KR20210053294A

KR20210053294A - 항-tim3 항체 제약 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210053294A
Application number: KR1020217006876A
Authority: KR
Inventors: 첸민 티안; 하오 리; 쉰 리우; 주오샤오 카오
Original assignee: 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2021-05-11
Also published as: EP3848049A1; EP3848049A4; CN112543647B; US20210261663A1; JP2022513553A; TW202009241A; CA3110002A1; AU2019330702A1; CN112543647A; WO2020043095A1

Abstract

TIM3 항체 제약 조성물 및 이의 용도가 본 출원에 개시된다. 특히, 제약 조성물은 완충액에 TIM3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, 제약 조성물은 당류 및 비 이온성 계면활성제를 더 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 양호한 안정성을 갖는다.

Description

항-TIM3 항체 제약 조성물 및 이의 용도

본 개시는 제약 제형의 분야에 속하며, 구체적으로 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물, 및 항암 의약으로서의 이의 용도에 관한 것이다.

본 배경기술의 기재 내용은 단지 본 발명에 관련된 배경 정보를 제공하는 것으로, 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아니다.

T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 분자 3(TIM-3; T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 3)은 A형 간염 바이러스 세포 수용체 2(HAVCR-2; hepatitis A virus cellular receptor 2)로도 지칭된다. TIM-3은 I형 막 표면 단백질로, TIM 패밀리의 구성원에 속한다. 인간 TIM-3 분자는 신호 펩티드, Ig 가변 영역(IgV 영역), Ser/Thr 풍부 뮤신 영역, 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함하는 301개의 아미노산으로 구성된다. 인간 TIM-3은 뮤린(murine) TIM-3과 63%의 상동성을 공유한다.

TIM-3은 IFN-γ 분비 T 헬퍼 세포(Th1 및 Th17), T 조절 세포(Treg), 수지상 세포(DC), 단핵구, 비만 세포, NK 세포, 종양 침윤 림프구(TIL)의 표면에서 선택적으로 발현된다(예를 들어, 문헌[Clayton et al., J. Immunol., 192(2): 782-791 (2014)]; 문헌[Jones et al., J. Exp. Med., 205: 2763-2779 (2008)] 참조). 현재 알려진 TIM-3 수용체는 포스파티딜 세린 갈렉틴-9(갈렉틴-9, Gal-9), 고 이동군 단백질 1(high mobility group protein 1, HMGB1) 및 암배아 항원 세포 접착 분자 1(CEACAM1; carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1)을 포함한다.

TIM-3은 여러 가지 방식으로 면역계의 기능을 조절할 수 있다. TIM-3은 Th1 세포 표면의 리간드 Gal-9에 결합하여 Th1 세포 반응을 하향 조절하고 Th1 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. TIM-3은 자가면역 및 동종이계(allogeneic) 면역 질환(예컨대, 전신 홍반 루프스, 천식) 및 면역 관용에서 중요한 역할을 한다. 단핵구-대식세포에 의해 발현된 TIM-3은 포스파티딜 세린과 상호 작용하여 아폽토시스성 세포의 식세포 활동을 촉진하고, 종양 침윤 DC에서, TIM-3은 리간드 HMGB1에 결합하여 핵산의 정확한 수송을 억제하여, 핵산 면역 반응을 억제하고 면역 회피에 관여한다. TIM-3은 면역 세포에서 발현될 뿐만 아니라, 난소암, 수막종, 및 흑색종과 같은 종양 세포에서도 과발현되며, 종양 성장을 직접적으로 촉진한다. TIM-3의 발현을 하향 조절하면 HeLa 세포의 침입과 전이를 현저히 억제할 수 있다. TIM-3의 과발현은 폐암, 위암, 전립선암 및 자궁경부암의 불량한 예후와 밀접하게 관련되어 있다. 혈액 종양에서, TIM-3은 급성 골수성 백혈병의 백혈병 줄기 세포와 MDS 환자의 조혈 줄기 세포에서 과발현되고, TIM-3+ 조혈 줄기 세포는 악성 생물학적 특성(낮은 분화, 낮은 아폽토시스 및 높은 증식)을 갖는다. 따라서, TIM-3의 활성을 억제하여(예컨대, TIM-3 항체) 선천적 면역계의 기능을 개선하는 것이 종양 치료를 위한 새로운 방법이 될 것으로 예상된다(예를 들어, 문헌[Ngiow et al., Cancer Res., 71(21): 1-5 (2011)]; 문헌[Guo et al., Journal of Translational Medicine, 11: 215 (2013)]; 및 문헌[Ngiow et al., Cancer Res., 71(21): 6567-6571 (2011)] 참조).

항체 의약의 안정성은 항체의 약물로서의 가능성(drugability)에 영향을 미치는 핵심 인자 중 하나이다. 그 중에서도, 아스파라긴(Asn)과 글루타민(Gln)의 비 효소적 탈아미드화는 항체를 불안정하고 불균일하게 만들 수 있으며, 항체 분자의 일반적인 화학적 분해 경로 중 하나이다. 여러 IgG1 서브타입 항체가 CDR 영역의 아미노산의 탈아미드화 및 이성질화로 인해 생물학적 활성을 상실하였음이 문헌에 보고된 바 있다. Huang 등은 IgG1 단클론 항체의 중쇄 가변 영역 2(CDR2)에 위치한 Asn55의 탈아미드화가 항체의 결합 활성을 현저히 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 항체 개발 과정에서, 해당 아미노산을 회피하거나 돌연변이시켜 항체의 탈아미드화를 줄여 항체의 안정성과 생체이용률을 증가시켜야 한다.

현재, WO2011159877, WO2013006490, WO2015117002, WO2016144803, WO2016161270 및 US20150218274와 같은 TIM-3 항체에 관한 특허 보고가 있다. 그러나 국내 또는 국외에서, 임상 연구 단계에 있는 TIM-3 항체는 2종뿐이다. 다른 항체 의약은 아직 발견 및 연구 단계에 있으며, TIM-3 항체가 임상적인 적용에 들어간 적이 없다. 따라서, TIM-3 관련 질환의 연구 및 치료 적용을 위하여 더 높은 활성, 높은 친화도 및 높은 안정성을 갖는 TIM-3 항체를 추가로 개발할 필요가 있다.

본 개시는 제조 및 투여에 더욱 유리한, 안정적인 효능을 갖는 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 개시는 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 완충액을 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 완충액은 아세트산염, 히스티딘염, 숙신산염, 인산염, 시트르산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 완충액은 아세트산염 완충액(acetate buffer) 및 히스티딘염 완충액(histidine salt buffer)이다.

일부 구현예에서, 제약 조성물의 아세트산염 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액이고, 히스티딘염 완충액은 히스티딘-아세트산 완충액 또는 히스티딘-염산 완충액이고, 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산나트륨 완충액이고, 인산염 완충액은 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액이고, 시트르산염 완충액은 시트르산-시트르산 나트륨이고, 바람직하게는 히스티딘-염산, 아세트산-아세트산 나트륨 또는 히스티딘-아세트산 완충액이고, 가장 바람직하게는 히스티딘-아세트산 완충액이다.

일부 구현예에서, 제약 조성물의 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 20 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 20 mM이다. 비제한적인 예로서 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, 30 mM을 포함하고, 가장 바람직하게는 약 10 mM이다.

일부 구현예에서, 제약 조성물의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 50 mg/ml 내지 60 mg/ml이다. 비제한적인 예로서 1 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml, 60 mg/m, 70 mg/m, 80 mg/m, 90 mg/m, 100 mg/ml을 포함하고, 가장 바람직하게는 50 mg/ml이다.

일부 구현예에서, 제약 조성물의 완충액의 pH 값은 약 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.2 내지 5.8, 또는 바람직하게는 약 5.5 내지 6.0, 가장 바람직하게는 5.5이다. 비제한적인 예로서 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0 및 약 6.5를 포함한다.

나아가, 일부 구현예에서, 위에 기술된 제약 조성물은 당류(saccharide)도 포함한다. 본 개시의 "당류"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당류 알코올, 환원 당류, 비 환원 당류 등을 포함한, 통상적인 조성 (CH₂O)_n 및 이의 유도체를 포함한다. 당류는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세롤, 에리스리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 멜리트리오스, 만니노트리오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 이소말툴로스 등으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 당류는 비 환원 이당류이고, 더욱 바람직하게는 트레할로스 또는 수크로스이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다.

일부 구현예에서, 위에 기술된 제약 조성물의 당류의 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 약 90 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 약 90 mg/ml, 바람직하게는 70 mg/ml 내지 약 80 mg/ml이다. 비제한적인 예로서 50 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml을 포함하고, 가장 바람직하게는 80 mg/ml이다.

나아가, 일부 구현예에서, 제약 조성물은 계면활성제도 포함한다. 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리하이드록시알킬렌, 트리톤, 도데실술폰산나트륨, 라우릴술폰산나트륨, 옥틸글리코시드 나트륨, 라우릴/미리스틸/리놀레일/스테아릴-술포베타인, 라우릴/미리스틸/리놀레일/스테아릴-사르코신, 리놀레일/미리스틸/세틸-베타인, 라우라미도프로필/코카미도프로필/리놀레아미도프로필/미리스타미도프로필/팔미토일프로필/이소스테아라미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필/팔미타미도프로필/이소스테아라미도프로필-디메틸아민, 메틸코코일 타우르산나트륨, 메틸올레일타우르산나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.

일부 구현예에서, 제약 조성물의 계면활성제의 농도는 약 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml이다. 비제한적인 예로서 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.45 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.55 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml을 포함하고, 가장 바람직하게는 0.4 mg/ml이다.

대안적인 구현예에서, 제약 조성물은

(a) 약 1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편,

(b) 약 5 mM 내지 30 mM의 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염 완충액,

(c) 약 50 mg/ml 내지 100 mg/ml의 당류, 및

(d) 약 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트

를 포함한다.

대안적인 구현예에서, 제약 조성물은

(a) 1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편,

(b) 5 mM 내지 30 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 또는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5,

(c) 50 mg/ml 내지 100 mg/ml의 당류, 및

(d) 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80

을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 제약 조성물은

(a) 40 mg/ml 내지 60 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편,

(b) 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 또는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.0,

(c) 70 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및

(d) 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80

을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 제약 조성물은

(a) 약 50 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편,

(b) 약 10 mM의 히스티딘-아세트산 완충액, pH 약 5.5,

(c) 약 80 mg/ml의 수크로스, 및

(d) 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80

을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIM-3의 세포 외 영역에 결합하고, (i) 내지 (ii)로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 단클론(monoclonal) 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하여 TIM-3에 결합하거나, (i) 내지 (ii)로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편임을 특징으로 한다:

(i) 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 CDR 영역 서열(들)을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열번호 8, 43 및 10의 아미노산 서열로 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 영역의 서열; 및/또는 서열번호 11, 12 및 13의 아미노산 서열로 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 영역의 서열;

(ii) 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 CDR 영역 서열(들)을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열번호 14, 15 및 16의 아미노산 서열로 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 영역의 서열; 및/또는 서열번호 17, 18 및 19의 아미노산 서열로 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 영역의 서열.

일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (i) 또는 (ii)로부터 선택된 임의의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

(i) 각각 서열번호 8, 43 및 10의 서열에 제시된 바와 같거나 서열번호 8, 43, 및 10과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역; 및/또는 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같거나 서열번호 11, 12 및 13과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

이때, 서열번호 43은 서열 DIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKD에 제시된 바와 같고, X₁은 N, L, V, M 및 E로 구성된 군으로부터 선택되고, X₂는 N, E, M, H, K, L, A 및 V로 구성된 군으로부터 선택되고, X₃은 G 및 A로 구성된 군으로부터 선택됨;

(ii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 서열에 제시된 바와 같거나 서열번호 14, 15, 및 16과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역; 및/또는 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 제시된 바와 같거나 서열번호 17, 18 및 19와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

위에 기술된 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 더욱 바람직하게는, 97%, 98% 또는 99% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 위에 기술된 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 1개 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이에 의해 수득될 수 있다.

일부 구현예에서, 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 8, 43 및 10에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 서열; 및 서열번호 11, 12 및 13에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역 서열을 포함하거나;

각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 서열; 및 서열번호 17, 18 및 19에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 내지 (m) 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 단클론 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하여 TIM-3에 결합하거나, (a) 내지 (m)으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 단클론 항체 또는 항원 결합 단편이다:

(a) 각각 서열번호 8, 9 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(b) 각각 서열번호 8, 62 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(c) 각각 서열번호 8, 63 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(d) 각각 서열번호 8, 64 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(e) 각각 서열번호 8, 65 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(f) 각각 서열번호 8, 66 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(g) 각각 서열번호 8, 67 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(h) 각각 서열번호 8, 68 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(i) 각각 서열번호 8, 69 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(j) 각각 서열번호 8, 70 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(k) 각각 서열번호 8, 71 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(l) 각각 서열번호 8, 72 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및

(m) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물의 TIM-3 항체 또는 항원 결합 단편은 위에 기술된 단클론 항체 중 임의의 하나에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 개시의 제약 조성물의 일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련하여, 항체는 재조합 항체이다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 단클론 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체로 구성된 군으로부터 선택된 재조합 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.

본 개시의 제약 조성물의 일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 개시의 제약 조성물의 일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련하여, 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 상의 경쇄 및 중쇄 FR 영역 서열은 각각 인간 생식선(germline) 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 유래한다.

본 개시의 제약 조성물의 일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련하여, 인간화 항체는 서열번호 20 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하고, 변이체는 서열번호 20 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이(back mutation)를 갖는다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호 20 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이를 갖는다. 바람직하게는, 복귀 돌연변이는 서열번호 20의 D89E, R98T, G49A, M48I, M70L, R38K 및 V68A로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 복귀 돌연변이; 또는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 Q3K 및/또는 R87K의 아미노산 복귀 돌연변이이다.

일부 구현예에서, 항체의 CDR 영역의 화학적 변형(예컨대, 아세틸화 및 탈아미드화)을 제거하기 위하여, 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR 영역의 화학적 변형에 취약한 부위는 아미노산 치환을 겪을 수 있다. 바람직하게는 CDR2의 NNG가 치환된다. 바람직하게는, 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 45, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 34 또는 35에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 변이체는 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이를 갖는다.

일부 구현예에서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 FR 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 변이체는 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이를 갖는다. 바람직하게는, 복귀 돌연변이는 서열번호 21의 A43S, 서열번호 32의 Q3K, I48V, K45Q, A43S 및 T85S로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 37, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 항체의 CDR 영역의 화학적 변형(예컨대, 아세틸화 및 탈아미드화)을 제거하기 위하여, 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR 영역의 화학적 변형에 취약한 부위는 아미노산 치환을 겪을 수 있다. 바람직하게는 CDR2의 NNG가 치환되어 서열번호 43에 제시된 바와 같은 CDR2 서열을 형성한다. 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 24에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 33에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 항체의 CDR 영역의 아미노산 부위의 탈아미드화를 제거하기 위하여, 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR 영역의 화학적 변형에 취약한 부위는 아미노산 치환을 겪을 수 있다. 바람직하게는 CDR2의 NNG가 치환된다. 본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 바람직한 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 51에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나, 서열번호 52에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이고, 인간 항체 불변 영역, 바람직하게는 서열번호 41에 제시된 바와 같은 인간 중쇄 불변 영역 서열 또는 서열번호 41과 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 바람직하게는 서열번호 42에 제시된 바와 같은 인간 경쇄 불변 영역 서열 또는 서열번호 42와 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 포함한다. 위에 기술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 더욱 바람직하게는, 90%, 95% 또는 99% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 위에 기술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 1개 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 가장 바람직하게는, 항체는 서열번호 73에 제시된 바와 같은 중쇄의 전장 서열 및 서열번호 74에 제시된 바와 같은 경쇄의 전장 서열을 포함한다.

본 개시의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 이황화 안정화 V 영역(dsFv), 및 CDR 영역을 포함하는 펩티드의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또한, 본 개시는 본원에 개시된 제약 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 TIM3 항체의 모액(stock solution)을 완충액을 이용하여 교체(replacement)하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직하게는 완충액은 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염 완충액, 더욱 바람직하게는 히스티딘-염산, 아세트산-아세트산 나트륨 또는 히스티딘-아세트산 완충액이고, 가장 바람직하게는 히스티딘-아세트산 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 20 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 30 mM이다. 비제한적인 예로서 5 mM, 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, 30 mM을 포함하고, 가장 바람직하게는 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액의 pH 값은 약 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.2 내지 5.8, 가장 바람직하게는 5.5이다. 비제한적인 예로서 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0을 포함한다.

또한, 본 개시는 위에 기술된 제약 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 교체 단계(replacement step)에서 수득한 용액에 당류 및 계면활성제를 첨가하는 단계 및 완충액으로 부피를 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직한 당류는 비 환원 이당류, 더욱 바람직하게는 트레할로스 또는 수크로스, 가장 바람직하게는 수크로스이고, 당류의 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 약 90 mg/ml, 더욱 바람직하게는 70 mg/ml 내지 약 80 mg/ml이다. 비제한적인 예로서 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml을 포함하고, 가장 바람직하게는 80 mg/ml이다. 일부 구현예에서, 바람직하게는 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다. 농도는 약 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml이다. 비제한적인 예로서 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.45 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.55 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml을 포함하고, 가장 바람직하게는 0.4 mg/ml이다.

또한, 본 개시는 TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법을 제공하며, 방법은 위에 기술된 제약 조성물을 동결건조하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005 및 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005 및 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-염산, pH 6.0을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-염산, pH 5.5를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 70 mg/ml의 수크로스를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 70 mg/ml의 α,α-트레할로스 이수화물을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 70 mg/ml의 수크로스, 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 70 mg/ml의 수크로스 및 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 70 mg/ml의 수크로스 및 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 50 mg/ml의 항-TIM3 항체 h1799-005, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 70 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 20을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 및 60 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 및 50 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 및 50 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 40 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 및 50 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 50 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.0, 및 60 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 60 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.0, 및 50 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 60 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 20 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.5, 및 40 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 및 40 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.0, 및 40 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.0, 및 60 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 제약 조성물은 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 5.0, 및 40 mg/ml의 TIM3 항체 h1799-005를 포함한다.

TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법의 일부 구현예에서, 동결건조는 사전 동결 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 연속하여 포함한다. 동결건조는 제형을 동결시킨 다음, 1차 건조에 적합한 온도에서 물을 승화시켜 수행된다. 이 조건 하에서, 생성물(product) 온도는 제형의 공융점(eutectic point) 또는 분해 온도보다 낮다. 보통 약 50 내지 250밀리토르의 범위 내의 적합한 압력 하에서, 1차 건조를 위한 저장 온도는 보통 약 -30 내지 25℃이다(1차 건조 과정 중에 생성물이 동결된 채로 유지됨을 가정함). 제형 및 샘플을 담는 용기(예를 들어, 유리 바이알)의 크기와 종류 및 액체의 부피는 건조에 필요한 시간의 길이를 결정하는데, 이는 수 시간 내지 수 일(예를 들어, 40 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 2차 건조 단계는 용기의 종류와 크기 및 사용된 단백질의 종류에 따라 약 0 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 2차 건조를 위한 시간 길이는 생성물의 원하는 잔류 습도 수준에 의해 결정되며, 일반적으로 적어도 약 5시간을 필요로 한다. 일반적으로, 동결건조에 의해 수득한 동결건조 제형의 수분 함량은 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 1차 건조 단계에 적용된 압력과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 2차 건조의 압력은 1차 건조의 압력보다 낮다. 동결건조 조건은 제형 및 바이알 크기에 따라 다를 수 있다.

또한, 본 개시는 위에 기술된 TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법에 의해 제조된 TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형을 제공한다.

일부 구현예에서, 동결건조 제형은 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 2 내지 8℃에서 안정적이다. 일부 구현예에서, 동결건조 제형은 적어도 7일, 적어도 14일 또는 적어도 28일 동안 40℃에서 안정적이다.

또한, 본 개시는 TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 재구성 용액(reconstitution solution)의 제조 방법을 제공하며, 방법은 위에 기술된 동결건조 제형을 재구성하는 단계를 포함하고, 재구성에 사용되는 용액은 주사용수, 생리식염수 또는 글루코스 용액으로 구성되나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된다.

또한, 본 개시는 위에 기술된 바와 같은, TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 재구성 용액의 제조 방법에 의해 제조된 TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 재구성 용액을 제공한다.

나아가, 본 개시는 본원에 기술된 임의의 안정적인 제약 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 용기는 중성 붕규산 유리(neutral borosilicate glass)로 제조된 주사용 병이다.

또한, 본 개시는 위에 기술된, 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다.

또한, 본 개시는 인간 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환의 진단제 제조에 있어서 위에 기술된 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액 또는 제조 물품의 용도를 제공한다.

또한, 본 개시는 인간 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환의 치료용 의약의 제조에 있어서 위에 기술된 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액 또는 제조 물품의 용도를 제공한다. TIM-3 양성 세포와 관련된 질환은 TIM-3 발현 세포에 관한 질환인 한 제한이 없으며, 암, 자가면역 질환 및 알레르기 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 개시는 암, 자가면역 질환 및 알레르기 질환의 치료 또는 진단 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 위에 기술된 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액 또는 제조 물품을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 암은 혈액암, 유방암, 자궁암, 결장직장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암 및 췌장암을 포함한다. 암의 바람직한 예는 혈액암, 식도암, 위암, 결장직장암, 간암 및 전립선암을 포함한다. 혈액암의 예는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종, 피부 T 세포 림프종(CTCL; cutaneous T cell lymphoma), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 역형성 큰세포 림프종(ALCL; anaplastic large cell lymphoma), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 기타 림프구성 백혈병, NK 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종(예컨대, 버킷 림프종) 등을 포함한다. 자가면역 질환의 특정 예는 류마티스 관절염, 건선, 크론병, 강직성 척추염, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 간염, 심근염, 쇼그렌 증후군, 이식 거부 후 자가면역 용혈성 빈혈, 수포성 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반성 루프스(SLE), 중증 근무력증, 천포창, 악성 빈혈 등을 포함한다. 알레르기 질환의 예는 급성 또는 만성 반응성 기도 질환, 기관지 천식, 아토피 피부염, 알레르기 비염, 두드러기, PIE 증후군, 식품 알레르기, 건초열, 알레르기 코, 기관지 천식, 아토피 피부염, 아나필락시스 쇼크를 포함한다.

또한, 본 개시는 종양 세포의 증식 또는 전이와 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 억제용 의약의 제조에 있어서 위에 기술된 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액의 용도를 제공한다.

나아가, 본 개시는 인간 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환의 진단 또는 치료 방법을 제공하며, 방법은 위에 기술된 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액을 이용하는 단계를 포함한다.

본 개시는 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성 용액 또는 제조 물품을 제공하며 이는 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

도 1은 후보 TIM-3 항체에 대한 세포 결합 테스트의 곡선이다. 데이터는 후보 항체인 mAb-1701과 mAb-1799가 항원 발현 세포에 대해 강한 결합 활성을 가짐을 보여준다.
도 2a 내지 도 2c은 혼합 림프구 반응 분석에서, IFNγ 분비에 미치는 본 개시의 후보 항체 및 이의 항원 결합 단편의 효과이다. 도 2a, IFNγ 분비에 미치는 h1701-009 및 이의 항원 결합 단편의 효과; 도 2b, IFNγ 분비에 미치는 h1701-005 및 이의 항원 결합 단편의 효과; 도 2c, IFNγ 분비에 미치는 h1701-009, h1799-005의 효과. 결과는 h1701-009 및 h1799-005 둘 다 IFNγ 분비를 효과적으로 자극할 수 있음을 보여준다.
도 3a 내지 도 3d은 PBMC 활성화 테스트 결과의 도표이다. 도 3a 내지 3d는 각각 FACs 분석에서 IFNγ 양성 세포의 비율, 모든 세포에서 IFNγ의 기하 평균, IFNγ 및 TIM-3 이중 양성 세포의 비율(TIM-3+IFNγ+%) 및 TIM-3+ 세포에서 IFNγ의 기하 평균을 보여준다; 결과는 h1701-009, h1799-005 및 AbTIM-3 모두가 활성화 시 PBMC 세포에서 IFNγ의 발현에 영향을 미치며, 세포 내 IFNγ 양성 세포의 백분율 및 IFNγ의 발현을 다양한 정도로 증가시킴을 보여준다.
도 4a 내지 도 4b는 SEB 자극 테스트 결과의 도표이다. 도 4a 및 도 4b는 IL12 및 IFNγ에 대한 ELISA 테스트 결과를 보여준다. 결과는 h1701-009, h1799-005 및 AbTIM-3이 5일 동안 SEB로 PBMC을 자극한 후, SEB 유도성 IL12 및 IFNγ의 분비를 효과적으로 증가시켰음을 보여준다.
도 5는 JMP 소프트웨어를 이용한, 본 개시의 TIM3 항체 제형의 성분에 대한 모델 적합화 결과이다.

당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 본 개시에 기술된 다양한 구현예의 하나의, 일부의 또는 모든 특징은 추가로 조합되어 본 개시의 다른 구현예를 형성할 수 있다. 본 개시의 위의 구현예 및 조합에 의해 얻어진 기타 구현예를 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 설명한다.

용어의 상세한 설명

본 개시 내용이 더욱 용이하게 이해되도록, 특정 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본원에서 명확하게 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 개시와 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.

본 개시는 참조에 의해 본원에 출원 PCT/CN2018/077190의 모든 내용을 포함한다.

"완충액"은 이의 공액(conjugate) 산-염기 성분으로 인해 pH 변화에 저항성(resistance)이 있는 완충액을 지칭한다. pH를 적절한 범위 내로 조절하는 완충액의 예는 아세트산염 완충액, 숙신산염 완충액, 글루콘산염 완충액, 히스티딘염 완충액, 옥살산염 완충액, 젖산염 완충액, 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 타르타르산염 완충액, 푸마르산염 완충액, 글리실 글리신 및 기타 유기산 완충액을 포함한다.

"히스티딘염 완충액"은 히스티딘 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 히스티딘염 완충액의 예는 히스티딘-염산 완충액, 히스티딘-아세트산염 완충액, 히스티딘-인산염 완충액, 히스티딘-황산염 완충액 등을 포함하고, 바람직하게는 히스티딘-아세트산염 완충액 또는 히스티딘-염산 완충액이다. 히스티딘-아세트산염 완충액은 히스티딘 및 아세트산에 의해 제조된다. 히스티딘-염산 완충액은 히스티딘 및 염산에 의해 제조된다.

"시트르산염 완충액"은 시트르산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 시트르산염 완충액의 예는 시트르산-시트르산 나트륨 완충액, 시트르산-시트르산 칼륨 완충액, 시트르산-시트르산 칼슘 완충액, 시트르산-시트르산 마그네슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 시트르산염 완충액은 시트르산-시트르산 나트륨이다.

"숙신산염 완충액"은 숙신산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 숙신산염 완충액의 예는 숙신산-숙신산 나트륨 완충액, 숙신산-숙신산 칼륨 완충액, 숙신산-숙신산 칼슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산 나트륨이다.

"인산염 완충액"은 인산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 인산염 완충액의 예는 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액, 인산수소이나트륨-인산이수소칼륨 완충액, 인산수소이나트륨-시트르산 완충액 등을 포함한다. 바람직한 인산염 완충액은 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨이다.

"아세트산염 완충액"은 아세트산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 아세트산염 완충액의 예는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, 아세트산-히스티딘염 완충액, 아세트산-아세트산 칼륨 완충액, 아세트산-아세트산 칼슘 완충액, 아세트산-아세트산 마그네슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 아세트산염 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨이다.

"제약 조성물"은 본 명세서에서 기술된 1종 이상의 화합물 또는 이의 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 및 다른 화학적 성분을 포함하는 혼합물을 지칭하며, 다른 화학적 성분은 예를 들어, 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제이다. 제약 조성물의 목적은 항체 활성 성분의 안정성을 유지하고, 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 활성을 발휘하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "제약 조성물" 및 "제형"은 상호 배타적이지 않다.

본 개시에서 제약 조성물의 용액 형태와 관련하여, 달리 명시되지 않는 한, 그 안에 포함된 용매는 물이다.

"동결건조 제형"은 액체 형태 또는 용액 형태의 제약 조성물 또는 제형을 진공 동결건조시켜 수득된 제형 또는 제약 조성물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)"은 당업자가 결정한 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 값을 지칭하며, 이는 부분적으로 값의 측정 또는 결정 방법에 따라 다를 것이다(즉, 측정 시스템의 한계). 예를 들어, "약"은 당해 분야에서 각각의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는(comprising essentially of)"은 뒤따르는 표시된 값으로부터 ± 최대 20%의 범위를 의미한다. 나아가, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 이 용어는 최대 그 자리수(an order of magnitude) 또는 최대 5배의 값을 지칭할 수 있다. 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 출원 및 청구범위에 언급된 특정 값에 적용될 때, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 추정되어야 한다.

본 개시의 제약 조성물은 안정적인 효과를 달성할 수 있다: 제약 조성물에 포함된 항체는 저장 후 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 유지할 수 있고; 바람직하게는, 제약 조성물은 저장 후 이의 물리적 안정성, 그리고 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 실질적으로 유지한다. 저장 수명(shelf-life)은 일반적으로 제약 조성물의 미리 정해진 저장 수명에 기초하여 결정된다. 현재 단백질 안정성을 측정하기 위한 다수의 분석 기술이 있으며, 이는 주어진 온도에서 주어진 기간 동안 저장한 후 안정성을 측정하는 데 사용될 수 있다.

항체의 안정적인 제약 제형은 다음 조건에서 현저한 변화가 관찰되지 않는 것이다: 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더욱 바람직하게는 1년, 훨씬 더 바람직하게는 최대 2년 동안 냉장 온도(2 내지 8℃)에서의 저장. 또한, 안정적인 액체 제형은 예를 들어 1개월, 3개월 및 6개월 동안 25℃의 온도에서 저장 시 원하는 특성을 나타내는 이러한 액체 제형을 포함한다. 전형적으로, 안정성에 대한 허용 가능한 기준은 다음과 같다: SEC-HPLC에 의해 평가 시, 전형적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 항체 단량체가 분해된다. 항체의 제약 제형은 육안 분석에 의해 연황색, 거의 무색, 및 투명한 액체, 또는 무색, 또는 투명 내지 약간의 유백색이다. 제형의 농도, pH 및 삼투압의 변화는 ±10% 이하이다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 감소가 관찰된다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하가 응집된다.

항체는 색 및/또는 투명성의 육안 검사 시 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정 시, 응집, 침전 및/또는 변성의 현저한 증가를 나타내지 않을 경우, 제약 제형에서 "이의 물리적 안정성을 유지한다"고 간주된다. 단백질 입체구조의 변화는 형광 분광법(단백질의 3차 구조를 결정함) 및 FTIR 분광법(단백질의 2차 구조를 결정함)에 의해 평가할 수 있다.

항체는 현저한 화학적 변경을 나타내지 않을 경우, 제약 제형에서 "이의 화학적 안정성을 보유한다"고 간주된다. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가할 수 있다. 단백질의 화학적 구조를 종종 바꾸는 분해 공정에는 가수 분해 또는 절단(크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법으로 평가함), 산화(질량 분광분석법 또는 MALDI/TOF/MS와 함께 펩티드 맵핑과 같은 방법으로 평가함), 탈아미드화(이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 포커싱, 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법으로 평가함) 및 이성질화(isomerization)(이소아스파르트산 함량 측정, 펩티드 맵핑 등으로 평가함)가 포함된다.

주어진 시간에 항체의 생물학적 활성이 제약 제제가 제조되었을 때 나타난 생물학적 활성의 미리 결정된 범위 내에 여전히 있는 경우, 항체는 제약 제형에서 "이의 생물학적 활성을 보유한다"고 간주된다. 항체의 생물학적 활성은 예를 들어, 항원 결합 테스트에 의해 결정할 수 있다.

본 개시에서 사용되는 아미노산에 대한 세 문자 부호(code) 및 단일 문자 부호는 문헌[J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)]에 기술되어 있다.

본 개시에서 사용되는 "항체"는 두 개의 동일한 중쇄 및 두 개의 동일한 경쇄 사이에서 사슬 간의(inter-chain) 이황화 결합에 의해 서로 연결된 네 개의 펩티드 쇄 구조인 면역글로불린을 지칭한다.

본 개시에서, 본 개시의 항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.

본 개시에서, 본 개시의 항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.

항체 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 인접한 약 110개의 아미노산 서열은 매우 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있고; C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이고, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 세 개의 과가변 영역(HVR) 및 네 개의 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 항체의 특이성(specificity)을 결정하는 세 개의 과가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 세 개의 CDR 영역 및 네 개의 FR 영역으로 구성되며, 순차적 순서는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 다음의 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 세 개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 세 개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본 개시에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LCVR 영역 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기의 번호 및 위치는 Kabat 넘버링 기준을 따른다(LCDR1~3, HCDR1~3).

본 개시의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체를 포함하며, 바람직하게는 인간화 항체이다.

본 개시에 언급된 "항체 또는 이의 항원 결합" 또는 "기능적 단편"은 항원에 결합하는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 2 단편, 및 Fv 단편 및 scFv 단편을 지칭한다. Fv 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역을 갖지 않고, 모든 항원 결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편으로 알려져 있다. 일반적으로, Fv 항체는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 또한 포함하여 항원 결합에 필요한 구조를 형성한다. 또한, 상이한 링커가 사용되어 2개의 항체 가변 영역을 연결하여 단일 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있으며, 이는 단쇄(single chain) 항체 또는 단쇄 Fv(sFv)라고 지칭된다.

본 개시에서 용어 "항원 결합 부위"는 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 인식될 수 있는 항원 상의 연속적 또는 불연속적인 3차원의 공간적인 부위를 지칭한다.

본 개시의 용어 "뮤린 항체"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 TIM3에 대한 단클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 시험 대상에게 TIM3 항원 주사를 놓은 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다.

용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 형성되는 항체이며, 키메라 항체는 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 완화할 수 있다. 키메라 항체를 구축하기 위하여, 특정 뮤린 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 구축한 다음, 가변 영역 유전자를 마우스 하이브리도마 세포로부터 클로닝한다. 이후, 인간 항체의 불변 영역 유전자를 원하는 대로 클로닝한다. 마우스 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자와 결찰하여 인간 벡터 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하며, 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵 또는 원핵 산업 시스템에서 발현시킨다. 본 개시의 바람직한 구현예에서, TIM3 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. TIM3 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 더 포함한다. 인간 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 또는 아미노산 돌연변이 후에 수득한 ADCC 독성(항체 의존적 세포 매개성 세포독성)이 없는 IgG4이다.

CDR 이식 항체로도 알려져 있는 "인간화 항체"라는 용어는 인간 항체의 가변 영역 프레임워크 내로 뮤린 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체, 즉, 상이한 유형의 인간 생식선 항체 프레임워크 서열들로부터 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다량의 뮤린 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 이질적 반응의 단점들을 극복한다. 이러한 프레임워크 서열은 생식선 항체 유전자 서열을 아우르는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식선 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식선 서열 데이터베이스(웹 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 이용 가능함)에서 찾을 수 있고, 문헌[Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.]에서도 찾을 수 있다. 면역원성의 감소와 함께 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 서열은 활성을 유지하기 위하여 최소한의 역돌연변이(reverse mutation) 또는 복귀 돌연변이(back mutation)를 거치게 된다. 또한, 본 개시의 인간화 항체는 파지 디스플레이에 의해 CDR 친화도 성숙(affinity maturation)이 수행되는 인간화 항체를 포함한다.

용어 "ADCC"(항체 의존적 세포 매개성 세포독성)는 항체의 Fc 세그먼트를 인식하여 Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체가 코팅된 표적 세포를 직접 사멸시키는 것을 지칭한다. 항체의 ADCC 이펙터 기능은 IgG의 Fc 세그먼트에 대한 변형을 통해 감소 또는 제거될 수 있다. 변형은 IgG1, IgG2/4 키메라에서 N297A, L234A, L235A로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이 및 IgG4에서 F234A/L235A 돌연변이와 같이 항체 중쇄 불변 영역에서의 돌연변이를 지칭한다.

본 개시에 기술된 돌연변이체 서열의 "돌연변이"는 "복귀 돌연변이", "보존적 변형" 또는 "보존적 교체 또는 치환"을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 개시에서 사용되는 "보존적 변형" 또는 "보존적 교체 또는 치환"은 단백질의 아미노산이 비슷한 특징(예컨대, 전하, 곁사슬 크기, 소수성/친수성, 주요 사슬 구조 및 경직도 등)을 나타내는 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미하며, 이러한 치환은 단백질의 생물학적 활성을 바꾸지 않으면서 빈번하게 수행될 수 있다. 일반적으로 말하면, 당업자는 폴리펩티드의 비 필수 영역의 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 바꾸지 않음을 안다(예를 들어, 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224 (4th edition)] 참조). 또한, 비슷한 구조 또는 기능을 갖는 아미노산으로의 치환은 생물학적 활성을 훼손할 가능성이 낮다.

본 개시에 기술된 "돌연변이된 서열"은 본 개시의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열이 돌연변이(치환, 삽입 또는 결실 등)에 의한 적절한 변형을 거치고, 수득한 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열이 본 개시의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열과 상이한 백분율의 서열 동일성을 가짐을 지칭한다. 본 개시에 기술된 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%, 바람직하게는 적어도 95%일 수 있다. 비제한적인 예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%를 포함한다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 국립생명공학연구센터(National Center For Biotechnology Institute) 웹사이트에서 이용 가능한 BLASTN/BLASTP 알고리즘으로 기본 설정(default setting)으로 수행할 수 있다.

용어 "TIM3"은 인테그린 관련 단백질로도 알려져 있는, 세포막 표면에서 광범위하게 발현되는 면역글로불린이다. 신호 조절 단백질(SIRP)은 억제 수용체 슈퍼패밀리의 구성원으로, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속한다. 이는 주로 대식세포, 수지상 세포 및 신경 세포의 표면에서 발현된다. 세포 표면에서 리간드와 접촉할 때, SIRP는 세포 이동 및 식세포 활성, 면역 항상성 및 신경망을 조절한다. TIM3은 인간 신호 조절 단백질 α(SIRPα)의 세포 외 리간드이다. 이는 대식세포의 표면에서 SIRPα와의 결합에 의해 식세포 활성을 감소시켜 억제 신호를 전달하여, 선천적 면역계를 억제한다. 이 신호는 "나를 먹지 마"의 신호로 생생하게 설명된다.

용어 "TIM3에 대한 결합"은 인간 TIM3과 상호작용하는 능력을 지칭한다.

용어 "항-TIM3 항체"와 "TIM3 항체"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 둘 다 TIM3에 결합하는 항체를 지칭한다.

본 개시에 기술된 융합 단백질은 DNA 재조합을 통해 2개의 유전자를 공동 발현시켜 수득한 단백질 생성물이다. 재조합 TIM3 세포 외 영역-Fc 융합 단백질은 DNA 재조합을 통해 TIM3 세포 외 영역(TIM3 extracellular region)과 Fc 단편을 공동 발현시킴으로써 수득한 융합 단백질이다. TIM3 세포 외 영역은 세포막 외부에서 발현되는 TIM3 단백질을 지칭하며, 이 서열은 서열번호 1에 제시된다.

항체 및 항원-결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15]에서 찾아볼 수 있다. 마우스를 인간 TIM3 또는 이의 단편으로 면역화할 수 있고, 수득한 항체는 재생시키고 정제할 수 있으며, 아미노산 시퀀싱은 종래의 방법에 의해 수행될 수 있다. 항원 결합 단편은 또한 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 인간 FR 영역을 비 인간 유래 CDR 영역에 부가하도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식선 서열은 ImMunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr로부터, 또는 문헌[The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351]로부터 얻을 수 있다.

본 개시의 유전자 조작된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종래의 방법에 의해 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 클로닝하여 GS 발현 벡터 내로 재조합할 수 있다. 그런 다음, 재조합된 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포에 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 당해 분야에 주지된 더욱 권장되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단에서 항체의 글리코실화를 초래할 것이다. 안정적인 클론은 인간 TIM3에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 수득할 수 있다. 양성 클론은 생물 반응기에서 항체 생산을 위한 무혈청 배양 배지에서 확장시킬 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 종래의 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 조정된 완충액으로 평형화시킨 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼에 의해 정제를 수행할 수 있다. 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거한다. 결합된 항체를 pH 구배에 의해 용리시키고, 항체 단편을 SDS-PAGE로 검출한 다음, 수집한다. 일반 기술을 이용하여 항체를 여과하고 농축할 수 있다. 또한, 가용성 혼합물 및 다량체는 분자 체, 이온 교환과 같은 일반 기술에 의해 제거될 수 있다. 수득한 생성물은 즉시 예를 들어 -70℃에서 냉동될 수 있거나, 동결건조될 수 있다.

“선택적인(optional)” 또는 “선택적으로(optionally)”는 이어지는 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수 있지만 반드시 일어나는 것은 아님을 의미하고, 이러한 기재 내용은 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 반드시 존재할 필요는 없음을 의미한다.

"투여" 및 "치료"는, 동물, 인간, 실험 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는 예컨대, 치료적, 약물동역학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라, 유체가 세포와 접촉하고 있는 경우 시약을 유체와 접촉시키는 것도 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단법, 결합 조성물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한, 예컨대, 세포의, 시험관 내 및 생체 외 처치를 의미한다. "치료"는, 인간, 수의학, 또는 연구 대상에 적용되는 바와 같이, 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치, 연구 및 진단적 응용을 지칭한다.

"치료하다"는 치료제, 예컨대, 본 개시의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물을, 치료제가 공지된 치료적 활성을 갖는 1종 이상의 질환 증상을 나타내는 환자에게 체내로 또는 체외로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 치료제는 치료되는 환자 또는 집단에서 1종 이상의 질환 증상을 완화시켜 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상의 진행을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. ("치료적 유효량"으로도 지칭되는) 임의의 특정 질환 증상을 완화시키기에 유효한 치료제의 양은 인자, 예컨대, 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 그리고 약제가 환자에서 원하는 반응을 유도하는 능력에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지는 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정에 의해 평가하여 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가할 수 있다. 본 개시의 구현예(예컨대, 치료 방법 또는 제조 물품)가 각각의 관심 질환 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 맨-휘트니에 따른 U 검정, 크루스칼 왈리스 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라 검정 및 윌콕슨 검정과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 통계적 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 관심 목표 질환 증상을 완화시켜야 한다.

본 개시의 제형은 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. TIM-3 양성 세포와 관련된 질환은 TIM-3 발현 세포에 관한 질환인 한 제한이 없으며, 예컨대, 암, 자가면역 질환 및 알레르기 질환이다. 암은 혈액암, 유방암, 자궁암, 결장직장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암 및 췌장암을 포함한다. 암의 바람직한 예는 혈액암, 식도암, 위암, 결장직장암, 간암 및 전립선암을 포함한다. 혈액암의 예는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수형성이상증후군(MDS), 다발성 골수종, 피부 T 세포 림프종(CTCL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 역형성 큰세포 림프종(ALCL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 기타 림프구성 백혈병, NK 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종(예컨대, 버킷 림프종) 등을 포함한다. 자가면역 질환의 특정 예는 류마티스 관절염, 건선, 크론병, 강직성 척추염, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 간염, 심근염, 쇼그렌 증후군, 이식 거부 후 자가면역 용혈성 빈혈, 수포성 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반성 루프스(SLE), 중증 근무력증, 천포창, 악성 빈혈 등을 포함한다. 알레르기 질환의 예는 급성 또는 만성 반응성 기도 질환, 기관지 천식, 아토피 피부염, 알레르기 비염, 두드러기, PIE 증후군, 식품 알레르기, 건초열, 알레르기 코, 기관지 천식, 아토피 피부염, 아나필락시스 쇼크 등을 포함한다.

"유효량"은 의학적 병태(condition)의 증상 또는 징후를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 촉진하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의(veterinary) 대상에 대한 유효량은 인자(factors), 예컨대, 치료되는 병태, 환자의 일반적인 건강 상태, 투여 경로 및 용량 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 유효량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 막는 최대한의 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다.

"교체(replacement)"는 항체 단백질을 용해시키는 용매 시스템의 교체를 지칭한다. 예를 들어, 항체 단백질을 포함하는 고염(high salt) 또는 고장(hypertonic) 용매 시스템은 안정적인 제형을 위한 완충액 시스템을 이용한 물리적인 조작에 의해 교체되어, 항체 단백질이 안정적인 제형에 존재한다. 물리적 조작은 한외여과, 투석 또는 원심분리 후 재구성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

"제약 조성물"은 본 명세서에 기술된 1종 이상의 화합물 또는 이의 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 및 다른 화학적 성분, 예를 들어, 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 제약 조성물의 목적은 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 한 다음, 생물학적 활성을 발휘하는 것이다.

항체 제약 조성물(제형)의 예시적인 제조 공정:

단계 1: 소정량의 정제된 TIM3 항체 용액을 항체가 없는 완충액(예컨대, 10 mM, pH 5.5의 히스티딘-아세트산 완충액)에 대한 (바람직하게는 한외여과에 의한) 용매 교체를 수행하였다. 교체는 적어도 6배 부피로 한외여과막을 통과시킴으로써 수행된다. 단백질을 약 70 mg/mL까지 농축시켰다. 소정 부피의 수크로스 모액을 첨가하고, 혼합하여 80 mg/mL의 최종 농도의 수크로스를 수득하였다. 소정 부피의 폴리소르베이트 80 모액을 첨가하고, 혼합하여 0.4 mg/mL의 최종 농도의 폴리소르베이트 80을 수득하였다. 10 mM pH 5.5의 히스티딘-아세트산 완충액을 첨가하여 부피를 조정하고, 단백질 농도를 50 mg/mL로 만들었다(다른 제형 또는 테스트하려는 안정적인 제형을 비슷한 단계에 따라 제조하였다).

생성물을 여과하고, 공정 중 제어 샘플링에 의해 멸균성을 테스트하였다. 모액을 0.22 μm의 PVDF 필터 사이로 통과시키고, 여과액을 수집하였다.

단계 2: 로딩(loading) 부피를 2.15 ml로 조정하고, 여과액을 2 ml의 마개가 있는 바이알에 로딩하고, 로딩 절차의 시작 시, 로딩 절차 중 및 종료 시에 각각 샘플링하여 부피 차이를 테스트하였다.

단계 3: 캡핑기를 사용하여 알루미늄 캡을 캡핑하였다.

단계 4: 부정확한 로딩과 같은 결함이 있는지를 확인하기 위하여 육안 검사를 수행하였다. 라벨을 인쇄하고 바이알에 부착하였다. 종이 트레이의 라벨을 인쇄하고, 종이 트레이를 접고, 바이알을 종이 트레이에 넣고, 라벨을 종이 트레이에 부착하였다.

이하, 본 개시를 실시예를 참조하여 추가로 설명한다. 그러나 본 개시의 범위는 이에 한정되지 않는다. 본 개시의 실시예에서, 특정 조건이 설명되지 않는 경우, 실험은 일반적으로 예를 들어, 문헌[Antibody Experimental Technology Guide and Molecular Cloning, by Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같은 종래의 조건이나 물질 또는 제품 제조사가 제안한 조건 하에 수행된다. 시약 공급원이 명시적으로 제시되지 않은 경우, 시약은 상업적으로 이용 가능한 통상적인 시약이다.

실시예 1. TIM3 항체의 제조

I. TIM-3 항원 및 검출에 사용되는 단백질의 제조

1. TIM-3 항원의 설계 및 발현

UniProt A형 간염 바이러스 세포 수용체 2(인간 HAVCR2, 인간 TIM-3, Uniprot No: Q8TDQ0)를 본 개시의 TIM-3의 주형(template)으로 사용하였다. 항원 및 본 개시에서 검출에 사용되는 단백질의 아미노산 서열을 설계하였고, 선택적으로 상이한 태그를 TIM-3 단백질과 융합하였다. 융합체를 pHr 벡터(자체 생산) 또는 pTargeT 벡터(promega, A1410)로 클로닝하였고, 벡터를 293 세포에서 일시적으로 발현시키거나 CHO-S에서 안정적으로 발현시킨 다음, 정제하여 암호화된 항원 및 본 개시에서 검출에 사용되는 단백질을 수득하였다. 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 이하에 언급된 TIM-3 항원은 인간 TIM-3을 지칭한다.

마우스의 면역화에 사용되는 TIM-3 세포 외 영역 및 hIgG1 Fc의 융합 단백질: TIM-3-Fc(서열번호 1):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이택릭체 부분은 Fc를 나타낸다.

검출에 사용되는 Flag 태그와 His 태그가 있는 TIM-3 세포 외 영역: TIM-3-Flag-His(서열번호 2):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRGSSDYKDDDDKHHHHHH;

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이택릭체 부분은 Flag-His 태그를 나타낸다.

TIM-3 과발현 세포주를 구축하는 데 사용되는 인간 TIM-3에 대한 전장(full-lenght) 아미노산 서열: TIM-3 전장(서열번호 3):

;

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이중 밑줄 친 부분은 막관통 영역을 나타내고, 물결선은 세포 내 영역을 나타내고, 나머지 다른 부분은 TIM-3의 세포 외 영역을 나타낸다.

2. TIM-3 관련 재조합 단백질의 정제, 및 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제

2.1 TIM-3-Flag-His 재조합 단백질의 정제 단계:

샘플을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 적절한 부피로 농축하였다. NI-NTA 친화도 컬럼(QIAGEN, Cat No. 30721)을 PBS로 평형화하고, 2 내지 5의 컬럼 부피로 세척하였다. 불순물을 제거한 후, 세포에 의해 발현된 상청액 샘플을 컬럼에 로딩하였다. A280 판독치가 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 컬럼을 PBS로 헹구어 원치 않는 단백질을 세척하고, 표적 단백질을 수집하였다. 표적 단백질을 세척 완충액(20 mM의 이미다졸) 및 용리 완충액(300 mM의 이미다졸)으로 연속하여 용리시키고, 용리 피크를 수집하였다.

수집된 용리액을 이온 교환에 의해 추가로 정제하였다(Hiload 16/600 Superdex 200 컬럼). pH 7.4를 보장하기 위하여 컬럼을 약 2 컬럼 부피의 PBS로 평형화하였다. 표적 단백질을 포함하는 것으로 확인된 용리 완충액을 농축한 다음, 컬럼에 로딩하였다. 샘플을 수집하고, SDS-PAGE 및 LC-MS를 이용하여 확인하고, 나중에 사용하기 위해 분취하였다.

2.2 하이브리도마, 재조합 항체, 및 Fc 융합 단백질의 정제

세포에 의해 발현된 상청액 샘플을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 하이브리도마에 의해 발현된 상청액을 단백질 G 컬럼에 의해 정제하고, 재조합 항체 및 Fc 융합 단백질에 의해 발현된 상청액을 단백질 A 컬럼에 의해 정제하였다. A280 판독치가 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 표적 단백질을 100 mM의 아세트산 pH 3.0으로 용리시키고 1 M의 트리스(Tris)-HCl pH 8.0으로 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절하게 농축시키고, PBS로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)로 더 정제하였다. 피크(응집물을 제외함)를 수집하고, 나중에 사용하기 위해 분취하였다.

II. 항-인간 TIM-3 단클론 항체의 제조

1. 동물 면역화

마우스를 면역화하여 항-인간 TIM-3 단일클론 항체를 생성하였다. 6 내지 8주령의 암컷 실험용 SJL 흰 마우스(Beijing Charles River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: SCXK (Beijing) 2012-0001)를 사용하였다. 급이 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 1주일 동안 실험실 환경, 12/12시간의 명암 주기 조정, 20~25℃의 온도, 40~60%의 습도에 적응시켰다. 환경에 적응시킨 마우스를 다음의 프로토콜에 따라 면역화하였다. 면역화를 위한 항원은 Fc 태그가 있는 인간 TIM-3의 세포 외 영역(서열번호 1)이다.

면역화 프로토콜: QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)를 사용하여 마우스를 면역화하였다. 항원 대 보조제(adjuvant)의 비율은 1:1이고, 10 μg/마우스/회(1차 면역화/부스터 면역화)이다. 항원 및 보조제를 신속히, 철저히 혼합한 다음, 접종하였다. 접종 기간은 1차 및 2차 면역화 사이의 21일의 간격을 포함하였고, 이후의 접종 사이의 간격은 14일이었다. 각각의 면역화 후 7일 후에 혈액을 채취하였고, 마우스 혈청의 항체 역가를 ELISA로 결정하였다. 혈청 중 높은 항체 역가를 갖고, 역가가 안정기(plateau)에 도달한 마우스를 비장세포 융합(splenocyte fusion)을 위해 선택하였다. 비장세포 융합 3일 전, 생리 식염수로 제조된 항원 용액을 20 μg/마우스로 복강 내(IP) 주사하여 부스터 면역화를 수행하였다.

2. 비장세포 융합

최적화된 PEG 매개성 융합 절차를 이용하여 비장 림프구를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287™)와 융합시켜 하이브리도마 세포를 수득하였다. 융합된 하이브리도마 세포를 완전 배지(20%의 FBS, 1×HAT 및 1×OPI를 포함하는 DMEM 배지)에 4×10⁵내지5 ×10⁵개/ml의 밀도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 100 μl/웰로 시딩하고, 3 내지 4일 동안 5%의 CO₂에서 37℃에서 인큐베이션한 다음, HAT 완전 배지를 100 μl/웰로 첨가하여 핀포인트 유사(pinpoint-like) 클론이 형성될 때까지 3 내지 4일 동안 세포를 추가로 배양하였다. 상청액을 제거하고, 200 μl/웰의 HT 완전 배지(20% FBS, 1×HT 및 1×OPI를 포함하는 RPMI-1640 배지)를 첨가하고, 5%의 CO₂에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, ELISA 검출을 수행하였다.

3. 하이브리도마 세포의 스크리닝

하이브리도마 세포의 성장 밀도에 따라, 하이브리도마 배양 상청액을 결합 ELISA 방법에 의해 검출하였다(시험예 1 참조). ELISA 방법에서 확인된 양성 웰의 세포 상청액을 사용하여 TIM-3 과발현 세포 결합 테스트를 수행하였다(시험예 2 참조). 단백질 결합 및 세포 결합 둘 다에 대해 양성인 웰의 세포는 동결보존을 위해 제 시간에 확장시키고, 단일의 세포 클론을 수득할 때까지 2 내지 3회 서브클로닝시켜야 한다.

각각의 서브클로닝된 세포에 대해 TIM-3 결합 ELISA 및 세포 결합 테스트를 수행하였다. 위의 테스트를 통해 하이브리도마 클론을 스크리닝하고, 분비된 항체 mAb-1701 및 mAb-1799를 수득하였다. 무혈청 세포 배양법에 의해 항체를 추가로 제조하였다. 정제 실시예에 따라 항체를 정제하고, 시험예에서의 사용을 위해 제공하였다.

4. 하이브리도마 양성 클론의 시퀀싱

양성 하이브리도마로부터 서열을 클로닝하는 공정은 다음과 같았다. 대수성장기(logarithmic growth phase)의 하이브리도마 세포를 수집하고, RNA를 키트 설명서에 따라 Trizol(Invitrogen, Cat No. 15596-018)로 추출하고, 역전사에 PrimeScript™ Reverse Transcriptase 키트(Takara, Cat No. 2680A)를 사용하였다. 역전사로 수득한 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Ig-Primer Set, Novagen, TB326 Rev. B 0503)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 시퀀싱 회사에 전달하였다. mAb-1701 및 mAb-1799의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA 서열에 상응하는 아미노산 서열을 수득하였다:

mAb-1701 중쇄 가변 영역(서열번호 4)

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVSVSA;

mAb-1701 경쇄 가변 영역(서열번호 5)

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSSPWTFGGGTKLEIK;

mAb-1799 중쇄 가변 영역(서열번호 6)

EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMNSLKSDDTATYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSA;

mAb-1799 경쇄 가변 영역(서열번호 7)

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASDNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQQHYGSPLTFGAGTKLELK;

위에 기술된 mAb-1701 및 mAb-1799의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열에서, 밑줄 친 부분은 CDR 영역을 나타내고, 각 서열의 배열은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4이다. 각 항체의 경쇄 및 중쇄의 CDR 서열을 표 1에 나타내었다.

각각의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역의 서열

Ab	중쇄		경쇄
mAb-1701	HCDR1	DYYMN 서열번호 8	LCDR1	LASQPIGIWLA 서열번호 11
	HCDR2	DIIPNNGGSKYNQKFKD 서열번호 9	LCDR2	AATSLAD 서열번호 12
	HCDR3	WGYGSSYRWFDY서열번호 10	LCDR3	QQLYSSPWT 서열번호 13
mAb-1799	HCDR1	DYYMA 서열번호 14	LCDR1	RASDNIYSYLA 서열번호 17
	HCDR2	NINYDGSSTYYLDSLKS 서열번호 15	LCDR2	NAKTLAE 서열번호 18
	HCDR3	DVGYYGGNYGFAY서열번호 16	LCDR3	QQHYGSPLT 서열번호 19

III. 항-인간 TIM-3 뮤린 하이브리도마 단클론 항체의 인간화

1. 항-TIM-3 항체 mAb-1701의 인간화

MOE 소프트웨어에 의해 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 IMGT 생식선 유전자 데이터베이스에 대해 정렬시킴으로써, mAb-1701 항체에 대해 높은 상동성을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식선 유전자를 주형으로서 개별적으로 선택하고, 뮤린 항체의 CDR을 각각 상응하는 인간 주형에 이식하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 가변 영역 서열을 형성하였다. 아미노산 잔기를 확인하고 Kabat 넘버링 시스템에 의해 주석을 달았다.

1.1 인간화 하이브리도마 클론 mAb-1701에 대한 프레임워크의 선택

뮤린 항체 mAb-1701의 인간화를 위한 경쇄 주형은 IGKV1-33*01 및 hjk4.1이고, 인간화를 위한 중쇄 주형은 IGHV1-18*01 및 hjh4.1이었다. 인간화 가변 영역 서열은 다음과 같다:

h1701VH-CDR 이식편(서열번호 20)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYYMN WVRQAPGQGLEWMG DIIPNNGGSKYNQKFKD RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR WGYGSSYRWFDY WGQGTLVTVSS;

h1701VL-CDR 이식편(서열번호 21)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC LASQPIGIWLA WYQQKPGKAPKLLIY AATSLAD GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQLYSSPWT FGGGTKVEIK;

비고: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되었고, 서열의 이탤릭체는 FR 서열을 나타내고, 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.

1.2 h1701을 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계

구체적인 돌연변이 설계를 아래 표 2에 나타내었다:

h1701을 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계

h1701_VL		h1701_VH
h1701_VL.1	이식됨	h1701_VH.1	이식됨
h1701_VL.1A	A43S	h1701_VH.1A	M48I
		h1701_VH.1B	R98T
		h1701_VH.1C	M48I, R98T
		h1701_VH.1D	M48I, R98T, R38K, D89E
		h1701_VH.1E	M48I, R98T, G49A, V68A, M70L
		h1701_VH.1F	M48I, R98T, G49A, V68A, M70L, R38K, D89E

비고: 예를 들어, A43S는 천연 넘버링에 따른 위치 43의 A가 S로 복귀 돌연변이됨을 의미한다. “이식됨”은 인간 생식선 FR 영역으로 이식된 뮤린 항체 CDR의 서열을 나타낸다.

h1701 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합

	h1701_VL.1	h1701_VL.1A
h1701_VH.1	h1701-005	h1701-006
h1701_VH.1A	h1701-007	h1701-008
h1701_VH.1B	h1701-009	h1701-010
h1701_VH.1C	h1701-011	h1701-012
h1701_VH.1D	h1701-013	h1701-014
h1701_VH.1E	h1701-015	h1701-016
h1701_VH.1F	h1701-017	h1701-018

비고: 이 표는 다양한 돌연변이 조합에 따른 서열을 보여준다. h1701-007에 의해 나타난 바와 같이, 인간화 뮤린 항체 h1701-007은 2개의 돌연변이체(경쇄 h1701_VL.1A 및 중쇄 h1701_VH.1A)를 갖는다. 나머지는 비슷한 방식으로 나타내어질 수 있다.

1701의 특정 인간화 서열은 다음과 같다:

>h1701_VH.1(h1701VH-CDR 이식편과 동일, 서열번호 22)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701h1701_VH.1A(서열번호 23)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1B(서열번호 24)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1C(서열번호 25)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1D(서열번호 26)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1E(서열번호 27)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1F(서열번호 28)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VL.1(h1701VL-CDR 이식편과 동일, 서열번호 29)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK;

>h1701_VL.1A(서열번호 30)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.

2. 항-TIM-3 항체 mAb-1799의 인간화

MOE 소프트웨어에 의해 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 IMGT 생식선 유전자 데이터베이스에 대해 정렬시킴으로써, mAb-1799 항체에 대해 높은 상동성을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식선 유전자를 주형으로서 개별적으로 선택하고, 뮤린 항체의 CDR을 각각 상응하는 인간 주형에 이식하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 가변 영역 서열을 형성하였다. 아미노산 잔기를 확인하고 Kabat 넘버링 시스템에 의해 주석을 달았다.

2.1 인간화 하이브리도마 클론 1799에 대한 프레임워크의 선택

뮤린 항체 1799의 인간화를 위한 경쇄 주형은 IGKV1-39*01 및 hjk2.1이고, 인간화를 위한 중쇄 주형은 IGHV3-7*01 및 hjh4.1이었다. 인간화 가변 영역 서열은 다음과 같다:

h1799VH-CDR 이식편(서열번호 31)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMA WVRQAPGKGLEWVA NINYDGSSTYYLDSLKS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DVGYYGGNYGFAY WGQGTLVTVSS;

h1799VL-CDR 이식편(서열번호 32)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASDNIYSYLA WYQQKPGKAPKLLIY NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYGSPLT FGQGTKLEIK;

2.2 하이브리도마 클론 1799를 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계, 아래 표 4 참조:

h1799를 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계

h1799_VL		h1799_VH
h1799_VL.1	이식됨	h1799_VH.1	이식됨
h1799_VL.1A	I48V	h1799_VH.1A	Q3K
h1799_VL.1B	I48V, K45Q	h1799_VH.1B	Q3K, R87K
h1799_VL.1C	I48V, K45Q, A43S
h1799_VL.1D	I48V, K45Q, A43S, T85S

비고: 예를 들어, I48V는 천연 넘버링에 따른 위치 48의 I가 V로 복귀 돌연변이됨을 의미한다. “이식됨”은 인간 생식선 FR 영역으로 이식된 뮤린 항체 CDR의 서열을 나타낸다.

뮤린 항체 1799에 대한 인간화항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열의 조합

	h1799_VL.1	h1799_VL.1A	h1799_VL.1B	h1799_VL.1C	h1799_VL.1D
h1799_VH.1	h1799-005	h1799-006	h1799-007	h1799-008	h1799-009
h1799_VH.1A	h1799-010	h1799-011	h1799-012	h1799-013	h1799-014
h1799_VH.1B	h1799-015	h1799-016	h1799-017	h1799-018	h1799-019

비고: 이 표는 다양한 돌연변이 조합에 따른 서열을 보여준다. h1799-005에 의해 나타난 바와 같이, 인간화 뮤린 항체 h1799-005는 2개의 돌연변이체(경쇄 h1799_VL.1A 및 중쇄 h1799_VH.1)를 갖는다. 나머지는 비슷한 방식으로 나타내어질 수 있다.

1799의 특정 인간화 서열은 다음과 같다:

>h1799_VH.1(h1799VH-CDR 이식편과 동일, 서열번호 33)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;

>h1799_VH.1A(서열번호 34)

EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;

>h1799_VH.1B(서열번호 35)

EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;

>h1799_VL.1(h1799VL-CDR 이식편과 동일, 서열번호 36)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;

>h1799_VL.1A(서열번호 37)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;

>h1799_VL.1B(서열번호 38)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;

>h1799_VL.1C(서열번호 39)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;

>h1799_VL.1D(서열번호 40)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK.

IV. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 제조

항체의 제조를 위하여, 인간 중쇄 IgG4/경쇄 카파의 불변 영역을 각각의 가변 영역과 조합하고, S228P 돌연변이를 Fc 세그먼트에 도입하여 IgG4 항체의 안정성을 증가시켰다. 당해 분야에 공지된 기타 돌연변이 또한 이의 성능을 개선하는 데 사용될 수 있다.

중쇄 불변 영역의 서열을 서열번호 41에 제시하였다:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;

경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 42에 제시된 바와 같다:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;

이때, 항체 h1799-005의 중쇄에 대한 전장 서열은 서열번호 73에 제시된 바와 같다:

;

항체 h1799-005의 경쇄에 대한 전장 서열은 서열번호 74에 제시된 바와 같다:

;

비고: 위에 기술된 항체 h1799-005의 전장 서열에서, 이탤릭체는 FR 영역 서열을 나타내고, 밑줄 친 부분은 CDR 영역 서열을 나타내고, 물결선은 불변 영역 서열을 나타낸다.

1. 재조합 키메라 항체의 분자 클로닝

하이브리도마 스크리닝으로부터 수득한 양성 항체 분자를 시퀀싱하여 가변 영역을 암호화하는 유전자의 서열을 수득한다. 시퀀싱에 의해 수득한 서열에 기초하여 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하고, 시퀀싱된 유전자는 주형으로 작용하였다. PCR에 의해 다양한 항체 VH/VK 유전자 단편을 구축한 다음, 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG4/h카파 불변 영역 유전자 (CH1-FC/CL) 단편 함유)과 상동 재조합하고, 재조합 키메라 항체를 위한 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr을 구축하여 2종의 키메라 항체 Ch1701 및 Ch1799를 구축하였다.

2. 인간화 항체의 분자 클로닝

설계된 인간화 항체에 대해 코돈 최적화를 수행하여 인간 코돈 선호도를 갖는 암호화 유전자 서열을 생성하였다. 프라미어를 설계하여 PCR에 의해 다양한 항체 VH/VK 유전자 단편을 구축한 다음, 단편들을 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG4/h카파 불변 영역 유전자 (CH1-FC/CL) 단편 함유)과 상동 재조합하여 인간화 항체 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr을 구축하였다.

3. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현 및 정제

항체 경쇄 및 중쇄를 개별적으로 발현하는 플라스미드를 HEK293E 세포에 1:1.2의 비율로 형질감염시켰다. 6일 후에 발현 상청액을 수집하고, 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독치가 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 표적 단백질을 pH 3.0 내지 pH 3.5의 산성 용리 용액으로 용리시키고, 1 M의 Tris-HCl pH 8.0~9.0으로 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절하게 농축한 다음, PBS로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)에 의해 더 정제하여 응집물을 제외시키고, 단량체 피크를 수집하고, 나중에 사용하기 위하여 분취하였다.

V. h1701 항체의 점 돌연변이

탈아미드화 변형은 나중 단계에서 안정성에 영향을 미칠 수 있는 항체의 흔한 화학적 변형이다. 특히, CDR 영역의 일부 아미노산은 고도로 탈아미드화, 산화 또는 이성질화된다. 일반적으로 이러한 돌연변이는 회피되거나 감소될 것이다. 가속화된 안정성 테스트 및 컴퓨터 시뮬레이션된 항체 구조 및 핫스팟 예측에 따르면, h1701 항체의 중쇄 CDR2의 NNG가 탈아미드화에 취약한 부위이다. 위에 기술된 NNG는 h1701 항체의 중쇄 가변 영역의 위치 54~56(천연 넘버링)에 위치한다. 아미노산의 특성 및 컴퓨터 시뮬레이션된 항체 구조에 대한 기술에 따르면, 위의 위치의 아미노산은 임의의 아미노산으로 교체될 수 있다. 바람직하게는, h1701의 CDR2 돌연변이체는 DIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKD(서열번호 43)이고, 여기서 X₁, X₂및 X₃은 h1701 항체 중쇄 가변 영역의 위치 54~56의 아미노산 잔기이고, X₁은 Asn, Leu, Val, Met 및 Glu로 구성된 군으로부터 선택되고, X₂는 Asn, Glu, Met, His, Lys, Leu, Ala 및 Val로 구성된 군으로부터 선택되고, X₃은 Gly 및 Ala로 구성된 군으로부터 선택된다.

나아가, 위에 기술된 위치 54~56의 돌연변이를 포함하는 CDR2 및 상이한 복귀 돌연변이를 포함하는 FR 영역은 다음의 중쇄 가변 영역을 구성할 수 있다:

>h1701_VH.1-CDR2 돌연변이체(서열번호 44)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1A-CDR2 돌연변이체(서열번호 45)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1B-CDR2 돌연변이체(서열번호 46)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1C-CDR2 돌연변이체(서열번호 47)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1D-CDR2 돌연변이체(서열번호 48)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1E-CDR2 돌연변이체(서열번호 49)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIADIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

>h1701_VH.1F-CDR2 돌연변이체(서열번호 50)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIADIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS.

h1701의 HCDR2 돌연변이체 및 상응하는 CDR2 돌연변이체를 포함하는 인간화 서열 h1701_VH.1B-CDR2 돌연변이체(서열번호 46)와 관련된 예시적인 서열을 다음의 돌연변이체 및 표 6에 나타내었다.

예로서, h1701-009의 HCDR2의 NNG를 NLG, NVG, NNA, NMA, NEA, NHA, NMG, NEG, NKG, NAG, NHG로 돌연변이되도록 설계하였다(위에 기술된 중쇄 가변 영역 CDR2 돌연변이체의 서열은 각각 서열번호 51 내지 61에 제시된 바와 같다). 발현 플라스미드 구축 및 293E 발현을 분자 클로닝 방법에 의해 수행하고, 돌연변이체 항체의 친화도 및 안정성을 정제 후 추가로 테스트하였다. 일련의 아미노산 돌연변이를 h1701-009에 수행하였다. 특정한 관련된 서열은 표 6에 기술된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항-탈아미드화 변형을 포함하는 h1701-009의 중쇄 가변 영역 돌연변이체의 서열

중쇄 가변 영역	VH에 대한 서열번호	상응하는 HCDR2 서열
h1701-009	서열번호 24	DIIPNNGGSKYNQKFKD(서열번호 9)
h1701-009NLG	서열번호 51	DIIPNLGGSKYNQKFKD(서열번호 62)
h1701-009NVG	서열번호 52	DIIPNVGGSKYNQKFKD(서열번호 63)
h1701-009NNA	서열번호 53	DIIPNNAGSKYNQKFKD(서열번호 64)
h1701-009NMA	서열번호 54	DIIPNMAGSKYNQKFKD(서열번호 65)
h1701-009NEA	서열번호 55	DIIPNEAGSKYNQKFKD(서열번호 66)
h1701-009NHA	서열번호 56	DIIPNHAGSKYNQKFKD(서열번호 67)
h1701-009NMG	서열번호 57	DIIPNMGGSKYNQKFKD(서열번호 68)
h1701-009NEG	서열번호 58	DIIPNEGGSKYNQKFKD(서열번호 69)
h1701-009NKG	서열번호 59	DIIPNKGGSKYNQKFKD(서열번호 70)
h1701-009NAG	서열번호 60	DIIPNAGGSKYNQKFKD(서열번호 71)
h1701-009NHG	서열번호 61	DIIPNHGGSKYNQKFKD(서열번호 72)

VI. 항체의 성능 및 효과 검출

다음의 테스트 방법은 본 개시의 항체의 성능 및 유익한 효과를 검증하는 데 사용된다:

시험예 1: 인간 TIM-3 과발현 CHO-s 세포에 대한 항-TIM-3 항체의 결합 테스트

항-TIM-3 항체의 결합 능력을 TIM-3 단백질 과발현 CHO-S 세포에 대한 항체의 결합에 의해 테스트하였다. 전기형질감염(electro-transfection)에 의해 TIM-3 전장 플라스미드(자체 생산, 서열번호 3)를 CHO-S 세포로 형질감염시키고, 스트레스 하에서 2주의 스크리닝 후, TIM-3의 발현 수준을 검출하였다. 과발현 세포를 96-웰 플레이트의 바닥에 고정시킨 다음, 항체 첨가 후 신호 강도를 이용하여 Tim-3 과발현 CHO-S 세포에 대한 항체의 결합 활성을 결정하였다. 특정 실험 방법은 다음과 같다. 사용된 양성 대조군 항체는 AbTim-3으로, 서열은 US20150218274A1의 표 2에서 유래하며, 출원인이 제조하였다.

100 μl/웰의 세포를 96-웰 플레이트에 4x10⁵개/ml의 밀도로 시딩하고 밤새 배양하였다. 상청액을 제거하고, 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 고정시키기 위해100 μl/웰의 4%의 PFA를 실온에서 30분 동안 첨가하고, 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 액체를 제거한 다음, 5% 탈지유(Bright Dariy의 탈지유 분말)를 포함하는, PBS로 희석한 차단(blocking) 용액을 200 μl/웰로 첨가하고, 차단을 위해 37℃의 인큐베이터에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 종료 시, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05%의 Tween-20을 포함하는 pH 7.4의 PBS)으로 5회 세척하였다. 테스트하려는 항체(하이브리도마 또는 인간화 항체로부터 정제된 항체)를 샘플 희석액으로 다양한 농도로 희석하고, 50 μl/웰로 첨가하고, 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석한, 100 μl/웰의 HRP 라벨링된 염소 항-마우스 2차 항체(Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003) 또는 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(KPL, Cat No. 52-00-03)을 첨가하고, 실온에서 5 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 50 μl/웰의 1 M의 H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도 값을 NOVOStar 플레이트 판독기를 이용하여 판독하였다. Tim-3 과발현 CHO-S 세포에 대한 TIM-3 항체의 결합을 보여주는 EC50 값을 계산하였다. 시험 결과를 도 1 및 표 7에 나타내었다.

세포 결합 테스트에서 후보 항체에 대한 EC50 결정

후보 항체	세포 기반 결합 ELISA EC50(nM)	후보 항체	세포 기반 결합 ELISA EC50(nM)
mAb-1701	0.122	Ch1799	0.080
mAb-1799	0.117	h1799-005	0.063
Ch1701	0.166	h1799-006	0.095
h1701-005	0.602	h1799-007	0.109
h1701-006	0.735	h1799-008	0.067
h1701-007	-	h1799-009	0.076
h1701-008	2.422	h1799-010	0.077
h1701-009	0.187	h1799-011	0.114
h1701-010	0.069	h1799-012	0.158
h1701-011	0.188	h1799-013	0.139
h1701-012	0.221	h1799-014	0.116
h1701-013	0.199	h1799-015	0.188
h1701-014	0.124	h1799-016	0.117
h1701-015	0.265	h1799-017	0.194
h1701-016	0.058	h1799-018	0.215
h1701-017	0.105	h1799-019	0.119
h1701-018	0.087

결과는 TIM-3 항체인 제1701호 및 제1799호, 그리고 이의 인간화 항체들이 전장 인간 TIM-3 단백질을 과발현하는 CHO-s 세포에 대해 유리한 결합 활성을 보여줌을 나타낸다.

인간 TIM-3 과발현 세포에 대한 결합 활성을 HCDR2 점 돌연변이를 갖는 h1701-009 항체에 대해 테스트하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.

세포 결합 테스트에서 후보 항체에 대한 EC50 결정

후보 항체	결합 ELISA EC50(nM)
h1701-009	0.503
h1701-009 NNA	0.515
h1701-009 NHA	0.530
h1701-009 NEA	0.667
h1701-009 NMA	0.629
h1701-009 NMG	0.603
h1701-009 NEG	0.673
h1701-009 NVG	0.717
h1701-009 NLG	0.637
h1701-009 NKG	0.438
h1701-009 NAG	0.512
h1701-009 NHG	0.317

결과는 HCDR2 점 돌연변이를 갖는 h1701-009 항체들이 인간 TIM-3을 과발현하는 CHO-s 세포에 대해 여전히 강한 결합 활성을 나타냄을 보여준다.

시험예 2: 항-TIM-3 항체의 경쟁(competition) 시험

항체 A를 pH7.4의 PBS 완충액(Sigma, Cat No. P4417-100TAB)으로 2 μg/ml의 농도까지 희석하고, 96-웰 마이크로적정 플레이트에 50 μl/웰(Corning, Cat No. CLS3590-100EA)로 첨가하고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에 두었다. 액체를 제거한 다음, 5% 탈지유(Bright Dariy의 탈지유 분말)를 포함하는, PBS로 희석한 차단 용액을 200 μl/웰로 첨가하고, 차단을 위해 37℃의 인큐베이터에서 2.5시간 동안 또는 4℃에서 밤새(16~18시간) 인큐베이션하였다. 차단 종료 시, 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% Tween-20을 포함하는 pH7.4의 PBS)으로 5회 세척하였다. 샘플 희석액(1%의 BSA를 함유하는 pH 7.4의 PBS)으로 20 μg/ml 및 4μg/ml으로 희석된 항체 B와 최종 농도 0.4 μg/ml의 비오틴 라벨링된 TIM-3-Fc 단백질(자체 생산, 서열번호 1)의 사전 혼합 용액을 50 μl/웰로 첨가하고, 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, 반응 용액을 ELISA 플레이트로부터 제거하고, 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 샘플 희석액으로 희석한 100 μl/웰의 HRP가 라벨링된 스트렙타비딘(Sigma, Cat No. S2438)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(KPL, Cat No. 52-00-03)을 첨가하고, 실온에서 5 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 50 μl/웰의 1 M의 H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도 값을 NOVOStar 플레이트 판독기를 이용하여 판독하였다. Tim-3에 대한 결합에 대한 상이한 항체의 경쟁적 효과를 계산하였다.

TIM-3에 결합하는 mAb-1701 및 mAb-1799의 경쟁 테스트

	농도(μg/ml)	mAb-1701	mAb-1799
mAb-1701	20	0.054	1.599
mAb-1701	4	0.072	1.685
mAb-1799	20	0.835	0.091
mAb-1799	4	0.86	0.077

결과는 TIM-3에 대한 결합에 대해 mAb-1701과 mAb-1799 사이에 경쟁적인 관계가 없음을 나타낸다.

시험예 3: 비아코어(BIAcore) 검출을 이용한 항-TIM-3 항체의 친화도 시험

1. 뮤린 항체의 비아코어 친화도 검출

마우스 항체 포획 키트(Cat. #BR-1008-38, GE)의 설명서에 기술된 방법에 따라, 마우스 항체-포획 항체를 CM5 바이오센서 칩(Cat. #BR-1000-12, GE)에 공유적으로 접합시켜 테스트하려는 항체를 친화도 포획(affinity-capture)하였다. 그 후, TIM-3-His(Sino. Biol, Cat. 10390-H03H) 항원을 칩의 표면에 유동시키고, 비아코어(Biacore) 기기를 이용하여 실시간 반응 신호를 검출하여 결합 및 해리 곡선을 획득하였다. 친화도 값을 피팅(fitting)으로 얻었다. 테스트에서 각 해리 주기를 완료한 후, 마우스 항체 포획 키트에 제공된 재생 용액으로 바이오칩을 세척하고 재생시켰다. 결과를 표 10에 나타내었다.

후보 항체의 친화도 결정

후보 항체	이동상	친화도(M)
h1701	TIM-3-His	1.82E-10
h1799	TIM-3-His	2.36E-10

결과는 TIM-3 항체 mAb-1701 및 mAb303이 인간 TIM-3 단백질에 대하여 강한 결합 활성 및 친화도를 가짐을 나타낸다.

2. 키메라 항체 및 인간화 항체에 대한 비아코어 친화도 검출

인간 항체 포획 키트(Cat. #BR-1008-39, GE)의 설명서에 기술된 방법에 따라, 인간 항체-포획 항체를 CM5 바이오센서 칩(Cat. #BR-1000-12, GE)에 공유적으로 접합시켜 테스트하려는 항체를 친화도 포획한 다음, TIM-3-Flag-His(자체 생산, 서열번호 2) 항원을 칩의 표면에 유동시키고, 비아코어 기기를 이용하여 실시간 반응 신호를 검출하여 결합 및 해리 곡선을 획득하였다. 친화도 값을 피팅(fitting)으로 얻었다(도 11 참조). 테스트에서 각 해리 주기를 완료한 후, 인간 항체 포획 키트에 제공된 재생 용액으로 바이오칩을 세척하고 재생시켰다.

항-TIM-3 항체의 친화도

후보 항체	이동상	친화도(M)
Ch1701	TIM-3-His	1.39E-9
h1701-009		1.34E-9
h1701-010		2.25E-9
h1701-016		1.60E-9
Ch1799		1.76E-9
h1799-005		1.78E-9
h1799-006		1.89E-9
h1799-010		2.48E-9

결과는 본 개시에서 스크리닝된 인간화 항체가 인간 TIM-3 단백질에 대해 강한 결합 활성 및 친화도를 가짐을 나타낸다.

HCDR2 점 돌연변이를 갖는 h1701-009 항체의 친화도를 비아코어에 의해 검출하였다. 결과를 표 12에 나타내었다.

항-TIM-3 항체의 친화도

고정상	이동상	친화도(M)
h1701-009	TIM-3-His	5.99E-10
h1701-009 NAG		5.79E-10
h1701-009 NEG		6.40E-10
h1701-009 NEA		6.53E-10
h1701-009 NHG		6.40E-10
h1701-009 NHA		5.97E-10
h1701-009 NKG		4.72E-10
h1701-009 NLG		6.40E-10
h1701-009 NMG		6.75E-10
h1701-009 NMA		6.53E-10
h1701-009 NNA		5.69E-10
h1701-009 NVG		5.81E-10

결과는 위의 h1701-009 돌연변이체는 여전히 강한 TIM-3 친화도를 가짐을 나타낸다. NNG 부위에서의 돌연변이는 항원에 대한 항체의 친화도에 영향을 미치지 않는다.

시험예 4: 면역 세포 기능의 시험관 내 테스트

T 림프구의 활성화에 미치는 항-TIM-3 항체의 영향을 연구하기 위하여, 3종의 시험관 내 기능 테스트를 확립하였다: 혼합 림프구 반응 분석(MLR 분석), PBMC 활성화 테스트 및 초항원 황색포도구균 장독소 B(SEB) 자극 테스트

1. 혼합 림프구 반응 분석

실험 절차를 다음과 같이 간략하게 설명한다:

1) 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수집하고 정제하였다.

2) PBMC를 2×10⁶개 세포/ml의 밀도로 6-웰 NUNC 플레이트에 접종하고, 2시간 동안 배양하였다.

3) 비부착 세포를 제거하고, GM-CSF(100 ng/ml) 및 IL-4(100 ng/ml)를 이용하여 부착 세포를 5일 동안 자극한 다음, 세포를 2일 동안 TNFα(100ng/ml)와 인큐베이션하여 DC 세포 성숙을 유도하였다.

4) 10 ng/ml의 CD3 항체로 사전 코팅된 96-웰 플레이트에 성숙한 DC 세포를 상이한 공여자로부터의 PBMC와 1:5의 비율로 혼합하고, 상이한 농도의 h1701-009, h1799-005, AbTIM-3 및 음성 대조군 Fc-IgG를 병렬적으로 첨가하였다.

5) 5일 후, 상청액의 IFNγ의 농도를 ELISA로 검출하였다(결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다).

결과는 h1701-009, h1799-005 및 AbTIM-3 모두가 IFNγ의 분비를 효과적으로 자극하며, 이때, h1701-009 및 h1799-005는 더 강한 자극 효과를 나타냄을 보여준다.

2. PBMC 활성화 테스트

실험 절차를 다음과 같이 간략하게 설명한다:

1) 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수집하고 정제하고, 96-웰 플레이트를 10 ng/ml의 농도의 CD3 항체 및 CD28 항체로 코팅하였다.

2) PBMC를 1×10⁵개 세포/웰의 밀도로 코팅된 96-웰 플레이트에 접종하였다. 상이한 농도의 TIM-3 항체 및 음성 대조군 Fc-IgG를 병렬적으로 첨가하였다.

3) 6일 후, 세포 내 IFNγ 및 TIM-3 염색을 위해 세포를 수집하였다. FACS를 이용하여 모든 세포에서 IFNγ 양성 세포의 비율(IFNγ+%), IFNγ 기하 평균값, IFNγ 및 TIM-3 이중 양성 세포의 비율(TIM-3+IFNγ+%) 및 TIM-3+ 세포에서 IFNγ 기하 평균값을 분석하였다(도 3a 내지 도 3d).

결과는 h1701-009, h1799-005 및 AbTIM-3이 세포 내 IFNγ-양성 세포의 백분율 및 IFNγ의 발현을 다양한 정도로 증가시키며, 이때, h1701-009 및 h1799-005가 더 강한 효과를 가짐을 나타낸다.

3. SEB 자극 테스트

실험 절차를 다음과 같이 간략하게 설명한다:

1) 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수집하고 정제하였다.

2) PBMC를 1×10⁵개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 1 ng/ml의 SEB 및 상이한 농도의 TIM-3 항체 및 음성 대조군 Fc-IgG를 병렬적으로 첨가하였다.

3) 5일 후, ELISA에 의한 IL12 및 IFNγ 검출을 위해 상청액을 수집하였다(각각 도 4a 및 도 4b 참조).

결과는 h1701-009, h1799-005 및 AbTIM-3 모두가 IL-12 및 IFNγ의 SEB 유도 분비를 효과적으로 자극하며, 이때, h1701-009 및 h1799-005는 낮은 용량에서 더 큰 장점을 나타냄을 보여준다.

시험예 5: 래트에서의 항-TIM-3 인간화 항체 h1701-009 및 h1799-005의 PK 결정

180 내지 240 g 무게의 12마리의 SD 래트를 Sippr-BK 실험동물 주식회사에서 구입하였다. 동물들은 급이 기간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있었고, 3일 이상 실험실 환경, 12/12시간 명암 주기 조정, 16~26℃의 온도, 40~70%의 상대 습도에 적응하게 되었다. 테스트 시작 전날, SD 래트를 넘버링하고, 무작위로 군당 3마리(수컷 2마리, 암컷 1마리)로 군을 나누었다. 테스트 당일, 두 군의 래트에게 각각 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량으로 테스트제(test agent)인 h1701-009를 정맥 내 주사하였다. 나머지 2개 군의 래트에게는 각각 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량으로 테스트제 h1799-005를 정맥 내 주사하였다. 정맥 내 주사의 부피는 5 ml/kg이었다.

다양한 시점, 즉, 투여 전, 투여 후 5분, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 및 28일에 혈액을 수집하였다. 항응고 시약을 첨가하지 않고 각 동물로부터 0.2 ml의 전혈을 수집하였다. 혈액을 수집한 후, 4℃에서 30분 동안 두었다가 1000 g에서 15분 동안 원심분리시키고, 상청액을 EP관에 옮기고 80℃에서 보관하였다.

ELISA 방법을 이용하여 혈청 중 항체의 농도를 검출하였고, Winnolin 소프트웨어를 이용하여 테스트한 작용제의 약동학 파라미터를 계산하였다. 얻은 주요 약동학 파라미터를 표 13에 나타내었다.

래트에서 h1799-005 및 h1701-009의 반감기

	h1799-005		h1701-009
용량(mg/kg)	3	10	3	10
t_1/2(일)	13.6±1.1	11.4±1.7	10.6±1.8	15.5±2.5

SD 래트에게 10 mg/kg의 항-TIM-3 항체 h1701-009 및 h1799-005를 정맥 내 주사한 결과, 래트에서 비슷한 노출량을 초래한다. 3 또는 10 mg/kg의 용량의 항체 h1799-005의 노출량의 증가는 용량의 증가와 선형적으로(linearly) 상관관계가 있다. 3 또는 10 mg/kg의 용량의 항체 h1701-009의 노출량의 증가는 용량의 증가보다 약간 더 높다. 항체 h1701-009의 제거 반감기는 h1799-005의 제거 반감기와 유사하다.

시험예 6: DSC에 의한 h1701-009 및 h1799-005 항체의 열 안정성 검출

상이한 pH 조건의 상이한 완충액 시스템을 열 안정성에 대해 비교하였다. 상이한 pH 값에 상응하는 예시적인 완충액 시스템은 다음과 같다: 10 mM의 PB(pH 7), 15 mM의 His(pH 6.0), 및 10 mM의 아세트산염(pH 5.2). 샘플을 상응하는 완충액으로 교체하고, 샘플 농도를 약 1 mg/ml으로 조절하고, MicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)를 검출에 사용하였다. 테스트 전에, 각 샘플 및 블랭크 완충액을 1 내지 2분 동안 진공 탈기장치로 탈기시켰다. 400 μl의 샘플 또는 블랭크 완충액을 샘플 플레이트의 각 웰에 첨가하였다(기기로의 로딩 부피는 300 μl이다). 14%의 Decon 90 및 ddH₂O를 세정 목적을 위해 마지막 두 쌍의 웰 플레이트에 첨가하고, 샘플 플레이트를 로딩한 다음, 플라스틱 소프트 커버로 덮었다. 스캐닝 온도는 25℃에서 시작하여 100℃에서 끝났고, 스캐닝 속도는 60℃/h였다. 특정 결과를 표 14에 나타내었다. 여러 테스트 시스템에서, h1701-009와 h1799-005 둘 다 유리한 열 안정성을 나타낸다.

상이한 pH에서 h1701-009 및 h1799-005 항체의 열 안정성 모니터링 표

샘플	완충액	Tm-개시(℃)	TM(℃)
h1701-009	pH7.0	63.09	74.59
	pH 6.0	59.1	77.24
	pH 5.2	60.32	77.13
h1799-005	pH7.0	62.99	76.63
	pH 6.0	60.01	77.49
	pH 5.2	60.2	77.69

시험예 7: 특정 농도 하의 주기적 안정성을 연구하기 위한 SEC-HPLC에 의한 샘플의 순도 모니터링

예시적인 조건 하에서, 예컨대, 샘플 농도가 약 50 mg/ml로 조절되고, PBS(pH 7.4) 시스템의 상이한 항체를 예를 들어, -80℃에서 5회의 반복된 냉동-해동 후, 1개월 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장하여 안정성을 비교하였다. Xbridge 단백질 BEH SEC 200A(Waters) HPLC 컬럼을 사용하여 항체 순도를 검출하였다. 1개월 동안 관찰 후, h1701-009와 h1799-005는 유리한 안정성을 나타내며, 40℃에서 1개월 동안 가속화된 SEC 순도에서 유의한 변화는 없었다.

시험예 8: 항체의 화학적 안정성

서열번호 51 내지 55에 제시된 바와 같은 h1701-009, h1799-005 및 h1701-009 돌연변이체의 화학적 안정성에 대해 테스트하였다.

500 μg의 테스트 대상 항체를 40℃의 수조에서 500 μl의 pH 7.4의 PBS에 용해시키고, 효소적 가수분해 테스트를 위해 제0일, 제14일, 및 제28일에 샘플을 취하였다. 상이한 시점에 취한 100 μg의 샘플을 100 μl의 0.2 M His-HCl, 8 M Gua-HCl 용액, pH 6.0에 용해시키고, 3 μl의 0.1g/mL DTT를 첨가하고, 샘플을 1시간 동안 50℃의 수조에 인큐베이션한 다음, 0.02 M의 His-HCl 용액, pH 6.0을 이용하여 2회 한외여과하고, 3 μL의 0.25 mg/mL의 트립신을 첨가하고, 샘플을 37℃의 수조에서 밤새 가수분해시켰다. Agilent 6530 Q-TOF를 LC-MS 검출 및 분석에 사용하였다. 결과는 h1799-005가 1개월의 가속화 동안 40℃에서 유의미한 이성질화, 산화 및 탈아미드화 변형을 보여주지 않음을 나타내어, 이러한 분자가 유리한 화학적 안정성을 가지고 있음을 시사한다. h1701-009의 검출의 경우, 유의미한 산화 및 이성질화 변형은 발견되지 않지만, N54N55G56 부위에 강한 탈아미드화 변형이 있다. 일련의 아미노산 돌연변이를 위의 부위에 도입하였다. 예시적인 돌연변이는 예컨대, NLG, NVG, NMA, NEA, NNA 등을 포함한다. 시험관 내 활성은 이들 돌연변이가 생물학적 활성에 영향을 미치지 않음을 검증하였다. 가속화 테스트 후, LC-MS 분석은 이들 돌연변이체가 탈아미드화 변형을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 표 15는 가속화 후 상이한 돌연변이체의 탈아미드화 변형의 비율을 보여준다.

CDR2 돌연변이가 있는 h1701-009 항체의 화학적 안정성 모니터링 표

	제0일	1주일	2주일
h1701-009	11.16%	17.55%	34.62%
h1701-009NLG	0	0	0
h1701-009NVG	0	0	0
h1701-009NMA	0	0	0
h1701-009NEA	0	0	0
h1701-009NNA	0	0	13.58%

실시예 2. 항-TIM3 항체 제형 완충액 시스템의 pH 값의 스크리닝

다음의 완충액을 이용하여 항-TIM3 항체 제형을 제조하였고, 이때, 항체 농도는 50 mg/ml이었다(h1799-005, 실시예 1에 따라 제조됨. 이후 사용된 것들도 유사하게 제조됨):

1) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 4.5

2) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0

3) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5

4) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0

고온(40℃)에서의 안정성을 연구하기 위하여 샘플을 수집하였다. 결과는 5.5 내지 6.0의 pH 범위가 항-TIM3 항체에 적합함을 나타낸다(표 16 참조).

항-TIM3 항체에 대한 PH 값 스크리닝 결과

번호	보존 기간	SEC (%) 단량체	ICE(%)
번호	보존 기간	SEC (%) 단량체	중성 피크	알칼리성 피크
1	D0	96.1	67.7	6.5
1	40℃ D7	95.5	57.5	18.1
2	D0	96.3	67.7	6.4
2	40℃ D7	95.0	59.7	15.4
3	D0	96.1	67.9	6.2
3	40℃ D7	94.9	63.4	10.5
4	D0	96.0	68.9	5.8
4	40℃ D7	95.6	64.5	8.3

비고: D는 일(day)을 나타낸다. 예를 들어, D7은 제7일을 나타낸다.

실시예 3. 항-TIM3 항체 제형을 위한 완충액 시스템의 스크리닝

다음의 완충액을 이용하여 항-TIM3 항체(h1799-005) 제형을 제조하였는데, 이때, 항체 농도는 50 mg/ml이었다:

1) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0

2) 10 mM의 시트르산-시트르산 나트륨, pH 6.0

3) 10 mM의 히스티딘-염산, pH 6.0

4) 10 mM의 인산이수소나트륨-인산수소이나트륨, pH 6.0

5) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5

6) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨, pH 5.5

7) 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨, pH 5.5

8) 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨, pH 6.0

9) 10 mM의 히스티딘-염산, pH 5.5

10) 10 mM의 시트르산-시트르산 나트륨, pH 5.5

고온(40℃) 및 저온에서 빛(4℃/4500 lx)에서의 안정성을 연구하기 위하여 샘플을 수집하였다. 결과는 항-TIM3 항체에 더욱 적합한 완충액 시스템은 히스티딘-염산(His-HCl), 아세트산-아세트산 나트륨(AA) 및 히스티딘-아세트산(His-AA) 완충액임을 나타낸다(표 17 참조). 실제 생산 샘플의 실제 pH가 목표 pH로부터 약간 이동함을 고려할 때, TIM3의 안정성을 위한 최적의 완충액 시스템은 His-AA 시스템이고, 다음으로 His-HCl 및 AA 시스템이 이어진다.

항-TIM3 항체에 대한 상이한 pH 값을 갖는 완충액 시스템의 스크리닝 결과

번호	시점	외관	SEC 단량체(%)	ICE(%)		비 환원 CE(%)
번호	시점	외관	SEC 단량체(%)	산성 피크	중성 피크	비 환원 CE(%)
1	D0	맑고 투명, 미량의 미세 입자	95.4	25.6	66.8	95.8
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.1	39.1	52.5	93.8
	빛 D10	맑고 투명, 미량의 미세 입자	92.8	30.5	61.2	95.9
2	D0	미세 입자	95.6	26.1	65.5	95.7
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	95.8	37.0	54.5	93.9
	빛 D10	미세 입자	93.3	26.2	65.7	95.8
3	D0	미세 입자	95.4	25.9	65.5	95.7
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.2	38.6	51.9	94.2
	빛 D10	미세 입자	93.0	29.5	64.9	95.9
4	D0	미세 입자	95.5	24.8	67.3	95.8
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	95.7	36.3	54.1	92.8
	빛 D10	미세 입자	91.7	28.3	63.6	95.2
5	D0	미세 입자	95.6	25.4	66.1	95.6
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.3	35.5	53.5	94.2
	빛 D10	미세 입자	93.4	28.1	62.8	96.1
6	D0	미세 입자	95.5	25.7	65.1	95.7
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.0	35.3	53.0	94.1
	빛 D10	미세 입자	93.0	28.7	61.2	96.1
7	D0	맑고 투명	95.4	24.7	66.4	95.7
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.0	36.4	51.2	94.4
	빛 D10	맑고 투명	93.3	24.8	65.6	95.9
8	D0	미세 입자	95.1	25.3	65.3	95.5
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	95.7	38.6	52.4	93.7
	빛 D10	미세 입자	92.2	26.7	66.2	95.6
9	D0	맑고 투명	95.4	25.1	66.7	95.7
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	96.4	33.2	54.2	94.2
	빛 D10	맑고 투명	93.5	28.2	64.2	96.1
10	D0	미세 입자	95.7	25.0	66.2	95.8
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	95.8	36.0	50.0	94.0
	빛 D10	미세 입자	93.5	26.4	64.3	96.1

비고: D는 일(day)을 나타낸다. 예를 들어, D21은 제21일을 나타낸다.

실시예 4. 항-TIM3 항체 제형을 위한 안정화제의 스크리닝

항체 농도가 50 mg/ml인 항-TIM3 항체(h1799-005) 제형을 상이한 당류 및 완충액으로 제조하였다.

1) 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 70 mg/ml의 수크로스;

2) 10 mM의 히스티딘-아세트산 pH 6.0, 70 mg/ml의 α,α-트레할로스 이수화물;

위에서 제조한 제형의 샘플을 대상으로 고온(40℃) 및 저온에서 빛(5 ± 3℃, 4500 lx)에서의 안정성 연구를 수행하였다. 결과를 표 18에 나타내었다. 결과는 수크로스와 트레할로스가 TIM3 항체의 안정성에 유사한 효과를 나타냄을 보여준다. 수크로스 농도가 80 mg/ml인 경우, 삼투압은 약 300 mosm/kg이고, 이는 등장압(isotonic pressure)에 가깝다. 따라서, 바람직하게는 수크로스 농도는 80 mg/ml이다.

안정화제에 대한 스크리닝 테스트 결과

제형 성분	시점	외관	SEC(%)
제형 성분	시점	외관	중합체	단량체	단편
50 mg/ml의 항-TIM3 항체, 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 70 mg/ml 수크로스	D0	맑고 투명	1.3	95.8	2.9
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	2.2	96.3	1.5
	빛 D10	맑고 투명	2.0	93.0	5.0
50 mg/ml의 항-TIM3 항체, 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 70 mg/ml의 α,α-트레할로스 이수화물	D0	맑고 투명	1.3	95.6	3.1
	40℃ D21	맑고 투명, 푸른 유백색	2.2	96.4	1.5
	빛 D10	맑고 투명	2.0	93.0	5.0

실시예 5. 항-TIM3 항체 제형을 위한 계면활성제의 스크리닝

상이한 농도 및 상이한 종류의 계면활성제를 포함하는 다음의 완충액을 이용하여 항-TIM3 항체(h1799-005) 제형을 제조하였는데, 이때, 수크로스 농도는 70 mg/ml이고, 항체 농도는 50 mg/ml이었다:

1) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5;

2) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80;

3) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80;

4) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80;

5) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 20;

위의 방법에 따라 제조한 항-TIM3 항체 제형(1~5군)의 샘플을 0.9%의 염화나트륨 주사용액에 희석하였는데, 단백질 농도를 0.5 mg/ml로 희석하였다. 희석 후 각 군의 샘플의 불용성 입자가 관찰되었다. 테스트 결과를 표 19에 나타내었다. 결과는 0.4 mg/ml 이상의 폴리소르베이트 80이 항-TIM3 항체에 대해 더 나은 안정성을 제공하며, 따라서 0.4 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 선택하였고, 바람직하게는 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80이 항-TIM3 항체를 위한 계면활성제로서 작용하였음을 나타낸다.

항-TIM3 항체에 대한 폴리소르베이트 희석액의 스크리닝 결과

번호	시간	희석 후 불용성 입자(입자/ml)
번호	시간	2 μm	10 μm	25 μm
1	0	4710	642	35
1	24시간	2705	614	70
2	0	856	45	2
2	24시간	299	20	1
3	0	248	7	0
3	24시간	87	4	0
4	0	174	24	1
4	24시간	77	9	1
5	0	429	81	9
5	24시간	96	10	0

실시예 6. 제형의 성분의 종합적인 스크리닝

단백질 농도, 완충액 시스템의 종류, 및 pH를 더욱 최적화하기 위하여, JMP 소프트웨어를 실험 설계(design of experiment, DoE)에 사용하였고, RSM 모델을 사용하여 일련의 제형을 수득하였다(아래 참조). 상이한 농도의 항-TIM3 항체, 80 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는 항-TIM3 항체(h1799-005) 제형을 상이한 이온 강도 및 상이한 pH를 갖는 다음의 완충액 시스템에 제조하였다:

1) 20 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 60 mg/ml의 TIM3 항체;

2) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 50 mg/ml의 TIM3 항체;

3) 20 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 50 mg/ml의 TIM3 항체;

4) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 40 mg/ml의 TIM3 항체;

5) 30 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 50 mg/ml의 TIM3 항체;

6) 20 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 50 mg/ml의 TIM3 항체;

7) 30 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0, 60 mg/ml의 TIM3 항체;

8) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 60 mg/ml의 TIM3 항체;

9) 20 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0, 50 mg/ml의 TIM3 항체;

10) 30 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 60 mg/ml의 TIM3 항체;

11) 20 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5, 40 mg/ml의 TIM3 항체;

12) 30 mM의 히스티딘-아세트산, pH 6.0, 40 mg/ml의 TIM3 항체;

13) 30 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0, 40 mg/ml의 TIM3 항체;

14) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0, 60 mg/ml의 TIM3 항체;

15) 10 mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0, 40 mg/ml의 TIM3 항체;

위의 방법에 따라 제조한 항-TIM3 항체(1~15군) 제형의 샘플을 안정성 분석을 위하여 40℃에서 보관하고, IEC 중성 피크와 산성 피크 사이의 차이를 평가 지표로 이용하고, 결과를 최소자승법(least square method)에 의해 통계적으로 분석하였다. 시험 결과를 도 5 및 표 20에 나타내었다. 결과는 10 mM의 이온 강도를 갖는 히스티딘-아세트산 시스템, pH 5.5가 항-TIM3 항체의 안정성에 유리하며, 단백질은 40 내지 60 mg/ml 사이의 농도에서 더욱 안정적임을 나타낸다. 50 mg/ml의 중앙값dl 항-TIM3 항체의 최종 단백질 농도로 사용된다.

고온에서 보관된 TIM3 항체의 안정성 테스트 결과

배치 번호	시간	SEC(%) 단량체	IEC(%)			NR-CE(%)
배치 번호	시간	SEC(%) 단량체	산성 피크	중성 피크	알칼리성 피크	NR-CE(%)
1	D0	98.7	18.8	67.3	13.9	97.1
1	40℃ M1	97.1	28.8	54.3	16.8	96.3
2	D0	98.3	19.0	67.7	13.3	97.3
2	40℃ M1	97.1	29.7	54.6	15.7	96.8
3	D0	98.8	19.1	67.6	13.3	97.1
3	40℃ M1	97.1	30.1	53.5	16.4	96.4
4	D0	98.7	19.1	68.1	12.8	97.5
4	40℃ M1	97.3	33.2	54.5	12.3	96.7
5	D0	98.9	19.1	67.6	13.2	97.4
5	40℃ M1	97.3	32.8	54.0	13.1	96.2
6	D0	98.8	19.3	67.9	12.8	97.4
6	40℃ M1	97.4	32.9	54.1	13.0	96.9
7	D0	98.8	19.1	67.4	13.5	97.1
7	40℃ M1	97.0	26.6	51.5	21.9	96.2
8	D0	98.7	19.2	67.9	12.9	97.2
8	40℃ M1	96.9	34.0	55.0	11.1	96.3
9	D0	98.5	19.1	67.6	13.3	97.2
9	40℃ M1	96.7	30.0	53.4	16.6	96.1
10	D0	98.9	19.1	67.8	13.0	97.1
10	40℃ M1	97.0	36.3	50.0	13.7	96.3
11	D0	98.8	19.1	67.6	13.3	97.6
11	40℃ M1	97.2	31.9	51.6	16.4	97.0
12	D0	98.8	19.3	68.3	12.4	97.4
12	40℃ M1	96.5	37.8	49.9	12.3	96.5
13	D0	98.8	19.1	66.8	14.1	97.4
13	40℃ M1	97.0	27.0	47.7	25.4	97.1
14	D0	98.5	18.9	67.2	13.9	97.4
14	40℃ M1	96.9	27.4	50.6	22.0	97.0
15	D0	98.6	19.0	67.1	13.9	97.5
15	40℃ M1	97.0	27.7	50.7	21.7	97.0

비고: M은 개월을 나타낸다. 예를 들어, M1은 1개월을 의미한다.

실시예 7. 대안적인 선택적 제형

또한, 본 개시는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 항-TIM3 항체 제형도 제공한다:

(1) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 6.0;

(2) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 20 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.5;

(3) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 6.5;

(4) 100 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.4;

(5) 100 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 20 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.4;

(6) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 90 mg/ml의 트레할로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2;

(7) 60 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 70 mg/ml의 수크로스, 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2;

(8) 40 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 70 mg/ml의 수크로스, 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.4;

(9) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 90 mg/ml의 수크로스, 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.5;

(10) 40 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 90 mg/ml의 트레할로스, 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 20 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 6.0;

(11) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 70 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2;

(12) 60 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 75 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.2;

(13) 55 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 75 mg/ml의 수크로스, 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.8;

(14) 45 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 85 mg/ml의 수크로스, 0.7 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.8;

(15) 50 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액 pH 5.9;

(16) 100 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 80 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 10 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 pH 5.5;

(17) 70 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 90 mg/ml의 수크로스, 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 5 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 pH 5.5;

(18) 1 mg/ml의 TIM3 항체(h1799-005), 60 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 20 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 pH 5.8;

(19) 90 mg/ml의 TIM3 항체, 60 mg/ml의 수크로스, 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 20 mM의 히스티딘-아세트산 완충액, pH 5.8.

<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTI-TIM3 ANTIBODY PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF <130> 719058CPCT <160> 74 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 430 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence for Fusion protein of TIM-3 extracellular domain and hIgG1 Fc <400> 1 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala 20 25 30 Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro 35 40 45 Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val 50 55 60 Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu 85 90 95 Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile 100 105 110 Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys 115 120 125 Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala 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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 340 345 350 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 355 360 365 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 370 375 380 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 385 390 395 400 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 405 410 415 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence for TIM-3 extracellular domain with Flag-tag and His-tag <400> 2 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala 20 25 30 Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro 35 40 45 Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val 50 55 60 Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val 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Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Trp Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Arg Trp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence for HCDR2 region of h1701-009 NLG mutant antibody <400> 62 Asp Ile Ile Pro Asn Leu Gly Gly Ser Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence for HCDR2 region of h1701-009 NVG mutant antibody <400> 63 Asp Ile Ile Pro Asn Val Gly Gly Ser Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> Amino acid sequence for HCDR2 region of h1701-009 NNA mutant antibody <400> 64 Asp Ile Ile Pro Asn Asn Ala Gly Ser Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> 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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp 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Claims

TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 완충액을 포함하는 제약 조성물로서, 완충액은 아세트산염, 히스티딘염, 숙신산염, 인산염 및 시트르산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 완충액은 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염 완충액이고, 완충액의 pH는 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.5 내지 6.0, 가장 바람직하게는 약 5.5인 것인, 제약 조성물.
제1항에 있어서, 아세트산 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액이고, 히스티딘염 완충액은 히스티딘-아세트산 완충액 또는 히스티딘-염산 완충액이고, 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산나트륨 완충액이고, 인산염 완충액은 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액이고, 바람직하게는 완충액은 히스티딘-염산, 아세트산-아세트산 나트륨 또는 히스티딘-아세트산 완충액이고, 가장 바람직하게는 히스티딘-아세트산 완충액인 것인, 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 20 mM, 가장 바람직하게는 약 10 mM인 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 40 mg/ml 내지 60 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 50 mg/ml인 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 당류를 추가로 포함하고, 바람직하게는 당류는 트레할로스 또는 수크로스, 가장 바람직하게는 수크로스인 것인, 제약 조성물.
제5항에 있어서, 당류의 농도는 50 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 70 mg/ml 내지 90 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 80 mg/ml인 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하고, 바람직하게는 계면활성제는 폴리소르베이트, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 것인, 제약 조성물.
제7항에 있어서, 계면활성제의 농도는 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.4 mg/ml인 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 약 1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
(b) 약 5 mM 내지 30 mM의 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염 완충액,
(c) 약 50 mg/ml 내지 100 mg/ml의 당류, 및
(d) 약 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 계면활성제를 포함하고,
바람직하게는, 제약 조성물은 (a) 40 mg/ml 내지 60 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 또는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.0, (c) 70 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트를 포함하고;
가장 바람직하게는, 제약 조성물은 (a) 약 50 mg/ml의 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 약 10 mM의 히스티딘-아세트산 완충액 또는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.5, (c) 약 80 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (i) 또는 (ii)로부터 선택된 임의의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 제약 조성물:
(i) 각각 서열번호 8, 43 및 10의 서열에 제시된 바와 같거나 각각 서열번호 8, 43, 및 10과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역; 및/또는 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같거나 각각 서열번호 11, 12 및 13과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
이때, 서열번호 43은 서열 DIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKD에 제시된 바와 같고, X₁은 N, L, V, M 및 E로 구성된 군으로부터 선택되고, X₂는 N, E, M, H, K, L, A 및 V로 구성된 군으로부터 선택되고, X₃은 G 및 A로 구성된 군으로부터 선택됨; 또는
(ii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 서열에 제시된 바와 같거나 각각 서열번호 14, 15, 및 16과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역; 및/또는 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 제시된 바와 같거나 각각 서열번호 17, 18 및 19와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제10항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (a) 내지 (m)으로부터 선택된 임의의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 제약 조성물:
(a) 각각 서열번호 8, 9 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(b) 각각 서열번호 8, 62 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(c) 각각 서열번호 8, 63 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(d) 각각 서열번호 8, 64 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(e) 각각 서열번호 8, 65 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(f) 각각 서열번호 8, 66 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(g) 각각 서열번호 8, 67 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(h) 각각 서열번호 8, 68 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(i) 각각 서열번호 8, 69 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(j) 각각 서열번호 8, 70 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(k) 각각 서열번호 8, 71 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(l) 각각 서열번호 8, 72 및 10의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 11, 12 및 13의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
(m) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 서열에 제시된 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR1~3 영역 및 각각 서열번호 17, 18 및 19의 서열에 제시된 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR1~3 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합.
제10항 또는 제11항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제약 조성물.
제12항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체이고, 인간화 항체의 경쇄 FR 영역 및 중쇄 FR 영역의 서열은 각각 인간 생식선 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 유래하는 것인, 제약 조성물.
제13항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하고, 변이체는 서열번호 20 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이를 갖고, 바람직하게는 복귀 돌연변이는 서열번호 20의 D89E, R98T, G49A, M48I, M70L, R38K, 및 V68A로부터 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나이거나, 또는 복귀 돌연변이는 서열번호 31의 Q3K 및/또는 R87K인 것인, 제약 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하고, 변이체는 서열번호 21 또는 32에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 복귀 돌연변이를 갖고, 바람직하게는 복귀 돌연변이는 서열번호 21의 A43S, 또는 서열번호 32의 Q3K, I48V, K45Q, A43S 및 T85S로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는
서열번호 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 28으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는
서열번호 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 서열번호 36, 37, 38, 39 또는 40으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는
서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 서열번호 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는
서열번호 4에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는
서열번호 6에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 또는
바람직하게는
서열번호 24에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
서열번호 33에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
서열번호 51에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
서열번호 52에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 서열번호 41에 제시된 바와 같은 인간 중쇄 불변 영역 서열 및 서열번호 42에 제시된 바와 같은 인간 경쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 항체는 서열번호 73에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 74에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함하는 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 항체는 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하여 TIM-3에 결합하는 것인, 제약 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 제조 방법으로서, TIM3 항체의 모액(stock solution)을 완충액으로 교체하는 단계를 포함하는 포함하는 방법.
TIM3 항체를 포함하는 동결건조 제형으로서, 동결건조 제형은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 동결건조하여 수득한 것인, 동결건조 제형.
TIM3 항체를 포함하는 재구성 용액으로서, 재구성 용액은 제20항에 따른 동결건조 제형을 재구성하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 재구성 용액.
용기를 포함하는 제품으로서, 용기는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 포함하거나, 제20항에 따른 동결건조 제형을 포함하거나, 제21항에 따른 재구성 용액을 포함하는 것인, 제품.
인간 TIM-3 양성 세포와 관련된 질환의 치료 또는 진단용 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물 또는 제20항에 따른 동결건조 제형 또는 제21항에 따른 재구성 용액 또는 제22항에 따른 제품의 용도.
암, 자가면역 질환 및 알레르기 질환의 치료 방법으로서, 질환을 가진 환자에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물 또는 제20항에 따른 동결건조 제형 또는 제21항에 따른 재구성 용액 또는 제22항에 따른 제품을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 암은 폐암(lung cancer), 편평상피세포 폐암(squamous cell lung cancer), 흑색종(melanoma), 신장암(kidney cancer), 유방암(breast cancer), IM-TN 유방암(IM-TN breast cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 백혈병(leukemia), 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 후두암(laryngeal cancer), 간암(liver cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 위암(gastric cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer) 및 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 자가면역 질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), I형 당뇨병(diabetes Type I), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 경피증(scleroderma), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.