CN103429261A

CN103429261A - 半寿期改进的修饰抗体

Info

Publication number: CN103429261A
Application number: CN201180068272XA
Authority: CN
Inventors: D.威尔逊; T.陶拉
Original assignee: Cephalon Australia Pty Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2013-12-04
Also published as: EA201390923A1; EP2654790B1; WO2012083370A1; KR20140003494A; US20130281677A1; AU2011349049A1; MX2013007392A; ZA201305123B; JP2017055771A; BR112013016235B1; US9505826B2; JP2014503209A; AU2011349049B2; PT2654790T; ES2720136T3; EP2654790A4; CA2824279A1; JP6147670B2; KR101941514B1; EP2654790A1

Abstract

本发明涉及通过以下组合其体内半寿期延长的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白：(i)修饰的IgG4Fc区或其FcRn结合结构域，和(ii)修饰的IgG4铰链区序列。

Description

半寿期改进的修饰抗体

相关申请

本文件要求USSN 61/425,858的优先权，其完整内容通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明涉及通过以下组合其体内半寿期延长的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白：(i)修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和(ii)修饰的IgG4铰链区序列。

发明背景

IgG是人和其它哺乳动物中最普遍的免疫球蛋白类别，并被用于各种类型的免疫疗法和诊断方法中。这些疗法的一个关键问题是免疫球蛋白在循环中的存留时间。所给予的免疫球蛋白的清除率直接影响免疫球蛋白给予的量和频率。对循环中IgG分解代谢的研究已鉴定出控制IgG代谢的IgG恒定结构域的部分，IgG分解代谢包括血清中IgG通过与FcRn (新生儿Fc受体)相互作用而降解的速率。对FcRn的结合亲和力提高延长IgG的循环(或血清)半寿期(参见例如Kim等，Eur J Immunol.，24:2429 (1994))。用于获得通过将FcRn结合多肽引入分子而改进其半寿期的生理活性分子的方法描述于例如WO 97/43316、US 5,869,046、US 5,747,035、WO 96/32478。用于使分子与抗体或其FcRn结合结构域片段融合的方法描述于例如WO 99/43713。然而，上述文献未公开影响半寿期的IgG恒定结构域中的特定突变体。

通过氨基酸取代、添加或缺失以提高或降低IgG分子对FcRn的亲和力的修饰公开于WO 98/23289，然而该文献未列举显示较长或较短体内半寿期的任何特定的突变体。

已表明延长循环半寿期的一种小鼠IgG1突变体是描述于例如WO 97/34631的三重突变Thr252Ala、Thr254Ser和Thr256Phe。MedImmune (US 7,083,784)已证实，在人IgG1的情况下，CH2结构域内的氨基酸残基251-256、285-290和308-314及CH3结构域内的氨基酸残基385-389和428-436的一个或多个的修饰可提高恒定结构域对FcRn的亲和力，因此延长循环半寿期。具体地讲，他们证实人IgG1同种型抗体Fc中的三重突变M252Y、S254T和T256E (命名为“YTE”)在非人灵长类动物中可延长抗体的循环半寿期约2-3倍。

IgG4 同种型抗体的特征

IgG4不同于其它人IgG同种型，因为在非还原条件下，在SDS-PAGE上观察到两种蛋白质类型，主要类型为四聚IgG (H2L2，即两条重链和两条轻链)，而第二种次要类型为“半免疫球蛋白”，其含有单条重链和单条轻链(HL)。这些研究结果表明铰链区两条重链之间二硫键形成的异质性。此外，当具有不同抗原结合特异性的不同人IgG4混合在一起时，各IgG4分子能够解离成半免疫球蛋白(HL)，其然后再缔合形成与两种不同抗原结合的四聚IgG (H2L2) (双特异性抗体)。HL类型被认为是IgG4装配中的主要中间体。人IgG重链铰链序列的分析表明，在IgG4的残基228 (按照Kabat等人的编号系统，Sequences of Proteins of Immunological Interest 第4版, Washington DC United States Department of Health and Human Services) (在某些出版物中亦称为残基241；为了避免产生歧义，这是指IgG4铰链区序列CPSCP (SEQ ID NO:1)中心的丝氨酸)处丝氨酸的存在可能是异质性的原因。如果IgG4中的这个残基由丝氨酸经修饰成为脯氨酸(天然存在于IgG1和IgG2该位置上的残基)，则导致血清半寿期延长的均质抗体的产生(Angal S等，Molecular Immunology 第30卷，第1期:105-108 (1993)；Labrijn等，Nature Biotechnology 第27卷，第8期:767-771；Schuurman J等，Molecular Immunology 38 (2001) 1-8)。

存在对产生性质改进(例如循环半寿期延长)的用于治疗目的的抗体的持续需要。

发明概述

本发明涉及通过以下的组合其体内半寿期延长的分子，具体地讲是抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白：(i)包含经修饰的IgG4同种型序列的Fc区或FcRn结合结构域区，和(ii)修饰的IgG4铰链区序列。具体来说，这些分子具有提高Fc或重链CH2和CH3恒定区对FcRn的亲和力、从而提高其在受试者中的循环半寿期的氨基酸修饰，例如突变。此外，所述分子包括修饰的IgG4铰链区序列，其消除了作为IgG4同种型抗体特征的混合异二聚体的形成。

本发明基于这样的预料不到的发现，即相对于其野生型未修饰对应物，上述修饰组合延长分子的循环半寿期，比仅一个或多个Fc区修饰或仅铰链区修饰明显更长。此外，修饰的组合导致半寿期的超累加(supra-additive) (协同)延长。因为基于人蛋白质的药物(包括包含人抗体恒定区的蛋白质)的任何修饰增加在患者中诱导抗药免疫应答的风险，所以一般可取的是限制这类突变的数目，以限制就诱导针对药物的这类免疫应答而言所推测的各个这类突变的风险的累加性提高。然而，由于本文所述出人意料的结果即，两种取代类型(Fc修饰和铰链修饰)的组合在延长IgG4抗体的循环半寿期中导致超累加作用。因此，这种组合提供出乎意料的优势，其可克服有关提高促进抗药免疫反应的发生率的推测缺点。延长分子半寿期的优势对本领域技术人员而言是直接明了的。这类益处包括较低的剂量和/或给药频率，这减少受试者中不良事件的风险并降低成本。因此，具有半寿期延长的这类免疫球蛋白具有重大的药学重要性。

此外，因为所述分子包含IgG4同种型恒定结构域和IgG4铰链区，所以该分子体内没有或具有最小的效应子功能。

因此，在一个实施方案中，本发明提供体内半寿期延长的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引(EU Index)编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

(ii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基取代为脯氨酸的人IgG4核心铰链区序列；

其中经修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期与相应未修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白相比延长。

通过参照缺乏上述取代的相应的人IgG4抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的半寿期来测定抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白体内半寿期的延长。

本发明还提供体内半寿期延长的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

(ii) 包含按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P的人IgG4核心铰链区序列；

其中与相应未修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白相比，经修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期延长。

本发明的抗体可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、superhumanised^®抗体、去免疫化抗体(de-immunized antibody)或饰面抗体(veneered antibody)。

在一个实例中，本发明提供体内半寿期延长的分离抗体，其包含：

(i) 人或人源化Fab，

(ii) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和

(iii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸(亦描述为按照Kabat中的EU索引的S228P取代)的人IgG4核心铰链区序列；

在整个说明书中，免疫球蛋白重链中残基的编号是Kabat的EU索引或编号系统的编号(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5版, Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1991, National Institutes of Health, Bethesda。“按照Kabat的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的编号(Edelman等, Proc. Natl. Acad. USA, 63，78-85，1969)。将各个铰链区的第一个和最后一个半胱氨酸残基(其形成重链间S-S键)置于相同位置，将IgG2、IgG3和IgG4同种型的氨基酸序列与IgG1序列进行比对。

使按照Kabat中的EU索引的氨基酸残基251-256位于Fc区的免疫球蛋白重链CH2结构域内。这些残基涉及Fc区与FcRn的结合，因此涉及改变抗体半寿期。

在另一个实例中，本发明提供体内半寿期延长的分离的免疫球蛋白构建体，其包含：

(i) 抗体片段；

(ii) 相对于相应未修饰的CH2结构域经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 CH2结构域，和

其中与相应未修饰的免疫球蛋白构建体相比，修饰的免疫球蛋白构建体的体内半寿期延长。

在一个实施方案中，分离的免疫球蛋白构建体包含人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域。

优选分离的免疫球蛋白构建体包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

具体的抗体片段包括但不限于(i) Fab片段，(ii) Fd片段，(iii) Fv片段，(iv) dAb片段，(v)分离的CDR区，(vi) F(ab’)2片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，(viii)双特异性单链Fv，及(ix)双链抗体(diabody)，(x)三链抗体(triabody)，和(xi)四链抗体(tetrabody)。

本发明还提供体内半寿期延长的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含经重组融合或化学缀合或工程改造以含有以下的生物活性分子：(i)与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和(ii)在按照Kabat中的EU索引的核心铰链区序列中包含氨基酸取代S228P的人IgG4。

生物活性分子可包括蛋白质或非蛋白质作用剂或非免疫球蛋白的蛋白质。

在一个实施方案中，生物活性分子是多肽。

在另一个实例中，本发明提供体内半寿期延长的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

(i) 生物活性分子；

(ii) 相对于IgG4 CH2结构域经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 CH2结构域，和

其中与相应未修饰的免疫球蛋白IgG4融合蛋白相比，修饰的免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期延长。

优选分离的免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域。

优选分离的免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

本发明的人IgG4核心铰链区序列优选包含按照Kabat中的EU索引的S228P取代。该取代亦称为按照Kabat等人 (1987 Sequences of proteins of immunological interest. United States Department of Health and Human Services, Washington DC)的S241P。取代具有制备与野生型IgG1或IgG2同种型抗体的相同的铰链区核心的序列的作用。对于IgG4同种型抗体，它导致IgG4抗体均质形式的产生，因此消除常常导致异二聚体IgG4抗体的产生的重链的解离和重新缔合。

本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合分子包含人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，其在按照Kabat中的EU索引的氨基酸残基252、254和256的一个或多个上包含取代。在某些实例中，本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含Fc区的氨基酸残基252、254或256任一个的单个取代。在其它实例中，抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含Fc区的残基252和254或残基254和256或残基252和256的取代。在一个具体的实例中，抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含人IgG4 Fc区序列的残基252、254和256每一个的取代。

在本发明的具体实例中，残基252被酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸或苏氨酸取代，残基254被苏氨酸或丝氨酸取代，而残基256被丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或苏氨酸取代。在一个具体的实例中，残基252被酪氨酸取代(M252Y)，残基254被苏氨酸取代(S254T)，而残基256被谷氨酸取代(T256E)。这些取代统称为“YTE修饰”。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或免疫球蛋白构建体可经进一步重组融合、化学缀合或工程改造以含有部分。本发明的部分可选自但不限于与该抗体直接或间接结合的治疗剂、细胞毒素、放射性同位素、免疫调节剂、抗血管生成药、抗新血管形成药和/或其它血管形成药(vascularization agent)、毒素、抗增殖药、促凋亡药、化疗剂和治疗性核酸。

在一个实例中，按照本发明修饰的抗体是与人IL-5特异性结合的抗体。在另一个实例中，按照本发明修饰的抗体是与人CD33特异性结合的抗体。

因此，在一个实例中，本发明还提供与IL-5特异性结合的分离抗体，其包含：

(i) 与相应未修饰的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和

(ii) 包含按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P的人IgG4核心铰链区序列，

其中与相应未修饰的抗体的半寿期相比，修饰抗体的体内半寿期延长。

在一个具体的实例中，相应未修饰的抗IL-5抗体是hu39D10。

在另一个实施方案中，分离抗体的Fab序列可对应于美泊利单抗的轻链和重链可变区序列。

在另一个实例中，本发明提供与IL-5特异性结合的抗体，该抗体包含SEQ ID NO: 6所示恒定重链序列和SEQ ID NO: 7所示重链可变区序列。在另一个实例中，抗体与IL-5特异性结合，还包含含有SEQ ID NO:8所示可变和恒定区序列的轻链。

在另一个实例中，本发明提供与CD33特异性结合的分离抗体，其包含：

在一个具体的实例中，按照本发明修饰的抗CD33抗体是抗体huMab195。

在另一个实例中，本发明提供与CD33特异性结合的抗体，该抗体包含SEQ ID NO:11所示重链序列和SEQ ID NO:12所示轻链序列。

本发明还提供体内半寿期延长的包含以下的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在药物中的用途：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其未修饰的FcRn结合结构域相比经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和

(ii) 包含氨基酸序列CPSCP内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸(亦描述为按照Kabat中的EU索引的S228P取代)的人IgG4核心铰链区序列(SEQ ID NO:1)。

优选分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

本发明还提供按照本发明修饰的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在制备用于治疗或预防病症的药物中的用途。

本发明提供包含以下的体内半寿期延长的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在制备用于治疗或预防受试者的病症的药物中的用途：

(ii) 包含按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P的人IgG4核心铰链区序列。

本发明还提供治疗或预防受试者的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症的方法，所述方法包括给予本发明的修饰的抗IL-5抗体。

本发明还提供治疗受试者的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症的方法，所述方法包括给予受试者与IL-5特异性结合的分离抗体，其包含：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其未修饰的FcRn结合结构域相比经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和

本发明还延伸到这类修饰的抗体在治疗或预防受试者的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症中的用途和修饰的抗体在制备用于治疗或预防特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症的药物中的用途。

在一个实例中，本发明提供与IL-5特异性结合的体内半寿期延长的包含以下的分离抗体在制备用于治疗或预防受试者的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症的药物中的用途：

在一个实例中，所述病症的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生(嗜酸性粒细胞增多)。

特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症可选自特应性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、非变应性鼻炎、哮喘、重度哮喘、慢性嗜酸性粒细胞肺炎、变应性支气管肺曲菌病、乳糜泻、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、嗜酸性粒细胞肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、水肿反应包括发作性血管性水肿(episodic angiodema)、寄生虫感染、盘尾丝虫皮炎、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性胃炎、嗜酸性粒细胞性肠胃炎、嗜酸性粒细胞性肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、鼻微息肉病(nasal micropolyposis)、鼻息肉病、阿司匹林不耐受性哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停、慢性哮喘、克罗恩病(Crohn’s disease)、硬皮病和心肌心内膜纤维变性。

在另一个实例中，所述病症是自身免疫病。

还应了解，本发明的修饰的抗IL-5抗体可用于与特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症有关的预防或诊断的方法中。

本发明还提供治疗受试者的癌症病症的方法，所述方法包括给予受试者本发明的修饰的抗CD33抗体。

本发明还提供治疗受试者的癌症病症的方法，所述方法包括给予受试者包含以下的特异性结合CD33的分离抗体：

本发明还延伸到这类修饰的抗体在治疗或预防癌症病症中的用途和修饰的抗体在制备用于治疗或预防癌症病症的药物中的用途。

在一个具体的实例中，所述癌症病症是急性髓细胞样白血病。

在另一个实例中，本发明提供与CD33特异性结合的体内半寿期延长的包含以下的分离抗体在制备用于治疗或预防受试者的癌症病症的药物中的用途：

(i) 相对于相应未修饰的人IgG4 Fc区或其未修饰的FcRn结合结构域经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

本发明还提供用于延长包含IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和IgG4铰链区的人或人源化IgG4同种型抗体或免疫球蛋白构建体的体内半寿期的方法，所述方法包括：

(i) 将按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E引入Fc区序列或其FcRn结合结构域，和

(ii) 将按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P引入核心铰链区序列。

在一个具体的实例中，上述方法可用来延长抗IL-5抗体、特别是hu39D10的半寿期。

在又一个具体的实例中，上述方法可用来延长抗CD33抗体的半寿期。

本发明还提供用于延长包含IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和IgG4铰链区的免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期的方法，所述方法包括：

(i) 将按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E引入人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

(ii) 将按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P引入人IgG4核心铰链区序列。

本发明还提供通过将蛋白质改造成为包含SEQ ID NO:14的融合蛋白而延长其体内半寿期的方法。

本发明还提供包含SEQ ID NO:14的融合蛋白。

在一个实例中，融合蛋白还包含与SEQ ID NO:14的C端直接连接的单个赖氨酸。

本发明还提供用于降低非IgG4抗体的效应子功能的方法，所述方法包括：

(i) 将非IgG4抗体的重链恒定区用经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4恒定区或其FcRn结合结构域置换；和

(ii) 将非IgG4抗体的铰链区用具有按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P的IgG4铰链区置换。

本发明还提供用于延长非人IgG4抗体的体内半寿期的方法，所述方法包括：

(i) 将非人IgG4抗体的重链恒定区用经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4恒定区或其FcRn结合结构域置换；和

(ii) 将非人IgG4抗体的铰链区用具有按照Kabat中的EU索引的氨基酸取代S228P的IgG4铰链区置换。

本发明还提供编码任何实施方案的本文所述抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的核酸。

本发明还提供表达任何实施方案的本文所述抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的转化细胞。

本发明还提供包含编码本文所述抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的核酸的转化细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供包含本发明的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。优选组合物包含治疗有效量的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。

附图说明

图 1显示包含可变结构域和IgG4恒定结构域relizumab重链的序列、恒定结构域(天然IgG4同种型)或具有S228P突变、“YTE”突变或S228P和YTE突变的组合的IgG4恒定结构域的序列；还显示了hu39D10重链可变结构域和hu39D10轻链的序列。

图 2显示人FcRn胞外结构域的序列。

图 3显示人β2微球蛋白的成熟部分的序列。

图 4显示测量人FcRn对含有天然IgG4 Fc结构域的hu39D10或携带S228P突变、YTE突变或S228P和YTE突变两者的hu39D10的亲和力的基于ELISA的测定法。

图 5显示具有人源化FcRn的小鼠，即内源FcRn基因缺失但具有人对应物的异位表达的小鼠中的PK研究。第0天，小鼠接受hu39D10或含有仅YTE取代、仅铰链取代(S228P)或两种类型的取代的变体。在2、12、24小时和2、4、7、10、14、18、21和28天从每只小鼠眶后窦采血。针对人源化抗体浓度对血浆样品进行分析。抗体水平表示为在24小时时间点上相同小鼠的百分比水平。

图 6显示CD33抗体huMab195的序列，其中Fc结构域是含有S228P和TYE修饰的IgG4同种型；还显示了huMab195的轻链。

图 7显示人CD33胞外结构域-Fc融合蛋白的序列。

图 8显示具有人源化FcRn的小鼠，即内源FcRn基因缺失但具有人对应物的异位表达的小鼠中的PK研究。第0天，小鼠接受具有天然IgG4 Fc结构域或含有仅YTE取代、仅铰链取代(S228P)或两种类型的取代的变体的huMab195。在2、12、24小时和2、4、7、10和14天，从每只小鼠的眶后窦采血。针对人源化抗体浓度对血浆样品进行分析。抗体水平表示为在24小时时间点上相同小鼠的百分比水平。

图 9显示天然人IgG4重链铰链-Fc部分的序列和具有S228P和YTE突变且缺乏C端赖氨酸的人IgG4重链铰链-Fc部分的序列。

发明详述

概要

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应视为对两种含义或对任一种含义提供明确支持。

在整个本说明书中，除非另有明确说明或文中另有要求，否则提及单个步骤、主题组合物、多步骤类或主题组合物类时，应视为包括这些步骤、主题组合物类、多步骤类(groups of steps)或主题组合物类(groups of compositions of matter)的一个和众多个(即一个或多个)。因此，本文所用单数形式包括复数方面，除非文中另有说明。例如，提及“该”包括单个以及两个或更多个；提及“所述”包括单个以及两个或更多个等。

本公开内容的各个实例应做必要修正地应用于每个和所有其它实施方案，除非另有明确说明。

本领域技术人员应了解，除明确描述的改变和修改以外，本文公开的内容还可被改变和修改。要了解，本公开内容包括所有的这类改变和修改。本公开内容还包括本说明书中单独或总的提及或标明的全部步骤、特征、组合物和化合物以及任何和所有组合或所述步骤或特征的任两个或更多个。

本公开内容在范围上不受本文所述具体实施方案的限制，所述具体实施方案仅旨在举例说明的目的。功能上等同的制品、组合物和方法也明确落入本公开内容的范围。

除非另有说明，否则在没有过度实验的情况下，采用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术，产生或进行本文所述主题组合物和方法。这类方法描述于例如Sambrook, Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 第2版(1989), 第I, II和III卷整卷；Benny K.C.Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, (2004) Humana Press, 第248卷；DNA Cloning: A Practical Approach, 第I和II卷(D. N. Glover主编, 1985), IRL Press, Oxford, 全文；Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait主编, 1984) IRL Press, Oxford, 全文及特别是其中的论文：Gait，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等，第83-115页和Wu等，第135-151页；4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins主编, 1985) IRL Press, Oxford, 全文；Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 全文；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Methods In Enzymology (S. Colowick和N. Kaplan主编, Academic Press, Inc.), 完整系列；J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis”, 载于：Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)；Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. L和Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342；Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154；Barany, G.和Merrifield, R.B. (1979)载于The Peptides (Gross, E.和Meienhofer, J.主编), 第2卷, 第1-284页, Academic Press, New York. 12. Wünsch, E.主编(1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E.主编), 第15卷, 第4版, 第1和2部, Thieme, Stuttgart；Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg；Bodanszky, M.和Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg；Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474；Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D. M. Weir和C. C. Blackwell主编, 1986, Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture: Practical Approach, 第3版(John R. W. Masters主编, 2000), ISBN 0199637970, 全文。

在整个本说明书中，措词“包含/包括”或其变化应理解为隐含纳入所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤类，而不排除任何其它要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤类。

定义

本文所用术语“相应的”未修饰的抗体意指与修饰抗体有相同序列但本文所述氨基酸序列特别是Fc和铰链区没有变化的抗体。

术语“表位”欲指抗体针对其产生并且抗体可与之结合的抗原分子的部分。本文所用术语“表位”是指在动物中、优选脊椎动物、更优选哺乳动物、最优选在人或表达人免疫系统的相关组分的转基因动物中具有抗原或免疫原活性的肽的一个或多个部分。表位可包含蛋白质、蛋白质片段、肽、碳水化合物、脂质和其它分子，但对于本发明的目的最通常为短的寡肽。术语“表位”欲包括“免疫原性表位”、“抗原性表位”或“抗原表位”。

本文所用术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区上的至少一个表位识别位点与靶标结合的分子。术语免疫球蛋白和抗体在整个说明书中可互换使用。免疫球蛋白或抗体分子包括四链抗体(例如两条轻链和两条重链)、重组或修饰抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类动物源化(primatized)抗体、去免疫化抗体、superhumanized^®抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体一般包含恒定结构域，其可被排列成为恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。抗体的示例性形式包含四链结构作为其基本单元。全长抗体包含共价连接的两条重链(约50-70 kD)和两条轻链(各约23 kD)。每条重链和轻链包含可变区和恒定结构域。轻链一般包含可变区(如存在的话)和恒定结构域，在哺乳动物中为κ轻链或λ轻链。重链一般包含可变区和通过铰链区与额外恒定结构域连接的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链具有下列类型α、δ、ε、γ或μ之一。每条轻链也与重链之一共价连接。例如，两条重链及重链和轻链通过链间二硫键和非共价相互作用保持在一起。链间二硫键的数目在不同类型的抗体中可变化。每条链具有N端可变区(V_H或V_L，其中各自的长度为约110个氨基酸)和位于C端的一个或多个恒定结构域。轻链的恒定结构域(C_L，其长度为约110个氨基酸)与重链的第一恒定结构域(C_H1，其长度为330-440个氨基酸)对齐，并与之形成二硫键。轻链可变区与重链可变区对齐。抗体重链可包含两个或更多个额外的C_H结构域(例如C_H2、C_H3等)，并且可包含介于C_H1和C_H2恒定结构域之间的铰链区。未修饰的抗体可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类。

本文所用术语“免疫球蛋白构建体”是指包含灵长类动物或人IgG4抗体的至少CH2重链恒定结构域和铰链区的构建体。优选术语欲指包含灵长类动物或人IgG4抗体的至少轻链和重链恒定结构域和铰链区的构建体。

术语“恒定区”或“恒定片段”是指相对于含有抗原结合部位的免疫球蛋白或抗体的其它部分(称为可变区)，具有核心保守氨基酸序列的免疫球蛋白或抗体分子的部分。在重链中，恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。

本文所用术语“Fc区”是指与通过木瓜蛋白酶消化IgG分子获得的可结晶片段有关的抗体或免疫球蛋白分子的部分。Fc区由IgG重链C端区组成——构成通过二硫键连接的IgG分子的两条重链约一半的C端。虽然按照Kabat的EU索引编号的界限可略有变化(在一些情况下，它包括铰链的部分)，但Fc区自氨基酸231延伸至氨基酸447。IgG的Fc区包含两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常自按照Kabat的EU索引的氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常自按照Kabat的EU索引的氨基酸342延伸至447。Fc区不具有抗原结合活性，但含有糖部分和Fc受体的结合部位，包括新生儿Fc受体(FcRn)。

本文所用术语“其FcRn结合结构域”是指能够与FcRn结合的Fc区的部分。在本文的情况下，它还欲指包括至少CH2结构域的Fc区序列的片段。

本文所用术语“FcRn受体”是指参与通过人或灵长类动物胎盘将母体IgG转运至胎儿和通过小肠从初乳转运给新生儿的Fc受体(“n”表示新生儿)。FcRn还参与通过结合IgG分子并使它们在血清中再循环而保持恒定的血清IgG水平。FcRn与IgG分子的结合是严格pH依赖性的，具有pH 6.0下的最佳结合。FcRn通常与β2微球蛋白形成复合物。

本文所用“铰链区”是指Fc和Fab区之间免疫球蛋白重链的富含脯氨酸的部分，其赋予抗体分子的两个Fab臂可动性。它位于重链的第一和第二恒定结构域之间。铰链区包括参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。它一般定义为按照Kabat的EU编号系统从人IgG1的Glu216延伸至Pro230 (或按照Kabat的编号系统从Glu226至Pro243)。可通过将形成重链间二硫(S-S)键的第一和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置将其它IgG同种型的铰链区与IgGl序列进行比对(参见例如WO 2010/080538)。铰链区包括参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。

本文所用术语“核心铰链区序列”欲指存在于IgG4中并自按照Kabat的EU索引的氨基酸226延伸至230的氨基酸序列CPSCP (SEQ D NO:1) (通常称为下铰链)。核心铰链区有别于上铰链区，上铰链区在人IgG4中为序列ESKYGPP。

本文所用术语“可变区”是指能够与抗原特异性结合并包括互补决定区(CDR)即CDRl、CDR2和CDR3及构架区(FR)的氨基酸序列的本文定义的抗体的轻链和/或重链的部分。例如，可变区包含3个或4个FR (例如FR1、FR2、FR3和任选FR4)以及3个CDR。在来源于IgNAR的蛋白质的情况下，蛋白质可能没有CDR2。V_H是指重链的可变区。V_L是指轻链的可变区。

本文所用术语“Fab”欲指由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成的抗体的区域(单价抗原结合片段)，但是其中重链被截短使得它没有CH2和CH3结构域(即VH、CH1、VL和CL)，并且还可能没有铰链区的一些或全部。它可通过用酶木瓜蛋白酶消化完整抗体而产生。Fab可指分离中的该区，或在全长抗体、免疫球蛋白构建体或Fab融合蛋白情况下的该区。

本文所用术语Fab’可通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着还原而获得，得到由完整轻链和包含V_H和单一恒定结构域的重链的部分组成的分子。按这种方式处理每抗体获得两个Fab'片段。

所谓“scFv”，它是指包含抗体VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链上。参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,856,456。一般，Fv多肽还包含在V_H和VL结构域之间且使scFv能够形成用于抗原结合所需结构的多肽接头。有关scFv的综述参见Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, 编辑Rosenburg和Moore (Springer-Verlag, New York)，第269-315页。Fv片段的VH和VL结构域复合物还可通过二硫键稳定(美国专利号5,747,654)。

所谓“无或最小效应子功能”，它是指通常可归因于IgG1型抗体的某些活性(例如补体结合或依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的刺激)被降低或消除。

本文所用术语“分离的”是指从其天然环境中提取的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。因此，对于本发明的目的，通过重组宿主产生的抗体、免疫球蛋白构建体或融合蛋白被视为分离的。优选分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白是基本上纯的。

所谓“基本上纯的”意指抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白基本上不含其来源于其中的细胞或组织源的细胞物质或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。该用语包括自其从中分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的抗体、免疫球蛋白构建体或融合蛋白的制备物。因此，基本不含细胞物质的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包括具有小于约30%、20%、10%或5% (以干重计)的污染蛋白质和培养基的制备物。

术语“免疫球蛋白IgG4融合蛋白”是指与修饰的人IgG4铰链区和修饰的人IgG4 Fc区和/或其FcRn结合结构域连接或相连的生物活性分子。稍后将更详细地论述融合蛋白。

本文所用术语“体内半寿期”是指含有Fc区和/或其FcRn结合结构域的特定抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在规定动物的循环中的循环半寿期，并用动物中给予量的一半从循环中清除所需时间表示。当将本发明的给定抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的清除曲线构建为时间的函数时，该曲线通常为双相的，具有快速的α期和较长的β期，其中α期表示血管内和血管外间隙之间的注射IgG分子的平衡，并且部分由分子的大小决定，而较长的β期表示血管内间隙IgG分子的分解代谢。术语“体内半寿期”实际上相当于β期修饰或未修饰的IgG4免疫球蛋白或融合蛋白的半寿期。

本文所用术语“体内半寿期延长”意指按照本发明修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在血清或血浆中具有较大持久性和/或相对于不含相同取代的同一抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，要花较长时间降低到半最大测量血清或血浆浓度。

术语“重组体”应理解为意指人工遗传重组的产物。因此，在包含抗体抗原结合结构域的重组体蛋白的情况下，该术语不包括天然存在于受试者体内的是在B细胞成熟期间发生的自然重组的产物的抗体。然而，如果分离这类抗体，则它被视为包含抗体可变区的分离的蛋白质。同样地，如果采用重组体方法分离并表达编码该蛋白质的核酸，则所得蛋白质是包含抗体抗原结合结构域的重组体蛋白。术语重组体还包括当它位于例如它在其中表达的细胞、组织或受试者内时，通过人工重组体方法表达的抗体、免疫球蛋白或融合蛋白。

术语“特异性结合”是指与某一抗原(例如表位或免疫复合物)特异性或优先结合且不与其它抗原(例如其它结构上或功能上相关的蛋白质，或具有序列同源性的蛋白质)特异性结合(即交叉反应)的分子(例如抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白)。与抗原特异性结合的分子可以较低亲和力与其它肽或多肽结合，这通过例如免疫测定法、BIAcore或本领域已知的其它测定法测定。优选与抗原特异性结合的分子不与其它蛋白质交叉反应。可通过例如免疫测定法、BIAcore或本领域技术人员已知的其它技术，鉴定与抗原特异性结合的分子。作为非限制性实例，如果抗体与一种抗原结合的解离常数(K_D)小于该抗体对另一种抗原的K_D，则所述抗体可视为与该抗原优先结合。在另一个非限制性实例中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的K_D至少一个数量级的亲和力结合第一抗原，则抗体可被视为优先结合所述第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体以小于该抗体对第二抗原的K_D至少两个数量级的亲和力结合第一抗原，则抗体可被视为优先结合所述第一抗原。

本文所用术语“治疗”或“医治”是指给予足以减轻或消除特定疾病或病况的至少一种症状的“治疗有效量”的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或融合蛋白。

本文所用术语“预防”或“防止”是指给予足以终止或阻碍特定病症或病况的发展的治疗有效量的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。

本文所用术语“治疗有效量”应视为意指抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白减轻或抑制临床疾病的一种或多种症状至低于所观察且可接受的作为该疾病的临床诊断或临床特性的水平的足够量。技术人员应了解，该量将随例如所给予特定抗体、免疫球蛋白构建体和/或免疫球蛋白IgG4融合蛋白和/或特定受试者和/或疾病的类型或严重程度或水平而变化。因此，该术语不得解释为限制本发明至特定的量，例如重量或数量，而是本发明包括足以在受试者中达到所述结果的抗体、免疫球蛋白构建体和/或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的任何量。

本文所用术语“药学上可接受的”意指经联邦或州政府管理机构批准或列于美国药典或其它普遍公认的药典以用于人。

本文所用术语“受试者”应视为意指人或非人灵长类动物，或具有人FcRn的非灵长类哺乳动物。

氨基酸取代

取代氨基酸的方法是本领域已知的。例如，氨基酸取代可通过位点定向诱变进行(例如Zoller和Smith Nucl. Acids Res. 10:6487 (1982))。可通过合成待修饰抗体恒定结构域序列内具有一个或多个修饰的寡核苷酸来进行诱变。位点专一诱变允许通过使用以下来产生突变体：编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数目的邻接寡核苷酸以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，以在待跨越缺失连接处的两端形成稳定的双链体。通常优选长度约17-约75个核苷酸或更多个核苷酸的引物，其经改变序列的连接处两端上有约10-约25或更多个残基。可以使用在一个或多个位置上引入各种不同的突变的许多这类引物，以产生突变体文库。

位点专一诱变的技术是本领域众所周知的(参见例如Kunkel等, Methods Enzymol. ，154:367-82，1987)。总的来说，通过首先获得单链载体或使双链载体的两条链部分解链，来进行位点定向诱变，所述载体在其序列内包括编码所需肽的DNA序列。一般合成制备带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后使该引物与单链载体退火，并受DNA聚合酶例如T7 DNA聚合酶支配，以完成带有突变链的合成。因此，形成异源双链，其中一条链编码原始的非突变序列，第二条链带有所需突变。然后使用该异源双链载体转化或转染合适的细胞，例如大肠杆菌(E. coli)细胞，选择包括带有突变序列排列的重组载体的克隆。正如所了解的一样，该技术通常利用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。可用于位点定向诱变的典型载体包括例如M13噬菌体等载体。这些噬菌体是容易市售可获得的，其用途普遍为本领域技术人员所熟知。双链质粒按常规也用于位点定向诱变，其消除将目标基因从质粒转移至噬菌体的步骤。位点定向诱变还已用来鉴定影响鼠IgG1铰链-Fc片段的血浆清除率的氨基酸残基，如Kim Jin-Kyoo等(1994) Eur. J. Immunol. 24:542-548)的描述。

或者，使用市售可获得的热稳定酶(例如Taq DNA聚合酶)的PCR可用来将诱变寡核苷酸引物掺入扩增的DNA片段，然后可将其克隆至合适的克隆或表达载体中。有关PCR介导的诱变法参见例如Tomic等, Nucleic Acids Res., 18(6):1656，1987和Upender等, Biotechniques, 18(1):29-30，32，1995。除热稳定聚合酶以外，利用热稳定连接酶的PCR也可用来将磷酸化诱变寡核苷酸掺入扩增的DNA片段，然后将其克隆至合适的克隆或表达载体中(参见例如Michael, Biotechniques, 16(3):410-2，1994)。

可以采用本领域技术人员已知的产生抗体Fc区或其FcRn结合结构域的序列变体的其它方法。例如，编码抗体恒定结构域的氨基酸序列或其片段的重组体载体可用诱变剂(例如羟胺)处理以获得序列变体。

可采用常规测定法(例如稍后描述的测定法)，筛选导致对FcRn的亲和力提高和体内半寿期延长的突变体。

示例性的氨基酸取代包括按照EU Kabat编号系统的T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。其它或替代性氨基酸取代描述于例如US20070135620或US7083784。

本发明的抗体

本发明的抗体或免疫球蛋白包括结合(按照本领域已知的用于测定特异性抗原-抗体结合的免疫测定法测定)抗原和含有Fc区或FcRn结合结构域的任何免疫球蛋白分子或抗体。抗体可以是多克隆的、单克隆的或单特异性的、双特异性的(在抗体的多聚体形式的情况下)、人、人源化、嵌合、superhumanized^®、灵长类动物源化或去免疫化的。在另一个实例中，本发明的抗体可以是单特异性(或双特异性的、三特异性的或如以多聚体形式存在的话，具有更高的多特异性)。

特别是，抗体为单特异性四聚体。

抗体(和本文所述的其它免疫球蛋白构建体或融合蛋白)可来自任何动物源。优选抗体是人或人源化的。本文所用术语“人”抗体包括人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体和包括自人免疫球蛋白文库或自对一个或多个人免疫球蛋白是转基因的并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如描述于例如US 5,939,598。

本发明的一种或多种抗体包含稳定的IgG4铰链区。术语“稳定的IgG4铰链区”应理解为意指经修饰以减少Fab臂交换或进行Fab臂交换的倾向或形成半抗体或形成半抗体的倾向的IgG4铰链区。“Fab臂交换”是指人IgG4的蛋白质修饰的一种类型，其中以IgG4重链和所连接的轻链(半分子)交换来自另一个IgG4分子的重链-轻链对。因此，IgG4分子可获得识别两个截然不同的抗原的两个截然不同的Fab臂(导致双特异性分子)。Fab臂交换在体内天然发生，并且可通过纯化的血细胞或还原剂(例如还原型谷胱甘肽)体外诱导。当IgG4抗体解离形成各含有单一重链和单一轻链的两个分子时形成“半抗体”。

稳定的IgG4铰链区包含在按照Kabat的EU编号系统的228位的丝氨酸至脯氨酸的取代(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001和Edelman等, Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969)，其相当于按照Kabat的编号系统241位的丝氨酸至脯氨酸的取代(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987和/或1991)。为了避免产生歧义，这是指IgG4铰链区序列CPSCP (SEQ ID NO:1)中心的丝氨酸。在脯氨酸取代丝氨酸后，IgG4铰链区包含序列CPPCP。在这一方面，技术人员应意识到，“铰链区”是连接Fc和Fab区的赋予两个抗体Fab臂可动性的抗体重链恒定区的富含脯氨酸的部分。

在一个实例中，本发明的抗体可呈多聚体形式。例如，抗体可呈单体免疫球蛋白分子的抗体二聚体、三聚体或高次多聚体的形式。完整免疫球蛋白分子或F(ab')₂片段的二聚体是四价的，而Fab片段或scFv分子的二聚体是二价的。抗体多聚体内的各个单体可以是相同的或不同的，即它们可以是异聚的或同聚的抗体多聚体。例如，多聚体的各个抗体可具有相同或不同的结合特异性。

抗体的多聚化可通过抗体的天然聚集或通过本领域普通技术人员已知的化学或重组体连接技术实现。例如，一定百分比的纯化抗体制备物自发地形成含有抗体同二聚体和其它高次抗体多聚体的蛋白质聚集体。或者，抗体同二聚体可通过本领域已知的化学连接技术形成。作为非限制性实例，异双官能交联剂，包括但不限于SMCC [4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺基酯]和SATA [S-乙酰基硫代-乙酸N-琥珀酰亚胺基酯] (可获自例如Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford，111.))，可用来形成抗体多聚体。Ghetie MA等人提供了用于形成抗体同二聚体的示例性方案。抗体同二聚体可通过用胃蛋白酶消化转化为F(ab')₂同二聚体。形成抗体同二聚体的另一种方法是通过使用描述于Zhao Y和Kohler H J. Immunother (1997) 25(5):396-404的autophilic Tl 5肽。

或者，可以天然地或通过重组DNA技术制备抗体以多聚化。ScFv二聚体还可通过本领域已知重组技术形成；Goel A等，Cancer Research 60(24):6964-6971提供了构建scFv二聚体的一个实例。抗体多聚体可通过本领域已知的任何合适的方法纯化，例如大小排阻层析法。

抗体衍生物

本发明还提供包含本文所述抗体分子(例如V_H结构域和/或V_L结构域)的变体(包括衍生物)或由所述变体组成的抗体，所述抗体特异性地结合抗原肽(例如IL-5抗原或CD33抗原)。可采用本领域技术人员已知技术将突变引入编码本发明的分子的核苷酸序列中，包括例如导致氨基酸取代的位点定向诱变和PCR介导的诱变。

本发明的抗体衍生物还包括保守氨基酸取代进入免疫球蛋白V_L和/或V_H区中。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有含类似电荷的侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域已界定了具有含类似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，可例如通过饱和诱变，沿编码序列的全部或部分随机引入突变，可针对生物活性筛选所得突变体以鉴定保持活性(例如结合本发明的抗原肽的能力)的突变体。

术语“保守取代”应视为意指表1给出的氨基酸取代。

表1. 示例性取代

原始残基	示例性取代
		Ala (A)	val；leu；ile；gly
Arg (R)	lys
		Asn (N)	gln；his
Asp (D)	glu
		Cys (C)	ser
Gln (Q)	asn；his
		Glu (E)	asp
Gly (G)	pro；ala
		His (H)	asn；gln
Ile (I)	leu；val；ala
		Leu (L)	ile；val；met；ala；phe
Lys (K)	arg
		Met (M)	leu；phe
Phe (F)	leu；val；ala
		Pro (P)	gly
Ser (S)	thr
		Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
		Tyr (Y)	trp；phe
Val (V)	ile；leu；met；phe；ala

例如，可仅在抗体分子的构架区或仅在CDR区引入突变。所引入的突变可以是沉默突变或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或几乎没作用。这些突变类型可用于使密码子选择最优化，或改进细胞系的抗体产生。

或者，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。本领域的技术人员应能够设计和测试具有所需性质(例如抗原结合活性未改变或结合活性改变(例如抗原结合活性改进或抗体特异性改变))的突变体分子。在诱变后，可按常规表达所编码的蛋白质，并可采用本文所述技术或通过本领域已知的常规改进技术，测定编码蛋白质的功能活性和/或生物活性(例如特异性结合本发明抗原肽的能力)。

本发明的抗体包括通过任何分子类型与抗体共价连接使得共价连接不妨碍抗体结合抗原的另外修饰的衍生物。例如，抗体衍生物包括通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封端基团衍生化、蛋白水解、与细胞配体或其它蛋白质连接等而被修饰的抗体。可通过本领域已知技术，包括特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等，来进行许多化学修饰的任一种。另外，衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。

另外，本发明的抗体可化学合成。例如，可通过使用肽合成仪合成相当于蛋白质一部分的肽。此外，如有需要，非典型氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代和/或添加引入复合物的多肽的一个、任一个、两个、几个或全部序列中。

非典型氨基酸包括但不限于常用氨基酸的D-异构体、氟-氨基酸、设计的氨基酸(designer amino acid)例如β-甲基氨基酸、C γ-甲基氨基酸、N γ-甲基氨基酸和通用的氨基酸类似物。

本发明还提供包含与不同部分(例如与抗体直接或间接结合的治疗剂)缀合的本发明的抗体或免疫球蛋白构建体(contract)的免疫缀合物。其它部分的实例包括但不限于细胞毒素、放射性同位素(例如碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调节剂、抗血管生成药、抗新血管形成药和/或其它血管形成药、毒素、抗增殖药、促凋亡药、化疗剂和治疗性核酸。

细胞毒素包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何作用剂。有关本领域已知的这类药物类别的描述及其作用机制，参见Goodman等，Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Macmillan Publishing Co.，1990。例如Vitetta (1993)和US 5,194,594提供了有关抗体免疫毒素制备的其它技术。示例性的毒素包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链 (来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、曲霉丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌毒素。参见例如WO 93/21232。

用于形成本发明的免疫缀合物的合适治疗剂包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌罗霉素、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(例如氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物例如卡铂)、抗生素(例如放线菌素D (旧称放线菌素)、博来霉素、柔红霉素(旧称道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))。

可获得各种放射性核素用于放射性缀合的抗体的产生。实例包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

抗体和治疗剂的缀合物使用各种双官能蛋白质偶联剂制备，所述双官能蛋白质偶联剂例如但不限于4-(4'乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰基苯基乙酸(acidic acid) (AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基噻烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(例如二甲基己二亚酰胺化物HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)及其衍生物。例如，可按Vitetta等(1987)所述，制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂(WO 94/11026)。

本发明的免疫球蛋白构建体

本文所用术语“免疫球蛋白构建体”欲指其中抗原结合抗体片段与本发明的修饰的人IgG4铰链区和修饰的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域连接的构建体。

特别引人关注的是包含重链(CH1-铰链-CH2-CH3)的Fc区、Fc融合物和恒定区的免疫球蛋白构建体。

具体的抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)由单一可变区组成的dAb片段(Ward等(1989) Nature 341:544-546)，(v)分离的CDR区，(vi) F(ab’)2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合形成抗原结合部位(Bird等(1988) Science 242:423-426；Huston等(1989) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883)，(viii)双特异性单链Fv (WO 03/11161)，和(ix)双链抗体和三链抗体或四链抗体(Tomlinson等(2000) Methods Enzymol 326:461-479；WO 94/13804；Hollinger等(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448)。可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定分子(Reiter等(1996) Nature Biotech 14:1239-1245)。

应了解，上述片段(其不含铰链区)可与其中铰链用作接头的铰链-Fc区连接。

在另一个实例中，抗体片段可以是由scFV-CH3和铰链区序列组成的柔性微型抗体(flex minibody) (描述于Hu，Shi-zhen等(1996) Cancer Research 56:3055-3061)。

抗体制备

可采用本领域已知的各种技术，包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术或其组合，来制备抗体。例如可使用杂交瘤技术，包括本领域已知的和例如Harlow等，Antibodies: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 第2版, 1988)教导的杂交瘤技术，来产生单克隆抗体。

本文所用术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。该术语是指来源于单个克隆(包括任何原核、真核或噬菌体克隆)，而不是其借以产生的方法的任何抗体。

使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域的常规方法。例如，小鼠可用目标抗原或表达这类抗原的细胞免疫。一旦检出免疫应答，则收获小鼠脾，分离脾细胞。然后使脾细胞与骨髓瘤细胞融合。杂交瘤通过有限稀释选择并克隆。然后通过本领域已知方法，针对分泌能够结合抗原的抗体的细胞来测定克隆。可通过用阳性杂交瘤克隆给小鼠腹膜内接种，以产生一般含有高水平抗体的腹水。

识别特异性表位的抗体片段可通过常规技术产生。例如，可使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)₂片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白水解来产生Fab和F(ab′)₂片段。F(ab′)₂片段含有完整轻链和重链的可变区、CH1区和铰链区。

还可采用各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面展示。在一个具体的实施方案中，这类噬菌体可用来展示自库(repertoire)或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合结构域，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可用抗原，例如使用标记的抗原或结合或俘获在固体表面或珠粒上的抗原，来选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体。用于这些方法的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白质。或者，本发明免疫球蛋白的修饰的FcRn结合部分也可在噬菌体展示系统中表达。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括公开于以下文献的方法：Brinkman等, J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995；Ames等, J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；Kettleborough等, Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994；Persic等, Gene, 187:9-18, 1997；Burton等, Advances in Immunology, 57:191-280, 1994；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公布WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。

在噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区，并用来产生完整抗体，包括人抗体或任何其它所需片段，并且在任何所需宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，还可采用本领域已知方法，例如公开于PCT公布WO 92/22324；Mullinax等, Biotechniques, 12(6):864-869，1992；Sawai等，AJRI ，34:26-34，1995；以及Better等，Science ，240:1041-1043，1988的方法，用于重组产生Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术。可于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括公开于以下文献的技术：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等, Methods in Enzymology, 203:46-88，1991；Shu等，PNAS ，90:7995-7999，1993；以及Skerra等，Science ，240:1038-1040，1988。

抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白 IgG4 融合蛋白的重组产生

本发明的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白可重组产生。例如，采用常规方法(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，易于分离编码本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的DNA并测序。杂交瘤细胞用作这类抗体DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至本身并不产生抗体蛋白质的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。有关在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)和Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)。实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的。各种各样的克隆和体外扩增方法适于重组核酸的构建。在许多克隆运用中足以指导技术人员的这些技术和操作指南的实例参见Berger和Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 第152卷, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)；Sambrook等(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2版), 第1 3卷, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook)；以及Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等主编, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994增刊) (Ausubel)。产生重组免疫球蛋白的方法也是本领域已知的。参见Cabilly，美国专利号4,816,567；以及Queen等(1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA USA 86: 10029 10033。

对于重组体产生，优选分离编码抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的核酸，并插入可复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。采用常规方法(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)，易于分离或合成编码抗体或融合蛋白的DNA。许多载体是可获得的。载体组分一般包括但不限于以下的一个或多个：信号序列、编码本发明的抗体或其片段的序列(例如来源于本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。

(i) 信号序列组分。本发明的抗体不仅可以直接重组产生，还可作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽N端具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选为被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II前导序列的类型的原核信号序列取代。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C. albicans)葡糖淀粉酶前导序列或描述于WO 90/13646的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)。使这类前体区的DNA与编码抗体的DNA符合读框地连接。

(ii) 启动子组分。表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别的启动子，并且与抗体核酸有效连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子例如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子是适宜的。用于细菌系统的启动子还可含有与编码抗体的DNA有效连接的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。

已知用于真核生物的启动子。几乎所有真核基因都具有位于距转录启始的位点上游约25-30个碱基的富含AT的区。距许多基因的转录起点上游70-80个碱基存在的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾添加至编码序列3'端的信号。所有这些序列均适宜于插入真核表达载体。用于酵母宿主的合适启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或以下其它糖解酶的启动子：例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。作为受生长条件控制的具有其它转录优势的诱导型启动子的其它酵母启动子有醇脱氢酶2、isocytochrome C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步描述于EP 73,657。还与酵母启动子一起有利地使用酵母增强子。

哺乳动物宿主细胞中载体的抗体转录受例如获自例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、CMV、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40 (SV40)的基因组的启动子和来自异种哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热激启动子的的启动子控制，只要这类启动子与宿主细胞系统相容。

(iii) 增强子元件组分。编码本发明抗体的DNA通过高等真核生物的转录常常通过将增强子序列插入载体而增加。目前已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常可使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点最近侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点近侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。有关用于真核启动子活化的增强元件另参见Yaniv (1982) Nature 297: 17-18。可使增强子在抗体编码序列的5'或3'位置剪接至载体中，但优选位于启动子的5'位点。

(iv) 转录终止组分。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体还可含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这类序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区，偶尔获自3'非翻译区。这些区含有作为编码抗体的mRNA非翻译部分中的聚腺苷酸化片段而转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/1 1026及其中公开的表达载体。

(v) 宿主细胞的选择和转化。用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌(Bacilli)例如枯草芽胞杆菌(B. subtilis)和地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294 (ATCC 31,446)，但是其它菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776 (ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110 (ATCC 27,325)也是适宜的。这些实例是说明性而非限制性的。

除原核生物以外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的发面酵母最常用于低等真核宿主微生物。然而，许多其它属、种和菌株是普遍可获得的，并且在文中是有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主例如乳酸克鲁维酵母(K. lactis)、脆壁克鲁维酵母(K. fragilis) (ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、维克克鲁维酵母(K. wickeramii) (ATCC 24,178)、维肯克鲁维酵母(K. waltii) (ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)；西洋蓍霉属(yarrowia) (EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒毒株和变体及来自以下宿主的相应的允许昆虫宿主细胞：例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti) (蚊)，白纹伊蚊(Aedes albopictus) (蚊)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) (果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的各种病毒毒株是可公开获取的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica) NPV的L-I变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，且这类病毒可用作本文的本发明的病毒，特别用于转染草地贪夜蛾细胞。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40 (COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CVl系；人胚肾系(用于在悬浮培养中生长而亚克隆的293或293细胞，Graham等(1977) Gen Virol. 36:59) ；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub等(1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216) ；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251 )；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等(1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞和PER.C6™ (Crucell NV)。

宿主细胞用上述表达或克隆载体转化用于抗体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的产生，并在经改良以适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。

(vii) 培养宿主细胞。可将用于产生本发明抗体的宿主细胞培养在各种培养基中。市售可获得的培养基例如Ham's Fl0 (Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMl-1640 (Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，以下文献描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基：Ham等(1979) Meth. Enz. 58:44；Barnes等(1980) Anal. Biochem. 102:255；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或美国专利参考号30,985。必要时，这些培养基的任一种都可补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN™药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能源。还可包括以本领域技术人员应了解的合适浓度的任何其它必需补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是与之前选用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，对普通技术人员而言将是显然的。

嵌合抗体

本发明的抗体可以是嵌合抗体。通过使获自一种物种的抗体产生细胞的可变轻链区和重链区(VL和VH)与得自另一物种的恒定轻链区和重链区组合，通过重组方法来制备嵌合抗体。通常嵌合抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区以产生具有主要是人结构域的抗体。例如，嵌合抗体包含与人恒定区融合的小鼠抗体可变区。这类嵌合抗体的产生是本领域已知的，并可通过标准方法实现(描述于例如Morrison，Science 229:1202 (1985)；Oi等, BioTechniques 4:214 (1986)；Gillies等, (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397)。

灵长类动物源化抗体

术语“灵长类动物源化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。用于产生灵长类动物源化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570、5,681,722和5,693,780。

人源化和人抗体

包括在本发明范围内的有具有采用描述于例如专利申请号EP0983303、WO 00/34317和WO 98/52976的方法产生的序列变化的去免疫化抗体。

术语“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括自人免疫球蛋白文库或自描述于例如美国专利号5,939,598的对一种或多种人免疫球蛋白是转基因的动物分离的抗体。人抗体可通过本领域已知的各种方法制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示。另参见WO 98/46645、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。

本发明的抗体可以是人源化抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其它抗原结合亚序列)。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在某些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个Fv构架残基被相应的非人残基置换。人源化抗体还可包含既不存在于接受者抗体中也不存在于输入CDR或构架序列中的残基。总的来说，人源化抗体可包含基本上所有或至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区相当于非人免疫球蛋白的CDR区，而所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最适宜还可包含至少免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的一部分(Jones等(1986) Nature，321:522-525；Riechmann等(1988) Nature，332:323-329；以及Presta (1992) Curr Op Struct Biol，2:593-59)。

用于使非人抗体人源化的方法可基本上按照Winter与同事(Jones PT等(1986) Nature 321(6069):522；Riechmann L等(1988) Nature 332(6162):323-327；Verhoeyen M等(1988) Science 239(4847):1534-1536)的方法进行。人源化抗体一般具有自非人来源导入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基取代的人抗体。

可采用各种本领域已知的技术，包括例如CDR移植(EP 239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、饰面或表面重建(EP 592106；EP519596；Padlan EA等(1991) Mol Immunol 28(4-5):489；Studnicka GM等(1994) Protein Eng 7(6):805-14)和链改组(美国专利5,565,332)，使抗体人源化。

在某些情况下，人免疫球蛋白一个或多个可变区的构架区内的残基被相应的非人残基置换(参见例如Queen，美国专利5,585,089、美国专利5,693,761、5,693,762和6,180,370。

本发明还延伸到按照描述于US 6,881,557和7,732,578的称为Superhumanization^®的方法人源化的抗体。简单地说，用于人源化抗体的这些方法以以下为基础：通过将非人抗体可变区CDR序列的典型CDR结构类型与来自人抗体序列文库的相应CDR的典型CDR结构类型进行比较，而从人抗体基因选择可变区构架序列。具有与非人CDR类似的典型CDR结构类型的人抗体可变区构成从中选择人构架序列的人抗体序列成员亚组。

还包括在本发明范围内的有“饰面抗体”。术语饰面抗体是指构架区残基被人构架区残基选择性置换以提供包含基本保持所有天然构架区折叠结构的抗原结合部位的异种分子。饰面技术基于这样的理解，即抗原结合部位的配体结合特性主要由抗原结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对配置决定。通过采用饰面技术，易面临免疫系统的外部(例如溶剂可达的)构架区残基被人残基选择性置换，以提供包含弱免疫原性或基本无免疫原性的饰面表面的杂合分子。

也可采用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter (1991) J Mol Biol，227:381；Marks等(1991) J Mol Biol，222:581)，来产生人抗体。Cole等人和Boerner等人的技术也适于制备人单克隆抗体(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77页(1985)和Boerner等(1991) J Immunol，147:86-95)。同样地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)，来制备人抗体。在攻击时，观察人抗体产生，这在所有方面(包括基因重排、装配和抗体库)都十分类似于在人中观察到的。该方法描述于例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016。

在另一个实施方案中，通过免疫转基因小鼠获得完全人抗体。一种这样的小鼠采用XenoMouse^TM技术(Abgenix；Fremont，Calif)获得，并公开于美国专利号6,075,181、6,091,001和6,114,598。预期完全人抗体使小鼠或小鼠衍生化单克隆抗体固有的免疫原性和变态反应减至最低，因此提高所给予抗体的功效和安全性。

识别选定表位的完全人抗体还可采用称为“引导选择(guided selection)”的技术产生。在该方法中，使用选定的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)以引导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等, Bio/technology 12:899-903 (1988))。

还可采用本领域已知的选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。优选的亲和力成熟抗体具有的亲和力是成熟抗体从中制备的起始抗体(一般为鼠、人源化或人的)的5倍、更优选10倍、甚至更优选20或30倍。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有所述改变的亲本抗体相比，导致抗体对IL-5的亲和力提高。Marks等(1991) J Mol Biol 222:581-597描述通过VH和VL结构域改组引起的亲和力成熟。

抗体结合

可通过本领域已知的任何方法，针对特异性结合对本发明的抗体进行测定。可采用的免疫测定法包括但不限于采用以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如BIAcore分析、FACS (荧光激活细胞分选仪)分析、免疫荧光法、免疫细胞化学、蛋白质印迹法、放射性免疫测定法、ELISA、夹心免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、A蛋白免疫测定法等。

免疫球蛋白 IgG4 融合蛋白

本发明还提供包含与本发明的修饰的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和修饰的人IgG4核心铰链区序列重组融合或化学缀合(包括共价或非共价缀合)的生物活性分子的融合蛋白。术语融合蛋白通常与术语“免疫黏附素”同义。虽不希望受理论约束，但认为免疫球蛋白IgG4融合蛋白的突变稳定铰链区，且Fc区的突变提高对人FcRn的亲和力。在一个具体的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其缺乏C端氨基酸(赖氨酸)的变体。

其是融合的生物活性分子可以是本领域技术人员已知的任何多肽或合成药物。合适多肽的实例包括细胞因子、细胞黏附分子(例如CTLA4、CD2和CD28)、配体(例如TNF-α、TNF-β和抗血管生成因子)、受体和生长因子(例如PDGF、EGF、NGF和KGF)、酶、趋化因子。

可以融合的生物活性分子还可以是非蛋白质性聚合物例如聚乙二醇或聚丙二醇。

用于产生本发明的生物活性分子或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的方法包括标准重组技术或蛋白质合成技术(例如通过使用自动蛋白质合成仪)。例如，编码本发明的生物活性分子的核酸分子可通过常规技术(包括自动DNA合成仪)合成。或者，基因片段的PCR扩增可使用在两个邻接基因片段间产生互补突出端的锚定引物进行，所述邻接基因片段随后可退火并再扩增以产生嵌合基因序列。此外，可将编码分子的核酸序列克隆至含有Fc区或其FcRn结合结构域的表达载体中，使得该分子与Fc区或其FcRn结合结构域符合读框地连接。

用于使多肽与抗体恒定区融合或缀合的方法是本领域已知的(参见例如US 5,336,603、US 5,622,929、US 5,359,046、US 5,349,053、US 5,447,851、US 5,723,125、US 5,783,181、US 5,908,626、US 5,844,096、US 5,112,946、US7,955,590)。

编码生物活性分子的核苷酸序列可获自例如Genbank，并且可通过对采用本文所述技术产生的突变体进行序列分析，来获得编码恒定结构域的核苷酸序列。可将编码融合蛋白的核苷酸序列插入合适的表达载体中。

多核苷酸

本发明还提供包含编码本发明的修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸和在高严格性条件下与之杂交的多核苷酸序列。

本发明的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白 IgG4 融合蛋白的半寿期的测定法

可按照Kim等，Eur J of Immunol 24:542 (1994)描述的方法，通过药代动力学研究(PK)测量本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的半寿期。按照该方法，将放射性标记的修饰的免疫球蛋白静脉内注射给小鼠，随时间的变化定期测量其血浆浓度，例如注射后3分钟-72小时。由此获得的清除率曲线应是双相的，即α期和β期。为了测定本发明的修饰的免疫球蛋白或融合蛋白的体内半寿期，计算β-期的清除率，并与野生型或未修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或IgG4融合蛋白的清除率相比较。

PK研究(例如上述PK研究)可在人源化FcRn小鼠模型中进行，其中按照Petkova SB等(2006) International Immunology 18(12):1759-1769所述敲出鼠内源FcRn并敲入人FcRn。

据最近报道，抗体半寿期延长可与体内活性改进有关(Zalevsky J等(2010) Nature Biotechnology 28(2):157-159)。

为了将修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白结合FcRn的能力与野生型IgG₄的进行比较，可对包含IgG₄铰链区修饰和重链恒定区修饰的修饰的IgG₄抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白和野生型IgG₄进行放射性标记，并使其在体外与表达FcRn的细胞反应。然后可对细胞结合部分的放射活性进行计数和比较。用于该测定法的表达FcRn的细胞优选为内皮细胞系，包括来源于B10.DBA/2小鼠肺的小鼠肺毛细血管内皮细胞(B10，D2.PCE)和来源于C3H/HeJ小鼠的SV40转化的内皮细胞(SVEC) (Kim等, J. Immunol., 40:457-465，(1994))。然而，还可使用表达足够数目的FcRn的其它细胞类型，例如自10-14日龄乳小鼠分离的肠刷状缘。或者，还可使用表达选定物种的重组FcRn的哺乳动物细胞。在对修饰的免疫球蛋白或融合蛋白的结合部分的放射活性或野生型IgG₄的放射活性计数后，然后用洗涤剂提取结合分子，并且可计算每单位细胞数的百分比释放，并进行比较。

可采用例如所述的BIAcore 2000 (BIAcore，Inc) (Popov等, Mol Immunol., 33:493-502 (1996)；Karlsson等, J. Immunol. Methods, 145:229-240 (1991)，其通过引用予以结合)，通过表面等离振子共振(SPR)测量，来测量修饰抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合物对FcRn的亲和力。在该方法中，使FcRn分子与BIAcore传感器芯片(例如Pharmacia的Cm5芯片)偶联，并且应用BIA评价2.1软件，以特定流速测量修饰的免疫球蛋白或融合蛋白与固定化FcRn的结合以获得传感图，据此可计算修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白与FcRn的结合速率和解离速率。

还可通过简单的竞争结合测定法，测量修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白和野生型IgG₄对FcRn的相对亲和力。将未标记的修饰抗体/免疫球蛋白构建体/免疫球蛋白IgG4融合蛋白或野生型IgG₄按不同的量加入固定了FcRn的96孔板各孔中。然后将恒定量的放射性标记的野生型IgG₄加入各孔中。对结合部分的百分比放射活性与未标记的修饰免疫球蛋白/融合蛋白或野生型IgG₄的量作图，可从曲线斜率计算修饰抗体/免疫球蛋白构建体/免疫球蛋白IgG4融合蛋白的相对亲和力。

此外，还可通过饱和研究和Scatchard分析，测量修饰的抗体/免疫球蛋白构建体/免疫球蛋白IgG4融合蛋白和野生型IgG₄对FcRn的亲和力。

可使用放射性标记的IgG₄和FcRn表达细胞，并比较细胞单层一侧的放射活性与另一侧的放射活性，通过体外转移测定法，来测量修饰的抗体/免疫球蛋白构建体/免疫球蛋白IgG4融合蛋白和野生型IgG₄向FcRn的转移。或者，可通过用放射性标记的修饰的抗体/免疫球蛋白构建体/免疫球蛋白IgG4融合蛋白蛋白质饲喂10-14日龄乳小鼠，并定期对血样中表明IgG₄转移通过肠至循环(或任何其它靶组织)的放射活性计数，来体内测量这类转移。为了测试对IgG转移通过肠的剂量依赖性抑制，将特定比例的放射性标记和未标记的IgG₄的混合物给予小鼠，并可定期测量血浆的放射活性(Kim等，Eur J of Immunol 24:542 (1994))。

药物组合物和给药方式

本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白可用于胃肠外、局部、口服或局部给药、气雾剂给药或透皮给药，用于预防性或治疗性治疗。可根据给药方法给予各种单位剂型的药物组合物。例如，适于口服给药的单位剂型包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂和锭剂。公认的是，当口服给予时，必须防止本发明的药物组合物被消化。这通常通过使蛋白质与组合物形成复合物以赋予其酸性水解和酶促水解抗性，或通过将蛋白质包装在适当抗性的载体(例如脂质体)中来实现。防止蛋白质被消化的方法是本领域已知的。

本发明的药物组合物可特别用于胃肠外给药，例如静脉内给药或给予体腔或器官或关节腔。用于给药的组合物通常可包含溶于药学上可接受的载体、优选水性载体中的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的溶液剂。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液剂是无菌的，且一般不含不需要的物质。这些组合物可通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可按需含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的浓度可大幅度变化，可根据选定的具体给药方式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等来选择。

例如，对于胃肠外给药，可将主题抗体与药学上可接受的胃肠外溶媒混合配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、混悬剂、乳剂)。这类溶媒的实例为水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用非水溶媒例如混合油和油酸乙酯。脂质体也可用作载体。溶媒可含有提高等渗性和化学稳定性的少量添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。

可将本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白配制用于胃肠外给药，例如配制用于通过静脉内、肌内、皮下、经皮注射，或其它这类途径，包括蠕动给药和直接滴注至肿瘤或疾病部位(腔内给药)。通常这类组合物可制备成注射剂，作为液体溶液剂或混悬剂；还可制备适用于在注射前加入液体时制备溶液剂或混悬剂的固体形式；并且还可使制剂乳化。

适于注射用的药物形式包括无菌水性溶液剂或分散体、包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂和用于即时制备无菌注射溶液剂或分散体的无菌粉针剂。在所有情况下，所述形式应是无菌的并且是达到存在注射性的程度的流体。它在制造和贮存条件下应是稳定的，并应针对污染性微生物(例如细菌和真菌)作用进行防腐。

可将组合物配制成呈中性或盐形式的无菌含水组合物。可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备作为游离碱或药学上可接受的盐的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的溶液剂。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)和与无机酸(例如盐酸或磷酸)或如乙酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。

合适的载体包括含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂和分散介质。在许多情况下，可优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需粒径和/或通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。

在存贮和使用的正常条件下，所有这类制剂都可含有防腐剂以防止微生物的生长。可通过抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生防止微生物的作用。可在组合物中使用吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，使注射用组合物的吸收延长。

在配制前或在配制时，可对本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白进行充分透析以除去不需要的小分子量分子，和/或冻干用于适当时更易配制在所需溶媒中。通过将所需量的活性成分(需要时与上文列举的各种其它成分一起)掺入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌注射溶液剂。一般通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和所需的来自上文列举的其它成分的无菌溶媒中，来制备分散体。

在用于制备无菌注射溶液剂的无菌粉针剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其得到活性成分加上任何其它所需的来自其之前过滤除菌溶液的成分的粉针剂。

本发明的合适药物组合物一般可包含与可接受的药用稀释剂或赋形剂(例如无菌水溶液)混合的一定量的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，得到各种各样的最终浓度，这取决于预定用途。制备技术一般是本领域已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Company，1980 (通过引用结合到本文中)所例示。应了解，内毒素污染应最低限度地保持在安全水平，例如小于0.5 ng/mg蛋白质。

在配制时，将按与剂型相容的方式并且以是治疗/预防有效的量给予本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。以各种剂型容易地给予制剂，例如上述注射溶液剂的类型，但是还考虑其它药学上可接受的形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂或口服给药的其它固体剂、栓剂、阴道栓剂、鼻用溶液剂或喷雾剂、气雾剂、吸入剂、脂质体形式等。还可使用药物“慢释”胶囊剂或组合物。慢释制剂一般被设计成在延长的一段时间内给予恒定的药物水平，并且可用来递送本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。

在一些实施方案中，脂质体和/或纳米粒还可与活性成分一起使用。脂质体的形成和使用是本领域技术人员普遍所知的。脂质体可由分散在含水介质中并自发地形成多层向心性双分子层囊泡(亦称多层囊泡(MLV)的磷脂形成。MLV一般可具有25 nm-4 μm的直径。超声处理MLV导致直径范围为200-500埃、在核心中含有水性溶液的小单层囊泡(SUV)的形成。磷脂当分散在水中时可形成非脂质体的各种结构，这取决于脂质与水的摩尔比率。在低比率下，脂质体是优选的结构。脂质体的物理性质取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可对离子和极性物质显示低的通透性，但在高温下经历显著改变其通透性的相变。相变包括由紧密堆积的有序结构(称为凝胶状态)至松散堆积不太有序的结构(称为流态)的变化。这发生在特有的相变温度下，并导致对离子、糖和药物的通透性增加。

纳米胶囊一般可以稳定和可再现的方式俘获化合物。为了避免因胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够体内降解的聚合物，来设计这类超细颗粒(大小约0.1 μm)。还考虑了符合这些要求的生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯纳米粒用于本发明，且可容易地制备这类颗粒。

国际公布号WO/2002/080967描述了用于给予包含抗体的雾化组合物以治疗例如哮喘的组合物和方法，这也适于给予本发明的抗体。

可由本领域技术人员确定本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的剂量。然而剂量将取决于修饰的免疫球蛋白或融合蛋白的体内半寿期延长的程度。此外，还可通过经修饰(例如脂化)以提高摄取和组织渗透(例如进入肺)，来减少本发明的抗体或融合蛋白的给药剂量和频率。

用本发明的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白治疗包括单次治疗或系列治疗。可一周一次、一周两次、每两周一次、一月一次或每六周一次给予本发明的药物组合物。

本发明的修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白 IgG4 融合蛋白的应用

本发明的修饰的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白可用于各种非治疗用途。它们可用作亲和纯化剂。它们还可用于诊断测定法，例如检测特定细胞、组织或血清中目标抗原的表达。对于诊断应用，抗体通常可用可检测部分标记，包括放射性同位素、荧光标记和各种酶底物标记。抗体也可应用于任何已知的测定方法，例如竞争结合测定法、直接和间接夹心测定法及免疫沉淀测定法。抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白还可用于体内诊断测定法。抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白一般用放射性核苷酸标记，使得可使用免疫闪烁法定位抗原或抗原表达细胞。

抗 IL-5 抗体在疗法中的应用

哮喘和其它慢性变应性疾病发病机制的一般特征已被证实为嗜酸性粒细胞(尤其在肺支气管粘膜中)数升高。当活化时，嗜酸性粒细胞分泌积极参与炎性气道反应的多种介质。在嗜酸性粒细胞活化中，白介素5 (IL-5)起重要作用。

IL-5是一种存在于许多哺乳动物物种中的细胞因子，特别是已克隆出IL-5的人和鼠基因两者。人基因由位于染色体5的4个外显子与3个内含子组成，并编码134个氨基酸N端前导序列。活性IL-5是同二聚体，通过X射线晶体学确定了重组hIL-5的三维结构。IL-5的受体主要存在于嗜酸性粒细胞上，它由α链和β链组成。受体的α链对IL-5有特异性，而确保高亲和力结合和信号转导的β链，是与IL-3和GM-CSF的异二聚体受体共有的。

IL-5主要由完全分化的Th2细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞分泌。已表明它作用于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T淋巴细胞并作用于鼠B细胞。

IL-5对嗜酸性粒细胞的作用包括趋化作用、对内皮细胞的粘附增强和激活细胞终末分化。此外，已证实，IL-5防止成熟嗜酸性粒细胞细胞凋亡。这些研究结果对IL-5是嗜酸性粒细胞分化最重要的细胞因子的观点起促进作用。

虽然哮喘的现有治疗包括皮质甾类，但预期哮喘以及由嗜酸性粒细胞介导的其它病况的未来治疗将包括抗IL-5抗体。来自嗜酸性粒细胞的细胞因子和其它效应分子的不当分泌引起周围组织损害和功能障碍。嗜酸性粒细胞浸润和活化引起的终器损伤代表了几种疾病状态的共同致病组分，包括特应性疾病和嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)。明确需要减少人的嗜酸性粒细胞数的疗法。

病症治疗或预防中的本发明的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白 IgG4 融合蛋白

修饰的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白具有各种治疗应用。修饰的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白可用于治疗患有或易患疾病或病症的可获益于给予修饰的抗体的受试者。可用抗体治疗的病况包括癌症、炎性病况例如哮喘、自身免疫病和病毒感染等。

可通过本文所述抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。

自身免疫病包括但不限于艾迪生病(Addison's disease)、自身免疫性耳病、自身免疫性眼病例如眼色素层炎(uveitis)、自身免疫性肝炎、克罗恩病(Crohn's disease)、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病(Graves' disease)、格-巴综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、溃疡性结肠炎和血管炎。

本发明还包括用于治疗特征在于嗜酸性粒细胞增多的疾病的方法。哮喘是本发明方法的关键靶标，但其它慢性病况例如多发性变态反应(multiple allergy)、变应性鼻炎和嗜酸性粒细胞性食管炎也是合适的治疗靶标。因此，本发明方法的一个实施方案包括治疗和/或预防和/或改善哮喘或特征在于嗜酸性粒细胞增多的其它慢性变应性病况，所述方法包括给予下调IL-5活性至嗜酸性粒细胞细胞数显著减少的程度的抗IL-5抗体。

在本文的情况下，与治疗前的嗜酸性粒细胞数相比，嗜酸性粒细胞细胞数显著减少至少20%，但是考虑更多的百分比，例如至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%和甚至至少90%。减少可以是全身性的，或者更通常是局部性的，例如肺。

通过本领域已知方法测定嗜酸性粒细胞数，通常使用合适的样品支气管肺泡灌洗(BAL)液的显微镜检查，并在显微镜下手工对嗜酸性粒细胞的细胞数计数。或者，可采用能够分辨嗜酸性粒细胞的流式细胞术，来对嗜酸性粒细胞数计数。

本发明的修饰的抗CD33抗体可特别用于治疗癌症，更特别为髓细胞样白血病。本发明还包括按照本发明修饰以延长其半寿期的与卡奇霉素缀合的抗CD33 (Hamann PR等(2002) Bioconj Chem. 13(1):40-6)。抗CD33-卡奇霉素缀合物可用来治疗急性髓细胞样白血病。

非免疫调节抗体的效用 (utility)

本发明的抗体、免疫球蛋白构建体和免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含修饰的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和修饰的人IgG4核心铰链区序列。本领域已知，抗体恒定结构域的同种型影响抗体的效应子功能。各种人免疫球蛋白类别中，已知仅人IgG1、IgG2、IgG3和IgM激活补体；并且人IgG1和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。由于本发明的免疫球蛋白和融合蛋白包含IgG4恒定区序列，因此它们不能够激活补体级联或ADCC活性，并因此不能激活任何不需要的NK细胞或T细胞活化。因此，它们特别适于其中不需要激发可能只加重病情的细胞活化的变应性病况，例如哮喘。

在其抗炎活性方面，IgG4抗体在功能上不同于其它IgG亚类，所述抗炎活性包括由于对C1q (补体第一组分的q片段)和Fc γ受体的亲和力低引起的诱导补体和细胞活化的能力差。因此，IgG4成为其中宿主效应子功能募集是不合乎需要的免疫疗法的优选亚类。

抗 IL-5 抗体

本发明延伸到包含与本发明的修饰的人IgG4 Fc区和修饰的人IgG4铰链区连接的已知IL-5抗体的轻链和重链的可变区序列的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。抗IL-5抗体的几个实例描述于US 5,683,892、US 5,693,323、US 5,783,184、US 5,851,525、US 6,129,913、US 5,096,071、US 6,056,957和US 6,451,982。另外，人源化抗IL-5抗体CTIL-5-10gH/-gL6 (如US RE39,548E中的描述，在本文称为人源化39D10或hu39D10)和美泊利单抗特别适于本发明的修饰。

本领域技术人员应了解，在不偏离概括描述的本发明范围的情况下，可按具体实施方案所示对本发明进行各种变化和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面均被视为说明性而非限制性的。

取代的协同作用

本发明人发现，IgG₄免疫球蛋白或抗体Fc区中的YTE取代(即M252Y、S254T和T256E突变)，当与IgG₄抗体中的S228P铰链区突变组合时，体内协同地延长修饰IgG₄抗体的半寿期。如实施例所述，这针对结合两种不同的无关抗原的两种不同抗体而证实。

具体地讲，本发明人发现，虽然YTE取代提高修饰抗体对人FcRn的亲和力，但再将S228P修饰纳入铰链区对抗体与FcRn的亲和力不产生更多的作用。鉴于该区不与FcRn相互作用，因此这并不是完全未预料到的。因此可预测，有关S228P取代和YTE取代可能无协同作用。因为基于人蛋白质的药物中的任何修饰(包括包含人抗体恒定区的蛋白质)增加诱导患者的抗药物免疫应答的风险，通常的作法是限制这类突变的数目，以限制每个这类突变就诱导针对药物的这类免疫应答而言的推测的额外风险增加。然而，由于本文所述出人意料的结果，即两种修饰类别(Fc修饰和铰链修饰)的组合导致对IgG4抗体循环半寿期延长的超累加作用，因此这两类突变组合的益处可能超过有关引起抗药免疫反应发生率提高的理论缺点。分子半寿期延长的优势对本领域技术人员而言是直接明了的。这类益处包括较低的给药剂量和/或频率、降低受试者中不良事件的风险并降低成本。因此，具有半寿期延长的这类免疫球蛋白具有重大的药学重要性。

本文提及的所有参考文献或文件被视为通过引用以其整体结合。

在整个本说明书中措词“包含”或变化例如“包括”或“含有”应理解为意指包括所述要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤类，而不排除任何其它要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤类。

包括在本说明书中的文献、法案、材料、物品等的任何论述不得视为承认这些内容的任一个或全部构成现有技术基础的部分或是本发明相关领域的公知常识，尽管它在本申请各权利要求的优先日之前已存在。

实施例 1

材料与方法

hu39D10 及其变体的产生

编码人IgG4重链恒定区的基因自Quickclone cDNA文库(Clontech，Mountain View，CA)分离，并克隆至pTT5表达载体中(Durocher等, Nucleic Acids Research, 第30卷，第2期，第e9页)。为了在Fc结构域中引入上述突变，合成了具有一个或多个突变的互补序列的一组两个引物，并用于基于PCR的位点定向诱变。通过类似方式构建Ig κ表达载体。通过基于PCR的基因装配，使用18 (重链)或16 (轻链)个寡核苷酸，从已发表的蛋白质序列(US RE39,548E)反向设计编码hu39D10可变区的DNA片段(图1)。利用整合至载体用于克隆的限制位点，将该片段克隆至表达载体中。hu39D10重链和轻链的最终氨基酸序列见图1。该图还显示具有4个氨基酸取代的hu39D10序列(YTE+S228P，SEQ ID NO:6)。

hu39D10 和变体的表达和纯化

按照Durocher等, Nucleic Acids Research 第30卷，第2期，第e9页，将用于hu39D10的pTT5表达载体及其变体转染至HEK293 6E细胞。转染6天后，分离培养基，然后使用G蛋白-琼脂糖珠(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)进行亲和纯化。

FcRn/ β ₂ 微球蛋白复合物表达构建体的产生

使用Superscript III第一链合成试剂盒(First-strand Synthesis kit) (Invitrogen，Carlsbad，CA)，自用人Universal RNA (BioChain，Hayward，CA) (人总RNA池)合成的cDNA分离编码人FcRn和β₂微球蛋白的DNA片段。将FcRn的胞外结构域(氨基酸24-290)和β₂微球蛋白的成熟部分(氨基酸21-119)分别克隆至pTT5表达载体中。人FcRn胞外结构域和β₂微球蛋白的序列分别见图2和图3。

FcRn/ β ₂ 微球蛋白复合物的表达和纯化

将用于产生人FcRn和β₂微球蛋白的pTT5表达载体共转染至HEK293 6E细胞中。转染后6天，分离培养基，然后使用IgG-Sephasore珠(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)进行亲和纯化。

测量 hu39D10 和变体对 FcRn/ β ₂ 微球蛋白复合物的亲和力的 ELISA

将Maxisorp 96孔板(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)用5 ug/ml抗β₂微球蛋白单克隆抗体包被。然后将各孔用PBS洗涤，并用Superblock封闭溶液(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)处理。然后，将FcRn/β₂微球蛋白复合物在SPBS6T (50 mM磷酸钠缓冲液pH 6.0、150 mM NaCl、0.05% Tween-20)中稀释至5 ug/ml后，加入以供在室温下被包被的抗β₂微球蛋白抗体俘获60分钟。将各孔然后用SPBS6T洗涤，然后暴露于含hu39D10或其变体的SPBS6T中，在室温下温育60分钟。通过温育形成的hu39D10/FcRn复合物用抗人κHRP缀合物的F(ab’)2片段(SourthernBiotechnology，Birmingham，AL；SPBS6T中的1/5000稀释液)在室温下探测30分钟。用SPBS6T洗涤后，将100 ul TMB (Sigma)加载到各孔中用于信号检测。然后，加入50 ul 2N硫酸终止显色，然后在Vmax读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中测量A450。应用GraphPad Software (La Jolla，CA)的Prism软件，计算IgG变体对FcRn的亲和力并作图。

结果与结论

如图4所示，通过产生YTE突变，hu39D10对人FcRn的亲和力(EC50 = 3.8 nM)增加至4.7倍(至EC50 = 0.81 nM)。此外加入S228P突变对FcRn亲和力无作用(EC50 = 0.81 nM，与具有YTE突变的hu39D10相同)。这个结果并非是出乎意料的，因为S228P突变远离与FcRn相互作用的Fc区。根据这个结果，不会预期YTE与S228P突变对循环半寿期的任何协同作用。

实施例 2

PK 研究

通过Jackson Laboratory-West (Sacramento，CA)，用其内源FcRn已被敲出但具有人FcRn敲入的小鼠(4919 Tg276半合小鼠模型，描述于Petkova等(2006) International Immunology 第18卷，第12期，第1759-1769页)进行了小鼠PK研究。第0天，每组7只小鼠腹膜内(IP)接受hu39D10或其变体(200 ug)。在2、12、24小时和2、4、7、10、14、18、21和28天，从每只小鼠的眶后窦采血以制备血浆样品。

测量血浆样品中的 hu39D10 和变体的 ELISA

将Maxisorp 96孔板(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)用PBS中的2 ug/ml重组IL-5 (hu39D10抗原；R&D Systems，Minneapolis，MN)在冰箱中包被过夜。然后将各孔用PBS洗涤，用200 ul Superblock封闭溶液(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)封闭30分钟，以使非特异性结合降到最低。然后将血浆样品在PBS-Tween20 (PBST)中稀释至1/50，并加载到IL-5包被孔中。另外，将重组hu39D10标准品在含2%小鼠血清(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的PBST中稀释，并加载至包被孔中以绘制标准曲线用于定量。在室温下温育60分钟后，将各孔用PBST洗涤，然后加入抗人Fc-HRP缀合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO，PBST中的1/1000稀释液)，在室温下温育30分钟。然后将各孔用PBST洗涤。对于信号检测，将100 ul TMB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)加载入各孔中。然后加入50 ul 2N硫酸终止显色，然后在Vmax读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中测量A450。应用Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)软件并利用hu39D10标准曲线，计算血浆中hu39D10和变体的浓度。对于每只小鼠，随时间的变化对较之于第1天测量的浓度(定义为100%)的hu39D10相对浓度作图。应用软件，还计算了各个动物中hu39D10或其变体的半寿期，假设指数式衰减且渐近线为零。对于具有组合突变(S228P + YTE)的变体的半寿期计算，平均半寿期计算中排除两个异常值结果(这是来自两只小鼠的结果)，所述异常值提高计算的半寿期。

结果与结论

如图5所示，与具有未修饰的Fc的hu39D10 (t1/2 = 4.6天)相比，具有S228P突变的hu39D10的血清半寿期(t1/2 = 6.5天)延长42%。YTE突变还显示血清半寿期显著延长75% (t1/2 = 8.0天)。出人意料的是，当组合时，S228P和YTE突变还协同延长循环半寿期(至t1/2 = 13.3天)。相对于仅YTE，S228P突变加上YTE突变延长循环半寿期达66% (或达5.3天)，而在非YTE突变的IgG4的情况下，S228P的半寿期延长仅导致42% (1.9天)延长。倘若S228P与YTE突变间不存在协同作用，那么在YTE突变的hu39D10的情况下，S228P突变应引起相同或按减少比例延长的半寿期，因为在非YTE突变的hu39D10中的确如此，对具有YTE和S228P突变两者的hu39D10，产生不超过11天的半寿期。

由于这种协同作用，因此得出结论是，尽管因Fc恒定区中突变数增加所致，引起抗药物免疫应答的机会增加，但是为了实现基于抗体(或Fc融合蛋白)的药物的极长半寿期，在相同分子中使YTE和S228P突变组合是有益的。

实施例 3

材料与方法

huMab195 及其 Fc 变体的产生

使用18 (重链)和18 (轻链)个寡核苷酸通过基于PCR的基因装配，从发表的蛋白质序列(US 5,693,761)反向改造编码CD33结合抗体huMab195可变区的DNA片段(图6)。然后将重链和轻链可变区片段克隆至以上部分所述的人IgG4 (天然和变体)表达载体中，以产生具有天然IgG4恒定结构域序列的huMab195的IgG4/κ形式，或含有S228P突变、YTE突变或S228P和YTE突变两者的形式。具有S228P和YTE突变两者的huMab195 IgG4重链的序列见图6，轻链序列同样见图6。

huMab195 和变体的表达和纯化

将huMab195及其变体的pTT5表达载体转染至HEK293 6E细胞中以产生各种IgG4蛋白，如实施例2中所述。然后如实施例2一样，使用G蛋白-琼脂糖珠纯化这些蛋白质。

人 CD33 胞外结构域的产生

自Quickclone人cDNA文库(Clontech，Mountain View，CA)扩增编码人CD33胞外结构域(hCD33 ECD，氨基酸1-258，包括前导序列)的DNA片段。使用携带(His)₆标签之后为凝血酶切割位点(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)的引物通过PCR，将编码这些序列的DNA加至hCD33 ECD片段的3’端。然后通过PCR使加his6标签的hCD33 ECD-编码DNA片段与人IgG1 Fc-编码DNA片段连接(hCD33 ECD-Fc)，并克隆至pTT5表达载体中。hCD33 ECD-Fc的蛋白质序列见图7。

人 CD33 胞外结构域的表达和纯化

将编码hCD33 ECD-Fc融合蛋白的pTT5表达载体转染至HEK293 6E细胞中，然后分离培养基，使用G蛋白-琼脂糖珠(GE Healthcare Sciences，Piscataway，NY)进行亲和纯化。为了分离hCD33 ECD，将纯化的融合蛋白用凝血酶(EMD Chemicals, San Diego, CA)处理以除去Fc部分。然后，通过NiNTA-琼脂糖(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)亲和层析法分离hCD33 ECD。

PK 研究

通过Jackson Laboratory-West (Sacramento，CA)，用其内源FcRn敲出但具有人FcRn敲入的小鼠(4919 Tg276半合小鼠模型，描述于Petkova等，International Immunology 第18卷，第12期，第1759-1769页)，进行小鼠PK研究。第0天，每组7只小鼠腹膜内(IP)接受huMab195或其变体(200 ug)。在给药后2、12和24小时和2、4、7、10、14天，给每只小鼠采血以制备血浆样品。

测量血浆样品中的 huMAb 195 和变体的 ELISA

将Maxisorp 96孔板(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)用2 ug/ml含重组hCD33 ECD的PBS溶液包被。然后将各孔用PBS洗涤，并用Superblock封闭溶液(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)封闭。将血浆样品在PBS-Tween20 (PBST)中稀释至1/50，然后加载到hCD33 ECD包被的孔中。平行地，将已知浓度的重组huMab195标准品在含2%小鼠血清(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的PBST中稀释，加载到包被的孔中以制备标准曲线用于定量。在室温下温育60分钟后，将各孔用PBST洗涤，然后加入抗人κ片段HRP-缀合物(Invitrogen，Carlsbad，CA；PBST中的1/2000稀释液)，并温育30分钟。在洗涤各孔后，按实施例2所述，显现、测量并分析信号。

结果与结论

如图8所示，与具有未修饰的Fc的huMAb195 (t1/2 = 1.6天)相比，具有S228P突变的huMab195的血清半寿期(t1/2 = 2.0天)延长达26%。YTE突变还显示血清半寿期显著提高达110% (t1/2 = 3.4天)。当S228P和YTE突变组合时，半寿期进一步延长至14天，与YTE变体相比，提高312%。倘若不存在协同作用，那么将S228P突变加至含YTE的huMab195的最大增加可为26%，导致4.3天的半寿期，这比所观察到的14天显著较短。此第二实例证实了这样的观察结果：对于其对具有人FcRn的受试者中IgG4抗体的循环半寿期延长的作用，人IgG4抗体的S228P和YTE修饰是协同的。这类协同作用可证实这两种修饰在同一蛋白质中的应用，尽管有免疫原性增加的可能。

Claims

1. 一种体内半寿期延长的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

(ii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸的人IgG4核心铰链区序列；

其中与相应未修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白相比，所述修饰的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期延长。

2. 一种体内半寿期延长的分离抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

3. 权利要求1或2的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类动物源化抗体、superhumanized^®抗体、去免疫化抗体或饰面抗体。

4. 一种体内半寿期延长的分离抗体，其包含：

(i) 人或人源化Fab，

(ii) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

(iii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸的人IgG4核心铰链区序列；

5. 一种体内半寿期延长的分离的免疫球蛋白构建体，其包含：

(i) 抗体片段；

(ii) 与相应未修饰的CH2结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 CH2结构域，和

其中与相应未修饰的免疫球蛋白构建体相比，所述修饰的免疫球蛋白构建体的体内半寿期延长。

6. 权利要求5的免疫球蛋白构建体，其包含人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域。

7. 权利要求5的免疫球蛋白构建体，其包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

8. 权利要求5的免疫球蛋白构建体，其中抗体片段选自：(i) Fab片段，(ii) Fd片段，(iii) Fv片段，(iv) dAb片段，(v)分离的CDR区，(vi) F(ab’)2片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，(viii)双特异性单链Fv，和(ix)双链抗体，(x)三链抗体和(xi)四链抗体。

9. 一种体内半寿期延长的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含经重组融合或化学缀合或工程改造以含有以下的生物活性分子：(i)与相应未修饰的IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和(ii)在按照Kabat中的EU索引的核心铰链区序列中包含氨基酸取代S228P的人IgG4。

10. 权利要求9的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其中所述生物活性分子是蛋白质、非蛋白质物质或非免疫球蛋白的蛋白质。

11. 一种体内半寿期延长的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含：

(i) 生物活性分子；

(ii) 与IgG4 CH2结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 CH2结构域，和

(iii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸的人IgG4核心铰链区序列，所述取代亦描述为按照Kabat中的EU索引的S228P取代；

其中与相应未修饰的免疫球蛋白IgG4融合蛋白相比，所述修饰的免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期延长。

12. 权利要求11的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域。

13. 权利要求11的免疫球蛋白IgG4融合蛋白，其包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

14. 权利要求1-8中任一项的抗体或免疫球蛋白构建体，其经重组融合、化学缀合或工程改造以含有部分。

15. 权利要求1-4中任一项的抗体，所述抗体是与IL-5特异性结合的分离抗体，其包含：

其中与相应未修饰的抗体的半寿期相比，所述修饰抗体的体内半寿期延长。

16. 权利要求15的抗体，其中相应的未修饰抗体是hu39D10。

17. 权利要求15或16的抗体，其包含SEQ ID NO: 6所示恒定重链序列和SEQ ID NO: 7所示重链可变区序列。

18. 权利要求15-17中任一项的抗体，其还包含含有SEQ ID NO:8所示可变和恒定区序列的轻链。

19. 权利要求1-4中任一项的抗体，所述抗体是与CD33特异性结合的分离抗体，其包含：

(i) 与相应未修饰的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域相比，经修饰以包含按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸取代M252Y、S254T和T256E的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域；和

20. 权利要求19的抗体，其中按照本发明修饰的抗CD33抗体是抗体huMab195。

21. 权利要求19或20的抗体，其包含SEQ ID NO:11所示重链序列和SEQ ID NO:12所示轻链序列。

22. 体内半寿期延长的包含以下的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在药物中的用途：

(i) 与相应未修饰的IgG4 Fc区或其未修饰的FcRn结合结构域相比，经修饰以在按照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251-256的一个或多个上包含取代的人IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域，和

(ii) 包含氨基酸序列CPSCP (SEQ ID NO:1)内的丝氨酸残基被取代成为脯氨酸或按照Kabat中的EU索引的S228P取代的人IgG4核心铰链区序列。

23. 权利要求22的用途，其中所述分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白包含按照Kabat中的EU索引编号的取代M252Y、S254T和T256E。

24. 体内半寿期延长的包含以下的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白在制备用于治疗或预防受试者的病症的药物中的用途：

25. 一种治疗受试者的特征在于过量嗜酸性粒细胞产生的病症的方法，所述方法包括给予受试者权利要求15-18中任一项的修饰的抗IL-5抗体。

26. 权利要求25的方法，或权利要求22-24中任一项的用途，其中所述病症选自特应性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、非变应性鼻炎、哮喘、重度哮喘、慢性嗜酸性粒细胞肺炎、变应性支气管肺曲菌病、乳糜泻、丘-施综合征、嗜酸性粒细胞肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、水肿反应包括发作性血管性水肿、寄生虫感染、盘尾丝虫皮炎、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性胃炎、嗜酸性粒细胞性肠胃炎、嗜酸性粒细胞性肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿司匹林不耐受性哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停、慢性哮喘、克罗恩病、硬皮病和心肌心内膜纤维变性。

27. 权利要求25的方法，或权利要求22-24中任一项的用途，其中所述病症是自身免疫病。

28. 一种治疗受试者的癌症病症的方法，所述方法包括给予受试者权利要求19-21中任一项的修饰的抗CD33抗体。

29. 权利要求28的方法或权利要求22-24中任一项的用途，其中所述病症是急性髓细胞样白血病。

30. 一种用于延长包含IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和IgG4铰链区的人或人源化IgG4同种型抗体或免疫球蛋白构建体的体内半寿期的方法，所述方法包括：

31. 一种用于延长包含IgG4 Fc区或其FcRn结合结构域和IgG4铰链区的免疫球蛋白IgG4融合蛋白的体内半寿期的方法，所述方法包括：

32. 权利要求31的方法，所述方法用于通过将蛋白质工程改造为包含SEQ ID NO:14的融合蛋白来延长其体内半寿期。

33. 一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO:14。

34. 权利要求33的融合蛋白，其还包含与SEQ ID NO:14的C端直接连接的单个赖氨酸。

35. 一种用于降低非IgG4抗体的效应子功能的方法，所述方法包括：

36. 一种用于延长非人IgG4抗体的体内半寿期的方法，所述方法包括：

37. 一种核酸，其编码权利要求1-21中任一项的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。

38. 一种转化细胞，其表达权利要求1-21中任一项的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白。

39. 一种转化细胞，其包含编码权利要求1-21中任一项的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白的核酸。

40. 一种药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项的分离的抗体、免疫球蛋白构建体或免疫球蛋白IgG4融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。