TWI797124B

TWI797124B - 抗干擾素-γ之抗體及其應用

Info

Publication number: TWI797124B
Application number: TW107115156A
Authority: TW
Inventors: 顧正崙; 施瀚博; 林嘉豪; 丁靜雅; 黃靜宜; 郭奕廷
Original assignee: 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2023-04-01
Also published as: JP2020519562A; CN109715661B; EP3621993A1; US20210171625A1; BR112019022702A2; US10968274B2; AU2018263196A1; KR20200004292A; MX2019012865A; CN109715661A; ZA201905642B; TW201904994A; US20210054066A1; WO2018202200A1; JP7308747B2; US20210171624A1; CA3057735A1; EP3621993A4

Abstract

本發明提供一種新穎之抗干擾素-γ(IFN-γ)抗體，以及包含該抗體之組成物，以用於中和干擾素-γ(IFN-γ)介導之活性。本發明亦提供一種包含該抗干擾素-γ(IFN-γ)抗體之醫藥組成物，用於治療IFN-γ介導之症候群。

Description

抗干擾素-γ之抗體及其應用

參考相關申請案

本申請案主張2017年5月5日提申之美國臨時專利申請號62/501,952之優先權，其揭示內容在此併入本案以作為參考資料。

本發明係有關針對干擾素-γ(IFN-γ)的新穎重組抗體或任一抗原結合片段。本發明亦有關該抗體或其任一抗原結合片段在改善、治療、或預防IFN-γ所介導之疾病的用途。

干擾素-γ(IFN-γ)係一在先天與後天免疫中扮演關鍵角色的細胞激素。本領域習知，IFN-γ與發炎作用和自體發炎性疾病相關。舉例而言，Kine Edvardsen等人揭示，在愛迪生氏病(Addison’s disease)患者中，普遍出現能產出大量IFN-γ的自體反應性21 OH特異性T細胞(J Interferon Cytokine Res.2015 Oct 1；35(10)：759-770)。Bisping G等人得出結論，即使在疾病不活動狀態下，發炎性腸病患者的腸上皮細胞介導之CD8⁺淋巴球仍展現增加生產IFN-γ的能力(Clin Exp Immunol.2001 Jan；123(1)：15-22.)。

與上述促發炎性功能相反的是，在特定情況下，IFN-γ的表現可導致T細胞活性被抑制。舉例而言，Benci JL等人顯示，腫瘤IFN-γ信號傳導可調節多基因抗性程序(multigenic resistance program)，以阻斷免疫檢查點(checkpoint)(Cell,2016,Dec 167：1540-1554)。其數據指出，阻斷或中和IFN-γ可改進獨特耗竭性T細胞子群的功能。因此，中和性抗IFN-γ試劑亦可用於增進T細胞免疫性。

鑑於抗IFN-γ試劑在治療發炎作用相關疾病的潛在醫藥應用，可用於產業與醫藥應用的抗IFN-γ抗體仍有持續需求。

本發明之一目的係提供一種新穎之抗IFN-γ抗體，以及包含其之組成物，用於中和IFN-γ介導之活性。本發明之另一目的係提供一種包含該抗IFN-γ抗體之醫藥組成物，用於治療IFN-γ介導之症候群。

為了完成前述之目的，本揭示係提供一種經分離之抗體，包含：V_H CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：120、123、126、129、144、147、150、或153；V_H CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：122、125、128、131、146、149、152、或155；V_L CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：132、135、138、141、156、158、160，或162；V_L CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：133、136、139、142、157、159、161，或163；以及V_L CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：134、137、140，或143。

本發明係提供一種經分離之抗體，其特異性地結合至與前述段落所稱抗體之相同的表位上。在某些具體實施例中，前述之抗體更包含如下與本文所述之表位(epitope)的結合特性。

本發明再提供一種經分離之抗體，其中該抗體特異性地結合至人類IFN-γ的第30-52或36-48個胺基酸，以及第78-92或82-92個胺基酸內之一或多個胺基酸，其中該第30-52個胺基酸包含SEQ ID NO：167、該第36-48個胺基酸包含SEQ ID NO：171、該第78-92個胺基酸包含SEQ ID NO：168，以及該第82-92個胺基酸包含SEQ ID NO：172。

本發明更提供一種經分離之抗體，其中該抗體特異性地結合至人類IFN-γ的第36-48與82-92個胺基酸內之一或多個胺基酸序列，其中該第36-48個胺基酸包含SEQ ID NO：171，以及該第82-92個胺基酸包含SEQ ID NO：172。

本發明又提供一種經分離之抗體，其特異性結合至人類IFN-γ之表位，其中該表位包含人類IFN-γ之胺基酸K43、胺基酸Q48與胺基酸K86；其中該人類IFN-γ包含SEQ ID NO：166。

接著，本發明係提供一種經分離之多核苷酸，其編碼前述之經分離之抗體。在某些具體實施例中，該經分離之多核苷酸編碼一抗體，其中該抗體包含一V_H CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：120、123、126、129、144、147、150，或153；V_H CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：122、125、128、131、146、149、152，或155；V_L CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：132、135、138、141、156、158、160，或162；V_L CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：133、136、139、142、157、159、161、或163；以及V_L CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：134、137、140，或143。

在某些具體實施例中，該經分離之多核苷酸包含第一序列，其具有與SEQ ID NO：173、175、176、177、179或181至少90%之等同度，其編碼抗體之V_H；以及第二序列，其具有與SEQ ID NO：174、178、180或182至少90%之等同度，編碼抗體之V_L。

本發明亦提供一種包含前述之多核苷酸之載體。

本發明亦提供一種經分離之宿主細胞，其包含前述載體。

本發明更提供一種經分離之宿主細胞，其表現前述經分離之抗體。

本發明亦提供一種用於中和IFN-γ活性之組成物，包含：前述經分離之抗體；以及一載劑。

本發明再提供一種用於治療IFN-γ介導之症候群之組成物，包含：有效量之前述經分離之抗體；以及醫藥上可接受之載劑。

本發明更提供一種治療IFN-γ介導之症候群之方法，包含：投予有需要之個體有效劑量之經分離之抗體。

本發明亦提供一種偵測環境中IFN-γ之方法，包含：(A)施加前述經分離之抗體至該環境中；(B)將該環境與抗IgG抗體一同靜置；其中該抗IgG抗體係與可偵測標記連結；以及(C)偵測該可偵測標記。

第一圖顯示實施例1之抗體2A6的PNGase F降解試驗結果。「-」代表未處理組；「+」代表經PNGase F處理組。箭頭指示經PNGase F處理後之帶移位。

第二圖顯示實施例1之抗體2A6、2A6_A與2A6_Q之SDS-PAGE分析結果。

第三圖顯示實施例2中，使不同濃度之重組人類IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10nM)通過固定於AHC生物感應器上之抗IFN-γ mAbs而得之結合曲線。

第四圖顯示實施例2中，使不同濃度之重組人類IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20nM)通過固定於AHC生物感應器上之抗IFN-γ抗體而得之結合曲線。AMG811為美國專利號7,335,743所述之抗IFN-γ抗體，並如本文所述方法製備。對照組抗體為人類同型IgG1對照組抗體(Bio X cell；BP0297)。

第五圖顯示本揭露抗體可有效且為劑量依賴性地抑制IFN-γ誘發之HLA-DR表現。

第六圖顯示實施例2之ELISA結果，其說明本揭露之抗體對IFN-γ結合親和力。

第七圖顯示實施例3之ELISA結果，其說明人類IFN-γ(R&D systems 285-IF-100)與本揭露抗體之結合親和性。

第八圖顯示實施例3之ELISA結果，其說明恒河猴/食蟹獼猴IFN-γ(R&D systems 961-RM-025)與本揭露抗體之結合親和力。

第九圖展現本揭露抗體對於IFN-γ之中和活性。

第十圖顯示在實施例3中進行的全血試驗中，抗IFN-γ抗體對於產生CXCL9的抑制作用。

第十一圖顯示實施例3的全血試驗中，抗IFN-γ抗體對於CXCL10之產生的抑制作用。

第十二圖說明本揭露抗體對IFN-γ誘發HLA-DR表現的抑制作用。

第十三圖說明本揭露抗體對IFN-γ誘發PD-L1表現的抑制作用。

第十四圖顯示實施例4中進行的表位鑑定實驗結果。

對於本文和所附申請專利範圍中的描述，單數形式「一(a)」和「一個(an)」包括複數指示物，除非上下文另有明確指示。因此，例如，「一蛋白質」係指包括多於一種蛋白質，且「一化合物」係指多於一種化合物。「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(「comprising)」、「包括(include)」、「包括(includes)」、「包括(including)」的使用是可互換的，而非限制性的。更應理解的是，各具體實施例之描述中，使用術語「包括(comprising)」的情況下，本領域技術人員將理解，在一些特定情況下，可以使用語言「基本上由......組成」或「由......組成」替代。

當提供一定範圍的數值，除非上下文另有明確規定，否則應當理解，該數值區間的整數以及該數值區間的每個整數的十分之一，介於該範圍的上限與下限之間，以及在該範圍內的任何其他陳述值或中間值，都涵蓋在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在該較小範圍內，同時也包含在本發明內，受限於所述範圍內的任何特別排除的限制。當陳述的範圍包括該限制的一或二者，排除這些限制之(i)或(ii)的範圍也包括在本發明中。例如，「1至50」包括「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。

所有文獻、專利、專利申請案和本發明中引用的其他文件，皆完整併入本文以作為參考資料，其內容如同每一獨立文獻、專利、專利申請案或其他文件所分別指出，皆併入本文以作為參考目的。

應當理解的是，包括附圖，以上一般性描述和以下詳細描述僅是示範性和解釋性的，並非用於限制本發明。

本文描述中使用的技術和科學術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義，除非另有明確定義。

術語「抗體」於此係包括完整抗體，以及其任一抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」係指一醣蛋白，包含透過雙硫鍵相互連結的至少二重(H)鏈與二輕(L)鏈，或其抗原結合部位。每條重鏈由重鏈可變區(於此縮寫為V_H)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(於此縮寫為V_L)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。V_H和V_L區可進一步細分為稱作互補決定區(CDR)的高度變異區，並穿插有更具保留性的區域，稱為框架區(FR)。每個V_H和V_L由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和典型之補體系統的第一成分(C1q)。

框架區域與CDR之內容係依據Kabat等人(請見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991)，以及ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(請見Lefranc,Nucleic Acids Res 29：207-9,2001；以及線上imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret=0&Option=humanIg)定義。

「Kabat系統」在本揭露內容中表示根據Kabat(1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit.,NIH publication no.91-3242U.S.Department of Health and Human services)，以及Chothia(1987；J.Mol.Biol.196,901-917)方式編號胺基酸的標準。此編號系統被本領域技術人員廣泛使用，其係以對抗原結合活性相當重要的可變結構域序列之序列變異性和三維環部分為基礎。在Kabat系統中，輕鏈或重鏈的所有胺基酸皆具有明確的位置；即Kabat系統適用於CDR以及框架區域。任何抗體的特定胺基酸位置可根據Kabat系統進行編號。根據Kabat系統辨識V_H和V_L鏈的CDR區之規則顯示於www.bioinf.org.uk/abs.。

IMGT獨特的編號系統是Kabat系統以外的另一種選擇，其允許人們比較該可變結構域，無論是何種抗原受體、鏈類型或物種[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.and Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT獨特的編號系統中，保留性胺基酸總是具有相同的位置，例如半胱胺酸23(1st-CYS)、色胺酸41(CONSERVED-TRP)、疏水胺基酸89、半胱胺酸104(2nd-CYS)，苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特的編號系統提供了框架區域的標準化界定(FR1-IMGT：位置1至26、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104，以及FR4-IMGT：118至128)，以及互補決定區域：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65，以及CDR3-IMGT：105至117。由於空格代表未佔據位置，CDR-IMGT長度(顯示在括號內並由點分隔，如[8.8.13])便成為關鍵資訊。IMGT獨特編號系統用於2D圖形表示，稱為IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.and Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，以及用於3D結構，稱為IMGT/3D結構-DB[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。

術語「抗原結合片段」於此是指一抗體片段，例如雙抗體、Fab、Fab'、F(ab’)₂、Fv片段、雙硫鍵穩定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv’)、雙硫鍵穩定化雙抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv雙體(雙價雙抗體)、由包含一或多個CDR的抗體部分形成的多特異性抗體，或結合至抗原但不包含全長或完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段可結合至與原始抗體或原始抗體片段(如原始scFv)相同的抗原。在某些具體實施例中，抗原結合片段可包含來自特定人類抗體的一或多個CDR，其與來自一或多個不同人類抗體的框架區嫁接。

在上述抗原結合片段中，Fab具有輕鏈和重鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈第一恆定區(CH1)之結構，並具有一個抗原結合位置。Fab’不同於Fab之處在於Fab’具有一鉸鏈區(hinge region)，在重鏈CH1結構域的C端包括至少一個半胱胺酸殘基。當Fab'的鉸鏈區之半胱胺酸殘基經由二硫鍵連接時，會產生F(ab’)₂。

Fv是最小的抗體片段，僅具有重鏈可變區和輕鏈可變區。用於產生Fv片段的重組技術在本領域中為已知。「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由輕鏈可變區和重鏈可變區組成的改造抗體，該輕鏈可變區和重鏈可變區直接或經由胜肽連結序列彼此連接。雙鏈Fv可具有其中重鏈可變區經由非共價鍵與輕鏈可變區連接的結構。單鏈Fv通常可以形成如在雙鏈Fv中的二聚體結構，其中重鏈可變區經由胜肽連結片段共價結合至輕鏈可變區，或是重鏈和輕鏈可變區在其C-端彼此直接連接。連結片段可為包括1至100，或2至50個胺基酸的胜肽連結片段，且其合適序列在本領域中為已知。

抗原結合片段可使用蛋白酶獲得(例如，可用木瓜蛋白酶切割完整抗體以獲得Fab片段，或可用胃蛋白酶切割以獲得F(ab’)₂片段)，或可藉由基因重組技術來製備。

「經分離之抗體」於此係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合IFN-γ的經分離之抗體實質上不含特異性結合至IFN-γ以外的抗原之抗體)。然而，特異性結合IFN-γ的經分離之抗體會對其他抗原，如來自其他物種的IFN-γ分子，具有交叉反應性。此外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞材料，及/或化學物質。

術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」於此係指具均質分子組成的抗體分子製劑。單株抗體組成物展現出對特定表位的單一結合特異性與親和力。

術語「人類抗體」於此係指其可變區之框架區和CDR區均衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。此外，如果該抗體含有恆定區，該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。本揭露之人類抗體可包括非衍生自人類免疫球蛋白序列編碼的胺基酸(例如經由體外隨機或位點特異性突變或經由體內體細胞突變引入的突變)。然而，術語「人類抗體」於此並不包括衍生自另一種哺乳動物物種(如小鼠)的CDR序列移植到人類框架序列上的抗體。

術語「人類單株抗體」是指展現單一結合特異性，且其可變區之框架區和CDR區均衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。

術語「重組人類抗體」於此包括所有經由重組技術製備、表現、產生或分離的人類抗體，例如(a)從用於人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)分離的抗體或由其製備的融合瘤(下面進一步描述)，(b)從宿主細胞分離的抗體，該宿主細胞係經轉化而用於表現人類抗體，例如來自轉染瘤，(c)由重組、組合性人類抗體庫分離出的抗體，以及(d)以涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他技術製備、表現、產生或分離的抗體。此種重組人類抗體具有可變區，其中框架區和CDR區衍生自人類免疫球蛋白序列。然而，在某些具體實施例中，可對於此類重組人類抗體進行體外突變(或者當使用人類Ig序列轉殖的動物時，進行體內體細胞突變)，且因此，重組人類抗體的V_H和V_L區胺基酸序列，雖然係衍生自且相關於人類種系V_H和V_L，可能非天然存在於體內人類抗體種系庫內者。

術語「人源化抗體」係指由非人類物種所產生的抗體，並包含已被修飾以增加它們與人類天然產生的抗體變異物之相似性的蛋白質序列。當在人類中使用非人類來源的抗體時，人源化過程是必要的，以避免不欲免疫原性效應。相較之下，術語「嵌合性抗體」於此係指經由將來自某一物種的抗原結合區(即V_H和V_L)與來自另一物種的恆定區互相融合的抗體。

術語「K_assoc」或「K_a」於此係指一特定抗體-抗原相互作用的結合率，術語「K_dis」或「K_d」於此係指一特定抗體-抗原相互作用的解離率。術語「K_D」於此表示解離常數，其由K_d與K_a的比率(即K_d/K_a)獲得，並以莫耳濃度(M)表示。可使用本領域中已建立的方法來測定抗體的K_D值。

如本文所用，「表位」係指被一特異性抗體識別和結合的抗原的一部分，其確立抗原的抗原特異性。表位也被稱為抗原決定位置。具體而言，在本揭露中，表位可為人類IFN-γ的特定結構域或結構域之組合。在本揭露的一些具體實施例中，該特定結構域或結構域之組合屬於包含SEQ ID NO：166的人類IFN-γ。

在本揭露之一具體實施例中，IFN-γ包含SEQ ID NO：166，且本揭露之抗體特異性地結合至SEQ ID NO：166之第30-52或36-48個胺基酸，以及SEQ ID NO：166之第78-92或82-92個胺基酸內之一或多個胺基酸。在本揭露之一特定具體實施例中，本揭露之抗體於SEQ ID NO：166之第30-52及78-92個胺基酸與IFN-γ特異性結合。在此特定具體實施例中，該SEQ ID NO：166之第30-52及78-92個胺基酸形成本揭露抗體之表位。在另一具體實施例中，本揭露抗體於SEQ ID NO：166之第36-48及82-92個胺基酸與IFN-γ特異性結合。在此特定具體實施例中，該SEQ ID NO：166之第36-48及82-92個胺基酸形成本揭露抗體之表位。

於本文中所述，抗體「特異性結合至IFN-γ」係指該抗體結合至IFN-γ，且具結合常數K_D小於1×10^-8M、小於1×10^-9M、小於1×10^-10M、小於1×10^-11M或更低。

本揭露之第一態樣。

在本揭露之第一態樣中，係提供一種經分離之抗體或其任一抗原結合部分。該經分離之抗體或其任一抗原結合部分包含：(a)V_H CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：120、123、126、129、144、147、150，或153；(b)V_H CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：121、124、127、130、145、148、151，或154；(c)V_H CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：122、125、128、131、146、149、152，或155；(d)V_L CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：132、135、138、141、156、158、160，或162；(e)V_L CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：133、136、139、142、157、159、161，或163；以及(f)V_L CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：134、137、140，或143。

在一特定具體實施例中，係提供抗體2A6。該抗體2A6之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、及SEQ ID NO：122；以及該抗體2A6之V_L CDR1、V_L CDR2與V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133，及SEQ ID NO：134。此外，該抗體2A6之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、及SEQ ID NO：146；其中該抗體2A6之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、及SEQ ID NO：134。

在一特定具體實施例中，係提供抗體2B6。該抗體2B6之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、及SEQ ID NO：125；其中該抗體2B6之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、及SEQ ID NO：137。此外。該抗體2B6之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、及SEQ ID NO：149；其中該抗體2B6之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、及SEQ ID NO：137。

在一特定具體實施例中，係提供抗體1E8。該抗體1E8之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、及SEQ ID NO：128；其中該抗體1E8之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、及SEQ ID NO：140。此外。該抗體1E8之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、及SEQ ID NO：152；其中該抗體1E8之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、及SEQ ID NO：140。

在一特定具體實施例中，係提供抗體2F2。該抗體2F2之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、及SEQ ID NO：131；其中該抗體2F2之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、及SEQ ID NO：143。此外。該抗體2F2之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、及SEQ ID NO：155；其中該抗體2F2之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、及SEQ ID NO：143。

在一特定具體實施例中，係提供抗體AB(「AB」包含2A6之V_H CDRs與2B6之V_L CDRs，亦稱之為「VH2A6/VL2B6」)。該抗體AB之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、及 SEQ ID NO：122；其中該抗體AB之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、及SEQ ID NO：137。此外。該抗體AB之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、及SEQ ID NO：146；其中該抗體AB之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、及SEQ ID NO：137。

在一特定具體實施例中，係提供抗體BA(「BA」包含2B6之V_H CDRs與2A6之V_L CDRs，亦稱之為「VH2B6/VL2A6」)。該抗體BA之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、及SEQ ID NO：125；其中該抗體BA之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、及SEQ ID NO：134。此外。該抗體BA之V_H CDR1、V_H CDR2與V_H CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、及SEQ ID NO：149；其中該抗體AB之V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、及SEQ ID NO：134。

在一些具體實施例中，本揭露提供包含如本文所述之V_H CDR和V_L CDR的經分離之抗體或其抗原結合片段，更包含具有與SEQ ID NO：109、110、111或112至少90%等同度的V_H區序列，以及具有與SEQ ID NO：113、114、115或116至少90%等同度的V_L區序列。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一些具體實施例中，本揭露提供基於本文所述具體實施例之經分離之抗體，其中該抗體更包含一重鏈和一輕鏈。在一些具體實施例中，該重鏈包含具有與SEQ ID NO：109、110、111或112至少90%等同度的V_H區序列；以及具有與SEQ ID NO：113、114、115或116至少90%等同度的V_L區序列。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體2A6之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：109至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：113至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體2B6之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：110至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：114至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體1E8之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：111至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：115至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體2F2之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：112至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：116至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體AB之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：109至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：114至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在一特定具體實施例中，本揭露提供的抗體包含抗體BA之CDRs，並更包含一V_H區序列，其具有與SEQ ID No：110至少90%等同度，以及一V_L區序列，其具有與SEQ ID No：113至少90%等同度。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在本揭露任一抗體的另一具體實施例中，該抗體經修飾，以使其在可變區中不包含N-連接醣基化位點。例如，在一些具體實施例中，該抗體經點突變而修飾其V_H區之位置76的天冬醯胺酸(N76)。在一具體實施例中，N76經突變為丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。在此述經分離之抗體之一特定具體實施例中，該抗體經點突變而修飾其V_H區之位置76的天冬醯胺酸(N76)，其中位置N76經突變為丙胺酸(A)或麩醯胺酸(Q)。

在可變區中不包含N-連接醣基化位點的抗體之一特定具體實施例中，本揭露提供抗體2A6_A和2A6_Q，其中該重鏈的N76分別突變為丙胺酸和麩醯胺酸。因此，在一具體實施例中，本揭露提供一種經分離之抗體「2A6_Q」，其中V_H包含具有與SEQ ID No：164至少90%等同度之一序列，其中位置76的胺基酸為A，或與SEQ ID NO：165至少90%等同度，其中位置76的胺基酸為Q；以及V_L包含具有與SEQ ID No：113至少90%等同度之一序列。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在另一具體實施例中，該經分離之抗體特異性地結合至人類IFN-γ，具結合值K_D小於1×10^-8M、小於1×10^-9M、小於1×10^-10M、小於1×10^-11M或更低。該與IFN-γ之結合值K_D係優先以生物膜干涉分析法測量。

在另一具體實施例中，該經分離之抗體抑制人類IFN-γ介導之活性，具IC₅₀值小於50ng/mL、小於25ng/mL，或小於10ng/mL。該IC₅₀值係優先以HLA-DR表現分析法測量。

在另一具體實施例中，本揭露之抗體可具有物種間的交叉反應性(cross-reactivity)，因而便於用於各種目的或用於不同動物模型的研究。例如，在一些具體實施例中，該抗體可與來自不同哺乳動物物種(例如來自人類、恒河猴/食蟹獼猴)的IFN-γ產生交叉反應。

在另一具體實施例中，此述之經分離之抗體(如2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q、1E8、2F2、AB、BA，與其抗原結合片段)更包含特異性結合至人類IFN-γ表位之特性，該人類IFN-γ表位包含SEQ ID NO：166的一或多個胺基酸或其不連續之胺基酸序列。在一具體實施例中，該抗體可特異性結合至包含人類IFN-γ之第30-52與78-92個胺基酸之表位。在一具體實施例中，該抗體可特異性結合至包含人類IFN-γ之第36-48與82-92個胺基酸之表位。

本揭露之第二態樣。

在本揭露之第二態樣中，係提供另一種經分離之抗體。該抗體特異性地結合至本揭露第一態樣之抗體的相同表位上。

在一特定具體實施例中，該抗體特異性地結合至人類IFN-γ之第30-52及78-92個胺基酸內之一或多個胺基酸。其中該第30-52個胺基酸包含SEQ ID NO：167，以及該第78-92個胺基酸包含SEQ ID NO：168。在另一具體實施例中，該抗體特異性地結合至人類IFN-γ之第36-48及82-92個胺基酸內之一或多個胺基酸，其中該第36-48個胺基酸包含SEQ ID NO：171，以及該第82-92個胺基酸包含SEQ ID NO：172。

在另一具體實施例中，該表位包含人類IFN-γ之胺基酸K43、胺基酸Q48與胺基酸K86；其中該人類IFN-γ包含SEQ ID NO：166。在另一具體實施例中，該表位包含人類IFN-γ之胺基酸K37、胺基酸E38、胺基酸K43、胺基酸Q46、胺基酸Q48、胺基酸K86與胺基酸R89；其中該人類IFN-γ包含SEQ ID NO：166。

本揭露之第三態樣。

在本揭露之第三態樣中，係提供編碼為一抗體之經分離之多核苷酸。具體而言，該多核苷酸編碼為本揭露第一態樣與第二態樣之抗體。在一特定具體實施例中，該多核苷酸編碼抗體2A6、2A6_A、2A6_Q、2B6、1E8、2F2、AB，或BA。例如，在某些具體實施例中，該經分離之多核苷酸編碼一抗體，該抗體包含V_H CDR1，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：120、123、126、129、144、147、150，或153；V_H CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：122、125、128、131、146、149、152，或155；V_L CDR1包含選自於SEQ ID NO：132、135、138、141、156、158、160，或162之胺基酸序列；V_L CDR2，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：133、136、139、142、 157、159、161，或163；以及V_L CDR3，其包含一胺基酸序列選自於SEQ ID NO：134、137、140，或143。

在一特定具體實施例中，編碼為抗體2A6之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體2A6_A之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：174至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體2A6_Q之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：174至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體2B6之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體1E8之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：180至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體2F2之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：182至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體AB之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：178至少90%等同度之序列。在一特定具體實施例中，編碼為抗體BA之多核苷酸包含具有與SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：177至少90%等同度之序列。在另一具體實施例中，該等同度為95%、該等同度為98%，或該等同度為99%。

在另一具體實施例中，該多核苷酸包含一多核苷酸序列，其包含一或多個經挑選的密碼子，以在哺乳動物細胞中最佳地表現所指抗體。此為另一用於增進產物之準確性與效率的特徵。在一特定具體實施例中，該哺乳動物為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6^®細胞和COS細胞。

本揭露之第四態樣。

在本揭露之第四態樣中，係提供一種載體與包含該載體之經分離之宿主細胞。該載體包含本揭露第三態樣定義之多核苷酸，並設計為可被任一種類之宿主細胞中攜帶或表現，而可製造本揭露抗體。該宿主細胞係選自於由大腸桿菌、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞組成的群組。

本揭露之第五態樣。

在本揭露之第五態樣中，係提供包含本揭露抗體之組成物。在一具體實施例中，該組成物係用於中和體內或體外之IFN-γ活性。在另一具體實施例中，該組成物為用於治療IFN-γ介導之症候群的醫藥組成物。該「IFN-γ介導之症候群」包含但不限於，發炎、後天免疫缺陷症候群(AIDS)、類風濕性關節炎，包括青少年類風濕性關節炎、發炎性腸病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病(Crohn’s disease)、多發性硬化症、艾迪生病(Addison’s disease)、糖尿病(第I型)、副睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、重症肌無力、天皰瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、動脈粥樣硬化、紅血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自體免疫性肝炎誘發之肝損傷、膽汁性肝硬化、酒精誘發之肝損傷，包括酒精性肝硬化、風濕熱、類肉瘤病、硬皮病、休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊柱關節病、強直性脊柱炎、川崎病(kawasaki disease)、乾眼病、噬血細胞淋巴組織細胞增多症、巨噬細胞活化症候群、甲狀腺炎、血管炎，或其組合。術語「IFN-γ介導之症候群」也包含與IFN-γ量增加或對IFN-γ敏感性增加相關的身體病況。

在一具體實施例中，該組成物包含本揭露之抗體與一載劑。該抗體可以有效量存在於該組成物中以用於達到該組成物的目的。該「有效量」使用於此係指，於一個體中達到所欲效果(如治療本揭露IFN-γ介導之症候群)所需之活性成分的量，不論是單獨或與一或多種其他活性試劑組合。如本領域技術人員所知，有效量係根據所治療的特定病症、病況的嚴重程度、個體患者參數(包括年齡、身體狀況、體型、性別和體重、治療持續時間、併行治療的性質(如果有的話)、特定的投藥途徑以及健康從業者的知識和專業中的類似因素)而變化。這些因素對於本領域的普通技術人員來說是眾所周知的，並且可以用不超過常規的實驗來解決。通常較佳使用單一成分或其組合的最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。然而，本領域普通技術人員應理解的是，出於醫療因素、心理因素或實際上任何其他原因，患者可能堅持較低劑量或可耐受劑量。

此種抗體組成物可藉由將具有所需純度的本揭露抗IFN-γ抗體與一或多種載劑混合而製備。典型地，此類抗體組成物可製備為水性溶液(請見如美國專利號6,171,586與WO2006/044908)，或凍乾製劑(請見美國專利號6,267,958)。

用於本揭露抗體組成物之載劑可為醫藥上可接受之載劑，一般包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、防腐劑、溶劑、分散介質、膜衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑，以及生理上相容的類似物。載劑最好是應適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸胃、脊柱或表皮施用(例如通過注射或輸注)。醫藥上可接受之載劑通常在所使用的劑量和濃度下，對於接受它們的受試者而言是無毒的。

各種此類醫藥上可接受之載劑在本領域中為已知(請見如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。用於本揭露抗體組成物中之示範性醫藥上可接受之載劑包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲銨氯化物；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(少於約10個胺基酸)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽類之相反離子如鈉；金屬錯合物(如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑如聚乙二醇(PEG)。

用於本揭露抗體組成物的醫藥上可接受的載劑尚可包括間隙性藥物分散劑(interstitial drug dispersion)，例如可溶性中性-活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)(請見如美國專利公開第2005/0260186號與第2006/0104968號)，如人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白(如rHuPH20或HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。

該組成物可更包括醫藥上可接受之賦形劑，如崩解劑、黏合劑、潤滑劑、防腐劑或其組合。

本揭露之第六態樣。

在本揭露之第六態樣中，係提供一種治療IFN-γ介導之症候群的方法。該方法包含施予有需要個體有效劑量之本揭露抗體。該有需要個體可為患有IFN-γ介導之症候群之病患(即人類)。該IFN-γ介導之症候群可縮限為上述者，但不限於上面列出之症狀或疾病。因此，在某些具體實施例中，本揭露抗體係經調劑為醫藥組成物以供施用，其中該組成物包含本揭露抗體和醫藥上可接受的載劑。任何本領域已知可用於抗體的任何醫藥上可接受的載劑包括但不限於水、PBS、鹽類溶液、明膠、油、醇或其組合。

本領域習知的可用於施予包含抗體的醫藥組成物的方法皆可用於施予本揭露的醫藥組成物。因此，在本揭露之第六態樣的一些具體實施例中，該施予為任何可將抗體系統性地傳送至受試者或期望之組織的方法。系統性投藥通常是指任何於某一處將該抗體施予個體，從而使抗體或其製劑進入個體的循環系統，並進入代謝過程與受到其他類似生理機制影響的方法；有別於直接將抗體施予至期望的位置、組織或器官。

因此，在本揭露治療方法中可用之投藥模式可包括但不限於注射、輸注、滴注和吸入。注射投藥可包括靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、玻璃體內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、脊髓內注射，以及胸骨內注射和輸注。

該抗體可與醫藥上可接受之載劑一同投藥。該醫藥上可接受之載劑包括但不限於水、PBS、鹽類溶液、明膠、油、醇或其組合。

本揭露之第七態樣。

在本揭露之第七態樣中，係提供一種偵測環境中IFN-γ的方法。該方法可用於實驗室中偵測樣本中IFN-γ之存在。在另一具體實施例中，該方法可用於定量樣本之IFN-γ。該方法包含(A)施加本揭露之抗體；(B)將該環境與抗IgG抗體一同靜置；其中該抗IgG抗體係與可偵測標記連結；以及(C)偵測該可偵測標記。在一特定具體實施例中，該方法為西方墨漬法(Western Blot)或酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)。在一特定具體實施例中，該抗IgG抗體為Fc特異性抗體。

在一特定具體實施例中，該環境可為包含待測樣品的容器、膜或盤。該可偵測標記係指為了偵測目的而與抗IgG抗體結合的分子。該可偵測標記包括，但不限於過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、螢光標記或其組合。在特定具體實施例中，該可檢測標記為過氧化物酶；以及該方法更包含在步驟(B)之後與步驟(C)之前，將該環境與對-硝基苯磷酸酯溶液(在另一具體實施例中使用TMB溶液)一同靜置。在此特定具體實施例中，經由呈色反應，可於OD₄₀₅觀察而偵測並定量IFN-γ。

實施例

以下代表性實施例中將列出本揭露的各種特徵和具體實施例，這些示範性實施例旨在是說明性的而非限制性的。本領域的技術人員將容易理解，特定具體實施例僅僅是針對其後的申請專利範圍更全面地描述本揭露。在本申請案中描述的每個具體實施例和特徵，應該被理解為可互換並且可與包含在其中的每個具體實施例組合。

實施例1. 重組抗IFN-γ抗體之製備。

以螢光活化細胞分選技術分離出單一人類B細胞。

根據人體試驗委員會(IRB)核定的流程，經簽署知情同意書後，自患有分枝桿菌病的人類患者收集周邊靜脈血樣本。依據產品說明，以Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度離心法純化而自患者的周邊靜脈血中分離出單核細胞。使經純化之單核細胞重新懸浮於含5%正常小鼠血清(Jackson ImmunoResearch)的FACS緩衝液中(1% FBS,2mM EDTA,0.1% NaN₃於PBS中)，濃度調整為1×10⁷細胞/mL，並置於冰上30分鐘。同時，加入20μg/mL抗人類CD119抗體(BioLegend)至細胞中。之後，以FACS緩衝液清洗含1×10⁶細胞的分液後，將其置於冰上20分鐘，並每1×10⁶細胞加入1μg重組IFN-γ蛋白(R&D systems)。在分選過程之前，於冰上使細胞經抗人類IgG PE(BD bioscience)、抗人類IgD APC(BD bioscience)、抗人類CD3 PE-花青素7(eBiosciense)、抗人類CD19 APC-eFluor 780(eBioscience)、抗人類IFN-γ FITC(BD Bioscience)染色，並以7-胺基放線菌素D(Sigma；作為DNA標記物)染色，進行30分鐘。以CD19⁺IgG⁺CD3^-IgD^-FITC⁺表面抗原篩選出個別之可與IFN-γ結合的B細胞，並分選至含有18μL/孔之RT-裂解緩衝液(其含有200ng隨機六聚體合引子(Thermo Scientific)、1μL之dNTP-mix(Thermo Scientific)、0.5% v/v Igepal CA-630(Sigma)，以及40U Ribolock(Fermentas))的96孔盤的各個孔中，由此獲得單個B細胞之全RNA溶解物混合物。將96孔盤以鋁密封帶(康寧公司)密封，並立即存放於-80℃。

單一細胞的RT-PCR與免疫球蛋白(Ig)基因放大。

於上述96孔盤的每一孔中添加2μL(50U；置於經DEPC處理的水中)之Maxima H minus反轉錄酶(Thermo Scientific)，以合成總體積為20μL/孔的cDNA。將每一可與IFN-γ結合之B細胞的全RNA進行反轉錄(RT)反應，其包括於42℃進行10分鐘的黏合步驟、於25℃進行預引子延伸步驟10分鐘，於50℃進行聚合步驟45分鐘，以及於85℃進行酵素失活步驟5分鐘。將如此形成的第一股cDNA儲存於-20℃。

每一B細胞之IgH、Igλ、Igκ V基因轉錄物係以巢式-PCR放大，其中第一回PCR起始於以2.5μL之上述獲得的第一股cDNA作為模板，而第二回PCR則使用2.5μL之得自第一回PCR之未經純化的PCR產物作為模板。所有PCR反應皆於總體積25μL的PCR反應混合物中進行，其含有0.5μM引子混合物(詳細內容如表1所列出之引子混合物，請見引子列表)、200μM每一dNTP(Thermo Scientific)與0.5U Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo Scientific)。所有PCR反應皆使用經DEPC-處理的水進行。巢式PCR反應之第一回與第二回皆於98℃進行失活步驟10秒、於65℃進行黏合步驟15秒，以及於72℃進行延長步驟30秒，共進行35回合。

Ig V基因序列分析

根據商品說明，使用QIAquick PCR純化試劑套組(Qiagen)純化每個B細胞的V_H、V_κ和V_λ鏈PCR產物分液(由上述第二回PCR獲得)，並分別使用SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：69之引子進行定序(參見引子列表)。所獲得的序列經IMGT^®(國際ImMunoGeneTics資訊系統(http：//www.imgy.org))進行分析，以辨識出具有最高相等性的種系V(D)J基因區段。

將所得之IgV基因序列編碼的重鏈可變區(V_H)和輕鏈可變區(V_L)的胺基酸序列，在引子列表中顯示並互相比對，其中框架區與其互補決定區(CDR)，係由IMGT或Kabat系統確定。

表現載體之選殖。

定序後，基於具有最高相等性之V或J片段(請見表2)挑選具基因特異性的引子(請見引子列表)，並以類似於前述巢式PCR的條件進行PCR反應；其中每一B細胞之V_H、V_κ與V_λ鏈的PCR產物(得自上述第二回PCR)係作為模板。如上述段落中所述方法純化所得PCR產物，並選殖至人類IgG₁λ表現載體中(由台灣中研院的Dr.Tse-Wen Chang提供)，因而獲得四個抗體的表現載體，辨識為「2A6」、「2B6」、「2F2」與「1E8」。

除上述四種表現載體外，亦建構用於表現2A6 V_H重鏈和2B6 V_L輕鏈的載體(稱為VH2A6/VL2B6，命名為「AB」)，以及2B6 V_H重鏈和2A6 V_L輕鏈組合的載體(稱為VH2B6/VL2A6，命名為「BA」)。

AMG811之V_H和V_L的DNA係使用GeneArt Gene Synthesis(Thermo Fher)合成。表現AMG811之載體係以PCR技術並基於上述選殖方法建構。

重組步驟係由GeneArt^®Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Invitrogen)進行。於42℃，將5μL重組產物轉化至勝任大腸桿菌中。藉由PCR篩選經轉化之大腸桿菌，分別使用pIgG₁κ-screen+(SEQ ID NO：117)或pIgG₁λ-screen+(SEQ ID NO：118)作為正向引子，以及pIgG1-screen-(SEQ ID NO：119)作為反向引子(請參考引子列表)。將具有預期大小(約1800bps)的PCR產物進行定序，以確認與原始PCR產物的等同性。使用QIAprep®Spin管柱(Qiagen)，將質體DNA自3mL經轉化的大腸桿菌培養物中分離出，該經轉化的大腸桿菌係於含有100μg/mL氨芐青黴素的Luria-Bertani培養液中，於37℃下生長16小時。

重組抗體之製造。

將FreeStyle^TM293-F細胞(Thermo Scientific,R79007)置於含有FreeStyle^TM293表現用培養液(Gibco,12338018)之250-mL錐形瓶中，於標準條件下以1×10⁶細胞的濃度培養。對呈指數生長之FreeStyle^TM 293-F細胞(1.5~2×10⁶細胞/ml)進行瞬時轉染(transient transfection)，其係使用具有平均分子量25kDa的線性聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，Warrington，Pa)作為轉染試劑及88μg的質體DNA進行。轉染後，將細胞培養3天，收穫培養液。將培養液於3000rpm離心10分鐘，以除去FreeStyle^TM 293-F細胞碎片，然後收集所得上清液，並通過0.45μm過濾膜過濾。

重組抗體之純化。

以Protein A Sepharose Fast Flow微珠(GE Healthcare,17-1279-01)純化上述獲得的上清液以獲得重組抗體。簡言之，將80mL上清液加入80μL Protein A Sepharose Fast Flow微珠，並均勻分裝到兩個50ml管中，於4℃下旋轉培養24小時。然後，於3000rpm離心該管10分鐘後，移除所得上清液，並以PBS平衡該些微珠。以0.1M甘胺酸(pH 3.0)沖提經平衡的該些微珠，將沖提液收集至含有1M Tris(pH8.0)的管中，並用PBS緩衝液透析，以獲得重組抗體。

為清楚起見，分別將每一單株抗體的V_H鏈和V_L鏈上的CDR統整於表3和表4中。CDR係經由Kabat和IMGT系統辨識出，使用序列註釋和網路序列分析(http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html與http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。於下表3與4中，前有「K：」之CDR代表使用Kabat系統，前有「I：」之CDR代表使用IMGT系統。

醣基化位點之點突變的選殖與分析。

當抗體2A6在哺乳動物細胞中表現時，可觀察到兩條重鏈帶(第一圖，第1行)。這可能是由於轉譯後修飾(posttranslational modification)所致。N-連接醣基化位點的共有序列為Asn-Xaa-Ser/Thr，以及罕見地共有序列為Asn-X-Cys。單株抗體在其Fc部分的N297位點具有一個保守性N-連接醣基化位點。值得注意的是，抗體2A6在其可變區(其重鏈的第76個胺基酸)也包含一個N-連接醣基化位點。

N-醣基化位點的存在係經PNGase F降解試驗確認。簡言之，將3.5μg抗體、1μl醣蛋白失活緩衝液(10×)和H₂O(如果需要)混合，以製得15μl之總反應體積。抗體係於100℃加熱10分鐘以將其失活。將失活之抗體置於冰上冷卻，並離心10秒。混合3μl之GlycoBuffer 2(10×)、3μl之10% NP-40與9μl之H₂O以製備總反應混合物(30μl)。將反應混合物於37℃靜置1小時，之後以SDS-PAGE分析。以電泳位移(mobility shift)測定抗體的去醣基化。

經PNGase F切割之後，抗體2A6之尺寸下降，表示N-連結之醣類已被移除。只有偵測到一條清晰具較低分子量的重鏈帶(第一圖，第2行)。這說明在PNGase F處理之前觀察到的重鏈的較低帶，是由於N-連接醣基化位點的部分糖基化而造成。

該N-連接醣基化位點被認為是一種部分醣基化位點(partial glycosylation site)，且會使抗體2A6的大量生產缺乏分子均一性。為了促進抗體2A6的商業應用，遂設計並進行點突變，以除去上述N-連接醣基化位點。

為了準備位點特異性醣基化突變體質體，係使用來自NEB的Q5聚合酶進行點突變。用於突變每一構建體的寡核苷酸如下(同義序列)：c2A6_Q 5’-CGTTTCTAGAGACAACGCCCAGAATTCGGTATATCTCCACA-3’(SEQ ID NO：169)與c2A6_A5’-CGTTTCTAGAGACAACGCCGCCAATTCGGTATATCTCCAC-3’(SEQ ID NO：170)。以DNA定序確認每一構建體的突變序列。在上述點突變後，抗體2A6的重鏈可變區的第76個胺基酸由天冬醯胺突變為麩醯胺酸或丙胺酸，分別命名為抗體2A6_Q(在其重鏈上攜帶N76Q突變)和抗體2A6_A(其重鏈上攜帶N76A突變)。基此，抗體2A6_Q和抗體2A6_A的重鏈分別包含SEQ ID NO：165與SEQ ID NO：164。

在抗體2A6_A和抗體2A6_Q的試驗中，SDS-PAGE分析顯示2A6的重鏈具有兩條帶，而2A6_A或2A6_Q的重鏈顯示出清楚的單一帶，且分子量較低(第二圖)。這些數據表明在2A6_Q和2A6_A中的N-連接醣基化位點被破壞。進一步進行質譜分析研究2A6、2A_Q和2A6_A的醣基化狀態。UPLC系統由帶有四級UPLC泵(QSM)的Acquity H級生物系統組成，配備有50μl樣品環和光電二極管陣列檢測器(Waters)的自動進樣裝置(SM)。使用Masslynex軟體(V4.1，Waters)處理層析圖。確認了2A6的ASN-76具有N連接醣基，且當Asn-76被Ala(2A6_A)或Gln(2A6_Q)取代，會導致該醣基化信號喪失。

實施例2. 重組抗IFN-γ抗體之活性的測定。

實驗流程：

A.生物膜干涉分析法分析(Bio-layer Interferometry；BLI)

利用生物膜干涉分析法(BLI，ForteBio Octet RED96)測定抗體結合動力學速率常數(k_a與k_d)。BLI試驗係以AHC(Anti-hIgG Fc Capture)生物感測器(ForteBio)進行，以捕捉各抗IFN-γ mAbs抗體(750ng/mL)，取得0.5nm位移(shift)，接著將生物感測器浸入不同濃度(亦即0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、及40nM)的重組人類IFN-γ蛋白質(R&D systems，285-IF-100；置於泳動緩衝液中，該緩衝液包含0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.1% Tween-20、250mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、及1.8mM KH₂PO₄)。利用5分鐘結合與15分鐘分離之交互作用時間的結合反應的曲線擬合分析(curve fitting analysis；1：1朗謬(Langmuir)模型)計算速率常數。

B.HLA-DR表現。

將2×10⁵個THP-1細胞(BCRC 60430)培養於100μL的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養基(Gibco，11875-093)，培養基中添加10% FBS與1%青黴素/鏈黴素，接著以不同濃度(亦即0.017、0.05、0.15、0.45、1.37、4.11、12.34、37.03、111.1、333.3、1000、3000、5000、及10000ng/mL)的2A6、2B6、1E8、及2F2抗IFN-γ mAbs處理30min。以2ng/mL重組人類IFN-γ蛋白刺激經處理的THP-1細胞，並在培養箱內(37℃，5% CO₂)培養24小時。以未經刺激的THP-1細胞作為對照組。之後，以HLA-DR-PE抗體(BD PharmigenTM)將經刺激與未經刺激的THP-1細胞染色，接著在冰上避光放置30分鐘。以2mL的PBS清洗經染色的細胞，並使其再懸浮於500μL的PBS中。以FACSVerse流式細胞儀取得經染色細胞的螢光強度，並以FACSuite軟體分析。各抗體HLA-DR表現的抑制百分比以下列方程式取得：A=(B/C)×100

其中A=HLA-DR表現的抑制百分比；B=經刺激細胞的螢光強度中位數；C=未經刺激細胞的螢光強度中位數。

C.IFN-γ抗體的ELISA試驗。

以含有100μL的重組型人類IFN-γ蛋白(2μg/mL)或BSA(2μg/mL)的碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)塗佈透明聚苯乙烯材質的96孔平底培養盤(Nunc)的每一孔，並放置在4℃整夜。以含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)清洗該培養盤三次，接著在25℃下以含有5%人類正常血清白蛋白(Aventis)的PBS阻斷2 小時。再次以含有0.05% Tween 20的PBS清洗該培養盤，接著將兩種不同濃度(1μg/mL與0.1μg/mL)的1E8、2F2、2A6、2B6、AB、及BA mAbs分別加入培養盤各孔中，以結合重組型人類IFN-γ蛋白，之後在25℃反應2小時。以含有0.05% Tween 20的PBS徹底清洗該培養盤，接著加入Fc特異性鹼性磷酸酶接合的AffiniPure山羊抗人類IgG(Cappel)，其中稀釋比率為1：2500。將培養盤放置於37℃90分鐘，接著以含有0.05% Tween 20的PBS清洗五次。在加入磷酸對硝基苯酯(pNPP)溶液(100μL/孔)後，將培養盤放置於37℃30分鐘。以VICTOR X3 Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)測定OD₄₀₅ nm下的吸光度。

結果：

A.生物膜干涉分析法分析。

第三圖顯示，使不同濃度的重組人類IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10nM)通過固定在AHC生物感測器上的抗IFN-γ mAbs而取得的結合曲線。抗體結合動力學速率常數(K_a與K_d)及平衡解離常數(K_D=K_d/K_a)列於表5。

參考表5，可看到重組2A6、2B6、1E8、及2F2抗體具有低的K_d值，代表本揭露重組抗體對人類IFN-γ具有高親和力。

在另一個涵蓋使用AMG811(AMG811為抗IFN-γ抗體，描述於美國專利第7,335,743號，其製備如內容所述)、2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q、AB、及BA抗體的實驗顯示，本揭露抗體表現出與AMG811相當或甚而更好的抗IFN-γ活性(第四圖與表6)。

表6

B.HLA-DR表現。

第五圖顯示IFN-γ誘發的HLA-DR表現具有劑量依賴性，且可有效地被本揭露抗體抑制。由第五圖可看到，當2A6、2B6、1E8、及2F2抗IFN-γ抗體的濃度增加時，抑制百分比亦增加。

2F2、1E8、2A6、及2B6抗IFN-γ抗體的IC₅₀(ng/mL)分別為36.1、8.6、3.4、及3.5。2F2、1E8、2A6、及2B6抗IFN-γ抗體的IC₉₀(ng/mL)分別為507.7、48.6、3851.3、及1020.5。上述結果顯示，本揭露抗體可有效地抑制IFN-γ介導的活性，且可用於治療IFN-γ介導的症狀。

C.抗IFN-γ抗體的ELISA試驗。

第六圖顯示在405nm(OD405)下培養盤各孔的吸光度，以檢測人類抗IFN-γ抗體。第六圖中可看到，濃度較高的抗體(1μg/mL)所呈現的吸光度比濃度較低者(0.1μg/mL)的強。此外，抗體未結合至BSA，代表本揭露抗體可特異性結合至人類IFN-γ。

實施例3. 重組抗IFN-γ抗體之活性的測定。

在本實施例中，以IFN-γ測試本揭露抗體2A6、2A6_A、2A6_Q、2B6、AB、及BA的結合親和力(ELISA)及中和活性(細胞分析測定與全血測定)。此外，亦使用AMG811作為正向對照組及比較例。

A.利用生物素化IFN-γ進行抗IFN-γ抗體的ELISA試驗。

依據產品手冊(EZ-Link NHS-LC-Biotin；Thermo # 21336)將重組人類IFN-γ(R&D systems 285-IF-100)與食蟹獼猴(Cynomolgus)IFN-γ(R&D systems961-RM-025)加上生物素標記，並分別結合至鏈黴親和素塗佈的培養盤。在室溫下培養1-2小時後，以300μL的清洗緩衝液清洗該培養盤三次。將序列稀釋的抗IFN-γ抗體加入各孔中。在室溫放置1-2小時後，用300μL洗滌緩衝液洗滌培養盤三次。在室溫下將HRP抗人IgG施加到每個孔中反應1小時。洗滌後，將培養盤用TMB基質顯色，並在OD_450-650下分析。

結果顯示於第七圖與第八圖。應注意到，本揭露所有測試的IFN-γ抗體皆呈現良好的人類IFN-γ結合親和力。此外，其結合親和力與AMG811的親和力沒有顯著差異(第七圖)。儘管其對人類IFN-γ的親和力較高，但本揭露測試的抗IFN-γ抗體亦與恒河獼猴/食蟹獼猴的IFN-γ呈現交叉反應性。值得注意的是，AMG811未顯示如本揭露抗IFN-γ抗體的交叉反應性(第八圖)-此為本揭露抗體的顯著優勢。

B.抗IFN-γ抗體的細胞分析試驗。

利用表現pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro]的螢光素酶報導基因HeLa穩定細胞株(Promega #CS179301)測定抗IFN-γ抗體的中和活性。簡言之，將HeLa細胞株以每孔8×10³個細胞的數量分盤於96孔不透明培養盤。以1ng/ml IFN-γ及不同濃度的抗IFN-γ抗體處理細胞18小時。利用ONE-Glo^TM螢光素酶試驗系統(Promega #E6110)分析螢光素酶(Luciferase)活性。

結果顯示，所有測試抗體皆能中和IFN-γ的活性(第九圖)。所有測試抗體皆被肯定具有產業或醫藥應用所需的中和活性。

C.抗IFN-γ抗體的全血試驗。

收集經接種卡介苗(bacillus Calmette-Guérin；BCG)的健康志願者的全血於10-ml肝素化試管中。在96孔微量滴定培養盤的圓底孔中，將20μl全血樣本混合80μl之含或不含BCG+IL12(20ng/ml)的RPMI 1640培養液。將微量滴定培養盤培養於37℃、5% CO₂中48小時。在培養後，利用CXCL9 ELISA套組 (R&D systems DCX900)測量CXCL9。利用CXCL10 ELISA套組(Biolegend 439905)測量CXCL10。在以稀釋因子校正後，求得細胞激素濃度。實驗中，以人類同型IgG1對照作為負向對照組。

如所預期，人類全血樣本產生高量的IFN-γ、CXCL9和CXCL10，CXCL9與CXCL10的產生已知會受IFN-γ調節。抑制內源性IFN-γ會阻斷IFN-γ依賴性之CXCL9與CXCL10的產生。

此結果確認本揭露抗IFN-γ抗體透過中和內源性IFN-γ而有效抑制CXCL9與CXCL10的產生(第十圖與第十一圖)。

D.利用抗IFN-γ抗體抑制T細胞抑制性受體的配體。

依據ATCC的說明培養THP-1細胞。將不同量的抗IFN-γ抗體置於含有40ng/ml IFN-γ的500μl RPMI-1640培養液中10分鐘，並將混和物加至4×10⁵個細胞(500μl)中，以供中和試驗使用。IFN-γ抗體的最終濃度為0、40、200、或1000ng/ml。在37℃培養箱中培養72小時後，以PE抗人類PD-L1抗體(Biolegend 329706)或FITC抗人類HLA-DR抗體(Biolegend 327006)染色細胞，並在避光的冰上放置30分鐘。以2ml的FACS緩衝液清洗細胞二次，並使其再懸浮於300μl的FACS緩衝液中。利用FACSCalibur流式細胞儀取得數據。

結果確認本揭露抗IFN-γ抗體能以劑量依賴性方式抑制IFN-γ誘發的HLA-DR(第十二圖)與PD-L1(第十三圖)表現。連同上述細胞分析試驗及全血試驗，發現本揭露抗體不僅顯示對IFN-γ的結合親和力，還能抑制IFN-γ活性。

實施例4. 本揭露抗體的表位測定。

A.表位鑑定(epitope binning)實驗。

進行表位鑑定實驗以測定哪些抗IFN-γ抗體會競爭結合至IFN-γ，這表示其結合至相同或類似的IFN-γ表位。簡言之，以鏈黴親和素塗佈的Octet生物感測器尖端(biosensor tips)(FortéBio)研究本揭露四個抗IFN-γ抗體1E8、2F2、2A6、及2B6的表位。首先，將2μg/mL之生物素化的重組人類IFN-γ填入鏈黴親和素感測器尖端，以取得0.5nm位移。在100秒穩定和120秒的基線步驟之後，將一級抗IFN-γ抗體個別地在600秒的結合步驟中以5μg/mL的量填入尖端。接著，以5μg/mL濃度的二級抗IFN-γ抗體與生物感測器尖端進行600秒結合反應的培養。若信號顯示大量積累在尖端，則視為結合至不同表位。

本揭露四個抗IFN-γ抗體2A6、2B6、1E8、及2F2的表位鑑定實驗結果列於第十四圖。彼等四個抗IFN-γ抗體落在二個表位群組：第I組包含1E8與2F2；以及第II組包含2A6與2B6。換言之，1E8與2F2具有類似/相同的IFN-γ表位，且2A6與2B6具有類似/相同的IFN-γ表位。

B.利用HDX定位人類IFN-γ表位。

利用HDX MS方法，以經胃蛋白酶分解之片段測定IFN-γ於存在與不存在抗IFN-γ抗體的氫氘交換(hydrogen-deuterium exchange；HDX)。在交換緩衝液(含有99.9% D₂O的PBS，pH 7.4)中以1：10的比率稀釋重組蛋白(15pmol)與蛋白-抗體錯合物(15pmol：10pmol)，並在室溫下啟動HD交換。分別在七個時間點(10s、40s、80s、180s、600s、1800s、3600s)取一等分試驗樣本(1.5pmol的目標蛋白質)並與預冷的淬滅緩衝液(quenching buffer)(最終濃度為1.5M胍鹽酸鹽、150mM參(2-羧乙基)膦、及0.8%甲酸)混合。於Orbitrap質譜儀中分析所得混合物。MS與MS/MS自動增益控制(automatic gain control)分別設定為1,000ms(全掃瞄)與120ms(MS/MS)，或者2×10⁶個離子(全掃瞄)與3×10³個離子(MS/MS)，以最大化累積時間或離子。在分析中，交換時間內平均氘摻入量大於10%的變化視為具顯著性。

基於HDX-MS表位定位數據，預測之人類IFN-γ上的抗體2A6_Q與抗體2B6的表位包含二個不連續的胺基酸片段：SEQ ID NO：166的第30-52個胺基酸與第78-92個胺基酸。更精準地說，此處提出人類IFN-γ上的抗體2A6_Q與抗體2B6的表位包含二個不連續的胺基酸片段：SEQ ID NO：166的第36-48個胺基酸與第82-92個胺基酸。抗IFN-γ抗體2A6_Q與2B6的HDX表位係列於表7。

C.丙胺酸掃瞄突變法(Alanine scanning mutagenesis)。

丙胺酸掃瞄突變法係用於鑑定特定區域中對抗體抗原之結合而言是重要的特定胺基酸。將SEQ ID NO：166中的36-48與82-92間之胺基酸各自突變為丙胺酸。在所有突變體中，有11個取代(胺基酸39、41、42、44、45、47、85、88、91、92)降低IFN-γ的生物活性(利用表現pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro(Promega #CS179301)]的HeLa穩定細胞株測定)，可能是丙胺酸取代造成構形改變故這些突變體未進行ELISA試驗。

將2A6_Q或2B6與其餘IFN-γ突變體蛋白質的ELISA結合結果與野生型IFN-γ的結果比較。將ELISA結合信號之最大值降至野生型的20%以下的狀況視為結合作用的降低，具有前揭狀況的突變即認定為顯著的影響了IFN-γ與抗體間之結合。結果如表7所示。結合試驗的數據與HDX MS作圖的結合區域圖非常一致。

此外，將HDX分析所得數據繪成時間對比H交換減少(time vs.reduced H exchange)的圖。將彼等數據圖與MS數據一起分析，顯示抗體結合至包含至少SEQ ID NO：166的第36-48與82-92個胺基酸等不連續表位。更長區域的HDX分析顯示，該表位可能進一步延伸，而包含IFN-γ序列SEQ ID NO：166的不連續之第30-52與78-92個胺基酸。

鑒於上述，結論為，抗體2A6、2B6、及2A6_Q辨識IFN-γ(SEQ ID NO：166)的K37、E38、K43、Q46、Q48、K86、及R89，且對IFN-γ(SEQ ID NO：166)的K43、Q48、及K86具有更強的親和力。

<110> 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司(Elixiron Immunotherapeutics(Hong Kong)Limited)

<120> 抗干擾素-γ之抗體及其應用

<140> TW107115156

<141> 2018-05-04

<150> US62/501,952

<151> 2017-05-05

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> 引子

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<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 143

<210> 144

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 144

<210> 145

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 145

<210> 146

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 146

<210> 147

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 147

<210> 148

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 148

<210> 149

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 149

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 150

<210> 151

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 151

<210> 152

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 152

<210> 153

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 153

<210> 154

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 154

<210> 155

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 155

<210> 156

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 156

<210> 157

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 157

<210> 158

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 158

<210> 159

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 159

<210> 160

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 160

<210> 161

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 161

<210> 162

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 162

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 163

<210> 164

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體

<400> 164

<210> 165

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體

<400> 165

<210> 166

<211> 143

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 166

<210> 167

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 167

<210> 168

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 168

<210> 169

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 169

<210> 170

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 170

<210> 171

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 171

<210> 172

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 172

<210> 173

<211> 373

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 173

<210> 174

<211> 334

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 174

<210> 175

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體

<400> 175

<210> 176

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體

<400> 176

<210> 177

<211> 373

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 177

<210> 178

<211> 334

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 178

<210> 179

<211> 364

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 179

<210> 180

<211> 349

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 180

<210> 181

<211> 366

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 181

<210> 182

<211> 331

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 182

Claims

一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用IMGT系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、及SEQ ID NO：122；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、及SEQ ID NO：134。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用Kabat系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、及SEQ ID NO：146；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、及SEQ ID NO：134。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用IMGT系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、及SEQ ID NO：125；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、及SEQ ID NO：137。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用Kabat系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、及SEQ ID NO：149；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、及SEQ ID NO：137。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用IMGT系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、及SEQ ID NO：122；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、及SEQ ID NO：137。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用Kabat系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、及SEQ ID NO：146；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、及SEQ ID NO：137。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用IMGT系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、及SEQ ID NO：125；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、及SEQ ID NO：134。
一種經分離之IFN-γ抗體，其中使用Kabat系統，該V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分別為SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、及SEQ ID NO：149；其中該V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分別為SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、及SEQ ID NO：134。
如請求項1或2之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H包含具有與SEQ ID NO：109至少90%等同度之序列，以及V_L包含具有與SEQ ID NO：113至少90%等同度之序列。
如請求項3或4之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H包含具有與SEQ ID NO：110至少90%等同度之序列，以及V_L包含具有與SEQ ID NO：114至少90%等同度之序列。
如請求項5或6之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H包含具有與SEQ ID NO：109至少90%等同度之序列，以及V_L包含具有與SEQ ID NO：114至少90%等同度之序列。
如請求項7或8之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H包含具有與SEQ ID NO：110至少90%等同度之序列，以及V_L包含具有與SEQ ID NO：113至少90%等同度之序列。
如請求項1至8中任一項之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H不包含N-連結醣基化位點。
如請求項13之經分離之IFN-γ抗體，其中V_H包含具有與SEQ ID NO：164至少90%等同度之序列其中位置76之胺基酸為A；或與SEQ ID NO： 165至少90%等同度之序列，其中位置76之胺基酸為Q；以及V_L包含具有一與SEQ ID NO：113至少90%等同度之序列。
如請求項1至8中任一項之經分離之IFN-γ抗體，其中該抗體為小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
如請求項1至8中任一項之經分離之IFN-γ抗體，其中該抗體與人類和恒河猴/食蟹獼猴之IFN-γ有交叉反應。
如請求項1至8中任一項之經分離之IFN-γ抗體，該經分離之IFN-γ抗體特異性結合至人類IFN-γ，並具結合值K_D小於1×10^-8M，其中該特異性IFN-γ結合值K_D係以生物膜干涉分析法測量。
如請求項1至8中任一項之經分離之IFN-γ抗體，其中該經分離之IFN-γ抗體抑制人類IFN-γ介導之活性，具IC₅₀值小於50ng/mL，其中該IC₅₀值係以HLA-DR表現分析法測量。
一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項1至18中任一項之經分離之IFN-γ抗體；該多核苷酸包含第一序列以及第二序列，分別編碼抗體之V_H及V_L，該第一序列及該第二序列分別具有：與SEQ ID NO：173至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：174至少90%之等同度；與SEQ ID NO：175至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：174至少90%之等同度；與SEQ ID NO：176至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：174至少90%之等同度；與SEQ ID NO：177至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：178至少90%之等同度；與SEQ ID NO：173至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：178至少90%之等同度；或與SEQ ID NO：177至少90%之等同度，以及與SEQ ID NO：174至少90%之等同度。
如請求項19之經分離之多核苷酸，其中該多核苷酸包含一多核苷酸序列，其包含一或多個經挑選以於哺乳動物細胞中進行最佳化表現抗體之密碼子。
如請求項20之經分離之多核苷酸，其中該經分離之多核苷酸係於哺乳動物細胞中進行表現，且該哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6細胞，以及COS細胞。
一種載體，包含如請求項19至21中任一項之多核苷酸。
一種經分離之宿主細胞，包含如請求項22之載體。
一種經分離之宿主細胞，表現如請求項1至18中任一項之經分離之IFN-γ抗體。
如請求項24之宿主細胞，其中該宿主細胞係選自於由大腸桿菌、昆蟲、酵母菌或哺乳動物細胞組成之群組。
一種用於中和IFN-γ活性之組成物，包含：如請求項1至18中任一項之經分離之IFN-γ抗體；以及一載劑。
一種以如請求項1至18中任一項之經分離之抗體製備治療IFN-γ介導之症候群之藥物的用途。
如請求項27之用途，其中該藥物之投予係以注射、輸液、滴注和吸入進行。
如請求項27之用途，其中該藥物之投予係以注射進行，以及該注射係選自於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、玻璃體內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、脊髓內注射，以及胸骨內注射和輸注。
如請求項27之用途，其中該IFN-γ介導之症候群包含發炎、後天免疫缺陷症候群(AIDS)、類風濕性關節炎，包括青少年類風濕性關節炎、發炎性腸病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病(Crohn’s disease)、多發性硬化症、艾迪生病(Addison’s disease)、糖尿病(第I型)、副睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、重症肌無力、天皰瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、動脈粥樣硬化、紅血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自體免疫性肝炎誘發之肝損傷、膽汁性肝硬化、酒精誘發之肝損傷，包括酒精性肝硬化、風濕熱、類肉瘤病、硬皮病、休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊柱關節病、強直性脊柱炎、川崎病(kawasaki disease)、乾眼病、噬血細胞淋巴組織細胞增多症、巨噬細胞活化症候群、甲狀腺炎、血管炎，或其組合。
一種偵測環境中IFN-γ之方法，包含：(a)施加如請求項1至18中任一項之經分離之IFN-γ抗體至該環境中；(b)將該環境與抗IgG抗體一同靜置；其中該抗IgG抗體係與可偵測標記連結；以及(c)偵測該可偵測標記。
如請求項31之方法，其中該抗IgG抗體為Fc特異性抗體。
如請求項31之方法，其中該可偵測標記包含鹼性去磷酸酶；以及該方法更包含在步驟(b)之後與步驟(c)之前，將該環境與對-硝基苯基磷酸酯溶液一同靜置。
如請求項31之方法，其中該步驟(c)之偵測係以測量該環境的OD₄₀₅吸收值進行。