CN118340881A - 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了包含抗IL‑5抗体的药物组合物及其用途。具体而言，本申请公开了一种药物组合物，其包含在缓冲液中的IL‑5抗体或其抗原结合片段。除此之外，该药物组合物还包含糖和非离子型表面活性剂。本公开中的药物组合物具备良好的稳定性。

Description

包含抗IL-5抗体的药物组合物及其用途
本申请是申请号为202080018182.9，申请日为2020年03月27日，发明名称为“包含抗IL-5抗体的药物组合物及其用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本公开属于药物制剂领域，具体涉及一种包含抗IL-5抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为IL-5相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。
背景技术
这里的陈述仅是提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
白细胞介素-5(IL-5)是白细胞介素家族的重要成员之一，又称为T细胞替代因子(T cell replacing factor，TRF)、B细胞生长因子-II(B cell growth factor-II，BCGF-II)、IgA增强因子(IgA-enhancing factor，IgA-EF)、酸性粒细胞分化因子(eosinophildifferentiation factor，EDF)，是一种主要由辅助性T细胞2(Th2)分泌的同二聚体糖蛋白。人的IL-5由134个氨基酸残基组成，包括由22个氨基酸组成的信号肽和2个糖基化位点。具有活性的IL-5呈现寡二聚体形式，两条肽链以二硫键连接，以反向平行的构型存在，而IL-5的单体则无生物学活性(Adv Im-munol.1994；57:145-90)。
嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)与肺部多种炎性疾病包括与过敏性反应有关的变应性病症有关。哮喘是一种慢性呼吸道炎症疾病，全球约有3亿患者，发病率为10％。其发病机制与多种细胞因子有关，IL-5及其受体IL-5R在哮喘的发病过程中扮演着重要的角色。目前对哮喘治疗最有效的方法是通过鼻腔或口腔给予固醇类药物来抑制哮喘中一些关键介质(包括IL-5)的表达，以减轻肺部炎症。然而长期使用固醇类药物具有很多副作用。因此，有必要寻找新的治疗哮喘的药物靶点。已有研究证明，使用抗IL-5的抗体抑制IL-5与其受体结合，可显著降低嗜酸性粒细胞在肺内的聚集，降低血液、组织、痰液中的嗜酸性粒细胞水平，并可减少嗜酸性粒细胞所介导的炎症反应，提高肺功能，对严重的嗜酸性粒细胞哮喘和复发性哮喘均具有很好的疗效(Drugs.2017May；77(7):777-784)。
抗体药物其分子量大，结构复杂，在生产、运输和储存的过程中经常会出现变性、聚集、污染和粒子形成的问题。为了保持抗体有效，抗体必须在生产、纯化、运输和储存期间维持其生物活性。目前，已开发出新的生产和纯化技术用于生产大量的高度纯化的单克隆抗体。然而，如何使这些抗体稳定以便运输和储存，并且提供适合于给药的剂型的抗体，一直是一个难题。
现有上市的抗IL-5抗体只有GSK公司的美泊利单抗(mepolizumab)和Teva Pharma公司的瑞利珠单抗(reslizumab)，相关专利有WO2018119016、WO2017033121、WO2014141149、WO2016040007、WO2015095539、WO2012138958、WO9535375等。
发明内容
本公开提供一种药物组合物，其包含IL-5抗体或其抗原结合片段、缓冲剂以及表面活性剂，所述缓冲剂选自醋酸-醋酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、组氨酸-盐酸盐和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂中的任一种，优选为醋酸-醋酸钠或琥珀酸-琥珀酸钠缓冲剂；其中所述的抗IL-5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(i)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17、18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、20、21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(ii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：22、23、24氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：25、26、27氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(iii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：28、29、30氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：31、32、33氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(iv)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：34、35、36氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：37、38、39氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(v)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：40、41、42氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：43、44、45氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(vi)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：34、82、36氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：37、38、39氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲剂的pH值为约5.0至约6.5，优选为约5.5至约6.5，优选为约6.0到约6.5，优选为约5.0至约6.0，优选为约5.5至约6.0，优选为约5.0至约5.5，优选为约5.0至约5.8，优选为大约5.2至约5.8；所述缓冲剂pH值的非限制的实施例包括约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.5，最优选为约5.5。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲剂浓度为大约10mM至约40mM，大约10mM至约30mM，优选为约15mM至约30mM，优选为约20mM至约30mM，优选为约25mM至约30mM，优选为约10mM至约25mM，优选为约15mM至约25mM，优选为约20mM至约25mM，优选为约10mM至约15mM；所述缓冲剂浓度的非限制性实施例包括为约10mM、约12mM、约14mM、约16mM、约18mM、约20mM、约22mM、约24mM、约26mM、约28mM、约30mM、约32mM、约34mM，最优选为约30mM。
在可选的实施方案中，药物组合物中所述抗IL-5抗体或其抗原结合片段的浓度为大约1mg/ml至约120mg/ml，优选为约1mg/ml至约100mg/ml，优选为约10mg/ml至约120mg/ml，优选为约20mg/ml至约120mg/ml，优选为约30mg/ml至约120mg/ml，优选为约40mg/ml至约120mg/ml，优选为约50mg/ml至约120mg/ml，优选为约60mg/ml至约120mg/ml，优选为约70mg/ml至约120mg/ml，优选为约80mg/ml至约120mg/ml，优选为约90mg/ml至约120mg/ml，优选为约100mg/ml至约120mg/ml，优选为约110mg/ml至约120mg/ml，优选为约20mg/ml至约100mg/ml，优选为约30mg/ml至约100mg/ml，优选为约40mg/ml至约100mg/ml，优选为约50mg/ml至约100mg/ml，优选为约60mg/ml至约100mg/ml，优选为约70mg/ml至约100mg/ml，优选为约80mg/ml至约100mg/ml，优选为约90mg/ml至约100mg/ml；作为非限制性实施例，所述抗IL-5抗体或其抗原结合片段浓度为约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约91mg/ml、约92mg/ml、约93mg/ml、约94mg/ml、约95mg/ml、约96mg/ml、约97mg/ml、约98mg/ml、约99mg/ml、约100mg/ml、约101mg/ml、约102mg/ml、约103mg/ml、约104mg/ml、约105mg/ml、约106mg/ml、约107mg/ml、约108mg/ml、约109mg/ml、约110mg/m、约115mg/m、约120mg/m，最优选为约100mg/ml。
在可选实施方案中，药物组合物中包含的表面活性剂可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。优选的表面活性剂是聚山梨醇醇酯80或聚山梨醇酯20，更优选为聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，药物组合物中聚山梨酯80的浓度为约0.05mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约0.1mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约0.2mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约0.3mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约0.4mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约0.5mg/ml至约0.6mg/ml，优选为约为0.2mg/ml至约0.5mg/ml，优选为约0.3mg/ml至约0.5mg/ml，优选为约0.4mg/ml至约0.5mg/ml，优选为约0.3mg/ml至约0.4mg/ml，作为非限制性实施例，所述药物组合物中表面活性剂的浓度约为0.2mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.45mg/ml、约0.5mg/ml、约0.55mg/ml、约0.6mg/ml，最优选为约0.4mg/ml。
进一步地，在可选的实施方案中，药物组合物还包括辅料，其中所述的辅料选自稳定剂。
在可选的实施方案中，其中所述的稳定剂选自糖或氨基酸；其中所述的糖可选自蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇，优选为蔗糖。其中所述的氨基酸选自甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。
在可选的实施方案中其中所述的糖的浓度为约50mg/ml至约80mg/ml，优选为约60mg/ml至约80mg/ml，优选为约70mg/ml至约80mg/ml，优选为约75mg/ml至约80mg/ml，优选为约70mg/ml-约75mg/ml；作为非限制性实施例，药物组合物中稳定剂的浓度为包括约70mg/ml、约71mg/ml、约72mg/ml、约73mg/ml、约74mg/ml、约75mg/ml、约76mg/ml、约77mg/ml、约78mg/ml、约79mg/ml、约80mg/ml，更优选为约72mg/ml。
在可选实施方案中，其中所述的氨基酸的浓度为约8mg/ml。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)约1mg/ml-约120mg/ml的抗IL-5抗体或其抗原结合片段；(b)约10mM-约30mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为约5.0-6.5；和(c)约0.1mg/ml-约0.6mg/ml聚山梨醇酯80。
在可选实施方案中，所述药物组合物包含：
(a)约80mg/ml-约100mg/ml的抗IL-5抗体或其抗原结合片段；(b)约10mM-约30mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为约5.0-约6.0和(c)约0.1mg/ml-约0.4mg/ml聚山梨醇酯80。
在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：
(d)约80mg/ml-约120mg/ml的IL-5抗体或其抗原结合片段；(e)约10mM-约30mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为约5.0-约5.8；(f)约0.2mg/ml-约0.6mg/ml聚山梨醇酯80；和(g)约70mg/ml-约75mg/ml蔗糖；优选地，所述药物组合物优选包含：
(h)约100mg/ml的IL-5抗体或其抗原结合片段，(i)约30mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为约5.5，(j)约0.4mg/ml的聚山梨醇酯80和(k)约72mg/ml的蔗糖。
在一些优选的实施方式中，本公开所述药物组合中的抗IL-5抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5人源化抗体含有SEQ ID NO：49、57、63、69或75所示的重链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：49、57、63、69或75所示的重链可变区序列上具有1-10个氨基酸回复突变。
在可选的实施方案中，所述的变体选自如下任一所示的变体：
(i)在SEQ ID NO：49所示的重链可变区上具有选自S49T，V93T和K98S中的一个或多个的氨基酸回复突变；
(ii)在SEQ ID NO：57所示的重链可变区上具有选自S49T,V93T和K98T中的一个或多个的氨基酸回复突变；
(iii)在SEQ ID NO：63所示的重链可变区上具有选自R38K，M48I，R67K，V68A，M70L，R72V，T74K和L83F中的一个或多个的氨基酸回复突变；
(iv)在SEQ ID NO：69所示的重链可变区上具有选自F29I，R38K，V48I，R72A，和T97F中的一个或多个的氨基酸回复突变和/或CDR中N55V突变；或
(v)在SEQ ID NO：75所示的重链可变区上具有选自R38K，M48I，R67K，V68A，R72A，T74K，M81L，L83F和D89E中的一个或多个的氨基酸回复突变。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5人源化抗体包含如SEQ ID NO：50或51所示的重链可变区；或
包含如SEQ ID NO：58或59所示的重链可变区；或
包含选自SEQ ID NO：64、65和66中任一个所示的重链可变区；或
包含如SEQ ID NO：70或71所示的重链可变区；或
包含选自SEQ ID NO：76、77、78和79中任一个所示的重链可变区。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5人源化抗体含有SEQ ID NO：46、54、60、67或72所示的轻链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：46、54、60、67或72所示的轻链可变区上具有1-10个氨基酸回复突变。
在可选的实施方案中，其中所述的变体选自如下任一所示的变体：
(i)在SEQ ID NO：46所示的轻链可变区上具有选自A43S，L47V，G66R，T69S，F71Y和Y87F中的一个或多个的氨基酸回复突变；
(ii)在SEQ ID NO：54所示的轻链可变区上具有选自A43S，L47M，F71Y和Y87F中的一个或多个的氨基酸回复突变；
(iii)在SEQ ID NO：60所示的轻链可变区上具有选自E1D，I2T，I57V，V84T和Y86F或其组合的氨基酸回复突变；
(iv)在SEQ ID NO：67所示的轻链可变区上具有选自M4L，A42S，L45P和L46W中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
(v)在SEQ ID NO：72所示的轻链可变区上具有选自A43S，I48V和F71Y中的一个或多个的氨基酸回复突变。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5人源化抗体包含如SEQ ID NO：47或48所示的轻链可变区；或
包含如SEQ ID NO：55或56所示的轻链可变区；或
包含如SEQ ID NO：61或62中所示的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO：68所示的轻链可变区；或
包含如SEQ ID NO：73或74所示的轻链可变区。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5人源化抗体包含：
(i)如SEQ ID NO：49、50、51中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区或和如SEQ ID NO：46、47、48中任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；
(ii)如SEQ ID NO：57、58、59中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区和如SEQ ID NO：54、55、56中任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；
(iii)如SEQ ID NO：63、64、65、66中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区和如SEQ ID NO：60、61、62中任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；
(iv)如SEQ ID NO：69、70、71中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区和如SEQ ID NO：67、68任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；或
(v)如SEQ ID NO：75、76、77、78、79中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区和如SEQ ID NO：72、73、74中任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；优选地，所述的抗IL-5人源化抗体包含：
(a)SEQ ID NO：51所示的重链可变区和SEQ ID NO：47所示的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO：65所示的重链可变区和SEQ ID NO：62所示的轻链可变区；
(c)SEQ ID NO：58所示的重链可变区和SEQ ID NO：56所示的轻链可变区；
(d)SEQ ID NO：71所示的重链可变区和SEQ ID NO：68所示的轻链可变区；或
(e)SEQ ID NO：79所示的重链可变区和SEQ ID NO：73所示的轻链可变区。
上述具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，优选地，其具有至少95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性，更优选地，其具有97％、98％或99％以上，最优选的具有至少99％以上序列一致性，上述具有至少95％序列同一性的氨基酸序列包括通过一个或者多个氨基酸缺失、插入或替换突变获得。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5抗体包括人抗体恒定区，优选包含SEQ ID NO：52所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：53所示的人抗体轻链恒定区。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5抗体包含：
(i)SEQ ID NO：83所示的重链和SEQ ID NO：84所示的轻链；
(ii)SEQ ID NO：85所示的重链和SEQ ID NO：86所示的轻链；
(iii)SEQ ID NO：87所示的重链和SEQ ID NO：88所示的轻链；
(iv)SEQ ID NO：89所示的重链和SEQ ID NO：90所示的轻链；或
(v)SEQ ID NO：91所示的重链和SEQ ID NO：92所示的轻链。
在可选的实施方案中，所述药物组合物中的抗IL-5抗体是一种与上述的抗IL-5抗体或其抗原结合片段竞争结合IL-5的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一种优选的实施方式中，本公开药物组合物中所述的抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。
本公开还提供制备前述药物组合物的方法，其中包括将抗IL-5抗体原液经缓冲液置换的步骤。在可选的实施方案中，所述缓冲液优选醋酸-醋酸钠缓冲剂。所述缓冲剂的pH值为约5.0到约6.5，优选约5.5至约6.5，优选约6.0至约6.5，优选约5.0至约6.0，优选约5.5至约6.0，优选约5.0至约5.5，优选为约5.2至约5.8，所述缓冲剂pH值的非限制的实施例包括约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.5，最优选约5.5。在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲剂浓度为约10mM至约30mM，优选为约15mM至约30mM，优选为约20mM至约30mM，优选为约25mM至约30mM，优选为约5mM至约25mM，优选为约10mM至约25mM，优选为约15mM至约25mM，优选为约20mM至约25mM，优选为约5mM至约20mM，优选为约10mM至约15mM；所述缓冲剂浓度的非限制性实施例包括约10mM、约12mM、约14mM、约16mM、约18mM、约20mM、约22mM、约24mM、约26mM、约28mM、约30mM，最优选为约30mM。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠，pH5.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠，pH5.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH6.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH5.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH6.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH6.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH5.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH6.0和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH6.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM枸橼酸-枸橼酸钠，pH5.5和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM组氨酸-盐酸，pH6.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM组氨酸-盐酸，pH6.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM组氨酸-盐酸，pH5.5和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM组氨酸-盐酸，pH6.0和0.05mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0和0.1mg/mL聚山梨醇酯20。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，50mg/mL蔗糖和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，50mg/mL海藻糖和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，50mg/mL甘露醇和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，50mg/mL山梨醇和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，8mg/mL甘氨酸和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，8mg/mL甲硫氨酸和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.0，8mg/mL脯氨酸和0.1mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.5，70mg/mL蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：80mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.8和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.4和0.6mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：80mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.4和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：80mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.4和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：80mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.8和0.6mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：120mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.0和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：80mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.0和0.6mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：120mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.8和0.6mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：120mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.4和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.4和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：120mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.0和0.6mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：120mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.8和0.2mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.0和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.8和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，10mM醋酸-醋酸钠pH5.5,70mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，20mM醋酸-醋酸钠pH5.5,70mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，30mM醋酸-醋酸钠pH5.5,70mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，30mM醋酸-醋酸钠pH5.5,73mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含：100mg/ml的抗IL-5抗体h1705-008，30mM醋酸-醋酸钠pH5.5，75mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，本公开中的药物组合物于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在25℃可稳定存在至少3个月，至少6个月。
本公开还提供一种制备包含抗IL-5抗体的冻干制剂的方法，其中包括将前述药物组合物经冷冻干燥的步骤。
在可选的实施方案中，制备包含抗IL-5抗体的冻干制剂的方法中所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。通过冷冻制剂和随后在适于一次干燥的温度使水升华，进行冷冻干燥。在此条件下，产物温度低于制剂的低共熔点或分解温度。在通常约50-250毫托范围的合适压力下，通常，一次干燥的存放温度范围为约-30至25℃(假设产物在一次干燥过程中保持冷冻)。制剂、容纳样品的容器(例如，玻璃小瓶)的大小和类型以及液体的体积决定了干燥所需的时间，所述时间的范围可为几小时至几天(例如40-60小时)。二次干燥阶段可在约0-40℃进行，这主要取决于容器的类型和大小以及采用的蛋白的类型。二次干燥时间由产物中的期望残余湿度水平决定，通常需要至少约5小时。通常，低压冻干的制剂的含水量小于约5％，优选小于约3％。压力可与在一次干燥步骤中应用的压力相同，优选的，二次干燥的压力低于一次干燥。冷冻干燥条件可以随制剂和小瓶大小而变化。
本公开还提供一种经前述制备包含抗IL-5抗体的冻干制剂的方法制备的含IL-5抗体的冻干制剂。
在一些实施方案中，该冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本公开还提供制备含有抗IL-5抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法，其中包括将前述冻干制剂经复溶的步骤，其复溶所用溶液包括但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液。
本公开还提供一种经前述含有抗IL-5抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法制备的含有IL-5抗体的冻干制剂的复溶溶液。
本公开进一步提供一种制品或试剂盒，其包含装有本文所述任何稳定的药物组合物的容器。在一些实施方案中，该容器为中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。
本公开还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液。
本公开还提供一种治疗IL-5介导的疾病的方法，所述方法包括向此有需要的受试者施用治疗有效量的如前所述的药物组合物或冻干制剂或复溶溶液或制品，其中所述的IL-5介导的疾病优选哮喘、慢性肺炎、过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位或类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎。
本公开还提供前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液或制品在制备治疗IL-5介导的疾病的药物中的用途，其中所述的IL-5介导的疾病优选哮喘、慢性肺炎、过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位或类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎。
本公开还提供用作治疗药物的前述药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液或制品，其中所述的药物用于治疗IL-5介导的疾病，其中所述的IL-5介导的疾病优选哮喘、慢性肺炎、过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位或类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎。
如本领域技术人员所熟知的，本公开中所述各个实施方案的一项、一些或所有特性可以进一步组合以形成本公开的其它实施方案。本公开的以上实施方案和通过组合得到的其他实施方案通过下面的详述进一步说明。
附图说明
图1显示抗IL-5抗体阻断IL-5结合IL-5受体的FACS实验结果；
图2显示抗IL-5抗体与Th2细胞因子的结合特异性检测结果；
图3显示抗IL-5抗体增强呼吸间歇值(Penh)水平。G1：正常对照组(PBS)；G2：模型组(IgG)；G3：h1705-008抗体10mpk组；G4：h1705-008抗体2mpk组；G5：h1706-009抗体10mpk组；G6：h1706-009抗体2mpk组；G7：Hu39D1010mpk组；其中，*p<0.05，**<0.01(通过ANOVA/Bonferroni与G2组进行比较)；
图4A显示哮喘小鼠肺部BALF嗜酸性粒细胞水平；图4B显示哮喘小鼠气管粘膜厚度评分。G1：正常对照组；G2：模型组；G3：h1705-008抗体10mpk组；
G4：h1705-008抗体2mpk组；G5：h1706-009抗体10mpk组；G6：h1706-009抗体2mpk组；G7：Hu39D10 10mpk组；图4C显示哮喘小鼠肺部BALF嗜酸性粒细胞百分比；
图5A和图5B显示IL5单抗降低BALF中嗜酸性粒细胞水平的能力。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲剂。将pH控制在适当范围中的缓冲剂的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸盐、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲剂。
“组氨酸盐缓冲剂”是包含组氨酸根离子的缓冲剂。组氨酸盐缓冲剂的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲剂，优选组氨酸-醋酸盐缓冲剂或组氨酸-盐酸盐缓冲剂，组氨酸-醋酸盐缓冲剂是组氨酸与醋酸配制而成，组氨酸盐缓冲剂是组氨酸与盐酸配制而成。
“枸橼酸盐缓冲剂”是包括枸橼酸根离子的缓冲剂。枸橼酸盐缓冲剂的实例包括枸橼酸-枸橼酸钠、枸橼酸-枸橼酸钾、枸橼酸-枸橼酸钙、枸橼酸-枸橼酸镁等。优选的枸橼酸盐缓冲剂是枸橼酸-枸橼酸钠。
“琥珀酸盐缓冲剂”是包括琥珀酸根离子的缓冲剂。琥珀酸盐缓冲剂的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲剂是琥珀酸-琥珀酸钠。
“磷酸盐缓冲剂”是包括磷酸根离子的缓冲剂。磷酸盐缓冲剂的实例包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸氢二钠-枸橼酸等。优选的磷酸盐缓冲剂是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。
“醋酸盐缓冲剂”是包括醋酸根离子的缓冲剂。醋酸盐缓冲剂的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲剂是醋酸-醋酸钠。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本文中，“药物组合物”和“制剂”在本文中可互换使用。
本公开的“糖”包含常规(CH2O)n及其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原性糖，非还原性糖等。可选自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，木糖醇l，山梨糖醇，甘露醇，密里二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水苏糖，麦芽糖，乳果糖，麦芽酮糖，山梨醇，麦芽糖醇，乳糖醇，异-麦芽酮糖等。优选的糖为非还原性二糖，更优选为蔗糖。
本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
本公开的冷冻干燥包括预冻，一次干燥，二次干燥。预冻目的是冷冻产品，获得结晶固体。预冻温度和预冻速度是两个重要工艺参数，本公开中将预冻温度设定为-45℃，预冻速度设定为1℃/min。一次干燥也称为主干燥，是样品冷冻干燥的主要阶段。目的是移除产品里冰的同时，保持产品形状，最小程度的减少对产品的破坏。若一次干燥的温度和真空度选择不当，会导致制品的塌陷。较高的温度和真空度均会加快冻干效率，但同时也会增加制品塌陷的风险。本发明所述一次干燥的温度可为本领域常规的温度，例如-30℃-0℃。二次干燥也称为解析干燥，是通过抽极限真空(0.01mbar)和升高温度(20-40℃)除去制品中结合水的主要步骤。由于大多数生物制品对温度比较敏感，所以二次干燥温度选择在温度范围的低点，即25℃。冷冻干燥的时间与冷冻机，冻干制剂剂量，冻干药剂的容器有关。这种时间的调整是在本领域技术人员所熟知的。
本文所用术语“约”、“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多±20％的范围，例如，约5.5的pH意指pH5.5±1.1。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该为在该具体值的可接受误差范围内。
本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到物理、和/或化学、和/或生物学活性显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的制剂：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是淡黄色近无色澄明液体或者无色，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的减少。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测定，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。
在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR，VL)和重链可变区(HCVR，VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
本公开中所述的“抗体的抗原结合片段”或“功能片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及与抗体结合的Fv片段scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chainantibody)或单链Fv(sFv)。
本公开的术语“抗原结合位点”指抗原上连续或不连续的，由本公开抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人IL-5的单克隆抗体。制备时用IL-5抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的IL-5嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的IL-5嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
本公开中所述的“ADCC”，即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合体，IgG4的F234A/L235A突变。
本公开中所述的突变序列中的“突变”包括但不限于“回复突变”、“保守修饰”或“保守置换或取代”。本公开中所述的“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
本公开所述的“突变序列”是指对本公开的核苷酸序列和/或氨基酸序列进行适当的替换、插入或缺失等突变修饰情况下，得到的与本公开的核苷酸序列和/或氨基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和/或氨基酸序列。本公开中所述的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For BiotechnologyInstitute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。
术语“与IL-5结合”，指能与IL-5，优选人IL-5相互作用。
术语“抗IL-5抗体”与“IL-5抗体”可互换使用，均为与IL-5结合的抗体。
本公开中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组，将得到的两个基因共表达的蛋白产物。重组IL-5胞外区Fc融合蛋白是通过DNA重组，把IL-5胞外区和人抗体Fc片段共表达的融合蛋白。所述的IL-5胞外区，是指IL-5蛋白表达在细胞膜以外的部分，序列见SEQ ID NO:1。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港实验室出版的《抗体实验技术指南》第5-8章和15章。小鼠可以用人IL-5或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人IL-5特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲剂的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链CDR区”意味着特定序列的抗体重链CDR区可以但不必须存在。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
对与IL-5相关的疾病没有限制，只要它是与IL-5相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类IL-5然后阻遏或抑制嗜酸性粒细胞刺激作用而产生。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的药物组合物对这样一些人是非常有用的，他们患有变态和/或特应性反应，或与嗜酸性粒细胞有关的反应，例如但不限于，哮喘、哮喘恶化、哮喘恶性发作、慢性肺炎、过敏性鼻炎、常年过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位、类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎等。在优选的实施方案中，这种治疗能抑制或减轻嗜酸性细胞的肺组织浸润。药物组合物给予的次数可以从每日三次到每6个月一次，给予的途径可以是静脉、皮下、肌肉、胃肠外或局部途径。
本公开制剂可用于治疗IL-5介导的疾病。例如，但不限于抑制或减轻IL-5介导的炎症反应和嗜酸性细胞在体内外的成熟、活化、脱颗粒或组织浸润；抑制IL-5引起的平滑肌的过度应激；降低IL-5在肺、气道或血液中的水平。优选地，本公开制剂可用于治疗IL-5介导的疾病，优选地，所述IL-5介导的疾病选自哮喘、慢性肺炎、过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位或类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“置换”是指溶解抗体蛋白的溶剂体系的置换，例如，使用稳定制剂的缓冲体系经物理操作方式将含抗体蛋白的高盐或高渗溶剂体系置换，从而使抗体蛋白存在于稳定制剂中。所称物理操作方式包括但不限于超滤、透析或离心后复溶。
实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非是对本公开范围的限制。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如参照冷泉港实验室出版的《抗体技术实验手册》，《分子克隆手册》；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.IL-5抗原及检测用蛋白的制备
1.1IL-5抗原设计及表达
编码带His标签的人IL-5，恒河猴IL-5，小鼠IL-5，大鼠IL-5，含人IgG1-Fc片段的人IL-5Rα受体胞外区融合蛋白序列克隆至phr载体上，构建成表达质粒，然后转染HEK293。待转染第6天，取样，4500rpm离心10min收集细胞上清，将含重组的IL-5和IL-5α受体蛋白上清利用镍柱进行纯化，重组的人IL-5-Fc融合蛋白利用Protein A亲和层析柱进行纯化。纯化的蛋白可用于后续实验中。具体抗原的蛋白序列如下：
带his标签的人IL-5氨基酸序列(rhIL-5-his)
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES
注释：斜体部分为His6-tag标记
SEQ ID NO：1
带his标签的食蟹猴IL-5氨基酸序列
MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPASALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIGGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES
SEQ ID NO：2
注释：斜体部分为His6-tag标记。
带his标签的小鼠IL-5氨基酸序列
MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG
SEQ ID NO：3
注释：斜体部分为His6-tag标记。
带his标签的大鼠IL-5氨基酸序列
MEIPMSTVVKETLIQLSTHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEILFQNLSLIKKYIDGQKEKCGEERRKTRHFLDYLQEFLGVMSTEWAMEV
SEQ ID NO：4
注释：斜体部分为His6-tag标记。
融合人Fc片段的人IL-5α受体氨基酸序列
DLLPDEKISLLPPVNFTIKVTGLAQVLLQWKPNPDQEQRNVNLEYQVKINAPKEDDYETRITESKCVT ILHKGFSASVRTILQNDHSLLASSWASAELHAPPGSPGTSIVNLTCTTNTTEDNYSRLRSYQVSLHCTWLVGTDAP EDTQYFLYYRYGSWTEECQEYSKDTLGRNIACWFPRTFILSKGRDWLAVLVNGSSKHSAIRPFDQLFALHAIDQIN PPLNVTAEIEGTRLSIQWEKPVSAFPIHCFDYEVKIHNTRNGYLQIEKLMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMC REAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWIEGRMD
SEQ ID NO：5
注释：斜体部分为人IgG1-Fc标签。
实施例2.重组IL-5α受体和IL-5α/β受体细胞系的构建和鉴定
为筛选有功能的抗体，本公开构建了表达IL-5α的CHO-S/IL-5α细胞株，以及同时表达IL-5α和IL-5β的CHO-S/IL-5α/IL-5β细胞株
具体为将人IL-5α全长基因(Q01344)克隆到哺乳动物细胞表达载体pTargeT上，将线性化质粒电转染至CHO-S细胞中，经G418筛选2周，再进行2次有限稀释。通过FACS检测细胞表面的IL-5α基因，挑选出IL-5α表达量高的CHO-S/IL-5α细胞株，在此基础上电转染线性化的pcDNA3.1-IL-5β，经G418和zeocin筛选2周，再进行2次有限稀释，通过FACS检测细胞表面的IL-5α和IL-5β基因，挑选出IL-5α和IL-5β表达量高的CHO-S/IL-5α/IL-5β细胞株。
实施例3.抗人IL-5鼠源单克隆抗体的制备
用重组蛋白rhIL-5-his和弗氏佐剂CFA(Sigma，Lot#SLBQ1109V)、IFA(Sigma，Lot#SLBJ2845V)高低两个剂量100g/50g/50g和25g/12.5g/12.5g分别免疫两组Balb/c(5只/组)小鼠，四组SJL(5只/组)小鼠。IL-5的特异性免疫反应由检测血清效价的ELISA，配体受体阻断实验和TF-1增殖抑制实验来测定。选取有较好特异性免疫反应的小鼠，处死后，取脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。
初次筛选用针对人IL-5的ELISA结合实验进行。当将杂交瘤细胞转移到24孔板后，用针对人、食蟹猴、小鼠IL-5的ELISA结合实验，基于ELISA的针对IL-5的受体阻断实验和TF-1增殖抑制实验，对其上清进行复筛。筛选出的阳性克隆经过两轮亚克隆后，得到杂交瘤克隆，用于抗体生产，并通过亲和层析方法纯化。
纯化后的抗体分别进行SEC-HPLC，内毒素含量检测，biacore测定对各种属IL-5的亲和力，基于FACS的针对IL-5的受体阻断实验，和TF-1增殖抑制实验，嗜酸性粒细胞的粘附实验，以及小鼠哮喘模型和豚鼠体内中和模型上的药效评价，筛选出体内外活性好的单克隆杂交瘤细胞株mAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773和mAb1779。
从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下：收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序。得到mAb1705和mAb1706，mAb1780，mAb1773，mAb1779的重链和轻链可变区DNA序列对应的氨基酸序列(VH/VL CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释)。
mAb1705鼠源重链可变区序列
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO：6
mAb1705鼠源轻链可变区序列
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLQDKEFPRTFGGGTRLELK
SEQ ID NO：7
mAb1706鼠源重链可变区序列
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATETLRESLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO：8
mAb1706鼠源轻链可变区序列
DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSASNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQHKQFPRTFGGGTKLELK
SEQ ID NO：9
mAb1780鼠源重链可变区序列
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVKQSQGRSLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKFSSTAYMEFRRLTFEDSAIYYCARDGGYSDPLDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO：10
mAb1780鼠源轻链可变区序列
DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQQPKLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK
SEQ ID NO：11
mAb1773鼠源重链可变区序列
EVQLQQSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKHGPKFQGKATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIYYCFRYGIYPDHWGQGTPLTVSS
SEQ ID NO：12
mAb1773鼠源轻链可变区序列
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTATLASGVPARFSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE
SEQ ID NO：13
mAb1779鼠源重链可变区序列
QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATLTADKSSSTAYLEFSRVTSEDSAIYYCGRRIAWDHWYFDFWGPGTMVTVSS
SEQ ID NO：14
mAb1779鼠源轻链可变区序列
DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDVAWYQQKSGRSPQLLVYAASRLQ DGVPSRFSGSGSGTRYFFKISGMQPEDEADYFCQQGYKTPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO：15
其中各抗体轻重链中CDR序列如表1所示。
表1.各抗体重链及轻链CDR区序列
其Biacore活性检测结果见表2。
表2.IL-5鼠源抗体的体外活性
结果显示，本公开中的鼠源抗体与抗原亲和力高。
实施例4.IL-5相关重组蛋白的纯化，以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
4.1IL-5-Flag-His重组蛋白的纯化步骤：
将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。利用PBS平衡NI-NTA亲和柱(QIAGEN，Cat No.30721)，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。依次用洗涤缓冲液(咪唑20mM)和洗脱缓冲液(咪唑300mM)洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱液用离子交换(Hiload 16/600superdex 200柱)进一步纯化。用PBS平衡2个柱体积左右，保证pH7.4。将鉴定含目的蛋白的洗脱缓冲液浓缩后上样，收集样品，SDS-PAGE和LC-MS鉴定为正确后分装备用。
4.2杂交瘤表达抗体，Fc融合蛋白的纯化
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，杂交瘤表达上清用Protein G柱，Fc融合蛋白表达上清用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，去聚体的峰收集好后分装备用。
实施例5.抗人IL-5单克隆抗体的人源化设计
鼠源抗人IL-5单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，鼠源抗体的恒定区替换为人恒定区，且将鼠源抗体的CDR移植到FR同源性最高人源模板上，并对FR区的氨基酸进行回复突变。
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，分别挑选与mAb-1705，mAb-1706，mAb1780，mAb1773和mAb1779抗体氨基酸序列同一性高的重链和轻链可变区种系作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
人源FR区的选择和氨基酸的回复突变
在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，从人源种系数据库中搜索轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的同源序列，按FR的同源性由高到低排序，选取FR同源性最高的种系作为主要模板，将鼠源抗体的CDR区移植到人源模板上，然后对FR的残基进行突变，并对氨基酸残基优化，得到最终的人源化分子。
5.1杂交瘤克隆mAb1705号人源化构架选择
h1705的VH选取IGHV3-23*04作为模板，VL选取IGKV1-12*01作为模板，将mAb1705的CDR移植到人源模板上，并通过软件找出包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基并回复突变，得到源化抗体不同的轻链和重链可变区，如表3所示。
表3.h1705的模板选择和回复突变设计
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将grafted的第43位A突变回S。
表4.h1705人源化抗体重轻链可变区相互组合表
h1705_VH.1 h1705_VH.1A h1705_VH.1B
h1705_VL.1 h1705-003 h1705-004 h1705-005
h1705_VL.1A h1705-006 h1705-007 h1705-008
h1705_VL.1B h1705-009 h1705-010 h1705-011
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1705-007表示，人源化的鼠抗体h1705-007含轻链h1705_VL.1A、重链h1705_VH.1A两种突变体，其它类推。
h1705号人源化抗体可变区具体序列如下：
>h1705_VL.1(SEQ ID NO：46)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
>h1705_VL.1A(SEQ ID NO：47)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
>h1705_VL.1B(SEQ ID NO：48)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
>h1705_VH.1(SEQ ID NO：49)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTLRESFDY
WGQGTLVTVSS
>h1705_VH.1A(SEQ ID NO：50)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
>h1705_VH.1B(SEQ ID NO：51)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
将上述轻链可变区与轻链恒定区序列组合形成轻链序列，将各重链可变区与重链恒定区组合形成重链序列。示例性的人源化抗体恒定区序列如下所示：
>重链IgG1恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：52
注：下划线为M252Y、S254T、T256E突变
>轻链kappa恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：53
5.2杂交瘤克隆mAb1706号人源化构架选择
h1706的VH选取了IGHV3-23*04作为模板，VL选取了IGKV1-12*01作为模板，将鼠源抗体mab1706的CDR区移植到选择的人源化模板上，并FR氨基酸进行回复突变，得到人源化抗体轻链和重链可变区，如表5所示。
表5.h1706的模板选择和回复突变设计
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区。如A43S表示依照氨基酸序列的自然顺序编号，将grafted的第43位A突变回S。
将设计的人源化分子按下表组合成不同的抗体，如表6所示。
表6.h1706人源化抗体重轻链可变区相互组合表
h1706_VH.1 h1706_VH.1A h1706_VH.1B
h1706_VL.1 h1706-002 h1706-003 h1706-004
h1706_VL.1A h1706-005 h1706-006 h1706-007
h1706_VL.1B h1706-008 h1706-009 h1706-010
h1706号人源化抗体可变区具体序列如下：
>h1706_VL.1(SEQ ID NO：54)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VL.1A(SEQ ID NO：55)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VL.1B(SEQ ID NO：56)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
>h1706_VH.1(SEQ ID NO：57)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETLRESLDYWGQGTMVTVSS
>h1706_VH.1A(SEQ ID NO：58)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
>h1706_VH.1B(SEQ ID NO：59)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSINYEGNSAYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
将上述轻链可变区与轻链恒定区序列组合形成轻链序列。将各重链可变区与重链恒定区组合形成重链序列。
5.3杂交瘤克隆mAb 1780号人源化构架选择
h1780的VH选取了IGHV1-2*02作为模板，VL选取了IGKV3-11*01作为模板，将鼠源抗体mAb1780的CDR区移植到选择的人源化模板上，并对FR区氨基酸进行复突变，得到人源化抗体轻链和重链可变区，如表7所示。
表7.h1780的模板选择和回复突变设计
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区。如E1D表示依照氨基酸序列的自然顺序编号，将grafted的第1位E突变回D。
将设计的人源化分子按下表组合成不同的分子，如表8所示。
表8 h1780人源化抗体重轻链可变区相互组合表
h1780_VH.1 h1780_VH.1A h1780_VH.1B h1780_VH.1C
h1780_VL.1 h1780-007 h1780-008 h1780-009 h1780-010
h1780_VL.1A h1780-011 h1780-012 h1780-013 h1780-014
h1780_VL.1B h1780-015 h1780-016 h1780-017 h1780-018
h1780号人源化抗体可变区具体序列如下：
>h1780_VL.1(SEQ ID NO：60)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPA
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VL.1A(SEQ ID NO：61)
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VL.1B(SEQ ID NO：62)
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
>h1780_VH.1(SEQ ID NO：63)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1A(SEQ ID NO：64)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1B(SEQ ID NO：65)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
>h1780_VH.1C(SEQ ID NO：66)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVKQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSKATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
将上述轻链可变区与轻链恒定区序列组合形成轻链序列。将各重链可变区与重链恒定区组合形成重链序列。
5.4杂交瘤克隆mAb1773号人源化构架选择
h1773的VH选取了IGHV3-73*01作为模板，VL选取了IGKV1-39*01作为模板，将鼠源抗体mab1773的CDR区移植到选择的人源化模板上，并进行回复突变，得到人源化抗体的轻链和重链可变区，如表9所示。同时，将h1773的HCDR2(RIDPANGDTK HGPKFQG)中N突变为V(即N55V)，形成HCDR2突变(突变后的HCDR2序列为SEQ ID NO:82：RIDPAVGDTKHGPKFQG)的重链可变区。
表9.h1773的模板选择和回复突变设计
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区。如M4L表示依照氨基酸序列的自然顺序编号，将grafted的第4位M突变回L。
将设计的人源化分子按下表组合成不同的分子，如表10所示。
表10.h1773人源化抗体重轻链可变区相互组合表
h1773_VH.1 h1773_VH.1A h1773_VH.1B
h1773_VL.1 h1773-002 h1773-003 h1773-004
h1773_VL.1A h1773-005 h1773-006 h1773-007
h1773号人源化抗体可变区具体序列如下：
>h1773_VL.1(SEQ ID NO：67)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKAPKLLIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
>h1773_VL.1A(SEQ ID NO：68)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
>h1773_VH.1(SEQ ID NO：69)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRYGIYPDHW
GQGTLVTVSS
>h1773_VH.1A(SEQ ID NO：70)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWG
QGTLVTVSS
>h1773_VH.1B(SEQ ID NO：71)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
将上述轻链可变区与如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区序列组合形成最终的完整重轻链序列。将各重链可变区与如SEQ ID NO:52所示的重链恒定区组合形成最终的各重链序列。
5.5杂交瘤克隆mAb1779号人源化构架选择
h1779的VH选取了IGHV1-2*02作为模板，VL选取了IGKV1-33*01作为模板，将鼠源抗体h1779的CDR区移植到选择的人源化模板上，并进行回复突变，得到人源化抗体的轻链和重链可变区，如表11所示。
表11.h1779的模板选择和回复突变设计
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区。如A43S表示依照氨基酸序列的自然顺序编号，将grafted的第43位A突变回S。
将设计的人源化分子按下表组合成不同的分子，如表12所示。
表12.h1779人源化抗体重轻链可变区相互组合表
h1779_VH.1 h1779_VH.1A h1779_VH.1B h1779_VH.1C h1779_VH.1D
h1779_VL.1 h1779-005 h1779-006 h1779-007 h1779-008 h1779-009
h1779_VL.1A h1779-010 h1779-011 h1779-012 h1779-013 h1779-014
h1779_VL.1B h1779-015 h1779-016 h1779-017 h1779-018 h1779-019
h1779号人源化抗体可变区具体序列如下：
>h1779_VL.1(SEQ ID NO：72)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VL.1A(SEQ ID NO：73)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VL.1B(SEQ ID NO：74)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
>h1779_VH.1(SEQ ID NO：75)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1A(SEQ ID NO：76)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNENFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1B(SEQ ID NO：77)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1C(SEQ ID NO：78)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
>h1779_VH.1D(SEQ ID NO：79)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
将上述轻链可变区与如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区序列组合形成轻链序列。将各重链可变区与如SEQ ID NO:52所示的重链恒定区组合形成重链序列。
示例性的人源化抗体全长序列如下：
h1705-008重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：83
h1705-008轻链：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：84
h1706-009重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：85
h1706-009轻链：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：86
h1780-017重链：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNEKFKSRAT LTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：87
h1780-017轻链：
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：88
h1773-007重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGPKFQGRFT ISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：89
h1773-007轻链：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：90
h1779-014重链：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNENFKRKAT MTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：91
h1779-014轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRFSGSGSGT DYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：92
本公开将WO2012083370A1中针对IL5的抗体Hu39D10作为阳性对照，其重链和轻链序列分别如SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示。
Hu39D10的重链序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSAIKSRFTI SRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：80
Hu39D10的轻链序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSAT DYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：81
实施例6.重组嵌合抗体以及人源化抗体的制备
1.重组嵌合抗体的分子克隆
杂交瘤筛选所获得的阳性抗体分子经过测序后，得到可变区编码基因序列。以测序所得序列设计首尾引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建重组嵌合抗体全长表达质粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr，得到Ch1705、Ch1706、Ch1780、Ch1773和Ch1779五个嵌合抗体。
2.人源化抗体的分子克隆
人源化抗体序列，经过密码子优化后得到人密码子偏好的编码基因序列，设计引物PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建人源化抗体全长表达质粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr。
3.重组嵌合抗体以及人源化抗体的表达与纯化
分别表达抗体轻重链的质粒，转染HEK293E细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。
以下用测试方法验证本公开抗体性能及有益效果。
体外活性生物学评价
测试例1.Biacore测定鼠源IL-5抗体与不同种属IL-5的结合
用Biacore T200(GE)仪器测定待测鼠源IL-5抗体和人IL-5的亲和力。
用Protein A生物传感芯片亲和捕获待测分子，然后于芯片表面流经抗原(实施例1制备所得的重组人，猴IL-5)，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，如表13所示。
表13.IL-5鼠源抗体与不同种属IL-5亲和力的BIAcore检测结果
本实施例证明，本公开的抗体mAb1705、mAb1706、mAb1780、mAb1773和mAb1779与不同种属(人、猴)的IL-5均有较高的亲和力。
测试例2.Biacore测定IL-5人源化抗体与不同种属IL-5的亲和力
用Biacore T200(GE)仪器测定待测人源化IL-5抗体和人IL-5的亲和力。
用Protein A生物传感芯片亲和捕获待测分子，然后于芯片表面流经抗原(实施例1制备所得)，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，如表14所示。
表14.IL-5人源化抗体与人IL-5亲和力的BIAcore检测结果
抗体 KD(M) 抗体 KD(M)
h1705-003 3.35E-09 h1706-003 1.89E-11
h1705-006 4.11E-09 h1706-006 1.73E-11
h1705-009 4.55E-09 h1706-009 5.45E-11
h1705-004 2.14E-11 h1780-017 7.78E-11
h1705-007 2.21E-11 h1773-007 2.07E-10
h1705-010 2.05E-11 h1779-014 4.12E-10
h1705-005 2.16E-11
h1705-008 3.42E-11
h1705-011 2.30E-11
结果显示，人源化IL-5抗体与人IL-5均具有较高的亲和力。
测试例3.基于ELISA的鼠源IL-5抗体阻断IL-5结合IL-5α受体实验
为鉴定IL-5抗体阻断IL-5结合到重组表达的IL-5α受体蛋白胞外区的能力，将IL-5(5μg/ml in PBS)包被ELISA板，37℃孵育1小时，弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4PBS含0.05％ Tween-20)洗板5次后，先加入25μl用生物素标记试剂盒(东仁化学，LK03)标记的10μg/ml的IL-5Rα(in 1％BSA)，再加入25μl梯度稀释的抗体，抗体和IL-5Rα竞争结合IL-5，37℃孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液以1:600浓度稀释的Streptavidin-Peroxidase Polymer(Sigma，S2438-250UG)于37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算IL-5抗体阻断IL-5与IL-5Rα结合的IC50值，结果如表15所示，本公开抗体均可有效抑制IL-5与其受体的结合。
表15.鼠源IL-5抗体阻断IL-5结合IL-5α受体的ELISA检测结果
mAb1705 mAb1706
IC50(μg/ml) 0.42 0.40
测试例4.基于FACS的IL-5抗体阻断IL-5结合IL-5受体实验
为了鉴定筛选到的IL-5抗体可以阻断细胞表面的IL-5受体，构建了高表达IL-5Rα/β的两种受体的CHOS重组细胞系。本实验鉴定IL-5抗体可以分别阻断IL-5结合到CHOS细胞系表面的重组IL-5α/β受体。
具体方法：用含100ng/ml G418,25ng/ml zeozin的CD-CHO来培养CHO-S-IL-5Rα和β，细胞培养过程中，浓度不要超过3×106细胞/ml。将状态良好的IL-5Rα/β-CHOS细胞离心(1000rpm，5min)，用10％FBS的PBS洗一遍，并且计数，将细胞浓度调整浓度至4×106细胞/ml,取25μl加入到圆底的96孔板中。用含10％ FBS的PBS溶液稀释待测抗体，初始浓度为200μg/ml，按1:10倍比稀释8个梯度。将25μl 100ng/ml的用生物素标记试剂盒(东仁化学，LK03)标记的IL-5和50μl稀释的各浓度抗体混合均匀，加到已加入细胞的96孔板中，在4℃孵育1小时。孵育结束后，4℃离心(400g，5min)，弃掉上清，用200μl的预冷PBS离心洗涤，重复两次后加入1:1333稀释的PE-Avidin二抗，4℃避光孵育40min后，4℃离心(400g，5min，弃掉上清，加入200μl的预冷PBS，吹起细胞，4℃离心洗涤，重复三次，加入100μl PBS，上机读板，根据荧光信号值计算IL-5抗体阻断IL-5与IL-5Rα/β结合的IC50值。结果如表16和图1所示。
表16.IL-5抗体阻断IL-5与IL-5Rα/β结合的检测结果
抗体 IgG hu39D10 h1705-008 h1706-009 h1780-017 h1779-014
IC50(ng/ml) 8777 25.07 14.51 24.74 16 49.64
结果显示，抗体h1705-008、h1706-009、h1780-017、h1779-014显示出较强的阻断IL-5结合到细胞表面IL-5受体的能力。
测试例5.IL-5抗体抑制IL-5诱导的TF1细胞增殖实验
IL-5可以诱导TF-1细胞增殖，IL-5抗体可以阻止IL-5对TF-1细胞的刺激增殖作用。
具体为：TF-1细胞(ATCC,CRL-2003)培养于10％FBS以及2ng/mL rhGM-CSF(联科生物,Catalog No.96-AF-300-03-20)的RPMI1640，放置与37℃，5％ CO2培养箱中，细胞密度不超过1×106个/ml。检测抗体时，取对数生长期的细胞用PBS洗三遍800rpm离心5min，用RPMI1640(FBS：2％，重组人IL-5:10ng/ml)调整细胞密度6000个/孔/90μl，并加入10μl梯度稀释的待测抗体到96孔培养3d后，加入30μl细胞滴度混匀后进行检测，根据读值计算IC50。检测结果如下表17所示。
表17.IL-5人源化抗体抑制IL-5诱导的TF1细胞增殖试验结果
抗体 IC50(nM) 抗体 IC50(nM)
Hu39D10 0.30 h1706-003 0.31
h1705-004 0.30 h1706-004 0.30
h1705-005 0.30 h1706-006 0.34
h1705-007 0.25 h1706-007 0.28
h1705-008 0.20 h1706-009 0.25
h1705-010 0.30 h1773-007 0.38
h1705-011 0.28 h1780-017 0.16
h1779-014 0.20
测试例6.IL5抗体抑制IL5诱导的嗜酸性粒细胞粘附实验
IL5可以诱导嗜酸性粒细胞的分化，成熟，迁移和活化，引起呼吸道炎症而导致哮喘。本实验利用IL-5细胞因子能够促进嗜酸性粒细胞粘附并使之激活的原理，收集和纯化来源于人外周全血的嗜酸性粒细胞来测试IL-5特异性抗体对IL-5该通路的阻断作用，在体外检测IL-5抗体对IL5介导的嗜酸性粒细胞数粘附效果的阻断。
具体为：人外周全血用含2mM EDTA的PBS稀释5倍，采用PercollTM(密度梯度为1.088)分离单核细胞和粒细胞，小心吸取含有粒细胞的红细胞层，利用红细胞裂解液去除红细胞；将剩余的细胞计数，按比例加人带有CD16抗体的分离磁珠(美天旎，CatalogNo.130-045-701)，孵育30min后过磁珠柱，负选收集直接流出细胞亚群即主要为嗜酸性粒细胞。分离得到的嗜酸性粒细胞计数，加入预先以IgG抗体包被的96孔细胞培养板内，每孔约1×104个，加人IL-5(20ng/ml)，以及不同浓度的IL-5抗体分子(10μg/ml起始，3倍稀释，10个浓度点)；细胞培养板置于37℃，5％ CO2培养箱孵育1h，取出培养板，加入0.3％ CTAB裂解细胞，最后加入过氧化物酶反应底物TMB显色反应，酶标仪读取OD450吸收值。最大吸附值为只加IL-5孔读值，不加IL-5及抗体药物孔为背景对照，计算各浓度下抗体药物相对于最大吸附孔的抑制值＝(最大吸附值-[抗体药物])/(最大吸附值-背景对照值)×100％，计算IC50。结果如下表18：
表18.IL-5抗体阻断IL-5诱导的嗜酸性粒细胞粘附
Hu39D10 h1705-008 h1706-009 h1780-017
IC50(ng/ml) 11.79 4.85 4.3 21.19
结果表明，本公开的人源化抗体显示较强的抑制IL5介导的嗜酸性粒细胞粘附的能力。
测试例7.人源化IL-5抗体Th2细胞因子的特异性评价
IL-5是Th2细胞因子中的一种，为了验证IL-5抗体只特异性针对IL-5而与其他细胞因子没有交叉反应，用Fortebio检测了12种Th2以及相关细胞因子，包括IL2(R&D,202-IL-010/CF)，IL4(R&D,204-IL-050/CF)，IL-5(R&D,205-IL-025/CF)，IFNgamma，IL6(R&D,7270-IL-025/CF)，IL9(R&D,209-IL-010/CF)，IL10(R&D,217-IL-025/CF)，IL13(R&D,213-ILB-025/CF)，IL25(R&D,8134-IL-025/CF)，IL31(R&D,2824-IL-010/CF)，以及与IL-5共用α受体的IL3(203-IL-050/CF)和GMCSF(R&D,215-GM-010/CF)。
具体为：用Protein A Biosensor(PALL Fortebio,18-5010)来捕获抗体，记录捕获信号，然后再进样40nM各细胞因子，记录新的结合信号。最后将与IL-5的结合信号定义为100％，看其他细胞因子与抗体的的结合信号，结果如图2所示。
结果显示，12种相关细胞因子中，IL-5人源化抗体h1705-008和h1706-009只特异性结合IL-5，与其他Th2细胞因子无交叉反应。
体内活性生物学评价
测试例8.IL-5抗体在OVA诱导的小鼠哮喘模型中的药效评价
本测试是基于气道炎性反应以及气道重塑来评估IL-5抗体在卵清蛋白(OVA)气雾诱导的BALB/c小鼠哮喘模型中的药效。
小鼠根据体重随机分成7组，每组10只小鼠：正常对照组(G1)；模型组(G2)；2个测试抗体h1705-008(G3和G4)和h1706-009(G5和G6)，每个测试抗体2个剂量(10mpk和2mpk)的治疗组；以及阳性抗体Hu39D10对照组(G7，10mpk)。在第1天和第14天，对所有小鼠腹腔注射致敏溶液进行致敏。在第28、29、30天，用OVA攻击溶液对第一组外的其他六组小鼠进行气雾攻击30分钟。攻击前2小时，第二组(G2)腹腔注射磷酸缓冲液，第三组至第七组(G3-G7)小鼠腹腔注射不同剂量的不同抗体，一天一次，连续三天。每次注射前配制新鲜的测试抗体，配制完成至给药半小时内完成。第一组的小鼠作为正常对照组用PBS进行气雾攻击30分钟，攻击前2小时腹腔注射磷酸缓冲液，一天一次，连续三天。
在第31天，使用WBP系统对动物进行气道高反应性的检测。所有动物均用雾化吸入1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL倍增浓度的乙酰甲胆碱，测定相应浓度下的增强呼气间歇值。
在第31天，WBP系统检测气道反应1小时后，直径1.2毫米的气管插管插入气管内并且固定，肺将被灌洗两次，每次0.8毫升的磷酸缓冲液含1％的BSA和0.6mM的EDTA。记录灌洗液的回收体积。
将BALF在4摄氏度300g下离心5分钟，上清液保留用于细胞因子分析。离心后，细胞重悬在1.5毫升的PBS里(含1％的BSA和0.6mM的EDTA)进行细胞计数。通过血球计数器和台盼蓝染色实验对BALF中的总细胞数进行计数。细胞涂片后，莱特染色液染色一分钟，接着用吉姆沙染色7分钟，从而区分出嗜酸细胞、中性白细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。在光学显微镜下计数。
灌洗后，收集肺组织并用10％的中性甲醛溶液浸染，然后固定在10％的中性甲醛溶液中。固定的组织进行石蜡包埋，切边，H&E染色，评分。测试结果如图3和图4A、图4B所示。
结果显示，本公开中抗体分子h1705-008和h1706-009可明显提高肺功能，且作用方式呈剂量依赖模式，而高剂量(10mpk)的阳性化合物却不能改善肺功能(参见图3)。同时，两个抗体显著降低了嗜酸性粒细胞水平和粘膜厚度，在同样剂量下(10mpk)显示出比阳性抗体更强的降低嗜酸性粒细胞的能力(参见图4A和4B)。而在同样类型小鼠哮喘模型中，重复实验也同样验证了1mg/ml的h1705-008，h1706-009和h1780-017均比阳性抗体更显著地降低BalF中的嗜酸性粒细胞水平(参见图4C)。
测试例9.外源性人IL-5诱导的豚鼠急性哮喘模型评价IL-5抗体的体内药效
本实验选用雄性豚鼠建立人IL-5诱导的急性哮喘模型，以hu39D10为阳性抗体，评估本公开5个IL-5人源化单抗对人IL-5诱导的豚鼠肺支气管灌流液(BALF)中的嗜酸性粒细胞增加是否有抑制作用。豚鼠共分为9组，每组8-10只：正常对照组、模型组、hu39D10(1mg/kg)组、h1705-008(1mg/kg)组、h1706-009(1mg/kg)组、h1780-017(1mg/kg)组、h1773-007(1mg/kg)组和h1779-014(1mg/kg)组。其中模型组和给药组豚鼠分别于第1天气管注射100μl人IL5(含IL5抗原5μg)激发，正常对照组气管注射PBS。给药组激发前2小时腹腔注射分别给予1mg/kg上述IL5单抗，给药体积为5ml/kg，模型组给予相应的IgG抗体，正常对照组腹腔给予PBS溶剂。气管注射后24h后麻醉豚鼠抽取肺支气管灌流液，待细胞浓度调整至5^106/ml时取15μl滴在载玻片上，晾干固定后进行HE染色，400倍镜下计数细胞总数和嗜酸性粒细胞数并计算嗜酸性粒细胞百分比。结果如图5A和图5B所示，表明本公开5个人源化抗体均可以显著降低BALF中嗜酸性粒细胞水平。
制剂成分的筛选及稳定性评价
示例性抗体药物组合物(制剂)制备工艺：
第一步：取一定量的纯化的抗IL-5抗体溶液，用不含抗体的缓冲剂(如30mM，pH5.5醋酸-醋酸钠缓冲剂)进行溶剂置换(优选超滤)，经超滤膜至少6倍体积置换，蛋白浓缩到约120mg/mL。加入一定体积的蔗糖母液，混匀，使最终蔗糖浓度为72mg/mL。加入一定体积的聚山梨醇酯80母液，混匀，使最终聚山梨醇酯80浓度为0.4mg/mL。加10mM pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲剂定容，使蛋白浓度为100mg/mL(其他待测试制剂或稳定性制剂参照相似步骤进行配制)。
产品经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。
第二步：调节装量至1.2ml，将滤液灌装于2ml西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。
第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。
第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。
测试例10.缓冲体系的筛选
在pH5.0-6.5一系列缓冲液中，配制蛋白浓度为100mg/mL的h1705-008制剂，其中振摇样品含0.2mg/ml聚山梨醇酯80(PS80)，其他样品含0.05mg/mL PS80。缓冲体系分别为10mM醋酸-醋酸钠(AA)pH5.0、5.5；10mM琥珀酸-琥珀酸钠(SA)pH5.0、5.5、6.0；10mM枸橼酸-枸橼酸钠(CA)pH5.5、6.0、6.5；10mM组氨酸-盐酸盐(His)pH5.5、6.0、6.5；10mM磷酸盐(PB)pH6.0、6.5。将每种制剂过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行强制降解实验，以外观、SEC、iCIEF为评价指标。
结果见表19，外观数据显示，振摇(300rpm，25℃)及40℃样品出现不同程度颗粒，整体来看pH较低时外观较好，缓冲体系醋酸-醋酸钠及琥珀酸-琥珀酸钠较优；SEC数据显示，40℃条件下AA pH 5.5组略优；iCIEF数据显示，40℃条件下AApH 5.5、His pH 5.5、CApH 6.5组略优；综合考虑物理化学稳定性，优选AA pH 5.5。
表19.pH和缓冲体系筛选结果
注：N/A表示未检测，D表示天，T0表示第0天。
测试例11.制剂的辅料筛选
在含下列不同种类辅料的10mM SA(pH5.0)缓冲液中，制备蛋白浓度为100mg/mL的h1705-008制剂。具体辅料如下：
1)0.1mg/mL聚山梨醇酯20(PS20)
2)0.1mg/mL聚山梨醇酯80(PS80)
3)50mg/mL蔗糖+0.1mg/mL PS80
4)50mg/mL海藻糖+0.1mg/mL PS80
5)50mg/mL甘露醇+0.1mg/mL PS80
6)50mg/mL山梨醇+0.1mg/mL PS80
7)8mg/ml精氨酸(Arg)+0.1mg/mL PS80
8)8mg/ml赖氨酸(Lys)+0.1mg/mL PS80
9)8mg/ml甘氨酸(Gly)+0.1mg/mL PS80
10)8mg/ml甲硫氨酸(Met)+0.1mg/mL PS80
11)8mg/ml脯氨酸(Pro)+0.1mg/mL PS80
12)8mg/ml氯化钠(NaCl)+0.1mg/mL PS80
每种制剂经过滤灌装，加塞，轧盖后备用。将样品进行40℃高温强制降解实验，结果表明(表20)：各组样品SEC、CE、iCIEF的检测结果无显著差异，Arg/Lys/NaCl组外观较差，其他组间无显著差异。蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸对蛋白稳定性均较好。
表20.辅料筛选结果
注：D表示天。
测试例12.表面活性剂的筛选
制备蛋白浓度100mg/ml，10mM SA pH5.5，70mg/ml蔗糖，0.4mg/ml PS20或PS80的h1705-008制剂。
将样品置于4℃条件考察稳定性，结果见表21，结果显示：4℃ M4后PS80组外观澄明，SEC、CE、iCIEF无显著变化，稳定性良好，而PS20组出现大量颗粒，因此PS80优于PS20，另外可以看出处方中同时加入PS80对h1705-008有较好的稳定作用，该处方稳定性较好。
表21.h1705-008 4℃稳定性结果
注：M表示月；N/A表示未检测。
测试例13.DOE处方设计和筛选
以10mM醋酸盐(AA)缓冲液pH、蛋白浓度和吐温浓度为变量进行DOE(Design ofexpriment)实验设计，因子及水平为pH5.0～5.8、PS80浓度0.2～0.6mg/mL、抗体h1705-008浓度80～120mg/mL，设计系列处方，处方见表22，将样品进行40℃高温强制降解，以外观、SEC、非还原CE、iCIEF为评价指标，结果见表23。
表22.DOE处方筛选实验处方设计
表23.DOE处方筛选实验结果
注：D表示天。
结果显示，各处方外观均澄明，SEC、CE、iCIEF分别下降<2％、<2％、约14％，在可接受范围内，处方稳定性较好，因此制剂包含蛋白浓度80-120mg/ml，0.2-0.6mg/ml PS80，pH5.0-5.8。最优处方为蛋白浓度100mg/ml，0.4mg/ml PS80，pH5.5。
测试例14.稳定性检测
制备蛋白浓度100mg/ml，10mM AA pH5.5，70 mg/ml蔗糖，0.4 mg/ml PS80的h1705-008制剂，将样品进行4℃、25℃稳定性考察，结果见表24。
结果显示，高温条件下h1705-008制剂SEC、CE、iCIEF略有下降，但下降幅度均在可接受范围，其他条件下各项指标均无显著变化，该处方稳定性较好，可保证h1705-008在4℃6个月内的稳定性。
表24.h1705-008 25℃及4℃稳定性结果
注：M表示月。
测试例15.离子强度的筛选
含下列不同离子强度的醋酸(钠)缓冲液中，制备蛋白浓度100mg/mL，70mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PS80的h1705-008制剂，测定置换用缓冲液及最终制剂pH，结果见表25。结果显示离子强度越高，pH漂移越小，当离子强度为30mM时，pH漂移小于0.1。
表25.不同离子强度制剂pH结果
离子强度 缓冲液-pH 制剂原液-pH △pH
10mM 5.50 5.71 0.21
20mM 5.50 5.66 0.16
30mM 5.50 5.59 0.09
测试例16.糖浓度的筛选
在含下列不同蔗糖浓度的缓冲液中，制备蛋白浓度为100mg/mL，含30mM AApH5.5，0.4mg/mlPS80的h1705-008制剂，测定渗透压，结果见表26。
结果显示，当糖浓度为70-75mg/ml时，渗透压处于最佳等渗范围(290-310mosm)；根据70mg/ml和73mg/ml组渗透压数据推算，糖浓度为72mg/ml时，渗透压可达最佳值，约300mosm。
表26.h1705-008不同糖浓度处方渗透压比较
糖浓度(mg/ml) 70 73 75
渗透压(mosm) 290 306 310
测试例17.制剂稳定性测试
制备蛋白浓度为100mg/mL，含30mM AA pH5.5，72mg/ml蔗糖，0.4mg/mlPS80的h1705-008制剂，考察其4℃及25℃稳定性，结果见表27。结果显示，高温条件下h1705-008制剂SEC、CE、IEC略有下降，但下降幅度均在可接受范围，4℃条件下各项指标均无显著变化，该处方稳定性较好。
表27.h1705-008制剂稳定性
条件 外观 SEC(％) IEC中性峰(％) 非还原CE-SDS(％)
T0 澄明 98.4 63.5 97.6
25℃-M3 N/A 96.8 55.0 96.5
4℃-M3 澄明 98.4 61.9 97.3
注：M表示月，T表示时间，N/A表示未测定。
测试例18.其它可选择制剂配方
此外，本公开还提供其它制剂配方的抗IL-5抗体药物制剂，包含但不限于：
(1)1mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH 5.5的10mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(2)100mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的20mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(3)120mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的40mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(4)100mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.0的30mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(5)80mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，75mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.4的20mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(6)100mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的30mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(7)90mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，74mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.6的25mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(8)90mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，76mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.4的35mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(9)80mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.6的30mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(10)100mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的40mM醋酸-醋酸钠缓冲剂；
(10)100mg/ml抗IL-5抗体(h1705-008)，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和pH为5.5的40mM醋酸-醋酸钠缓冲剂。
实验结果表明，上述制剂配方的IL-5抗体制剂均具有良好的稳定性，可应用于IL-5抗体药物的配制。
测试例19.抗IL-5抗体制剂的冻干
用pH5.5的30mM醋酸-醋酸钠缓冲液，制备含72mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80的抗IL-5抗体浓度为100mg/ml的h1705-008抗体制剂。将抗体以2.15mL/瓶填充入6mL西林瓶中，装入冻干箱中，冻干。冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥。冻干程序结束后，真空加塞。复溶样品进行冻干前后对比。结果表明，复溶溶液可保持液体制剂良好的性能。
表28.制剂的冻干步骤
注：N/A(Not applicable)表示本表对其不适用。

Claims (25)

1.一种药物组合物，其包含抗IL-5抗体或其抗原结合片段、缓冲剂和表面活性剂，其中所述缓冲剂选自醋酸-醋酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、组氨酸-盐酸盐和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂中的任一种，优选为醋酸-醋酸钠或琥珀酸-琥珀酸钠缓冲剂；其中所述的抗IL-5抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17、18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、20、21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的缓冲剂的pH为5.0至6.5，优选为5.0至5.8，最优选为5.5。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述缓冲剂浓度为10mM至40mM，优选为32mM。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述的表面活性剂为聚山梨醇酯80。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述的聚山梨酯80的浓度为0.1mg/ml至0.6mg/ml，优选为0.2mg/ml至0.6mg/ml，更优选为0.6mg/ml。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其还包括稳定剂，其中所述的稳定剂为糖或氨基酸，其中所述的糖选自蔗糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇，优选为蔗糖；其中所述的氨基酸选自甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述糖的浓度为50mg/ml至80mg/ml，优选为60mg/ml至80mg/ml。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述氨基酸的浓度为8mg/ml。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其包含如下成分：
10mM至40mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为5.0至6.5；和0.1mg/ml至0.6mg/ml聚山梨酯80；和抗IL-5抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗IL-5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17、18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、20、21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其包含：
10mM至40mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为5.0至5.8；0.2mg/ml至0.6mg/ml聚山梨酯80和60mg/ml至80mg/ml的蔗糖；和抗IL-5抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗IL-5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17、18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、20、21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，所述药物组合物包含：
抗IL-5抗体或其抗原结合片段，32mM的醋酸-醋酸钠缓冲剂，pH为5.5，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80和60mg/ml至80mg/ml的蔗糖；和抗IL-5抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗IL-5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17、18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、20、21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述的抗IL-5抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的抗IL-5人源化抗体包含SEQ IDNO：49所示的重链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：49所示的重链可变区序列上分别具有1-10个氨基酸回复突变。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述的变体选自：
在SEQ ID NO：49所示的重链可变区上具有选自S49T，V93T和K98S中的一个或多个的氨基酸回复突变。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述的抗IL-5人源化抗体包含如SEQ IDNO：50或51所示的重链可变区。
15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的抗IL-5人源化抗体含有如SEQ IDNO：46所示的轻链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO：46所示的轻链可变区上具有1-10个氨基酸回复突变。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述的变体选自：
在SEQ ID NO：46所示的轻链可变区上具有选自A43S，L47V，G66R，T69S，F71Y和Y87F中的一个或多个的氨基酸回复突变。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗IL-5人源化抗体包含如SEQ IDNO：47或48所示的轻链可变区。
18.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述的抗IL-5人源化抗体包含：
如SEQ ID NO：49、50、51中任一所示或与其具有95％序列同一性的重链可变区和如SEQID NO：46、47、48中任一所示或与其具有95％序列同一性的轻链可变区；优选地，所述的抗IL-5人源化抗体包含：SEQ ID NO：51所示的重链可变区和SEQ ID NO：47所示的轻链可变区。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述抗IL-5抗体包括人抗体恒定区；优选包含SEQ ID NO：52所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：53所示的人抗体轻链恒定区。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述抗IL-5抗体包含：
SEQ ID NO：83所示的重链和SEQ ID NO：84所示的轻链。
21.制备权利要求1至20中任一项所述的药物组合物的方法，包括将抗IL-5抗体或其抗原结合片段原液经缓冲液置换的步骤，其中所述的缓冲液优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。
22.一种含抗IL-5抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂通过将权利要求1至20中任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得；优选地，所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。
23.一种含有抗IL-5抗体或其抗原结合片段的复溶溶液，其中所述的复溶溶液是通过将权利要求22所述的冻干制剂经复溶获得。
24.一种制品，其包括容器，该容器中装有如权利要求1至20中任一项所述的药物组合物，或权利要求22所述的冻干制剂，或权利要求23所述的复溶溶液。
25.一种治疗IL-5介导的疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的药物组合物，或权利要求22所述的冻干制剂，或权利要求23所述的复溶溶液，或权利要求26所述制品，其中所述的IL-5介导的疾病优选为哮喘、慢性肺炎、过敏性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞增多症、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、盘尾丝虫皮炎、间歇性血管水肿、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、嗜酸粒细胞性胃肠炎、蠕虫感染、何杰金氏病、鼻息肉、Loeffler’s综合征、荨麻疹、嗜酸粒细胞过度增多性支气管炎、结节性动脉炎、鼻窦炎、嗜酸粒细胞性食管炎、过敏性嗜酸粒细胞性食管炎、变应性结膜炎、盘尾丝虫皮炎、子宫内膜异位或类固醇依赖性嗜酸细胞性支气管炎。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096704A (en) * 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
JP3202029B2 (ja) * 1991-02-27 2001-08-27 サントリー株式会社 インターロイキン５の微量定量
WO1995014040A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
ATE346867T1 (de) * 1994-12-23 2006-12-15 Smithkline Beecham Corp Rekombinante il-5 antagonisten für die behandlung von il-5 bedingten krankheiten
CN103429261A (zh) * 2010-12-22 2013-12-04 塞法隆澳大利亚股份有限公司 半寿期改进的修饰抗体
EA201391488A1 (ru) 2011-04-07 2014-01-30 ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи Композиции со сниженной вязкостью
WO2014141149A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Formulations with reduced viscosity
JP7325166B2 (ja) 2013-12-20 2023-08-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二重特異性抗体
EA034864B1 (ru) 2014-09-08 2020-03-31 Сефалон, Инк. Способ лечения эозинофильной астмы со степенью тяжести от умеренной до тяжёлой
EA037487B1 (ru) 2015-08-24 2021-04-02 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти (No.2) Лимитед Биофармацевтические композиции
US11111292B2 (en) 2016-12-23 2021-09-07 Cephalon, Inc. Anti-IL-5 antibodies
BR112019025736A2 (pt) * 2017-06-06 2020-06-30 Glaxosmithkline Llc uso de um anticorpo e composições para tratar uma doença e para diminuir uma contagem absoluta de eosinófilo no sangue
TWI801425B (zh) * 2017-09-29 2023-05-11 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

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