JP2022513553A - 抗ｔｉｍ３抗体医薬組成物およびその使用 - Google Patents

抗ｔｉｍ３抗体医薬組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本出願において開示されるのは、ＴＩＭ３抗体医薬組成物およびその使用である。特に、該医薬組成物は、バッファー中にＴＩＭ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。さらに、該医薬組成物は、糖類および非イオン性界面活性剤をさらに含む。本発明の医薬組成物は良好な安定性を有する。

Description

本発明は医薬製剤の分野に属し、特に、ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、および抗癌薬剤としてのその使用に関する。
本明細書の記載は、本発明に関連する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。
T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子3(ＴＩＭ－３)は、A型肝炎ウイルスセルラレセプター2(HAVCR-2)とも呼ばれる。ＴＩＭ－３はI型膜表面タンパク質であり、TIMファミリーのメンバーに属する。ヒトＴＩＭ－３分子は、シグナルペプチド、Ig可変領域(IgV領域)、Ser/Thrトランスムチン領域、膜貫通領域および細胞質領域を含む301アミノ酸から構成され、ヒトＴＩＭ－３はマウスＴＩＭ－３と63%の相同性を共有する。
ＴＩＭ－３はIFN-γ分泌性Tヘルパー細胞(Th1およびTh17)、T調節細胞(Treg)、樹状細胞(DC)、単球, マスト細胞、NK細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)(例、Claytonら、JImmunol、192(2):782-791(2014); Jonesら、JExpを参照)の表面に選択的に発現される。Med.,205: 2763－2779(2008))。現在知られているＴＩＭ‐３のレセプターは、ホスファチジルセリンガレクチン‐9(Galectin‐9, Gal‐9)、高移動度群タンパク質1(HMGB1)及びがん胎児性抗原細胞接着分子1(CEACAM1)を含む。
ＴＩＭ－３は、多くの方法で免疫システムの機能を調節することができる。Th1細胞上のリガンドGal-9と結合してTh1細胞反応をダウンレギュレートし、Th1細胞アポトーシスを誘導することができる。自己免疫疾患や同種異系免疫疾患(全身性エリテマトーデス、ぜん息など)、免疫トレランスにかかわっている。単球マクロファージによって発現されるＴＩＭ－３はホスファチジルセリンと相互作用して、アポトーシス細胞のファゴサイトーシスを促進する。腫瘍浸潤性DCにおいて、ＴＩＭ－３はリガンドHMGB1と結合して、核酸の正確な輸送を阻害し、それにより、核酸免疫反応を阻害し、免疫逃避に関与する。ＴＩＭ－３は免疫細胞で発現するだけでなく、卵巣がん、髄膜腫、メラノーマなどの腫瘍細胞で過剰発現し、直接的に腫よう成長を促進する。ＴＩＭ－３の発現をダウンレギュレートすると、HeLa細胞の浸潤と転移を有意に阻害できる。ＴＩＭ－３の過剰発現は肺がん, 胃がん(gastric cancer), 前立腺がんや子宮頸がんの予後不良と密接に関連している。血液腫瘍ようでは、ＴＩＭ－３はMDS患者の急性骨髄性白血病と造血幹細胞の白血病幹細胞上に過剰発現し、ＴＩＭ－３＋造血幹細胞は悪性生物学的特徴(低分化、低アポトーシスと高増殖)を有する。したがって、自然免疫システムの機能を改善するためにＴＩＭ－３(ＴＩＭ－３抗体など)の活性を阻害することは、腫瘍の治療のための新しい方法になることが期待される(例えば、Ngiow et a1、Cancer Res.,71(21):1－5(2011); Guo et a1、Journal of Translational Medicine,11: 215(2013);およびNgiow et a1、Cancer Res.,71(21):6567－6571(2011)を参照のこと)。
抗体薬剤の安定性は、抗体の薬効に影響を及ぼす重要な因子の1つ。これらの中で、アスパラギン(Asn)およびグルタミン(Gln)の非酵素的脱アミド化は抗体を不安定かつ不均一にすることができ、抗体分子の一般的な化学劣化経路の1つ。文献では、いくつかのIgG1サブタイプ抗体がCDR領域におけるアミノ酸の脱アミド化および異性化のために、それらの生物学的活性を失うことが報告されている。Huangらは、IgG1モノクローナル抗体の重鎖可変領域2(CDR2)に位置するAsn55上の脱アミド化がそれらの結合活性を有意に低下させることを見出した。したがって、抗体発生の過程において、抗体の安定性およびバイオアベイラビリティを増大させるために、対応するアミノ酸は、in抗体での脱アミド化を減少させるために回避または変異されるべきである。
現在、WO2011159877、WO2013006490、WO2015117002、WO2016144803、WO2016161270、US20150218274など、TIM-3抗体に関する報告がある。しかし、国内あるいは国内では、2つのTIM-3抗体のみが治験段階にある。TIM-3抗体は他の抗体薬剤もまだ発見・研究段階にあり、実用化されていない。したがって、TIM‐3関連疾患の治療の研究および出願のために、より高い活性、高い親和性および高い安定性を有するTIM‐3抗体をさらに開発しなければならない。
本発明は、安定な性能を有するTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物であって、製剤および投与により有利な医薬組成物を提供する。
本発明はTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントおよびバッファーを含む医薬組成物を提供し、バッファーは、酢酸塩、ヒスチジン塩、コハク酸塩、リン酸塩、クエン酸バッファーからなる群から選択され、好ましくはバッファーは酢酸塩バッファーおよびヒスチジン塩バッファーである。
いくつかの実施形態に、医薬組成物中の酢酸塩バッファーは酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファーであり、ヒスチジン塩バッファーはヒスチジン－酢酸バッファーまたはヒスチジン－塩酸バッファーであり、コハク酸バッファーはコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーであり、リン酸バッファーはリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファーであり、クエン酸バッファーはクエン酸－クエン酸ナトリウムであり、好ましくはヒスチジン－塩酸、酢酸－ナトリウム酢酸塩またはヒスチジン－酢酸バッファー、最も好ましくはヒスチジン－酢酸バッファーである。
いくつかの実施形態に、医薬組成物中のバッファーの濃度は約5mM～30mM、好ましくは約10mM～30mM、好ましくは約5mM～20mM、好ましくは約10mM～20mMであり、非限定的な例としては、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、30mM、最も好ましくは約10mMが挙げられる。
いくつかの実施形態に、医薬組成物中のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度は、約1mg/ml～100mg/ml、好ましくは約40mg/ml～60mg/ml、好ましくは50mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/m、70mg/m、80mg/m、90mg/m、100mg/ml、最も好ましくは50mg/mlである。
いくつかの実施形態に、医薬組成物中のバッファーのpH値は約5.0～6.5、好ましくは約5.0～6.0、好ましくは約5.2～5.8、または好ましくは約5.5～6.0、最も好ましくは5.5であり、非限定的な例としては、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0および約6.5が挙げられる。
さらに、いくつかの実施形態に、上記の医薬組成物はまた、糖を含む。本発明の「糖類」は、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖類アルコール、還元糖類、非還元糖類などを含む、従来の構成(CH2O)nおよびその誘導体を包含する。糖類は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセリン、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メリトリオース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルトロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルトロースなどからなる群より選択することができる。好ましい糖類は非還元二糖類であり、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースである。
いくつかの実施形態に、上記の医薬組成物中の糖類の濃度は約50mg/ml～約100mg/ml、好ましくは約60mg/ml～約90mg/ml、好ましくは約70mg/ml～約90mg/ml、好ましくは70mg/ml～約80mg/mlであり、非限定的な例としては、50mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、最も好ましくは80mg/mlが挙げられる。
さらに、いくつかの実施形態に、医薬組成物は界面活性剤も含む。界面活性剤は、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリヒドロキシアルキレン、トリトン、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリル/スルホン酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル/ミリスチル/ステアリル－スルホベタイン、ラウリル/ミリスチル/リノリル/ステアリル－サルコシン、リノリル/ミリスチル/セチル－ベタイン、ラウラウラミドプロピル/コカミドプロピル/ミリスタミドプロピル/パルミトアミドプロピル/イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル/パルミトプロピル/パルミトプロピル/イソステアラミドプロピル/イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、タウリン酸メチルコイルナトリウム、オレイルタウリン酸メチルナトリウム、ポリエチレングリコール、エチレンおよびプロピレングリコールの共重合体などからなる群から選択することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80またはポリソルベート20、より好ましくはポリソルベート80である。
いくつかの実施形態に、医薬組成物中の界面活性剤の濃度は約0.2mg/ml～0.8mg/ml、好ましくは0.2mg/ml～0.6mg/ml、より好ましくは0.4mg/ml～0.6mg/mlであり、非限定的な例としては、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、最も好ましくは0.4mg/mlが挙げられる。
代替の実施形態では、医薬組成物がを含む:
(a)約1mg/ml～100mg/mlのTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメント
(b)約5mM～30mMの酢酸塩バッファーまたはヒスチジン塩バッファー
(c)約50mg/ml～100mg/mlの糖
(d)約0.2mg/ml～0.8mg/mlのポリソルベート。
代替の実施形態では、医薬組成物がを含む:
(a)1mg/ml～100mg/mlのTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメント、(b)5mM～30mMのヒスチジン－酢酸バッファーまたは酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー、pHは約5.0～6.5である
(c)－50mg/ml～100mg/mlの糖
(d)0.2mg/ml～0.8mg/mlのポリソルベート80。
代替の実施形態では、医薬組成物がを含む:
(a)40mg/ml～60mg/mlのTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメント、(b)10mM～30mMのヒスチジン－酢酸バッファーまたは酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー、pH約5.0～6.0
(c)70mg/ml～90mg/mlのスクロースまたはトレハロース
(d)0.4mg/ml～0.6mg/mlのポリソルベート80。
代替の実施形態では、医薬組成物がを含む:
(a)約50mg/mlのTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメント、(b)約10mMのヒスチジン－酢酸バッファー、pH約5.5
(c)約80mg/mlのショ糖
(d)約0.4mg/mlのポリソルベート80。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物中のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトTIM－3の細胞外領域に結合し、(i)～(ii)からなる群より選択される任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとTIM－3に結合するために競合することを特徴とするか、または(i)～(ii)からなる群より選択される任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである:
(i)以下からなる群から選択される1つ以上のCDR領域配列を含むか、またはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント:
抗体重鎖可変領域HCDR領域の配列:アミノ酸配列配列番号(SEQ ID NO): 8、43および10に示す通り;および/または抗体軽鎖可変領域LCDR領域の配列:アミノ酸配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13に示す通り;
(ii)以下からなる群から選択される1つ以上のCDR領域配列を含むか、またはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント:
抗体重鎖可変領域HCDR領域の配列:アミノ酸配列配列番号(SEQ ID NO): 14、15および16に示す通り;および/または抗体軽鎖可変領域LCDR領域の配列:アミノ酸配列配列番号(SEQ ID NO): 17、18および19に示す通り。
いくつかの実施形態に、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の(i)または(ii)から選択される任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである:
(i)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、43および10にそれぞれ示されるような、または配列番号(SEQ ID NO): 8、43および10に対して少なくとも95%の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および/または配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示されるような、または配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13に対して少なくとも95%の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
配列番号(SEQ ID NO): 43は配列DIIPX 1 X 2 X 3 GSKYNQKFKDに示すようなものであり、X 1はN、L、V、MおよびEからなる群から選択され、X 2はN、E、M、H、K、L、AおよびVからなる群から選択され、X 3はGおよびAからなる群から選択される;
(ii)配列配列番号(SEQ ID NO): 14、15および16にそれぞれ示されるような、または配列番号(SEQ ID NO): 14、15および16に対して少なくとも95%の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および/または配列配列番号(SEQ ID NO): 17、18および19にそれぞれ示されるような、または配列番号(SEQ ID NO): 17、18および19に対して少なくとも95%の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
上記の少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列は好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、より好ましくは97%、98%または99%以上の配列同一性を有し、最も好ましくは少なくとも99%以上の配列同一性を有する。上記の少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換突然変異によって得ることができる。
いくつかの実施形態に、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号(SEQ ID NO): 8、43および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域配列;ならびに配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13に示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域配列を含む;
または、配列番号(SEQ ID NO): 14、15および16にそれぞれ示されるような抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域配列;ならびに配列番号(SEQ ID NO): 17、18および19に示されるような抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域配列を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物中のTIM－3抗体または抗原結合フラグメントは(a)～(m)のいずれか1つに示されるように、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントとTIM－3に結合するために競合するか、または(a)～(m)からなる群より選択される任意のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである:
(a)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、9および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(b)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、62および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(c)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、63および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(d)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、64および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(e)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、65および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(f)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、66および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(g)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、67および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(h)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、68および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(i)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、69および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(j)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、70および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;ならびに配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(k)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、71および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント;
(l)配列配列番号(SEQ ID NO): 8、72および10にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 11、12および13にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント
(m)配列配列番号(SEQ ID NO): 14、15および16にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域HCDR1－3領域;および配列配列番号(SEQ ID NO): 17、18および19にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域LCDR1－3領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物中のTIM－3抗体または抗原結合フラグメントは、上記のモノクローナル抗体のいずれか1つによって結合されるものと同じエピトープに結合することを特徴とする。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、抗体は組換え抗体である。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントからなる群より選択される組換え抗体である。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号(SEQ ID NO): 4に示す重鎖可変領域配列および/または配列番号(SEQ ID NO): 5に示す軽鎖可変領域配列を含むか;または配列番号(SEQ ID NO): 6に示す重鎖可変領域配列および/または配列番号(SEQ ID NO): 7に示す軽鎖可変領域配列を含む。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、ヒト化抗体軽鎖および重鎖可変領域上の軽鎖および重鎖FR領域配列は、それぞれヒト生殖系列軽鎖および重鎖、またはその突然変異配列に由来する。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、ヒト化抗体は配列番号(SEQ ID NO): 20または31に示されるような重鎖可変領域またはその変形例を含み、変形例は、配列番号(SEQ ID NO): 20または31に示されるような重鎖可変領域において1～10個のアミノ酸復帰突然変異を有する。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態において、変異体は配列番号(SEQ ID NO): 20または31に示されるように、重鎖可変領域のFR領域において1～10アミノ酸の復帰突然変異を有し;好ましくは、復帰突然変異が配列番号(SEQ ID NO): 20におけるD89E、R98T、G49A、M48I、M70L、R38KおよびV68A;または配列番号(SEQ ID NO): 31に示されるように、重鎖可変領域におけるQ3Kおよび/またはR87Kのアミノ酸の復帰突然変異からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸の復帰突然変異である。
いくつかの実施形態に、抗体のCDR領域の化学修飾(例えば、アセチル化および脱アミド化)を排除するために、本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのCDR領域における化学修飾を受けやすい部位はアミノ酸置換に供することができ;好ましくはCDR2におけるNNGは置換され;好ましくは本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントの実施形態において、ヒト化抗体は配列番号(SEQ ID NO): 45、45、46、47、48、49および50からなる群より選択される任意の1つに示される重鎖可変領域を含む。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、ヒト化抗体は、配列番号(SEQ ID NO): 34または35に示されるような重鎖可変領域を含む。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、ヒト化抗体は配列番号(SEQ ID NO): 21または32に示されるような軽鎖可変領域またはその変異体を含み、変異体は、配列番号(SEQ ID NO): 21または32に示されるような軽鎖可変領域において1～10個のアミノ酸復帰突然変異を有する。
いくつかの実施形態に、TIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号(SEQ ID NO): 21または32に示されるような軽鎖可変領域のFR領域またはその変異体を含み;変異体が配列番号(SEQ ID NO): 21または32に示されるような軽鎖可変領域において1～10アミノ酸の復帰突然変異(単数または複数)を有し;好ましくは復帰突然変異が配列番号(SEQ ID NO): 32における配列番号(SEQ ID NO): 21、Q3K、I48V、K45Q、A43sおよびT85sからなる群より選択される少なくとも1種である。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、ヒト化抗体は、配列番号(SEQ ID NO): 30に示されるような軽鎖可変領域を含むか、または配列番号(SEQ ID NO): 37、37、38、39および40からなる群より選択される任意の1つに示されるような軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態に、抗体のCDR領域の化学修飾(例えば、アセチル化および脱アミド化)を排除するために、本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのCDR領域における化学修飾を受けやすい部位をアミノ酸置換に供することができ;好ましくはCDR2におけるNNGを置換して、配列番号(SEQ ID NO): 43に発明CDR2配列を形成し;本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態にはヒト化抗体が配列番号(SEQ ID NO): 44、45、46、47、48、49および50、ならびに配列番号(SEQ ID NO): 29または30に発明軽鎖可変領域配列からなる群より選択される任意の1つに発明重鎖可変領域配列を含む。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、ヒト化抗体は配列番号(SEQ ID NO): 22、23、24、25、26、27および28からなる群より選択される任意の1つに示される重鎖可変領域配列;および配列番号(SEQ ID NO): 29または30に示される軽鎖可変領域配列;好ましくは配列番号(SEQ ID NO): 24に示される重鎖可変領域配列および配列番号(SEQ ID NO): 29に示される軽鎖可変領域配列を含む。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、ヒト化抗体は配列番号(SEQ ID NO): 33、34および35からなる群から選択される任意の1つに示される重鎖可変領域配列;ならびに配列番号(SEQ ID NO): 36、37、38、39および40からなる群から選択される任意の1つに示される軽鎖可変領域配列;好ましくは配列番号(SEQ ID NO): 33に示される重鎖可変領域配列および配列番号(SEQ ID NO): 36に示される軽鎖可変領域配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体のCDR領域におけるアミノ酸部位の脱アミド化を排除するために、本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのCDR領域における化学修飾に感受性である部位はアミノ酸置換に供され得る;好ましくはCDR2におけるNNGが置換される;本開示のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントの好ましい実施形態において、ヒト化抗体は配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60および61、ならびに配列番号29または30に示される軽鎖可変領域配列;好ましくは配列番号51に示される重鎖可変領域配列および配列番号29に示される軽鎖可変領域配列;または配列番号52に示される重鎖可変領域配列からなる群から選択されるいずれか1つに示される重鎖可変領域配列を含み、配列番号29に示す軽鎖可変領域配列である。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態において、抗体は全長抗体であり、ヒト抗体定常領域、好ましくは配列番号(SEQ ID NO): 41に示すヒト重鎖定常領域配列、または配列番号(SEQ ID NO): 41と85%の配列同一性を有する配列;および好ましくは配列番号(SEQ ID NO): 42に示すヒト軽鎖定常領域配列、または配列番号(SEQ ID NO): 42と85%の配列同一性を有する配列をさらに含む。上記の少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列は好ましくは少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し;より好ましくは90%、95%または99%以上の配列同一性を有し;最も好ましくは少なくとも95%以上の配列同一性を有し;上記の少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列が1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換変異によって得られ得る。最も好ましくは、抗体が配列番号(SEQ ID NO): 73に示されるような重鎖の全長配列および配列番号(SEQ ID NO): 74に示されるような軽鎖の全長配列を含む。
本発明のTIM－3抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態、抗原結合フラグメントは、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(ダイアボディ)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)、およびCDR領域を含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群より選択される。
また、本発明は、バッファーを用いてTIM3抗体の原液を置換する工程を含む、上記医薬組成物の調製方法を提供する。いくつかの実施形態に、好ましくはバッファーは酢酸塩バッファーまたはヒスチジン塩バッファー、より好ましくはヒスチジン－塩酸、酢酸－酢酸塩ナトリウムまたはヒスチジン－酢酸バッファー;最も好ましくはヒスチジン－酢酸バッファーである。いくつかの実施形態に、バッファーの濃度は約5mM～30mM、好ましくは約5mM～20mM、好ましくは10mM～30mMであり、非限定的な例としては、5mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、30mM、最も好ましくは約10mMが挙げられる。いくつかの実施形態に、バッファーのpH値は約5.0～6.5、好ましくは約5.0～6.0、好ましくは約5.2～5.8、最も好ましくは5.5であり、非限定的な例としては、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0が挙げられる。
また、本開示は、前記置換工程で得られた溶液に糖類及び界面活性剤を添加する工程と、バッファーで体積を調整する工程とをさらに含む、上記医薬組成物の調製方法を提供する。いくつかの実施形態に、好ましい糖類は非還元二糖類、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースであり、糖類の濃度は約50mg/ml～約100mg/ml、より好ましくは約60mg/ml～約90mg/ml、より好ましくは70mg/ml～約80mg/mlであり、非限定的な例としては、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、最も好ましくは80mg/mlが挙げられる。いくつかの実施形態に、好ましくは界面活性剤はポリソルベート80またはポリソルベート20、より好ましくはポリソルベート80であり、濃度は約0.2mg/ml～0.8mg/ml、より好ましくは0.4mg/ml～0.6mg/mlであり、非限定的な例としては、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、最も好ましくは0.4mg/mlが挙げられる。
本開示はまた、上記の医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む、TIM3抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法を提供する。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005および10mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005および10mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン－塩酸、pH 6.0を含む。
いくつかの実施形態に、本開示の医薬組成物は、50mg/ml抗TIM3抗体h1799－005、10mM酢酸ナトリウム酢酸塩、pH 5.5を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン－塩酸、pH 5.5を含む。
いくつかの実施形態的に、本開示の医薬品組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン酢酸pH 6.0および70mg/mlのスクロースからなる。
いくつかの実施形態に、本開示の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン酢酸pH 6.0、および70mg/mlのα, αトレハロース二水和物を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)、70mg/mlのスクロース、および0.4mg/mlのポリソルベート80を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)、70mg/mlのスクロースおよび0.2mg/mlのポリソルベート80を含む。
いくつかの実施形態に、本開示の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799-005、10mMのヒスチジン酢酸pH 5.5、70mg/mlのスクロースおよび0.6mg/mlのポリソルベート80を含む。
いくつかの実施形態に、本開示の医薬組成物は、50mg/mlの抗TIM3抗体h1799－005、10mMのヒスチジン酢酸pH 5.5、70mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート20を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80、20mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)、および60mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロース、0.4mg/mlのポリソルベート80、10mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)、および50mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、20mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.5、および50mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、10mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0、および40mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、30mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.5、および50mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、20mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0、および50mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、30mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.0、および60mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、10mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0、および60mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、20mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.0、および50mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、30mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0、および60mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、20mMのヒスチジン－酢酸(pH 5.5)、および40mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、30mMのヒスチジン－酢酸、pH 6.0、および40mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、30mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.0、および40mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、10mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.0、および60mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
いくつかの実施形態に、本発明の医薬組成物は、80mg/mlのスクロースおよび0.4mg/mlのポリソルベート80、10mMのヒスチジン－酢酸、pH 5.0、および40mg/mlのTIM3抗体h1799－005を含む。
TIM3抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法のいくつかの実施形態、凍結乾燥は、連続して、予備凍結、一次乾燥および二次乾燥の工程を含む。凍結乾燥は、製剤を凍結させ、次いで一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって行われる。この条件下では、生成物温度が配合物の共晶点または分解温度よりも低い。通常、約50～250ミリトールの範囲の適切な圧力下で、一次乾燥のための貯蔵温度は、通常、約－30～25℃である(一次乾燥工程の間、生成物が凍結したままであると仮定する)。サンプルを保持する製剤および容器(例えば、ガラスバイアル)の大きさおよび種類、ならびに液の体積は数時間～数日(例えば、40～60時間)に及ぶことができる、乾燥に必要な時間の長さを決定する。二次乾燥段階は、容器の種類及び大きさ並びに使用されるタンパク質の種類に応じて、約0～40℃で行うことができる。二次乾燥のための時間の長さは、製品中の所望の残留湿度レベルによって決定され、通常、少なくとも約5時間を必要とする。一般に、凍結乾燥によって得られる凍結乾燥製剤の水分含有量は、約5%未満、好ましくは約3%未満である。圧力は、一次乾燥工程で適用される圧力と同じであり得る。好ましくは、二次乾燥の圧力が一次乾燥の圧力よりも低い。凍結乾燥のための条件は、製剤およびバイアルサイズによって変化し得る。
本開示はまた、上記のTIM3抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法によって調製されたTIM3抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
いくつかの実施形態に、凍結乾燥製剤は、2～8℃で少なくとも3ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも12ヶ月間、少なくとも18ヶ月間、または少なくとも24ヶ月間安定である。いくつかの実施形態に、凍結乾燥製剤は、40℃で少なくとも7日間、少なくとも14日間、または少なくとも28日間安定である。
本開示はまた、上記の凍結乾燥製剤を再構成する工程を含む、TIM3抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製するための方法を提供し、再構成のために使用される溶液は注射用水、生理食塩水またはブドウ糖溶液からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
本開示はまた、上記のように、TIM3抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製するための方法によって調製されたTIM3抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載される任意の安定な医薬組成物を含む容器を含む、製造部材またはキットを提供する。いくつかの実施形態に、容器は中性ホウケイ酸ガラス製の注射ボトルである。
本開示はまた、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成液を含む容器を含む、製造部材を提供する。
本発明はまた、ヒトTIM－3陽性細胞に関連する疾患の診断薬の調製における、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤もしくは凍結乾燥製剤の再構成液の使用、または製剤の部材を提供する。
本発明はまた、ヒトTIM－3陽性細胞に関連する疾病治療のための薬剤の調製における、上記の医薬組成物、凍結乾燥製剤、または凍結乾燥製剤の再構成液、または製剤の部材の使用を提供する。TIM-3発現細胞に関連する疾患である限り、TIM-3陽性細胞に関連する疾患に関する制約はなく、これはがん、自己免疫疾患およびアレルギー疾患を含むが、これらに限定されない。
本発明はまた、癌、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を治療または診断するための方法を提供し、これは、医薬組成物、凍結乾燥製剤、または凍結乾燥製剤の再構成液、または上記の製剤の部材を対象に投与することを含む。好ましくは癌は血中癌、乳がん、子宮がん(uterine cancer)、結腸直腸癌、食道がん(esophageal cancer), 胃がん(gastric cancer), 卵巣がん,肺がん,腎臓がん(kidney cancer), 直腸がん、甲状腺癌、子宮頸がん、小腸癌、前立腺がんおよび膵臓がんを含む。がんの好例としては、血がん、食道がん(esophageal cancer)、胃がん(gastric cancer)、結腸直腸がん、肝臓がんおよび前立腺がんが挙げられる。たとえば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、未分化大細胞リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma)(ALCL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、他のリンパ性白血病、NK細胞リンパ腫、ホジキン病(バーキットリンパ腫など)などがある。自己免疫疾患の特定例、関節リウマチ, 乾癬,クローン病,強直性脊椎炎,多発性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosus)(SLE)、重症筋無力症, 天疱瘡,悪性貧血などがある。アレルギー疾患の実施例は、急性または慢性の反応性気道疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、PIE症候群、食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショックを含む。
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖または転移に関連する疾患または障害を治療または阻害するための薬剤組成物の調製における、上記の凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成液の使用を提供する。
本発明はさらに、ヒトTIM－3陽性細胞に関連する疾患を診断または治療するための方法を提供し、この方法は、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成液を使用することを含む。
当業者には周知のように、本開示で説明される様々な実施形態の1つ、いくつか、またはすべての特徴をさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成することができる。本開示の上記の実施形態および組み合わせによって得られる他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに例示される。
図１は、候補TIM－3抗体についての細胞結合試験の曲線;データーは、候補抗体mAb－1701およびmAb－1799が細胞発現抗原に対して強い結合活性を有することを示す。 図２Ａ～図２Ｃは、混合リンパ球反応アッセイにおけるIFNγ分泌に対する本発明の候補抗体およびその抗原結合フラグメントの効果;図2A、IFNγ分泌に対するh1701－009およびその抗原結合フラグメントの効果;図2B、IFNγ分泌に対するh1701－005およびその抗原結合フラグメントの効果;図2C、IFNγ分泌に対するh1701－009、h1799－005の効果。結果は、h1701～009とh1799～005の両方がIFNγの分泌を効果的に刺激できることを示す。 図３Ａ～３Ｄは、PBMC活性化試験結果の図;図3A～3Dは、FACS解析におけるIFNγ陽性細胞の比率、すべての細胞におけるIFNγの幾何平均、IFNγおよびTIM-3二重陽性細胞の比率(TIM-3+IFNγ+%)およびTIM-3+細胞におけるIFNγの幾何平均をそれぞれ示し;結果はh1701-009、h1799-005およびAbTIM-3がすべて、活性化時のPBMC細胞におけるIFNγの式に影響を及ぼし、細胞内IFNγ陽性細胞の割合およびIFNγの式を様々な程度に増大させることを示す。 図４Ａ～図４Ｂは、SEB刺激試験結果の図、図4Aおよび図4Bは、IL12およびIFNγについてのELISA試験結果を示す;結果が5日間のSEBによるPBMCの刺激後、h1701-009、h1799-005およびAbTIM-3がIL12およびIFNγのSEB誘導分泌を効果的に増加させたことを示す。 図５は、JMPソフトウエアを用いた、本発明のTIM3抗体定式化の構成要素に対するモデルフィッティング結果である。
発明の詳細な説明
・用語の詳細な説明
本開示をより理解しやすくするために、一定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書で特に明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。
本開示は、出願PCT/CN2018/077190の全ての内容を参照により本明細書に組み込む。
「バッファー」は、その共役酸－塩基成分によるpHの変化に抵抗性であるバッファーを指す。pHを適正範囲内に制御するバッファーの実施例としては、酢酸塩バッファー、コハク酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジン塩バッファー、シュウ酸バッファー、乳酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グリシルグリシンおよび他の有機酸バッファーが挙げられる。
「ヒスチジン塩バッファー」は、ヒスチジンイオンを含むバッファーを指す。ヒスチジン塩バッファーの実施例は、ヒスチジン－塩酸塩バッファー、ヒスチジン－酢酸塩バッファー、ヒスチジン－リン酸バッファー、ヒスチジン－硫酸バッファーなど、好ましくはヒスチジン－酢酸塩バッファーまたはヒスチジン－塩酸バッファーを含み;ヒスチジン－酢酸塩バッファーはヒスチジンおよび酢酸塩酸によって調製され;ヒスチジン－塩酸バッファーはヒスチジンおよび塩酸によって調製される。
「クエン酸バッファー」は、クエン酸イオンを含むバッファーを指す。クエン酸バッファーの実施例としては、クエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カルシウムバッファー、クエン酸－クエン酸マグネシウムバッファーなどが挙げられる。好ましいクエン酸バッファーはクエン酸－クエン酸ナトリウムである。
「コハク酸バッファー」は、コハク酸イオンを含むバッファーを指す。コハク酸バッファーの実施例には、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー、コハク酸－コハク酸カリウムバッファー、コハク酸－コハク酸カルシウムバッファーなどが含まれる。好ましいコハク酸バッファーはコハク酸－コハク酸ナトリウムである。
「リン酸バッファー」は、リン酸イオンを含むバッファーを指す。リン酸バッファーの実施例としては、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファー、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウムバッファー、リン酸水素二ナトリウム－クエン酸バッファー等が挙げられる。好ましいリン酸バッファーは、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。
「酢酸塩バッファー」は、酢酸塩イオンを含むバッファーを指す。酢酸塩バッファーの実施例としては、酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー、酢酸－ヒスチジン塩バッファー、酢酸－酢酸塩バッファーカリウム、酢酸－カルシウム酢酸塩バッファー、酢酸－マグネシウム酢酸塩バッファーなどが挙げられる。好ましい酢酸塩バッファーは酢酸－ナトリウム酢酸塩である。
「医薬組成物」とは、本明細書に記載される1つ以上の化合物、または生理学的/薬学的に許容される塩もしくはそのプロドラッグおよび他の化学成分を含む混合物をいい、他の化学成分は例えば、生理学的/薬学的に許容可能な担体および賦形剤である。医薬組成物の目的は抗体活性成分の安定性を維持し、生物への投与を促進し、活性成分の吸着を促進し、それによって生物学的活性を発揮することである。
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」および「製剤」は、相互に排他的ではない。
本発明の医薬組成物の液状に関しては、特に断らない限り、その中に含まれる溶媒は水である。
「凍結乾燥製剤」は、医薬組成物または製剤の液体形態または溶液形態を真空凍結乾燥することによって得られる製剤または医薬組成物を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「約」は当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内にある値をいい、これは値がどのように測定または決定されるか(すなわち、測定システムの制限)に部分的に依存する。例えば、「約」は当技術分野におけるそれぞれの実施について1またはそれ以上の標準偏差を示すことができる。代替的に、以下の示される値から±20%までの範囲の「約」または「本質的に含む」手段を示す。さらに、特に生物学的システムまたは処理に関して、この用語は値の1桁までまたは5倍までを指すことができる。出願および特許請求の範囲に記載される特定の値に適用される場合、特に明確に記載されない限り、「約」または「本質的に含む」の意味はその特定の値について許容可能な誤差範囲内にあると仮定されるべきである。
本開示の医薬組成物は、安定した効力を達成することができる:医薬組成物に含まれる抗体物が貯蔵後にその物理的安定性および/または化学的安定性および/または生物学的活性を実質的に維持することができる。好ましくは医薬組成物が貯蔵後にその物理的安定性、ならびに化学的安定性および生物学的活性を実質的に維持する。貯蔵寿命は一般に、医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて決定される。現在、タンパク質安定性を測定するための多くの分析技術が存在し、これを使用して、任意の温度で所与の時間貯蔵した後の安定性を測定することができる。
抗体の安定な医薬製剤は、以下の条件下で有意な変化が観察されないものである:冷蔵温度(2～8℃)で少なくとも3ヶ月、好ましくは6ヶ月、より好ましくは1年、さらにより好ましくは2年までの貯蔵。さらに、安定な液体製剤は例えば、25℃の温度で1ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月の期間貯蔵すると所望の特性を示すような液体製剤を含む。典型的には、安定性の許容基準は以下の通りである。典型的にはSEC－HPLCによって評価されるように、約10%以下、好ましくは約5%以下の抗体一量体が分解される。抗体の医薬製剤は目視解析により、淡黄色、無色に近い透明な液状、又は無色ないし透明ないしわずかに乳白色である。製剤の濃度、pHおよび浸透圧の変化は±10%以下である。典型的には、約10%以下、好ましくは約5%以下の減少が観察される。典型的には、約10%以下、好ましくは約5%以下が凝集される。
抗体は、色彩および/または明瞭性の目視検査で凝集、析出および/または変性の有意な増大を示さない場合、または紫外線散乱、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー(SEC)および動的光散乱(DLS)によって測定される場合、医薬製剤中で「その物理的な安定性を維持する」と考えられる。タンパク質配座の変化は、蛍光分光法(タンパク質の三次構造を決定する)およびFTIR分光法(タンパク質の二次構造を決定する)によって評価することができる。
抗体は、それが有意な化学的変化を示さない場合、医薬製剤において「その化学的安定性を保持する」と考えられる。化学的安定性は化学的に変化した形態のタンパク質を検出し、定量することによって評価することができる。タンパク質の化学構造をしばしば変化させる分解プロセスは、加水分解または切断(サイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS－頁などの方法によって評価される)、酸化(マススペクトロスコピーまたはMALDI/TOF/MSと組み合わせたペプチドマッピングなどの方法によって評価される)、脱アミド化(イオン交換クロマトグラフィー、毛細管等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸測定などの方法によって評価される)、および異性化(イソアスパラギン酸含有量、ペプチドマッピングなどを測定することによって評価される)を含む。
抗体は、ある時点での抗体の生物学的活性が製剤が調製された時点で示された生物学的活性の所定の範囲内に依然としてある場合、医薬製剤中に「その生物学的活性を保持する」と考えられる。抗体の生物学的活性は例えば、抗原結合試験によって決定され得る。
本開示において使用されるアミノ酸についての3文字コードおよび1文字コードは、J. Biol. Chem. 243, P. 3558 (1968) に記載されている。
本発明で使用される「抗体」は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合によって一緒に連結されたテトラペプチド連鎖構造免疫グロブリンを指す。
本開示において、本開示の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスκ、λ鎖またはそれらの変形例を含む軽鎖定常領域をさらに含むことができる。
本開示において、本開示の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの変形例を含む重鎖定常領域をさらに含むことができる。
抗体重鎖および軽鎖のN末端に隣接する約110個のアミノ酸配列は、可変領域(Fv領域)として知られる高度に可変であり;C末端に隣接する残りのアミノ酸配列が定常領域として知られる比較的安定である。可変領域は、3つの超可変領域(HVR)および4つの比較的保存された骨格領域(FR)を含む。抗体の特異性を決定する3つの超可変領域は、相補性決定領域(CDR)としても知られている。各軽鎖可変領域(LCVR)および各重鎖可変領域(HCVR)は3つのCDR領域および4つのFR領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端への順序は、以下の順序である: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4。軽鎖の3つのCDR領域はLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を指し、重鎖の3つのCDR領域はHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を指す。本発明に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントのLCVR領域およびHCVR領域におけるCDRアミノ酸残基の数および位置は、既知のKabat番号付け基準(LCDR1－3、HCDR1－3)に従う。
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。
本発明において言及される「抗体またはその抗原結合」または「機能的フラグメント」は、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ならびに抗原に結合するFvフラグメントおよびscFvフラグメントを指す。Fvフラグメントは抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域を有さず、全ての抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントとして知られている。一般に、Fv抗体はまた、抗原結合に必要な構成を形成するために、VHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。2つの抗体可変領域を連結して、単鎖抗体または単鎖Fv(sFv)と呼ばれる単一のポリペプチド鎖を形成するために、様々なリンカーを使用することもできる。
本開示における「抗原結合部位」という語は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントによって認識され得る、抗原上の連続または不連続の三次元空間部位を指す。
本発明における「ネズミ抗体」とは、当該分野の知識および技能に従って調製されたヒトTIM3に対するモノクローナル抗体をいう。調製の間、試験対象にTIM3抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。
「キメラ抗体」という語はマウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、キメラ抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫反応を軽減することができる。キメラ抗体を構築するために、比マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築し、次いで可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングする。続いて、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングする。マウス可変領域遺伝子はヒト定常領域遺伝子と連結されて、ヒトベクターに挿入され得るキメラ遺伝子を形成し、そして最後に、キメラ抗体分子は、真核生物または原核生物工業システムにおいて発現される。本発明の好ましい実施形態において、TIM3キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖、またはそれらの変異体の軽鎖定常領域をさらに含む。TIM3キメラ抗体の重鎖は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはその変異体の重鎖定常領域をさらに含む。ヒト抗体の定常領域は、アミノ酸変異後に得られるADCC毒性(抗体依存性細胞媒介性細胞毒性)のないヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4またはその変異体、好ましくはヒトIgG2またはIgG4重鎖定常領域、またはIgG4の重鎖定常領域からなる群より選択され得る。
「ヒト化抗体」という語はCDR移植抗体としても知られており、マウスCDR配列をヒト抗体の可変領域フレームワーク、すなわち種々のタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列から産生される抗体に移植することによって生成される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のネズミタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される強力な不均一反応の欠点を克服する。このような骨格配列は、生殖系列抗体遺伝子配列上記公衆された参考文献を網羅する公衆DNAデータベースから得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は「VBase」ヒト生殖系列配列データベース(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase上で入手可能)に見出すことができ、ならびにKabat、E A、et al,1991 Sequences ofタンパク質of Immunological Interest,5th Edに見出すことができる。免疫原生低下とともに活性の低下を避けるため、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク配列には最小限の復帰突然変異あるいは復帰突然変異を与えて活性を維持する。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによってCDR親和性成熟が行われるヒト化抗体を含む。
「ADCC」(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性)という語は、抗体のFcセグメントを認識することによる、Fcレセプターを発現する細胞による、抗体でコーティングされたターゲット細胞の直接的な殺傷を指す。本抗体のADCCエフェクタ機能は、IgGのFcセグメント上の修飾を介して減少または排除され得る。改変とは、抗体重鎖定常領域における変異、例えば、IgG1ではN297A、L234A、L235A、IgG2/4キメラ、IgG4ではF234A/L235Aの変異から選択されたものを指す。
上記開示に記載される突然変異体配列における「突然変異体」には「復帰突然変異体」、「保存的修飾」または「保存的置換または置換」が含まれるが、これらに限定されるものではなく、上記開示において使用される「保存的修飾」または「保存的置換または置換」は類似の特性を示す他のアミノ酸(充電、側鎖の大きさ、疎水性/親水性、主鎖の配座および剛性など)とタンパク質中のアミノ酸との置換を手段するものであり、このような置換はタンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に行うことができる。当業者は一般的に言えば、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを知っている(例えば、Watsonら(1987)Molecular Biology of Gene、The Benjamin/Cummings Pubを参照のこと)。(株式会社224ページ(第4版))。さらに、類似の構造または機能を有するアミノ酸での置換は、生物学的活性を破壊しそうにない。
本開示に記載される「変異配列」とは、本開示のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列が変異(置換、挿入または削除失など)による適切な改変に供され、得られたヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列が本開示のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列に対して異なる配列同一性パーセントを有することをいう。本開示において記載される配列同一性は、少なくとも85%、90%または95%、好ましくは少なくとも95%であり得る。非限定的な例としては、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%が挙げられる。2つの配列間の配列比較およびアイデンティティパーセントの決定は、National Center For Biotechnology Instituteのウェブサイトで入手可能なBLASTN/BLASTPアルゴリズムによって、デフォルト設定で行うことができる。
「TIM3」という語は、インテグリン関連タンパク質としても知られる、細胞膜の表面に広く発現される免疫グロブリンである。信号調節タンパク質(SIRP)は阻害レセプタースーパーファミリーの一員であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。主に大食細胞、樹状細胞、神経細胞の表面に発現している。細胞表層のリガンドと接触すると、SIRPは細胞遊走と貪食活性、免疫恒常性と神経回路網を調節する。TIM3はヒトシグナル調節タンパク質α(SIRPα)の細胞外リガンドである。マクロファージ表面のSIRPαに結合して抑制性シグナルを伝達することにより、貪食活性を低下させ、自然免疫システムを抑制する。この信号は、「私を食べない」信号として鮮やかに記述される。
「TIM3への結合」という用語は、ヒトTIM3と相互作用する能力を指す。
用語「抗TIM3抗体」および「TIM3抗体」は、互換的に使用され得、そして両方とも、TIM3に結合する抗体をいう。
本発明に記載の融合タンパク質は、2つの遺伝子を組換えにより共発現させることにより得られるタンパク質産物である。組換えTIM3細胞外領域-Fc融合タンパク質は、TIM3細胞外領域とFcフラグメントを組換えにより共発現させることにより得られる融合タンパク質である。TIM3細胞外領域は細胞膜外で発現されるTIM3タンパク質を指し、配列は配列番号(SEQ ID NO):1に示される。
抗体および抗原結合フラグメントを製造および精製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、抗体Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor、第5～8章および第15章に見出すことができる。マウスをヒトTIM3またはそのフラグメントで免疫化することができ、得られた抗体を再生および精製することができ、アミノ酸配列決定を従来の方法によって行うことができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製され得る。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、1つ以上のヒトFR領域を非ヒト由来CDR領域に付加するように遺伝子操作される。ヒトFR生殖系列配列はImMunoGeneTics(IMGT)ウェブサイトhttp://IMGT.cines.frから、またはThe Immunoglobulin FactsBook、2001ISBN012441351から得ることができる。
本発明の操作された抗体またはその抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするcDNA配列をクローニングし、GS発現ベクターに組換えることができる。次いで、組み換えられた免疫グロブリン発現ベクターを、CHO細胞に安定にトランスフェクトすることができる。当該分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現システムは、典型的にはFc領域において高度に保存されたN末端で、抗体のグリコシル化を生じる。安定なクローンは、ヒトTIM3に特異的に結合する抗体の発現によって得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培養培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、精製は、調整されたバッファーで平衡化されたAまたはGセファロースFFコラムによって行うことができる。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体をpH傾きによって溶出し、抗体フラグメントをSDS－PAGEによって検出し、次いで収集する。抗体は一般的な技術を用いて濾過し、濃縮することができる。水溶性混合物および多量体はまた、モレキュラーシーブ、イオン交換などの一般的な技術によって除去することができる。得られた生成物は例えば－70℃で直ちに凍結することができ、または凍結乾燥することができる。
「任意」または「任意」は記載された事象または状況に続くが必ずしも起こらないことを手段し、記載は事象または状況が起こる場合または起こらない場合を含む。例えば、「任意に、1～3抗体重鎖可変領域を含む」は特異的配列を有する抗体重鎖可変領域が存在することができるが、存在する必要はないことを手段する。
「投与」および「治療」は動物、ヒト、実験例被験体、細胞、組織、機関、または生体液に適用する場合、外生的医薬品、治療、診断、薬剤、または組成物を動物、ヒト、被験体、細胞、組織、機関、または生体液に接触させることを意味する。「投与」および「治療」は例えば、治療、薬物動態学、診断、研究、および実験例方法を指すことができる。細胞の治療は試薬を細胞に接触させること、ならびに流体に試薬を接触させることを包含する。「投与」および「治療」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、インビトロおよびエクスビボ治療を意味する。「治療」はヒト、獣医学、または研究被験体に適用される場合、治療処置、予防または予防手段、研究、および診断適用を指す。
治療薬剤(例えば、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物)を、薬剤が既知の治療活性を有する1つ以上の疾患症状(symptom)を有する患者に対して、内部または外部に投与するための「治療」手段。典型的には、治療薬剤が治療される患者または集団における1つ以上の疾患症状(symptom)を軽減するのに有効な量で投与され、その結果、そのような症状(symptom)の回帰分析を誘導するか、または任意の臨床的に測定可能な程度まで進行を阻害する。任意の特定の疾患症状(symptom)を緩和するのに有効な治療薬剤の量(「治療有効量」とも呼ばれる)は、患者の病態、年齢、および重量、ならびに患者において所望の反応を引き出す薬剤の能力などの因子に従って変化上記。疾患症状(symptom)が軽減したかどうかは、その症状(symptom)の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練したヘルスケア提供者によって一般的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態(例えば、治療方法または製造部材)は関心それぞれの疾患症状(symptom)を軽減するのに効果的ではないが、生徒t検定、カイ二乗検定、マンおよびホイットニーによるU検定、クラスカル－ウォリス検定(H検定)、ジョンケア－テルプストラ検定、およびウィルコクソン検定などの当技術分野で知られている任意の統計学的検定によって決定されるような統計的に有意数の患者において、関心標的疾患症状(symptom)を軽減すべきである。
本発明の配合は、TIM－3陽性細胞に関連する疾患を治療するために使用することができる。TIM-3陽性細胞に関連する疾患については、がん、自己免疫疾患、アレルギー疾患などTIM-3発現細胞に関連する疾患である限り、制約はない。がんには、血液がん、乳がん、子宮がん(uterine cancer)、大腸がん、食道がん(esophageal cancer), 胃がん(gastric cancer), 卵巣がん,肺がん,腎臓がん(kidney cancer), 直腸がん、甲状腺がん、子宮頸がん、小腸がん、前立腺がんおよび膵臓がんが含まれる。がんの好例としては、血がん、食道がん(esophageal cancer)、胃がん(gastric cancer)、結腸直腸がん、肝臓がんおよび前立腺がんが挙げられる。たとえば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、未分化大細胞リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma)(ALCL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、他のリンパ性白血病、NK細胞リンパ腫、ホジキン病(バーキットリンパ腫など)などがある。自己免疫疾患の特定例、関節リウマチ, 乾癬,クローン病,強直性脊椎炎,多発性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosus)(SLE)、重症筋無力症, 天疱瘡,悪性貧血などがある。アレルギー疾患の実施例は、急性または慢性の反応性気道疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、PIE症候群、食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショックなどを含む。
「有効量」は、医学的状態の症状(symptom)または徴候を改善または予防するのに充分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にするかまたは容易にするのに充分な量を手段する。特定の患者または獣医学被験体についての有効量は、処置される状態、患者の一人般的な健康、投与の経路および照射量、ならびに副作用の重篤度のような因子に依存して変化上記。有効量とは、重大な副作用または毒性作用を回避する最大投与量または投与プロトコルであり得る。
「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶媒システムの置換を指す。例えば、抗体タンパク質を含む高塩または高張溶媒システムは抗体タンパク質が安定な製剤中に存在するように、安定な製剤のためのバッファーシステムを使用する物理的操作によって置き換えられる。物理的な操作は遠心分離後の限外濾過、透析または再構成を含むが、これらに限定されない。
「医薬組成物」は、本明細書に記載される1つ以上の化合物、またはその生理学的/薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、ならびに生理学的/薬学的に許容可能な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む混合物を手段する。医薬組成物の目的は生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、次いで生物学的活性を発揮することである。
抗体医薬組成物(製剤)の例示的な調製方法:
工程1:一定量の精製TIM3抗体液を、抗体を含まない(10mM、pH 5.5ヒスチジン酢酸バッファーなど)バッファーに対する溶媒置換(好ましくは限外濾過による)に供し、置換は、少なくとも6倍容量の限外濾過膜を通過させることによって行われ;タンパク質が約70mg/mLに濃縮された。ある体積のショ糖原液を添加し、混合して、80mg/mLのショ糖の最終濃度を得た。ある体積のポリソルベート80原液を添加し、混合して、0.4mg/mLのポリソルベート80の最終濃度を得た。10mM pH 5.5のヒスチジン－酢酸バッファーを添加して体積を調整し、タンパク質濃度を50mg/mLにした(試験すべき他の製剤または安定な製剤を同様の工程に従って調製した)。
生成物を濾過し、インプロセス制御サンプリングによって無菌性について試験した。ストック溶液を0.22μmのPVDFフィルターに通し、ろ液を回収した。
工程2:負荷容量を2.15mlに調整し、ろ液を2mlのストッパ付き瓶に負荷し、負荷手順の開始時、最中および終了時にそれぞれサンプリングすることによって容量差を試験した。
ステップ3:キャップ装置を用いてアルミニウムキャップをキャップした。
ステップ4:目視検査を行って、不正確な負荷などの欠陥があるかどうかを確認した。ラベルを印刷し、バイアルに貼り付け、ラベルを紙トレイに印刷し、紙トレイを折り畳み、バイアルを紙トレイに配置し、ラベルを紙トレイに貼り付けた。
以下、実施例を参照して本開示をさらに説明するが、本開示の範囲はこれに限定されない。具体的な条件が記載されていない本発明の実施例において、実験は一般に、抗体実験技術ガイドおよび分子クローニングのような、コールドスプリングハーバーによる従来の条件下で;または物質もしくは生成物の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給源が特に示されていない場合、試薬は市販の従来の試薬である。
例１．ＴＩＭ３抗体の調製
Ｉ．ＴＩＭ－３抗原の調製および検出に用いるタンパク質
1.TIM-3抗原の設計と式
Uniprot Hepatitis Aウイルスセルラレセプター2(ヒトHAVCR2、ヒトTIM-3、Uniprot NO 8QTDQ0)を本開示のTIM－3の鋳型として使用し、本開示で検出に使用した抗原およびタンパク質のアミノ酸配列を設計し、任意選択で種々のタグをTIM－3タンパク質と融合させ、融合物をpHrベクター(ハウスメイド)またはpTargeTベクター(プロメガ、A1410)にクローニングし、ベクターを293細胞で一過性に発現させるか、またはCHO－Sで安定に発現させ、次いで精製して、コードされた抗原および本開示で検出に使用したタンパク質を得たと、特に示さない限り、以下に記載する。
TIM-3細胞外領域とhIgG1 Fcの融合タンパク質:TIM-3-Fc(SEQ ID NO:1)、マウスの免疫に使用:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
注記:下線部分はシグナルペプチドを表し、斜体化された部分はFcを表す。
TIM－3－Fc(配列番号(SEQ ID No): 1)と、の融合タンパク質と、フラグおよびHisタグ検出：MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRGSSDYKDDDDKHHHHHH
注記：下線部分はシグナルペプチドを表し、イタリック体部分はFlag-Hisタグを表す。
TIM-3-Flag-His(配列番号(SEQ ID No): 2)と、を有するTIM-3細胞外領域と、ヒトTIM-3の全長アミノ酸配列:TIM-3過剰発現細胞株、TIM-3全長(配列番号3)
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP
注記：下線部分はシグナルペプチドを表し、下線部分は膜貫通領域を表し、波線は細胞内領域を表し、他の部分はTIM-3の細胞外領域を表す)を構築するために使用される)。
２．ＴＩＭ－３関連組換えタンパク質の精製、ハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
２．１ ＴＩＭ－３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製工程：
サンプル物を高速で遠心分離して不純物を除去し、適切な体積まで濃縮した。NI－NTAアフィニティーカラム(QIAGEN、カタログ番号30721)をPBSで平衡化し、2～5カラム容量で洗浄した。不純物を除去した後、細胞で表した上清サンプルを塔に装填した。A280の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをPBSですすいだ。カラムをPBSですすぎ、望ましくないタンパク質を洗浄し、標的タンパク質を回収した。標的タンパク質を洗浄バッファー(20mMイミダゾール)および溶離バッファー(300mMイミダゾール)で連続的に溶離し、溶離ピークを収集した。
回収した溶出液をイオン交換(Hiload 16/600 Superdex 200カラム)によりさらに精製した。カラムを約2カラム容量のPBSで平衡化し、pH 7.4を確保した。標的タンパク質を含む同定された溶離バッファーを濃縮し、次いで塔に装填した。サンプルを回収し、SDS－PAGEおよびLC－MSを使用して同定し、後の使用のためにアリコートした。
２．２ハイブリドーマ、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製
細胞で発現させた上清サンプルを高速遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマで発現させた上清をタンパク質Gカラムで精製し、組換え抗体で発現させた上清とFc融合タンパク質をプロテインAカラムで精製した。A280の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをPBSですすいだ。標的タンパク質を100mM酢酸(pH3.0)で溶出し、1M Tris－HCl(pH8.0)で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBS平衡ゲルクロマトグラフィーSuperdex 200(GE)によりさらに精製した。ピーク(凝集体を除去した)を回収し、後の使用のためにアリコートした。
ＩＩ．抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体の調製
１．動物免疫化
抗ヒトTIM－3モノクローナル抗体を、マウスを免疫化することによって産生した。研究所SJL白色マウス、雌、6～8週齢(北京チャールズ・リバー・ラボラトリー・アニマル・テクノロジー社、動物製造許可番号: SCXK(北京)2012－0001)を使用した。給餌環境: SPFレベル。マウスを購入した後、1週間、12/12時間の明/暗周期調節、温度20～25℃、湿度40～60%の実験室環境に適合させた。周囲に適応させたマウスを、以下のプロトコルに従って免疫した。免疫化のための抗原は、Fc－タグを有するヒトTIM－3の細胞外領域である(配列番号(SEQ ID NO): 1)。
免疫化プロトコル: QuickAntibody－Mouse5W(KX0210041)を用いてマウスを免疫化した。アジュバントに対する抗原の比率は1:1、10μg/マウス/時間(初時間免疫/昇圧)である。抗原およびアジュバントを迅速かつ完全に混合し、次いで接種した。接種期間は、1回目接種から2回目接種まで21日間の間隔を設け、その後の接種間隔は14日間とした。免疫7日後に採血し、マウス血清中の抗体価を測定した。血清中の抗体価が高く、その力価がプラトーに達しているマウスを選択し、ひ細胞融合を行った。脾細胞の融合の3日前に、生理食塩水で調製した抗原溶液20μg/マウスを腹腔内(IP)注射することによって追加免疫を行った。
２．脾細胞溶融
最適化されたPEG媒介溶融工程を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Sp2/0細胞(ATCC(登録商標)CRL－8287(商標))と溶融させて、ハイブリドーマ細胞を得た。融合ハイブリドーマ細胞を完全培地(20% FBS、1×ハットおよび1×OPIを含むDMEM培地)に4×105 ～5×105/mlの密度で再懸濁し、96ウェルプレート上に100μl/ウェルで播種し、5% CO 2中37℃で3～4日間インキュベートし、次いでハット完全培地を100μl/ウェルで添加して、ピンポイント様クローン化が形成されるまで3～4日間細胞をさらに培養した。上清を除去し、200μl/ウェルのHT完全培地(20% FBS、1×HTおよび1×OPIを含むRPMI－1640培地)を添加し、5% CO 2 中37℃で3日間インキュベートし、次いでELISA法を行った。
３．ハイブリドーマ細胞の検診
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に従い、ハイブリドーマ培養上清を、ELISA方法を結合させることによって検出した(試験例1を参照のこと)。TIM－3過剰発現細胞結合試験を、ELISA方法で同定された陽性ウェル中の細胞上清を用いて行った(試験例2参照)。タンパク質結合および細胞結合の両方について陽性であるウェル中の細胞は、凍結保存に間に合うように拡大され、そして単一の細胞クローンが得られるまで2～3回サブクローニングされるべきである。
サブクローン化細胞ごとにTIM-3結合ELISAおよび細胞結合試験を実施した。ハイブリドーマクローンを上記の試験によりスクリーニングし、分泌された抗体mAb－1701およびmAb－1799を得た。無血清細胞培養方法によって抗体をさらに調製した。抗体は、精製例に従って精製され、試験例での使用のために提供された。
４．ハイブリドーマ陽性クローンのシークエンシング
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りであった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収し、キットの命令に従ってトリゾール(インビトロジェン、カタログ番号15596－018)によってRNAを抽出し、逆転写のためにPrimeScript(商標)逆転写酵素キットを使用した(タカラ、カタログ番号2680A)。逆転写によって得られたcDNAを、マウスIg-Primer Set(Novagen、TB326 RevB 0503)を用いたPCRによって増幅し、シークエンシングのために会社に送達した。mAb‐1701とmAb‐1799の重鎖と軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対応するDNA配列:
mAb-1701重鎖可変領域(配列番号(SEQ ID NO): 4) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVSVSA;
mAb-1701軽鎖可変領域(配列番号(SEQ ID NO): 5)
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSSPWTFGGGTKLEIK;
mAb-1799重鎖可変領域(配列番号(SEQ ID NO): 6) EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMNSLKSDDTATYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSA;
mAb-1799軽鎖可変領域(配列番号(SEQ ID NO): 7)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASDNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQQHYGSPLTFGAGTKLELK;
上記のmAb-1701およびmAb-1799の明配置および重鎖可変領域配置において、下線部はCDR部位を表し、各配置。それぞれの抗体の光および重鎖におけるCDR配列を表1に示す。
Figure 2022513553000001
ＩＩＩ． 抗ヒトＴＩＭ－３マウスハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
１． 抗ＴＩＭ－３抗体ｍＡｂ－１７０１のヒト化
MOEソフトウェアによるヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のIMGT生殖系列遺伝子データベースに対して整列させることにより、mAb‐1701抗体に対して高ホモロジーを有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を別々に鋳型として選択し、マウス抗体のCDRを対応するヒト鋳型上にそれぞれ移植し、FR1‐CDR1‐FR2‐CDR2‐FR3‐CDR3‐FR4の順序で可変領域配列を形成した。アミノ酸残基を同定し、カバット番号付けシステムによって注釈を付けた。
１．１ ヒト化ハイブリドーマクローンｍＡｂ－１７０１のフレームワークの選択
マウス抗体mAb‐1701のヒト化のための軽鎖鋳型はIGKV1‐33*01およびhjk4.1であり、ヒト化のための重鎖鋳型はIGHV1‐18*01およびhjh4.1であった。ヒト化可変領域配列は以下の通りである:
h1701VH-CDRグラフト(配列番号(SEQ ID NO): 20)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
h1701VL-CDRグラフト(配列番号(SEQ ID NO): 21)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK;
注記: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に並べ、配列中のイタリック体はFR配列を表し、下線はCDR配列を表す。
１．２ｈ１７０１のテンプレート選択および逆突然変異設計
特定の突然変異設計を以下の表2に示す:
Figure 2022513553000002
 注:例えば、A43Sは、位置43のAが天然番号付けに従って、Sに変異して戻ることを手段する。「移植された」は、ヒト生殖系列FR領域に移植されたマウス抗体CDRの配列を表す。
Figure 2022513553000003
注:この表は、様々な突然変異の組み合わせの結果として生じる配列を示す。h1701-007によって示されるように、ヒト化マウス抗体h1701-007は、2つの突然変異体(軽鎖h1701_VL.1Aおよび重鎖h1701_VH.1A)を有する。他のものも同様に示すことができる。
1701の特定のヒト化配列は以下の通りである:
> h1701_VH.1(h1701VH-CDRグラフトと同じ、配列番号(SEQ ID NO): 22)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> 1701h1701_VH.1A(配列番号(SEQ ID NO): 23)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1B(配列番号(SEQ ID NO): 24)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1C(配列番号(SEQ ID NO): 25)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1D(配列番号(SEQ ID NO): 26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1E(配列番号(SEQ ID NO): 27)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1F(配列番号(SEQ ID NO): 28)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VL.1(h1701VL-CDR移植片と同じ、29配列番号(SEQ ID NO):目)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK;
> h1701_VL.1A(配列番号(SEQ ID NO): 30)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.
２． 抗ＴＩＭ－３抗体ｍＡｂ－１７９９のヒト化
MOEソフトウェアによるヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のIMGT生殖系列遺伝子データベースに対して整列させることにより、mAb‐1799抗体に対して高ホモロジーを有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を別々に鋳型として選択し、マウス抗体のCDRを対応するヒト鋳型上にそれぞれ移植し、FR1‐CDR1‐FR2‐CDR2‐FR3‐CDR3‐FR4の順序で可変領域配列を形成した。アミノ酸残基を同定し、カバット番号付けシステムによって注釈を付けた。
２．１ ヒト化ハイブリドーマクローン１７９９のフレームワークの選択
マウス抗体1799のヒト化のための軽鎖鋳型はIGKV1‐39*01およびhjk2.1であり、ヒト化のための重鎖鋳型はIGHV3‐7*01およびhjh4.1であった。ヒト化可変領域配列は以下の通りである:
h1799VH-CDRグラフト(配列番号(SEQ ID NO): 31)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;
h1799VL-CDRグラフト(配列番号(SEQ ID NO): 32)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;
注意: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に並べ、配列中のイタリック体はFR配列を表し、下線はCDR配列を表す。
２．２ ハイブリドーマクローン１７９９についてのテンプレート選択および逆突然変異設計（以下の表４を参照のこと）：
Figure 2022513553000004
注:例えば、I48Vは、48位のIが天然の番号付けに従って、Vに変異して戻ることを手段する。「移植された」は、ヒト生殖系列FR領域に移植されたマウス抗体CDRの配列を表す。
Figure 2022513553000005
 注:この表は、様々な突然変異の組み合わせの結果として生じる配列を示す。h1799-005によって示されるように、ヒト化マウス抗体h1799-005は、2つの突然変異体(軽鎖h1799_VL.1Aおよび重鎖h1799_VH.1)を有する。他のものも同様に示すことができる。
1799の特定のヒト化配列は以下の通りである:
> h1799_VH.1(h1799VH-CDRグラフトと同じ、配列番号(SEQ ID NO): 33)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;
> h1799_VH.1A(配列番号(SEQ ID NO): 34)
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;
> h1799_VH.1B(配列番号(SEQ ID NO): 35)
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS;
> h1799_VL.1(h1799VL-CDR移植片、配列番号(SEQ ID NO): 36と同じ)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;
> h1799_VL.1A(配列番号(SEQ ID NO): 37)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;
> h1799_VL.1B(配列番号(SEQ ID NO): 38)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;
> h1799_VL.1C(配列番号(SEQ ID NO): 39)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK;
> h1799_VL.1D(配列番号(SEQ ID NO): 40)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK.
IV. 組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の調製
抗体の調製のために、ヒト重鎖IgG4/軽鎖κの定常領域をそれぞれの可変領域と組み合わせ、S228P変異をFcセグメントに導入して、IgG4抗体の安定性を増大させた。当技術分野で知られている他の突然変異も、その性能を改善するために使用することができる。
重鎖定常領域の順序は配列番号(SEQ ID NO): 41に示される:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
軽鎖定常領域の順序は配列番号(SEQ ID NO): 42に示す通りである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;
ここで、抗体h1799－005の重鎖のための全長配列は、配列番号(SEQ ID NO): 73に示されるとおりである:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
抗体h1799-005の軽鎖の全長配列は配列番号(SEQ ID NO): 74に示すとおりである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;
注:上記の抗体h1799-005の全長配列において、イタリック体はFR領域配列を表し、下線部分はCDR領域配列を表し、波線は定常領域配列を表す。
1. 組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマスクリーニングから得られた陽性抗体分子を配列決定して、可変領域コード遺伝子の配列を得る。順方向プライマーおよび逆方向プライマーは配列決定によって得られた配列に基づいて設計され、配列決定された遺伝子は鋳型として役立ち、種々の抗体VH/VK遺伝子フラグメントはPCRによって構築され、次いで、発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよびhIgG4/hκ定常領域遺伝子(CH1－FC/CL)フラグメントを用いて)と相同的に組み換えられ、組換えキメラ抗体のための全長発現プラスミドVH－CH1－FC－pHr/VL－CL－pHrが構築されて、2つのキメラ抗体Ch1701およびCh1799を形成した。
2. ヒト化抗体の分子クローン化
設計したヒト化抗体配列についてコドン最適化を行い、ヒトコドン嗜好を有するコード遺伝子配列を作製した。PCRにより種々の抗体VH/VK遺伝子フラグメントを構築するようにプライマーを設計し、次いで、フラグメントを発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよびhIgG4/hκ定常領域遺伝子(CH1－FC/CL)フラグメントを用いて)と相同的に組換えて、ヒト化抗体全長発現プラスミドVH－CH1－FC－pHr/VL－CL－pHrを構築した。
3. 組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖を別々に発現するプラスミドを1:1.2の比率でHEK293E細胞にトランスフェクトし、発現上清を6日後に回収し、高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインAカラムで精製した。A280の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをPBSですすいだ。標的タンパク質をpH 3.0～pH3.5の酸性溶出液で溶出し、1M Tris－HCl(pH 8.0～9.0)で中和した。溶出したサンプルを適当に濃縮し、次いでPBS平衡化ゲルクロマトグラフィーSuperdex 200(GE)によりさらに精製して凝集体を除去し、単量体ピークを収集し、後の使用のためにアリコートした。
V. h1701の抗体の点変異
脱アミド化修飾は抗体における一般的な化学修飾であり、後の段階での安定性に影響を及ぼし得る。特に、CDR領域中のいくつかのアミノ酸は高度に脱アミド化され、酸化され、または異性化される;一般に、このような変異は、回避または低減されるべきである。加速安定性試験と計算機シミュレーションによる抗体組織およびホットスポット予測によれば、h1701の重鎖CDR2中のNNGは脱アミド化に感受性のある部位である。上記のNNGは、h1701抗体の重鎖可変領域の位置54～56(天然番号付け)に位置する。アミノ酸の特性、コンピューターシミュレーションによる抗体構造によれば、上記位置のアミノ酸を任意のアミノ酸に置き換えることができる。好ましくはh1701のCDR2遺伝子組換え体がDIIPX 1 X 2 X 3 GSKYNQKFKD(配列番号(SEQ ID NO): 43)であり、ここではX 1、X 2 及びX 3はh1701抗体重鎖可変領域; X 1 における54～56の位置におけるアミノ酸残留物であり、Asn、Leu、Val、Met, Gluからなるグループから選択し、X 2はAsn、Glu、Met、His、Lys、Leu、Ala及びValから構成されるグループから選択し、X 3はGly及びAlaから構成されるグループから選択する。
さらに、上記の54～56位に突然変異を含むCDR2および種々の逆突然変異を含むFR部位は、以下の重鎖可変領域を構成することができる:
>h1701_VH.1-CDR2 突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 44)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPX1X2 X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1A-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 45)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPX1X2 X3 GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1B-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 46)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDIIPX1X2 X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1C-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 47)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDIIPX1X2 X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1D-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 48)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIIPX1X2 X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1E-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 49)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIADIIPX1X2 X3 GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;
> h1701_VH.1F-CDR2突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 50)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIADIIPX1X2 X3GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS。
h1701のHCDR2突然変異体およびヒト化配列h1701_VH.1B-CDR2に関連する例示的配列 対応するCDR2突然変異体を含む突然変異体(配列番号(SEQ ID NO): 46)を以下の突然変異体および表6に示す。
例えば、h1701-009のHCDR2中のNNGはNLG、NVG、NNA、NMA、NEA、NHA、NMG、NEG、NKG、NAG、NHGに変異するように設計された(上記の重鎖可変領域CDR2突然変異体の配列はそれぞれ配列番号(SEQ ID NO): 51-61に示すとおり)。発現プラスミド構築および293E発現を分子クローニングの方法によって行い、変異体抗体の親和性および安定性を、精製後にさらに試験した。一連のアミノ酸変異を、h1701-009に対して行った;特定の関連配列は表6に記載されるものを含むが、これらに限定されない。
Figure 2022513553000006
ＶＩ．抗体の性能・効果の把握
以下の試験方法は、本発明の抗体の性能及び効果を検証するために使用される。
試験例１：ＣＨＯ－ｓ細胞を過剰発現するヒトＴＩＭ－３に対する抗ＴＩＭ－３抗体の結合試験
抗TIM-3抗体の結合能を、CHO-S細胞を過剰発現するTIM-3タンパク質への抗体の結合によって試験した。TIM全長プラスミド(ハウスメイド、配列番号(SEQ ID NO): 3)を電気トランスフェクションによりCHO‐S細胞にトランスフェクトし、応力下で2週間スクリーニングした後、TIM‐3の発現レベルを検出した。過剰発現細胞を96ウェルプレートの底部に固定し、次いで、抗体を加えた後のシグナル強度を使用して、Tim-3過剰発現CHO-S細胞に対する抗体の結合活性を決定した。特定の実験方法は以下の通りである。使用したポジティブ・コントロール抗体はAbTim-3であり、配列は、本出願人によって調製されたUS20150218274A1の表2からのものである。
100 μl/ウェルの細胞を96ウェルプレートに4×105/mlの密度で播種し、一晩培養した。上清を除去し、プレートをPBSで3回洗浄し、100μl/ウェルの4% PFAを加えて室温で30時間固定し、プレートをPBSで3回洗浄した。液体を除去し、次いで、PBSで希釈した5%脱脂乳(Bright Dairyからの脱脂乳粉末)を含むブロッキング溶液を200μl/ウェルで添加し、ブロッキングのために37℃インキュベーター中で2.5時間インキュベートした。遮断の端部に、遮断液を除去し、プレートをPBSTバッファー(0.05% Tween-20を含むpH7.4 PBS)で5回洗浄し、試験すべき抗体(ハイブリドーマまたはヒト化抗体から精製した抗体)をサンプル希釈剤で様々な濃度に希釈し、50μl/ウェルで添加し、37℃インキュベーター中で1時間インキュベートした。培養終了後、平板をPBSTで5回洗浄し、サンプル希釈液で希釈したHRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)100μl/ウェルを添加し、37℃で1時間培養した。プレートをPBSTで6回洗浄した後、50μl/ウェルのTMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を添加し、室温で5～15時間インキュベートし、50μl/ウェルの1M H 2 SO 4を添加して反応を止め、450nmでの吸光度値をNOVOStarプレートリーダーを用いて読み取った。Tim-3過剰発現CHO-S細胞へのTIM-3抗体の結合を示すEC50値を算出した。試験結果を図1および表7に示す。
Figure 2022513553000007
結果は、TIM-3抗体番号1701および1799、ならびにそのヒト化抗体が完全長ヒトTIM-3タンパク質を過剰発現するCHO-s細胞に対する良好な結合活性を示すことを示す。
ヒトTIM-3過剰発現細胞に対する結合活性を、HCDR2点変異を有するh1701-009抗体で試験した。試験結果は表8のとおりであった。
Figure 2022513553000008
 結果は、HCDR2点変異を有するh1701-009抗体がヒトTIM-3を過剰発現するCHO-s細胞に対する強力な結合活性を依然として示すことを示す。
試験例２：抗ＴＩＭ－３抗体の競合試験
抗体AをpH7.4のPBSバッファー(シグマ、カタログ番号P4417-100TAB)で2μg/mlに希釈し、50μl/ウェルの96ウェルマイクロタイタープレート(コーニング、カタログ番号CLS3590-100EA)に加え、37℃のインキュベーターに2時間入れた。液体を除去し、PBSで希釈した5%脱脂乳(Bright Dairyからの脱脂乳粉末)を含むブロッキング溶液を200μl/ウェルで添加し、ブロッキングのために37℃インキュベーター中で2.5時間または4℃で一晩(16～18時間)インキュベートした。ブロッキング端部時に、ブロッキング溶液を除去し、めっきをPBSTバッファー(0.05% Tween‐20を含むpH7.4 PBS)で5回洗浄した;サンプル希釈剤(1% BSAを含むpH7.4 PBS)および最終濃度0.4μg/mlのビオチン標識TIM‐3‐Fcタンパク質(ハウス製、配列番号(SEQ ID NO): 1)で20μg/mlおよび4μg/mlに希釈した抗体Bの予混合溶液を50μl/wellで添加し、37°Cインキュベータで1時間インキュベートした。インキュベーション終了後、反応液をELISAプレートから取り除き、PBSTで5回洗浄し、100μl/井戸のHRPラベルストレプタビジン(シグマ、Cat NoS2438)をサンプル液で希釈し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄した後、50μl/ウェルのTMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を添加し、室温で5～15時間インキュベートし、50μl/ウェルの1M H2 SO4を添加して反応を止め、NOVOStarプレートリーダーを用いて450nmでの吸光度を読み取った。Tim-3への結合に対する種々の抗体の競合作用を計算した。-
Figure 2022513553000009
 結果は、TIM-3への結合に関してmAb-1701とmAb-1799との間に競合関係がないことを示す。
検出例３：ＢＩＡｃｏｒｅ検定を用いた抗ＴＩＭ－３抗体の親和性検出
１．マウス抗体のＢＩＡｃｏｒｅ親和性検出
マウス抗体捕捉キット(カタログ番号BR-1008-38、GE)の指示書に記載された方法に従って、マウス抗体捕捉抗体をCM5バイオセンサチップ(カタログ番号BR-1000-12、GE)上に共有結合させて、試験される抗体を親和性捕捉した。TIM-3-His (SinoBiol、Cat。10390-H03H)抗原をチップ表面に流し、Biacore装置を用いてリアルタイムシグナルを検出し、会合および解離の曲線を得た。試験中に解離の各サイクルが終了した後、バイオチップを洗浄し、マウス抗体捕捉キットに備え付けの再生液で再生した。試験結果は表10 のとおりであった。
Figure 2022513553000010
結果は、TIM-3抗体mAb-1701およびmAb-1799がヒトTIM-3タンパク質に対して強い結合活性および親和性を有することを示す。
２．キメラ抗体およびヒト化抗体のためのＢＩＡｃｏｒｅアフィニティーディテクション
ヒト抗体捕捉キット(カタログ番号BR-1008-39、GE)の指示書に記載されている方法に従って、ヒト抗体捕捉抗体をCM5バイオセンサチップ(カタログ番号BR-1000-12、GE)上に共有結合させて、試験すべき抗体をアフィニティー捕捉し、次いで、TIM-3-Flag-His(ハウスメイド、配列番号(SEQ ID No):2)抗原をチップの表面を通して流し、Biacore装置を用いてリアルタイムシグナルを検出し、会合および解離の曲線を得た。アフィニティー値を適合によって得た(表11参照)。試験中に解離の各サイクルが終了した後、バイオチップを洗浄し、ヒト抗体捕捉キットに備えられた再生液で再生した。
Figure 2022513553000011
結果は、本発明においてスクリーニングされたヒト化抗体がヒトTIM-3タンパク質に対して強い結合活性および親和性を有することを示す。
HCDR2点変異を有するh1701-009抗体の親和性を、BIAcoreによって検出した。試験結果は表12 のとおりであった。
Figure 2022513553000012
結果は、上記のh1701-009突然変異体が依然として強力なTIM-3親和性を有することを示す。NNG部位の変異は、抗体の抗原への親和性には影響しない。
試験例４：免疫細胞機能の試験管内試験
Tリンパ球の活性化に及ぼす抗TIM‐3抗体の影響を検討するために、混合リンパ球反応アッセイ(MLRアッセイ)、PBMC活性化試験およびスーパー抗原黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)刺激試験の3つのインビトロ機能試験を確立した。
1. 混合リンパ球反応アッセイ
実験プロセスを以下に簡単に説明する。
1) ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を回収し、精製した;
2) PBMCを6ウェルNUNC板に2×106 細胞/mlの密度で接種し、2時間培養した;
3) 非接着性細胞を除去し、GM-CSF(100ng/ml)およびIL-4(100ng/ml)を用いて接着性細胞を5日間刺激し、次いで細胞をTNFα(100ng/ml)と共に2日間インキュベートして、直流細胞成熟を誘導した;
4) 成熟直流細胞を、10ng/mlのCD3抗体で予めコーティングした96ウェルプレート中で、異なるドナー(donor)由来のPBMCと1:5の比率で混合し、異なる濃度のh1701-009、h1799-005、AbTIM-3およびネガティブ・コントロールFc-IgGを並行して添加した;
5) 5日後、上清中のIFNγをELISAにより検出した(結果を図2A～図2Cに示す)。
結果はh1701-009、h1799-005およびAbTIM-3がすべてIFNγの分泌を効果的に刺激し、h1701-009およびh1799-005がより強い刺激効果を示すことを示す。
２．ＰＢＭＣ活性化試験
実験プロセスを以下に簡単に説明する。
1) ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を回収精製し、96ウェルプレートを10ng/mlのCD3抗体およびCD28抗体でコーティングした;
2) PBMCをコーティングした96ウェルプレートに1×105 細胞/ウェルの密度で接種した。種々の濃度のTIM-3抗体およびネガティブ・コントロールFc-IgGを並行して添加した;
3) 6日後、細胞内IFNγおよびTIM-3汚染のために細胞を採取した。FACSを使用して、すべての細胞におけるIFNγ陽性細胞(IFNγ+%)、IFNγ Geo平均値、IFNγおよびTIM-3二重陽性細胞の割合(TIM-3+IFNγ+%)、ならびにTIM-3+細胞におけるIFNγ Geo平均値の割合を分析した(図3A～図3D)。
結果はh1701-009、h1799-005およびAbTIM-3が細胞内IFNγ陽性細胞の割合およびIFNγの発現を様々な程度に増大させることを示し、ここでh1701-009およびh1799-005はより強い影響を有する。
３．ＳＥＢ刺激試験
実験プロセスを以下に簡単に説明する。
1) ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を回収し、精製した;
2) PBMCを96ウェルプレートに1×105 細胞/ウェルの密度で接種した。1ng/mlのSEBおよび種々の濃度のTIM-3抗体およびネガティブ・コントロールFc-IgGを並行して添加した;
3) 5日後、ELISAによるIL12およびIFNγ検出のために上清を収集した(それぞれ、図4Aおよび図4Bを参照のこと);
結果はh1701-009、h1799-005およびAbTIM-3がすべて、IL12およびIFNγのSEB誘導分泌を効果的に増加させることを示し、ここで、h1701-009およびh1799-005は、低用量でより高い利点を示す。
試験例５：ラットにおける抗ＴＩＭ－３ヒト化抗体、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５の薬物動態測定
12 体重180～240gのSDラットは、Sippr-BK laboratory animal CoLtd.から購入した。動物は給餌期間中、食物および水に自由にアクセスすることができ、動物は、12/12時間の明/暗サイクル調整、温度16～26℃、相対湿度40～70%で、実験室環境を3日以上適応させた。試験開始前日、SDラットに番号を付け、無作為に群分けし、各群3匹(オス2匹、雌1匹)とした。試験当日、2群のラットに試験薬h1701-009をそれぞれ3mg/kgおよび10mg/kgの照射量で静脈内注射し、他の2群のラットに試験薬h1799-005をそれぞれ3mg/kgおよび10mg/kgの照射量で静脈内注射した。静脈内注射のための体積は5ml/kgであった。
投与前、5分、8時間、1日、2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日に採血した。0.2mLの全血を、抗凝固剤剤を添加することなく、それぞれの動物から収集した。採血後、30分間4℃に置き、15分間1000gで遠心し、上清をEPチューブに移植し、80℃で貯留した。
ELISA方法を用いて血清中の抗体濃度を検出し、ウインノリンソフトウエアを用いて試験薬剤の薬物動態パラメータを計算した。得られた主な薬物動態パラメータを表13に示す。
Figure 2022513553000013
10mg/kgの抗TIM-3抗体h1701-009及びh1799-005をSD系ラットに静脈内注射すると、ラットの曝露量は同程度となる。3又は10mg/kgの用量での抗体h1799-005の曝露量の増加は用量の増加と直線的に相関する。3又は10mg/kgの用量での抗体h1701-009の曝露量の増加は用量の増加よりもわずかに高い。抗体h1701-009のクリアランス半減期はh1799-005と同様である。
試験例６：ＤＳＣによるｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５抗体の熱安定性の検出
熱安定性のために、異なったバッファーシステムを異なったpH条件下で比較した。種々のpH値に対応する例示的なバッファーシステムは、以下の通りである: 10mM PB(pH7)、15mM His(pH6.0)、および10mM酢酸塩(pH5.2)。サンプルを対応するバッファーに置き換え、サンプル濃度を約1mg/mlに制御し、検出にはMicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)を使用した。試験に先立ち、それぞれのサンプルおよびブランクのバッファーを真空脱ガス装置で1～2分間脱気した。400μlのサンプルまたはブランクのバッファーを、サンプル平板の各ウェルに添加した(機器への負荷容量は300μl)。14%12月90日およびddH 2 Oを、洗浄のために最後の2一対のウェルプレートに添加し;サンプルプレートを装填し、次いで、塑性ソフトカバーで覆った。走査温度は25℃から開始し、100℃で終了し、走査速度は60℃/hであった。特定の結果を表14に示す。いくつかの試験システムにおいて、h1701-009およびh1799-005の両方は、良好な熱安定性を示す。
Figure 2022513553000014
試験例７：ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりサンプルの純度を監視し、一定濃度での周期安定性を調べた
サンプル濃度が約50mg/mlに制御されるような例示的条件下で、PBS(pH7.4)システム中の種々の抗体を比較し、例えば、-80℃で5回凍結解凍を繰り返した後、4℃または40℃で1ヶ月間保存した後のそれらの安定性について比較した。タンパク質架橋XBEH SEC 200A(Waters)HPLC塔を用いて抗体純度を検出した;1ヶ月間観察した後、h1701-009およびh1799-005の両方が良好な安定性を示し、40℃で1ヶ月間加速SEC純度に有意な変化はなかった。
試験例８：抗体の化学的安定性
配列番号(SEQ ID NO): 51-55に示すh1701-009、h1799-005およびh1701-009突然変異体の化学的安定性を試験した。
試験する抗体500μgを、40℃の水浴中の500μlのpH 7.4 PBSに溶解し、酵素的加水分解試験のために0日目、14日目、および28日目にサンプルを採取した。100 様々な時点で採取したサンプルを100μlの0.2M His-HCl、8M Gua-HCl溶液(pH 6.0)に溶解し、3μlの0.1g/mL DTTを添加し、サンプルを50℃の水浴中で1時間インキュベートし、次に0.02 M His-HCl溶液(pH 6.0)を用いて2回限外濾過し、3μlの0.25mg/mLトリプシンを添加し、サンプルを37℃の水浴中で一晩加水分解した。Agilent 6530 Q-TOFをLC-MS検出および解析に使用した。結果はh1799-005が40℃で1ヶ月の加速度で有意な異性化、酸化および脱アミド化修飾を示さないことを示し、このことは、この分子が良好な化学的安定性を有することを示唆する。h1701-009の検出のために、有意な酸化および異性化修飾は見出されないが、N54N55G56部位に強力な脱アミド化修飾が存在し;一連のアミノ酸変異が上記部位に導入された。例示的な突然変異は、NLG、NVG、NMA、NEA、NNAなどを含む。in vitro活性は、これらの変異が生物学的活性に影響しないことを検証した。加速試験後、LC-MS解析は、これらの突然変異体が脱アミド化修飾を効果的に減少させることができることを示す。表15は、加速後の異なる突然変異体の脱アミド化修飾の比を示す。
Figure 2022513553000015
例２．抗ＴＩＭ３抗体製剤バッファーシステムのｐＨ値のスクリーニング
以下のバッファーを用いて、抗体濃度が50mg/mlである抗TIM3抗体製剤を調製した(h1799-005、実施例1に従って調製した、以下で使用したものと同様):
1) 10mMヒスチジン酢酸、pH 4.5
2) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.0
3) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5
4) 10mMヒスチジン酢酸、pH 6.0
高温(40℃)での安定性を調べるために、サンプルを収集した。結果は、5.5～6.0が抗TIM3抗体に適していることを示している(表16参照)。
Figure 2022513553000016
 注: Dは日を表し、たとえば、D7 は7 番目の日を表す。
例３．抗ＴＩＭ３抗体製剤のバッファーシステムの選別
以下のバッファーを用いて、抗体濃度が50mg/mlである抗TIM3抗体(h1799-005)製剤を調製した:
1) 10mMヒスチジン酢酸、pH 6.0
2) 10mMクエン酸・クエン酸ナトリウム、pH 6.0
3) 10mMヒスチジン・塩酸、pH 6.0
4) 10mMリン酸二水素ナトリウムリン酸水素二ナトリウム、pH 6.0
5) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5
6) 10mM酢酸・酢酸塩ナトリウム、pH 5.5
7) 10mMコハク酸・コハク酸ナトリウム、pH 5.5
8) 10mMコハク酸・コハク酸ナトリウム、pH 6.0
9) 10mMヒスチジン塩酸、pH 5.5
10) 10mMクエン酸・クエン酸ナトリウム、pH 5.5
高温(40℃)および低温(4℃/4500lx)での光中での安定性を検討するために、サンプルを収集した。結果は、抗TIM3抗体により適したバッファーシステムがヒスチジン-塩酸(His-HCl)、酢酸-酢酸塩ナトリウム(AA)およびヒスチジン-酢酸(His-AA)バッファーであることを示す(表17参照)。実際の製造サンプルの実際のpHが標的pHからわずかにずれ得ることを考慮すると、TIM3の安定性のための最適なバッファーシステムは、His－AAシステム、続いてHis-HClおよびAAシステムである。
表１７． 抗ＴＩＭ３抗体に対する種々のｐＨ値を有するバッファーシステムのスクリーニング結果
Figure 2022513553000017
記: Dは曜日を表す。たとえば、D21 は21 stの曜日を表す。
例４．抗ＴＩＭ３抗体製剤のための安定剤のスクリーニング
抗体濃度が50mg/mlである抗TIM3抗体(h1799-005)製剤を、種々の糖類およびバッファーを用いて調製した。
1) 10mMヒスチジン酢酸pH 6.0、70mg/mlショ糖;
2) 10mMヒスチジン酢酸pH 6.0、α, αトレハロース二水和物70mg/ml;
上記で調製した製剤のサンプル物を、高温(40℃)および低温(5±3℃、4500lx)での光中での安定性試験に供した。結果を表18に示す。これらの結果は、ショ糖およびトレハロースがTIM3抗体の安定性に同様の効力を及ぼすことを示している。スクロース濃度が80mg/mlである場合、浸透圧は約300 mosm/kgであり、これは等張圧に近い。したがって、スクロース濃度は80mg/mlであることが好ましい。
Figure 2022513553000018
 注: Dは日を表し、たとえば、D21 は21 日を表す。
例５．抗ＴＩＭ３抗体製剤のための界面活性剤のスクリーニング
異なる濃度および異なるタイプの界面活性剤を含む以下のバッファーを使用して、抗TIM3抗体(h1799-005)製剤を調製し、ここで、ショ糖濃度は70mg/mlであり、抗体濃度は50mg/mlであった。
1) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5;
2) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、0.2mg/mlポリソルベート80;
3) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、0.4mg/mlポリソルベート80;
4) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、0.6mg/mlポリソルベート80;
5) 10mMヒスチジン－酢酸、pH 5.5、0.4mg/mlポリソルベート20;
上記の方法に従って調製した抗TIM3抗体製剤(群1～5)のサンプルを、0.9%塩化ナトリウム注射液中に希釈し、タンパク質濃度を0.5mg/mlに希釈した;希釈後のサンプルのそれぞれの群の不溶性粒子を観察した。試験結果を表19に示す。結果は0.4mg/ml以上のポリソルベート80が抗TIM3抗体に対してより良好な安定性を提供し、従って、0.4～0.6mg/mlのポリソルベート80が選択され、好ましくは、0.4mg/mlのポリソルベート80が抗TIM3抗体のための界面活性剤として役立ったことを示す。
Figure 2022513553000019
例６．製剤中の成分の包括的スクリーニング
タンパク質濃度、バッファーシステムの種類、およびpHをさらに最適化するために、JMPソフトウエアを用いて実験計画を行い、RSM模型を用いて一連の配合を得た(下記参照)。異なる濃度の抗TIM3抗体、80mg/mlショ糖および0.4mg/mlポリソルベート80を含む抗TIM3抗体(h1799-005)製剤を、異なるイオン強度および異なるpHを有する以下のバッファーシステムで調製した。
1) 20mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、60mg/ml TIM3抗体;
2) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、50mg/ml TIM3抗体;
3) 20mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、50mg/ml TIM3抗体;
4) 10mMヒスチジン酢酸、pH 6.0、40mg/ml TIM3抗体;
5) 30mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、50mg/ml TIM3抗体;
6) 20mMヒスチジン酢酸、pH 6.0、50mg/ml TIM3抗体;
7) 30mMヒスチジン酢酸、pH 5.0、60mg/ml TIM3抗体;
8) 10mMヒスチジン酢酸、pH 6.0、60mg/ml TIM3抗体;
9) 20mMヒスチジン酢酸、pH 5.0、50mg/ml TIM3抗体;
10) 30mMヒスチジン酢酸、pH 6.0、60mg/ml TIM3抗体;
11) 20mMヒスチジン酢酸、pH 5.5、40mg/ml TIM3抗体;
12) 30mMヒスチジン酢酸、pH 6.0、40mg/ml TIM3抗体;
13) 30mMヒスチジン酢酸、pH 5.0、40mg/ml TIM3抗体;
14) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.0、60mg/ml TIM3抗体;
15) 10mMヒスチジン酢酸、pH 5.0、40mg/ml TIM3抗体;
上記の方法に従って調製した抗TIM3抗体(群1～15)製剤のサンプル物を、安定性解析のために40℃で保存し、IEC中性ピークと酸性ピークとの間の差異を評価指標として使用し、結果を最小二乗方法によって統計的に分析した。試験結果を図5および表20に示す。その結果、イオン強度10mM、pH 5.5のヒスチジン‐酢酸システムは抗TIM3抗体の安定性に有利であり、タンパク質は40～60mg/mlでより安定であった。50mg/mlの中央値を抗TIM3抗体の最終タンパク質濃度として用いる。
Figure 2022513553000020
 注: Mは月、たとえば、1 ヶ月手段のM1 を表す。
例７．代替の任意配合
さらに、本発明はまた、限定されるものではないが、を含む他の抗TIM3抗体製剤を提供する。
(1)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 6.0);
(2)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.5);
(3)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 6.5);
(4)100mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.4);
(5)100mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.4);
(6)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、90mg/mlのトレハロース、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.2);
(7)60mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、70mg/mlのショ糖、0.8mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.2);
(8)40mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、70mg/mlのショ糖、0.8mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.4);
(9)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、90mg/mlのショ糖、0.5mg/mlのポリソルベート80、および30mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.5);
(10)40mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、90mg/mlのトレハロース、0.5mg/mlのポリソルベート80、および20mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 6.0);
(11)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、70mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.2);
(12)60mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、75mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.2);
(13)55mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、75mg/mlのショ糖、0.5mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.8);
(14)45mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、85mg/mlのショ糖、0.7mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.8);
(15)50mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMの酢酸ナトリウム酢酸塩バッファー(pH 5.9);
(16)100mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、80mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および10mMのヒスチジン－酢酸バッファー(pH 5.5);
(17)70mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、90mg/mlのショ糖、0.8mg/mlのポリソルベート80、および5mMのヒスチジン－酢酸バッファー(pH 5.5);
(18)1mg/mlのTIM3抗体(h1799-005)、60mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMのヒスチジン－酢酸バッファー(pH 5.8);
(19)90mg/mlのTIM3抗体、60mg/mlのショ糖、0.6mg/mlのポリソルベート80、および20mMのヒスチジン－酢酸バッファー(pH 5.8)。
本発明は医薬製剤の分野に属し、具体的には、ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、および抗癌薬剤としてのその使用に関する。
本明細書の記載は、本発明に関連する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ－３）は、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ－２）とも呼ばれる。ＴＩＭ－３はＩ型膜表面タンパク質であり、ＴＩＭファミリーのメンバーに属する。ヒトＴＩＭ－３分子は、シグナルペプチド、Ｉｇ可変領域（ＩｇＶ領域）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチムチン領域、膜貫通領域および細胞質領域を含む３０１アミノ酸から構成される；ヒトＴＩＭ－３は、マウスＴＩＭ－３と６３％の相同性を共有する。
ＴＩＭ－３は、ＩＦＮ－γ分泌性Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１およびＴｈ１７）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、樹状細胞（ＤＣ）、単球、マスト細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の表面に選択的に発現している（例えば、Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９２（２）：７８２－７９１頁（２０１４年）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：２７６３－２７７９頁（２００８年）を参照）。ＴＩＭ－３の現在知られている受容体には、ホスファチジルセリンガレクチン－９（ガレクチン－９、Ｇａｌ－９）、ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＨＭＧＢ１）および癌胎児性抗原細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）が含まれる。
ＴＩＭ－３は多くの方法で免疫系の機能を調節することができる。ＴＩＭ－３は、Ｔｈ１細胞表面にあるリガンドＧａｌ－９に結合して、Ｔｈ１細胞の応答をダウンレギュレートし、Ｔｈ１細胞のアポトーシスを誘導することができる。ＴＩＭ－３は、自己免疫疾患および同種異系免疫疾患（全身性エリテマトーデス、喘息など）ならびに免疫寛容において重要な役割を果たす。単球マクロファージによって発現されるＴＩＭ－３は、ホスファチジルセリンと相互作用して、アポトーシス細胞の食作用を促進する；腫瘍浸潤性ＤＣでは、ＴＩＭ－３はリガンドＨＭＧＢ１に結合して、核酸の正しい輸送を阻害し、それによって核酸免疫応答を阻害し、免疫回避に関与する。ＴＩＭ－３は免疫細胞で発現するだけでなく、卵巣癌、髄膜腫、黒色腫などの腫瘍細胞でも過剰発現し、腫瘍の成長を直接的に促進する。ＴＩＭ－３の発現をダウンレギュレートすると、ＨｅＬａ細胞の浸潤および転移を大幅に阻害することができる。ＴＩＭ－３の過剰発現は、肺癌、胃癌、前立腺癌および子宮頸癌の予後不良と密接に関連している。血液腫瘍では、ＴＩＭ－３は急性骨髄性白血病の白血病幹細胞およびＭＤＳ患者の造血幹細胞上で過剰発現しており、ＴＩＭ－３＋造血幹細胞は悪性の生物学的特性（低分化、低アポトーシスおよび高増殖）を有する。したがって、自然免疫系の機能を改善するためにＴＩＭ－３の活性を阻害すること（ＴＩＭ－３抗体など）は、腫瘍の治療のための新規な方法になると期待されている（例えば、Ｎｇｉｏｗ ｅｔ ａ１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７１（２１）：１－５頁（２０１１年）；Ｇｕｏ ｅｔ ａ１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：２１５頁（２０１３年）；およびＮｇｉｏｗ ｅｔ ａ１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７１（２１）：６５６７－６５７１頁（２０１１年）を参照）。
抗体薬剤の安定性は、抗体の耐久性を左右する重要な因子の１つである。中でも、アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）の非酵素的脱アミド化は、抗体を不安定かつ不均一にすることができ、抗体分子の一般的な化学分解経路の１つである。文献では、いくつかのＩｇＧ１サブタイプ抗体が、ＣＤＲ領域中のアミノ酸の脱アミド化および異性化により生物学的活性を失ったことが報告されている。Ｈｕａｎｇらは、ＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖可変領域２（ＣＤＲ２）に位置するＡｓｎ５５の脱アミド化により、該抗体の結合活性が大幅に低下することを発見した。したがって、抗体の開発のプロセスにおいて、抗体の安定性およびバイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を高めるために、対応するアミノ酸を避けるか変異させて、抗体の脱アミド化を減少させる必要がある。
現在、ＷＯ２０１１１５９８７７、ＷＯ２０１３００６４９０、ＷＯ２０１５１１７００２、ＷＯ２０１６１４４８０３、ＷＯ２０１６１６１２７０、ＵＳ２０１５０２１８２７４等のＴＩＭ－３抗体に関する特許報告がある。しかしながら、国内外で臨床研究段階にあるＴＩＭ－３抗体は２つしかない。他の抗体薬剤はまだ発見・研究段階であり、ＴＩＭ－３抗体は臨床応用されていない。したがって、ＴＩＭ－３関連疾患の治療の研究および応用のために、より高い活性、高い親和性および高い安定性を有するＴＩＭ‐３抗体をさらに開発する必要がある。
本開示は、安定した性能を有するＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物であって、製造および投与により有利な医薬組成物を提供する。
本開示は、ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび緩衝液を含む医薬組成物を提供し、前記緩衝液は、酢酸緩衝液、ヒスチジン塩緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液からなる群から選択され、好ましくは前記緩衝液は酢酸緩衝液およびヒスチジン塩緩衝液である。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記酢酸緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液であり、前記ヒスチジン塩緩衝液はヒスチジン－酢酸緩衝液またはヒスチジン－塩酸緩衝液であり、前記コハク酸緩衝液はコハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液であり、前記リン酸緩衝液はリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液であり、前記クエン酸緩衝液はクエン酸－クエン酸ナトリウムであり；好ましくは、前記緩衝液は、ヒスチジン－塩酸緩衝液、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液またはヒスチジン－酢酸緩衝液であり、最も好ましくはヒスチジン－酢酸緩衝液である。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～２０ｍＭである；非限定的な例としては、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭが挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ～６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ～６０ｍｇ／ｍｌである；非限定的な例としては、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４１ｍｇ／ｍｌ、４２ｍｇ／ｍｌ、４３ｍｇ／ｍｌ、４４ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、４６ｍｇ／ｍｌ、４７ｍｇ／ｍｌ、４８ｍｇ／ｍｌ、４９ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５１ｍｇ／ｍｌ、５２ｍｇ／ｍｌ、５３ｍｇ／ｍｌ、５４ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、５６ｍｇ／ｍｌ、５７ｍｇ／ｍｌ、５８ｍｇ／ｍｌ、５９ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記緩衝液のｐＨ値は、約５．０～６．５、好ましくは約５．０～６．０、好ましくは約５．２～５．８、または好ましくは約５．５～６．０、最も好ましくは５．５であり、非限定的な例としては、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０および約６．５が挙げられる。
さらに、いくつかの実施形態では、上記の医薬組成物は糖類も含む。本開示の「糖類」は、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖類アルコール、還元糖類、非還元糖類などを含む、従来の組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎおよびその誘導体を包含する。糖類は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセロール、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メリトリオース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどからなる群から選択され得る。好ましい糖類は、非還元二糖類であり、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースである。
いくつかの実施形態では、上記の医薬組成物中の糖類の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例としては、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは８０ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
さらに、いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は界面活性剤も含む。界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリヒドロキシアルキレン、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホン酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｃｔｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、ラウリル／ミリスチル／リノレイル／ステアリル－スルホベタイン、ラウリル／ミリスチル／リノレイル／ステアリル－サルコシン、リノレイル／ミリスチル／セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル／コカミドプロピル／リノールアミドプロピル／ミリスタミドプロピル／パルミタミドプロピル／イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル／パルミタミドプロピル／イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、ココイルタウリン酸メチルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｃｏｃｏｙｌ ｔａｕｒａｔｅ）、オレイルタウリン酸メチルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｅｙｌ ｔａｕｒａｔｅ）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンおよびプロピレングリコールの共重合体などからなる群から選択され得る。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０、より好ましくはポリソルベート８０である。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物中の前記界面活性剤の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例としては、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
（ａ）約１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、
（ｂ）約５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸緩衝液またはヒスチジン塩緩衝液、
（ｃ）約５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの糖類、および
（ｄ）約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート
を含む。
代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
（ａ）１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、
（ｂ）５ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液または酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨが約５．０～６．５）、
（ｃ）５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの糖類、および
（ｄ）０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
（ａ）４０ｍｇ／ｍｌ～６０ｍｇ／ｍｌの前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、
（ｂ）１０ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液または酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨが約５．０～６．０）、
（ｃ）７０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌのスクロースまたはトレハロース、および
（ｄ）０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替の実施形態では、前記医薬組成物は、
（ａ）約５０ｍｇ／ｍｌの前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、
（ｂ）約１０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨが約５．５）、
（ｃ）約８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および
（ｄ）約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物中の前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に結合することを特徴とし、以下の（ｉ）～（ｉｉ）からなる群から選択されるいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと競合してＴＩＭ－３に結合するか、または以下の（ｉ）～（ｉｉ）からなる群から選択されるいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする：
（ｉ）以下からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含むか、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント：
抗体重鎖可変領域のＨＣＤＲ領域の配列：配列番号８、４３および１０のアミノ酸配列に示すとおり；および／または
抗体軽鎖可変領域のＬＣＤＲ領域の配列：配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列に示すとおり；
（ｉｉ）以下からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含むか、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント：
抗体重鎖可変領域のＨＣＤＲ領域の配列：配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列に示すとおり；および／または
抗体軽鎖可変領域のＬＣＤＲ領域の配列：配列番号１７、１８および１９のアミノ酸配列に示すとおり。
いくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである：
（ｉ）配列番号８、４３および１０にそれぞれ示されるか、配列番号８、４３および１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、および／または、配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示されるか、配列番号１１、１２および１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含み、
配列番号４３は配列ＤＩＩＰＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＫＹＮＱＫＦＫＤに示され、ここで、Ｘ１はＮ、Ｌ、Ｖ、ＭおよびＥからなる群から選択され、Ｘ２はＮ、Ｅ、Ｍ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、ＡおよびＶからなる群から選択され、Ｘ３はＧおよびＡからなる群から選択される、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｉｉ）配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示されるか、配列番号１４、１５および１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、および／または、配列番号１７、１８および１９にそれぞれ示されるか、配列番号１７、１８および１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
上記の少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有し、最も好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する。上記の少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換変異によって得ることができる。
いくつかの実施形態では、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、４３および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域配列、ならびに配列番号１１、１２および１３に示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域配列を含むか、または
配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域配列、ならびに配列番号１７、１８および１９に示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物中の前記ＴＩＭ－３抗体または抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）～（ｍ）のいずれか１つに示されるモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと競合してＴＩＭ－３に結合するか、または以下の（ａ）～（ｍ）からなる群から選択されるいずれかのモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである：
（ａ）配列番号８、９および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号８、６２および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｃ）配列番号８、６３および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｄ）配列番号８、６４および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｅ）配列番号８、６５および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｆ）配列番号８、６６および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｇ）配列番号８、６７および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｈ）配列番号８、６８および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｉ）配列番号８、６９および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｊ）配列番号８、７０および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｋ）配列番号８、７１および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｌ）配列番号８、７２および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；および
（ｍ）配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１～３領域、ならびに配列番号１７、１８および１９にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１～３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物中の前記ＴＩＭ－３抗体または抗原結合フラグメントは、上記のモノクローナル抗体のいずれか１つによって結合されるものと同じエピトープに結合することを特徴とする。
本開示の医薬組成物のいくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、抗体は組換え抗体である。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される組換え抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントである。
本開示の医薬組成物のいくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示される重鎖可変領域配列、および／または、配列番号５に示される軽鎖可変領域配列を含むか、
配列番号６に示される重鎖可変領域配列、および／または、配列番号７に示される軽鎖可変領域配列を含む。
本開示の医薬組成物のいくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、前記ヒト化抗体軽鎖および重鎖可変領域上の軽鎖ＦＲ領域および重鎖ＦＲ領域の配列は、それぞれヒト生殖細胞系列軽鎖および重鎖、またはそれらの変異体配列に由来する。
本開示の医薬組成物のいくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントに関して、前記ヒト化抗体は、配列番号２０もしくは３１に示される重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、当該バリアントは、前記配列番号２０または３１に示される重鎖可変領域中に１～１０個のアミノ酸復帰変異を有する。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記バリアントは、前記配列番号２０または３１に示される重鎖可変領域のＦＲ領域中に１～１０個のアミノ酸復帰変異を有し；好ましくは、前記復帰変異は、配列番号２０におけるＤ８９Ｅ、Ｒ９８Ｔ、Ｇ４９Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ３８ＫおよびＶ６８Ａからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸復帰変異であるか、または配列番号３１に示される重鎖可変領域におけるＱ３Ｋおよび／またはＲ８７Ｋのアミノ酸復帰変異である。
いくつかの実施形態では、抗体のＣＤＲ領域の化学修飾（アセチル化および脱アミド化など）を排除するために、本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ領域における化学修飾を受けやすい部位は、アミノ酸置換に供することができる；好ましくは、ＣＤＲ２中のＮＮＧが置換される；好ましくは、本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントの一実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号４５、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域を含む。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号３４または３５に示される重鎖可変領域を含む。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号２１もしくは３２に示される軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、当該バリアントは、前記配列番号２１または３２に示される軽鎖可変領域中に１～１０個のアミノ酸復帰変異を有する。
いくつかの実施形態では、前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２１もしくは３２に示される軽鎖可変領域またはそのバリアントのＦＲ領域を含み、当該バリアントは、前記配列番号２１または３２に示される軽鎖可変領域中に１～１０個のアミノ酸復帰変を有し；好ましくは、前記復帰変異は、配列番号２１におけるＡ４３Ｓ、配列番号３２におけるＱ３Ｋ、Ｉ４８Ｖ、Ｋ４５Ｑ、Ａ４３ＳおよびＴ８５Ｓからなる群から選択される少なくとも１つである。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号３０に示される軽鎖可変領域を含むか、または配列番号３７、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるいずれか１つに示される軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体のＣＤＲ領域の化学修飾（アセチル化および脱アミド化など）を排除するために、本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ領域における化学修飾を受けやすい部位は、アミノ酸置換に供することができる；好ましくは、ＣＤＲ２中のＮＮＧが置換されて、配列番号４３に示されるＣＤＲ２配列が形成される；本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号２９または３０に示される軽鎖可変領域配列を含む。
本発明のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号２９または３０に示される軽鎖可変領域配列を含み、好ましくは、配列番号２４に示される重鎖可変領域配列および配列番号２９に示される軽鎖可変領域配列を含む。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるいずれか１つに示される軽鎖可変領域配列を含み、好ましくは配列番号３３に示される重鎖可変領域配列および配列番号３６に示される軽鎖可変領域配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗体のＣＤＲ領域におけるアミノ酸部位の脱アミド化を排除するために、本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのＣＤＲ領域における化学修飾を受けやすい部位は、アミノ酸置換に供され得る；好ましくは、ＣＤＲ２中のＮＮＧが置換される；本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントの好ましい実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号２９または３０に示される軽鎖可変領域配列を含み、好ましくは、配列番号５１に示される重鎖可変領域配列および配列番号２９に示される軽鎖可変領域配列、または配列番号５２に示される重鎖可変領域配列および配列番号２９に示される軽鎖可変領域配列を含む。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体は全長抗体であり、ヒト抗体定常領域、好ましくは配列番号４１に示されるヒト重鎖定常領域配列または配列番号４１に対して８５％の配列同一性を有する配列；および好ましくは配列番号４２に示されるヒト軽鎖定常領域配列または配列番号４２に対して８５％の配列同一性を有する配列をさらに含む。上記の少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは９０％、９５％または９９％以上の配列同一性を有し、最も好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性を有し、上記の少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換変異によって得ることができる。最も好ましくは、前記抗体は、配列番号７３に示される重鎖の全長配列および配列番号７４に示される軽鎖の全長配列を含む。
本開示のＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲ領域を含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される。
本開示はまた、緩衝液を使用することによってＴＩＭ３抗体のストック溶液を置換するステップを含む、上記医薬組成物の調製方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記緩衝液は、好ましくは酢酸緩衝液またはヒスチジン塩緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン－塩酸緩衝液、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液またはヒスチジン－酢酸緩衝液であり、最も好ましくはヒスチジン－酢酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、前記緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ～３０ｍＭであり、非限定的な例としては、５ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記緩衝液のｐＨ値は、約５．０～６．５、好ましくは約５．０～６．０、好ましくは約５．２～５．８、最も好ましくは５．５であり、非限定的な例としては、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０が挙げられる。
本開示はまた、前記置換ステップで得られた溶液に糖類および界面活性剤を添加するステップと、緩衝液で体積を調整するステップとをさらに含む、上記医薬組成物の調製方法を提供する。いくつかの実施形態では、好ましい糖類は非還元二糖類、より好ましくはトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースであり、糖類の濃度は約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約９０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは７０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例としては、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは８０ｍｇ／ｍｌが挙げられる。いくつかの実施形態では、好ましくは、前記界面活性剤はポリソルベート８０またはポリソルベート２０、より好ましくはポリソルベート８０であり、その濃度は約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例としては、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
本開示はまた、上記の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の調製方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５および１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５および１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－塩酸（ｐＨ６．０）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌ抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－塩酸（ｐＨ５．５）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬品組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および７０ｍｇ／ｍｌのスクロースを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および７０ｍｇ／ｍｌのα，α－トレハロース二水和物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、および０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、２０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、および６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、および５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、２０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、および５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、３０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、および５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、２０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、３０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．０）、および６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、２０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．０）、および５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、３０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、２０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．５）、および４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、３０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、および４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、３０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．０）、および４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．０）、および６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１０ｍＭのヒスチジン－酢酸（ｐＨ５．０）、および４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体ｈ１７９９－００５を含む。
ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の調製方法のいくつかの実施形態では、凍結乾燥は、予備凍結、一次乾燥および二次乾燥のステップを連続して含む。凍結乾燥は、製剤を凍結させ、次いで一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって行われる。この条件下では、製品の温度は、製剤の共晶点または分解温度よりも低い。通常約５０～２５０ミリトールの範囲の適切な圧力下で、一次乾燥のための保存温度は、通常、約－３０～２５℃である（一次乾燥プロセスの間、製品は凍結したままであると仮定）。製剤およびサンプルを保持する容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズおよび種類、ならびに液体の量によって、乾燥に必要な時間の長さが決まり、数時間～数日（例えば、４０～６０時間）に及び得る。二次乾燥段階は、容器の種類およびサイズならびに使用されるタンパク質の種類に応じて、約０～４０℃で行うことができる。二次乾燥の時間の長さは、製品中の所望の残留湿度レベルによって決定され、通常、少なくとも約５時間を必要とする。一般に、凍結乾燥によって得られた凍結乾燥製剤の水分含有量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。圧力は、一次乾燥ステップで適用される圧力と同じにすることができる。好ましくは、二次乾燥の圧力は一次乾燥の圧力よりも低い。凍結乾燥の条件は、製剤およびバイアルサイズによって変化し得る。
本開示はまた、上記のＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の調製方法によって調製された、ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
いくつかの実施形態では、前記凍結乾燥製剤は、２～８℃で少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、または少なくとも２４ヶ月間安定である。いくつかの実施形態では、前記凍結乾燥製剤は、４０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２８日間安定である。
本開示はまた、上記の凍結乾燥製剤を再構成するステップを含む、ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液の調製方法を提供し、再構成のために使用される溶液は、限定されないが、注射用水、生理食塩水およびグルコース溶液からなる群から選択される。
本開示はまた、上述したＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液の調製方法によって調製された、ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を提供する。
本開示はさらに、本明細書に記載される任意の安定な医薬組成物を含む容器を備える、製品またはキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記容器は、中性ホウケイ酸ガラス製の注射ボトルである。
本開示はまた、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を含む容器を備える、製品を提供する。
本開示はまた、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患の診断薬の調製における、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液または製品の使用を提供する。
本開示はまた、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患の治療のための薬剤の調製における、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液または製品の使用を提供する。前記ＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患については、ＴＩＭ－３発現細胞に関連する疾患である限り制限はなく、限定されないが、癌、自己免疫疾患およびアレルギー疾患を含む。
本開示はまた、癌、自己免疫疾患およびアレルギー疾患を治療または診断するための方法であって、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液または製品を対象に投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、前記癌には、血液癌、乳癌、子宮癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌および膵臓癌が含まれる。癌の好ましい例には、血液癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌および前立腺癌が含まれる。血液癌の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、その他のリンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）などが含まれる。自己免疫疾患の特定の例には、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血などが含まれる。アレルギー疾患の例には、急性または慢性の反応性気道疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、ＰＩＥ症候群、食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショックが含まれる。
本開示はまた、腫瘍細胞の増殖または転移に関連する疾患または障害を治療または阻害するための薬剤の調製における、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液の使用を提供する。
本開示はさらに、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患を診断または治療するための方法であって、上記の医薬組成物または凍結乾燥製剤または凍結乾燥製剤の再構成溶液を使用することを含む、方法を提供する。
当業者には周知のように、本開示に記載されている様々な実施形態の１つ、いくつか、またはすべての特徴をさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成することができる。本開示の上記の実施形態および組み合わせによって得られる他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに例示される。
図１：候補ＴＩＭ－３抗体についての細胞結合試験の曲線；データは、候補抗体ｍＡｂ－１７０１およびｍＡｂ－１７９９が抗原を発現する細胞に対して強い結合活性を有することを示している。 図２Ａ～図２Ｃ：混合リンパ球反応アッセイにおける、ＩＦＮγ分泌に対する本開示の候補抗体およびその抗原結合フラグメントの効果；図２Ａ、ＩＦＮγ分泌に対するｈ１７０１－００９およびその抗原結合フラグメントの効果；図２Ｂ、ＩＦＮγ分泌に対するｈ１７０１－００５およびその抗原結合フラグメントの効果；図２Ｃ、ＩＦＮγ分泌に対するｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５の効果。結果は、ｈ１７０１－００９とｈ１７９９－００５の両方がＩＦＮγの分泌を効果的に刺激できることを示している。 図３Ａ～３Ｄ：ＰＢＭＣ活性化試験結果の図；図３Ａ～３Ｄは、ＦＡＣＳ分析におけるＩＦＮγ陽性細胞の割合、すべての細胞におけるＩＦＮγの幾何平均値、ＩＦＮγおよびＴＩＭ－３二重陽性細胞の割合（ＴＩＭ－３＋ＩＦＮγ＋％）およびＴＩＭ－３＋細胞におけるＩＦＮγの幾何平均値をそれぞれ示している；結果は、ｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびＡｂＴＩＭ－３がすべて、活性化時のＰＢＭＣ細胞におけるＩＦＮγの発現に影響を及ぼし、細胞内ＩＦＮγ陽性細胞の割合およびＩＦＮγの発現を様々な程度に増加させることを示している。 図４Ａ～図４Ｂ：ＳＥＢ刺激試験結果の図；図４Ａおよび図４Ｂは、ＩＬ１２およびＩＦＮγについてのＥＬＩＳＡ試験結果を示している；結果は、ｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびＡｂＴＩＭ－３が、ＳＥＢによるＰＢＭＣの５日間の刺激後、ＩＬ１２およびＩＦＮγのＳＥＢ誘導分泌を効果的に増加させたことを示している。 図５：ＪＭＰソフトウエアを使用することによる、本開示のＴＩＭ３抗体製剤の成分に対するモデルフィッティングの結果。
発明の詳細な説明
・用語の詳細な説明
本開示をより理解しやすくするために、特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書で別段明確に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示は、出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７７１９０の全ての内容を参照により本明細書に組み込む。
「緩衝液」は、その共役酸－塩基成分のため、ｐＨの変化に耐性のある緩衝液を指す。ｐＨを適切な範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン塩緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グリシルグリシンおよび他の有機酸緩衝液が含まれる。
「ヒスチジン塩緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液を指す。ヒスチジン塩緩衝液の例には、ヒスチジン－塩酸塩緩衝液、ヒスチジン－酢酸塩緩衝液、ヒスチジン－リン酸塩緩衝液、ヒスチジン－硫酸塩緩衝液など、好ましくはヒスチジン－酢酸塩緩衝液またはヒスチジン－塩酸緩衝液が含まれる;ヒスチジン－酢酸塩緩衝液は、ヒスチジンおよび酢酸によって調製される;ヒスチジン－塩酸緩衝液は、ヒスチジンおよび塩酸によって調製される。
「クエン酸緩衝液」は、クエン酸イオンを含む緩衝液を指す。クエン酸緩衝液の例には、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸－クエン酸カリウム緩衝液、クエン酸－クエン酸カルシウム緩衝液、クエン酸－クエン酸マグネシウム緩衝液などが含まれる。好ましいクエン酸緩衝液は、クエン酸－クエン酸ナトリウムである。
「コハク酸緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液を指す。コハク酸緩衝液の例には、コハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸－コハク酸カリウム緩衝液、コハク酸－コハク酸カルシウム緩衝液などが含まれる。好ましいコハク酸緩衝液は、コハク酸－コハク酸ナトリウムである。
「リン酸緩衝液」は、リン酸イオンを含む緩衝液を指す。リン酸緩衝液の例には、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム－クエン酸緩衝液などが含まれる。好ましいリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。
「酢酸緩衝液」は、酢酸イオンを含む緩衝液を指す。酢酸緩衝液の例には、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸－ヒスチジン塩緩衝液、酢酸－酢酸カリウム緩衝液、酢酸－酢酸カルシウム緩衝液、酢酸－酢酸マグネシウム緩衝液などが含まれる。好ましい酢酸緩衝液は、酢酸－酢酸ナトリウムである。
「医薬組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の化合物、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分とを含む混合物を指し、該他の化学成分は、例えば、生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤である。医薬組成物の目的は、抗体活性成分の安定性を維持し、生物への投与を促進し、該活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的活性を発揮することである。
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」および「製剤」は、相互に排他的ではない。
本開示における医薬組成物の溶液形態に関しては、別段の指定がない限り、その中に含まれる溶媒は水である。
「凍結乾燥製剤」は、医薬組成物または製剤の液体形態または溶液形態を真空凍結乾燥することによって得られる製剤または医薬組成物を指す。
本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内にある値を指し、これは、その値がどのように測定または決定されるか（すなわち、測定システムの制限）に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における各実施について、１以内または１超の標準偏差を示すことができる。あるいは、「約」または「本質的に～からなる」は、それに続く表示値から最大±２０％の範囲を意味する。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、本用語は、最大１０倍または最大５倍の値を指すことができる。本出願および特許請求の範囲に記載された特定の値に適用される場合、特に明確に記載されない限り、「約」または「本質的に～からなる」の意味は、その特定の値の許容可能な誤差範囲内にあると想定されるべきである。
本開示の医薬組成物は、安定した効果を達成することができる：医薬組成物に含まれる抗体は、保存後、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を実質的に維持することができる；好ましくは、医薬組成物は、保存後、その物理的安定性、ならびに化学的安定性および生物学的活性を実質的に維持する。貯蔵寿命は、一般に、医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて決定される。現在、タンパク質の安定性を測定するための多くの分析技術が存在し、これらを使用して、所与の温度で所与の期間保存した後の安定性を測定することができる。
抗体の安定な医薬製剤は、以下の条件で有意な変化が観察されないものである：冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１年、さらにより好ましくは最長２年の保存。さらに、安定な液体製剤は、例えば、２５℃の温度で１ヶ月、３ヶ月、および６ヶ月の期間保存した際に、所望の特性を示すような液体製剤を含む。典型的には、安定性の許容基準は以下のとおりである：典型的には、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって評価したとき、抗体モノマーの約１０％以下、好ましくは約５％以下が分解される。抗体の医薬製剤は、目視分析により、淡黄色、ほぼ無色、および透明な液体、または無色、または透明からわずかに乳白色である。製剤の濃度、ｐＨおよび浸透圧の変化は±１０％以下である。典型的には、約１０％以下、好ましくは約５％以下の低下が観察される。典型的には、約１０％以下、好ましくは約５％以下が凝集する。
抗体は、色および／または透明度の目視検査で、またはＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合に、凝集、沈殿および／または変性の有意な増加を示さないならば、医薬製剤中で「その物理的安定性を維持する」と見なされる。タンパク質のコンフォメーションの変化は、（タンパク質の三次構造を決定する）蛍光分光法、および（タンパク質の二次構造を決定する）ＦＴＩＲ分光法によって評価することができる。
抗体は、有意な化学的変化を示さない場合、医薬製剤中で「その化学的安定性を保持する」と見なされる。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出および定量化することによって評価することができる。タンパク質の化学構造をしばしば変化させる分解プロセスは、加水分解またはトランケーション（サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの方法で評価される）、酸化（質量分析またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングなどの方法で評価される）、脱アミド化（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸測定などの方法で評価される）、および異性化（イソアスパラギン酸含有量の測定、ペプチドマッピングなどで評価される）を含む。
所与の時点での抗体の生物学的活性が、医薬製剤が調製された時点で示された生物学的活性の所定の範囲内に依然としてある場合、抗体は、医薬製剤中で「その生物学的活性を保持する」と見なされる。抗体の生物学的活性は、例えば、抗原結合試験によって決定され得る。
本開示で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４３、３５５８頁（１９６８年）に記載されている。
本開示で使用される「抗体」は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合によって一緒に接続されたテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。
本開示において、本開示の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ鎖、λ鎖またはそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域をさらに含むことができる。
本開示において、本開示の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントを含む重鎖定常領域をさらに含むことができる。
抗体重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸の配列は非常に可変的であり、可変領域（Ｆｖ領域）として知られる；Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域として知られる。可変領域には、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が含まれる。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端への順序は、以下の順序である：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指す。本開示に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＬＣＶＲ領域およびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号および位置は、既知のＫａｂａｔナンバリング基準（ＬＣＤＲ１－３、ＨＣＤＲ１－３）に準拠している。
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。
本開示において言及される「抗体またはその抗原結合」または「機能的フラグメント」は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに抗原に結合するＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域を有さず、全ての抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントとして知られている。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーも含み、抗原結合に必要な構成を形成する。異なるリンカーを使用して、２つの抗体可変領域を接続し、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれる単一のポリペプチド鎖を形成することもできる。
本開示における「抗原結合部位」という用語は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントによって認識され得る、抗原上の連続または不連続の三次元空間部位を指す。
本開示における「マウス抗体」という用語は、当該分野の知識および技能に従って調製された、ヒトＴＩＭ３に対するモノクローナル抗体を指す。その調製中、試験対象はＴＩＭ３抗原を注入され、次いで、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマが分離される。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、キメラ抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を構築するためには、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築し、次いで可変領域遺伝子を該マウスハイブリドーマ細胞からクローニングする。続いて、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングする。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子に連結して、ヒトベクターに挿入できるキメラ遺伝子を形成し、最後に、キメラ抗体分子を真核生物または原核生物の産業用システムで発現させる。本開示の好ましい実施形態では、ＴＩＭ３キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖、またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。ＴＩＭ３キメラ抗体の重鎖は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。ヒト抗体の定常領域は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域、好ましくはヒトのＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、またはアミノ酸変異後に得られるＡＤＣＣ毒性（抗体依存性細胞媒介性細胞障害）のないＩｇＧ４からなる群から選択され得る。
ＣＤＲ移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって生成される抗体、すなわち異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列から産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される強い不均一な応答の欠点を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体の遺伝子配列をカバーする公開ＤＮＡデータベースまたは公開されている参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ上で利用可能）、ならびにＫａｂａｔ， Ｅ Ａ， ｅｔ ａｌ， １９９１年 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版に見出すことができる。免疫原生の低下に伴う活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域中のフレームワーク配列は、最小限の逆変異または復帰変異を受けて、活性を維持する。本開示のヒト化抗体は、ファージディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が行われるヒト化抗体も含む。
「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）という用語は、抗体のＦｃセグメントを認識することによる、抗体でコーティングされた標的細胞のＦｃ受容体を発現する細胞による直接的な殺傷を指す。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの改変を介して低減または排除され得る。該改変は、抗体重鎖定常領域における変異、例えば、ＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ；およびＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異からなる群から選択される変異を指す。
本開示に記載される変異体配列中の「変異」には、「復帰変異」、「保存的改変」または「保存的置換または置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」が含まれるが、これらに限定されるものではない。本開示において使用される「保存的改変」または「保存的置換または置換」は、タンパク質中のアミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖のコンフォメーション、および剛性など）を示す他のアミノ酸で置換することを意味し、そのような置換はタンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に行うことができる。当業者は、一般的に言って、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，２２４頁（第４版）を参照）。さらに、類似の構造または機能を有するアミノ酸による置換が生物学的活性を破壊する可能性は低い。
本開示に記載される「変異配列」とは、本開示のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が変異（置換、挿入または欠失など）による適切な改変を受け、その得られたヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が本開示のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列に対して異なる配列同一性パーセントを有することを指す。本開示に記載される配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が挙げられる。配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、米国国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによってデフォルト設定で行うことができる。
「ＴＩＭ３」という用語は、細胞膜の表面に広く発現している免疫グロブリンであり、インテグリン関連タンパク質としても知られている。シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）は、抑制性受容体スーパーファミリーのメンバーであり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。それは、主にマクロファージ、樹状細胞および神経細胞の表面に発現している。細胞表面上でリガンドと接触すると、ＳＩＲＰは、細胞の遊走および食作用、免疫恒常性ならびに神経回路網を調節する。ＴＩＭ３は、ヒトのシグナル制御タンパク質α（ＳＩＲＰα）の細胞外リガンドである。それは、マクロファージ表面のＳＩＲＰαに結合して抑制性シグナルを伝達し、それによって自然免疫系を阻害することにより、食作用を低下させる。このシグナルは、「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルとして鮮明に表現される。
「ＴＩＭ３への結合」という用語は、ヒトＴＩＭ３と相互作用する能力を指す。
「抗ＴＩＭ３抗体」および「ＴＩＭ３抗体」という用語は互換的に使用され得、両方ともＴＩＭ３に結合する抗体を指す。
本開示に記載の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えにより２つの遺伝子を共発現させることによって得られるタンパク質産物である。組換えＴＩＭ３細胞外領域－Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えにより、ＴＩＭ３細胞外領域とＦｃフラグメントを共発現させることによって得られる融合タンパク質である。ＴＩＭ３細胞外領域は、細胞膜の外側に発現されるＴＩＭ３タンパク質を指し、その配列は配列番号１に示されている。
抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒのＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｕｉｄｅ、第５～８章および第１５章に見出すことができる。マウスをヒトＴＩＭ３またはそのフラグメントで免疫化することができ、得られた抗体を再生および精製することができ、アミノ酸配列のシークエンシングを従来の方法によって行うことができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法によって調製することができる。本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒト由来ＣＤＲ領域に付加するように遺伝子操作されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ＩＭＧＴ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ（２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１）から取得することができる。
本開示の操作された抗体またはその抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。次に、組換え免疫グロブリン発現ベクターをＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトすることができる。当技術分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端で、抗体のグリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンは、ヒトＴＩＭ３に特異的に結合する抗体の発現を通じて得ることができる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培地で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術により精製することができる。例えば、調整した緩衝液で平衡化されたＡまたはＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムによって、精製を行うことができる。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗体はｐＨ勾配で溶出し、抗体フラグメントはＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出してから、回収する。抗体は、一般的な技術を使用してろ過および濃縮することができる。可溶性混合物および多量体は、モレキュラーシーブ、イオン交換などの一般的な技術によって除去することもできる。得られた産物は、例えば－７０℃で直ちに凍結するか、凍結乾燥することができる。
「任意の」または「任意に」とは、続いて記載した出来事または状況が発生する可能性があるが、必ずしも発生するとは限らないことを意味し、そのような記載には、出来事または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意に、１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列を有する該抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在する必要はないことを意味する。
「投与」および「治療」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療薬、診断薬、または組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または生体液と接触させることを指す。「投与」および「治療」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を指すことができる。細胞の治療（処理）は、試薬を細胞と接触させること、ならびに流体が細胞と接触している場合に試薬を該流体と接触させることを含む。「投与」および「治療」は、例えば、試薬、診断、結合組成物または別の細胞による、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの治療も意味する。「治療」は、ヒト、獣医、または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的または予防的措置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）、研究および診断への適用を指す。
「治療する」とは、本開示の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、該治療薬が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有する患者に、内部的にまたは外部的に投与することを意味する。典型的には、治療薬は、治療された患者または集団における１つ以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与され、任意の臨床的に測定可能な程度まで、そのような症状の退行を誘発するか、そのような疾患の進行を阻害する。特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘発する治療薬の能力などのさまざまな因子によって変動し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練した医療提供者が通常使用する任意の臨床測定によって評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、治療方法または製品）は、目的の各疾患症状を軽減するのに効果的ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニー（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定、およびウィルコクソン検定などの当該技術分野で既知の任意の統計的試験によって決定される統計的に有意な数の患者において、目的の標的疾患症状を軽減するはずである。
本開示の製剤は、ＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患を治療するために使用することができる。ＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患については、癌、自己免疫疾患およびアレルギー疾患などのＴＩＭ－３発現細胞に関連する疾患である限り、制限はない。癌には、血液癌、乳癌、子宮癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌および膵臓癌が含まれる。癌の好ましい例には、血液癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌および前立腺癌が含まれる。血液癌の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、その他のリンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）などが含まれる。自己免疫疾患の特定の例には、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血などが含まれる。アレルギー疾患の例には、急性または慢性の反応性気道疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、ＰＩＥ症候群、食物アレルギー、枯草熱、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショックなどが含まれる。
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を含む。有効量は、診断を可能または容易にするのに十分な量も意味する。特定の患者または獣医学的対象についての有効量は、治療される状態、患者の一般的な健康、投与の経路および用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大用量または投与プロトコルであり得る。
「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶媒システムの置換を指す。例えば、抗体タンパク質を含む高塩または高張溶媒システムは、該抗体タンパク質が安定な製剤中に存在するように、安定な製剤用の緩衝液システムを使用した物理的操作によって置換される。物理的操作には、限外ろ過、透析または遠心分離後の再構成が含まれるが、これらに限定されない。
「医薬組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の化合物またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の化学成分を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、次いで生物学的活性を発揮することである。
抗体医薬組成物（製剤）の例示的な調製プロセス：
ステップ１：一定量の精製ＴＩＭ３抗体溶液を、抗体を含まない緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）など）に対する（好ましくは限外ろ過による）溶媒置換に供した。該置換は、限外ろ過膜に少なくとも６倍量を通過させることによって行われる；タンパク質は約７０ｍｇ／ｍＬに濃縮された。一定量のスクロースのストック溶液を添加し、混合して８０ｍｇ／ｍＬのスクロース最終濃度を得た。一定量のポリソルベート８０のストック溶液を添加し、混合して０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０最終濃度を得た。１０ｍＭヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を添加し体積を調整して、タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍＬにした（試験対象の他の製剤または安定な製剤は、同様のステップに従って調製された）。
生成物をろ過し、インプロセス制御サンプリングによって無菌性を試験した。ストック溶液を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターに通し、ろ液を回収した。
ステップ２：充填容量を２．１５ｍｌに調整し、ろ液を２ｍｌの栓付きバイアルに充填した；充填手順の開始時、実行中および終了時にそれぞれサンプリングすることによって容量差を試験した。
ステップ３：キャッピングマシンを用いてアルミニウムキャップをキャップした。
ステップ４：不正確な充填などの欠陥がないかどうかを確認するために、目視検査を行った。ラベルを印刷し、バイアルに貼り付けた；ラベルを紙トレイに印刷し、紙トレイを折り畳み、バイアルを紙トレイに入れ、ラベルを紙トレイに貼り付けた。
以下、実施例を参照して本開示をさらに説明するが、本開示の範囲はこれに限定されない。具体的な条件が記載されていない本開示の実施例では、実験は、一般に、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒによるＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｕｉｄｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇなどに記載されるような従来の条件下で、または材料もしくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給源が特に示されていない場合、その試薬は市販の従来の試薬である。
例１．ＴＩＭ３抗体の調製
Ｉ．ＴＩＭ－３抗原および検出に用いるタンパク質の調製
１．ＴＩＭ－３抗原の設計および発現
ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２）（ヒトＨＡＶＣＲ２、ヒトＴＩＭ－３、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｎｏ：Ｑ８ＴＤＱ０）を本開示のＴＩＭ－３のテンプレートとして使用し、本開示における抗原および検出に用いるタンパク質のアミノ酸配列を設計し、任意に、異なるタグをＴＩＭ－３タンパク質と融合させ、その融合物（ｆｕｓｉｏｎ）をｐＨｒベクター（自社製）またはｐＴａｒｇｅＴベクター（プロメガ、Ａ１４１０）にクローニングし、そのベクターを２９３細胞で一過性に発現させるかＣＨＯ－Ｓで安定に発現させた後、精製して本開示におけるコードされた抗原および検出に用いるタンパク質を得た。特に明記しない限り、以下で言及するＴＩＭ－３抗原はヒトＴＩＭ－３を指す。
ＴＩＭ－３細胞外領域とｈＩｇＧ１ Ｆｃとの融合タンパク質：ＴＩＭ－３－Ｆｃ（配列番号１）、マウスの免疫化に使用：
Figure 2022513553000032
注：下線部分はシグナルペプチドを表し、イタリック体部分はＦｃを表す。
ＦｌａｇおよびＨｉｓタグ付きのＴＩＭ－３細胞外領域：ＴＩＭ－３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ（配列番号２）、検出に使用：
Figure 2022513553000033
 注：下線部分はシグナルペプチドを表し、イタリック体部分はＦｌａｇ－Ｈｉｓタグを表す。
ヒトＴＩＭ－３の全長アミノ酸配列：ＴＩＭ－３－全長（配列番号３）、ＴＩＭ－３過剰発現細胞株の構築に使用：
Figure 2022513553000034
注：下線部分はシグナルペプチドを表し、二重下線部分は膜貫通領域を表し、波線は細胞内領域を表し、その他の部分はＴＩＭ－３の細胞外領域を表す。
２．ＴＩＭ－３関連組換えタンパク質の精製、ならびにハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
２．１ ＴＩＭ－３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製ステップ：
サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適切な量に濃縮した。ＮＩ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号３０７２１）をＰＢＳで平衡化し、２～５カラム容量で洗浄した。不純物を除去した後、細胞によって発現された上清サンプルをカラムにロードした。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳですすいだ。カラムをＰＢＳですすぎ、不所望のタンパク質を洗浄し、標的タンパク質を回収した。標的タンパク質を洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール）および溶出緩衝液（３００ｍＭイミダゾール）で連続して溶出し、溶出ピークを回収した。
回収した溶出液をイオン交換（Ｈｉｌｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム）でさらに精製した。カラムは、ｐＨ７．４を確保するために、約２カラム容量のＰＢＳで平衡化した。同定された標的タンパク質を含む溶出緩衝液を濃縮してから、カラムにロードした。サンプルを回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳを用いて同定し、後で使用するために分注した。
２．２ ハイブリドーマ、組換え抗体、およびＦｃ融合タンパク質の精製
細胞によって発現された上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマによって発現された上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムで精製し、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質によって発現された上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳですすいだ。標的タンパク質を１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳ平衡化ゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ）でさらに精製した。ピーク（凝集体が除去された）を回収し、後で使用するために分注した。
ＩＩ．抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体の調製
１．動物の免疫化
抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体は、マウスを免疫化することによって産生された。実験用ＳＪＬ白色マウス、雌、６～８週齢（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（北京）２０１２－０００１）を使用した。給餌環境：ＳＰＦレベル。マウスを購入した後、１週間、１２／１２時間の明／暗サイクル制御、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％の実験室環境に適応させた。環境に適応したマウスを、以下のプロトコルに従って免疫化した。免疫化用の抗原は、Ｆｃ－タグ付きのヒトＴＩＭ－３の細胞外領域（配列番号１）である。
免疫化プロトコル：ＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍｏｕｓｅ５Ｗ（ＫＸ０２１００４１）を用いてマウスを免疫化した。抗原とアジュバントの比率は１：１で、１０μｇ／マウス／時間（１回目免疫化／追加免疫化）である。抗原およびアジュバントを迅速かつ完全に混合してから接種した。接種期間は、１回目免疫化と２回目免疫化の間に２１日間の間隔を含み、その後の免疫化の間の間隔は１４日間であった。各免疫化の７日後に採血し、マウス血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。血清中の抗体力価が高く、その力価がプラトーに達したマウスを脾細胞融合のために選択した。脾細胞の融合の３日前に、生理食塩水で調製した抗原溶液２０μｇ／マウスを腹腔内（ＩＰ）注射することによって追加免疫化を行った。
２．脾細胞融合
最適化されたＰＥＧを介した融合ステップを使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得た。融合させたハイブリドーマ細胞を完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に４×１０５～５×１０５／ｍｌの密度で再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で３～４日間インキュベートし、次いでＨＡＴ完全培地を１００μｌ／ウェルで添加して、ピン状のクローン（ｐｉｎｐｏｉｎｔ－ｌｉｋｅ ｃｌｏｎｅｓ）が形成されるまで３～４日間細胞をさらに培養した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）を添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出を行った。
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、結合ＥＬＩＳＡ法によってハイブリドーマ培養上清を検出した（試験例１を参照）。ＥＬＩＳＡ法で同定された陽性ウェル内の細胞上清を使用して、ＴＩＭ－３過剰発現細胞結合試験を行った（試験例２を参照）。タンパク質結合および細胞結合の両方について陽性であるウェル内の細胞は、凍結保存に間に合うように増殖させ、単一細胞クローンが得られるまで２～３回サブクローン化する必要がある。
サブクローニングした各細胞について、ＴＩＭ－３結合ＥＬＩＳＡおよび細胞結合試験を行った。ハイブリドーマクローンを上記の試験によりスクリーニングし、分泌された抗体ｍＡｂ－１７０１およびｍＡｂ－１７９９を得た。さらに、無血清細胞培養法によって抗体を調製した。抗体は、精製例に従って精製され、試験例で使用するために提供された。
４．ハイブリドーマ陽性クローンのシークエンシング
陽性ハイブリドーマ由来の配列をクローニングするプロセスは、以下のとおりであった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収し、キットの説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し、逆転写のためにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素キットを使用した（タカラ、カタログ番号２６８０Ａ）。逆転写によって得られたｃＤＮＡは、マウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）を用いたＰＣＲによって増幅され、シークエンシングのために会社に届けられた。ｍＡｂ‐１７０１およびｍＡｂ‐１７９９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列が得られた：
Figure 2022513553000035
上記のｍＡｂ－１７０１およびｍＡｂ－１７９９の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列において、下線部はＣＤＲ領域を表し、各配列の配置はＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。各抗体の軽鎖および重鎖中のＣＤＲ配列を表１に示す。
表１．各重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域の配列
Figure 2022513553000036
ＩＩＩ．抗ヒトＴＩＭ－３マウスハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
１． 抗ＴＩＭ－３抗体ｍＡｂ－１７０１のヒト化
ＭＯＥソフトウェアによってヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のＩＭＧＴ生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアライメントすることにより、ｍＡｂ‐１７０１抗体に対して高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子を別々にテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレート上にそれぞれ移植して、ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４の順番で可変領域配列を形成した。アミノ酸残基を同定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって注釈を付けた（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）。
１．１ ヒト化ハイブリドーマクローンｍＡｂ－１７０１のためのフレームワークの選択
マウス抗体ｍＡｂ‐１７０１のヒト化のための軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ１‐３３＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化のための重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１‐１８＊０１およびｈｊｈ４．１であった。ヒト化可変領域配列は以下のとおりである：
Figure 2022513553000037
注：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順番に並んでおり、配列中のイタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。
１．２ ｈ１７０１のテンプレート選択および復帰変異設計
具体的な変異の設計を以下の表２に示す：
表２．ｈ１７０１のテンプレート選択および復帰変異設計
Figure 2022513553000038
注：例えば、Ａ４３Ｓは、天然ナンバリングに従って、４３位のＡが変異してＳに復帰することを意味する。「移植された」は、ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域に移植されたマウス抗体ＣＤＲの配列を表す。
表３．ｈ１７０１ヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ
Figure 2022513553000039
注:この表は、さまざまな変異の組み合わせの結果として得られる配列を示している。ｈ１７０１－００７によって示されるように、ヒト化マウス抗体ｈ１７０１－００７は、２つの変異体（軽鎖ｈ１７０１＿ＶＬ．１Ａおよび重鎖ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ａ）を有する。他のものも同様の方法で示すことができる。
１７０１の特定のヒト化配列は以下のとおりである：
Figure 2022513553000040
２． 抗ＴＩＭ－３抗体ｍＡｂ－１７９９のヒト化
ＭＯＥソフトウェアによってヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のＩＭＧＴ生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアライメントすることにより、ｍＡｂ‐１７９９抗体に対して高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子を別々にテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレート上にそれぞれ移植して、ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４の順番で可変領域配列を形成した。アミノ酸残基を同定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって注釈を付けた（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）。
２．１ ヒト化ハイブリドーマクローン１７９９のためのフレームワークの選択
マウス抗体１７９９のヒト化のための軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ１‐３９＊０１およびｈｊｋ２．１であり、ヒト化のための重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３‐７＊０１およびｈｊｈ４．１であった。ヒト化可変領域配列は以下のとおりである：
Figure 2022513553000041
注：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順番に並んでおり、配列中のイタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。
２．２ ハイブリドーマクローン１７９９のテンプレート選択および復帰変異設計
以下の表４を参照：
表４．ｈ１７９９のテンプレート選択および復帰変異設計
Figure 2022513553000042
注：例えば、Ｉ４８Ｖは、天然ナンバリングに従って、４８位のＩが変異してＶに復帰することを意味する。「移植された」は、ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域に移植されたマウス抗体ＣＤＲの配列を表す。
表５．マウス抗体１７９９のためのヒト化抗体重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の組み合わせ
Figure 2022513553000043
注：この表は、さまざまな変異の組み合わせの結果として得られる配列を示している。ｈ１７９９－００５によって示されるように、ヒト化マウス抗体ｈ１７９９－００５は、２つの変異体（軽鎖ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ａおよび重鎖ｈ１７９９＿ＶＨ．１）を有する。他のものも同様の方法で示すことができる。
１７９９の特定のヒト化配列は以下のとおりである：
Figure 2022513553000044
ＩＶ．組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の調製
抗体の調製のために、ヒト重鎖ＩｇＧ４／軽鎖カッパ（κ）の定常領域を各可変領域と組み合わせ、ＩｇＧ４抗体の安定性を高めるために、Ｓ２２８Ｐ変異をＦｃセグメントに導入した。当技術分野で知られている他の変異を使用して、その性能を改善することもできる。
重鎖定常領域の配列は、配列番号４１に示されている：
Figure 2022513553000045
 軽鎖定常領域の配列は、配列番号４２に示されるとおりである：
Figure 2022513553000046
 ここで、抗体ｈ１７９９－００５の重鎖の全長配列は、配列番号７３に示されるとおりである：
Figure 2022513553000047
 抗体ｈ１７９９－００５の軽鎖の全長配列は、配列番号７４に示されるとおりである：
Figure 2022513553000048
注：上記の抗体ｈ１７９９－００５の全長配列において、イタリック体はＦＲ領域配列を表し、下線部分はＣＤＲ領域配列を表し、波線は定常領域配列を表す。
１．組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマスクリーニングから得られた陽性抗体分子は、可変領域コード遺伝子の配列を得るためにシークエンシングされる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、シークエンシングによって得られた配列に基づいて設計され、シークエンシングされた遺伝子がテンプレートとして使用された；さまざまな抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントがＰＣＲによって構築され、次いで、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈカッパ（κ）定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）と相同的に組換えられ、そして組換えキメラ抗体のための全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒが構築されて、２つのキメラ抗体Ｃｈ１７０１およびＣｈ１７９９が形成された。
２．ヒト化抗体の分子クローニング
設計したヒト化抗体配列に対してコドン最適化を行って、ヒトコドン選好性を有するコード遺伝子配列を作製した。プライマーを設計して、ＰＣＲによりさまざまな抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築した後、該フラグメントを発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈカッパ（κ）定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）と相同的に組み換えて、ヒト化抗体全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。
３．組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖を別々に発現するプラスミドを１：１．２の比率でＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、その発現上清を６日後に回収し、高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳでリンスした。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶出液で標的タンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～９．０）で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳで平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ）によりさらに精製して凝集体を除去した；モノマーのピークを収集し、後の使用のために分注した。
Ｖ．ｈ１７０１の抗体の点変異
脱アミド化修飾は、後の段階で安定性に影響を与え得る抗体の一般的な化学修飾である。特に、ＣＤＲ領域中の一部のアミノ酸は高度に脱アミド化、酸化、または異性化されている；一般に、このような変異は、回避または低減されるべきである。加速安定性試験および計算機シミュレーションされた抗体構造、ならびにホットスポット予測によると、ｈ１７０１抗体の重鎖ＣＤＲ２中のＮＮＧは、脱アミド化を受けやすい部位である。上記のＮＮＧは、ｈ１７０１抗体の重鎖可変領域中の５４～５６位（天然ナンバリング（ｎａｔｕｒａｌ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ））に位置する。アミノ酸の性質と計算機シミュレーションされた抗体構造のための技術によると、上記位置のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することができる。好ましくは、ｈ１７０１のＣＤＲ２変異体は、ＤＩＩＰＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＫＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号４３）であり、ここでＸ１、Ｘ２およびＸ３は、ｈ１７０１抗体の重鎖可変領域中の５４～５６位のアミノ酸残基であり；Ｘ１は、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＧｌｕからなる群から選択され；Ｘ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＶａｌからなる群から選択され；Ｘ３は、ＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択される。
さらに、上記の５４～５６位に変異を含むＣＤＲ２と、異なる復帰変異を含むＦＲ領域は、以下の重鎖可変領域を構成することができる：
Figure 2022513553000049
ｈ１７０１のＨＣＤＲ２変異体および対応するＣＤＲ２変異体を含むヒト化配列ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｂ－ＣＤＲ２変異体（配列番号４６）に関連する例示的な配列を、以下の変異体および表６に示す。
一例として、ｈ１７０１－００９のＨＣＤＲ２中のＮＮＧは、ＮＬＧ、ＮＶＧ、ＮＮＡ、ＮＭＡ、ＮＥＡ、ＮＨＡ、ＮＭＧ、ＮＥＧ、ＮＫＧ、ＮＡＧ、ＮＨＧに変異するように設計された（上記の重鎖可変領域ＣＤＲ２変異体の配列は、それぞれ配列番号５１～６１に示すとおりである）。発現プラスミド構築および２９３Ｅ発現は分子クローニングの方法によって行われ、変異体抗体の親和性および安定性は精製後にさらに試験された。一連のアミノ酸変異が、ｈ１７０１－００９に対して行われた；特定の関連配列には、限定されないが、表６に記載されているものが含まれる。
表６．脱アミド化防止修飾を含むｈ１７０１－００９の重鎖可変領域変異体の配列
Figure 2022513553000050
ＶＩ．抗体の性能および効果の検出
以下の試験方法が、本開示の抗体の性能および有益な効果を検証するために使用される：
試験例１：ヒトＴＩＭ－３を過剰発現するＣＨＯ－ｓ細胞に対する抗ＴＩＭ－３抗体の結合試験
抗ＴＩＭ－３抗体の結合能力を、ＴＩＭ－３タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－Ｓ細胞への抗体の結合によって試験した。ＴＩＭ－３全長プラスミド（自社製、配列番号３）をエレクトロトランスフェクションによりＣＨＯ‐Ｓ細胞にトランスフェクトし、ストレス下で２週間スクリーニングした後、ＴＩＭ‐３の発現レベルを検出した。過剰発現細胞を９６ウェルプレートの底部に固定し、次いで、抗体添加後のシグナル強度を用いて、Ｔｉｍ－３過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞に対する抗体の結合活性を決定した。具体的な実験方法は以下のとおりである。使用したポジティブコントロール抗体はＡｂＴｉｍ－３であり、その配列はＵＳ２０１５０２１８２７４Ａ１の表２に由来し、本出願人によって調製された。
１００μｌ／ウェルの細胞を９６ウェルプレートに４×１０５／ｍｌの密度で播種し、一晩培養した。上清を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの４％ＰＦＡを加えて室温で３０分間固定し、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。液体を除去した後、ＰＢＳで希釈した５％脱脂乳（Ｂｒｉｇｈｔ Ｄａｉｒｙ社製の脱脂粉乳）を含むブロッキング溶液を２００μｌ／ウェルで添加し、ブロッキングのために３７℃のインキュベーター中で２．５時間インキュベートした。ブロッキングの最後に、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で５回洗浄した；サンプル希釈液でさまざまな濃度に希釈した試験対象の抗体（ハイブリドーマから精製した抗体またはヒト化抗体）を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃のインキュベーター中で１時間インキュベートした。インキュベーション終了後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３５－００３）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２－００－０３）を添加し、室温で５～１５分間インキュベートした；５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止し、ＮＯＶＯＳｔａｒプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの波長での吸光度値を読み取った；Ｔｉｍ－３過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞へのＴＩＭ－３抗体の結合を示すＥＣ５０値を算出した。試験結果を図１および表７に示す。
表７．細胞結合試験における候補抗体のＥＣ５０の決定
Figure 2022513553000051
結果は、ＴＩＭ－３抗体Ｎｏ．１７０１およびＮｏ．１７９９ならびにそれらのヒト化抗体が、全長ヒトＴＩＭ－３タンパク質を過剰発現するＣＨＯ－ｓ細胞に対して良好な結合活性を示すことを示している。
ヒトＴＩＭ－３過剰発現細胞に対する結合活性を、ＨＣＤＲ２点変異を有するｈ１７０１－００９抗体で試験した。結果を表８に示す。
表８．細胞結合試験における候補抗体のＥＣ５０の決定
Figure 2022513553000052
結果は、ＨＣＤＲ２点変異を有するｈ１７０１－００９抗体が、ヒトＴＩＭ－３を過剰発現するＣＨＯ－ｓ細胞に対して依然として強い結合活性を示すことを示している。
試験例２：抗ＴＩＭ－３抗体の競合試験
抗体ＡをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ４４１７－１００ＴＡＢ）で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に５０μｌ／ウェルで加え、３７℃のインキュベーターに２時間入れた。液体を除去し、ＰＢＳで希釈した５％脱脂乳（Ｂｒｉｇｈｔ Ｄａｉｒｙ社製の脱脂粉乳）を含むブロッキング溶液を２００μｌ／ウェルで添加し、ブロッキングのために３７℃インキュベーター中で２．５時間または４℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートした。ブロッキングの終わりに、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で５回洗浄した；サンプル希釈液（１％ＢＳＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で２０μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌに希釈した抗体Ｂと、最終濃度０．４μｇ／ｍｌのビオチン標識ＴＩＭ‐３‐Ｆｃタンパク質（自社製、配列番号１）のプレミックス溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃インキュベータで１時間インキュベートした。インキュベーション終了後、反応溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した；サンプル希釈液で希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２４３８）を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２－００－０３）を添加し、室温で５～１５分間インキュベートした；５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止し、ＮＯＶＯＳｔａｒプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長での吸光度値を読み取った。Ｔｉｍ－３への結合に対する異なる抗体の競合効果を算出した。
表９．ｍＡｂ－１７０１およびｍＡｂ－１７９９のＴＩＭ－３への結合の競合試験
Figure 2022513553000053
結果は、ＴＩＭ－３への結合に関してｍＡｂ－１７０１とｍＡｂ－１７９９との間に競合関係がないことを示している。
試験例３：ＢＩＡｃｏｒｅ検出を用いた抗ＴＩＭ－３抗体の親和性試験
１．マウス抗体のＢＩＡｃｏｒｅ親和性検出
マウス抗体捕捉キット（カタログ番号ＢＲ－１００８－３８、ＧＥ）の説明書に記載された方法に従って、マウス抗体捕捉抗体をＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ－１０００－１２、ＧＥ）上に共有結合させて、試験対象の抗体を親和性捕捉した。次に、ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ．Ｂｉｏｌ、カタログ番号１０３９０－Ｈ０３Ｈ）抗原がチップ表面を通過し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いてリアルタイムの反応シグナルを検出し、会合および解離の曲線を取得した；親和性値をフィッティングにより求めた。試験中に解離の各サイクルが完了した後、バイオチップは洗浄され、マウス抗体捕捉キットに含まれる再生溶液で再生された。結果を表１０に示す。
表１０．候補抗体の親和性の決定
Figure 2022513553000054
結果は、ＴＩＭ－３抗体ｍＡｂ－１７０１およびｍＡｂ－１７９９がヒトＴＩＭ－３タンパク質に対して強い結合活性および親和性を有することを示している。
２．キメラ抗体およびヒト化抗体のＢＩＡｃｏｒｅ親和性検出
ヒト抗体捕捉キット（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）の説明書に記載された方法に従って、ヒト抗体捕捉抗体をＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ－１０００－１２、ＧＥ）上に共有結合させて試験対象の抗体を親和性捕捉し、次いで、ＴＩＭ－３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ（自社製、配列番号２）抗原がチップの表面を通過し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いてリアルタイムの反応シグナルを検出し、会合および解離の曲線を取得した。親和性値をフィッティングにより求めた（表１１参照）。試験中に解離の各サイクルが完了した後、バイオチップは洗浄され、ヒト抗体捕捉キットに含まれる再生溶液で再生された。
表１１．抗ＴＩＭ－３抗体の親和性
Figure 2022513553000055
結果は、本開示でスクリーニングされたヒト化抗体がヒトＴＩＭ－３タンパク質に対して強い結合活性および親和性を有することを示している。
ＨＣＤＲ２点変異を有するｈ１７０１－００９抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅによって検出した。結果を表１２に示す。
表１２．抗ＴＩＭ－３抗体の親和性
Figure 2022513553000056
結果は、上記のｈ１７０１－００９変異体が依然として強いＴＩＭ－３親和性を有することを示している。ＮＮＧ部位の変異は、抗原に対する抗体の親和性に影響を与えない。
試験例４：免疫細胞機能のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
Ｔリンパ球の活性化に対する抗ＴＩＭ－３抗体の効果を検討するために、３つのｉｎ ｖｉｔｒｏ機能試験を確立した：混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲアッセイ）、ＰＢＭＣ活性化試験、およびスーパー抗原黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）刺激試験。
１．混合リンパ球反応アッセイ
実験プロセスを以下に簡単に説明する。
１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集および精製した；
２）ＰＢＭＣを６ウェルＮＵＮＣプレートに２×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、２時間培養した；
３）非接着細胞を除去し、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて接着細胞を５日間刺激し、その後、該細胞をＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に２日間インキュベートして、ＤＣ細胞の成熟を誘導した；
４）１０ｎｇ／ｍｌのＣＤ３抗体でプレコーティングした９６ウェルプレート中で、成熟ＤＣ細胞を異なるドナー由来のＰＢＭＣと１：５の比率で混合し、異なる濃度のｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５、ＡｂＴＩＭ－３およびネガティブコントロールＦｃ－ＩｇＧをパラレルに添加した；
５）５日後、上清中のＩＦＮγの濃度をＥＬＩＳＡにより検出した（結果を図２Ａ～図２Ｃに示す）。
結果は、ｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびＡｂＴＩＭ－３がすべてＩＦＮγの分泌を効果的に刺激し、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５がより強い刺激効果を示すことを示している。
２．ＰＢＭＣ活性化試験
実験プロセスを以下に簡単に説明する。
１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集および精製し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体で９６ウェルプレートをコーティングした；
２）コーティングした９６ウェルプレートに、ＰＢＭＣを１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。異なる濃度のＴＩＭ－３抗体およびネガティブコントロールＦｃ－ＩｇＧをパラレルに添加した；
３）６日後、細胞内ＩＦＮγおよびＴＩＭ－３染色のために細胞を収集した。ＦＡＣＳを使用して、ＩＦＮγ陽性細胞の割合（ＩＦＮγ＋％）、全細胞におけるＩＦＮγ Ｇｅｏ平均値、ＩＦＮγおよびＴＩＭ－３二重陽性細胞の割合（ＴＩＭ－３＋ＩＦＮγ＋％）、ならびにＴＩＭ－３＋細胞におけるＩＦＮγ Ｇｅｏ平均値を分析した（図３Ａ～図３Ｄ）。
結果は、ｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびＡｂＴＩＭ－３が細胞内ＩＦＮγ陽性細胞の割合およびＩＦＮγの発現をさまざまな程度に増加させ、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５がより強い効果を有することを示している。
３．ＳＥＢ刺激試験
実験プロセスを以下に簡単に説明する：
１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集および精製した；
２）ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢと異なる濃度のＴＩＭ－３抗体およびネガティブコントロールＦｃ－ＩｇＧをパラレルに添加した；
３）５日後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ１２およびＩＦＮγ検出のために上清を収集した（それぞれ、図４Ａおよび図４Ｂを参照）；
結果は、ｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびＡｂＴＩＭ－３がすべて、ＳＥＢによって誘導されるＩＬ１２およびＩＦＮγの分泌を効果的に増加させることを示しており、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５は低用量でより高い利点を示す。
試験例５：ラットにおける抗ＴＩＭ－３ヒト化抗体ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５の薬物動態測定
体重１８０～２４０ｇのＳＤラット１２匹は、Ｓｉｐｐｒ－ＢＫ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ．から購入した。給餌期間中、動物は食物および水への自由なアクセスを許された；動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル調整、温度１６～２６℃、相対湿度４０～７０％で、３日以上実験室環境に適応することを許された。試験開始の前日、ＳＤラットに番号を付け、各群３匹（オス２匹、メス１匹）になるように無作為に群分けした。試験当日、２つの群のラットに試験剤ｈ１７０１－００９をそれぞれ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した；他の２つの群のラットには、試験剤ｈ１７９９－００５をそれぞれ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。静脈内注射の容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
採血は、さまざまな時点、すなわち投与前、投与後５分、８時間、１日、２日、４日、７日、１０日、１４日、２１日および２８日に行った。抗凝固剤を添加せずに、各動物から０．２ｍＬの全血を採取した。採血後、４℃で３０分間静置し、１０００ｇで１５分間遠心し、上清をＥＰチューブに移し、８０℃で保存した。
ＥＬＩＳＡ法を用いて血清中の抗体濃度を検出し、Ｗｉｎｎｏｌｉｎソフトウエアを用いて試験剤の薬物動態パラメータを算出した。得られた主な薬物動態パラメータを表１３に示す。
表１３．ラットにおけるｈ１７９９－００５およびｈ１７０１－００９の半減期
Figure 2022513553000057
１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＩＭ－３抗体ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５のＳＤラットへの静脈内注射は、ラットにおいて同様の曝露量をもたらす；３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体ｈ１７９９－００５の曝露量の増加は、用量の増加と直線的に相関する；３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体ｈ１７０１－００９の曝露量の増加は、用量の増加よりもわずかに高い；抗体ｈ１７０１－００９のクリアランス半減期は、ｈ１７９９－００５のクリアランス半減期と同様である。
試験例６：ＤＳＣによるｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５抗体の熱安定性の検出
熱安定性について、種々のｐＨ条件を有するさまざまな緩衝液システムを比較した。種々のｐＨ値に対応する例示的な緩衝液システムは、以下のとおりである：１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７）、１５ｍＭ Ｈｉｓ（ｐＨ６．０）、および１０ｍＭ アセテート（ｐＨ５．２）。サンプルを対応する緩衝液中に置換し、サンプル濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調整した；検出にはＭｉｃｒｏＣａｌ＊ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用した。試験に先立ち、各サンプルおよびブランク緩衝液を真空脱気装置で１～２分間脱気した。４００μｌのサンプルまたはブランク緩衝液を、サンプルプレートの各ウェルに添加した（装置へのロード量は３００μｌである）。１４％Ｄｅｃｏｎ９０およびｄｄＨ２Ｏを、洗浄目的で最後の２組のウェルプレートに添加した；サンプルプレートをロードし、次いで、プラスチック製のソフトカバーで覆った。走査温度は２５℃から開始し、１００℃で終了し、走査速度は６０℃／ｈであった。特定の結果を表１４に示す。いくつかの試験システムにおいて、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５の両方が良好な熱安定性を示す。
表１４．異なるｐＨでのｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５抗体の熱安定性のモニタリング表
Figure 2022513553000058
試験例７：一定濃度下での周期的安定性を調べるための、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるサンプルの純度のモニタリング
サンプル濃度が約５０ｍｇ／ｍｌに制御されるような例示的な条件下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）システム中のさまざまな抗体を、例えば、－８０℃で５回凍結融解を繰り返し、４℃または４０℃で１ヶ月間保存した後のそれらの安定性について比較した。Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００Ａ（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣカラムを使用して、抗体の純度を検出した；１ヶ月間の観察後、ｈ１７０１－００９およびｈ１７９９－００５の両方が良好な安定性を示し、４０℃で１ヶ月間の加速されたＳＥＣ純度（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ＳＥＣ ｐｕｒｉｔｙ）に有意な変化はなかった。
試験例８：抗体の化学的安定性
配列番号５１～５５に示すｈ１７０１－００９、ｈ１７９９－００５およびｈ１７０１－００９変異体の化学的安定性を試験した。
試験対象の抗体５００μｇを、４０℃の水浴中でｐＨ７．４のＰＢＳ５００μｌに溶解した；酵素加水分解試験のために、０日目、１４日目、および２８日目にサンプルを採取した。さまざまな時点で採取した１００μｇのサンプルを、１００μｌの０．２Ｍ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、３μｌの０．１ｇ／ｍＬ ＤＴＴを添加し、サンプルを５０℃の水浴中で１時間インキュベートした後、０．０２Ｍ Ｈｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ６．０）を用いて２回限外ろ過し、３μｌの０．２５ｍｇ／ｍＬトリプシンを添加し、サンプルを３７℃の水浴中で一晩加水分解した。ＬＣ－ＭＳ検出および分析には、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑ－ＴＯＦを使用した。結果は、ｈ１７９９－００５が１ヶ月の加速の間（ｆｏｒ ｏｎｅ ｍｏｎｔｈ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）４０℃で有意な異性化、酸化および脱アミド化修飾を示さないことを示しており、この分子が良好な化学的安定性を有することを示唆している。ｈ１７０１－００９の検出では、有意な酸化および異性化修飾は見出されないが、Ｎ５４Ｎ５５Ｇ５６部位に強力な脱アミド化修飾が存在し、上記部位に一連のアミノ酸変異が導入された。例示的な変異には、例えば、ＮＬＧ、ＮＶＧ、ＮＭＡ、ＮＥＡ、ＮＮＡなどが含まれる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性により、これらの変異が生物学的活性に影響を与えないことが確認された。加速試験後のＬＣ－ＭＳ分析は、これらの変異体が脱アミド化修飾を効果的に低減できることを示している。表１５は、加速後のさまざまな変異体の脱アミド化修飾の比率を示している。
表１５．ＣＤＲ２変異を有するｈ１７０１－００９抗体の化学的安定性のモニタリング表
Figure 2022513553000059
例２．抗ＴＩＭ３抗体製剤緩衝液システムのｐＨ値のスクリーニング
以下の緩衝液を用いて、抗体濃度が５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体製剤を調製した（ｈ１７９９－００５、例１に従って調製、以下で使用したものも同様）：
１）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ４．５
２）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０
３）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５
４）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０
高温（４０℃）での安定性を調べるために、サンプルを収集した。結果は、５．５～６．０のｐＨ範囲が抗ＴＩＭ３抗体に適していることを示している（表１６参照）。
表１６．抗ＴＩＭ３抗体のｐＨ値のスクリーニング結果
Figure 2022513553000060
例３．抗ＴＩＭ３抗体製剤のための緩衝液システムのスクリーニング
以下の緩衝液を用いて、抗体濃度が５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）製剤を調製した：
１）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０
２）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
３）１０ｍＭヒスチジン－塩酸、ｐＨ６．０
４）１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．０
５）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５
６）１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５
７）１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５
８）１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０
９）１０ｍＭヒスチジン－塩酸、ｐＨ５．５
１０）１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５
高温（４０℃）および低温・光下（４℃／４５００ｌｘ）における安定性を調べるために、サンプルを収集した。結果は、抗ＴＩＭ３抗体により適した緩衝液システムがヒスチジン－塩酸（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸－酢酸ナトリウム（ＡＡ）およびヒスチジン－酢酸（Ｈｉｓ－ＡＡ）緩衝液であることを示している（表１７参照）。実際の生産サンプルの実際のｐＨが標的ｐＨからわずかにずれ得ることを考慮すると、ＴＩＭ３の安定性のための最適な緩衝液システムはＨｉｓ－ＡＡシステムであり、次にＨｉｓ－ＨＣｌおよびＡＡシステムが続く。
表１７．抗ＴＩＭ３抗体に対するさまざまなｐＨ値の緩衝液システムのスクリーニング結果
Figure 2022513553000061
例４．抗ＴＩＭ３抗体製剤のための安定剤のスクリーニング
抗体濃度が５０ｍｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）製剤を、さまざまな糖類および緩衝液を用いて調製した。
１）１０ｍＭヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース；
２）１０ｍＭヒスチジン－酢酸（ｐＨ６．０）、７０ｍｇ／ｍｌのα，α－トレハロース二水和物；
上記で調製した製剤のサンプルを、高温（４０℃）および低温・光下（５±３℃、４５００ｌｘ）での安定性試験に供した。結果を表１８に示す。結果は、スクロースおよびトレハロースがＴＩＭ３抗体の安定性に対して同様の効果を有することを示している。スクロース濃度が８０ｍｇ／ｍｌの場合、浸透圧は約３００ｍｏｓｍ／ｋｇであり、これは等張圧に近い。したがって、好ましくは、スクロース濃度は８０ｍｇ／ｍｌである。
表１８．安定剤のスクリーニング試験の結果
Figure 2022513553000062
例５．抗ＴＩＭ３抗体製剤のための界面活性剤のスクリーニング
異なる濃度および異なる種類の界面活性剤を含む以下の緩衝液を使用して、抗ＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）製剤を調製した。当該製剤中で、スクロース濃度は７０ｍｇ／ｍｌであり、抗体濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった：
１）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５；
２）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０；
３）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０；
４）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、０．６ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０；
５）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０；
上記の方法に従って調製した抗ＴＩＭ３抗体製剤（群１～５）のサンプルを、０．９％塩化ナトリウム注射溶液で希釈し、タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した；希釈後の各群のサンプルの不溶性粒子を観察した。試験結果を表１９に示す。結果は、０．４ｍｇ／ｍｌ以上のポリソルベート８０が抗ＴＩＭ３抗体により優れた安定性を与えることを示し、従って、０．４～０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０が選択され、好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０が抗ＴＩＭ３抗体のための界面活性剤として使用された。
表１９．抗ＴＩＭ３抗体のポリソルベート希釈のスクリーニング結果
Figure 2022513553000063
例６．製剤中の成分の包括的スクリーニング
タンパク質濃度、緩衝液システムの種類、およびｐＨをさらに最適化するために、ＪＭＰソフトウエアを用いて実験計画（ＤｏＥ）を行い、ＲＳＭモデルを用いて一連の製剤を得た（下記参照）。異なる濃度の抗ＴＩＭ３抗体、８０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む抗ＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）製剤を、異なるイオン強度および異なるｐＨを有する以下の緩衝液システムで調製した：
１）２０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、６０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
２）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、５０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
３）２０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、５０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
４）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
５）３０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、５０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
６）２０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０、５０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
７）３０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０、６０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
８）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０、６０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
９）２０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０、５０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１０）３０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０、６０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１１）２０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．５、４０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１２）３０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ６．０、４０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１３）３０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０、４０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１４）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０、６０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体；
１５）１０ｍＭヒスチジン－酢酸、ｐＨ５．０、４０ｍｇ／ｍｌ ＴＩＭ３抗体。
上記の方法に従って調製した抗ＴＩＭ３抗体（群１～１５）製剤のサンプルを、安定性分析のために４０℃で保存し、ＩＥＣ中性ピークと酸性ピークとの間の差を評価指標として使用し、結果を最小二乗方法によって統計的に分析した。試験結果を図５および表２０に示す。結果は、イオン強度１０ｍＭ、ｐＨ５．５のヒスチジン－酢酸システムが抗ＴＩＭ３抗体の安定性により有利であり、該タンパク質は４０～６０ｍｇ／ｍｌの濃度でより安定であることを示している。５０ｍｇ／ｍｌの中央値が抗ＴＩＭ３抗体の最終タンパク質濃度として用いられる。
表２０．高温で保存されたＴＩＭ３抗体の安定性の試験結果
Figure 2022513553000064
例７．代替の任意の製剤
さらに、本開示は、限定されるものではないが、以下を含む他の抗ＴＩＭ３抗体製剤も提供する：
（１）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）；
（２）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および２０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）；
（３）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）；
（４）１００ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）；
（５）１００ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および２０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）；
（６）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、９０ｍｇ／ｍｌのトレハロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）；
（７）６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）；
（８）４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）；
（９）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および３０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）；
（１０）４０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、９０ｍｇ／ｍｌのトレハロース、０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および２０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）；
（１１）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）；
（１２）６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）；
（１３）５５ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）；
（１４）４５ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．７ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）；
（１５）５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．９）；
（１６）１００ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）；
（１７）７０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．８ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および５ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）；
（１８）１ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体（ｈ１７９９－００５）、６０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および２０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）；
（１９）９０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ３抗体、６０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および２０ｍＭのヒスチジン－酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）。

Claims (25)

  1. バッファーが酢酸塩、ヒスチジン塩、コハク酸塩、リン酸塩およびクエン酸バッファーからなる群から選択され、好ましくはバッファーが酢酸塩バッファーまたはヒスチジン塩バッファーであり、抗体のｐＨが５．０～６．５、好ましくは５．５～６．０、最も好ましくは約５．５でＴＩＭ－３バッファーまたはその抗原結合フラグメントおよびバッファーを含む医薬組成物。
  2. 酢酸塩バッファーが酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファーであり、ヒスチジン塩バッファーがヒスチジン－酢酸バッファーまたはヒスチジン－塩酸バッファーであり、コハク酸バッファーがコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーであり、リン酸バッファーがリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファーであり、好ましくはバッファーがヒスチジン－塩酸、酢酸－ナトリウム酢酸塩またはヒスチジン－酢酸バッファーであり、最も好ましくはヒスチジン－酢酸バッファーで請求項１に記載の医薬組成物。
  3. バッファーが５ｍＭ～３０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ～２０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭで請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度が、１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ～６０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌで請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 糖類をさらに含み、好ましくは糖類がトレハロースまたはスクロースであり、最も好ましくはスクロースで請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記糖類の濃度が、５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌで請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 界面活性剤をさらに含み、好ましくは界面活性剤がポリソルベートであり、より好ましくはポリソルベート８０で請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記界面活性剤の濃度が、０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌで請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 以下を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物：
    （ａ）約１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント
    （ｂ）約５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩バッファーまたはヒスチジン塩バッファー
    （ｃ）約５０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの糖
    （ｄ）約０．２ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌの界面活性剤；
    好ましくは、（ａ）４０ｍｇ／ｍｌ～６０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、（ｂ）１０ｍＭ～３０ｍＭのヒスチジン－酢酸バッファーまたは酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー、ｐＨ約５．０～６．０、（ｃ）７０ｍｇ／ｍｌ～９０ｍｇ／ｍｌのスクロースまたはトレハロース、および（ｄ）０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベートを含む医薬組成物；
    最も好ましくは、（ａ）約５０ｍｇ／ｍｌのＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメント、（ｂ）約１０ｍＭのヒスチジン－酢酸バッファーまたは酢酸－ナトリウム酢酸塩バッファー（ｐＨ約５．５）、（ｃ）約８０ｍｇ／ｍｌのショ糖、および（ｄ）約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む医薬組成物である。
  10. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが、以下の（ｉ）または（ｉｉ）から選択される任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントで請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物：
    （ｉ）配列配列番号８、４３および１０にそれぞれ示されるような、または配列番号８、４３および１０に対してそれぞれ少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および／または配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示されるような、または配列番号１１、１２および１３に対してそれぞれ少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    配列番号４３が配列ＤＩＩＰＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＫＹＮＱＫＦＫＤに示されるように、Ｘ１がＮ、Ｌ、Ｖ、ＭおよびＥからなる群から選択され、Ｘ２がＮ、Ｅ、Ｍ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、ＡおよびＶからなる群から選択される、ＧおよびＡからなる群から選択される；または
    （ｉｉ）配列配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示されるような、または配列番号１４、１５および１６に対してそれぞれ少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および／または配列配列番号１７、１８および１９にそれぞれ示されるような、または配列番号１７、１８および１９に対してそれぞれ少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが、以下の（ａ）～（ｍ）から選択される任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントで請求項１０に記載の医薬組成物：
    （ａ）配列配列番号８、９および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｂ）配列配列番号８、６２および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｃ）配列配列番号８、６３および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｄ）配列配列番号８、６４および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｅ）配列配列番号８、６５および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｆ）配列配列番号８、６６および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｇ）配列配列番号８、６７および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｈ）配列配列番号８、６８および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｉ）配列配列番号８、６９および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｊ）配列配列番号８、７０および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；ならびに配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｋ）配列配列番号８、７１および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；
    （ｌ）配列配列番号８、７２および１０にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および配列配列番号１１、１２および１３にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント
    （ｍ）配列配列番号１４、１５および１６にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ１－３領域；および配列配列番号１７、１８および１９にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１－３領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. 前記ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
  13. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化抗体であり、ヒト化抗体の軽鎖ＦＲ領域および重鎖ＦＲ領域の配列が、それぞれヒト生殖系列軽鎖および重鎖由来でまたはその変異配列で請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号２０または３１に示されるような重鎖可変領域またはその変異体を含み、変異体が配列番号２０または３１に示されるような重鎖可変領域のＦＲ領域に１～１０アミノ酸の復帰突然変異を有し；好ましくは復帰突然変異が配列番号２０においてＤ８９Ｅ、Ｒ９８Ｔ、Ｇ４９Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ３８Ｋ、およびＶ６８Ａからなる群より選択される少なくとも１ち、または復帰突然変異は配列番号３１においてＱ３Ｋおよび／またはＲ８７Ｋで請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号２１または３２に示されるような軽鎖可変領域またはその変形例を含み、変形例が配列番号２１または３２に示されるような軽鎖可変領域において１～１０アミノ酸の復帰突然変異を有する；好ましくは、復帰突然変異が配列番号２１におけるＡ４３Ｓ、または配列番号３２におけるＱ３Ｋ、Ｉ４８Ｖ、Ｋ４５Ｑ、Ａ４３ＳおよびＴ８５Ｓからなる群より選択される少なくとも１つで請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
  16. ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントが、を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物：
    配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択される任意の１つに示される重鎖可変領域配列；および／または配列番号２９もしくは３０に示される軽鎖可変領域配列；またはを含む：
    配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群から選択される任意の１つに示される重鎖可変領域配列；および／または配列番号２９もしくは３０に示される軽鎖可変領域配列；またはを含む：
    配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列；および／または配列番号３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるいずれか１つに示される軽鎖可変領域配列；またはこれらを含む：
    配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域配列；および／または配列番号２９もしくは３０に示される軽鎖可変領域配列を含む：
    配列番号４に示す重鎖可変領域配列および／または配列番号５に示す軽鎖可変領域配列を含む：
    配列番号６に示すような重鎖可変領域配列および／または配列番号７に示すような軽鎖可変領域配列；
    好ましくは：
    配列番号２４に示すような重鎖可変領域配列および配列番号２９に示すような軽鎖可変領域配列；または配列番号３３に示すような重鎖可変領域配列および配列番号３６に示すような軽鎖可変領域配列；または配列番号５１に示すような重鎖可変領域配列および配列番号２９に示すような軽鎖可変領域配列；または配列番号５２に示すような重鎖可変領域配列および配列番号２９に示すような軽鎖可変領域配列。
  17. 抗体がヒト抗体定常領域をさらに含み；好ましくは、配列番号４１に示されるヒト重鎖定常領域配列および配列番号４２に示されるヒト軽鎖定常領域配列を含み；最も好ましくは抗体が配列番号７３に示されるような重鎖および配列番号７４に示されるような軽鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 前記抗体が、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと競合してＴＩＭ－３に結合する、ＴＩＭ－３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. ＴＩＭ３抗体の原液をバッファーで置換する工程を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物の調製方法。
  20. ＴＩＭ３抗体を含む凍結乾燥製剤であって、凍結乾燥された製剤が、請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することによって得られる、凍結乾燥製剤。
  21. 前記再構成溶液が、請求項２０に記載の凍結乾燥製剤を再構成することによって調製されることを特徴とする、ＴＩＭ３抗体を含む再構成溶液。
  22. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、または請求項２０に記載の凍結乾燥製剤を含む、または請求項２１に記載の再構成溶液を含む、容器を含む製品。
  23. ヒトＴＩＭ－３陽性細胞に関連する疾患を治療または診断するための薬剤物の調製における、請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２０に記載の凍結乾燥製剤、または請求項２１に記載の再構成液、または請求項２２に記載の生成物の使用。
  24. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項２０に記載の凍結乾燥製剤または請求項２１に記載の再構成液または請求項２２に記載の製剤の治療有効量を、疾患を有する患者に投与することを含む、癌、自己免疫疾患およびアレルギー疾患を治療するための方法。
  25. 癌が肺がん、扁平上皮細胞肺がん、メラノーマ、腎臓がん、乳がん、ＩＭ－ＴＮ乳がん、結腸直腸癌、白血病、膀胱がん、子宮頸がん、結腸がん、胆嚢がん癌、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺癌、唾液腺癌、方法およびメルケル細胞がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）からなる群より選択される；ここで、自己免疫疾患は、多発性硬化症、糖尿病Ｉ型、関節リウマチ、強皮症，クローン病、乾癬、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）（ＳＬＥ）および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項２４に記載の膵臓がん。
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