KR20220143882A

KR20220143882A - 항-il-4r 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220143882A
Application number: KR1020227031858A
Authority: KR
Inventors: 팅팅 우; 젠 얀; 순 리우
Original assignee: 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-10-25
Also published as: EP4104858A1; WO2021164728A1; BR112022016345A2; CN114980926A; AU2021223128A1; JP2023515423A; EP4104858A4; MX2022010217A; US20230088052A1; CA3169959A1; TW202139974A

Abstract

항-IL-4R 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도가 제공된다. 약학적 조성물은 히스티딘-아세트산 완충제, 점도 변형제, 계면활성제, 및 안정화제에 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유한다.

Description

항-IL-4R 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도

본 개시내용은 약학적 제형, 특히 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 면역 질환의 치료용 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

본원의 진술은 단지 본 개시내용과 관련된 배경 정보를 제공할 뿐이고, 필수적으로 선행 기술을 이룰 수 없다.

알레르기 질환은 생명을 위협하지 않는 알레르기 반응 및 생명을 위협하는 알레르기 반응을 포함한 중증 의학적 장애이다. 현재의 알레르기 치료 방법은 알레르겐 회피(allergen avoidance), 증상에 대한 약물학적 치료, 및 알레르겐-특이적 면역요법을 이용한 예방을 포함한다.

인터루킨-4(IL-4, B 세포 자극 인자 또는 BSF-1로도 알려져 있음)는 저농도의 항-표면 면역글로불린 항체에 반응하여 B 세포 증식을 자극시키는 이의 능력을 특징으로 하였다. IL-4는 T 세포, 비만 세포, 과립구, 거핵구(megakaryocyte), 적혈구 등의 성장을 자극시키는 것을 포함하여 광범위한 생물학적 활성을 갖는 것으로 입증되었다. IL-4는 휴지기 B 세포에서 MHC-II 발현을 유도하고, 활성화된 B 세포에 의한 면역글로불린 IgE 및 IgG1의 분비를 증강시킨다.

IL-4의 생물학적 활성은 특정 세포 표면 IL-4 수용체(IL-4R)에 의해 매개된다. IL-4 수용체(IL-4R)는 802개의 아미노산 잔기로 구성되고, IL-4R은 T 세포, B 세포, 흉선 세포, 골수 세포, 대식 세포 및 비만 세포의 표면 상에서 발현된다. IL-4R의 α 사슬은 또한 IL-13 수용체(IL-13R)의 일부이고, 따라서 IL-4R은 또한 IL-13의 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 신규 요법으로서, IL-4R 길항제를 함유하는 약제 및 이의 조성물은 알레르겐에의 노출 또는 알레르기 증상의 발증 전, 동안 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.

높은 단백질 농도를 갖는 제형은 단백질의 물리적 및 화학적 안정성에 과제를 제시하고, 단백질 제형의 제조, 저장 및 전달에서 어려움을 제기한다. 하나의 문제점은 취급 및/또는 저장 동안 입자를 형성하는 단백질의 경향이 추가 가공 동안 작업을 어렵게 만든다는 점이다.

현재, 항-IL-4R 항체 및 이의 제형과 관련된 기존의 특허 출원은 WO2010053751, WO2001092340, WO2008054606, WO2014031610, CN106604744A 등을 포함한다.

단백질 제형의 점도 증가가 제형의 제조로부터 환자에게의 약물의 전달까지 악영향을 미친다는 것을 고려하면, 상대적으로 높은 농도 및 적합하게 낮은 점도를 갖는 단백질 제형을 개발하는 필요성이 존재하고, 여기서 낮은 점도는 단백질 제형의 제조, 저장 및 투여에 적합하다.

본 개시내용은 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 완충제는 히스티딘-아세트산 완충제로부터 선택되고, 약학적 조성물은 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 약 4.5 내지 5.5, 가장 바람직하게는 약 5.0의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 약학적 조성물에서, 완충제는 4.8 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.0의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 완충제는 약 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 4.5 내지 5.5, 바람직하게는 약 4.6 내지 5.5, 바람직하게는 약 4.7 내지 5.5, 바람직하게는 약 4.8 내지 5.5, 4.9 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.2 내지 5.5, 또는 바람직하게는 약 5.3 내지 5.5, 가장 바람직하게는 5.0의 pH를 갖고, 비제한적인 예는 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.0, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4 및 약 5.5를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 히스티딘-아세트산 완충제는 10 mM 내지 60 mM의 농도를 갖고, 비제한적인 예는 10 mM 내지 30 mM, 10 mM 내지 40 mM, 및 20 mM 내지 50 mM을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 완충제는 약 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 30 mM의 농도를 가지며, 비제한적인 예는 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, 30 mM, 32 mM, 34 mM, 36 mM, 38 mM, 40 mM, 42 mM, 44 mM, 46 mM, 48 mM 및 50 mM을 포함하고, 가장 바람직하게는, 완충제는 약 20 mM 또는 50 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도를 갖고, 비제한적인 예는 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 및 그 사이의 임의의 범위를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 180 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약 150 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 이상, 바람직하게는 100 mg/mL 내지 150 mg/mL, 가장 바람직하게는 120 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 140 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 120 mg/mL의 농도를 갖고, 비제한적인 예는 102 mg/mL, 104 mg/mL, 106 mg/mL, 108 mg/mL, 110 mg/mL, 112 mg/mL, 114 mg/mL, 116 mg/mL, 118 mg/mL 및 120 mg/mL를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 점도 변형제를 추가로 포함하며, 점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, Arg-HCl, 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 MgCl₂, 히스티딘 및 아르기닌 하이드로클로라이드(Arg-HCl)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 점도 변형제를 포함한다. 일부 경우, 항체 조제물은 고농도의 항체로 인해 높은 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 아르기닌이다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 염 형태, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 히스티딘의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 아미노산, 예컨대 L-형태 아미노산, 예컨대 L-아르기닌, L-리신 또는 L-히스티딘이다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, Arg-HCl, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 MgCl₂, 히스티딘 및 Arg-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 5 mM 내지 약 220 mM의 농도를 갖는다. 비제한적인 예는 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 또는 220 mM, 및 그 사이의 임의의 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 10 mM 내지 약 220 mM의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 50 mM 내지 약 180 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 5 mM 내지 약 148 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 50 mM 내지 약 120 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 점도 변형제는 약 10 mM 내지 약 40 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 40 mPa.s 미만 또는 30 mPa.s 미만의 점도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 20 mPa.s 미만의 점도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 점도 변형제는 50 mM 내지 148 mM, 바람직하게는 85 mM 내지 120 mM의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 하기이다:

i) 5 mM 내지 220 mM 아르기닌 하이드로클로라이드;

ii) 5 mM 내지 100 mM 히스티딘; 또는

iii) 5 mM 내지 90 mM MgCl₂.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 하기이다:

i) 10 mM 내지 220 mM 아르기닌 하이드로클로라이드;

ii) 10 mM 내지 100 mM 히스티딘; 또는

iii) 10 mM 내지 90 mM MgCl₂.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 5 mM 내지 220 mM 아르기닌 하이드로클로라이드이고, 비제한적인 예는 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 또는 220 mM, 및 그 사이의 임의의 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 5 mM 내지 100 mM 히스티딘이고, 비제한적인 예는 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 또는 100 mM, 및 그 사이의 임의의 범위를 포함한다.

일부 구현예에서, 점도 변형제는 10 mM 내지 90 mM MgCl₂이고, 비제한적인 예는 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM 또는 90 mM, 및 그 사이의 임의의 범위를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도를 갖고, 점도 변형제는 MgCl₂, 히스티딘 및 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도를 가질 때, 점도 변형제는 50 mM 내지 200 mM MgCl₂, 히스티딘 및 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도를 가지며, 점도 변형제는 50 mM 내지 90 mM MgCl₂, 50 mM 내지 100 mM 히스티딘 및 10 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 50 mM 내지 180 mM, 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 120 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도를 갖고, 점도 변형제는 50 mM 내지 90 mM MgCl₂, 50 mM 내지 100 mM 히스티딘 및 50 mM 내지 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 140 mg/mL의 농도를 가지며, 점도 변형제는 5 mM 내지 50 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 및 MgCl₂로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 또는 MgCl₂이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 140 mg/mL의 농도를 갖고, 점도 변형제는 30 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 또는 MgCl₂이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 120 mg/mL의 농도를 가지며, 점도 변형제는 5 mM 내지 50 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 및 MgCl₂로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 또는 MgCl₂이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 점도 변형제는 50 mM 내지 90 mM MgCl₂, 85 mM 내지 100 mM 히스티딘 및 90 mM 내지 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 점도 변형제는 5 mM 내지 50 mM 히스티딘, 아르기닌 염산 및 MgCl₂로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 히스티딘, 아르기닌 염산 또는 MgCl₂이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 계면활성제는 0.1 mg/mL 내지 1.2 mg/mL, 바람직하게는 0.8 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 계면활성제는 약 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 바람직하게는 0.2 mg/mL 내지 0.8 mg/mL, 더 바람직하게는 0.4 mg/mL 내지 0.8 mg/mL의 농도를 가지며, 비제한적인 예는 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.45 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.55 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 1.0 mg/mL 및 그 사이의 임의의 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않고, 가장 바람직하게는 계면활성제는 0.8 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 약학적 조성물은

(a) 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-6.0; (c) 50 mM 내지 220 mM 점도 변형제; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하며, 점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, 아르기닌, 아르기닌 하이드로클로라이드, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 점도 변형제는 MgCl₂, 히스티딘 및 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 안정화제를 추가로 포함하며, 안정화제는 바람직하게는 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수크로스이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 안정화제는 20 mg/mL 내지 70 mg/mL, 바람직하게는 40 mg/mL 내지 60 mg/mL, 가장 바람직하게는 58 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 안정화제는 40 mg/mL 내지 70 mg/mL의 농도를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 약학적 조성물 내 당(sugar)은 약 50 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 바람직하게는 55 mg/mL 내지 60 mg/mL이고, 비제한적인 예는 50 mg/mL, 51 mg/mL, 52 mg/mL, 53 mg/mL, 54 mg/mL, 55 mg/mL, 56 mg/mL, 57 mg/mL, 58 mg/mL, 59 mg/mL 및 60 mg/mL를 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 150 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 80 mM 내지 148 mM, 또는 5 mM 내지 50 mM 점도 변형제; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 60 mg/mL 수크로스, 여기서 약학적 조성물은 20 mPa.s 미만의 점도를 가짐.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 150 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 80 mM 내지 148 mM 점도 변형제; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 히스티딘; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.0 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 50 mg/mL 내지 60 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은

(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 점도 변형제; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스;

또는

(a) 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 40 mM 내지 220 mM 점도 변형제; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80

을 포함하며; 점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, 아르기닌, 아르기닌 하이드로클로라이드, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 점도 변형제; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스, 여기서 점도 변형제는 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 또는 MgCl₂임; 또는

(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 40 mM 내지 90 mM MgCl₂; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 또는

(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 50 mM 내지 100 mM 히스티딘; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 또는

(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 50 mM 내지 200 mM 아르기닌 하이드로클로라이드; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 히스티딘; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 30 mM 히스티딘; (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 58 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 30 mM 히스티딘; (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 58 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 58 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 약 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 약 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 4.5-5.5; (c) 약 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 90 mM 내지 200 mM 아르기닌 하이드로클로라이드.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 약 150 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 내지 60 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은

(a) 100 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 내지 60 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 50 mg/mL 내지 60 mg/mL 수크로스를 포함하고; 바람직하게는, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0-5.5; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 58 mg/mL 수크로스.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다:

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아래 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(ii) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13으로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(iii) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 40으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(iv) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 8로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 40으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.

(v) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되거나 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2로 표시되거나 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;

(vi) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9로 표시되거나 SEQ ID NO: 9와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10으로 표시되거나 SEQ ID NO: 10과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;

(vii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 43 또는 47로 표시되거나 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 43 또는 47과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 37 또는 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 37 또는 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐; 또는

(viii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 31, 32 또는 33으로 표시되거나 SEQ ID NO: 31, 32 또는 33과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 34, 35 또는 36으로 표시되거나 SEQ ID NO: 34, 35 또는 36과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;

바람직하게는, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아래 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(IX) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되거나 SEQ ID NO: 43과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37로 표시되거나 SEQ ID NO: 37과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐; 또는

(X) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되거나 SEQ ID NO: 43과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐; 또는

(XI) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 47로 표시되거나 SEQ ID NO: 47과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시된 서열을 갖고, 이의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37로 표시된 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 κ 및 λ 사슬 또는 이의 변이체의 불변 영역을 포함하고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체, 예컨대 IgG4-S228P 또는 IgG4-234A/235A 돌연변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아래 제시된 중쇄 및 경쇄를 포함한다:

SEQ ID NO: 17로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 18로 표시된 경쇄; 또는

SEQ ID NO: 19로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 20으로 표시된 경쇄; 또는

SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 45로 표시된 경쇄; 또는

SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 46으로 표시된 경쇄; 또는

SEQ ID NO: 48로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 46으로 표시된 경쇄.

일부 구현예에서, 약학적 조성물 내 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 45로 표시된 경쇄를 포함한다.

본 출원은 또한, 항-IL-4R 항체에 관한 것이며, 이의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 47로 표시되거나 SEQ ID NO: 47과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.

본 출원은 또한, SEQ ID NO: 48로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 46으로 표시된 경쇄를 포함하는 항-IL-4R 항체에 관한 것이다.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-6.0; 및 (c) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; 및 (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5; 및 (c) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; 및 (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 6.0; 및 (c) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; 및 (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.5; 및 (c) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100-150 mg/mL hu25G7-A 항체; 및 (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0-5.5.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 122 mM NaCl.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 85 mM MgCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 148 mM CaCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 124 mM KCl.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 86 mM CH₃COONa.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 96 mM Na₂SO₄.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 113 mM NaI.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 74 mM NaF.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 112 mM NaSCN.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 120 mM Arg-HCl.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 118 mM 리신.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 93 mM 히스티딘.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 207 mM 프롤린.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 85 mM MgCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 148 mM CaCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 93 mM 히스티딘.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 50 mM MgCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 90 mM MgCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 90 mM CaCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 90 mM 히스티딘.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 120 mM Arg-HCl.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 90 mM MgCl₂; 및 (d) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 90 mM MgCl₂; 및 (d) 1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 122 mM NaCl; 및 (d) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 122 mM NaCl; 및 (d) 1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 90 mM 히스티딘; 및 (d) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 90 mM 히스티딘; 및 (d) 1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 120 mM Arg-HCl; 및 (d) 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 120 mM Arg-HCl; 및 (d) 1 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 165 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 약 50 mM 내지 90 mM MgCl₂.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 165 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 약 50 mM 내지 90 mM 히스티딘.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 165 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; 및 (c) 약 90 mM 내지 200 mM Arg-HCl.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 120 mM Arg-HCl; 및 (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.8; (c) 87 mM 히스티딘; 및 (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 100 mM 히스티딘; 및 (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 30 mM 히스티딘; (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 41.8 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 30 mM 히스티딘; (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.2; (c) 30 mM 히스티딘; (d) 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 50 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 120 mg/mL 내지 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 30 mM 내지 100 mM 히스티딘; (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 41.8 mg/mL 내지 58 m/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드; 및 (d) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.8-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 100 mg/mL 내지 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 132 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.5; (c) 약 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 4.5; (c) 약 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 140 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 4.5; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 4.5; (c) 약 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5; (c) 약 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 100 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.5; (c) 약 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.5; (c) 약 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 약 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스.

본 개시내용은 또한, 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 보존 용액(stock solution)을 완충제-교환하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 또한, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제형을 제공하며, 동결건조된 제형은 상기 기재된 약학적 조성물을 동결건조함으로써 수득된다.

본 개시내용은 또한, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제형을 제공하며, 동결건조된 제형은 상기 기재된 약학적 조성물을 희석시킨 다음 동결건조함으로써 수득된다.

본 개시내용은 또한, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제형을 제공하며, 동결건조된 제형은 상기 기재된 약학적 조성물을 1배, 2배 또는 3배 희석시킨 다음 동결건조함으로써 수득된다.

본 개시내용은 또한, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재구성된 용액을 제공하며, 재구성된 용액은 상기 기재된 동결건조된 제형을 재구성함으로써 수득된다.

일부 구현예에서, 재구성된 용액은 하기 성분을 포함한다:

(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 50 mg/mL 수크로스.

일 구현예에서, 재구성된 용액은 (a) 약 120 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 약 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 58 mg/mL 수크로스를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 5.3이다.

일 구현예에서, 재구성된 용액은 (a) 약 150 mg/mL hu25G7-A 항체; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 5.3이다.

본 개시내용은 또한, 상기 기재된 약학적 조성물 또는 동결건조된 제형 또는 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는 제조 물품(article of manufacture)을 제공한다.

본 개시내용은 또한, 면역 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 치료적 유효량의 상기 기재된 약학적 조성물, 동결건조된 제형 또는 재구성된 용액을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 면역 질환은 IL-4R-매개 질환 또는 장애이다.

일부 구현예에서, 면역 질환 또는 장애는 천식, 비용종(nasal polyps), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 알레르기성 피부 장애, 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 관절염(arthritis), 염증성 질환, 알레르기 반응, 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바렛 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵(tuberculosis), 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 질환 또는 장애는 천식 또는 알레르기성 피부 장애이다.

일부 구현예에서, 면역 질환 또는 장애는 천식이다.

다른 구현예에서, 면역 질환 또는 장애는 알레르기성 피부 장애이다.

본 개시내용은 또한, 면역 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서 상기 기재된 약학적 조성물, 동결건조된 제형, 동결건조된 제형의 재구성된 용액, 또는 제조 물품의 용도를 제공하며, 바람직하게는, 면역 질환 또는 장애는 IL-4R-매개 질환 또는 장애이다.

본 개시내용의 약학적 조성물, 동결건조된 제형, 동결건조된 제형의 재구성된 용액, 또는 제조 물품은 약제로서, 바람직하게는 면역 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제로서, 더 바람직하게는 IL-4R-매개 질환 또는 장애의 치료용 약제로서 사용될 수 있다.

본 개시내용에서 약학적 조성물, 동결건조된 제형, 동결건조된 제형의 재구성된 용액, 또는 제조 물품은 약제로서, 바람직하게는 면역 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제로서 사용될 수 있으며, 더 바람직하게는, 면역 질환 또는 장애는 천식, 비용종, 만성 부비동염, 알레르기성 피부 장애, 호산구성 식도염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알레르기성 비염, 관절염, 염증성 질환, 알레르기 반응, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 바렛 식도, 자가면역 포도막염, 결핵, 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 질환 또는 장애는 천식 또는 알레르기성 피부 장애이다.

본 출원에서, 히스티딘은 완충제와 점도 변형제 둘 다로서 작용할 수 있으며, 따라서 약학적 조성물 내 히스티딘의 최종 함량은 완충제 내 히스티딘의 함량과 점도를 감소시키기 위해 추가로 첨가되는 히스티딘의 함량의 합계이다. 예를 들어, 90 mM 히스티딘이 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제 pH 5.0에 이의 점도-강하 효과를 증가시키기 위해 추가로 첨가된다면, 약학적 조성물 내 히스티딘의 최종 농도는 110 mM이고, 약학적 조성물의 pH는 약 5.0이다.

도 1은 마우스에서 피부염에 미치는 항-IL-4R 항체의 효과에 대한 실험 결과를 도시한다. 마우스 피부염 모델에서, 아세톤으로 감작시킨 후, 인간화 항체 hu25G7-A와 hu25G7-B 및 양성 기준 항체 두필루맙을 피하 투여하였다: 투여를 1주 2회 수행하였고, 마우스의 귀 두께를 제27일에 측정하였다. 결과는, 대조군과 비교하여, hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙이 모두 마우스의 귀 두께를 감소시키는 데 효과적이었고, hu25G7-B는 두필루맙보다 더 양호한 효과를 보여주었음을 보여준다.
도 2는 제형 화학식의 적합(fitting) 결과를 도시한다.
도 3은 제형 안정성의 변화의 등고선도(contour diagram)를 도시하며, 회색 영역은 한계를 넘어서고 있음을 나타내고 백색 영역은 한계 내에 있음을 나타낸다.

용어

본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 일부 기술적 및 과학적 용어는 아래에서 구체적으로 정의된다. 본원 어디에서나 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 분야의 당업계에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.

출원 PCT/CN2019/102169는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

"완충제"는 이의 산-염기 접합체 구성요소의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 완충제를 지칭한다. pH를 적절한 범위에서 제어하는 완충제의 예는 아세테이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘 염, 옥살레이트, 락테이트, 포스페이트, 시트레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글리실글리신 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.

"히스티딘 염 완충제"는 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘 염 완충제의 예는 히스티딘-하이드로클로라이드 완충제, 히스티딘-아세테이트 완충제, 히스티딘-포스페이트 완충제, 히스티딘-설페이트 완충제 등을 포함하고, 히스티딘-아세테이트 완충제가 바람직하다. 히스티딘-아세테이트 완충제는 히스티딘과 아세트산으로 제조되고, 히스티딘-아세트산(His-AA) 완충제로도 알려져 있다.

"시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 포함하는 완충제이다. 시트레이트 완충제의 예는 시트르산-나트륨 시트레이트 완충제, 시트르산-칼륨 시트레이트 완충제, 시트르산-칼슘 시트레이트 완충제, 시트르산-마그네슘 시트레이트 완충제 등을 포함한다. 바람직한 시트레이트 완충제는 시트르산-나트륨 시트레이트 완충제이다.

"숙시네이트 완충제"는 숙시네이트 이온을 포함하는 완충제이다. 숙시네이트 완충제의 예는 숙신산-나트륨 숙시네이트 완충제, 숙신산-칼륨 숙시네이트 완충제, 숙신산-칼슘 숙시네이트 완충제 등을 포함한다. 바람직한 숙시네이트 완충제는 숙신산-나트륨 숙시네이트 완충제이다.

"포스페이트 완충제"는 포스페이트 이온을 포함하는 완충제이다. 포스페이트 완충제의 예는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-나트륨 디하이드로겐 포스페이트 완충제, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-칼륨 디하이드로겐 포스페이트 완충제, 디소듐 하이드로겐 포스페이트-시트르산 완충제 등을 포함한다. 바람직한 포스페이트 완충제는 디소듐 하이드로겐 포스페이트-나트륨 디하이드로겐 포스페이트 완충제이다.

"아세테이트 완충제"는 아세테이트 이온을 포함하는 완충제이다. 아세테이트 완충제의 예는 아세트산-나트륨 아세테이트 완충제, 아세트산 히스티딘 염 완충제, 아세트산-칼륨 아세테이트 완충제, 아세트산-칼슘 아세테이트 완충제, 아세트산-마그네슘 아세테이트 완충제 등을 포함한다. 바람직한 아세테이트 완충제는 아세트산-나트륨 아세테이트 완충제이다.

"약학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 다른 화학적 구성요소, 예를 들어, 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물의 목적은 항체의 활성 성분의 안정성을 유지하고 유기체에의 투여를 촉진하는 것이며, 이는 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 활성을 발휘한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "약학적 조성물" 및 "제형"은 상호 배제적이지 않다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 약학적 조성물의 용액 형태의 용매는 수용액이다.

"교환"은 항체 단백질을 용해시키는 용매 시스템의 교환을 지칭한다. 예를 들어, 항체 단백질을 포함하는 고장성(hypertonic) 용매 시스템 또는 고염(high-salt)은 물리적 작업에 의해 안정한 제형의 완충제 시스템으로 교환되어, 항체 단백질은 안정한 제형에 존재한다. 물리적 작업은 한외여과(ultrafiltration), 투석 또는 원심분리 후 재구성을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"동결건조된 제형"은 액체 또는 용액 형태의 약학적 조성물 또는 제형의 진공 동결건조에 의해 수득되는 제형 또는 약학적 조성물을 지칭한다.

본 개시내용의 "당류(saccharide)"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당 알코올, 환원당, 비-환원당 등을 포함한 일반적인 조성물 (CH₂O)_n 및 이의 유도체를 포함한다. 이는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스(melezitose), 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스(stachyose), 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 당류는 비-환원성 이당류이며, 더 바람직한 당류는 트레할로스 또는 수크로스이고, 가장 바람직한 당류는 수크로스이다.

본 개시내용의 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리톤(Triton), 나트륨 도데실 설포네이트, 나트륨 라우릴 설포네이트, 나트륨 옥틸 글리코사이드, 라우릴-/미리스틸-/리놀레일-/스테아릴-설포베타인, 라우릴-/미리스틸-/리놀레일-/스테아릴-사르코신, 리놀레일-/미리스틸-/세틸-베타인, 라우라미도 프로필-/코카라미드 프로필-/리놀레인아미드 프로필-/미리스틸아미드 프로필-/팔미트아미드 프로필-/이소스테아르아미드 프로필-베타인, 미리스틸아미드 프로필-/팔미트아미드 프로필-/이소스테아르아미드 프로필-디메틸아민, 나트륨 메틸 코코일, 나트륨 메틸 올레일 타우레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이고, 더 바람직한 것은 폴리소르베이트 80이다.

용어 "점도"는 "동점도(kinematic viscosity)" 또는 "절대 점도"일 수 있다. "동점도"는 중력의 영향 하에 유동하는 유체의 저항의 측정치이다. 동일한 부피의 2개 유체를 동일한 모세관 점도계에 넣고 중력에 의해 유동시킬 때, 점성 유체는 모세관을 통해 유동하는 데 있어서 점성이 낮은 유체보다 더 오래 소요된다. 예를 들어, 하나의 유체가 이의 유동을 완료하는 데 200초가 소요되고 또 다른 유체가 400초 소요된다면, 제2 유체의 동점도는 제1 유체의 동점도의 2배이다. 이따금 역학(dynamic) 또는 단순 점도(simple viscosity)라고 하는 "절대 점도"는 동점도와 유체 밀도의 결과물(절대 점도 = 동점도 x 밀도)이다. 동점도는 L²/T로 표현되는데, L은 길이이고 T는 시간이다. 통상 동점도는 센티스토크(cSt: centistoke)로 표현된다. 동점도의 SI 단위는 mm²/s이고, 이는 1 cSt이다. 절대 점도는 센티푸아즈(cP: centipoise)로 표현된다. 절대 점도의 SI 단위는 밀리파스칼-초(mPa-s: milliPascal-second)이며, 1 cP = 1 mPa-s이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 수치가 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있고 수치는 그 값이 측정되거나 결정되는 방법(즉, 측정 시스템의 한계)에 부분적으로 의존함을 의미한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 이후에 지시된 특정 수치의 ±20%, ±15%, ±10% 또는 ±5%의 범위를 의미할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 대해, 용어는 수치의 최대 5배 또는 최대 자릿수를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 제공될 때, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 해당하는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.

본원에 기재된 약학적 조성물은 안정한 효과를 달성할 수 있다: 그 안의 항체는 저장 후 이의 물리적 안정성, 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 저장 후 이의 물리적 및 화학적 안정성과 이의 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 저장 기간은 일반적으로 약학적 조성물의 예정된 저장 수명에 기초하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위해 현재 이용 가능한 여러 가지 분석 기법이 존재하고, 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 저장한 후의 안정성이 측정될 수 있다.

안정한 약학적 항체 제형은 하기 조건 하에 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않는 것이다: 냉장 온도(2-8℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더 바람직하게는 1년, 심지어 더 바람직하게는 최대 2년 동안 저장됨. 이에 더하여, 안정한 액체 제형은 25℃를 포함한 온도에서 1개월, 3개월 및 6개월을 포함한 기간 동안 저장 후 바람직한 특질을 나타내는 액체 제형을 포함한다. 안정성에 대한 전형적인 허용 가능한 기준은 하기와 같다: 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 항체 단량체가 SEC-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 분해된다. 약학적 항체 제형은 시각적 분석에 의해 담황색, 거의 무색 및 투명한 액체이거나, 무색, 또는 투명 내지 약간 유백광이다. 제형의 농도, pH 및 삼투질농도(osmolality)는 ±10% 이하의 변화를 갖는다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 저하가 관찰된다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집이 형성된다.

항체는 이것이 색상 및/또는 명료성의 시각적 검사 시 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정되는 바와 같이, 응집, 침전 및/또는 변성에서 어떠한 유의한 증가도 나타내지 않는다면 약학적 제형에서 "이의 물리적 안정성을 보유한다". 단백질 형태(conformation)의 변화는 형광 분광법(단백질 3차 구조를 결정함)에 의해 그리고 FTIR 분광법(단백질 2차 구조를 결정함)에 의해 평가될 수 있다.

항체는 이것이 어떠한 유의한 화학적 변화도 나타내지 않는다면 약학적 제형에서 "이의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변화된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 단백질의 화학적 구조를 종종 변화시키는 분해 과정은 가수분해 또는 클리핑(clipping)(크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법에 의해 평가됨), 산화(질량 분광법 또는 MALDI/TOF/MS와 연계된 펩타이드 맵핑과 같은 방법에 의해 평가됨), 탈아미드화(deamidation)(이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 집속법(capillary isoelectric focusing), 펩타이드 맵핑, 및 이소아스파르트산 측정과 같은 방법에 의해 평가됨), 및 이성질체화(이소아스파르트산 함량의 측정, 펩타이드 맵핑 등에 의해 평가됨)를 포함한다.

항체는 주어진 시간에서 이러한 항체의 생물학적 활성이, 약학적 제형이 제조되었을 때 나타난 생물학적 활성의 예정된 범위 내에 있다면 약학적 제형에서 "이의 생물학적 활성을 보유한다". 항체의 생물학적 활성은 예를 들어, 항원-결합 검정에 의해 결정될 수 있다.

"인간 IL-4R"(hIL-4R)은 인터루킨-4(IL-4) 또는 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 인간 사이토카인 수용체를 지칭한다.

본원에 사용되는 아미노산에 대한 3-글자 또는 1-글자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기재되어 있다.

용어 "항체(Ab)"는 특정 항원(또는 이의 에피토프, 예를 들어, IL-4R 항원 또는 이의 에피토프)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 영역(도메인)인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 영역(도메인, CL)을 포함한다. VH 영역 및 VL 영역은 초가변 영역으로 더 세분될 수 있으며, 이는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하고, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 개재된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

항-IL-4R 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 천연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 항체는 상이한 하위부류, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위부류), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.

항원-결합 단편의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드)을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위(minimal recognition unit), 또는 구속형(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식됨 항체, 이중체(diabody), 삼중체(triabody), 사중체(tetrabody), 미니체(minibody), 나노체(nanobody)(예컨대 1가 나노체 및 2가 나노체), 소형 모듈형 면역약제(SMIP: small modular immunopharmaceuticals), 및 샤크 가변(shark variable) IgNAR 영역이 또한 본원에 사용되는 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다.

항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 영역을 포함할 것이다. 가변 영역은 임의의 크기의 영역 또는 아미노산 조성물일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열의 프레임에 존재하거나 이에 인접한 CDR을 포함할 것이다. VH 영역 및 VL 영역을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 영역 및 VL 영역은 임의의 적합한 배열에서 서로에 비해 놓일 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성일 수 있고 VH-VL 또는 VL-VH 이량체를 함유한다.

소정의 구현예에서, 항원-결합 단편의 가변 영역 및 불변 영역의 임의의 배치에서, 가변 영역 및 불변 영역은 서로 직접 연결될 수 있거나 전체 또는 부분 힌지(hinge) 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자 내 인접한 가변 영역 및/또는 불변 영역 사이에 가요성 또는 반가요성(semi-flexible) 연결부(linkage)를 초래하는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 항원-결합 단편은 서로 비공유적으로 연결되고/되거나 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 영역에 연결된(예를 들어, 이황화 결합에 의해) 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 동종이량체(homo-dimer) 또는 이종이량체(hetero-dimer)를 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 "뮤린 항체"는 당업계의 지식 및 숙련에 따라 제조된 마우스-유래 또는 래트-유래 단일클론 항체이다. 제조 동안, 시험 대상체에게 항원이 주사된 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 주사의 시험 대상체가 마우스일 때, 생성되는 항체는 마우스-유래 항체이고, 주사의 시험 대상체가 래트일 때, 생성되는 항체는 래트-유래 항체이다.

"키메라 항체"는 제1 종(예컨대 마우스)의 항체의 가변 영역을 제2 종(예컨대 인간)의 항체의 불변 영역과 융합함으로써 형성되는 항체이다. 키메라 항체는 우선 제1 종의 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립한 다음, 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝하고, 필요하다면 제2 종의 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 제1 종의 가변 영역 유전자와 제2 종의 불변 영역 유전자를 연결하여 키메라 유전자를 형성하고, 키메라 유전자를 발현 벡터 내로 삽입하고, 마지막으로 진핵생물 시스템 또는 원핵생물 시스템에서 키메라 항체 분자를 발현시킴으로써 확립된다. 본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ 사슬과 λ 사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 키메라 항체의 항체 중쇄는 아미노산 돌연변이(예를 들어, YTE 돌연변이, 역돌연변이, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 또는 S228P 돌연변이)를 사용하여 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역, 또는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 변이체를 추가로 포함한다.

CDR-이식된 항체를 포함한 용어 "인간화 항체"는 동물로부터 유래된 항체(예를 들어, 뮤린 항체)의 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역의 프레임워크 영역 내로 이식함으로써 생성되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다량의 이종성 단백질 성분을 갖고 있기 때문에 키메라 항체에 의해 유도되는 이종성 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개적인 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(http://www.vbase2.org/로부터 입수 가능함), 뿐만 아니라 문헌[Kabat, E. A. 등, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed]에서 찾을 수 있다. 면역원성의 저하에 의해 야기되는 활성의 저하를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역 내 FR 서열은 소량의 역돌연변이를 받아 활성을 유지할 수 있다. 본 개시내용의 인간화 항체는 또한, 파지 디스플레이에 의한 CDR 친화도 성숙화를 추가로 받은 인간화 항체를 포함한다.

항원의 접촉 잔기때문에, CDR의 이식은 항원과 접촉 시 프레임워크 잔기로 인해 항원에 대한 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 감소된 친화도를 초래할 수 있다. 이러한 상호작용은 체세포의 과돌연변이의 결과일 수 있다. 그러므로, 이러한 공여자 프레임워크 아미노산을 인간화 항체의 프레임워크에 이식하는 것이 여전히 필요할 수 있다. 항원 결합에 관여하는 비-인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터의 아미노산 잔기는 동물 단일클론 항체의 가변 영역의 서열 및 구조를 검사함으로써 식별될 수 있다. 생식계열과 상이한 CDR 공여자 프레임워크 내 잔기는 관련이 있는 것으로 여겨질 수 있다. 가장 가까운 생식계열이 결정될 수 없다면, 서열은 높은 유사성 백분율을 갖는 동물 항체 서열의 공통 서열(consensus sequence) 또는 하위부류의 공통 서열과 비교될 수 있다. 드문(rare) 프레임워크 잔기는 체세포 과돌연변이의 결과인 것으로 생각되며, 따라서 결합에서 중요한 역할을 한다.

본 개시내용의 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 뮤린 κ 및 λ 사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있거나, 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.

인간 항체 중쇄 불변 영역 및 인간 항체 경쇄 불변 영역의 "종래의(conventional) 변이체"는 선행 기술에 개시되었고 항체 가변 영역의 구조 및 기능을 변화시키지 않는, 인간으로부터 유래된 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 변이체를 지칭한다. 예시적인 변이체는 중쇄 불변 영역에 부위-안내 변형(site-directed modification) 및 아미노산 치환을 갖는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 변이체를 포함한다. 특정 치환은 예를 들어, YTE 돌연변이, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 또는 S228P 돌연변이, 또는 당업계에 알려진 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조(따라서 항체 중쇄는 노브-Fc와 홀-Fc의 조합을 가짐)를 수득하기 위한 돌연변이이다. 이러한 돌연변이는 새로운 특성을 갖지만 항체 가변 영역의 기능을 변화시키지 않는 항체를 만드는 것으로 확인되었다.

"인간 항체" 및 "인간-유래 항체"는 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 인간으로부터 유래된 항체 또는 항원 자극에 반응하여 특정 인간 항체를 생성하도록 "조작된" 유전자이식(transgenic) 유기체로부터 수득된 항체일 수 있고, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 소정의 기법에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위의 요소는 세포주(cell strain) 내로 도입되고, 이 세포주 내에서 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위는 표적화된 방해를 받는다. 유전자이식 유기체는 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 유기체는 인간 항체-분비형 하이브리도마를 생성하는 데 사용될 수 있다. 인간 항체는 또한, 중쇄 및 경쇄가 하나 이상의 인간 DNA 공급원으로부터 유래되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 항체일 수 있다. 완전 인간 항체는 또한, 유전자 또는 염색체 형질주입 방법 및 파지 디스플레이 기법에 의해, 또는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 작제될 수 있으며, 이는 모두 당업계에 알려져 있다.

"단일클론 항체"는 가능한 변이체 항체(예를 들어, 천연 발생 돌연변이 또는 단일클론 항체 제형의 생성 동안 발생하는 돌연변이를 함유하며, 이러한 변이체는 소량으로 존재함)를 제외하고는, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 동일한 에피토프를 인식하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 단일클론 항체 조제물(제형)의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 그러므로, 수식어 "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자 좌위 중 모두 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 여러 가지 기법에 의해 제조될 수 있으며, 단일클론 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.

더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 인코딩된다 하더라도, 이는 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있으며, 따라서 이는 VL 영역 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)라고 함; 예를 들어, 문헌[Bird 등, (1988) Science, 242: 423-426]; 및 문헌[Huston 등, (1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85: 5879-5883] 참조). 이러한 단일-사슬 항체는 또한, 용어 항체의 "항원-결합 단편"에 포함되고자 한다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 종래의 기법을 사용하여 수득되고, 무손상(intact) 항체와 동일한 방식으로 활용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 모이어티는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 또는 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다.

항원-결합 단편은 또한, 탠덤(tandem) Fv 단편(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 사슬 분자 내로 혼입될 수 있으며, 이는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 항원-결합 영역 쌍을 형성한다(문헌[Zapata 등, 1995 Protein Eng. 8(10): 1057-1062]; 및 미국 특허 제US5641870호).

Fab는 약 50,000 Da의 분자량을 가지며, 항원-결합 활성을 갖고, IgG 항체를 프로테아제 파파인(이는 H 사슬의 224번 위치에서 아미노산 잔기를 절단함)으로 처리함으로써 수득되는 항체 단편이며, 여기서 H 사슬의 N-말단 면(side) 중 약 절반과 전체 L 사슬은 이황화 결합에 의해 함께 접합된다.

F(ab')₂는 약 100,000 Da의 분자량을 가지며, 항원-결합 활성을 갖고, 힌지 위치에서 연결된 2개의 Fab 영역을 포함하는 항체 단편이며, IgG 힌지 영역 내 2개의 이황화 결합 아래 부분을 펩사제(pepsase)로 분해함으로써 수득된다.

Fab'는 약 50,000 Da의 분자량을 가지며 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이고, 상기 기재된 F(ab')₂의 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단함으로써 수득된다. Fab'는 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 F(ab')₂를 환원제,예컨대 디티오트레이톨로 처리함으로써 생성될 수 있다.

이에 더하여, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 인코딩하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하고 벡터를 진핵생물 또는 원핵생물 내로 도입함으로써 발현될 수 있다.

용어 "단일 사슬 항체", "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 일반식을 가질 수 있다: NH₂-VL-링커-VH-COOH 또는 NH₂-VH-링커-VL-COOH. 선행 기술에서 적합한 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예를 들어, 1 내지 4개(1, 2, 3 또는 4개 포함)의 반복된 변이체로 구성된다(문헌[Holliger 등 (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]). 본 개시내용에 사용될 수 있는 링커는 문헌[Alfthan 등 (1995), Protein Eng. 8:725-731]; 문헌[Choi 등 (2001), Eur. J. Immuno. 31:94-106]; 문헌[Hu 등 (1996), Cancer Res. 56:3055-3061]; 문헌[Kipriyanov 등 (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56]; 및 문헌[Roovers 등 (2001), Cancer Immunother.50:51-59]에 기재되어 있다.

이중체는 scFv가 이량체화되는 항체 단편이고, 2가 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가 항원-결합 활성에서, 2개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다.

dsFv는 각각의 VH 및 VL 내 하나의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통해 시스테인 잔기로 치환되는 폴리펩타이드를 연결함으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 항체의 3-차원 구조의 예측에 기초하여 기지의 방법(문헌[Protein Engineering, 7:697 (1994)])에 따라 선택될 수 있다.

본 개시내용의 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 하기 단계에 의해 생성될 수 있다: 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 본 개시내용의 단일클론 항체의 VH 및/또는 VL을 인코딩하는 cDNA 및 다른 원하는 도메인을 인코딩하는 cDNA를 수득하는 단계, 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA를 작제하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하는 단계, 그 후에 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 항원-결합 단편을 발현시키는 단계.

"Fc 영역"은 네이티브(native) 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 위치의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 이의 카르복실-말단까지 신장(stretch)되는 것으로 한정된다. Fc 영역 내 잔기의 숫자매김은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 지수의 숫자매김이다. 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]. 면역글로불린의 Fc 영역은 전형적으로 2개의 불변 영역 도메인 CH2 및 CH3을 갖는다.

용어 "아미노산 차이" 또는 "아미노산 돌연변이"는 원래의 단백질 또는 폴리펩타이드에 기초하여 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환의 발생을 포함한, 원래의 단백질 또는 폴리펩타이드와 비교하여 변이체 단백질 또는 폴리펩타이드 내 아미노산 변화 또는 돌연변이의 존재를 지칭한다.

항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄(VL)의 가변 영역 또는 항체 중쇄(VH)의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려져 있는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 각각의 사슬 내 CDR은 FR에 의해 함께 그리고 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 긴밀하게 고정되고, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기법이 존재한다: (1) 종간(cross-species) 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(문헌[Al-Lazikani 등, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)]). 본원에 사용되는 바와 같이, CDR은 어느 하나의 접근법에 의해 또는 접근법 둘 다의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.

용어 "항체 프레임워크" 또는 "FR"은 가변 도메인 VL 또는 VH의 일부를 지칭하며, 이는 가변 도메인의 항원-결합 루프(CDR)에 대한 프레임워크로서 역할을 한다. 이는 본질적으로 CDR이 없는 가변 도메인이다.

용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)이 존재한다. CDR의 아미노산 서열 경계는 "카바트" 숫자매김 체계(문헌[Kabat 등 (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] 참조). "초티아(Chothia)" 숫자매김 체계(문헌[Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001] 참조) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 숫자매김 체계(문헌[Lefranc, M.P. 등, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)] 참조)를 포함하여 임의의 여러 가지 잘 알려진 체계를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 형식에 대해, 카바트 체계에 따르면, 중쇄 가변 도메인(VH) 내 CDR 아미노산 잔기는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로서 숫자매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내 CDR 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로서 숫자매겨진다. 초티아 체계에 따르면, VH 내 CDR 아미노산은 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)로서 숫자매겨지고; VL 내 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로서 숫자매겨진다. 카바트 체계와 초티아 체계 둘 다의 조합에 의한 CDR 정의에 따르면, CDR은 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3) 및 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 이루어진다. IMGT 체계에 따르면, VH 내 CDR 아미노산 잔기는 대체로 27-38(CDR1), 56-65(CDR2) 및 105-117(CDR3)로 숫자매겨지고, VL 내 CDR 아미노산 잔기는 대체로 27-38(CDR1), 56-65(CDR2) 및 105-117(CDR3)로 숫자매겨진다. IMGT 체계에 따르면, 항체의 CDR은 프로그램 IMGT/DomainGap Align을 사용하여 결정될 수 있다.

"항체 불변 영역 도메인"은 상이한 부류의 항체로부터 유래되는 CL 도메인 및 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함한, 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역으로부터 유래되는 도메인을 지칭한다.

"에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적(contiguous) 또는 불연속적 아미노산을 독특한 공간 배치에서 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G.E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.

용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "~에 선택적으로 결합하다" 및 "~에 특이적으로 결합하다"는 예정된 항원 상의 에피토프에의 항체의 결합을 지칭한다.

용어 "친화도"는 단일 에피토프에서 항원과 항체 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 아미노산 부위에서 약한 비공유 힘을 통해 항원과 상호작용한다; 상호작용이 많을수록, 친화도가 강해진다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, Fab 단편)에 대한 "높은 친화도"는 1E^-9 M 이하의 K_D(예를 들어, 1E^-10 M 이하의 K_D, 1E^-11 M 이하의 K_D, 1E^-12 M 이하의 K_D, 1E^-13 M 이하의 K_D 또는 1E^-14 M 이하의 K_D)를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다.

용어 "KD" 또는 "K_D"는 특이적인 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 항체는 예를 들어, BIACORE 장비에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기법을 사용하여 결정되는 바와 같이, 약 1E^-8 M 미만(예를 들어, 약 1E^-9 M 미만, 1E^-10 M 미만 또는 1E^-11 M 미만 또는 그 미만)의 해리 평형 상수(KD)로 항원에 결합한다. KD 값이 작을수록, 친화도는 커진다.

용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 분자 또는 RNA 분자, 예를 들어, 이중-가닥 DNA 또는 mRNA일 수 있다. 핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 "작동 가능하게 연결된"다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.

용어 "벡터"는 관심의 하나 이상의 유전자 또는 서열을 전달하고 바람직하게는 이를 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 나상(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 소정의 진핵생물 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

항체 및 항원-결합 단편을 생성하고 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[chapters 5-8 and 15 of Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]에 기재된 것이다. 예를 들어, 마우스는 항원 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 수득된 항체는 재생되고 정제될 수 있고, 아미노산 시퀀싱은 종래의 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 항원-결합 단편은 마찬가지로, 종래의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 추가 인간 FR을 비-인간 CDR에 함유하도록 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 MOE 소프트웨어를 이용하여 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스를 정렬시킴으로써 수득되거나, 문헌[Immunoglobulin Journal, 2001ISBN012441351]로부터 수득될 수 있다.

용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환을 받기 쉬운 박테리아는 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과(family)의 구성원, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella)의 균주; 바실라세애(Bacillaceae) 과의 구성원, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모콕커스(Pneumococcus); 스트렙토콕커스(Streptococcus) 및 해모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(차이니즈 햄스터 난소 세포주), HEK293 세포(비제한적인 예는 HEK293E 세포를 포함함) 및 NS0 세포를 포함한다.

조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 종래의 방법을 사용하여 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA 서열은 클로닝되고 GS 발현 벡터 내로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포 내로 안정하게 형질주입될 수 있다. 선택적인 선행 기술로서, 포유류 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보조된 N-말단 부위에서 항체의 글리코실화를 초래할 수 있다. 안정한 클론은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 의해 수득된다. 양성 클론은 생물반응기의 무혈청 배지에서 확장되어 항체를 생성한다. 분비된 항체를 갖는 배양물은 종래의 기법을 사용하여, 예를 들어, 조정된 완충제를 함유하는 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 FF 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 비-특이적으로 결합된 분획은 세척되어 나간다. 결합된 항체는 pH 구배 방법을 사용하여 용리되고, 항체 단편은 SDS-PAGE를 사용하여 검출되고 수집된다. 항체는 종래의 방법을 사용하여 여과되고 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체는 또한, 종래의 방법, 예컨대 분자체 및 이온 교환을 사용하여 제거될 수 있다. 생성된 생성물은 예를 들어, -70℃에서 즉시 냉동되거나, 동결건조될 필요가 있다.

"투여하다", "투여", "주는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 외인성 약물, 치료제, 진단제, 조성물 또는 수동 작업(예를 들어, 실시예에서 "안락사")을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 제공하는 접촉을 지칭한다. "주는" 및 "치료하는"은 예를 들어, 치료적, 약동학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 처리는 시약을 세포와 접촉시키는 것 및 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉된다. "주는" 및 "치료하는"은 또한, 예를 들어, 세포를 시약, 진단 결합 조성물에 의해 또는 시험관내에서 그리고 생체외에서 또 다른 세포에 의해 처리하는 것을 지칭한다. "치료하는"은 인간, 수의학 또는 연구 대상체에게 적용될 때, 치료적 치료, 방지적 또는 예방적 조치, 및 연구 및 진단 적용을 지칭한다.

"치료하는" 및 "치료"는 치료제, 예컨대 본 개시내용의 실시예의 임의의 하나의 화합물을 포함하는 조성물을, 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 알려진 질환의 하나 이상의 증상을 갖는(또는 갖는 것으로 의심되거나 갖기 쉬운) 환자(또는 대상체)에게 내부적으로 또는 외부적으로 투여하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 치료제는 치료되는 환자(또는 대상체) 또는 집단에서 질환의 하나 이상의 증상을 경감시키기에 효과적인 양으로 투여되어, 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상의 진행을 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도까지 저해한다. 질환의 임의의 특정 증상을 경감시키기에 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"으로도 지칭됨)은 질환 상태, 환자(또는 대상체)의 연령 및 체중, 및 환자(또는 대상체)에서 원하는 치료 효과를 발휘하는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 질환의 증상이 경감되었는지의 여부는 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 다른 의료 전문가에 의해 보편적으로 사용되는 임의의 임상적 시험 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 개시내용(예를 들어, 치료 방법 또는 생성물)의 구현예가 질환의 모든 표적 증상을 경감시키는 데 효과적이지 않을 수 있더라도, 이는 당업계에 알려진 임의의 통계학적 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정(Student t-test), 카이-제곱 검정(chi-square test), 만 및 휘트니 U 검정(Mann and Whitney's U test), 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)(H 검정), 존크히어리-테릅스트라 검정(Jonckheere-Terpstra) 및 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)에 따라 결정되는 바와 같이, 통계학적으로 유의한 수의 환자(또는 대상체)에서 질환의 표적 증상을 감소시켜야 한다.

"아미노산 보존적 변형" 또는 "아미노산 보존적 치환"은 단백질 또는 폴리펩타이드 내 아미노산이 유사한 특징(예컨대 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 형태 및 강성도(rigidity))을 갖는 다른 아미노산에 의해 치환되어, 변화가 빈번하게는 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 또는 다른 필요한 특징(예컨대 항원에의 친화도 및/또는 특이성)을 변경시키지 않으면서 수행될 수 있음을 의미한다. 당업자는, 일반적으로 폴리펩타이드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않음을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson 등 (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 이에 더하여, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해하는 경향이 덜하다.

"IL-4R에 결합하다"는 인간 IL-4R과 상호작용하는 능력을 지칭한다. 본원에서 용어 "항원-결합 부위"는 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 인식되는 3-차원 공간적 부위를 지칭한다.

"교차-반응하다"는 본원에 기재된 항체가 상이한 종으로부터의 IL-4R에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 IL-4R에 결합하는 본원에 기재된 항체는 또한, 또 다른 종의 IL-4R에 결합할 수 있다. 교차-반응성은 결합 검정(예를 들어, SPR 및 ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적인 반응성 또는 IL-4R을 생리학적으로 발현하는 세포와의 결합이나 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정된다. 교차-반응성을 결정하는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 또는 유세포분석을 포함한다.

"중화" 또는 "차단" 항체는, hIL-4R에의 결합이 hIL-4 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 저해를 초래하는 항체를 지칭한다. hIL-4 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 이러한 저해는 당업계에 잘 알려진 hIL-4 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 하나 이상의 지수, 예컨대 hlL-4 및/또는 hIL-13-유도 세포 활성화 및 hIL-4R에의 hIL-4의 결합을 측정함으로써 평가될 수 있다(예를 들어, CN103739711A 참조). "성장의 저해"(예를 들어, 세포를 수반함)는 세포 성장에서 임의의 측정 가능한 감소를 포함하고자 한다.

용어 "면역 반응을 유도하는"과 "면역 반응을 증강시키는"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 특정 항원에 대한 면역 반응의 자극(즉, 수동적 또는 적응적)을 지칭한다. CDC 또는 ADCC를 유도하는 데 특이적인 용어 "유도하다"는 특이적인 직접적 세포 사멸화 기전을 자극시키는 것을 지칭한다.

"항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)"은, Fc 수용체-발현 세포가 항체의 Fc 분절의 인식에 의해 항체-코팅된 표적 세포를 직접 사멸화시킴을 의미한다. 항체의 ADCC 이펙터 기능은 IgG의 Fc 분절의 변형에 의해 감소되거나 무력화될 수 있다. 변형은 항체의 중쇄 불변 영역에서의 돌연변이, 예컨대 IgG1의 N297A, L234A 및 L235A; IgG2/4 키메라, IgG4의 F235E, 및 L234A/E235A 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 지칭한다.

조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 종래의 방법을 사용하여 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA 서열은 클로닝되고 GS 발현 벡터 내로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포 내로 안정하게 형질주입될 수 있다. 본원에 기재된 인간화 항체의 서열은 분자 클로닝 기법을 사용함으로써 상응하는 발현 벡터 내로 삽입되었고, 상응하는 인간화 항체는 발현 및 생성을 위해 HEK293 세포 발현 시스템을 사용함으로써 수득될 수 있었다. 더 권고된 선행 기술로서, 포유류 발현 시스템은 특히 FC 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 초래할 수 있다. 안정한 클론은 인간-유래 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 의해 수득된다. 양성 클론은 생물반응기의 무혈청 배지에서 확장되어 항체를 생성한다. 분비된 항체를 갖는 배양물은 종래의 기법을 사용하여 정제되고 수집될 수 있다. 항체는 종래의 방법을 사용하여 여과되고 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체는 또한, 종래의 방법, 예컨대 분자체 및 이온 교환을 사용하여 제거될 수 있다. 생성된 생성물은 예를 들어, -70℃에서 즉시 냉동되거나, 동결건조될 필요가 있다.

"유효량" 또는 "유효 용량"은 임의의 하나 이상의 유익한 또는 원하는 치료 결과를 수득하기 위해 필요한 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 사용을 위해, 유익한 또는 원하는 결과는 위험도의 무력화 또는 감소, 장애, 이의 합병증 및 장애의 진행 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학, 조직학 및/또는 행동 증상을 포함한 장애의 중증도의 감소 또는 발병의 지연을 포함한다. 치료적 용도를 위해, 유익한 또는 원하는 결과는 임상적 결과, 예컨대 본 개시내용의 표적 항원과 관련된 다양한 장애의 발생을 감소시키거나 장애의 하나 이상의 증상을 경감시키는 것, 장애를 치료하는 데 필요한 다른 제제의 투여량을 감소시키는 것, 또 다른 제제의 치료 효과를 증강시키는 것, 및/또는 본 개시내용의 표적 항원과 관련된 환자(또는 대상체)의 장애의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.

"외인성"은 환경에 따라 유기체, 세포 또는 인체 외부에서 생성되는 성분을 지칭한다.

"내인성"은 환경에 따라 세포, 유기체 또는 인체 내부에서 생성되는 성분을 지칭한다.

"단리된"은 정제된 상태를 지칭하고, 이러한 경우 지정된 분자에 다른 생물분자, 예컨대 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질(예컨대 세포 찌꺼기 및 성장 배지)이 실질적으로 없음을 의미한다. 일반적으로, 용어 "단리된"은, 이러한 성분이 본원에 기재된 화합물의 실험적 또는 치료적 용도를 유의하게 방해할 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 성분의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 의미하지는 않는다.

"상동성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에서의 또는 2개의 폴리펩타이드 사이에서의 서열 유사성을 지칭한다. 비교되는 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하위단위에 의해 차지하게 될 때, 예를 들어, 2개의 DNA 분자의 각각의 위치가 아데닌에 의해 차지하게 된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이에서 상동성 백분율은 2개의 서열에 의해 공유된 일치하는 또는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 x 100%를 한 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열이 최적으로 정렬될 때 10개 위치 중 6개가 일치하거나 상동성이라면, 2개의 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 2개의 서열이 정렬될 때, 비교가 수행되어 최대 상동성 백분율을 수득한다. 본원에 기재된 "적어도 85%의 서열 동일성"은 변이체와 모(parent) 서열이 정렬될 때 2개의 서열이 적어도 85% 상동성임을 의미하고; 일부 구현예에서, 이들은 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이며; 일부 구체적인 구현예에서, 이들은 90%, 95% 또는 99% 이상 상동성이고; 다른 구체적인 구현예에서, 이들은 적어도 95% 상동성이다. 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 모 서열에서 이루어진 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이에 의해 수득된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 모든 이러한 표기는 이의 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달(transfer)의 수에 상관 없이, 1차 시험 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 정교한 또는 의도치 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 같이 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다.

용어 "선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있으나 반드시 그런 것은 아니며, 설명은 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있으나 반드시 그런 것은 아님을 의미한다.

항체의 약학적 조성물(제형)에 대한 예시적인 제조 과정:

단계 1: 소정량의 정제된 항-IL-4R 항체 용액을 항체가 없는 완충제로 용매 교환(바람직하게는 한외여과)을 받게 하였다; 적어도 6배 부피를 한외여과 막에 의해 교환하였고, 항체를 소정의 농도까지 농축시켰다. 소정 부피의 다른 보조 물질의 모액을 첨가하고, 혼합물을 완충제로 희석시켜 항체 및 각각의 보조 물질이 필요한 농도에 도달하게 하고 잘 혼합하였다. 보존 용액을 여과한 다음, 중앙-제어 시료화(central-control sampling)를 받게 하고 멸균에 대해 시험하였다. 보존 용액은 0.22 μm PVDF 필터를 통과하였고, 여과물을 수집하였다.

단계 2: 충전량을 2.15 mL로 조정하고, 여과물을 2 mL 바이얼 내로 충전하고, 스토퍼(stopper)를 적용하고, 중앙-제어 시료화를 충전 시작 시, 도중에 그리고 종료 시에 수행하여, 충전 부피의 차이를 검출하였다.

단계 3: 캡핑 기계를 개시하여, 알루미늄 캡을 적용하고 캡핑을 수행하였다.

단계 4: 시각적 조사를 수행하여, 생성물이 어떠한 검출물, 예컨대 부정확한 충전을 갖지 않음을 확인하였다. 바이얼 표지를 인쇄하고 부착하였다; 판지 표지(carton label)를 인쇄하고, 판지를 접고, 패킹(packing)을 수행하고, 판지 표지를 부착하였다.

실시예

하기 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하지만, 본 개시내용은 이로 제한되지 않는다. 구체적인 조건이 명시되지 않는 실시예에서의 실험 방법은 일반적으로 종래의 조건, 예컨대 문헌[항체: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Cold Spring Harbor Laboratory] 하에 또는 원료 또는 제품의 제조업체에 의해 권고되는 조건 하에 수행된다. 표시된 특정 기원이 없는 시약은 상업적으로 입수 가능한 종래의 시약이다.

항체 제조의 실시예

실시예 1: 마우스 면역화 및 검출

his-태깅된 인간 IL-4R(h-IL-4R-his) 재조합 단백질, his-태깅된 마우스 IL-4R(m-IL-4R-his) 재조합 단백질 및 his-태깅된 레서스 IL-4R(레서스-IL-4R-his) 재조합 단백질을 Acrobiosystems에 의해 합성하고, HEK293에 의해 발현시키고, 정제하였다.

인간화 Fc-태깅된 인간 IL-4R 재조합 단백질(h-IL-4R-Fc)을 자가-설계하고, 발현시키고, 정제하였다. 정제된 단백질을 하기 실시예에 기재된 실험에 사용하였다.

이 실시예에서 항체 또는 항원-결합 단편의 VL 영역 및 VH 영역의 CDR 아미노산 잔기는 수 및 위치의 측면에서 기지의 카바트 숫자매김 체계(LCDR 1-3, HCDR 2-3) 및 AbM 체계(HCDR1)에 상응한다.

마우스를 면역화함으로써 항-인간 IL-4R 단일클론 항체를 생성하였다. 마우스는 실험용 C57BL/6 마우스, 암컷, 6 내지 8 주령이었다(Joinn Laboratories (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd., 동물 생산 라이센스 번호: 201503052).

사육 환경: SPF 등급. 구매된 마우스를 실험실 환경에서 1주일 동안 12/12시간 명/암 사이클에서, 20-25℃의 온도에서, 40-60%의 습도로 사육하였다. 환경에 적응하였던 마우스를 각각의 케이지에 5 마리씩, 3개의 케이지로 나누었다. 면역 항원은 Fc-태깅된 인간 IL-4R 재조합 단백질(0.73 mg/mL의 농도에서 h-IL4R-Fc)이었다. Freund's 아쥬반트(Sigma, Cat#: F5881)를 에멀젼화에 사용하였고, 여기서 Freund's 완전 아쥬반트(CFA, Pierce, Cat# 77140)를 1차 면역화에 사용하고, 핵산 아쥬반트(CpG, Sangon Biotech (Shanghai)) 및 알루미늄 아쥬반트(Alum, Thermo Cat# 77161)를 나머지 부스트 면역화에 사용하였다.

제0일에, 70 μg의 에멀젼화된 항원을 각각의 마우스에서 복강내(IP) 주사하였다. 제14일, 제28일, 제42일, 제56일 및 제77일에, 항원의 등쪽(dorsal) 주사 및 복강내 주사(각각 0.1 mL)를 등쪽 덩어리(dorsal lump) 및 복부 팽만에 기초하여 수행하였다. 혈액 시험을 위해 혈액을 제21일, 제35일, 제49일, 제63일 및 제84일에 수집하고, 마우스 혈청을 실시예 2의 ELISA 방법에 의해 시험하여 마우스 혈청 내 항체 역가를 결정하였다. 네번째 면역화 후, 항체 역가가 높고 혈청에서 안정한 경향이 있는 마우스에서 비장 세포 융합을 수행하였다. 융합 전 3일째에 부스트 면역화를 수행하고, 포스페이트 완충제로 제형화된 10 μg의 항원 용액을 각각의 마우스에서 복강내(IP) 주사하였다. 비장 림프구 및 골수종 세포, Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287™)를 최적화된 PEG-매개 융합 절차에 따라 융합하여, 하이브리도마 세포를 수득하였다.

실시예 2: 항체의 ELISA 시험 및 스크리닝

1. ELISA 결합 실험:

ELISA 실험을 사용하여, 항-IL-4R 항체의 결합 특성을 검출하였다. 마이크로플레이트를 his-태깅된 IL-4R 재조합 단백질로 코팅하였다. 항체를 각각의 웰에 첨가한 후, 2차 항체(HRP-접합 항-1차 항체 Fc 항체) 및 HRP 기질 TMB를 첨가함으로써 항원에의 항체의 결합 활성을 검출하였다.

인간 또는 레서스 IL-4R-his 단백질을 96-웰 마이크로플레이트 상에 0.5 μg/mL의 농도에서 웰당 100 μL로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 차단(blocking) 용액을 웰당 200 μL로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 희석제에서 희석된 시험될 항-IL-4R 항체를 웰당 100 μL로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 희석제로 1:20000에서 희석된 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG 2차 항체를 웰당 100 μL로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. TMB를 웰당 100 μL로 첨가하고, 혼합물을 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 0.16 M/L 황산을 웰당 50 μL로 첨가하였다. OD 값을 Thermo MultiSkanFc 마이크로플레이트 판독기에 의해 450 nm에서 판독하고, IL-4R에의 항-IL-4R 항체의 결합 EC₅₀ 값을 계산하였다.

2. ELISA 차단 실험:

이 실험에서, 시험관내 차단 실험에 의해, 선택된 항-인간 IL-4R 항체에 의한 인간 IL-4에의 인간 IL-4R의 결합의 차단을 검출하였다. 구체적으로, Fc-태깅된 IL-4R 재조합 단백질을 96-웰 마이크로플레이트 상에 코팅한 다음, 인간 IL-4R에 결합된 항체를 첨가하여 에피토프에 완전히 결합하고 이를 차지하게 하였고, 그 후에 IL-4(Biolegend, Cat# 574004)를 첨가하였다. 비오틴-접합 항-IL-4 항체 및 뉴트라비딘-HRP(Pierce, Cat# 31001)를 사용하여, IL-4가 IL-4R에 여전히 결합할 수 있는지의 여부를 검출하였고, IL-4R 항체에 의한 IL-4/IL-4R 결합의 차단의 IC₅₀ 값을 계산하였다.

인간 IL-4R-Fc 단백질을 96-웰 마이크로플레이트 상에 0.5 μg/mL의 농도에서 웰당 100 μL로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 차단 용액을 웰당 200 μL로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 희석제에서 희석된 시험될 항-IL-4R 항체를 웰당 100 μL로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. 희석된 IL-4를 웰당 100 μL로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 3회 세척하였다. 희석된 비오틴-접합 항-IL-4 항체를 웰당 100 μL로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 3회 세척하였다. 희석제에서 1:5000으로 희석된 HRP-표지된 뉴트라비딘을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 웰당 250 μL에서 3회 세척하였다. TMB를 웰당 100 μL로 첨가하고, 혼합물을 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 0.16 M/L 황산를 웰당 50 μL로 첨가하였다. OD 값을 Thermo MultiSkanFc 마이크로플레이트 판독기에 의해 450 nm에서 판독하고, IL-4R 항체에 의한 IL-4에의 IL-4R의 결합의 차단의 IC₅₀ 값을 계산하였다.

실시예 3: 인간 IL-4R에 결합하는 항체의 리포터 유전자 세포 활성 실험

HEK-청색 IL-4 세포를 Invivogen(Cat# hkb-stat6)으로부터 구매하고, 세포를 인간 IL-4R 유전자 및 STAT6-매개 SEAP 게놈으로 안정하게 형질주입하였다. 따라서, 상층액 내 분비된 SEAP를 SEAP의 기질인 QUANTI-Blue에 의해 검출함으로써 IL-4R 신호전달 경로의 활성화 수준을 특징화할 수 있었다.

이 실험에서, HEK-청색 IL-4 세포의 활성화를 검출함으로써 IL-4R 항체의 시험관내 세포 활성을 IC₅₀에 따라 평가하였다.

HEK-청색 IL-4 세포를 10% FBS, 100 μg/mL 제오신(Zeocin)(Invivogen, Cat# ant-zn-05) 및 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, Cat # ant-bl-05)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하고, 1주일에 2 내지 3회 1:5 또는 1:10의 계대배양비로 계대배양하였다. 계대배양 동안, 배지를 피펫팅에 의해 제거하고, 세포층을 5 mL의 0.25% 트립신으로 헹구었다. 그 후에, 트립신을 피펫팅에 의해 제거하고, 세포를 인큐베이터에서 3분 내지 5분 동안 분해한 다음, 신선한 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 세포 배양 플레이트에 5x10⁵ 세포/mL의 밀도로 첨가하였고, 배지는 10% FBS, 100 μg/mL 제오신 및 30 μg/mL 블라스티시딘을 함유하는 DMEM이었다. 단지 100 μL의 멸균수를 96-웰 플레이트의 주변부(periphery)에 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다(37℃, 5% CO₂). 세포가 벽에 접착된 후, 시험될 일련으로 희석된 항체를 웰당 100 μL로 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 20시간 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다(37℃, 5% CO₂). 그 후에, 20 μL의 세포 상층액을 각각의 웰로부터 새로운 96-웰 편평 바닥 플레이트 내로 넣고, 180 μL의 QUANTI-Blue 기질 용액을 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터에서 암실에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 620 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Thermo MultiSkanFc)로 측정하였다.

실시예 4: 인간 IL-4R에의 항체 결합에 의한 TF-1 세포의 증식의 저해

TF-1 세포(ATCC CRL-2003)는 IL-4R을 발현하고 IL-4/IL-13과 같은 사이토카인에 민감한 림프종 세포이다. IL-4는 GM-CSF의 부재 하에 증식하기 위해 TF-1 세포를 자극시킬 수 있다. 이 실험에서, IL-4의 작용 경로를 차단하고 TF-1 세포의 증식을 저해하기 위해 중화 항체를 첨가함으로써 상이한 항-IL-4R 항체의 중화 활성을 비교하였다.

TF-1 세포를, 10% FBS 및 2 ng/mL GM-CSF(R&D, Cat# 215-GM-010)를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하고, 1주일에 2 내지 3회 1:10의 계대배양비로 계대배양하였다. 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 세포 배양 플레이트에 2x10⁵ 세포/mL의 밀도로 첨가하였고, 배지는 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지였다. 단지 100 μL의 멸균수를 96-웰 플레이트의 주변부에 첨가하였다. 50 μL의 시험될 일련으로 희석된 항체 및 50 μL의 IL-4(R&D, Cat# 204-IL-050)를 0.7 ng/mL의 최종 농도로 각각의 웰에 첨가하고, 배양 플레이트를 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션하였다(37℃, 5% CO₂). 배양을 완료한 후, CTG 키트(Promega, Cat# G7572)를 사용함으로써 세포 증식을 검출하였다.

실시예 5: 시험관내 결합 친화도 및 동역학 실험

인간 IL-4R에 대해 시험될 IL-4R에 대한 인간화 항체의 친화도를 Biacore, GE 장비를 사용하여 결정하였다.

인간 항체 포착(capture) 항체를, 인간 항체 포착 키트(Cat# BR-1008-39, GE)의 설명에 기재된 방법에 따라 Biacore 장비(Biacore X100, GE)의 바이오센서 칩 CM5에 공유 커플링하고, 따라서 소정량의 시험될 항체를 친화도에 기초하여 포착하였다. 그 후에, 일련의 농도 구배의 IL-4R 항원(IL-4R 항원은 모두 Acrobiosystems로부터 구매되었음, Cat# ILR-H5221)은 칩의 표면을 통해 유동하였고, Biacore 장비(Biacore X100, GE)를 사용하여 반응 신호를 실시간으로 검출하여, 결합 및 해리 곡선을 수득하였다. 각각의 사이클의 해리를 완료한 후, 바이오칩을 세척하고, 인간 항체 포착 키트에서 제조된 재생 용액으로 재생시켰다. 실험에 사용된 아미노 커플링 키트를 GE사로부터 구매하였고(Cat# BR-1000-50, GE), 완충제는 탈이온수(D.I. Water)로 1x(pH 7.4)로 희석된 HBS-EP+ 10x 완충제 용액(Cat# BR-1006-69, GE)이었다.

실험으로부터 수득된 데이터를 BiacoreX100 평가 소프트웨어 2.0 GE 소프트웨어로 (1:1) 결합 모델로 적합화하여, 친화도 값을 수득하였다.

실시예 6: 항체의 서열 및 제조

실시예 2에서 상기 기재된 바와 같은 ELISA 결합 실험(인간 IL-4R-his의 ELISA 결합)과 ELISA 차단 실험(인간 IL-4/IL-4R의 ELISA 차단), 실시예 3에서 IL-4 자극 하에 HEK293-청색 IL-4 세포의 활성화를 저해하는 실험 및 실시예 4에서 IL-4 자극 하에 TF-1 세포의 증식을 저해하는 실험에 기초하여, 최상의 시험관내 활성을 보여주는 2개의 단일클론 하이브리도마 세포주를 선택하였다. 활성 시험의 결과를 표 2에 제시한다.

단일클론 하이브리도마 세포주 25G7 및 7B10을 선택하고, 항체 서열을 이로부터 클로닝하였다. 하이브리도마로부터의 서열의 클로닝은 하기와 같다.

대수 성장기(logarithmic growth phase)에 있는 하이브리도마 세포를 수집하고, 트리졸(Trizol)(Invitrogen, 15596-018)(키트 설명의 절차에 따라)을 사용하여 RNA를 추출하고 역전사시켰다(PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat# 2680A). 역전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-Primer Set(Novagen, TB326 Rev.B 0503)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨 다음, 시퀀싱 회사에 의한 시퀀싱을 위해 보내고, 생성된 항체 서열을 분석하였다.

뮤린 단일클론 항체 25G7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:

이 항체에 함유된 CDR 서열을 표 3에 제시한다.

뮤린 단일클론 항체 7B10의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:

이 항체에 함유된 CDR 서열을 표 4에 제시한다.

수득된 가변 영역 서열을 인간 불변 영역 서열에 연결하여, 인간-뮤린 키메라 항체 서열을 수득하였다. 분자 클로닝 기법을 사용하여 키메라 항체의 서열을 상응하는 발현 벡터 내로 삽입하였다. HEK293 세포 발현 시스템을 사용하여 인간-뮤린 키메라 항체 25G7-C 및 7B10-C를 수득하였다.

정제된 키메라 항체를 상기 실시예 2 내지 5에 기재된 방법에 의해 시험관내에서 이의 활성에 대해 시험하였고, 데이터를 표 5에 제시한다. 결과는, IL-4 결합을 차단하는 것과 세포 증식을 저해하는 것 둘 다에 있어서 25G7-C 항체가 기준 항체 두필루맙(문헌[WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012]를 참조로 하여 합성됨)보다 유의하게 더 양호함을 보여준다.

실시예 7: 마우스 항체 인간화 실험

생성된 뮤린 항체 25G7 및 7B10을 인간화하였다. 수득된 뮤린 항체 VH/VLCDR의 전형적인 구조에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 인간 항체 생식계열(Germine) 데이터베이스와 비교하여, 높은 상동성을 갖는 인간 생식계열 주형을 수득하였다. 인간 생식계열 경쇄 프레임워크 영역은 인간 κ 경쇄 유전자, 바람직하게는 인간 생식계열 경쇄 주형 IGKV3-11*01(SEQ ID NO: 22, 항체 25G7에 대해) 및 IGKV2D-29*01(SEQ ID NO: 24, 항체 7B10에 대해)로부터 유래되었다. 인간 생식계열 중쇄 프레임워크 영역은 인간 중쇄, 바람직하게는 인간 생식계열 중쇄 주형 IGHV3-48*01(SEQ ID NO: 21, 항체 25G7에 대해) 및 IGHV1-2*02(SEQ ID NO: 23, 항체 7B10에 대해)로부터 유래되었다.

인간 생식계열 주형의 서열을 하기에 제시한다.

뮤린 항체의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형 상으로 이식한 다음, IgG 불변 영역과 재조합하고, 그 후에 역돌연변이를 수행하여 일련의 인간화 분자를 수득하였다.

hu7B10-VH-a, hu7B10-VH-b 및 hu7B10-VH-c를 약물 기량성(druggability)을 위해 변형시키고, 중쇄 인간 생식계열 주형의 첫번째 위치를 Q로부터 E로 변화시켰다. 2개 항체의 인간화 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 25-27 및 SEQ ID NO: 31-33으로 각각 표시된다; 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 28-30 및 SEQ ID NO: 34-36으로 각각 표시된다.

하이브리도마 클론 25G7의 역돌연변이 설계를 표 6에 제시한다.

하이브리도마 클론 7B10의 역돌연변이 설계를 아래 표 7에 제시한다.

예시적인 인간화 항체 hu25G7(VH-c 중쇄 및 VL-a 경쇄를 사용함) 및 hu7B10 항체 분자(VH-b 중쇄 및 VL-b 경쇄를 사용함)의 각각의 완전한 경쇄 및 중쇄 서열을 SEQ ID NO: 17-20으로 표시한다.

분자 클로닝 기법을 사용하여 인간화 항체의 서열을 상응하는 발현 벡터 내로 삽입하였고, 발현 및 생성을 위한 HEK293 세포 발현 시스템을 사용하여 상응하는 인간화 항체를 수득할 수 있었다.

실시예 8: 인간화 항체의 활성 데이터

인간화 항체 hu25G7 및 hu7B10을 실시예 2 내지 5에 기재된 시험관내 활성 검정을 받게 하였고, 결과를 표 8에 제시한다.

결과는, hu25G7과 hu7B10이 둘 다 레서스 IL-4R이 아니라 인간 IL-4R에만 결합하였음을 보여주었고, 이는 인간 IL-4R에 특이적으로 결합되고 레서스에 상동성이 아닌 인간 에피토프에 결합된 2개 항체 모두를 나타낸다. 항체는 둘 다 IL-4/IL-4R 결합 및 세포내 신호전달 경로를 차단하여, IL-4 활성화의 중화 및 TF-1 세포의 증식의 저해를 초래할 수 있었고, 여기서 hu25G7의 차단 및 저해 활성은 기준 항체 두필루맙의 차단 및 저해 활성보다 여전히 유의하게 더 양호하다.

실시예 9: 인간화 항체 hu25G7에 대한 친화도 성숙화 검정

hu25G7 항체를 효모 디스플레이 플랫폼 기술을 통해 친화도 성숙화를 받게 하고, 6개의 CDR을 표적화하는 친화도 성숙화 효모 라이브러리를 설계하고 hu25G7 항체에 기초하여 제조하고, 변성 프라이머를 설계하고, 설계된 돌연변이체 아미노산을 PCR 및 상동성 재조합에 의해 hu25G7-scFv 항체 라이브러리 내로 도입하였다. 각각의 라이브러리의 크기는 약 10⁹이었고, 작제된 효모 라이브러리를 2세대 시퀀싱(GENEWIZ) 방법에 의해 이의 다양성(diversity)에 대해 확증하였다.

비오틴-표지된 인간 IL-4R을 사용하여, hu25G7-scFv 효모 라이브러리로부터 고-친화도 항체를 선택하였다. 2회의 MACS 스크리닝(스트렙토마이신 자기 비드, Invitrogen) 및 2회의 FACS 스크리닝(BD FACSAria™ FUSION) 후, 효모 단일 클론을 배양 및 발현 유도를 위해 선택하였다. FACS(BD FACSCanto II)를 사용하여, 인간 IL-4R에의 효모 단일 클론의 결합을 검출하고, 야생형 25G7 항체보다 더 높은 친화도를 갖는 효모 단일 클론을 시퀀싱 확증을 위해 선택하였다. 시퀀싱 클론의 정렬 및 분석 후, 중복(redundant) 서열을 제거하고, 비-중복 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 전장 인간 항체 분자로 전환시켰다. 친화도 정제 후 전장 항체의 친화도 결정을 BIAcore X-100(GE Life Sciences)을 사용하여 수행하였고, 인간 IL-4R에 대해 더 높은 친화도를 갖는 후보 항체 분자를 선택하였다. 인간 IL-4R에 대한 항체 분자의 친화도는 야생형 hu25G7 항체의 친화도보다 더 높았으며, 여기서 hu25G7-A 항체 분자의 친화도는 두필루맙의 친화도와 대등하였고, hu25G7-B 분자의 친화도는 두필루맙의 친화도보다 유의하게 더 양호하였다.

친화도 성숙화로부터 비롯되는 항체 hu25G7-A의 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:

이 항체에 함유된 CDR 서열을 표 9에 제시한다.

항체 hu25G7-B의 경쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:

이 항체에 함유된 CDR 서열을 표 10에 제시한다.

상기 기재된 경쇄 가변 영역 hu25G7-A LCVR을 hu25G7 경쇄 불변 영역과 재조합하여 hu25G7-A 항체 경쇄를 수득하였다; 상기 기재된 경쇄 가변 영역 hu25G7-B LCVR을 hu25G7 경쇄 불변 영역과 재조합하여 hu25G7-B 항체 경쇄를 수득하였다.

hu25G7-VH-c의 아미노산 잔기를 최적화하여, 중쇄 가변 영역 hu25G7-A/B VH 및 hu25G7-C VH를 수득하였다.

상기 기재된 중쇄 가변 영역을 hu25G7 중쇄 불변 영역과 재조합하여, hu25G7-A/hu25G7-B 및 hu25G7-C 항체 중쇄를 수득할 수 있었다.

hu25G7-A 및 hu25G7-B의 완전한 중쇄 서열을 SEQ ID NO: 44로 표시한다.

각각의 완전한 경쇄 서열을 SEQ ID NO: 45-46으로 표시한다.

실시예 10: 인간화 항체의 친화도 성숙화 활성 데이터

항체 hu25G7-A 및 hu25G7-B를 실시예 3 및 실시예 4에 따라 검출하였다; 항체 hu25G7-A와 hu25G7-B는 둘 다 IL-4/IL-4R 결합 및 세포내 신호전달 경로를 차단하여, IL-4 및 IL-13 활성화의 중화 및 TF-1 세포의 증식의 저해를 초래할 수 있었다. 활성 데이터를 표 11에 제시한다.

IL-13 자극에 의해 야기되는 TF-1 세포의 증식을 저해하는 실험에서, hu25G7-A와 hu25G7-B는 둘 다 유익한 효과를 나타내었다. 두필루맙과 비교하여, hu25G7-A 및 hu25G7-B는 IL-4R에의 IL-4와 IL-13의 결합 및 이러한 결합에 의해 야기되는 세포 증식을 차단하는 데 있어서 유의하게 향상된 효과를 갖는다.

실시예 11: 마우스 피부염에 미치는 인간화 항체의 효과에 대한 연구

마우스 피부염 모델의 확립: IL-4/IL-4Rα 유전자이식 마우스(Cyagen Bioscience Biological Research Center (Taicang) Co., Ltd.로부터 구매됨)를 사용하고, 100 μL의 1.5% OXZ 아세톤 올리브 오일 용액(아세톤:올리브 오일 = 4:1)을 감작을 위해 각각의 마우스의 복부(3 cm x 3 cm의 영역)에 고르게 적용하였고, 감작일은 D0(제0일)이었다. 제7일에, 20 μL의 1% OXZ 아세톤 올리브 오일 용액을 시험감염(challenging)을 위해 각각의 마우스의 양쪽 귀(양면)에 고르게 적용하고, 시험감염을 72시간마다 수행하였다.

실험에서, 5개 군, 즉, 정상 대조군(감작 및 자극(excitation)을 위해 아세톤 올리브 오일 용액만 적용하였음), 모델 대조군, hu25G7-A 군, hu25G7-B 군 및 두필루맙군을 설정하였고, 각각의 군에는 3 내지 5 마리의 마우스가 존재하였다. 투여군의 투여 용량은 50 mg/kg이었고, 투여 경로는 피하 투여이고, 투여를 1주일에 2회 수행하였다(구체적인 정보에 대해서는 표 12 참조). 제27일에 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 귀 두께를 측정하였고, 결과를 도 1에 도시한다.

결과는, 모델 대조군의 마우스의 귀가 분명한 병리학적 손상을 가졌고, 귀의 두께가 정상 대조군의 귀 두께보다 유의하게 더 컸음을 보여주었다. hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙 군의 마우스의 귀 두께는 제27일에 모델 대조군의 귀 두께보다 유의하게 더 작았다. 다시 말해, hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙은 피부염을 치료하는 데 사용될 수 있고, hu25G7-B는 두필루맙보다 더 양호한 효과를 갖는다.

제형 제조의 실시예

제조에 사용된 장비 및 결과를 계산하는 방법은 하기와 같다:

SEC 분자 배제 크로마토그래피:

이는 젤 공극의 공극 크기와 중합체 시료 분자 코일의 크기 사이의 상대적인 관계에 의해 용질의 분리를 분석하는 방법이다.

SEC 단량체 함량 백분율 = A 단량체/A 전체 x 100% (A 단량체는 시료 내 주요 피크 단량체의 피크 면적이고, A 전체는 모든 피크 면적의 합계임).

SEC 측정 장비: Agilent 1260; 컬럼: waters, XBrige BEH200Å SEC(300 x 7.8 mm 3.5 μm).

CE 모세관 젤 전기영동:

이는 젤을 전기영동을 위한 지지(supporting) 배지로서 모세관 내로 이동시키고 소정의 전압 하에 시료의 분자량에 따라 분리하는 방법이다.

비-환원된 CE 순도 백분율 = A 주요 피크/A 전체 x 100% (A 주요 피크는 시료 내 주요 피크의 피크 면적이고, A 전체는 모든 피크 면적의 합계임).

CE 측정 장비: Beckman 모델 plus800

iCIEF 이미지화된 모세관 등전점 집속법 전기영동:

이는 단백질의 등전점 pI의 차이에 따라 분리하는 기법이다.

iCIEF 중성 피크 함량 백분율 = 중성 피크 면적/전체 면적 x 100%(전체 면적은 산성 피크, 중성 피크 및 염기성 피크의 면적의 합계임).

iCIEF 결정용 장비의 제조업체: 단순 단백질, 모델: muarice.

점도 측정: 점도를 유량계(rheometer)(제조업체: Anton Paar, 모델: MCR xx2)를 사용하여 25℃의 측정 온도에서 측정하고, 시료를 시험용 측정 플레이트 상에 직접 놓는다.

삼투압: 어는점 방법을 사용하여 삼투압을 측정한다. 어는점 강하 값과 용액의 몰농도 사이의 비례 관계에 기초하여 고-민감도 온도-감지 요소를 사용한 다음, 전기량을 통해 삼투압으로 전환시킴으로써 용액의 어는점을 측정한다. 장비의 제조업체: Loser, 모델: OM815.

실시예 1: 완충제 시스템의 스크리닝

100 mg/mL hu25G7-A 항체 및 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80(PS80)을 함유하는 제형을 4.5-6.5의 pH를 갖는 상이한 완충제 시스템에서 제조하고, 상이한 완충제 시스템에서 항체의 안정성을 검사하였다. 제형의 특정 설계를 아래 표에 제시한다.

시료를 각각 멸균 여과를 받게 하고, 바이얼 내로 충전시킨 다음, 40℃의 고온 조건 하에 외양 및 SEC에 대해 검사하였다. 데이터를 아래 표에 제시한다.

결과는, SA/CA/AA 완충제의 외양이 상대적으로 불량하였고, 따라서 His-AA가 완충제 시스템으로서 선택되었음을 보여주었다. His-AA 시스템에서, 4.5-5.5의 pH는 더 양호한 외양을 초래하였다; His-AA pH 6.5를 제외하고는, 각각의 완충제 시스템의 SEC는 어떠한 유의한 차이도 갖지 않았고, pH 5.0 및 6.0은 약간 더 양호하였다. 따라서, 항체의 완충제 시스템은 His-AA, pH 4.5-6.0이었다.

실시예 2: 항체 농도의 스크리닝

상이한 농도에서 hu25G7-A의 제형을 20 mM His-AA pH 5.0, 5.5 완충제 시스템에서 제조하였고, 제형 성분은 하기와 같다:

1) 20 mM His-AA pH5.0, 100 mg/mL hu25G7-A

2) 20 mM His-AA pH5.5, 100 mg/mL hu25G7-A

3) 20 mM His-AA pH5.0, 150 mg/mL hu25G7-A

4) 20 mM His-AA pH5.5, 150 mg/mL hu25G7-A

5) 20 mM His-AA pH5.0, 139 mg/mL hu25G7-A

6) 20 mM His-AA pH5.0, 127 mg/mL hu25G7-A

7) 20 mM His-AA pH5.0, 120 mg/mL hu25G7-A

8) 20 mM His-AA pH5.5, 138 mg/mL hu25G7-A

9) 20 mM His-AA pH5.5, 122 mg/mL hu25G7-A.

각각의 제형을 제조한 후, 우선 제형 시료 중 일부를 취하여 제형의 점도를 검출하였다. 그 후에, 시료를 각각 멸균 여과를 받게 하고, 바이얼 내로 충전시킨 다음, 40℃의 고온 조건 하에 외양, SEC, 비-환원된 CE-SDS 및 iCIEF에 대해 검사하여, hu25G7-A 제형의 점도 및 안정성에 미치는 상이한 항체 농도의 영향을 검사하였다. 결과를 아래 표에 제시한다:

결과는 하기를 보여주었다: 상이한 항체 농도의 외양, SEC, CE 및 iCIEF는 어떠한 유의한 차이도 갖지 않았다; 즉, pH 5.0 또는 5.5를 갖는 His-AA 완충제에서, 항체 농도는 제형의 안정성에 거의 영향을 미치지 않았다; 그러나, 항체 농도가 높을수록, 제형의 점도가 높아지고, pH 5.0을 갖는 완충제 용액에서, 항체 농도가 100 mg/mL였을 때 점도는 약 14 mPa.s인 한편, 항체 농도가 120 mg/mL였을 때 점도는 약 22 mPa.s이었다.

실시예 3: 점도 변형제의 스크리닝

120 mg/mL의 항체 농도에서 상이한 점도 변형제를 함유하는 hu25G7-A 제형을 20 mM His-AA(pH 5.0) 완충제에서 제조하였다. 제형의 점도에 미치는 상이한 점도 변형제의 영향을 평가 지수로서 점도와 함께 검사하였다. 피하 제형의 등장성 요건을 충족시키기 위해, 각각의 점도 변형제를 270 mosm/kg의 블랭크 점도 변형제 삼투압에서 제형에 첨가하여, 이의 효과를 검사하였다. 구체적인 결과를 아래 표에 제시한다.

결과는, 프롤린을 제외한 NaCl, MgCl₂, CaCl₂, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, NaF, NaSCN, Arg-Hcl, Lys(리신) 및 His(히스티딘)이 모두 상응하는 최대 농도에서 제형의 점도를 감소시키는 데 유의한 효과를 가졌음을 보여주었다. 이들 변형제 중에서, Arg-HCl, MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN 및 히스티딘이 더 양호한 효과를 가졌고, 따라서 Arg-HCl, MgCl₂, CaCl₂ 및 히스티딘이 점도 변형제로서 바람직하였다.

실시예 4: 고농도 제형의 점도에 미치는 점도 변형제의 효과

점도 변형제의 효과를 시험하기 위해, 150 mg/mL hu25G7-A의 항체 농도에서 hu25G7-A 제형을 20 mM His-AA, pH5.0 완충제에서 제조하였고, 구체적인 성분은 하기와 같다:

1) 점도 변형제 없음(N/A)

2) 85 mM MgCl₂

3) 148 mM CaCl₂

4) 93 mM 히스티딘

고농도 제형의 점도에 미치는 상이한 보조 물질의 영향을 평가 지수로서 점도와 함께 검사하였다.

결과는, 항체의 농도가 150 mg/mL였을 때, 제형의 점도가 MgCl₂, CaCl₂ 및 히스티딘에 의해 20 mPa.s 미만으로 감소될 수 있었고, 점도 감소 효과는 상대적으로 양호하였음을 보여주었다.

실시예 5: 제형 안정성에 미치는 점도 변형제의 영향

20 mM His-AA pH 5.0 완충제 시스템에서, 150 mg/mL의 항체 농도에서 그리고 보조 물질을 상이한 농도에서 함유하는 Hu25G7-A 제형을 제조하고, 제형의 열적 안정성(40℃에서 17일 동안 저장됨)에 미치는 상이한 농도에서의 보조 물질의 영향을 검사하였다. 실험 설계 및 결과를 아래 표에 제시한다.

결과는 하기를 보여주었다: MgCl₂, Arg-HCl, NaCl 및 히스티딘은 제형의 안정성에 약간의 영향을 미쳤으며, 여기서 MgCl₂, Arg-HCl, NaCl 및 히스티딘을 함유하는 제형의 안정성은 CaCl₂를 함유하는 제형의 안정성보다 더 양호하였고, 고온 조건 하에 CaCl₂ 군의 CE 감소는 다른 제형 시료보다 더 컸고, MgCl₂, Arg-HCl 및 히스티딘을 함유하는 제형의 안정성은 더 양호하였고, 따라서 MgCl₂, Arg-HCl 및 히스티딘이 바람직하였다.

실시예 6: 제형 안정성에 미치는 점도 변형제의 영향의 전반적인 평가

20 mM His-AA pH 5.0 완충제에서, 0.1 mg/mL PS80, 150 mg/mL Hu25G7-A 및 점도 변형제를 함유하는 제형을 제조하였으며, 여기서 15일 동안 진탕된 시료 내 PS80의 농도는 1 mg/mL였다. Hu25G7-A 조제물의 점도 및 안정성에 미치는 상이한 보조 물질의 영향을 검사하였다. 실험 설계는 하기와 같다.

1) N/A(점도 변형제 없음)

2) 90 mM MgCl₂

3) 120 mM Arg-HCl

4) 90 mM 히스티딘

각각의 제형을 제조한 후, 우선 제형 시료 중 일부를 취하여 제형의 점도를 검출하였다. 그 후에, 시료를 각각 멸균 여과를 받게 하고, 바이얼 내로 충전시킨 다음, 40℃의 고온 조건 하에 외양, SEC, 비-환원된 CE에 대해 검사하고, 냉동과 해동(-35℃ 내지 4℃) 및 진탕(25℃에서 300 rpm)을 반복하여, 제형의 점도 및 안정성에 미치는 상이한 보조 물질의 영향을 평가하였다. 결과를 아래 표에 제시한다.

결과는 하기를 보여주었다:

보조 물질 점도 변형제를 첨가한 후, 외양은 유백광을 보여주었으나, 보조 물질 사이에 어떠한 차이도 존재하지 않았다; 제형이 0.1 mg/mL PS80을 함유하였을 때, 점도 변형제-함유 군을 1일 동안 진탕하였고 입자가 나타났다. 그러나, PS80이 1 mg/mL였을 때, 외양은 15일 동안 진탕한 후에도 투명하게 남아 있었다.

40℃에서 SEC 결과는, 점도 변형제를 첨가한 후 SEC 단량체 함량이 약간 감소되었으나, 각각의 군의 시료 사이에 어떠한 유의한 차이도 존재하지 않았음을 보여주었으며, 여기서 Arg-HCl 시료군 및 히스티딘 시료군이 더 양호하였고, 히스티딘 시료는 안정성에서 최상이었다. 40℃에서 CE 결과는, 점도 변형제를 첨가한 후 CE가 약간 감소되었으나, 보조 물질 사이에서의 차이는 작았음을 보여주었다.

실시예 7: 점도 변형제 농도의 스크리닝

20 mM His-AA pH 5.0 완충제 시스템에서, Hu25G7-A 항체 상이한 농도 및 점도 변형제를 함유하는 제형을 제조하여, 제형의 점도를 검사하였다. 실험 설계 및 결과를 아래 표에 제시한다.

결과는, 점도 변형제 His, MgCl₂ 및 Arg-HCl의 농도를 증가시키는 것이 제형의 점도를 유의하게 감소시킬 수 있었음을 보여주었다.

실시예 8: 제형 안정성 시험

제형의 외양을 향상시키기 위해, 제형에 첨가된 염기성 아미노산(점도 변형제)의 양은 감소되는 것으로 여겨졌고, 제형 시료를 하기와 같이 제조하였다:

1. 20 mM His-AA pH 5.0, 30 mM 히스티딘, 0.8 mg/mL PS80, 41.8 mg/mL 수크로스, 항체 Hu25G7-A 120 mg/mL, 시료 내 히스티딘의 최종 함량은 50 mM임;

2. 20 mM His-AA pH 4.8, 87 mM 히스티딘, 0.8 mg/mL PS80, 150 mg/mL 항체 Hu25G7-A;

3. 20 mM His-AA pH 5.0, 100 mM 히스티딘, 0.8 mg/mL PS80, 150 mg/mL 항체 Hu25G7-A;

4. 20 mM His-AA pH 5.0, 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 0.8 mg/mL PS80, 150 mg/mL 항체 Hu25G7-A;

각각의 제형을 제조한 후, 우선 제형 시료 중 일부를 취하여 제형의 점도를 검출하였다. 그 후에, 시료를 각각 멸균 여과를 받게 하고, 바이얼 내로 충전시킨 다음, 4℃ 및 25℃에서 안정성에 대해 검사하였다. 시료의 외양, 삼투압, pH, SEC, 비-환원된 CE 및 iCIEF를 검출하여, 상이한 제형 시료의 점도 및 안정성을 평가하였고, 결과를 표에 제시한다.

결과는 하기를 보여주었다: 1번 내지 4번 제형 시료의 pH 변화는 모두 0.1 내에 있었고, 완충제 용량은 상대적으로 양호하였다; 삼투압은 등장성 범위에 있었고, 점도는 모두 20 mPa.s 내에 있었다; 시료 1번을 25℃에서 3개월 동안 저장한 후, CE/iCIEF는 약간 저하되었고, 4℃에서 3개월 동안 저장한 후, 외양은 여전히 투명하였고, 화학적 안정성은 유의하게 변하지 않았다. 시료 1번 내지 4번은 4℃에서 11개월 동안 저장된 후 외양이 투명하였고, SEC, iCIEF 및 CE-SDS의 검출 결과는 안정하였으며, 따라서 상기 기재된 1번 내지 4번 제형은 모두 상대적으로 안정하였다.

실시예 9: 당 농도의 스크리닝

피하 제형을 개발하고 주사 자극을 감소시키기 위해, 삼투압을 등장성으로 제어하는 것이 최상이었고, 따라서 당 농도를 스크리닝하여 등장성 당 농도를 결정하였다. 50 mM His-AA pH 5.0, 58 mg/mL 수크로스, 0.8 mg/mL PS80 및 120 mg/mL hu25G7-A 항체를 함유하는 제형을 제조하고, 어는점 방법(freezing point method)을 사용하여 삼투압을 3회 측정하였다.

결과는, 삼투압이 약 297 mosm/kg이었으며, 즉, 58 mg/mL의 당 농도에서 등장성이었음을 보여주었다.

실시예 10: 동결건조 과정의 스크리닝

25 mM His-AA pH 4.9, 60 mg/mL hu25G7-A, 25 mg/mL 수크로스 및 0.2 mg/mL PS80을 함유하는 제형을 제조하고, 멸균 여과를 받게 하고, 3.4 mL/바이얼에서 바이얼 내로 충전시키고, 하기 절차에 따라 동결건조하였다.

동결건조된 후, 시료를 상자 밖으로 꺼냈고, 여기서 시료의 외양은 하기와 같았다: 완전한 외양을 갖고 붕괴가 없는 백색의 가압된 분말. 대략 1.5 mL의 주사용수를 재구성에 사용하였고, 재구성된 시료의 성분은 하기와 같았다: 50 mM His-AA, 120 mg/mL hu25G7-A, 50 mg/mL 수크로스, 0.4 mg/mL PS80, pH 5.3. 재구성된 시료를 다양한 검출을 받게 하였다. 결과는, 희석물 냉동 및 농축물 용해 후 재구성된 용액의 지수가 양호함을 보여주었다.

실시예 11: 제형 화학식의 최적화

50 mM His-AA 완충제 pH, Hu25G7-A 항체 농도 및 PS80 농도를 변수로서 이용하여 DOE 실험 설계를 수행하고(변수는 pH 4.5-5.5, PS80 0.4-1.2 mg/mL 및 Hu25G7-A 항체 단백질 농도 100-140 mg/mL였음), JMP 소프트웨어를 사용하여 일련의 Hu25G7-A 제형 화학식을 수득하였고, 여기서 화학식은 모두 58 mg/mL 수크로스를 함유하였고, 구체적인 정보를 표 29에 나타낸다. 제형의 안정성을, 40℃ 고온, 진탕(300 rpm) 및 냉동-해동 실험(-35℃ 내지 4℃)을 포함하는 강제 분해(forced degradation)에 의해 시험하였다. 외양, 점도, SEC, 비-환원된 CE 및 iCIEF를 평가 지수로서 사용하였고, 결과를 표 30에 나타낸다. 최소 제곱법(least square method)을 결과의 통계학적 분석에 사용하였다.

결과는, 5회의 냉동-해동 사이클 후, 각각의 제형의 외양이 투명하게 남아 있었음을 보여주었다.

강제 분해 데이터를 적합화하고, 40℃ CE와 iCIEF 및 점도의 분해 차이값을 양호하게 적합화하고, 모델은 효과적이었다. 결과를 도 2에 도시한다. PS 농도가 0.8 mg/mL일 때, 항체 농도 및 pH를 각각 수평 좌표 및 수직 좌표로 취하고 점도 및 40℃ CE/iCIEF 분해 차이값을 지수(index)로서 취함으로써 등고선도를 도시하였고, 점도 < 30 cP, CE 감소 < 3% 및 iCIEF 감소 < 30%를 한계로서 취함으로써 제형의 안정성 변화의 등고선도를 도시하였고, 결과를 도 3에 도시한다.

결과는 하기를 보여주었다: 단백질 농도가 낮을수록, pH가 낮을수록, 제형의 점도는 더 낮고; CE 결과는 pH가 5.0일 때 최적이었고, iCIEF 중성 피크는 pH가 5.1일 때 최적이었다. 등고선도 및 점도 결과를 참조로 하여, 안정한 제형은 하기와 같다: 항체 농도는 100 내지 140 mg/mL이고, PS80은 0.4 내지 1.2 mg/mL이고, pH는 4.5 내지 5.5이다. 더욱이, 제형은 항체 농도가 110 내지 130 mg/mL이고 pH가 4.85 내지 5.45일 때, 더 안정하다.

실시예 12: 제형 안정성 시험

50 mM His-AA pH 5.0, 120 mg/mL hu25G7-A 항체, 58 mg/mL 수크로스 및 0.8 mg/mL PS80을 함유하는 제형을 제조하고, 멸균 여과를 받게 하고, 바이얼 내로 충전시켰다. 그 후에, 4℃ 안정성 시험을 수행하였고, 결과를 표 31에 나타낸다.

결과는 하기를 보여주었다: 상기 기재된 제형이 4℃에서 4개월 동안 저장된 후에도 여전히 안정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ANTI-IL-4R ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 721013CPCT <150> CN202010107765.0 <151> 2020-02-21 <160> 48 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> Heavy chain variable region of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> Light chain variable region of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> HCDR1 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <223> HCDR2 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 4 Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> HCDR3 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 5 Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> LCDR1 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 6 Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <223> LCDR2 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 7 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> LCDR3 of murine monoclonal antibody 25G7 <400> 8 Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(125) <223> Heavy chain variable region of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Ser Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <223> Light chain variable region of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> HCDR1 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 11 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <223> HCDR2 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 12 Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(16) <223> HCDR3 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 13 Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(14) <223> LCDR1 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 14 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <223> LCDR2 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 15 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> LCDR3 of murine monoclonal antibody 7B10 <400> 16 Gln His Ser Asn Glu Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 17 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(445) <223> Heavy chain of humanized antibody hu25G7 <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 18 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(215) <223> Light chain of humanized antibody hu25G7 <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 19 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(455) <223> Heavy chain of humanized antibody hu7B10 <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 20 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(218) <223> Light chain of humanized antibody hu7B10 <400> 20 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(98) <223> Human germline heavy chain template IGHV3-48*01 <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 22 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(95) <223> Human germline light chain template IGKV3-11*01 <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 23 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(98) <223> Human germline heavy chain template IGHV1-2*02 <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 24 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(100) <223> Human germline light chain template IGKV2D-29*01 <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Ile Gln Leu Pro 100 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> hu25G7-VH-a <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> hu25G7-VH-b <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> hu25G7-VH-c <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> hu25G7-VL-a <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> hu25G7-VL-b <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> hu25G7-VL-c <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(125) <223> hu7B10-VH-a <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 32 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(125) <223> hu7B10-VH-b <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(125) <223> hu7B10-VH-c <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <223> hu7B10-VL-a <400> 34 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 35 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <223> hu7B10-VL-b <400> 35 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <223> hu7B10-VL-c <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> Light chain variable region of hu25G7-A <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> LCDR1 of hu25G7-A <400> 38 Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <223> LCDR2 of hu25G7-B <400> 39 Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> LCDR3 of hu25G7-A <400> 40 Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met Leu Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> Light chain variable region of hu25G7-B <400> 41 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) <223> LCDR1 of hu25G7-B <400> 42 Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu Ala 1 5 10 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> Heavy chain variable region after hu25G7-A/B VH optimization <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(445) <223> Heavy chain of hu25G7-A and hu25G7-B <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 45 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(215) <223> Light chain of hu25G7-A <400> 45 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 46 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(215) <223> Light chain of hu25G7-B <400> 46 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 47 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <223> hu25G7-C VH <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> Heavy chain of hu25G7-C antibody <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims

항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물로서, 완충제는 히스티딘-아세트산 완충제이고, 완충제는 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 4.5 내지 5.5의 pH를 갖는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 히스티딘-아세트산 완충제는 10 mM 내지 60 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 30 mM의 농도를 갖는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 이상, 바람직하게는 100 mg/mL 내지 200 mg/mL, 바람직하게는 100 mg/mL 내지 180 mg/mL, 더 바람직하게는 100 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도를 갖는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 점도 변형제를 추가로 포함하고, 점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH₃COONa, Na₂SO₄, NaI, 아르기닌, 아르기닌 하이드로클로라이드, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 MgCl₂, 히스티딘 및 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 점도 변형제는 5 mM 내지 220 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 148 mM의 농도를 갖고; 더 바람직하게는, 점도 변형제는 하기 물질인, 약학적 조성물:
i) 5 mM 내지 220 mM 아르기닌 하이드로클로라이드;
ii) 5 mM 내지 100 mM 히스티딘; 또는
iii) 5 mM 내지 90 mM MgCl₂.
제5항에 있어서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 200 mg/mL, 바람직하게는 120 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도를 갖고; 점도 변형제는 50 mM 내지 90 mM MgCl₂, 50 mM 내지 100 mM 히스티딘, 및 10 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 50 mM 내지 180 mM 아르기닌 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 mg/mL 내지 140 mg/mL, 바람직하게는 100 mg/mL 내지 120 mg/mL의 농도를 갖고; 점도 변형제는 5 mM 내지 50 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 및 MgCl₂, 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 및 MgCl₂, 가장 바람직하게는 30 mM 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 및 MgCl₂로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하고, 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트, 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20인, 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 계면활성제는 0.1 mg/mL 내지 1.2 mg/mL, 바람직하게는 0.4 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 가장 바람직하게는 0.8 mg/mL의 농도를 갖는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제를 추가로 포함하고, 안정화제는 바람직하게는 트레할로스 또는 수크로스, 더 바람직하게는 수크로스인, 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 안정화제는 20 mg/mL 내지 70 mg/mL, 바람직하게는 40 mg/mL 내지 60 mg/mL, 가장 바람직하게는 58 mg/mL의 농도를 갖는, 약학적 조성물.
약학적 조성물로서,
(a) 100 mg/mL 내지 150 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 80 mM 내지 148 mM 점도 변형제; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하거나;
(a) 100 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 5 mM 내지 50 mM 히스티딘; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.0 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 50 mg/mL 내지 60 mg/mL 수크로스를 포함하는, 약학적 조성물.
약학적 조성물로서,
(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 점도 변형제; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스를 포함하거나;
(a) 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 40 mM 내지 220 mM 점도 변형제; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하고;
점도 변형제는 MgCl₂, CaCl₂, NaF, NaSCN, KCl, CH3COONa, Na₂SO₄, NaI, 아르기닌, 아르기닌 하이드로클로라이드, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
바람직하게는, 약학적 조성물은 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
(a) 100 mg/mL 내지 140 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 10 mM 내지 40 mM 점도 변형제; (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (e) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스, 여기서 점도 변형제는 히스티딘, 아르기닌 하이드로클로라이드 또는 MgCl₂임; 또는
(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 40 mM 내지 90 mM MgCl₂; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 또는
(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 50 mM 내지 100 mM 히스티딘; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 또는
(a) 100 mg/mL 내지 180 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 10 mM 내지 30 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 50 mM 내지 200 mM 아르기닌 하이드로클로라이드; 및 (d) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80.
약학적 조성물로서,
(a) 100 mg/mL 내지 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 내지 60 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 4.5-5.5; (c) 0.4 mg/mL 내지 1.2 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 40 mg/mL 내지 70 mg/mL 수크로스를 포함하고; 바람직하게는, 약학적 조성물은 하기를 포함하는, 약학적 조성물:
(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 5.0; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 58 mg/mL 수크로스.
약학적 조성물로서,
(a) 약 150 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 약 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제, pH 약 5.0; (c) 약 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 약 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 40으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iii) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13으로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iv) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 8로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며; 바람직하게는 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로 각각 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 40으로 각각 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
더 바람직하게는, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 중 임의의 하나로 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며:
(v) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1로 표시되거나 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2로 표시되거나 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;
(vi) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9로 표시되거나 SEQ ID NO: 9와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10으로 표시되거나 SEQ ID NO: 10과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;
(vii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 43 또는 47로 표시되거나 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 43 또는 47과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 37 또는 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 37 또는 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐; 또는
(viii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 31, 32 또는 33으로 표시되거나 SEQ ID NO: 31, 32 또는 33과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 34, 35 또는 36으로 표시되거나 SEQ ID NO: 34, 35 또는 36과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;
가장 바람직하게는, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 중 임의의 하나로 제시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학적 조성물:
(IX) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되거나 SEQ ID NO: 43과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37로 표시되거나 SEQ ID NO: 37과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐;
(X) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 표시되거나 SEQ ID NO: 43과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐; 또는
(XI) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 47로 표시되거나 SEQ ID NO: 47과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 표시되거나 SEQ ID NO: 41과 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 가짐.
제16항에 있어서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 불변 영역을 포함하며; 바람직하게는, 항-IL-4R 항체는 아래 표시된 중쇄 및 경쇄를 포함하고:
SEQ ID NO: 17로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 18로 표시된 경쇄; 또는
SEQ ID NO: 19로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 20으로 표시된 경쇄; 또는
SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 45로 표시된 경쇄; 또는
SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 46으로 표시된 경쇄; 또는
SEQ ID NO: 48로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 46으로 표시된 경쇄;
더 바람직하게는, 항-IL-4R 항체는 SEQ ID NO: 44로 표시된 중쇄 및 SEQ ID NO: 45로 표시된 경쇄를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 보존 용액(stock solution)을 완충제-교환하는 단계를 포함하는, 방법.
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 동결건조된 제형으로서, 동결건조된 제형은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 동결건조함으로써 수득되는, 동결건조된 제형.
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재구성된 용액으로서, 재구성된 용액은 제19항에 따른 동결건조된 제형을 재구성함으로써 수득되고; 바람직하게는, 재구성된 용액은 하기 성분을 포함하는, 재구성된 용액:
(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제; (c) 0.4 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 50 mg/mL 수크로스, 약학적 조성물은 약 5.3의 pH를 가짐; 또는
(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 50 mM 히스티딘-아세트산 완충제; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 50 mg/mL 수크로스, 약학적 조성물은 약 5.3의 pH를 가짐; 또는
(a) 120 mg/mL 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (b) 20 mM 히스티딘-아세트산 완충제; (c) 0.8 mg/mL 폴리소르베이트 80; 및 (d) 120 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 약학적 조성물은 약 5.3의 pH를 가짐.
제조 물품(article of manufacture)으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제19항에 따른 동결건조된 제형, 또는 제20항에 따른 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는, 제조 물품.
면역 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 제19항에 따른 동결건조된 제형, 또는 제20항에 따른 재구성된 용액을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는, 면역 질환 또는 장애는 IL-4R-매개 질환 또는 장애이고; 더 바람직하게는, 면역 질환 또는 장애는 천식, 비용종(nasal polyps), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 알레르기성 피부 장애, 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 관절염(arthritis), 염증성 질환, 알레르기 반응, 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바렛 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵(tuberculosis), 및 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 가장 바람직하게는, 면역 질환 또는 장애는 천식 또는 알레르기성 피부 장애인, 방법.