CN116284381B - 抗IFN-γ的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域,具体涉及抗IFN‑γ的抗体及其应用。本发明提供的抗体能够以高亲和力结合IFN‑γ,且具有较高的特异性。本发明还提供用于检测IFN‑γ含量的抗体对,该抗体对通过双抗夹心ELISA方法可特异性检测样品中IFN‑γ的含量,是理想的IFN‑γ含量的检测试剂,可用于T细胞,NK细胞以及CAR‑T细胞等功能性评价,为CGT疗法的评估提供了有效的工具。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体涉及抗IFN-γ的抗体及其应用。
背景技术
不同于传统化学药物或抗体药在蛋白质水平进行调控的局限性,细胞与基因治疗(Cell and Gene Therapy, CGT)聚焦于“从根源解决问题”,通过直接靶向DNA、改变DNA来改变最终蛋白质的性状,实现从根源上治疗疾病,具有“一次治疗、长期获益”的特点,因此被誉为引领生物医药的“第三次产业变革”。随着CGT技术的发展,目前已有多款CAR-T产品上市并展现出疗效优势,CGT疗法迎来了蓬勃的发展机遇。
γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ)主要由CD8+T细胞、Th1 CD4+T细胞和自然杀伤细胞(NK)在多种刺激下分泌,通过包括抑制Th2细胞分化、刺激Th1细胞增殖、促进巨噬细胞活化、诱导MHC I/MHC II表达等实现抗病毒、免疫调节、调控细胞增殖分化等多样广泛的生物学作用。在CAR-T疗法中,通过CAR-T细胞产生的IFN-γ和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等可以增强抗原呈递、细胞粘附和Th1细胞的募集,从而增强宿主的抗肿瘤免疫。因此,IFN-γ的释放量被作为CAR-T细胞疗法疗效和功能评价的重要指标。
目前IFN-γ的定量检测试剂普遍存在方法不够稳定、板间变异系数大以及不同基质间存在干扰等问题,开发高特异性和高亲和力的抗IFN-γ抗体对于实现高效准确的IFN-γ检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗IFN-γ的抗体及其应用。
本发明通过以体外构建的人IFN-γ蛋白作为免疫原进行小鼠免疫,经细胞融合与筛选、杂交瘤细胞亚克隆,获得表达抗体的杂交瘤细胞株。通过实验验证发现,该抗体能够特异性识别人IFN-γ蛋白,而且不与其他细胞因子产生交叉反应。进一步地,本发明通过杂交瘤测序获得了该抗体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
具体地,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段为以下(1)~(10)中的任意一种:
(1)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5、6所示;
(2)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8、9所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11、12所示;
(3)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、14、15所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16、17、18所示;
(4)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20、21所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示;
(5)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、26、27所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、29、30所示;
(6)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、32、33所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、35、36所示;
(7)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、38、39所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:40、41、42所示;
(8)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:43、44、45所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、47、48所示;
(9)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49、50、51所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52、53、54所示;
(10)重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、56、57所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:58、59、60所示。
优选地,所述抗体或其抗原结合片段为以下(1)~(10)中的任意一种:
(1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示;
(2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示;
(3)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示;
(4)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示;
(5)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示;
(6)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示;
(7)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示;
(8)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示;
(9)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示;
(10)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示。
优选地,以上所述的抗体或其抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、单克隆抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为2D8E11的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5、6所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示。
克隆号为2D8E11的抗体的序列具体如下:SEQ ID NO.1:重链可变区CDR1:SNYMS;
SEQ ID NO.2:重链可变区CDR2:VIYSGGRTDYADSVKG;
SEQ ID NO.3:重链可变区CDR3:VVSDAFDM;
SEQ ID NO.4:轻链可变区CDR1:RASQSISSWLA;
SEQ ID NO.5:轻链可变区CDR2:KASILES;
SEQ ID NO.6:轻链可变区CDR3:QQYNGYSYT;
SEQ ID NO.61:重链可变区:
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGRTDYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARVVSDAFDMWGQGTMVTVSS;
SEQ ID NO.62:轻链可变区:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPVDFATYYCQQYNGYSYTFGQGTKLEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为3E5B9的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8、9所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11、12所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。
克隆号为3E5B9的抗体的序列具体如下:SEQ ID NO.7:重链可变区CDR1:SNYMT;
SEQ ID NO.8:重链可变区CDR2:VIYSGSSTDYADSVKG;
SEQ ID NO.9:重链可变区CDR3:VVTDAFDI;
SEQ ID NO.10:轻链可变区CDR1:RASQSIVSWLA;
SEQ ID NO.11:轻链可变区CDR2:KTSNLEA;
SEQ ID NO.12:轻链可变区CDR3:QQYNTYSRAYT;
SEQ ID NO.63:重链可变区:
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVRSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGSSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCARVVTDAFDIWGQGTMVTVSS;SEQ ID NO.64:轻链可变区:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIVSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKTSNLEAGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYSRAYTFGQGTNLEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为7C3B2的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、14、15所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16、17、18所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示。
克隆号为7C3B2的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.13:重链可变区CDR1:SYSMN;
SEQ ID NO.14:重链可变区CDR2:SISSSSNYIYYADSVKG;
SEQ ID NO.15:重链可变区CDR3:WAQNYDILTGYYPDAFDI;
SEQ ID NO.16:轻链可变区CDR1:RASQSVSSNLA;
SEQ ID NO.17:轻链可变区CDR2:GASTRAT;
SEQ ID NO.18:轻链可变区CDR3:QQYYNWPPWT;
SEQ ID NO.65:重链可变区:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSNYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARWAQNYDILTGYYPDAFDIWGQRTMVSVSS;
SEQ ID NO.66:轻链可变区:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIHGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPPWTFGQGTKVEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为1C1C3的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20、21所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示。
克隆号为1C1C3的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.19:重链可变区CDR1:TYNMN;
SEQ ID NO.20:重链可变区CDR2:SISLSSSYIYYADSVKG;
SEQ ID NO.21:重链可变区CDR3:AIRPDYYDARGYYPDAFDI;
SEQ ID NO.22:轻链可变区CDR1:RASQSVSRNLA;
SEQ ID NO.23:轻链可变区CDR2:GASTRAT;
SEQ ID NO.24:轻链可变区CDR3:QQYYNWPPWT;
SEQ ID NO.67:重链可变区:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYNMNWVRQAPGKGLEWVSSISLSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARAIRPDYYDARGYYPDAFDIWGQGTMVTVSS;
SEQ ID NO.68:轻链可变区:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPPWTFGQGTKVEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为13E6H6的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、26、27所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、29、30所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。
克隆号为13E6H6的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.25:重链可变区CDR1:SYAMN;
SEQ ID NO.26:重链可变区CDR2:WINTNTGNPTYAQGFTG;
SEQ ID NO.27:重链可变区CDR3:EYGSGNYIPY;
SEQ ID NO.28:轻链可变区CDR1:SGDALPKQYAY;
SEQ ID NO.29:轻链可变区CDR2:KDSERPS;
SEQ ID NO.30:轻链可变区CDR3:QSADRSGTWV;
SEQ ID NO.69:重链可变区:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRVVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREYGSGNYIPYWGQGTLVTVSS;
SEQ ID NO.70:轻链可变区:
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTIVTLTISGVQAEDEADYYCQSADRSGTWVFGGGTKLTVL。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为18B4H9的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、32、33所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、35、36所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示。
克隆号为18B4H9的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.31:重链可变区CDR1:DYYMN;
SEQ ID NO.32:重链可变区CDR2:YISCSSSYTNYADSVKG;
SEQ ID NO.33:重链可变区CDR3:DVWFSGYDTPPRYYYYYGMDV;
SEQ ID NO.34:轻链可变区CDR1:QGDSLRSYYAS;
SEQ ID NO.35:轻链可变区CDR2:DKNNRPS;
SEQ ID NO.36:轻链可变区CDR3:NCRASSGPRV;
SEQ ID NO.71:重链可变区:
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVASGFTFSDYYMNWIRQAPGKGLEWVSYISCSSSYTNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVWFSGYDTPPRYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS;
SEQ ID NO.72:轻链可变区:
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYDKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNCRASSGPRVFGGGTKLTVL。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为1C1A7的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、38、39所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:40、41、42所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示。
克隆号为1C1A7的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.37:重链可变区CDR1:RNYMS;
SEQ ID NO.38:重链可变区CDR2:VIYSGGTSYYADSVKG;
SEQ ID NO.39:重链可变区CDR3:DLQEFGGMDV;
SEQ ID NO.40:轻链可变区CDR1:RASQSVSSSFLA;
SEQ ID NO.41:轻链可变区CDR2:GASSRAT;
SEQ ID NO.42:轻链可变区CDR3:QQYGSSTIT;
SEQ ID NO.73:重链可变区:
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCVASGFTVSRNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGTSYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARDLQEFGGMDVWGQGTTVTVSS;
SEQ ID NO.74:轻链可变区:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQQYGSSTITFGQGTRLEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为7C3B3的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:43、44、45所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、47、48所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示。
克隆号为7C3B3的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.43:重链可变区CDR1:RYEMN;
SEQ ID NO.44:重链可变区CDR2:YISTGSPIHYADFVKG;
SEQ ID NO.45:重链可变区CDR3:VLTAAGPYFYGMDV;
SEQ ID NO.46:轻链可变区CDR1:RASQSISRYLH;
SEQ ID NO.47:轻链可变区CDR2:AASNLQS;
SEQ ID NO.48:轻链可变区CDR3:QQTYSSPQT;
SEQ ID NO.75:重链可变区:
EVQLVESGGGSVQPEGSLRLSCVASGFTLSRYEMNWVRQAPGKGLEWISYISTGSPIHYADFVKGRFTVSRDNPKNSLYLQLTSLRAEDTAVYYCARVLTAAGPYFYGMDVWGQGTTVTVSS;
SEQ ID NO.76:轻链可变区:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVSSRFSGSGSGADFTLTINNLQPEDLATYFCQQTYSSPQTFGQGTTLEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为8C5F8的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49、50、51所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52、53、54所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示。
克隆号为8C5F8的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.49:重链可变区CDR1:SGSYYWN;
SEQ ID NO.50:重链可变区CDR2:RIYTSGSTSYNPSLKS;
SEQ ID NO.51:重链可变区CDR3:ETLDYVTYNSWFDP;
SEQ ID NO.52:轻链可变区CDR1:KSSQRVLYSSNNKNYLA;
SEQ ID NO.53:轻链可变区CDR2:WASTRES;
SEQ ID NO.54:轻链可变区CDR3:QQYYNTPRT;
SEQ ID NO.77:重链可变区:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGSYYWNWIRQPAGKGLEWIGRIYTSGSTSYNPSLKSRVTVSLDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCASETLDYVTYNSWFDPWGQGTLVTVSS;
SEQ ID NO.78:轻链可变区:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQRVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKVLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNTPRTFGQGTKVEIK。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为13E6H4的抗体,其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、56、57所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:58、59、60所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示。
克隆号为13E6H4的抗体的序列具体如下:
SEQ ID NO.55:重链可变区CDR1:SYEMN;
SEQ ID NO.56:重链可变区CDR2:CISSSGSTIYYADSVKG;
SEQ ID NO.57:重链可变区CDR3:DAREWFGDLVDY;
SEQ ID NO.58:轻链可变区CDR1:TGSSSNIGAGYDVH;
SEQ ID NO.59:轻链可变区CDR2:GNINRPS;
SEQ ID NO.60:轻链可变区CDR3:QSYDSSLSGLWV;
SEQ ID NO.79:重链可变区:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSCISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAREWFGDLVDYWGQGTLVTVSS;
SEQ ID NO.80:轻链可变区:
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGLWVFGGGTKLTVL。
第二方面,本发明提供编码以上所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列,本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性,编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一,所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
第三方面,本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料;所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
第四方面,本发明提供一种抗体偶联物,其为将所述抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到,所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
第五方面,本发明提供一种抗体组合物,所述抗体组合物包含以上(1)~(10)中的至少两种抗体。
在本发明的一些实施方式中,提供一种抗体组合物,所述抗体组合物包含以上(1)~(10)中的任意两种结合抗原表位不同的抗体。该抗体组合物可用于作为双抗夹心ELISA检测IFN-γ的配对抗体,抗体组合物中的两个抗体分别作为双抗夹心ELISA中的包被抗体和检测抗体。其中,检测抗体还可携带可检测的标记。
在本发明的一些实施方式中,提供一种抗体组合物,所述抗体组合物由以上所述的克隆号为8C5F8的抗体和克隆号为13E6H4的抗体组成。这两个抗体可作为配对抗体分别作为双抗夹心ELISA中的包被抗体和检测抗体。
在本发明的一些实施方式中,提供一种抗体组合物,所述抗体组合物由以上所述的克隆号为8C5F8的抗体和克隆号为13E6H4的抗体组成,其中,8C5F8作为双抗夹心ELISA中的包被抗体,13E6H4作为检测抗体。
第六方面,本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗体组合物的以下(1)~(5)中的任一种应用:
(1)在制备用于检测IFN-γ在样品中的存在或其水平的产品中的应用;
(2)在非诊断和治疗目的的检测IFN-γ在样品中的存在或其水平中的应用;
(3)在制备用于检测免疫细胞功能或CAR-T细胞疗法的治疗效果的产品中的应用;
(4)在制备用于中和样品中的IFN-γ活性的产品中的应用;
(5)在制备用于中和体内IFN-γ活性的药物中的应用。
上述(1)中所述的应用包括:将本发明的抗体或其抗原结合片段制备为用于检测IFN-γ在样品中的存在或其水平的产品,利用所述产品检测IFN-γ在样品中的存在或其水平。
为便于检测,本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。
本发明还提供检测IFN-γ在样品中的存在或其水平的方法,所述方法包括利用本发明的抗体或其抗原结合片段检测IFN-γ在样品中的存在或其水平。上述方法可以为诊断目的(例如:所述样品是来自患者的样品,包括血液样品等),或者非诊断和治疗目的(例如,所述样品是培养细胞上清液等,并非来自患者的样品)。
利用本发明的抗体或其抗原结合片段检测IFN-γ的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
在本发明的一些实施方式中,利用本发明的抗体或其抗原结合片段以双抗体夹心法检测IFN-γ。双抗体夹心法检测IFN-γ利用本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段作为包被抗体,以本发明提供的另一种抗体或其抗原结合片段作为检测抗体进行,或者以本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段为包被抗体,以已知的其他抗IFN-γ抗体为检测抗体进行,或者以已知的其他抗IFN-γ抗体为包被抗体,以本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段作为检测抗体进行。
上述(3)中,检测免疫细胞功能或CAR-T细胞疗法的治疗效果具体为通过检测受试者体内IFN-γ的水平,判断免疫细胞功能或CAR-T细胞疗法的治疗效果。其中所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、CAR-T细胞等。
上述(4)和(5)中,中和IFN-γ的活性具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段与样品中的IFN-γ结合,进而中和IFN-γ活性。
上述(5)中,所述药物用于预防或治疗与IFN-γ水平相关的疾病或由IFN-γ介导的疾病,所述疾病为自身免疫疾病或炎性紊乱综合症,包括但不限于风湿性关节炎、发炎性肠病、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、甲状腺炎、血管炎、后天免疫缺陷综合征(AIDS)、多发性硬化症、I型糖尿病、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、动脉粥样硬化、红血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自体免疫性肝炎诱发的肝损伤、胆汁性肝硬化、酒精诱发的肝损伤、风湿热、川崎病(kawasaki disease)、干眼病、噬血细胞淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征等。
优选地,本发明所述的IFN-γ为人IFN-γ。
第七方面,本发明提供一种IFN-γ检测试剂盒,其包含以上所述的抗体或其抗原结合片段,或包含以上所述的抗体偶联物,或包含以上所述的抗体组合物。
在本发明的一些实施方式中,提供IFN-γ的ELISA检测试剂盒,所述试剂盒包含以上所述的抗体或其抗原结合片段,或者包含以上所述的抗体组合物。所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂,这些试剂包括但不限于IFN-γ标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
第八方面,本发明提供一种药物组合物,其包含以上所述的抗体或其抗原结合片段。
上述药物组合物用于预防或治疗与IFN-γ水平相关的疾病或由IFN-γ介导的疾病,所述疾病可为自身免疫疾病或炎性紊乱综合症。本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为上述药物组合物的唯一活性成分,或者与其它药物活性成分联合使用。药物组合物还可包含药学领域允许的辅料。
第九方面,本发明提供一种非诊断和治疗目的的IFN-γ检测方法,所述方法包括:利用双抗夹心ELISA方法检测待测样品中是否存在IFN-γ和/或其存在水平,所述双抗夹心ELISA方法中的包被抗体和检测抗体分别为以上(1)~(10)中两种结合抗原表位不同的抗体。
在本发明的一些实施方式中,所述双抗夹心ELISA方法中的包被抗体和检测抗体分别为克隆号为8C5F8的抗体和克隆号为13E6H4的抗体。
本发明的有益效果至少包括:本发明提供的抗体能够以高亲和力结合IFN-γ(尤其是人IFN-γ),且具有较高的特异性,不与其他的细胞因子结合。本发明还提供用于检测IFN-γ含量的抗体对,该抗体对结合特殊的空间表位,通过双抗夹心ELISA方法可特异性检测培养基以及血清等样品中IFN-γ的含量,且具有较高的亲和力,而不结合其他的细胞因子,是理想的IFN-γ蛋白含量的检测试剂,可用于T细胞,NK细胞以及CAR-T细胞等功能性评价,为CGT疗法的评估提供了有效的工具。利用本发明提供的抗体进行IFN-γ的检测具有成本低、操作简单快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度等优势。
附图说明
图1为本发明实施例3中抗体的SDS-PAGE鉴定结果。
图2为本发明实施例3中抗体的ELISA结合实验结果。
图3为本发明实施例3中抗体的ELISA结合实验结果。
图4为本发明实施例3中抗体的SPR分析结果。
图5为本发明实施例3中抗体的SPR分析结果。
图6为本发明实施例3中双抗体夹心法对人IFN-γ进行定量检测的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 特异性人IFN-γ抗体的制备
1、小鼠免疫:将人IFN-γ蛋白(购自Acrobiosystems)作为免疫原,用人IFN-γ蛋白免疫小鼠。免疫结束后,用ELISA方法检测免疫动物血清,以此确定免疫应答的水平。常规免疫结束后,如果免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平,进行细胞融合。
2、筛选:用ELISA方法筛选融合细胞的上清液,挑选出对人IFN-γ 蛋白特异性结合呈阳性且与IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,GM-CSF,TNF-alpha等蛋白均无结合的细胞。
3、克隆扩大培养:将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集上清,用ELISA方法进行检测。
4、亚克隆:采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆,用ELISA方法进行亚克隆筛选。
5、杂交瘤细胞抗体基因测序:提取杂交瘤细胞总RNA,通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列,将抗体轻链和重链序列构建到T载体上,之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。
6、抗体生产与纯化:将步骤5获得的抗体基因序列转染到HEK293细胞中,并进行扩大培养,采用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体,用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
实施例2 人IFN-γ融合细胞的上清液的特异性分析
本实施例中,按照上述实施例1中的细胞融合后获得25个不同的细胞上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对上述人IFN-γ抗体进行特异性分析,分析方法如下:
1、用PBS分别将HEK293细胞重组表达的人IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、TNF-alpha蛋白稀释至2 μg/mL,分别加入酶标板孔中,每孔100 μL。用封板膜封板,放置4℃过夜。
2、弃去孔中液体,拍干酶标板,用PBST洗液洗板,300 μL/孔浸泡,拍干酶标板,进行下一次清洗,共洗板3次。
3、每孔加入100 μL封闭剂(含有5%BSA的PBST洗液), 用封板膜封板,放置37℃孵育,后清洗。
4、将上述人IFN-γ抗体细胞上清加入酶标板中,每孔100 μL。用封板膜封板,放置37℃孵育,后清洗。
5、用样品稀释液将HRP-Anti-Mouse IgG稀释至0.05 μg/mL,每孔加入100 μL,用封板膜封板,放置37℃孵育,后清洗。
6、每孔加入100 μL显色液. 用封板膜封板,放置37℃避光孵育。
7、每孔加入50 μL终止液,轻轻震荡酶标板至显色均匀。
8、用酶标仪读取450 nm和630nm的吸光度值,用OD450扣减OD630值得到吸光度值(OD值),部分抗体的OD值如表1所示。
9、选择与人IFN-γ蛋白强结合,与IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,GM-CSF,TNF-alpha蛋白不结合的克隆进行亚克隆。最终选择的克隆有:2D8E11,3E5B9,7C3B2,1C1C3,13E6H6,18B4H9,1C1A7,7C3B3,8C5F8,13E6H4。
表1 不同抗体的ELISA检测OD值
实施例3 人IFN-γ特异性抗体的分析鉴定和功能分析
本实施例中,采用本领域已知的方法对实施例2中筛选得到的人IFN-γ特异性抗体(克隆号:8C5F8,13E6H4)进行分析鉴定和功能分析,具体如下:
1、SDS-PAGE鉴定结果(图1)显示,8C5F8,13E6H4克隆号抗体还原电泳两条带分子量大小分别为27kDa和50kDa左右,纯度大于99%。
2、ELISA结合实验结果表明,8C5F8(图2)、13E6H4(图3)克隆号的抗体能够特异地识别人IFN-γ蛋白,但与白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-10(IL-10),巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子α(TNF-alpha)蛋白无结合。
3、SPR分析数据显示,从上往下6条拟合线分别代表人IFN-γ蛋白在50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM浓度下与8C5F8(图4)、13E6H4(图5)克隆号抗体之间亲和和解离随时间的变化规律,结果表明,8C5F8,13E6H4克隆号的抗体结合人IFN-γ蛋白的亲和力分别是41.1 pM和158 pM。
4、以8C5F8为包被抗体(使用浓度为2μg/mL,100μL/孔),13E6H4为检测抗体(使用浓度为0.5μg/mL,100μL/孔)进行人IFN-γ定量检测实验,结果表明(图6),8C5F8,13E6H4克隆号的抗体可以采用双抗体夹心法对人IFN-γ进行定量检测,从而获得基质中人IFN-γ蛋白的含量。
5、人IFN-γ定量检测的方法开发与方法学验证
人IFN-γ定量检测的方法包括如下步骤:
5.1 用PBS将抗体8C5F8稀释至2μg/mL,加入酶标板孔中,每孔100 μL。用封板膜封板,放置4℃过夜。
5.2 弃去孔中液体,拍干酶标板,用PBST洗液洗板,300 μL/孔浸泡,拍干酶标板,进行下一次清洗,共洗板3次。
5.3 每孔加入100 μL封闭剂(含有5%BSA的PBST洗液), 用封板膜封板,放置37℃孵育后清洗。
5.4 将系列稀释后的标准品(500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125pg/ml)加入反应孔内,每孔加入100 μL。空白对照孔加入100μL 稀释液。
5.5用封板膜封板,室温孵育。
5.6 小心揭开封板膜,弃去孔中液体,每孔加入300μL洗液,浸泡10 s,共洗板3次。每次洗板后,需在吸水纸上拍干。
5.7 在对应板孔内加入100 μL 生物素标记的13E6H4(0.5μg/mL)用封板膜封板,室温孵育,后清洗。
5.8在对应板孔内加入100 μL稀释的Streptavidin-HRP。用封板膜封板,室温孵育。后清洗。
5.9每孔加入100 μL显色液。用封板膜封板,需避光,室温孵育。
5.10每孔加入50 μL 终止液,轻轻震荡酶标板至混合均匀。
5.11用酶标仪测定各孔在450 nm和630 nm波长的吸光值,请在终止后10分钟内读数。
【标准曲线】
利用上述双抗体夹心法定量检测IFN-γ的OD值如表2所示。绘制的标准曲线如图6所示。
表2 双抗体夹心法定量检测IFN-γ
【精密度】
(1)酶标板内精密度
将3个已知IFN-γ浓度的样本在酶标板内重复测试20次,以评估酶标板内的精密度。
(2)酶标板间精密度
将3个已知IFN-γ浓度的样本酶标板间重复测试3次,以评估酶标板间的精密度。
精密度的检测结果如表3所示。
表3 精密度检测结果
【准确度】
将5份健康人血清中加入3个不同浓度的人干扰素-γ,以未加入人干扰素-γ的血清作为本底,计算回收率。结果表明,回收率的范围在107%-113%。
【稀释线性】
将高浓度的人干扰素-γ加入到不同的稀释基质中,进行梯度稀释,评估检测的线性,结果如表4所示。
表4 稀释线性检测结果
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种抗IFN-γ抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49、50、51所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52、53、54所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示;轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:78所示。
3.核酸分子,其特征在于,其编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
4.生物材料,其特征在于,其含有权利要求3所述的核酸分子,所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.一种抗体偶联物,其特征在于,其为将权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到,所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
6.一种抗体组合物,其特征在于,所述抗体组合物包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段以及以下抗IFN-γ抗体或其抗原结合片段:
重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、56、57所示;轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:58、59、60所示。
7.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的抗体偶联物或权利要求6所述的抗体组合物的以下(1)~(5)中的任一种应用:
(1)在制备用于检测IFN-γ在样品中的存在或其水平的产品中的应用;
(2)在非诊断和治疗目的的检测IFN-γ在样品中的存在或其水平中的应用;
(3)在制备用于检测免疫细胞功能或CAR-T细胞疗法的治疗效果的产品中的应用;
(4)在制备用于中和样品中的IFN-γ活性的产品中的应用;
(5)在制备用于中和体内IFN-γ活性的药物中的应用。
8.一种IFN-γ检测试剂盒,其特征在于,其包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,或包含权利要求5所述的抗体偶联物,或包含权利要求6所述的抗体组合物。
9.一种药物组合物,其特征在于,其包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
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