CN109715661B

CN109715661B - 抗干扰素-γ的抗体及其应用

Info

Publication number: CN109715661B
Application number: CN201880003302.0A
Authority: CN
Inventors: 顾正仑; 施瀚博; 林嘉豪; 丁静雅; 黄静宜; 郭奕廷
Original assignee: Elixiron Immunotherapeutics Hong Kong Ltd
Current assignee: Anlixirong Shanghai Biopharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: US20210171625A1; ZA201905642B; KR20200004292A; AU2018263196A1; BR112019022702A2; MX2019012865A; US20210054066A1; WO2018202200A1; EP3621993A1; US20210171624A1; JP2020519562A; CN109715661A; US10968274B2; TW201904994A; CA3057735A1; JP7308747B2; EP3621993A4; TWI797124B

Abstract

本发明提供一种新颖的抗干扰素‑γ(IFN‑γ)抗体，以及包含该抗体的组合物，以用于中和干扰素‑γ(IFN‑γ)介导的活性。本发明亦提供一种包含该抗干扰素‑γ(IFN‑γ)抗体的药物组合物，用于治疗IFN‑γ介导的综合征。

Description

抗干扰素-γ的抗体及其应用

相关申请

本申请案主张2017年5月5日提出的美国临时专利申请号62/501,952的优先权，其揭示内容在此并入本案以作为参考数据。

技术领域

本发明系有关针对干扰素-γ(IFN-γ)的新颖重组抗体或任一抗原结合片段。本发明亦有关该抗体或其任一抗原结合片段在改善、治疗、或预防IFN-γ所介导的疾病的用途。

背景技术

干扰素-γ(IFN-γ)系一在先天与后天免疫中扮演关键角色的细胞激素。本领域习知，IFN-γ与发炎作用和自体发炎性疾病相关。举例而言，Kine Edvardsen等人揭示，在爱迪生氏病(Addison’s disease)患者中，普遍出现能产出大量IFN-γ的自体反应性21OH特异性T细胞(J Interferon Cytokine Res.2015Oct 1；35(10):759–770)。Bisping G等人得出结论，即使在疾病不活动状态下，发炎性肠病患者的肠上皮细胞介导的CD8⁺淋巴球仍展现增加生产IFN-γ的能力(Clin Exp Immunol.2001Jan；123(1):15-22.)。

与上述促发炎性功能相反的是，在特定情况下，IFN-γ的表达可导致T细胞活性被抑制。举例而言，Benci JL等人显示，肿瘤IFN-γ信号传导可调节多基因抗性程序(multigenic resistance program)，以阻断免疫检查点(checkpoint)(Cell,2016,Dec167:1540-1554)。其数据指出，阻断或中和IFN-γ可改进独特耗竭性T细胞子群的功能。因此，中和性抗IFN-γ试剂亦可用于增进T细胞免疫性。

鉴于抗IFN-γ试剂在治疗发炎作用相关疾病的潜在医药应用，可用于产业与医药应用的抗IFN-γ抗体仍有持续需求。

发明内容

本发明目的之一系提供一种新颖的抗IFN-γ抗体，以及包含其的组合物，用于中和IFN-γ介导的活性。本发明的另一目的系提供一种包含该抗IFN-γ抗体的医药组合物，用于治疗IFN-γ介导的综合征。

为了完成前述目的，本揭示系提供一种经分离的抗体，包含：V_H CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:120、123、126、129、144、147、150、或153；V_H CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:122、125、128、131、146、149、152、或155；V_L CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:132、135、138、141、156、158、160，或162；V_L CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:133、136、139、142、157、159、161，或163；以及V_L CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:134、137、140，或143。

本发明系提供一种经分离的抗体，其特异性地结合至与前述段落所称抗体的相同的表位上。在某些具体实施例中，前述抗体更包含如下与本文所述表位(epitope)的结合特性。

本发明还提供一种经分离的抗体，其中该抗体特异性地结合至人类IFN-γ的第30-52或36-48位氨基酸，以及第78-92或82-92位氨基酸内之一或多个氨基酸，其中该第30-52位氨基酸包含SEQ ID NO:167、该第36-48位氨基酸包含SEQ ID NO:171、该第78-92位氨基酸包含SEQ ID NO:168，以及该第82-92位氨基酸包含SEQ ID NO:172。

本发明更提供一种经分离的抗体，其中该抗体特异性地结合至人类IFN-γ的第36-48与82-92位氨基酸内之一或多个氨基酸序列，其中该第36-48位氨基酸包含SEQ IDNO:171，以及该第82-92位氨基酸包含SEQ ID NO:172。

本发明又提供一种经分离的抗体，其特异性结合至人类IFN-γ的表位，其中该表位包含人类IFN-γ的氨基酸K43、氨基酸Q48与氨基酸K86；其中该人类IFN-γ包含SEQ IDNO:166。

接着，本发明系提供一种经分离的多核苷酸，其编码前述的经分离的抗体。在某些具体实施例中，该经分离的多核苷酸编码一抗体，其中该抗体包含一V_H CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:120、123、126、129、144、147、150，或153；V_H CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:122、125、128、131、146、149、152，或155；V_L CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:132、135、138、141、156、158、160，或162；V_L CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:133、136、139、142、157、159、161、或163；以及V_L CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:134、137、140，或143。

在某些具体实施例中，该经分离的多核苷酸包含第一序列，其具有与SEQ ID NO:173、175、176、177、179或181至少90％的等同度，其编码抗体的V_H；以及第二序列，其具有与SEQ ID NO:174、178、180或182至少90％的等同度，编码抗体的V_L。

本发明亦提供一种包含前述多核苷酸的载体。

本发明亦提供一种经分离的宿主细胞，其包含前述载体。

本发明更提供一种经分离的宿主细胞，其表达前述经分离的抗体。

本发明亦提供一种用于中和IFN-γ活性的组合物，包含：前述经分离的抗体；以及一载体。

本发明还提供一种用于治疗IFN-γ介导的综合征的组合物，包含：有效量的前述经分离的抗体；以及药学上可接受的载体。

本发明更提供一种治疗IFN-γ介导的综合征的方法，包含：给药有需要的个体有效剂量的经分离的抗体。

本发明亦提供一种检测环境中IFN-γ的方法，包含：(A)施加前述经分离的抗体至该环境中；(B)将该环境与抗IgG抗体一同静置；其中该抗IgG抗体系与可检测标记链接；以及(C)检测该可检测标记。

附图说明

图1显示实施例1的抗体2A6的PNGase F降解试验结果。「-」代表未处理组；「+」代表经PNGase F处理组。箭头指示经PNGase F处理后的带移位。

图2显示实施例1的抗体2A6、2A6_A与2A6_Q的SDS-PAGE分析结果。

图3显示实施例2中，使不同浓度的重组人类IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10nM)通过固定于AHC生物传感器上的抗IFN-γmAbs而得的结合曲线。

图4显示实施例2中，使不同浓度的重组人类IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20nM)通过固定于AHC生物传感器上的抗IFN-γ抗体而得的结合曲线。AMG811为美国专利号7,335,743所述的抗IFN-γ抗体，并如本文所述方法制备。对照组抗体为人类同型IgG1对照组抗体(Bio X cell；BP0297)。

图5显示本申请抗体可有效且为剂量依赖性地抑制IFN-γ诱发的HLA-DR表达。

图6显示实施例2的ELISA结果，其说明本申请的抗体对IFN-γ结合亲和力。

图7显示实施例3的ELISA结果，其说明人类IFN-γ(R&D systems 285-IF-100)与本申请抗体的结合亲和性。

图8显示实施例3的ELISA结果，其说明恒河猴/食蟹猕猴IFN-γ(R&D systems961-RM-025)与本申请抗体的结合亲和力。

图9展现本申请抗体对于IFN-γ的中和活性。

图10显示在实施例3中进行的全血试验中，抗IFN-γ抗体对于产生CXCL9的抑制作用。

图11显示实施例3的全血试验中，抗IFN-γ抗体对于CXCL10的产生的抑制作用。

图12说明本申请抗体对IFN-γ诱发HLA-DR表达的抑制作用。

图13说明本申请抗体对IFN-γ诱发PD-L1表达的抑制作用。

图14显示实施例4中进行的表位鉴定实验结果。

实施方式

对于本文和所附申请专利范围中的描述，单数形式「一(a)」和「一个(an)」包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，「一蛋白质」系指包括多于一种蛋白质，且「一化合物」系指多于一种化合物。「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(「comprising)」、「包括(include)」、「包括(includes)」、「包括(including)」的使用是可互换的，而非限制性的。更应理解的是，各具体实施例的描述中，使用术语「包括(comprising)」的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言「基本上由......组成」或「由......组成」替代。

当提供一定范围的数值，除非上下文另有明确规定，否则应当理解，该数值区间的整数以及该数值区间的每个整数的十分之一，介于该范围的上限与下限之间，以及在该范围内的任何其他陈述值或中间值，都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小范围内，同时也包含在本发明内，受限于所述范围内的任何特别排除的限制。当陈述的范围包括该限制的一或二者，排除这些限制之(i)或(ii)的范围也包括在本发明中。例如，「1至50」包括「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。

所有文献、专利、专利申请和本发明中引用的其他文件，皆完整并入本文以作为参考数据，其内容如同每一独立文献、专利、专利申请案或其他文件所分别指出，皆并入本文以作为参考目的。

应当理解的是，包括附图，以上一般性描述和以下详细描述仅是示范性和解释性的，并非用于限制本发明。

本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有明确定义。

术语「抗体」于此系包括完整抗体，以及其任一抗原结合片段(即「抗原结合部分」)或其单链。「抗体」系指一醣蛋白，包含透过双硫键相互连结的至少二重(H)链与二轻(L)链，或其抗原结合部位。每条重链由重链可变区(于此缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(于此缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的高度变异区，并穿插有更具保留性的区域，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原交互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和典型的补体系统的第一成分(C1q)。

框架区域与CDR的内容系依据Kabat等人(请见Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices,1991)，以及ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(请见Lefranc,Nucleic Acids Res29:207-9,2001；以及在线imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝humanIg)定义。

「Kabat系统」在本申请内容中表示根据Kabat(1991；Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th edit.,NIH publication no.91-3242U.S.Department ofHealth and Human services)，以及Chothia(1987；J.Mol.Biol.196,901-917)方式编号氨基酸的标准。此编号系统被本领域技术人员广泛使用，其系以对抗原结合活性相当重要的可变结构域序列的序列变异性和三维环部分为基础。在Kabat系统中，轻链或重链的所有氨基酸皆具有明确的位置；即Kabat系统适用于CDR以及框架区域。任何抗体的特定氨基酸位置可根据Kabat系统进行编号。根据Kabat系统辨识V_H和V_L链的CDR区的规则显示于www.bioinf.org.uk/abs.。

IMGT独特的编号系统是Kabat系统以外的另一种选择，其允许人们比较该可变结构域，无论是何种抗原受体、链类型或物种[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.andLefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT独特的编号系统中，保守性氨基酸总是具有相同的位置，例如半胱氨酸23(1st-CYS)、色氨酸41(CONSERVED-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(2nd-CYS)，苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特的编号系统提供了框架区域的标准化界定(FR1-IMGT：位置1至26、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104，以及FR4-IMGT：118至128)，以及互补决定区域：CDR1-IMGT:27至38、CDR2-IMGT：56至65，以及CDR3-IMGT：105至117。由于空格代表未占据位置，CDR-IMGT长度(显示在括号内并由点分隔，如[8.8.13])便成为关键信息。IMGT独特编号系统用于2D图形表示，称为IMGTColliers de Perles[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.and Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，以及用于3D结构，称为IMGT/3D结构-DB[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor andMHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。

术语「抗原结合片段」于此是指一抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab’)₂、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定化双抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv双体(双价双抗体)、由包含一或多个CDR的抗体部分形成的多特异性抗体，或结合至抗原但不包含全长或完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段可结合至与原始抗体或原始抗体片段(如原始scFv)相同的抗原。在某些具体实施例中，抗原结合片段可包含来自特定人类抗体的一或多个CDR，其与来自一或多个不同人类抗体的框架区嫁接。

在上述抗原结合片段中，Fab具有轻链和重链可变区、轻链恒定区、重链第一恒定区(CH1)的结构，并具有一个抗原结合位置。Fab’不同于Fab之处在于Fab’具有一铰链区(hinge region)，在重链CH1结构域的C端包括至少一个半胱氨酸残基。当Fab'的铰链区的半胱氨酸残基经由二硫键连接时，会产生F(ab’)₂。

Fv是最小的抗体片段，仅具有重链可变区和轻链可变区。用于产生Fv片段的重组技术在本领域中为已知。「单链Fv抗体」或「scFv」是指由轻链可变区和重链可变区组成的改造抗体，该轻链可变区和重链可变区直接或经由肽连结序列彼此连接。双链Fv可具有其中重链可变区经由非共价键与轻链可变区连接的结构。单链Fv通常可以形成如在双链Fv中的二聚体结构，其中重链可变区经由肽连结片段共价结合至轻链可变区，或是重链和轻链可变区在其C-端彼此直接连接。连结片段可为包括1至100，或2至50个氨基酸的肽连结片段，且其合适序列在本领域中为已知。

抗原结合片段可使用蛋白酶获得(例如，可用木瓜蛋白酶切割完整抗体以获得Fab片段，或可用胃蛋白酶切割以获得F(ab’)₂片段)，或可藉由基因重组技术来制备。

「经分离的抗体」于此系指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合IFN-γ的经分离的抗体实质上不含特异性结合至IFN-γ以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合IFN-γ的经分离的抗体会对其他抗原，如来自其他物种的IFN-γ分子，具有交叉反应性。此外，经分离的抗体可实质上不含其他细胞材料，及/或化学物质。

术语「单克隆抗体」或「单克隆抗体组合物」于此系指具均质分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物展现出对特定表位的单一结合特异性与亲和力。

术语「人类抗体」于此系指其可变区的框架区和CDR区均衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果该抗体含有恒定区，该恒定区亦衍生自人类免疫球蛋白序列。本申请的人类抗体可包括非衍生自人类免疫球蛋白序列编码的氨基酸(例如经由体外随机或位点特异性突变或经由体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语「人类抗体」于此并不包括衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的CDR序列移植到人类框架序列上的抗体。

术语「人类单克隆抗体」是指展现单一结合特异性，且其可变区的框架区和CDR区均衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体。

术语「重组人类抗体」于此包括所有经由重组技术制备、表达、产生或分离的人类抗体，例如(a)从用于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)分离的抗体或由其制备的融合瘤(下面进一步描述)，(b)从宿主细胞分离的抗体，该宿主细胞系经转化而用于表达人类抗体，例如来自转染瘤，(c)由重组、组合性人类抗体库分离出的抗体，以及(d)以涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他技术制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人类抗体具有可变区，其中框架区和CDR区衍生自人类免疫球蛋白序列。然而，在某些具体实施例中，可对于此类重组人类抗体进行体外突变(或者当使用人类Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞突变)，且因此，重组人类抗体的V_H和V_L区氨基酸序列，虽然系衍生自且相关于人类种系V_H和V_L，可能非天然存在于体内人类抗体种系库内者。

术语「人源化抗体」系指由非人类物种所产生的抗体，并包含已被修饰以增加它们与人类天然产生的抗体变体的相似性的蛋白质序列。当在人类中使用非人类来源的抗体时，人源化过程是必要的，以避免不需要的免疫原性效应。相较之下，术语「嵌合性抗体」于此系指经由将来自某一物种的抗原结合区(即V_H和V_L)与来自另一物种的恒定区互相融合的抗体。

术语「K_assoc」或「K_a」于此系指一特定抗体-抗原相互作用的结合率，术语「K_dis」或「K_d」于此系指一特定抗体-抗原相互作用的解离率。术语「K_D」于此表示解离常数，其由K_d与K_a的比率(即K_d/K_a)获得，并以摩尔浓度(M)表示。可使用本领域中已建立的方法来测定抗体的K_D值。

如本文所用，「表位」系指被一特异性抗体识别和结合的抗原的一部分，其确立抗原的抗原特异性。表位也被称为抗原决定位置。具体而言，在本申请中，表位可为人类IFN-γ的特定结构域或结构域的组合。在本申请的一些具体实施例中，该特定结构域或结构域的组合属于包含SEQ ID NO：166的人类IFN-γ。

在本申请的一具体实施例中，IFN-γ包含SEQ ID NO:166，且本申请的抗体特异性地结合至SEQ ID NO:166的第30-52或36-48位氨基酸，以及SEQ ID NO:166的第78-92或82-92位氨基酸内之一或多个氨基酸。在本申请的一特定具体实施例中，本申请的抗体于SEQID NO:166的第30-52及78-92位氨基酸与IFN-γ特异性结合。在此特定具体实施例中，该SEQ ID NO:166的第30-52及78-92位氨基酸形成本申请抗体的表位。在另一具体实施例中，本申请抗体于SEQ ID NO:166的第36-48及82-92位氨基酸与IFN-γ特异性结合。在此特定具体实施例中，该SEQ ID NO:166的第36-48及82-92位氨基酸形成本申请抗体的表位。

于本文中所述，抗体「特异性结合至IFN-γ」系指该抗体结合至IFN-γ，且具结合常数K_D小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M或更低。

本申请的第一方面。

在本申请的第一方面中，系提供一种经分离的抗体或其任一抗原结合部分。该经分离的抗体或其任一抗原结合部分包含：

(a)V_H CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:120、123、126、129、144、147、150，或153；

(b)V_H CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:121、124、127、130、145、148、151，或154；

(c)V_H CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:122、125、128、131、146、149、152，或155；

(d)V_L CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:132、135、138、141、156、158、160，或162；

(e)V_L CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:133、136、139、142、157、159、161，或163；以及

(f)V_L CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:134、137、140，或143。

在一特定具体实施例中，系提供抗体2A6。该抗体2A6的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、及SEQ ID NO:122；以及该抗体2A6的V_L CDR1、V_L CDR2与V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133，及SEQ IDNO:134。此外，该抗体2A6的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、及SEQ ID NO:146；其中该抗体2A6的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、及SEQ ID NO:134。

在一特定具体实施例中，系提供抗体2B6。该抗体2B6的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、及SEQ ID NO:125；其中该抗体2B6的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、及SEQ IDNO:137。此外。该抗体2B6的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、及SEQ ID NO:149；其中该抗体2B6的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、及SEQ ID NO:137。

在一特定具体实施例中，系提供抗体1E8。该抗体1E8的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、及SEQ ID NO:128；其中该抗体1E8的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、及SEQ IDNO:140。此外。该抗体1E8的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、及SEQ ID NO:152；其中该抗体1E8的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、及SEQ ID NO:140。

在一特定具体实施例中，系提供抗体2F2。该抗体2F2的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、及SEQ ID NO:131；其中该抗体2F2的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、及SEQ IDNO:143。此外。该抗体2F2的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、及SEQ ID NO:155；其中该抗体2F2的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、及SEQ ID NO:143。

在一特定具体实施例中，系提供抗体AB(「AB」包含2A6的V_H CDRs与2B6的V_L CDRs，亦称之为「VH2A6/VL2B6」)。该抗体AB的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQID NO:120、SEQ ID NO:121、及SEQ ID NO:122；其中该抗体AB的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、及SEQ ID NO:137。此外。该抗体AB的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、及SEQ IDNO:146；其中该抗体AB的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、及SEQ ID NO:137。

在一特定具体实施例中，系提供抗体BA(「BA」包含2B6的V_H CDRs与2A6的V_L CDRs，亦称之为「VH2B6/VL2A6」)。该抗体BA的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQID NO:123、SEQ ID NO:124、及SEQ ID NO:125；其中该抗体BA的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、及SEQ ID NO:134。此外。该抗体BA的V_H CDR1、V_H CDR2与V_H CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、及SEQ IDNO:149；其中该抗体AB的V_L CDR1、V_L CDR2、V_L CDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、及SEQ ID NO:134。

在一些具体实施例中，本申请提供包含如本文所述的V_H CDR和V_L CDR的经分离的抗体或其抗原结合片段，更包含具有与SEQ ID NO:109、110、111或112至少90％等同度的V_H区序列，以及具有与SEQ ID NO:113、114、115或116至少90％等同度的V_L区序列。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一些具体实施例中，本申请提供基于本文所述具体实施例的经分离的抗体，其中该抗体更包含一重链和一轻链。在一些具体实施例中，该重链包含具有与SEQ ID NO:109、110、111或112至少90％等同度的V_H区序列；以及具有与SEQ ID NO:113、114、115或116至少90％等同度的V_L区序列。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体2A6的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID NO:109至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID NO:113至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体2B6的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID NO:110至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID NO:114至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体1E8的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID NO:111至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID NO:115至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体2F2的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID NO:112至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID NO:116至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体AB的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID NO:109至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID NO:114至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在一特定具体实施例中，本申请提供的抗体包含抗体BA的CDRs，并更包含一V_H区序列，其具有与SEQ ID No:110至少90％等同度，以及一V_L区序列，其具有与SEQ ID No:113至少90％等同度。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在本申请任一抗体的另一具体实施例中，该抗体经修饰，以使其在可变区中不包含N-连接糖基化位点。例如，在一些具体实施例中，该抗体经点突变而修饰其V_H区的位置76的天冬酰氨酸(N76)。在一具体实施例中，N76经突变为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在此述经分离的抗体的一特定具体实施例中，该抗体经点突变而修饰其V_H区的位置76的天冬酰氨酸(N76)，其中位置N76经突变为丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)。

在可变区中不包含N-连接糖基化位点的抗体的一特定具体实施例中，本申请提供抗体2A6_A和2A6_Q，其中该重链的N76分别突变为丙氨酸和谷氨酰胺。因此，在一具体实施例中，本申请提供一种经分离的抗体「2A6_Q」，其中V_H包含具有与SEQ ID No:164至少90％等同度的一序列，其中位置76的氨基酸为A，或与SEQ ID NO:165至少90％等同度，其中位置76的氨基酸为Q；以及V_L包含具有与SEQ ID No:113至少90％等同度的一序列。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在另一具体实施例中，该经分离的抗体特异性地结合至人类IFN-γ，具结合值K_D小于1×10^-8M、小于1×10^-9M、小于1×10^-10M、小于1×10^-11M或更低。该与IFN-γ的结合值K_D系优先以生物膜干涉分析法测量。

在另一具体实施例中，该经分离的抗体抑制人类IFN-γ介导的活性，具IC₅₀值小于50ng/mL、小于25ng/mL，或小于10ng/mL。该IC₅₀值系优先以HLA-DR表达分析法测量。

在另一具体实施例中，本申请的抗体可具有物种间的交叉反应性(cross-reactivity)，因而便于用于各种目的或用于不同动物模型的研究。例如，在一些具体实施例中，该抗体可与来自不同哺乳动物物种(例如来自人类、恒河猴/食蟹猕猴)的IFN-γ产生交叉反应。

在另一具体实施例中，此述的经分离的抗体(如2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q、1E8、2F2、AB、BA，与其抗原结合片段)更包含特异性结合至人类IFN-γ表位的特性，该人类IFN-γ表位包含SEQ ID NO:166的一或多个氨基酸或其不连续的氨基酸序列。在一具体实施例中，该抗体可特异性结合至包含人类IFN-γ的第30-52与78-92位氨基酸的表位。在一具体实施例中，该抗体可特异性结合至包含人类IFN-γ的第36-48与82-92位氨基酸的表位。

本申请的第二方面。

在本申请的第二方面中，系提供另一种经分离的抗体。该抗体特异性地结合至本申请第一方面的抗体的相同表位上。

在一特定具体实施例中，该抗体特异性地结合至人类IFN-γ的第30-52及78-92位氨基酸内的一或多个氨基酸。其中该第30-52位氨基酸包含SEQ ID NO:167，以及该第78-92位氨基酸包含SEQ ID NO:168。在另一具体实施例中，该抗体特异性地结合至人类IFN-γ的第36-48及82-92位氨基酸内之一或多个氨基酸，其中该第36-48位氨基酸包含SEQ ID NO:171，以及该第82-92位氨基酸包含SEQ ID NO:172。

在另一具体实施例中，该表位包含人类IFN-γ的氨基酸K43、氨基酸Q48与氨基酸K86；其中该人类IFN-γ包含SEQ ID NO:166。在另一具体实施例中，该表位包含人类IFN-γ的氨基酸K37、氨基酸E38、氨基酸K43、氨基酸Q46、氨基酸Q48、氨基酸K86与氨基酸R89；其中该人类IFN-γ包含SEQ ID NO:166。

本申请的第三方面。

在本申请的第三方面中，系提供编码为一抗体的经分离的多核苷酸。具体而言，该多核苷酸编码为本申请第一方面与第二方面的抗体。在一特定具体实施例中，该多核苷酸编码抗体2A6、2A6_A、2A6_Q、2B6、1E8、2F2、AB，或BA。例如，在某些具体实施例中，该经分离的多核苷酸编码一抗体，该抗体包含V_H CDR1，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:120、123、126、129、144、147、150，或153；V_H CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:121、124、127、130、145、148、151，或154；V_H CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:122、125、128、131、146、149、152，或155；V_L CDR1包含选自于SEQ ID NO:132、135、138、141、156、158、160，或162的氨基酸序列；V_L CDR2，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:133、136、139、142、157、159、161，或163；以及V_L CDR3，其包含一氨基酸序列选自于SEQ ID NO:134、137、140，或143。

在一特定具体实施例中，编码为抗体2A6的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体2A6_A的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:175和SEQ ID NO:174至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体2A6_Q的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:174至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体2B6的多核苷酸包含具有与SEQ IDNO:177和SEQ ID NO:178至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体1E8的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体2F2的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:182至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体AB的多核苷酸包含具有与SEQID NO:173和SEQ ID NO:178至少90％等同度的序列。在一特定具体实施例中，编码为抗体BA的多核苷酸包含具有与SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:177至少90％等同度的序列。在另一具体实施例中，该等同度为95％、该等同度为98％，或该等同度为99％。

在另一具体实施例中，该多核苷酸包含一多核苷酸序列，其包含一或多个经挑选的密码子，以在哺乳动物细胞中最佳地表达所指抗体。此为另一用于增进产物的准确性与效率的特征。在一特定具体实施例中，该哺乳动物为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、

细胞和COS细胞。

本申请的第四方面。

在本申请的第四方面中，系提供一种载体与包含该载体的经分离的宿主细胞。该载体包含本申请第三方面定义的多核苷酸，并设计为可被任一种类的宿主细胞中携带或表达，而可制造本申请抗体。该宿主细胞系选自于由大肠杆菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞组成的群组。

本申请的第五方面。

在本申请的第五方面中，系提供包含本申请抗体的组合物。在一具体实施例中，该组合物系用于中和体内或体外的IFN-γ活性。在另一具体实施例中，该组合物为用于治疗IFN-γ介导的综合征的药物组合物。该「IFN-γ介导的综合征」包含但不限于，发炎、后天免疫缺陷综合征(AIDS)、类风湿性关节炎，包括青少年类风湿性关节炎、发炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)、多发性硬化症、艾迪生病(Addison’sdisease)、糖尿病(第I型)、副睪炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、动脉粥样硬化、红血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自体免疫性肝炎诱发的肝损伤、胆汁性肝硬化、酒精诱发的肝损伤，包括酒精性肝硬化、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、脊柱关节病、强直性脊柱炎、川崎病(kawasaki disease)、干眼病、噬血细胞淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、甲状腺炎、血管炎，或其组合。术语「IFN-γ介导的综合征」也包含与IFN-γ量增加或对IFN-γ敏感性增加相关的身体病况。

在一具体实施例中，该组合物包含本申请的抗体与一载体。该抗体可以有效量存在于该组合物中以用于达到该组合物的目的。该「有效量」使用于此系指，于一个体中达到所欲效果(如治疗本申请IFN-γ介导的综合征)所需的活性成分的量，不论是单独或与一或多种其他活性试剂组合。如本领域技术人员所知，有效量系根据所治疗的特定病症、病况的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重、治疗持续时间、并行治疗的性质(如果有的话)、特定的投药途径以及健康从业者的知识和专业中的类似因素)而变化。这些因素对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以用不超过常规的实验来解决。通常较佳使用单一成分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员应理解的是，出于医疗因素、心理因素或实际上任何其他原因，患者可能坚持较低剂量或可耐受剂量。

此种抗体组合物可藉由将具有所需纯度的本申请抗IFN-γ抗体与一或多种载体混合而制备。典型地，此类抗体组合物可制备为水性溶液(请见如美国专利号6,171,586与WO2006/044908)，或冻干制剂(请见美国专利号6,267,958)。

用于本申请抗体组合物的载体可为药学上可接受的载体，一般包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、溶剂、分散介质、膜衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及生理上兼容的类似物。载体最好是应适用于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠胃、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。药学上可接受的载体通常在所使用的剂量和浓度下，对于接受它们的受试者而言是无毒的。

各种此类药学上可接受的载体在本领域中为已知(请见如Remington'sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。用于本申请抗体组合物中的示范性药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；芐索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个氨基酸)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、组氨酸、精氨酸或离氨酸；单醣、双醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐类的相反离子如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；及/或非离子性界面活性剂如聚乙二醇(PEG)。

用于本申请抗体组合物的药学上可接受的载体尚可包括间隙性药物分散剂(interstitial drug dispersion)，例如可溶性中性-活性透明质酸酶醣蛋白(sHASEGP)(请见如美国专利公开第2005/0260186号与第2006/0104968号)，如人类可溶性PH-20透明质酸酶醣蛋白(如rHuPH20或

Baxter International,Inc.)。

该组合物可更包括药学上可接受的赋形剂，如崩解剂、黏合剂、润滑剂、防腐剂或其组合。

本申请的第六方面。

在本申请的第六方面中，系提供一种治疗IFN-γ介导的综合征的方法。该方法包含给药有需要个体有效剂量的本申请抗体。该有需要个体可为患有IFN-γ介导的综合征的病患(即人类)。该IFN-γ介导的综合征可缩限为上述者，但不限于上面列出的症状或疾病。因此，在某些具体实施例中，本申请抗体系经调剂为药物组合物以供施用，其中该组合物包含本申请抗体和药学上可接受的载体。任何本领域已知可用于抗体的任何药学上可接受的载体包括但不限于水、PBS、盐类溶液、明胶、油、醇或其组合。

本领域已知的可用于给药包含抗体的药物组合物的方法皆可用于给药本申请的药物组合物。因此，在本申请的第六方面的一些具体实施例中，该给药为任何可将抗体系统性地传送至受试者或期望的组织的方法。系统性给药通常是指任何于某一处将该抗体给药个体，从而使抗体或其制剂进入个体的循环系统，并进入代谢过程与受到其他类似生理机制影响的方法；有别于直接将抗体给药至期望的位置、组织或器官。

因此，在本申请治疗方法中可用的给药模式可包括但不限于注射、输注、滴注和吸入。注射给药可包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、玻璃体内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内注射，以及胸骨内注射和输注。

该抗体可与药学上可接受的载体一同给药。该药学上可接受的载体包括但不限于水、PBS、盐类溶液、明胶、油、醇或其组合。

本申请的第七方面。

在本申请的第七方面中，系提供一种检测环境中IFN-γ的方法。该方法可用于实验室中检测样本中IFN-γ的存在。在另一具体实施例中，该方法可用于定量样本的IFN-γ。该方法包含(A)施加本申请的抗体；(B)将该环境与抗IgG抗体一同静置；其中该抗IgG抗体系与可检测标记链接；以及(C)检测该可检测标记。在一特定具体实施例中，该方法为免疫印迹法(Western Blot)或酶联免疫吸附实验(ELISA)。在一特定具体实施例中，该抗IgG抗体为Fc特异性抗体。

在一特定具体实施例中，该环境可为包含待测样品的容器、膜或盘。该可检测标记系指为了检测目的而与抗IgG抗体结合的分子。该可检测标记包括，但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光标记或其组合。在特定具体实施例中，该可检测标记为过氧化物酶；以及该方法更包含在步骤(B)之后与步骤(C)之前，将该环境与对-硝基苯磷酸酯溶液(在另一具体实施例中使用TMB溶液)一同静置。在此特定具体实施例中，经由呈色反应，可于OD₄₀₅观察而检测并定量IFN-γ。

实施例

以下代表性实施例中将列出本申请的各种特征和具体实施例，这些示范性实施例旨在是说明性的而非限制性的。本领域的技术人员将容易理解，特定具体实施例仅仅是针对其后的申请专利范围更全面地描述本申请。在本申请案中描述的每个具体实施例和特征，应该被理解为可互换并且可与包含在其中的每个具体实施例组合。

实施例1.重组抗IFN-γ抗体的制备。

以荧光活化细胞分选技术分离出单一人类B细胞。

根据人体试验委员会(IRB)核定的流程，经签署知情同意书后，自患有分枝杆菌病的人类患者收集周边静脉血样本。依据产品说明，以Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度离心法纯化而自患者的周边静脉血中分离出单核细胞。使经纯化的单核细胞重新悬浮于含5％正常小鼠血清(Jackson ImmunoResearch)的FACS缓冲液中(1％FBS,2mM EDTA,0.1％NaN₃于PBS中)，浓度调整为1×10⁷细胞/mL，并置于冰上30分钟。同时，加入20μg/mL抗人类CD119抗体(BioLegend)至细胞中。之后，以FACS缓冲液清洗含1×10⁶细胞的分液后，将其置于冰上20分钟，并每1×10⁶细胞加入1μg重组IFN-γ蛋白(R&D systems)。在分选过程之前，于冰上使细胞经抗人类IgG PE(BD bioscience)、抗人类IgD APC(BD bioscience)、抗人类CD3 PE-花青素7(eBiosciense)、抗人类CD19 APC-eFluor 780(eBioscience)、抗人类IFN-γFITC(BD Bioscience)染色，并以7-氨基放线菌素D(Sigma；作为DNA标记物)染色，进行30分钟。以CD19⁺IgG⁺CD3^-IgD^-FITC⁺表面抗原筛选出个别的可与IFN-γ结合的B细胞，并分选至含有18μL/孔的RT-裂解缓冲液(其含有200ng随机六聚体引物(Thermo Scientific)、1μL的dNTP-mix(Thermo Scientific)、0.5％v/v Igepal CA-630(Sigma)，以及40U Ribolock(Fermentas))的96孔盘的各个孔中，由此获得单个B细胞的全RNA溶解物混合物。将96孔盘以铝密封带(康宁公司)密封，并立即存放于-80℃。

单一细胞的RT-PCR与免疫球蛋白(Ig)基因放大。

于上述96孔盘的每一孔中添加2μL(50U；置于经DEPC处理的水中)的Maxima Hminus反转录酶(Thermo Scientific)，以合成总体积为20μL/孔的cDNA。将每一可与IFN-γ结合的B细胞的全RNA进行反转录(RT)反应，其包括于42℃进行10分钟的黏合步骤、于25℃进行预引物延伸步骤10分钟，于50℃进行聚合步骤45分钟，以及于85℃进行酵素失活步骤5分钟。将如此形成的第一股cDNA储存于-20℃。

每一B细胞的IgH、Igλ、IgκV基因转录物系以巢式-PCR放大，其中第一回PCR起始于以2.5μL的上述获得的第一股cDNA作为模板，而第二回PCR则使用2.5μL的得自第一回PCR的未经纯化的PCR产物作为模板。所有PCR反应皆于总体积25μL的PCR反应混合物中进行，其含有0.5μM引物混合物(详细内容如表1所列出的引物混合物，请见引物列表)、200μM每一dNTP(Thermo Scientific)与0.5U Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo Scientific)。所有PCR反应皆使用经DEPC-处理的水进行。巢式PCR反应的第一回与第二回皆于98℃进行失活步骤10秒、于65℃进行黏合步骤15秒，以及于72℃进行延长步骤30秒，共进行35回合。

表1.

Ig V基因序列分析

根据商品说明，使用QIAquick PCR纯化试剂套组(Qiagen)纯化每个B细胞的V_H、V_κ和V_λ链PCR产物分液(由上述第二轮PCR获得)，并分别使用SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：69的引物进行定序(参见引物列表)。所获得的序列经

(国际ImMunoGeneTics信息系统(http://www.imgy.org))进行分析，以辨识出具有最高相等性的种系V(D)J基因区段。

将所得的IgV基因序列编码的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的氨基酸序列，在引物列表中显示并互相比对，其中框架区与其互补决定区(CDR)，系由IMGT或Kabat系统确定。

表达载体的克隆。

定序后，基于具有最高相等性的V或J片段(请见表2)挑选具基因特异性的引物(请见引物列表)，并以类似于前述巢式PCR的条件进行PCR反应；其中每一B细胞的V_H、V_κ与V_λ链的PCR产物(得自上述第二回PCR)系作为模板。如上述段落中所述方法纯化所得PCR产物，并克隆至人类IgG₁λ表达载体中，因而获得四个抗体的表达载体，辨识为「2A6」、「2B6」、「2F2」与「1E8」。

表2

除上述四种表达载体外，亦建构用于表达2A6 V_H重链和2B6 V_L轻链的载体(称为VH2A6/VL2B6，命名为「AB」)，以及2B6 V_H重链和2A6 V_L轻链组合的载体(称为VH2B6/VL2A6，命名为「BA」)。

AMG811的V_H和V_L的DNA系使用GeneArt Gene Synthesis(Thermo Fher)合成。表达AMG811的载体系以PCR技术并基于上述克隆方法建构。

重组步骤系由

Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Invitrogen)进行。于42℃，将5μL重组产物转化至胜任大肠杆菌中。藉由PCR筛选经转化的大肠杆菌，分别使用pIgG₁κ-screen+(SEQ ID NO：117)或pIgG₁λ-screen+(SEQ ID NO：118)作为正向引物，以及pIgG1-screen-(SEQ ID NO：119)作为反向引物(请参考引物列表)。将具有预期大小(约1800bps)的PCR产物进行定序，以确认与原始PCR产物的等同性。使用

管柱(Qiagen)，将质体DNA自3mL经转化的大肠杆菌培养物中分离出，该经转化的大肠杆菌系于含有100μg/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani培养液中，于37℃下生长16小时。

重组抗体的制造。

将FreeStyle^TM293-F细胞(Thermo Scientific,R79007)置于含有FreeStyle^TM293表达用培养液(Gibco,12338018)的250-mL锥形瓶中，于标准条件下以1×10⁶细胞的浓度培养。对呈指数生长的FreeStyleTM 293-F细胞(1.5～2×10⁶细胞/ml)进行瞬时转染(transient transfection)，其系使用具有平均分子量25kDa的线性聚乙烯亚氨(PEI)(Polysciences，Warrington，Pa)作为转染试剂及88μg的质体DNA进行。转染后，将细胞培养3天，收获培养液。将培养液于3000rpm离心10分钟，以除去FreeStyleTM 293-F细胞碎片，然后收集所得上清液，并通过0.45μm过滤膜过滤。

重组抗体的纯化。

以Protein A Sepharose Fast Flow微珠(GE Healthcare,17-1279-01)纯化上述获得的上清液以获得重组抗体。简言之，将80mL上清液加入80μL Protein A SepharoseFast Flow微珠，并均匀分装到两个50ml管中，于4℃下旋转培养24小时。然后，于3000rpm离心该管10分钟后，移除所得上清液，并以PBS平衡该些微珠。以0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱经平衡的该些微珠，将洗脱液收集至含有1M Tris(pH8.0)的管中，并用PBS缓冲液透析，以获得重组抗体。

为清楚起见，分别将每一单克隆抗体的V_H链和V_L链上的CDR统整于表3和表4中。CDR系经由Kabat和IMGT系统辨识出，使用序列注释和网络序列分析(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html与http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。于下表3与4中，前有「K:」的CDR代表使用Kabat系统，前有「I:」的CDR代表使用IMGT系统。

表3

表4

糖基化位点的点突变的克隆与分析。

当抗体2A6在哺乳动物细胞中表达时，可观察到两条重链带(图1，第1行)。这可能是由于翻译后修饰(posttranslational modification)所致。N-连接糖基化位点的共有序列为Asn-Xaa-Ser/Thr，以及罕见地共有序列为Asn-X-Cys。单克隆抗体在其Fc部分的N297位点具有一个保守性N-连接糖基化位点。值得注意的是，抗体2A6在其可变区(其重链的第76位氨基酸)也包含一个N-连接糖基化位点。

N-糖基化位点的存在系经PNGase F降解试验确认。简言之，将3.5μg抗体、1μl醣蛋白失活缓冲液(10×)和H₂O(如果需要)混合，以制得15μl的总反应体积。抗体系于100℃加热10分钟以将其失活。将失活的抗体置于冰上冷却，并离心10秒。混合3μl的GlycoBuffer 2(10×)、3μl的10％NP-40与9μl的H₂O以制备总反应混合物(30μl)。将反应混合物于37℃静置1小时，之后以SDS-PAGE分析。以电泳位移(mobility shift)测定抗体的去糖基化。

经PNGase F切割之后，抗体2A6的尺寸下降，表示N-连结的醣类已被移除。只有检测到一条清晰具较低分子量的重链带(图1，第2行)。这说明在PNGase F处理之前观察到的重链的较低带，是由于N-连接糖基化位点的部分糖基化而造成。

该N-连接糖基化位点被认为是一种部分糖基化位点(partial glycosylationsite)，且会使抗体2A6的大量生产缺乏分子均一性。为了促进抗体2A6的商业应用，遂设计并进行点突变，以除去上述N-连接糖基化位点。

为了准备位点特异性糖基化突变体质体，系使用来自NEB的Q5聚合酶进行点突变。用于突变每一构建体的寡核苷酸如下(同义序列):c2A6_Q 5’-CGTTTCTAGAGACAACGCCCAGAATTCGGTATATCTCCACA-3’(SEQ ID NO:169)与c2A6_A 5’-CGTTTCTAGAGACAACGCCGCCAATTCGGTATATCT CCAC-3’(SEQ ID NO:170)。以DNA定序确认每一构建体的突变序列。在上述点突变后，抗体2A6的重链可变区的第76位氨基酸由天冬酰氨突变为谷氨酰胺或丙氨酸，分别命名为抗体2A6_Q(在其重链上携带N76Q突变)和抗体2A6_A(其重链上携带N76A突变)。基此，抗体2A6_Q和抗体2A6_A的重链分别包含SEQ ID NO:165与SEQ ID NO:164。

在抗体2A6_A和抗体2A6_Q的试验中，SDS-PAGE分析显示2A6的重链具有两条带，而2A6_A或2A6_Q的重链显示出清楚的单一带，且分子量较低(图2)。这些数据表明在2A6_Q和2A6_A中的N-连接糖基化位点被破坏。进一步进行质谱分析研究2A6、2A_Q和2A6_A的糖基化状态。UPLC系统由带有四级UPLC泵(QSM)的Acquity H级生物系统组成，配备有50μl样品环和光电二极管数组检测器(Waters)的自动进样装置(SM)。使用Masslynex软件(V4.1，Waters)处理层析图。确认了2A6的ASN-76具有N连接醣基，且当Asn-76被Ala(2A6_A)或Gln(2A6_Q)取代，会导致该糖基化信号丧失。

实施例2.重组抗IFN-γ抗体的活性的测定。

实验流程：

A.生物膜干涉分析法分析(Bio-layer Interferometry；BLI)

利用生物膜干涉分析法(BLI，ForteBio Octet RED96)测定抗体结合动力学速率常数(k_a与k_d)。BLI试验系以AHC(Anti-hIgG Fc Capture)生物传感器(ForteBio)进行，以捕捉各抗IFN-γmAbs抗体(750ng/mL)，取得0.5nm位移(shift)，接着将生物传感器浸入不同浓度(亦即0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、及40nM)的重组人类IFN-γ蛋白质(R&D systems，285-IF-100；置于电泳缓冲液中，该缓冲液包含0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％Tween-20、250mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、及1.8mM KH₂PO₄)。利用5分钟结合与15分钟分离的相互作用时间的结合反应的曲线拟合分析(curve fitting analysis；1：1朗谬(Langmuir)模型)计算速率常数。

B.HLA-DR表达。

将2×10⁵个THP-1细胞(BCRC 60430)培养于100μL的Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)-1640培养基(Gibco，11875-093)，培养基中添加10％FBS与1％青霉素/链霉素，接着以不同浓度(亦即0.017、0.05、0.15、0.45、1.37、4.11、12.34、37.03、111.1、333.3、1000、3000、5000、及10000ng/mL)的2A6、2B6、1E8、及2F2抗IFN-γmAbs处理30min。以2ng/mL重组人类IFN-γ蛋白刺激经处理的THP-1细胞，并在培养箱内(37℃，5％CO₂)培养24小时。以未经刺激的THP-1细胞作为对照组。之后，以HLA-DR-PE抗体(BD PharmigenTM)将经刺激与未经刺激的THP-1细胞染色，接着在冰上避光放置30分钟。以2mL的PBS清洗经染色的细胞，并使其再悬浮于500μL的PBS中。以FACSVerse流式细胞仪取得经染色细胞的荧光强度，并以FACSuite软件分析。各抗体HLA-DR表达的抑制百分比以下列方程式取得：

A＝(B/C)×100

其中A＝HLA-DR表达的抑制百分比；B＝经刺激细胞的荧光强度中位数；C＝未经刺激细胞的荧光强度中位数。

C.IFN-γ抗体的ELISA试验。

以含有100μL的重组型人类IFN-γ蛋白(2μg/mL)或BSA(2μg/mL)的碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)涂布透明聚苯乙烯材质的96孔平底培养盘(Nunc)的每一孔，并放置在4℃整夜。以含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐液(PBS)清洗该培养盘三次，接着在25℃下以含有5％人类正常血清白蛋白(Aventis)的PBS阻断2小时。再次以含有0.05％Tween 20的PBS清洗该培养盘，接着将两种不同浓度(1μg/mL与0.1μg/mL)的1E8、2F2、2A6、2B6、AB、及BA mAbs分别加入培养盘各孔中，以结合重组型人类IFN-γ蛋白，之后在25℃反应2小时。以含有0.05％Tween 20的PBS彻底清洗该培养盘，接着加入Fc特异性碱性磷酸酶结合的AffiniPure山羊抗人类IgG(Cappel)，其中稀释比率为1:2500。将培养盘放置于37℃90分钟，接着以含有0.05％Tween 20的PBS清洗五次。在加入磷酸对硝基苯酯(pNPP)溶液(100μL/孔)后，将培养盘放置于37℃30分钟。以VICTOR X3 Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)测定OD₄₀₅ nm下的吸光度。

结果：

A.生物膜干涉分析法分析。

图3显示，使不同浓度的重组人类IFN-γ(0、0.625、1.25、2.5、5、10nM)通过固定在AHC生物传感器上的抗IFN-γmAbs而取得的结合曲线。抗体结合动力学速率常数(K_a与K_d)及平衡解离常数(K_D＝K_d/K_a)列于表5。

参考表5，可看到重组2A6、2B6、1E8、及2F2抗体具有低的K_d值，代表本申请重组抗体对人类IFN-γ具有高亲和力。

表5

mAb	K<sub>a</sub>(1/Ms)	K<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
				2A6	1.08×10<sup>6</sup>	3.97×10<sup>-5</sup>	3.68×10<sup>-11</sup>
2B6	1.48×10<sup>6</sup>	1.08×10<sup>-4</sup>	7.31×10<sup>-11</sup>
				1E8	4.64×10<sup>5</sup>	1.21×10<sup>-4</sup>	2.61×10<sup>-10</sup>
2F2	3.44×10<sup>5</sup>	1.09×10<sup>-4</sup>	3.17×10<sup>-10</sup>

在另一个涵盖使用AMG811(AMG811为抗IFN-γ抗体，描述于美国专利第7,335,743号，其制备如内容所述)、2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q、AB、及BA抗体的实验显示，本申请抗体表现出与AMG811相当或甚至更好的抗IFN-γ活性(图4与表6)。

表6

mAb	K<sub>a</sub>(1/Ms)	K<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
				AMG811	2.48×10<sup>6</sup>	8.59×10<sup>-5</sup>	3.47×10<sup>-11</sup>
2A6	2.61×10<sup>6</sup>	4.90×10<sup>-5</sup>	1.87×10<sup>-11</sup>
				2B6	3.13×10<sup>6</sup>	5.40×10<sup>-5</sup>	1.72×10<sup>-11</sup>
2A6_A	2.32×10<sup>6</sup>	5.17×10<sup>-5</sup>	2.23×10<sup>-11</sup>
				2A6_Q	2.41×10<sup>6</sup>	5.23×10<sup>-5</sup>	2.17×10<sup>-11</sup>
AB	2.19×10<sup>6</sup>	5.46×10<sup>-5</sup>	2.50×10<sup>-11</sup>
				BA	2.76×10<sup>6</sup>	1.31×10<sup>-4</sup>	4.75×10<sup>-11</sup>

B.HLA-DR表达。

图5显示IFN-γ诱发的HLA-DR表达具有剂量依赖性，且可有效地被本申请抗体抑制。由图5可看到，当2A6、2B6、1E8、及2F2抗IFN-γ抗体的浓度增加时，抑制百分比亦增加。

2F2、1E8、2A6、及2B6抗IFN-γ抗体的IC₅₀(ng/mL)分别为36.1、8.6、3.4、及3.5。2F2、1E8、2A6、及2B6抗IFN-γ抗体的IC₉₀(ng/mL)分别为507.7、48.6、3851.3、及1020.5。上述结果显示，本申请抗体可有效地抑制IFN-γ介导的活性，且可用于治疗IFN-γ介导的症状。

C.抗IFN-γ抗体的ELISA试验。

图6显示在405nm(OD405)下培养盘各孔的吸光度，以检测人类抗IFN-γ抗体。图6中可看到，浓度较高的抗体(1μg/mL)所呈现的吸光度比浓度较低者(0.1μg/mL)的强。此外，抗体未结合至BSA，代表本申请抗体可特异性结合至人类IFN-γ。

实施例3.重组抗IFN-γ抗体的活性的测定。

在本实施例中，以IFN-γ测试本申请抗体2A6、2A6_A、2A6_Q、2B6、AB、及BA的结合亲和力(ELISA)及中和活性(细胞分析测定与全血测定)。此外，亦使用AMG811作为正向对照组及比较例。

A.利用生物素化IFN-γ进行抗IFN-γ抗体的ELISA试验。

依据产品手册(EZ-Link NHS-LC-Biotin；Thermo#21336)将重组人类IFN-γ(R&Dsystems 285-IF-100)与食蟹猕猴(Cynomolgus)IFN-γ(R&D systems961-RM-025)加上生物素标记，并分别结合至链霉亲和素涂布的培养盘。在室温下培养1-2小时后，以300μL的清洗缓冲液清洗该培养盘三次。将序列稀释的抗IFN-γ抗体加入各孔中。在室温放置1-2小时后，用300μL洗涤缓冲液洗涤培养盘三次。在室温下将HRP抗人IgG施加到每个孔中反应1小时。洗涤后，将培养盘用TMB基质显色，并在OD_450-650下分析。

结果显示于图7与图8。应注意到，本申请所有测试的IFN-γ抗体皆呈现良好的人类IFN-γ结合亲和力。此外，其结合亲和力与AMG811的亲和力没有显著差异(图7)。尽管其对人类IFN-γ的亲和力较高，但本申请测试的抗IFN-γ抗体亦与恒河猕猴/食蟹猕猴的IFN-γ呈现交叉反应性。值得注意的是，AMG811未显示如本申请抗IFN-γ抗体的交叉反应性(图8)–此为本申请抗体的显著优势。

B.抗IFN-γ抗体的细胞分析试验。

利用表达pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro]的荧光素酶报导基因HeLa稳定细胞株(Promega#CS179301)测定抗IFN-γ抗体的中和活性。简言之，将HeLa细胞株以每孔8×10³个细胞的数量分盘于96孔不透明培养盘。以1ng/ml IFN-γ及不同浓度的抗IFN-γ抗体处理细胞18小时。利用ONE-Glo^TM荧光素酶试验系统(Promega#E6110)分析荧光素酶(Luciferase)活性。

结果显示，所有测试抗体皆能中和IFN-γ的活性(图9)。所有测试抗体皆被肯定具有产业或医药应用所需的中和活性。

C.抗IFN-γ抗体的全血试验。

收集经接种卡介苗(bacillus Calmette-Guérin；BCG)的健康志愿者的全血于10-ml肝素化试管中。在96孔微量滴定培养盘的圆底孔中，将20μl全血样本混合80μl的含或不含BCG+IL12(20ng/ml)的RPMI 1640培养液。将微量滴定培养盘培养于37℃、5％CO₂中48小时。在培养后，利用CXCL9 ELISA套组(R&D systems DCX900)测量CXCL9。利用CXCL10 ELISA套组(Biolegend 439905)测量CXCL10。在以稀释因子校正后，求得细胞激素浓度。实验中，以人类同型IgG1对照作为负向对照组。

如所预期，人类全血样本产生高量的IFN-γ、CXCL9和CXCL10，CXCL9与CXCL10的产生已知会受IFN-γ调节。抑制内源性IFN-γ会阻断IFN-γ依赖性的CXCL9与CXCL10的产生。

此结果确认本申请抗IFN-γ抗体透过中和内源性IFN-γ而有效抑制CXCL9与CXCL10的产生(图10与图11)。

D.利用抗IFN-γ抗体抑制T细胞抑制性受体的配体。

依据ATCC的说明培养THP-1细胞。将不同量的抗IFN-γ抗体置于含有40ng/mlIFN-γ的500μl RPMI-1640培养液中10分钟，并将混和物加至4×10⁵个细胞(500μl)中，以供中和试验使用。IFN-γ抗体的最终浓度为0、40、200、或1000ng/ml。在37℃培养箱中培养72小时后，以PE抗人类PD-L1抗体(Biolegend 329706)或FITC抗人类HLA-DR抗体(Biolegend 327006)染色细胞，并在避光的冰上放置30分钟。以2ml的FACS缓冲液清洗细胞二次，并使其再悬浮于300μl的FACS缓冲液中。利用FACSCalibur流式细胞仪取得数据。

结果确认本申请抗IFN-γ抗体能以剂量依赖性方式抑制IFN-γ诱发的HLA-DR(图12)与PD-L1(图13)表达。连同上述细胞分析试验及全血试验，发现本申请抗体不仅显示对IFN-γ的结合亲和力，还能抑制IFN-γ活性。

实施例4.本申请抗体的表位测定。

A.表位鉴定(epitope binning)实验。

进行表位鉴定实验以测定哪些抗IFN-γ抗体会竞争结合至IFN-γ，这表示其结合至相同或类似的IFN-γ表位。简言之，以链霉亲和素涂布的Octet生物传感器尖端(biosensor tips)(FortéBio)研究本申请四个抗IFN-γ抗体1E8、2F2、2A6、及2B6的表位。首先，将2μg/mL的生物素化的重组人类IFN-γ填入链霉亲和素传感器尖端，以取得0.5nm位移。在100秒稳定和120秒的基线步骤之后，将一级抗IFN-γ抗体个别地在600秒的结合步骤中以5μg/mL的量填入尖端。接着，以5μg/mL浓度的二级抗IFN-γ抗体与生物传感器尖端进行600秒结合反应的培养。若信号显示大量积累在尖端，则视为结合至不同表位。

本申请四个抗IFN-γ抗体2A6、2B6、1E8、及2F2的表位鉴定实验结果列于图14。所述四个抗IFN-γ抗体落在两个表位群组：第I组包含1E8与2F2；以及第II组包含2A6与2B6。换言之，1E8与2F2具有类似/相同的IFN-γ表位，且2A6与2B6具有类似/相同的IFN-γ表位。

B.利用HDX定位人类IFN-γ表位。

利用HDX MS方法，以经胃蛋白酶分解的片段测定IFN-γ于存在与不存在抗IFN-γ抗体的氢氘交换(hydrogen-deuterium exchange；HDX)。在交换缓冲液(含有99.9％D₂O的PBS，pH 7.4)中以1:10的比率稀释重组蛋白(15pmol)与蛋白-抗体复合物(15pmol:10pmol)，并在室温下启动HD交换。分别在七个时间点(10s、40s、80s、180s、600s、1800s、3600s)取一等分试验样本(1.5pmol的目标蛋白质)并与预冷的淬灭缓冲液(quenchingbuffer)(最终浓度为1.5M胍盐酸盐、150mM参(2-羧乙基)膦、及0.8％甲酸)混合。于Orbitrap质谱仪中分析所得混合物。MS与MS/MS自动增益控制(automatic gain control)分别设定为1,000ms(全扫瞄)与120ms(MS/MS)，或者2×10⁶个离子(全扫瞄)与3×10³个离子(MS/MS)，以最大化累积时间或离子。在分析中，交换时间内平均氘掺入量大于10％的变化视为具显著性。

基于HDX-MS表位定位数据，预测的人类IFN-γ上的抗体2A6_Q与抗体2B6的表位包含两个不连续的氨基酸片段：SEQ ID NO:166的第30-52位氨基酸与第78-92位氨基酸。更精准地说，此处提出人类IFN-γ上的抗体2A6_Q与抗体2B6的表位包含两个不连续的氨基酸片段：SEQ ID NO:166的第36-48位氨基酸与第82-92位氨基酸。抗IFN-γ抗体2A6_Q与2B6的HDX表位系列于表7。

C.丙氨酸扫描突变法(Alanine scanning mutagenesis)。

丙氨酸扫描突变法系用于鉴定特定区域中对抗体抗原的结合而言是重要的特定氨基酸。将SEQ ID NO：166中的36-48与82-92间的氨基酸各自突变为丙氨酸。在所有突变体中，有11个取代(氨基酸39、41、42、44、45、47、85、88、91、92)降低IFN-γ的生物活性(利用表达pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro(Promega#CS179301)]的HeLa稳定细胞株测定)，可能是丙氨酸取代造成构形改变故这些突变体未进行ELISA试验。

将2A6_Q或2B6与其余IFN-γ突变体蛋白质的ELISA结合结果与野生型IFN-γ的结果比较。将ELISA结合信号的最大值降至野生型的20％以下的状况视为结合作用的降低，具有前揭状况的突变即认定为显著的影响了IFN-γ与抗体间的结合。结果如表7所示。结合试验的数据与HDX MS作图的结合分区图非常一致。

此外，将HDX分析所得数据绘成时间对比H交换减少(time vs.reduced Hexchange)的图。将这些数据图与MS数据一起分析，显示抗体结合至包含至少SEQ ID NO：166的第36-48与82-92位氨基酸等不连续表位。更长区域的HDX分析显示，该表位可能进一步延伸，而包含IFN-γ序列SEQ ID NO：166的不连续的第30-52与78-92位氨基酸。

鉴于上述，结论为，抗体2A6、2B6、及2A6_Q辨识IFN-γ(SEQ ID NO:166)的K37、E38、K43、Q46、Q48、K86、及R89，且对IFN-γ(SEQ ID NO:166)的K43、Q48、及K86具有更强的亲和力。

表7

引物列表

序列表

<110> 安立玺荣生医股份有限公司

<120> 抗干扰素-γ的抗体及其应用

<130> 072203-8001CN01

<160> 182

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

accatggact gsacctggag 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

caccatggac acactttgct mcac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

accatggaca tactttgttc cacg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

atggagtttg ggctgagctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

atggaactgg ggctccgctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

atggagttgg ggctgtgctg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

catggagttt gggcttagct g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

catggagttt tggctgagct g 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

catgaaacac ctgtggttct tcct 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

aatgaagcac ctgtggttct tcct 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

acatgaaaca tctgtggttc ttcct 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

atggggtcaa ccgccatcct 20

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

aatgtctgtc tccttcctca tcttcct 27

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

saggtgcagc tggtgsagtc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

caggtccagc ttgtgcagtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

caggttcagc tggtgcagtc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

caggtccagc tggtacagtc tg 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

caggtcacct garggagtct ggt 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gaggtgcagc tgttggagtc t 21

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

cagstgcagc tgcaggagt 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

caggtgcagc tacarcagtg g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

caggtacagc tgcagcagtc a 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

caggtgcagc tggtgcaat 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ggtccccgct cagctcctgg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

agtcctcgct cagctcctgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

gctccctgct cagctcctgg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gctccttgct cagcttctgg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

cctgctactc tggctcccag 20

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

atttctctgt tgctctggat ctctg 25

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

cttcctcctc ctttggatct ctg 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

tctgctgctc tgggttccag 20

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gacatccagw tgacccagtc tcc 23

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gatattgtga tgacccagac tccactct 28

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gatattgtga tgactcagtc tccactct 28

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gaaattgtgt tgacrcagtc tccag 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

gaaatagtga tgacgcagtc tccag 25

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gacatcgtga tgacccagtc tc 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gaaacgacac tcacgcagtc tc 22

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gaaattgtgc tgactcagtc tcca 24

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ggtcctgggc ccagtctgtg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ggtcctgggc ycagtctgcc 20

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gctctgwggc ctcctatgag ct 22

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gctctgtgac ctcctatgwg ctg 23

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

gttctgtggt ttcttctgag ctgact 26

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

ggtctctctc ccwgcytgtg c 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gttccctctc gcaggctgtg 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gktccctctc ccagcctgtg 20

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gttcttgggc caattttatg ctg 23

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

ggtccaattc ycagrctgtg gtg 23

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

gagtggattc tcagactgtg gtga 24

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

tgtcagtggt ccaggcaggg 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

cagtctgtgy tgacgcagcc 20

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

cagtctgtgc tgactcagcc a 21

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

cagtctgccc tgactcagcc 20

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

tcctatgagc tgacwcagcc a 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

tcttctgagc tgactcagga cc 22

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

cagsctgtgc tgactcagcc 20

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

cagcctgtgc tgactcaatc at 22

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

cagcttgtgc tgactcaatc g 21

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

aattttatgc tgactcagcc ccac 24

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

cagrctgtgg tgacycagga gc 22

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

caggcagggc tgactcagcc 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

aggtgtgcac gccgctggtc 20

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

ggttcgggga agtagtcctt gac 23

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

gtttctcgta gtctgctttg ctca 24

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

gtgctgtcct tgctgtcctg ct 22

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

ttggagggtk tggtggtctc cac 23

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

ttgacggggc tgcyatctgc 20

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

cacrgctccc gggtagaagt c 21

<210> 70

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

gttgctacgc gtgtcctgag csaggtgcag ctggtgsagt c 41

<210> 71

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtccag cttgtgcagt c 41

<210> 72

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggttcag ctggtgcagt c 41

<210> 73

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtccag ctggtacagt ctg 43

<210> 74

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtcacc ttgarggagt ctg 43

<210> 75

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

gttgctacgc gtgtcctgag cgaggtgcag ctgttggagt ct 42

<210> 76

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

gttgctacgc gtgtcctgag ccagstgcag ctgcaggagt 40

<210> 77

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtgcag ctacarcagt gg 42

<210> 78

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtacag ctgcagcagt ca 42

<210> 79

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 79

gttgctacgc gtgtcctgag ccaggtgcag ctggtgcaat 40

<210> 80

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 80

gatgggccct tggtgctagc tgaggagacg gtgaccagg 39

<210> 81

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 81

gatgggccct tggtgctagc tgaggagaca gtgaccaggg t 41

<210> 82

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 82

gatgggccct tggtgctagc tgaagagacg gtgaccattg tc 42

<210> 83

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 83

gatgggccct tggtgctagc tgaggagacg gtgaccgtg 39

<210> 84

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 84

ggctcccagg tgcacgatgt gacatccagw tgacccagtc tcc 43

<210> 85

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 85

ggctcccagg tgcacgatgt gatattgtga tgacccagac tccactct 48

<210> 86

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 86

ggctcccagg tgcacgatgt gaaattgtgt tgacrcagtc tccag 45

<210> 87

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 87

ggctcccagg tgcacgatgt gacatcgtga tgacccagtc tc 42

<210> 88

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 88

ggctcccagg tgcacgatgt gaaacgacac tcacgcagtc tc 42

<210> 89

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 89

ggctcccagg tgcacgatgt gaaattgtgc tgactcagtc tcca 44

<210> 90

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 90

tgcagccacc gtacgtttga tttccacctt ggtccct 37

<210> 91

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 91

tgcagccacc gtacgtttga tctccagctt ggtccct 37

<210> 92

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 92

tgcagccacc gtacgtttga tatccacttt ggtccca 37

<210> 93

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 93

tgcagccacc gtacgtttga tctccacctt ggtccct 37

<210> 94

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 94

tgcagccacc gtacgtttaa tctccagtcg tgtccctt 38

<210> 95

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 95

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agtctgtgyt gacgcagcc 49

<210> 96

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 96

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agtctgtgct gactcagcca 50

<210> 97

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 97

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agtctgccct gactcagcc 49

<210> 98

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 98

tccttgctta tgggtccgga gtggattctt cctatgagct gacwcagcca 50

<210> 99

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 99

tccttgctta tgggtccgga gtggattctt cttctgagct gactcaggac 50

<210> 100

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 100

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agsctgtgct gactcagcc 49

<210> 101

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 101

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agyctgtgct gactcaatc 49

<210> 102

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 102

tccttgctta tgggtccgga gtggattcta attttatgct gactcagccc 50

<210> 103

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 103

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc agrctgtggt gacycaggag 50

<210> 104

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 104

tccttgctta tgggtccgga gtggattctc aggcagggct gactcagcc 49

<210> 105

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 105

ggccttgggc tgacctagga cggtgacctt ggtcc 35

<210> 106

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 106

ggccttgggc tgacctagga cggtcagctt ggtcc 35

<210> 107

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 107

ggccttgggc tgacctagga cggtcacctt ggtgc 35

<210> 108

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 108

ggccttgggc tgacctagga cggtcagctg ggtgc 35

<210> 109

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Thr Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Arg Thr Lys Tyr Met Phe Tyr Ser Asp Ser Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Ser Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Asp His Ser Asp Ser Asn Ser Ala Ala Asp Leu Leu

100 105 110

His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 110

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人

<400> 110

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Met Thr Ser Arg Thr Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Leu Ile Ser Arg Asp Asn Asp Arg Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Gly Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Ser Asp Ser Gly Val Asp Phe Gln

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 111

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 111

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Gly Arg Asn Ile Ile Ser Pro Gly Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 112

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 112

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Ser Ile Met Arg Gly Thr Tyr Tyr Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 113

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 113

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Gly Tyr Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ile Val Ile Ser Cys Val Arg Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser His

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Ala Met Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Val Asp Ala Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly

85 90 95

Asn Asn Gln Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 114

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 114

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ile Thr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Ile Ala Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gly Val Pro Lys Ile Val

35 40 45

Val Phe Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Thr Ser Thr Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asp

85 90 95

Ala Asn His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 115

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 115

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Asn Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Lys

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Val Met

35 40 45

Arg Val Gly Thr Gly Gly Ile Val Gly Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Val Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Phe Leu Thr Ile

65 70 75 80

Lys Asn Ile Gln Glu Glu Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp

85 90 95

His Gly Ser Ala Asn Asn Phe Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

100 105 110

Leu Thr Val Leu

115

<210> 116

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 116

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Pro Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Pro Ala Ser Leu Ala Ile Gly Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asn Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> 引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 118

gcttatgggt ccggagtgga ttct 24

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 119

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 120

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<212> PRT

<213> 智人

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Ile Ser Gly Arg Thr Lys Tyr Met

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 122

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His

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<211> 8

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<213> 智人

<400> 123

Gly Phe Pro Phe Ser Arg Tyr Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

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Met Thr Ser Arg Thr Asn His Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 125

Ala Arg Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Ser Asp Ser Gly Val Asp Phe Gln

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Tyr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 126

Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ser

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<212> PRT

<213> 智人

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Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 128

Ala Lys Ser Gly Arg Asn Ile Ile Ser Pro Gly Phe Asp Ser

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<212> PRT

<213> 智人

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Gly Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Tyr

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<212> PRT

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<213> 智人

<400> 131

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 134

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Arg Gly Tyr Ile Ala Ser Tyr Tyr

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1

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<212> PRT

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<213> 智人

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Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Lys

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 139

Val Gly Thr Gly Gly Ile Val Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 140

Gly Ala Asp His Gly Ser Ala Asn Asn Phe Ile Trp Val

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 141

Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Pro

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 142

Phe Asn Asn

1

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<212> PRT

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<400> 143

Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Leu Val

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 144

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Phe Ile His

1 5 10

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 145

Thr Ile Ser Gly Arg Thr Lys Tyr Met Phe Tyr Ser Asp Ser Leu Arg

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Gly

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 146

Gly Tyr Asp His Ser Asp Ser Asn Ser Ala Ala Asp Leu Leu His

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 147

Gly Phe Pro Phe Ser Arg Tyr Ser Met His

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 148

Ser Met Thr Ser Arg Thr Asn His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu Lys

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Gly

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<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 149

Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Ser Asp Ser Gly Val Asp Phe Gln Tyr

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 150

Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ser Met Asn

1 5 10

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 151

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly

<210> 152

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 152

Ser Gly Arg Asn Ile Ser Pro Gly Phe Asp Ser

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 153

Gly Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr

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<213> 智人

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Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys

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<212> PRT

<213> 智人

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Asp Pro Ser Ile Met Arg Gly Thr Tyr Tyr Met Asp Val

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<212> PRT

<213> 智人

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<213> 智人

<400> 157

Glu Asp Ser His Arg Pro Ser

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 158

Thr Arg Gly Arg Gly Tyr Ile Ala Ser Tyr Tyr Val Gln

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<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 159

Glu Asp Thr Gln Arg Pro Ser

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 160

Thr Leu Asn Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Asp

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<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 161

Val Gly Thr Gly Gly Ile Val

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 162

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Pro Val Ser

1 5 10

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 163

Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 164

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体

<400> 164

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Asp

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Ser Leu Thr Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Thr Ile Ser Gly Arg Thr Lys Tyr Met Phe Tyr Ser Asp Ser Leu

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Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Ala Asn Ser Val Tyr

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100 105 110

His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 165

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体

<400> 165

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Thr Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Arg Thr Lys Tyr Met Phe Tyr Ser Asp Ser Leu

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Ser Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Asp His Ser Asp Ser Asn Ser Ala Ala Asp Leu Leu

100 105 110

His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 166

<211> 143

<212> PRT

<213> 智人

<400> 166

Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile

20 25 30

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln

35 40 45

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln

50 55 60

Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys

65 70 75 80

Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr

85 90 95

Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu

100 105 110

Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys

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Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln

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<210> 167

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 167

Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met

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Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe

20

<210> 168

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 168

Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe

1 5 10 15

<210> 169

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 169

cgtttctaga gacaacgccc agaattcggt atatctccac a 41

<210> 170

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 170

cgtttctaga gacaacgccg ccaattcggt atatctccac 40

<210> 171

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 171

Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln

1 5 10

<210> 172

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 172

Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe

1 5 10

<210> 173

<211> 373

<212> DNA

<213> 智人

<400> 173

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggactc tctgacagtc 60

tcctgtgtcg cctctggatt cactttcagc aactatttca tccactgggt ccgacaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtcgcaacg atcagtggcc gtacgaaata tatgttctac 180

tcagactcat tgaggggccg attcaccgtt tctagagaca acgccaacaa ttcggtatat 240

ctccacatga gcagcctgag aggcgaagac acggctctct attactgtgt gagaggctat 300

gatcatagtg attccaactc ggcagcagac ctcctgcatt ggggccgggg caccctggtc 360

accgtctcct cag 373

<210> 174

<211> 334

<212> DNA

<213> 智人

<400> 174

aattttatgc tgactcagcc cctctctgtg tcgggctatc cgggaaagac gatagtcatc 60

tcctgtgtcc ggagcagtgg cagcgtggcc agccactatg tgcagtggtt ccaacagcgc 120

ccgggcagtg cccccgccat ggtgatttat gaagatagcc acagaccttc tgggattcct 180

gatcgattct ctggctccgt cgacgcctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgaagactg aggacgaggc tgactacttc tgtcaatctt attatggcaa caatcaggtt 300

ctcttcggcg gcgggaccaa gctgaccgtc ctag 334

<210> 175

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体

<400> 175

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggactc tctgacagtc 60

tcctgtgtcg cctctggatt cactttcagc aactatttca tccactgggt ccgacaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtcgcaacg atcagtggcc gtacgaaata tatgttctac 180

tcagactcat tgaggggccg attcaccgtt tctagagaca acgcccagaa ttcggtatat 240

ctccacatga gcagcctgag aggcgaagac acggctctct attactgtgt gagaggctat 300

gatcatagtg attccaactc ggcagcagac ctcctgcatt ggggccgggg caccctggtc 360

accgtctcct cag 373

<210> 176

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体

<400> 176

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggactc tctgacagtc 60

tcctgtgtcg cctctggatt cactttcagc aactatttca tccactgggt ccgacaggct 120

ccagggaagg gactggagtg ggtcgcaacg atcagtggcc gtacgaaata tatgttctac 180

tcagactcat tgaggggccg attcaccgtt tctagagaca acgccgccaa ttcggtatat 240

ctccacatga gcagcctgag aggcgaagac acggctctct attactgtgt gagaggctat 300

gatcatagtg attccaactc ggcagcagac ctcctgcatt ggggccgggg caccctggtc 360

accgtctcct cag 373

<210> 177

<211> 373

<212> DNA

<213> 智人

<400> 177

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggctt ccccttcagt cgctattcaa tgcactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcg atgacgtctc ggactaacca caaatactac 180

gcagactcac tgaagggccg attcctcatc tctcgagaca acgacaggga ctcactgtac 240

ctggaaatga acagcctggg agtcgaggac acggcgatat atttctgtgc aagaggctat 300

gatactagtg gttccgactc gggagtagac ttccaatact ggggccaggg caccctggtc 360

accgtctcct cag 373

<210> 178

<211> 334

<212> DNA

<213> 智人

<400> 178

aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac gataaccatc 60

tcctgcaccc gcggcagagg atacattgcc agctactatg tccagtggta ccaacagcgc 120

ccgggcggtg tccccaaaat tgtggtcttt gaggatactc agagaccctc tggggtccct 180

gatcgaatct ctggctccat cgacacctcc accaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgcagactg aagacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatgatgc caatcatgtg 300

atcttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctag 334

<210> 179

<211> 364

<212> DNA

<213> 智人

<400> 179

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc cgggggggcc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc atctacagta tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt attagtggga gtggcgataa tacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc accagagaca gttccaagaa cacactgtat 240

ctgcaaatga acaccctcag agccgaggac acggccgtat atttttgtgc gaaatctgga 300

agaaatatta tatcccctgg atttgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tcag 364

<210> 180

<211> 349

<212> DNA

<213> 智人

<400> 180

cagcctgtgc tgactcagcc accttctgca tcagcctccc tgggagcctc ggtcacactc 60

acgtgcaccc tgaacagcga ctatggtgat tataaagtgg actggtacca gcagagacca 120

gggaagggcc cccgatttgt gatgcgagtg ggcactggtg ggattgtggg atccaagggg 180

gacggcatcc ctgatcgctt ctcagtcttg gggtcaggcc tgaatcggtt cctgaccatt 240

aagaacatcc aggaagagga tgagagtgac tactactgtg gggcagacca tggcagtgcg 300

aacaacttca tttgggtgtt cggcggaggg accaagctga ccgtcctag 349

<210> 181

<211> 366

<212> DNA

<213> 智人

<400> 181

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagagtc cctgagactc 60

gcctgtgtag cctctggctt caacttcagt gactactaca tgacgtggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatat attagtaata gtggtagtca cacatactac 180

gcagacgctg tgaagggccg cttcaccgtc tccagggaca atgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga ccagcctgag aggcgaggac acggccatat atttctgtgc gagagatcct 300

tctatcatgc ggggaaccta ctacatggac gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 182

<211> 331

<212> DNA

<213> 智人

<400> 182

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggaaccc ccggccagag ggtcaccatc 60

tcttgttccg gaagcagctc caacatcgga actaaccctg tcagttggta ccagcagttc 120

cccggaatgg cccccaagct cctcatctat tttaacaatc agcggccctc aggggtccct 180

gaacgattct ctggctccaa gtctggcacc ccagcctccc tggccatcgg tggactccag 240

tctgaggatg aggctaacta ttattgtgca tcctgggatg acaccctgaa tggtctggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta g 331

Claims

1.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用IMGT系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_HCDR3分别为SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、及SEQ ID NO: 122；其中该抗体的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、及SEQ ID NO: 134。

2.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用Kabat系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分别为SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、及SEQ ID NO: 146；其中该抗体的V_LCDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、及SEQ ID NO: 134。

3.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用IMGT系统，该抗体的VH CDR1、V_H CDR2、及V_HCDR3分别为SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、及SEQ ID NO: 125；其中该抗体的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、及SEQ ID NO: 137。

4.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用Kabat系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分别为SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、及SEQ ID NO: 149；其中该抗体的V_LCDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、及SEQ ID NO: 137。

5.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用IMGT系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_HCDR3分别为SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、及SEQ ID NO: 122；其中该抗体的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、及SEQ ID NO: 137。

6.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用Kabat系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分别为SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、及SEQ ID NO: 146；其中该抗体的V_LCDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、及SEQ ID NO: 137。

7.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用IMGT系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_HCDR3分别为SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、及SEQ ID NO: 125；其中该抗体的V_L CDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、及SEQ ID NO: 134。

8.一种经分离的抗IFN-γ的抗体，其中使用Kabat系统，该抗体的V_H CDR1、V_H CDR2、及V_H CDR3分别为SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、及SEQ ID NO: 149；其中该抗体的V_LCDR1、V_L CDR2、及V_L CDR3分别为SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、及SEQ ID NO: 134。

9.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，其中V_H包含具有与SEQID NO: 109或110至少90%等同度的序列；以及V_L包含具有与SEQ ID NO: 113或114至少90%等同度的序列。

10.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，其中V_H不包含N-连结糖基化位点。

11.如权利要求10所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，其中V_H包含具有与SEQ ID NO: 164至少90%等同度的序列，其中位置76的氨基酸为A；或与SEQ ID NO: 165至少90%等同度的序列，其中位置76的氨基酸为Q；以及V_L包含具有一与SEQ ID NO: 113至少90%等同度的序列。

12.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，其中该抗体为小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。

13.如权利要求第1至8中任一项所述的分离的抗IFN-γ的抗体，其中该抗体与人类和恒河猴/食蟹猕猴的IFN-γ有交叉反应。

14.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，该经分离的抗IFN-γ的抗体特异性结合至人类IFN-γ，并具结合值K_D小于1×10^-8 M。

15.如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体，其中该抗体抑制人类IFN-γ介导的活性，具IC₅₀值小于50 ng/mL。

16.一种用于治疗IFN-γ介导的综合征的药物组合物，包含：

有效量的如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体；以及

药学上可接受的载体；

其中，所述IFN-γ介导的综合征包含发炎、后天免疫缺陷综合征(AIDS)、多发性硬化症、艾迪生病(Addison’s disease)、第I型糖尿病、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、动脉粥样硬化、红血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自体免疫性肝炎诱发的肝损伤、胆汁性肝硬化、酒精诱发的肝损伤、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、脊柱关节病、川崎病(kawasaki disease)、干眼病、噬血细胞淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征，或其组合。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述发炎包含类风湿性关节炎、发炎性肠病、副睪炎、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、甲状腺炎、血管炎，或其组合。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述类风湿性关节炎包括青少年类风湿性关节炎，所述发炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)。

19.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述酒精诱发的肝损伤包括酒精性肝硬化。

20.一种有效量的如权利要求1至8中任一项所述的经分离的抗IFN-γ的抗体在制备治疗IFN-γ介导的综合征的药物组合物的应用，其中该IFN-γ介导的综合征包含发炎、后天免疫缺陷综合征(AIDS)、多发性硬化症、艾迪生病(Addison’s disease)、第I型糖尿病、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、动脉粥样硬化、红血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自体免疫性肝炎诱发的肝损伤、胆汁性肝硬化、酒精诱发的肝损伤、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)、脊柱关节病、川崎病(kawasaki disease)、干眼病、噬血细胞淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征，或其组合。

21.如权利要求20所述的应用，其中所述发炎包含类风湿性关节炎、发炎性肠病、副睪炎、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、甲状腺炎、血管炎，或其组合。

22.如权利要求21所述的应用，其中所述类风湿性关节炎包括青少年类风湿性关节炎，所述发炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)。

23.如权利要求20所述的应用，其中所述酒精诱发的肝损伤包括酒精性肝硬化。