종 완전 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 SEQ ID NO: 52로 표시된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종 완전 중쇄 서열을 형성하였다.
5.5 하이브리도마 클론 mAb1779에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1779에 대해, IGHV1-2*02를 VH에 대한 주형으로서 선택하였으며, IGKV1-33*01을 VL에 대한 주형으로서 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1779의 CDR을 선택된 인간화 주형 상으로 그래프팅하였으며; 아미노산을 역돌연변이를 받게 하였다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 11에 나타낸 바와 같이 수득하였다.
Figure pct00034
설계된 인간화 분자를 조합하여, 표 12에 나타낸 바와 같이 하기 표에 나타낸 상이한 항체를 형성하였다.
Figure pct00035
h1779 인간화 항체의 가변 영역의 특이적인 서열은 하기와 같다:
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
상기 기재된 바와 같은 각각의 경쇄 가변 영역을 SEQ ID NO: 53으로 표시된 바와 같은 경쇄 불변 영역 서열과 조합하여 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 SEQ ID NO: 52로 표시된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 중쇄 서열을 형성하였다.
예시적인 인간화 항체의 전장 서열은 하기와 같다:
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
WO2012083370A1에서 IL5에 대한 항체 Hu39D10을 본 개시내용에서 양성 대조군으로서 사용하고, 이의 중쇄 및 경쇄 서열은 SEQ ID NO: 80 및 SEQ ID NO: 81로 각각 표시되어 있다.
Figure pct00049
Figure pct00050
실시예 6. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 제조
1. 재조합 키메라 항체의 분자 클로닝
하이브리도마를 스크리닝함으로써 양성 항체 분자를 수득한 후, 가변 영역을 인코딩하는 유전자 서열을 시퀀싱에 의해 수득하였다. 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 수득된 서열에 기초하여 설계하였으며, 시퀀싱된 유전자를 주형으로서 사용하여 각각의 항체 VH/VK 유전자 단편을 PCR에 의해 제작한 다음, 상동성 재조합에 의해 발현 벡터 pHr(신호 펩타이드 및 hIgG1/h카파 불변 영역 유전자(CH1-Fc/CL) 단편을 가짐) 내로 삽입하여, 재조합 키메라 항체 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr를 제작하여, 5개의 키메라 항체 Ch1705, Ch1706, Ch1780, Ch1773 및 Ch1779를 수득하였다.
2. 인간화 항체의 분자 클로닝
인간화 항체 서열을 코돈 최적화를 받게 한 다음, 인간 코돈-선호도를 갖는 코딩 유전자 서열을 수득하였으며; 각각의 항체 VH/VK 유전자 단편을 PCR에 의해 제작하도록 프라이머를 설계하였으며, 그 후에 이를 상동성 재조합에 의해 발현 벡터 pHr(신호 펩타이드 및 hIgG1/h카파 불변 영역 유전자(CH1-Fc/CL) 단편을 가짐) 내로 삽입하여, 인간화 항체 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr을 제작하였다.
3. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현 및 정제
항체 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 플라스미드를 HEK293E 세포 내로 별개로 형질주입하였다. 6일 후에, 발현 상층액을 수집하며, 고속에서 원심분리하여 불순물을 제거하고, 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독물이 기준선으로 저하될 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 산성 용출 완충제, pH 3.0-pH 3.5로 용출시키고, 1 M Tris-HCl, pH 8.0-9.0으로 중화시켰다. 용출된 시료를 적절하게 농축시키고, PBS로 예비-평형화된 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)에 의해 추가로 정제하여 응집물을 제거하며, 단량체 피크를 수집하고 사용을 위해 분취하였다.
하기 시험 방법을 사용하여, 본 개시내용의 항체의 성능 및 유익한 효과를 확증하였다.
시험관내에서 활성의 생물학적 평가
시험예 1. Biacore 검정에 의한, 상이한 종의 IL-5에의 뮤린 IL-5 항체의 결합
시험될 뮤린 IL-5 항체와 인간 IL-5의 친화도를 Biacore T200(GE) 기기에 의해 측정하였다.
단백질 A 바이오센서 칩을 시험될 분자의 친화도 포착(capture), 그 후에 칩의 표면을 통해 유동하는 항원(실시예 1에서 제조된 재조합 인간 및 시노 IL-5)의 포착에 사용하고, 반응 신호를 Biacore T200 기기로 실시간으로 검출하여 결합 곡선 및 해리 곡선을 수득하였다. 각각의 실험 사이클의 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하며 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)으로 재생시켰다. BIAevaluation 버전 4.1 GE 소프트웨어를 사용하여, 데이터를 (1:1) 랭뮤어(Langmuir) 모델에 대해 적합화시키고, 친화도 값을 수득하고 표 13에 나타내었다.
Figure pct00051
이 실시예는, 본 개시내용의 항체 mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779가 상이한 종(인간, 원숭이)의 IL-5에 대해 높은 친화도를 가짐을 입증한다.
시험예 2. Biacore 검정에 의한, 상이한 종의 IL-5에의 인간화 IL-5 항체의 친화도
시험될 인간화 IL-5 항체와 인간 IL-5의 친화도를 Biacore T200(GE) 기기에 의해 측정하였다.
단백질 A 바이오센서 칩을 시험될 분자의 친화도 포착, 그 후에 칩의 표면을 통해 유동하는 항원(실시예 1에서 제조됨)의 포착에 사용하고, 반응 신호를 Biacore T200 기기로 실시간으로 검출하여 결합 곡선 및 해리 곡선을 수득하였다. 각각의 실험 사이클의 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하며 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)으로 재생시켰다. BIAevaluation 버전 4.1 GE 소프트웨어를 사용하여, 데이터를 (1:1) 랭뮤어 모델에 대해 적합화시키고, 친화도 값을 수득하고 표 14에 나타내었다.
Figure pct00052
결과는, 모든 인간화 IL-5 항체가 인간 IL-5에 대해 높은 친화도를 가짐을 보여준다.
시험예 3. IL-5가 IL-5α 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린 IL-5 항체의 ELISA-기초 검정
재조합적으로 발현된 IL-5α 수용체 단백질의 세포외 영역에 IL-5가 결합하는 것을 차단하는 IL-5 항체의 능력을 식별하기 위해, IL-5(PBS 중 5 μg/ml)를 ELISA 플레이트 상에 코팅시키고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며; 액체를 제거하며, 200 μl/웰의, PBS로 희석된 5% 탈지유 차단 용액을 첨가하고, 차단을 위해 37℃ 인큐베이터에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 후, 차단 용액을 제거하며, 플레이트를 PBST 완충제(0.05% Tween-20을 포함하는 pH 7.4 PBS)로 5회 세척하고; 25 μl의, 비오틴 표지화 키트(Tojin Chemical, LK03)에 의해 표지된 10 μg/ml IL-5Rα(1% BSA 중)를 첨가한 다음, 25 μl의 구배-희석된 항체를 첨가하고(IL-5와의 결합을 위해 IL-5Rα와 경쟁한 항체), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트 내의 반응 용액을 제거하며, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 50 μl/웰의, 시료 희석 용액과 1:600으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다제 중합체(Sigma, S2438-250UG)를 첨가하며, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하며, 50 μl/웰의 TMB 발색원성 기질(KPL, 52-00-03)을 첨가하고, 실온에서 3분 내지 10분 동안 인큐베이션하였으며; 50 μl/웰의 1 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시키고; NOVOStar 마이크로타이터 판독기를 사용하여 흡광도 값을 450 nm에서 판독하며; IL-5가 IL-5Rα에 결합하는 것을 차단하는 IL-5 항체의 IC50 값을 계산하였다. 결과를 표 15에 나타낸다. 본 개시내용의 항체는 IL-5가 이의 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 수 있다.
Figure pct00053
시험예 4. IL-5가 IL-5 수용체에 결합하는 것을 차단하는 IL-5 항체의 FACS-기초 검정
세포 표면 상에서 IL-5 수용체를 차단할 수 있는 스크리닝된 IL-5 항체를 식별하기 위해, IL-5Rα/β의 2개의 수용체를 고도로 발현하는 CHOS 재조합 세포주를 제작하였다. 이 실험은, IL-5가 CHOS 세포주의 표면 상의 재조합 IL-5α/β 수용체에 결합하는 것을 각각 IL-5 항체가 차단할 수 있음을 실증하였다.
특정 방법은 하기와 같았다: 100 ng/ml G418 및 25 ng/ml 제오진(zeozin)을 포함하는 CD-CHO를 사용하여 CHO-S-IL-5Rα 및 β를 배양하였다. 세포 배양 동안, 농도는 3x106 세포/ml을 초과하지 않아야 한다. 양호한 조건에서 IL-5Rα/β-CHOS 세포를 원심분리하며(1000 rpm에서, 5분), PBS 중 10% FBS로 1회 세척하고, 세포를 카운팅하며, 세포 농도를 4x106 세포/ml로 조정하고, 25 μl를 수합하고 둥근-바닥 96-웰 플레이트 내로 첨가하였다. 시험될 항체를, 10% FBS를 포함하는 PBS 용액으로 희석시켰다. 초기 농도는 200 μg/ml였으며, 8개 구배 희석을 위해 1:10으로 희석시켰다. 비오틴 표지화 키트(Tojin Chemical, LK03)에 의해 표지된 25 μl의 100 ng/ml IL-5를 첨가하고, 각각의 농도에서 50 μl의 희석된 항체와 완전히 혼합하며, 세포가 첨가되었던 96-웰 플레이트 내로 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시료를 4℃(400 g, 5분)에서 원심분리하며, 상층액을 제거하고, 플레이트를 200 μl의 예비-냉각된 PBS로 원심분리에 의해 세척하며, 2회 반복하였고; 1:1333으로 희석된 PE-아비딘 2차 항체를 첨가하며, 암실에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하며, 4℃(400 g, 5분)에서 원심분리하고; 상층액을 제거하며, 200 μl의 예비-냉각된 PBS를 첨가하여 세포를 피펫팅하며; 플레이트를 4℃에서 원심분리에 의해 3회 동안 세척하고; 100μl의 PBS를 첨가하며, 플레이트를 기계 상에서 판독하고; IL-5가 IL-5Rα/β에 결합하는 것을 차단하는 IL-5 항체의 IC50 값을 형광 신호 값에 따라 계산하였다. 결과를 표 16 및 도 1에 나타낸다.
Figure pct00054
결과는, 항체 h1705-008, h1706-009, h1780-017, 및 h1779-014가 세포 표면 상에서 IL-5가 IL-5 수용체에 결합하는 것을 차단하는 강한 능력을 나타냄을 보여준다.
시험예 5. IL-5 항체는 TF1 세포의 IL-5 유도 증식을 저해한다
IL-5는 TF-1 세포의 증식을 유도할 수 있고, IL-5 항체는 IL-5가 TF-1 세포의 증식을 자극하는 것을 방지할 수 있다.
특히: TF-1 세포(ATCC, CRL-2003)를, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배치된 10% FBS 및 2 ng/mL rhGM-CSF(LinkBio, 카탈로그 번호 96-AF-300-03-20)를 포함하는 RPMI1640에서 배양하며, 세포 밀도는 1x106 세포/ml을 초과하지 않을 것이다. 항체를 검출하기 위해, 대수생장기에서의 세포를 PBS로 3회 세척하며 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하고; 세포 밀도를 RPMI1640(FBS: 2%, 재조합 인간 IL-5: 10 ng/ml)으로 6000개 세포/웰/90 μl로 조정하며; 시험될 10 μl의 구배-희석된 항체를 배양용 96-웰 플레이트에 첨가하고, 3일의 배양 후, 30 μl의 세포 역가를 첨가하며 검출을 위해 혼합하고, IC50을 판독물에 따라 계산하였다. 시험 결과를 하기 표 17에 나타낸다.
Figure pct00055
시험예 6. IL5-유도 호산구 접착을 저해하는 IL5 항체의 시험
IL5는 호산구의 분화, 성숙, 이동 및 활성화를 유도하여, 호흡기의 염증을 야기하고 천식을 유발할 수 있다. 이 실험은, IL-5 사이토카인이 호산구의 접착 및 활성화를 촉진할 수 있다는 원리에 기초한다. 호산구를 인간 말초 혈액으로부터 수집하고 정제하여, IL-5 경로에 미치는 IL-5 특이적 항체의 차단 효과를 시험하기 위해 그리고 시험관내에서 IL5-매개 호산구 접착에 미치는 IL-5 항체의 차단 효과를 검출하였다.
특히: 인간 말초 혈액을 2 mM EDTA를 포함하는 PBS로 5-배 희석시키며, Percoll™(1.088의 밀도 구배)을 사용하여 단핵구 및 과립구를 단리하였다. 과립구를 포함하는 적혈구 세포층을 조심스럽게 흡인하고, 적혈구 세포 용해 용액을 사용하여 적혈구 세포를 제거하였으며; 잔여 세포를 카운팅하고, CD16 항체와 함께 분리 자기 비드(Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-045-701)를 나누어서 첨가하며, 30분 동안 인큐베이션하고 자기 비드 컬럼을 통해 유동시키며, 컬럼을 통해 직접 유동하는 아집단(subpopulation)(주로 호산구)을 음성 선택에 의해 수집하였다. 단리된 호산구를 카운팅하고, IgG 항체로 예비-코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 약 1x104 세포로 첨가하며; 상이한 농도(10 μg/ml로부터 시작하여, 3-배 희석, 10개 농도점)의 인간 IL-5(20 ng/ml) 및 IL-5 항체 분자를 첨가하고; 세포 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배치하며 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 배양 플레이트를 꺼내고, 0.3% CTAB를 첨가하여 세포를 용해시키고, 마지막으로 발색을 위해 퍼옥시다제 반응 기질인 TMB를 첨가하며, OD450 흡수값을 마이크로타이터 플레이트 판독기로 판독하였다. IL-5 단독이 첨가된 웰에 대한 판독값은 최대 흡수값이었으며; IL-5 및 항체 제제가 없는 웰은 배경 대조군으로서 역할을 하고; 최대 흡착값에 비해 각각의 농도에서 항체 제제의 저해값을 계산하고 = (최대 흡착값-[항체 제제])/(최대 흡착값-배경 대조군 값) x 100%, IC50을 계산하였다. 결과를 표 18에 나타낸다:
Figure pct00056
결과는, 본 개시내용의 인간화 항체가 IL5-매개 호산구 접착을 저해하는 강한 능력을 나타냄을 보여준다.
시험예 7. Th2 사이토카인과의 인간화 IL-5 항체의 특이성 평가
IL-5는 Th2 사이토카인 중 하나였다. IL-5 항체가 IL-5만 특이적으로 표적화하고 다른 사이토카인과는 교차-반응하지 않음을 확증하기 위해, Fortebio를 사용하여, IL-5와 α 수용체를 공유하는 IL2(R&D, 202-IL-010/CF), IL4(R&D, 204-IL-050/CF), IL-5(R&D, 205-IL-025/CF), IFN감마, IL6(R&D, 7270-IL-025/CF), IL9(R&D, 209-IL-010/CF), IL10(R&D, 217-IL-025/CF), IL13(R&D, 213-ILB-025/CF), IL25(R&D, 8134-IL-025/CF), IL31(R&D, 2824-IL-010/CF), 및 IL3(203-IL-050/CF) 및 GMCSF(R&D, 215-GM-010/CF)를 포함하여 12개 유형의 Th2 및 관련 사이토카인을 검출하였다.
특히: 단백질 A 바이오센서(PALL Fortebio, 18-5010)를 사용하여 항체를 포착하였으며, 포착 신호를 기록한 다음, 40 nM의 각각의 사이토카인을 주사하고, 새로운 결합 신호를 기록하였다. 마지막으로, IL-5와의 결합 신호를 100%로서 정의하였다. 항체와의 다른 사이토카인의 결합 신호를 관찰하였으며, 결과를 도 2에 나타낸다.
결과는, 12개의 관련 사이토카인 중에서, 인간화 IL-5 항체 h1705-008 및 h1706-009만 IL-5에 특이적으로 결합하고 다른 Th2 사이토카인과 어떠한 교차-반응성도 갖지 않음을 보여준다.
생체내에서 활성의 생물학적 평가
시험예 8. OVA-유도 마우스 천식 모델에서 IL-5 항체의 효능의 평가
이 실험은, 오브알부민(OVA: ovalbumin) 에어로졸에 의해 유도되는 BALB/c 마우스 천식 모델에서 IL-5 항체의 효능을 평가하기 위한 기도 염증 반응 및 기도 재건(remodeling)에 기초하였다.
마우스를 체중에 따라 7개 그룹으로 무작위로 나누었으며, 각각의 그룹은 10 마리의 마우스였고: 정상 대조군(G1); 모델 그룹(G2); 시험될 각각의 항체의 2개 용량(10 mpk 및 2 mpk)에서 시험될 2개 항체의 치료 그룹 h1705-008(G3 및 G4) 및 h1706-009(G5 및 G6); 및 양성 항체 Hu39D10 대조군(G7, 10 mpk). 제1일 및 제14일에, 모든 마우스를 알레르기 용액의 복강내 주사에 의해 민감화시켰다. 제28일, 제29일, 및 제30일에, 6개 그룹의 마우스(제1 그룹 제외)를 에어로졸 OVA 시험감염(challenge) 용액에 의해 30분 동안 시험감염시켰다. 시험감염 전 2시간째에, 제2 그룹(G2)에게 포스페이트 완충제를 복강내 주사하며, 제3 그룹 내지 제7 그룹(G3 내지 G7)의 마우스에게 상이한 용량의 상이한 항체를 복강내 주사하였다(1일 1회, 3일 연속일 동안). 시험될 항체를 각각의 주사 전에 새롭게 제조하고, 항체의 제조로부터 30분 이내에 투여를 완료하였다. 제1 그룹(정상 대조군으로서)의 마우스를 PBS 에어로졸로 30분 동안 시험감염시키고, 시험감염 전 2시간째에 포스페이트 완충제를 1일 1회 3일 연속일 동안 복강내 주사하였다.
제31일에, WBP 시스템을 사용하여, 동물의 기도 과민반응성(hyperresponsiveness)을 시험하였다. 모든 동물이 2-배 증분(incremental) 농도(1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 mg/mL)의 메타콜린을 흡입하도록 에어로졸에 의해 투여하였으며, 상응하는 농도에서 호흡기 증강 일시정지(respiratory enhanced pause)의 값을 측정하였다.
제31일에, WBP 시스템에 의한 기도 반응성의 검출 후 1시간째에, 1.2 mm 직경의 기관 관(tracheal tube)을 기관(trachea) 내로 삽입하며 고정시키고, 폐 세척(lung lavage)을 매번 1% BSA 및 0.6 mM EDTA를 포함하는 0.8 ml 포스페이트 완충제로 2회 수행하였다. 세척액의 회수 부피를 기록하였다.
BALF를 4℃에서 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 사이토카인 분석을 위해 유지시켰다. 원심분리 후, 세포 카운팅을 위해 세포를 1.5 ml의 PBS(1% BSA 및 0.6 mM EDTA를 포함함)에 재현탁시켰다. 혈구 계산기 및 트립판 블루 염색 실험을 사용하여, BALF 중 세포의 총 수를 카운팅하였다. 세포를 슬라이드 상에 도말하고, Wright 염색 용액으로 1분 동안 염색한 다음, Giemsa로 7분 동안 염색하여, 호산구, 중성구, 대식세포 및 림프구를 구분하였다. 카운팅을 광 현미경(light microscope) 하에 수행하였다.
세척 후, 폐 조직을 수집하며, 10% 중성 포름알데하이드 용액으로 염색한 다음, 10% 중성 포름알데하이드 용액에서 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 포매시키며, 트리밍(trim)하고, H&E에 의해 염색하며, 채점하였다. 시험 결과를 도 3, 도 4a 및 도 4b에 나타낸다.
결과는, 본 개시내용의 항체 분자 h1705-008 및 h1706-009가 폐 기능을 용량-의존적 모드로 유의하게 향상시킬 수 있는 한편, 고용량(10 mpk)의 양성 화합물은 폐 기능을 향상시킬 수 없음을 보여준다(도 3 참조). 한편, 2개의 항체는 동일한 용량(10 mpk)에서 호산구의 수준 및 점막의 두께를 유의하게 감소시키고, 양성 항체보다 호산구를 감소시키는 더 강한 능력을 보여준다(도 4a 및 도 4b 참조). 동일한 유형의 마우스 천식 모델에서, 반복 실험은 또한, 1 mg/ml h1705-008, h1706-009 및 h1780-017이 양성 항체보다 BalF에서 호산구의 수준을 유의하게 감소시킴을 확증하였다(도 4c 참조).
시험예 9. 외인성 인간 IL-5에 의해 유도되는 기니 피그 급성 천식 모델에서 IL-5 항체의 생체내 효능의 평가
이 실험에서, 수컷 기니 피그를 선택하여, 인간 IL-5에 의해 유도되는 급성 천식 모델을 확립하며, 인간 IL-5에 의해 유도되는 기니 피그 폐의 기관지 세척액(BALF) 중 호산구의 증가에 미치는 본 개시내용의 5개 IL-5 인간화 mAb의 저해 효과를 평가하였으며; hu39D10을 양성 항체로서 사용하였다. 기니 피그를 9개 그룹으로 나누었으며, 각각은 8 내지 10 마리의 동물을 포함하였다: 정상 대조군, 모델 그룹, hu39D10(1 mg/kg) 그룹, h1705-008(1 mg/kg) 그룹, h1706-009(1 mg/kg) 그룹, h1780-017(1 mg/kg) 그룹, h1773-007(1 mg/kg) 그룹 및 h1779-014(1 mg/kg) 그룹. 자극(irritation)을 위해 제1일에 모델 그룹 및 투여 그룹의 기니 피그에게 100μl의 인간 IL5(5 μg의 IL5 항원을 포함함)를 각각 기관(tracheally) 주사하였으며; 정상 대조군에게 PBS를 기관 주사하였다. 투여 그룹에게 상기 기재된 바와 같은 1 mg/kg IL5 단일클론 항체를, 자극 전 2시간째에 5 ml/kg의 투여 부피로 복강내 주사하며; 모델 그룹에게 상응하는 IgG 항체를 투여하고; 정상 대조군에게 PBS 용매를 복강내 투여하였다. 기관 주사 후 24시간째에 기니 피그를 마취시켜, 폐 기관지 세척액을 추출하였다. 세포 농도를 5^106/ml로 조정하였다. 15 μl를 슬라이드 상에 떨어뜨리고, 고정을 위해 건조하였으며; HE 염색을 수행하고, 총 세포 및 호산구의 수를 400-배 현미경 하에 카운팅하고, 호산구의 백분율을 계산하였다. 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내며, 이는 본 개시내용의 5개 인간화 항체가 BALF 중 호산구의 수준을 유의하게 감소시킴을 나타낸다.
제제에서 성분의 선택 및 안정성 평가
항체의 약학적 조성물(제제)에 대한 예시적인 제조 과정:
단계 1: 소정량의 정제된 항-IL-5 항체 용액을 수합하였으며, 무항체(antibody-free) 완충제(예컨대, 30 mM, pH 5.5 아세트산-소듐 아세테이트 완충제)를 사용하여 용매-교환을 대체하고(바람직하게는 초여과에 의해); 부피의 적어도 6-배를 초여과 막에 의해 교환하며, 단백질을 약 120 mg/mL까지 농축시켰다. 소정 부피의 수크로스 스탁 용액을 첨가하고 혼합하여, 72 mg/mL의 최종 농도의 수크로스를 얻었다. 소정 부피의 폴리소르베이트 80 스탁 용액을 첨가하고 혼합하여, 0.4 mg/mL의 최종 농도의 폴리소르베이트 80을 얻었다. 10 mM pH 5.5 아세트산-소듐 아세테이트 완충제를 첨가하여 소정의 부피에 도달하여, 100 mg/mL의 단백질 농도를 초래하였다(시험될 다른 제제 또는 안정한 제제를 유사한 단계에 따라 제조하였음).
생성물을 여과한 다음, 병원성 제제(pathogenic agent)-무함유(free)에 대해 중앙-제어 시료화(central-control sampling)에 의해 시험하였다. 스탁 용액을 0.22 μm PVDF 필터에 통과시키고, 여과물을 수집하였다.
단계 2: 부피를 1.2 ml로 조정하며, 여과물을 스토퍼(stopper)가 적용되는 2 ml 바이얼에 로딩하고, 중앙-제어 시료화를 로딩 시작 시, 중간에, 그리고 종료 시에 수행하여, 로딩 부피의 차이를 검출하였다.
단계 3: 캡핑 기계를 시작시켜, 알루미늄 캡을 적용하고 캡핑을 수행하였다.
단계 4: 시각적 조사를 수행하여, 생성물이 어떠한 결함, 예컨대 부정확한 로딩을 갖지 않음을 확인하였다. 바이얼 표지를 인쇄하고 부착하였으며; 카툰(carton) 표지를 인쇄하고; 카툰을 접고; 패킹(packing)하며; 박스 표지를 부착하였다.
시험예 10. 완충제 시스템의 스크리닝
100 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 h1705-008 제제를 5.0 내지 6.5의 pH에서 일련의 완충제에서 제조하였으며, 진탕 시료는 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함하고, 다른 시료는 0.05 mg/mL PS80을 포함하였다. 완충제 시스템은 하기와 같았다: 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트(AA) pH 5.0, 5.5; 10 mM 숙신산-소듐 숙시네이트(SA) pH 5.0, 5.5, 6.0; 10 mM 시트르산-소듐 시트레이트(CA) pH 5.5, 6.0, 6.5; 10 mM 히스티딘-하이드로클로라이드(His) pH 5.5, 6.0, 6.5; 10 mM 포스페이트(PB) pH 6.0, 6.5. 각각의 제제를 여과하며, 로딩하고, 스토퍼로 적용하며, 캡핑하였다. 시료를 강제 분해 실험을 받게 하였으며; 외양, SEC, iCIEF는 평가 지표로서 역할을 하였다.
결과를 표 19에 나타낸다. 외양 데이터는, 시료가 진탕(300 rpm, 25℃)을 경험하였고 40℃에서의 시료는 상이한 정도의 입자 형성을 보여줌을 나타낸다. 전반적으로, pH가 더 낮을 때 외양은 더 양호하고, 완충제 시스템 아세트산-소듐 아세테이트 및 숙신산-소듐 숙시네이트는 더 양호하며; SEC 데이터는, AA pH 5.5 그룹이 40℃에서 약간 더 양호함을 보여주고; iCIEF 데이터는, AA pH 5.5, His pH 5.5, CA pH 6.5 그룹이 40℃에서 약간 더 양호함을 보여주며; 물리적 및 화학적 안정성의 포괄적인 고려 하에, AA pH 5.5가 바람직하다.
Figure pct00057
Figure pct00058
시험예 11. 제제 내 부형제의 스크리닝
100 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 h1705-008 제제를, 하기 상이한 유형의 부형제를 포함하는 10 mM SA(pH 5.0) 완충제에서 제조하였다. 특히, 부형제는 하기와 같았다:
1) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 20(PS20)
2) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80(PS80)
3) 50 mg/mL 수크로스 + 0.1 mg/mL PS80
4) 50 mg/mL 트레할로스 + 0.1 mg/mL PS80
5) 50 mg/mL 만니톨 + 0.1 mg/mL PS80
6) 50 mg/mL 소르비톨 + 0.1 mg/mL PS80
7) 8 mg/ml 아르기닌(Arg) + 0.1 mg/mL PS80
8) 8 mg/ml 라이신(Lys) + 0.1 mg/mL PS80
9) 8 mg/ml 글리신(Gly) + 0.1 mg/mL PS80
10) 8 mg/ml 메티오닌(Met) + 0.1 mg/mL PS80
11) 8 mg/ml 프롤린(Pro) + 0.1 mg/mL PS80
12) 8 mg/ml 소듐 클로라이드(NaCl) + 0.1 mg/mL PS80.
각각의 제제를 사용을 위해 여과하며, 로딩하고, 스토퍼로 적용하며, 캡핑하였다. 시료를 40℃에서 강제 분해 실험을 받게 하였으며, 결과는 (표 20): 시료의 각각의 그룹 중에서 SEC, CE, 및 iCIEF의 시험 결과에서 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않으며, Arg/Lys/NaCl 그룹이 더 불량한 외양을 갖고, 다른 그룹 중에서 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않음을 보여준다. 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 프롤린, 및 메티오닌은 단백질 안정성에 선호할 만한 효과를 갖는다.
Figure pct00059
시험예 12. 계면활성제의 스크리닝
10 mM SA pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml PS20 또는 PS80을 포함하는 h1705-008 제제를 100 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였다.
시료를 4℃에서 배치하여, 안정성을 조사하였다. 결과를 표 21에 나타낸다. 결과는, PS80 그룹이 투명한 외양을 나타내고 4℃에서 4개월 동안 SEC, CE, 및 iCIEF에서 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않음을 보여주며, 이는 선호할 만한 안정성을 나타내는 반면; 다량의 입자를 PS20 그룹에서 관찰한다. 따라서, PS80은 PS20보다 더 양호하다. 게다가, 제제 내로의 PS80의 첨가는 h1705-008에 더 양호한 안정화 효과를 가지며, 제제의 안정성이 더 양호한 것으로 보여질 수 있다.
Figure pct00060
시험예 13. DOE 제제의 설계 및 스크리닝
DOE(Design of expriment)를 변수로서 10 mM 아세테이트 완충제(AA)의 pH, 단백질 농도 및 Tween 농도로 수행하였으며; 일련의 제제를 하기 인자 및 수준에 기초하여 설계하였다: pH는 5.0 내지 5.8이며, PS80의 농도는 0.2 내지 0.6 mg/mL이고, 항체 h1705-008의 농도는 80 내지 120 mg/mL이며; 제제를 표 22에 나타낸다. 시료를 40℃의 고온에서 강제 분해를 받게 하였다. 외양, SEC, 비-환원성 CE, 및 iCIEF를 평가 지표로서 사용하였다. 결과를 표 23에 나타낸다.
Figure pct00061
Figure pct00062
결과는, 각각의 제제의 외양이 투명함을 보여주며; SEC, CE 및 iCIEF는 허용 가능한 범위 내에서 각각 <2%, <2% 및 약 14%만큼 저하되고; 제제의 안정성은 선호할 만하며; 따라서, 제제는 80-120 mg/ml의 단백질 농도, 0.2-0.6 mg/ml PS80, pH 5.0-5.8을 포함한다. 최적 제제는, 100 mg/ml 단백질, 0.4 mg/ml PS80, pH 5.5이다.
시험예 14. 안정성 시험
10 mM AA pH 5.5, 70 mg/ml 수크로스, 및 0.4 mg/ml PS80을 포함하는 h1705-008 제제를 100 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였으며; 시료를 4℃ 및 25℃에서 안정성 조사를 받게 하였다. 결과를 표 24에 나타낸다.
결과는, 고온 조건 하에, SEC, CE, 및 iCIEF가 h1705-008 제제에서 약간 저하되지만, 이러한 저하는 허용 가능한 범위 내에 있음을 보여주고; 다른 조건 하에 모든 지표에서 어떠한 유의한 변화도 존재하지 않는다. 제제는 선호할 만한 안정성을 갖고, 4℃에서 6개월 내에 h1705-008의 안정성을 보장할 수 있다.
Figure pct00063
시험예 15. 이온 강도의 스크리닝
100 mg/mL의 단백질 농도, 70 mg/mL 수크로스 및 0.4 mg/mL PS80을 포함하는 h1705-008 제제를, 상이한 이온 강도의 (소듐) 아세테이트 완충제에서 제조하였으며; 교환에 사용되는 완충제의 pH 및 최종 제제의 pH를 측정하였다. 결과를 표 25에 나타낸다. 결과는, 이온 강도가 높을수록, pH 드리프트(drift)가 낮아짐을 보여준다. 이온 강도가 30 mM일 때, pH 드리프트는 0.1 미만이다.
Figure pct00064
시험예 16. 당류의 농도의 스크리닝
100 mg/mL의 단백질 농도, 30 mM AA pH 5.5, 0.4 mg/ml PS80을 포함하는 h1705-008 제제를, 상이한 농도의 수크로스를 포함하는 하기 완충제에서 제조하였다. 삼투압을 결정하였다. 결과를 표 26에 나타낸다.
결과는, 당류 농도가 70 내지 75 mg/ml일 때 삼투압이 290 내지 310 mosm의 최적 등장성 범위에 있음을 보여주며; 70 mg/ml 및 73 mg/ml 그룹의 삼투압 데이터에 따르면, 당류 농도가 72 mg/ml일 때 삼투압은 약 300 mosm의 최상의 값에 도달한다.
Figure pct00065
시험예 17. 제제의 안정성 시험
100 mg/mL의 단백질 농도, 30 mM AA pH 5.5, 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml PS80을 포함하는 h1705-008 제제를 제조하여, 4℃ 및 25℃에서 안정성을 조사하였다. 결과를 표 27에 나타낸다. 결과는, SEC, CE 및 IEC가 고온 조건 하에 h1705-008 제제에서 약간 저하되지만, 이러한 저하는 허용 가능한 범위 내에 있음을 보여주고; 4℃ 조건에서 모든 지표에서 어떠한 유의한 변화도 존재하지 않으며, 이는 제제가 선호할 만한 안정성을 가짐을 나타낸다.
Figure pct00066
시험예 18. 추가의 선택적인 제제
게다가, 본 개시내용은 또한, 항-IL-5 항체 약학적 제제를 위한 추가 제제를 제공하며, 이는
(1) 1 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 10 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(2) 100 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 20 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(3) 120 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 40 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(4) 100 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 80 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.0인 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(5) 80 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 75 mg/ml 수크로스, 0.6 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.4인 20 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(6) 100 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(7) 90 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 74 mg/ml 수크로스, 0.5 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.6인 25 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(8) 90 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 76 mg/ml 수크로스, 0.3 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.4인 35 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(9) 80 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.6인 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(10) 100 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 40 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제;
(11) 100 mg/ml 항-IL-5 항체(h1705-008), 80 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 pH 5.5인 40 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제
를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
실험 결과는, 상기 기재된 바와 같은 IL-5 항체 제제가 선호할 만한 안정성을 갖고, IL-5 항체 제제의 제조에 적용될 수 있음을 보여준다.
시험예 19. 항-IL-5 항체 제제의 동결건조
72 mg/ml 수크로스, 0.4 mg/ml 폴리소르베이트 80 및 100 mg/ml 농도의 항-IL-5 항체를 포함하는 h1705-008 항체 제제를 30 mM 아세트산-소듐 아세테이트 완충제에서 pH 5.5에서 제조하였다. 항체를 2.15 mL/바이얼에서 6 mL 바이얼 내로 로딩하고, 동결건조를 위해 동결건조 챔버에 배치하였다. 동결건조 과정은 예비-냉동, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 동결건조 과정이 지났을 때, 바이얼을 진공 처리하고, 스토퍼로 적용하였다. 재구성된 시료를 동결건조 전의 대응물과 비교하였다. 결과는, 재구성된 용액이 액체 제제의 성능으로서 선호할 만한 성능을 유지할 수 있음을 보여준다.
Figure pct00067
Sequence listing <110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD. SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ANTIBODY AGAINST IL-5 AND USE THEREOF <130> 702030CPCT <160> 92 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid sequence for human IL-5 with His-tag (rhIL-5-his) <400> 1 Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu 20 25 30 Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu 35 40 45 Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr 50 55 60 Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln 65 70 75 80 Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys 85 90 95 Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val 100 105 110 Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr 115 120 125 Glu Trp Ile Ile Glu Ser His His His His His His 130 135 140 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid sequence for cyno IL-5 with His-tag <400> 2 Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Ala Ser Ala Leu Val Lys Glu 20 25 30 Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu 35 40 45 Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr 50 55 60 Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln 65 70 75 80 Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys 85 90 95 Tyr Ile Gly Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val 100 105 110 Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr 115 120 125 Glu Trp Ile Ile Glu Ser His His His His His His 130 135 140 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid sequence for mouse IL-5 with His-tag <400> 3 Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu 1 5 10 15 Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro 20 25 30 Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln 35 40 45 Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu 50 55 60 Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln 65 70 75 80 Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp 85 90 95 Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu 100 105 110 Gly His His His His His His 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid sequence for rat IL-5 with His-tag <400> 4 Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ile Gln Leu 1 5 10 15 Ser Thr His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro 20 25 30 Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln 35 40 45 Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu 50 55 60 Ile Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln 65 70 75 80 Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Lys Thr Arg His Phe Leu Asp 85 90 95 Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu 100 105 110 Val His His His His His His 115 <210> 5 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid sequence for human IL-5 alpha receptor fused to human Fc fragment <400> 5 Asp Leu Leu Pro Asp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Val Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu Gln Trp Lys Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg Asn Val Asn Leu Glu Tyr Gln Val Lys 35 40 45 Ile Asn Ala Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Glu Thr Arg Ile Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Cys Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser Ala Ser Val Arg Thr 65 70 75 80 Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser Ser Trp Ala Ser Ala 85 90 95 Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Ile Val Asn Leu 100 105 110 Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asn Tyr Ser Arg Leu Arg Ser 115 120 125 Tyr Gln Val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu Val Gly Thr Asp Ala Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ser Trp Thr Glu 145 150 155 160 Glu Cys Gln Glu Tyr Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg Asn Ile Ala Cys 165 170 175 Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg Asp Trp Leu Ala 180 185 190 Val Leu Val Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile Arg Pro Phe Asp 195 200 205 Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn Pro Pro Leu Asn 210 215 220 Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile Gln Trp Glu Lys 225 230 235 240 Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr Glu Val Lys Ile 245 250 255 His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys Leu Met Thr Asn 260 265 270 Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr Asp Val Gln Val 275 280 285 Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly Leu Trp Ser Glu 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His Lys Pro Leu Arg 305 310 315 320 Glu Trp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 325 330 335 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 340 345 350 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 355 360 365 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 370 375 380 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 385 390 395 400 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 405 410 415 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 420 425 430 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 435 440 445 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 450 455 460 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 465 470 475 480 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 485 490 495 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 500 505 510 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 515 520 525 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 530 535 540 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 545 550 555 560 <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1705 murine heavy chain variable region <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gln Thr Leu Arg Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1705 murine light chain variable region <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ile Ala Arg Ser Pro Lys Leu Val Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln Asp Lys Glu Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1706 murine heavy chain variable region <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Ser Ile Asn Tyr Glu Gly Asn Ser Ala Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Thr Leu Arg Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1706 murine light chain variable region <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ser Pro Lys Leu Met Ile 35 40 45 His Ser Ala Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Pro Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gln His Lys Gln Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1780 murine heavy chain variable region <400> 10 Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Leu Ile His Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Arg Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1780 murine light chain variable region <400> 11 Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Gly Leu Thr Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1773 murine heavy chain variable region <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Leu Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Pro Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1773 murine light chain variable region <400> 13 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu 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Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> The sequence for mAb1779 murine light chain variable region <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Phe Phe Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1705 HCDR1 <400> 16 His Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1705 HCDR2 <400> 17 Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1705 HCDR3 <400> 18 Gln Thr Leu 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<213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1780 LCDR3 <400> 33 Gln Gln Asn Trp Asn Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 HCDR1 <400> 34 Asn Thr Tyr Ile His 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 HCDR2 <400> 35 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 HCDR3 <400> 36 Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 LCDR1 <400> 37 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 LCDR2 <400> 38 Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1773 LCDR3 <400> 39 Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> 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190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 91 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> h1779-014 heavy chain <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 245 250 255 Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 92 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> h1779-014 light chain <400> 92 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (27)

  1. 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 완충제 및 계면활성제를 포함하는 약학적 조성물로서, 완충제는 아세트산-소듐 아세테이트, 숙신산-소듐 숙시네이트, 히스티딘-하이드로클로라이드 및 시트르산-소듐 시트레이트 완충제, 바람직하게는 아세트산-소듐 아세테이트 또는 숙신산-소듐 숙시네이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나이며; 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 i) 내지 vi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학적 조성물:
    i) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16, 17 및 18로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 19, 20 및 21로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    ii) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 22, 23 및 24로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 25, 26 및 27로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    iii) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28, 29 및 30으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 31, 32 및 33으로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    iv) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34, 35 및 36으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 37, 38 및 39로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    v) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 40, 41 및 42로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 43, 44 및 45로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    vi) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34, 82 및 36으로 각각 표시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 37, 38 및 39로 각각 표시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.8, 가장 바람직하게는 약 5.5인, 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완충제의 농도는 약 10 mM 내지 약 40 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 30 mM인, 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 100 mg/ml인, 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80인, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 폴리소르베이트 80의 농도는 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.4 mg/ml인, 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제를 추가로 포함하며, 안정화제는 당류(saccharide) 또는 아미노산이고, 당류는 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 소르비톨, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되며; 아미노산은 글리신, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 당류의 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 80 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 75 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 72 mg/ml인, 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 아미노산의 농도는 약 8 mg/ml인, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성요소를 포함하는, 약학적 조성물:
    약 1 mg/ml 내지 약 120 mg/ml의 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편;
    약 10 mM 내지 약 40 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.0 내지 약 6.5인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제; 및
    약 0.1 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 80 mg/ml 내지 약 120 mg/ml의 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
    약 10 mM 내지 약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.0 내지 약 5.8인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제,
    약 0.2 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및
    약 70 mg/ml 내지 약 80 mg/ml의 수크로스
    를 포함하고,
    바람직하게는, 약학적 조성물은
    약 100 mg/ml의 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
    약 30 mM의 아세트산-소듐 아세테이트 완충제로서, pH는 약 5.5인, 아세트산-소듐 아세테이트 완충제,
    약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및
    약 72 mg/ml의 수크로스
    를 포함하는, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린(murine) 항체, 키메라(chimeric) 항체 또는 인간화(humanized) 항체인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 인간화 항-IL-5 항체는 SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 또는 75로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 변이체는 SEQ ID NO: 49, 57, 63, 69 또는 75로 각각 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이(back-mutation)를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 변이체는 하기 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 변이체인, 약학적 조성물:
    i) SEQ ID NO: 49로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 S49T, V93T 및 K98S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    ii) SEQ ID NO: 57로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 S49T, V93T 및 K98T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    iii) SEQ ID NO: 63으로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 R38K, M48I, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K 및 L83F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    iv) SEQ ID NO: 69로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 F29I, R38K, V48I, R72A, 및 T97F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이, 및/또는 HCDR2에 N55V 돌연변이를 포함하는 변이체; 또는
    v) SEQ ID NO: 75로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F 및 D89E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체.
  15. 제14항에 있어서, 인간화 항-IL-5 항체는
    SEQ ID NO: 50 또는 51로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 58 또는 59로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 64, 65 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 70 또는 71로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 76, 77, 78 및 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 인간화 항-IL-5 항체는 SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 또는 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하며; 변이체는 SEQ ID NO: 46, 54, 60, 67 또는 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이를 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 변이체는 하기 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 변이체인, 약학적 조성물:
    i) SEQ ID NO: 46으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y 및 Y87F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    ii) SEQ ID NO: 54로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, L47M, F71Y 및 Y87F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    iii) SEQ ID NO: 60으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 E1D, I2T, I57V, V84T 및 Y86F로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체;
    iv) SEQ ID NO: 67로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 M4L, A42S, L45P 및 L46W로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체; 또는
    v) SEQ ID NO: 72로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 A43S, I48V 및 F71Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 포함하는 변이체.
  18. 제17항에 있어서, 인간화 항-IL-5 항체는
    SEQ ID NO: 47 또는 48로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 55 또는 56으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 61 또는 62로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 68로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    SEQ ID NO: 73 또는 74로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 약학적 조성물.
  19. 제12항에 있어서, 인간화 항-IL-5 항체는
    i) SEQ ID NO: 49, 50 및 51 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 49, 50 및 51 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 46, 47 및 48 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 46, 47 및 48 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
    ii) SEQ ID NO: 57, 58 및 59 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 57, 58 및 59 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 54, 55 및 56 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 54, 55 및 56 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
    iii) SEQ ID NO: 63, 64, 65 및 66 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 63, 64, 65 및 66 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 60, 61 및 62 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 60, 61 및 62 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;
    iv) SEQ ID NO: 69, 70 및 71 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 69, 70 및 71 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 67 및 68 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 67 및 68 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
    v) SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 및 79 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78 및 79 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 72, 73 및 74 중 임의의 하나로 표시된 바와 같거나 SEQ ID NO: 72, 73 및 74 중 임의의 하나와 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하며,
    바람직하게는, 인간화 항-IL-5 항체는
    a) SEQ ID NO: 51로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 47로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역;
    b) SEQ ID NO: 65로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 62로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
    c) SEQ ID NO: 58로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 56으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역;
    d) SEQ ID NO: 71로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 68로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    e) SEQ ID NO: 79로 표시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 73으로 표시된 바와 같은 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-5 항체는 인간 항체 불변 영역(들)을 포함하며; 바람직하게는
    SEQ ID NO: 52로 표시된 바와 같은 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 SEQ ID NO: 53으로 표시된 바와 같은 인간 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 항-IL-5 항체는
    i) SEQ ID NO: 83으로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 84로 표시된 바와 같은 경쇄;
    ii) SEQ ID NO: 85로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 86으로 표시된 바와 같은 경쇄;
    iii) SEQ ID NO: 87로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 88로 표시된 바와 같은 경쇄;
    iv) SEQ ID NO: 89로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 90으로 표시된 바와 같은 경쇄; 또는
    v) SEQ ID NO: 91로 표시된 바와 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 92로 표시된 바와 같은 경쇄
    를 포함하는, 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-5 항체는 인간 IL-5에 결합하기 위해 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 제조 방법으로서, 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 스탁(stock) 용액을 완충제로 대체하는 단계를 포함하고, 완충제는 바람직하게는 아세트산-소듐 아세테이트 완충제인, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 동결건조에 의해 수득되는, 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제제로서, 바람직하게는, 동결건조는 예비-냉동, 1차 건조 및 2차 건조를 연속적으로 수행하는 단계를 포함하는, 제제.
  25. 항-IL-5 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재구성된 용액(reconstituted solution)으로서, 재구성된 용액은 제24항에 따른 동결건조된 제제의 재구성에 의해 수득되는, 재구성된 용액.
  26. 용기를 포함하는 물품(article)으로서, 용기는 제1항 내지 제22항 중 임의의 하나에 따른 약학적 조성물, 또는 제24항에 따른 동결건조된 제제, 또는 제25항에 따른 재구성된 용액을 포함하는, 물품.
  27. IL-5 매개 질환의 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제24항에 따른 동결건조된 제제, 또는 제25항에 따른 재구성된 용액, 또는 제26항에 따른 물품을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
    IL-5 매개 질환은 바람직하게는 천식(asthma), 만성 폐렴(chronic pneumonia), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 질환(allergic bronchopulmonary aspergillosis disease), 호산구증가증(eosinophilia), 척-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 간헐적 맥관부종(intermittent angioedema), 호산구성 근육통 증후군(eosinophilic myalgia syndrome), 호산구성 위염(eosinophilic gastroenteritis), 벌레 감염(worm infection), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 비용종(nasal polyp), 뢰플러 증후군(Loeffler's syndrome), 두드러기(urticaria), 과호산구성 기관지염(hypereosinophilic bronchitis), 결절 동맥염(nodular arteritis), 부비동염(sinusitis), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 알레르기성 호산구성 식도염(allergic eosinophilic esophagitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 자궁내막증(endometriosis) 및 스테로이드-의존적 호산구성 기관지염(steroid-dependent eosinophilic bronchitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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