CN117720650A - 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 - Google Patents
抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117720650A CN117720650A CN202410156248.0A CN202410156248A CN117720650A CN 117720650 A CN117720650 A CN 117720650A CN 202410156248 A CN202410156248 A CN 202410156248A CN 117720650 A CN117720650 A CN 117720650A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- respiratory syncytial
- syncytial virus
- human respiratory
- antibody
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 64
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 claims abstract description 69
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 12
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 abstract description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 26
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 4
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用。本发明提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，具有较高的亲和力，而且不与人呼吸道合胞病毒融合后F蛋白结合，能够实现人呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的特异、灵敏和准确检测。基于本发明的抗体得到的检测试剂能够实现样品中人呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的定量检测，具有较高的灵敏度、特异性、准确性和精密度，检测成本低，可用于人呼吸道合胞病毒疫苗等样品中融合前F蛋白的定量检测，为人呼吸道合胞病毒疫苗的开发、质量评价和应用提供了有效的检测手段，具有较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用。
背景技术
人呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，简称RSV）是一种常见的呼吸道病毒，主要感染婴幼儿和老年人，尤其是免疫力较弱的人群。目前尚无治疗RSV感染的特效药。
RSV是一种单链RNA病毒，含有8种结构蛋白。在8种结构蛋白中，融合蛋白（fusionprotein，F）和粘附蛋白（attachment protein，G）是病毒入侵人体的关键，二者都可以成为病毒防治的理想靶点，而由于G蛋白变异较多、相对不稳定，F蛋白便成为了重要靶点，更适合用于疫苗的开发。F蛋白存在融合前（Pre-fusion F）和融合后（Post-fusion F）两种构象，目前已经发现在两种构象中均有一些中和抗体表位，但融合前中和抗体表位更多，且有一些仅融合前才具备的中和抗体表位，如Site ø、Site V。因此，融合前F蛋白可能能够诱导更高、更优质的中和抗体反应，也是目前较好的RSV疫苗抗原。
随着RSV的病原学与结构生物学的进一步深入研究，RSV疫苗已经取得了一些进展。目前已有RSV疫苗试验成功推进至临床后期，并且表现出较好的有效性与安全性。RSV疫苗的开发和生产过程中，需要对产生的RSV蛋白含量进行测定，以对RSV疫苗进行质量控制。因此，亟需开发能够高效、特异地结合RSV的融合前F蛋白的抗体及其相关检测试剂，为RSV疫苗的开发和应用提供有效的检测方法。
发明内容
本发明提供抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为12D12的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为14B3的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明提供的上述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人呼吸道合胞病毒的融合前F蛋白，且具有较高的亲和力，但不结合融合后F蛋白。
本发明提供编码以上所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
本发明还提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
本发明提供一种抗体偶联物，其为将以上所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
本发明提供抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
以上（1）-（2）中的抗体结合不同的抗原空间表位。
优选地，上述（1）中的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
上述（2）中的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
上述抗体组合物可用于作为双抗体夹心ELISA（酶联免疫吸附试验）法检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为双抗体夹心ELISA法中的包被抗体和检测抗体。其中，检测抗体还可携带可检测的标记。
在本发明的一些实施方式中，以（1）中所述抗体作为包被抗体，以（2）中所述抗体作为检测抗体。
本发明提供一种检测试剂盒，其包含以上所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物，或包含所述抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物。
上述试剂盒可作为人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的检测试剂盒。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA检测试剂盒。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体偶联物或抗体组合物，通过双抗体夹心ELISA法可特异性检测样品中人呼吸道合胞病毒的融合前F蛋白的含量，具有较高的灵敏度、特异性和准确性。
为便于检测，所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于携带可检测的标记的第二抗体、人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供以上所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物或所述检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在非疾病诊断和治疗目的的检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在制备用于检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白在样品中的存在或其水平的试剂中的应用；
（3）在制备用于诊断人呼吸道合胞病毒感染的试剂中的应用；
（4）在人呼吸道合胞病毒疫苗的鉴定或其中人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的含量检测中的应用；
（5）在制备用于人呼吸道合胞病毒疫苗的免疫原性检测的产品中的应用；
（6）在人呼吸道合胞病毒疫苗的质控中的应用；
（7）在作为人呼吸道合胞病毒疫苗免疫后血清中抗人呼吸道合胞病毒抗体水平检测的阳性参考抗体中的应用。
上述（1）中，所述应用包括利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白在样品中的存在或其水平。在非疾病诊断和治疗目的的检测中，所述样品可为体外培养制得的病毒液或疫苗、体外制备的人呼吸道合胞病毒的融合前F蛋白等并非直接来源于人或动物的样品。
利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的方法可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
在本发明的一些实施方式中，利用所述抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、抗体组合物或检测试剂盒以双抗体夹心ELISA法（作为包被抗体和/或检测抗体）检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白。
上述（2）中，所述产品可为非疾病诊断和治疗目的的检测试剂或试剂盒，也可为疾病诊断和治疗目的的检测试剂或试剂盒。
上述（3）中，所述试剂通过检测样品中人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的存在或其水平诊断人呼吸道合胞病毒感染。
上述（4）中，通过检测疫苗中是否存在人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白对疫苗进行鉴定。
上述是（5）中，免疫原性检测具体为检测人呼吸道合胞病毒疫苗引起动物机体免疫应答的性能，包括免疫动物体液免疫功能（例如：中和抗体及其水平、抗体的亲和力）的评价等，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为阳性参考抗体用于疫苗的免疫原性检测。
上述（6）中，通过检测疫苗中是否存在人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白及其存在水平对疫苗进行质控。
上述（7）中，本发明的抗体或其抗原结合片段可作为阳性参考抗体，用于人呼吸道合胞病毒疫苗免疫后血清中抗人呼吸道合胞病毒抗体水平检测（例如采用间接ELISA法），即进行人呼吸道合胞病毒疫苗体液免疫效价检测。
本发明提供一种非疾病诊断和治疗目的的检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的方法，所述方法包括：利用以上所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物或所述检测试剂盒对待测样品中的人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白进行检测。
上述检测可采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，具有较高的亲和力，而且不与人呼吸道合胞病毒融合后F蛋白结合，能够实现人呼吸道合胞病毒的融合前F蛋白的特异、灵敏和准确检测。
基于本发明的抗体得到的检测试剂能够实现样品中人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的定量检测，具有较高的灵敏度、特异性、准确性和精密度，检测成本低，可用于人呼吸道合胞病毒疫苗等样品中融合前F蛋白的定量检测，还可用于人呼吸道合胞病毒感染的诊断试剂的制备等，为人呼吸道合胞病毒疫苗的开发、质量评价和应用以及人呼吸道合胞病毒感染检测提供了有效的检测手段，具有较好的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中12D12抗体亲和力的检测结果。
图2为本发明实施例3中14B3抗体亲和力的检测结果。
图3为本发明实施例4中人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白含量检测的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明利用HEK293细胞重组表达的人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白作为免疫原进行小鼠免疫，经细胞融合与母克隆筛选、细胞亚克隆，获得表达小鼠抗体的杂交瘤细胞株。通过建立活性分析方法，筛选合适的细胞株进行抗体的生产与表达，并采用双抗体夹心ELISA法进行人呼吸道合胞病毒（RSV）含量的检测。通过实验验证发现，筛选得到的抗体能够特异性识别人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白，并且不能识别融合后F蛋白。进一步地，本发明通过杂交瘤测序获得了该抗体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
实施例1 抗人呼吸道合胞病毒（RSV）抗体的制备
1、小鼠免疫：用人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白（购自Acrobiosystems）作为免疫原免疫小鼠。免疫结束后，用ELISA方法检测免疫动物血清，以此确定免疫应答的水平。常规免疫结束后，如果免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平，进行细胞融合。
2、筛选：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白特异性结合，但是对融合后F蛋白不结合的细胞。
3、克隆扩大培养：选择10株筛选出来的细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集上清，用ELISA方法检测。
4、亚克隆：采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，用ELISA方法进行亚克隆筛选。
5、杂交瘤细胞抗体基因测序：提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录为cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，然后进行DNA测序分析，获得抗体基因序列。
6、抗体生产与纯化：将步骤7获得的抗体基因序列转染到HEK293细胞中，并进行扩大培养，采用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中。
实施例2 抗人呼吸道合胞病毒（RSV）抗体的特异性分析
本实施例中，选择上述实施例1中经筛选和纯化获得的10株抗体，采用间接ELISA法对抗体结合人呼吸道合胞病毒（RSV）蛋白的特异性进行分析，分析方法如下：
1、用PBS将人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白以及融合后F蛋白分别稀释至2μg/mL，加入酶标板孔中，每孔100μL。用封板膜封板，放置4℃过夜。
2、弃去孔中液体，拍干酶标板，用PBST洗液洗板，300μL/孔浸泡，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板3次。
3、每孔加入100μL封闭剂（含有5%BSA的PBST洗液），用封板膜封板，放置37℃孵育，然后清洗。
4、将实施例1中筛选的10株人呼吸道合胞病毒（RSV）抗体用样品稀释液进行梯度稀释，浓度为1μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL。用封板膜封板，放置37℃孵育。
5、将检测二抗Anti-mouse antibody，用样品稀释液稀释至0.05μg/mL，每孔加入100μL，用封板膜封板，放置37℃孵育，然后清洗。
6、每孔加入100μL显色液，用封板膜封板，放置37℃避光孵育。
7、每孔加入50μL终止液，轻轻震荡酶标板至显色均匀。
8、用酶标仪读取450 nm和630 nm的吸光度值，用OD450扣减OD630值得到吸光度值（OD值）。
结果如表1所示，选择可以准确并高灵敏度检测人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白且不识别融合后F蛋白的克隆：12D12和14B3。
表1 抗人呼吸道合胞病毒（RSV）抗体的特异性分析
实施例3 抗体对人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白的亲和力检测
对克隆号为12D12和14B3的单克隆抗体进行亲和力检测，具体方法和结果如下：
1、配体的捕获：分别将抗RSV蛋白抗体12D12和14B3用流动缓冲液（含0.005%Tween-20的1×HEPES）稀释至5μg/mL，用Biacore 8K（Cytiva）的protein G芯片进行捕获。捕获的流速为10μL/min，达到约100 RU的捕获水平，并同时设置参比通道，参比通道不需要配体捕获步骤。每个分析物的实验循环需要分别将配体捕获到实验通道上。
2、分析物的分析：用相同的流动缓冲液（含0.005%Tween-20的1×HEPES）稀释RSV蛋白至8个浓度（25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813、0.391和0 nM）。将RSV蛋白以30μL/min的流速注入实验通道与参比通道中，结合时间为120 s，解离时间为300 s。结合和解离过程均在流动缓冲液中处理。分析物按照最低到最高的浓度进行重复。每循环相互作用分析结束后，芯片表面以10 mM甘氨酸-盐酸（pH 1.5），流速为20μL/min，持续30 s进行再生，以去除配体和任何结合的分析物，然后下一个浓度循环的分析需要重复配体捕获、分析物注射和再生步骤。
克隆号为12D12和14B3的单克隆抗体的亲和力检测结果分别如图1和图2所示，12D12抗体的KD=1.74E-09M，14B3抗体的KD=1.63E-11M。
实施例4 人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白的含量检测
本实施例利用上述筛选得到的克隆号为12D12和14B3的单克隆抗体，采用双抗体夹心ELISA法对人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白进行检测，检测方法如下：
1、用PBS将抗体（克隆号：12D12）稀释至1μg/mL，加入酶标板孔中，每孔100μL。用封板膜封板，放置4℃过夜。
2、弃去孔中液体，拍干酶标板，用PBST洗液洗板，300μL/孔浸泡，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板3次。
3、每孔加入100μL封闭剂（含有5%BSA的PBST洗液），用封板膜封板，放置37℃孵育，然后清洗。
4、将人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白用样品稀释液进行梯度稀释，浓度范围为1.5625-100 ng/mL，加入酶标板中，每孔100μL。用封板膜封板，放置37℃孵育，然后清洗。
5、将抗体（克隆号：14B3）进行HRP标记，用样品稀释液稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，用封板膜封板，放置37℃孵育，然后清洗。
6、每孔加入100μL显色液，用封板膜封板，放置37℃、避光孵育。
7、每孔加入50μL终止液，轻轻震荡酶标板至显色均匀。
8、用酶标仪读取450 nm和630 nm的吸光度值，用OD450扣减OD630值得到吸光度值（OD值）。
9、利用双抗体夹心ELISA法建立标准曲线（图3和表2），根据标准曲线，样品中人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白的含量可以进行定量。计算公式为y = 0.026x + 0.0735，其中y为OD值，将样品的OD值带入上式公式中，计算x，即样品中人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白的浓度值。
经检测，上述双抗体夹心ELISA法检测人呼吸道合胞病毒（RSV）的灵敏度为3.125ng/mL，能够满足疫苗蛋白含量检测的要求。
表2 人呼吸道合胞病毒（RSV）融合前F蛋白含量检测标准曲线
注：表2中OD值-1、OD值-2为两次平行检测结果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
2.根据权利要求1所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：14所示；
（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：16所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或多特异抗体。
4.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1~3任一项所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求7所述的抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物。
9.权利要求1~3任一项所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在非疾病诊断和治疗目的的检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在制备用于检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白在样品中的存在或其水平的试剂中的应用；
（3）在制备用于诊断人呼吸道合胞病毒感染的试剂中的应用；
（4）在人呼吸道合胞病毒疫苗的鉴定或其中人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的含量检测中的应用；
（5）在制备用于人呼吸道合胞病毒疫苗的免疫原性检测的产品中的应用；
（6）在人呼吸道合胞病毒疫苗的质控中的应用；
（7）在作为人呼吸道合胞病毒疫苗免疫后血清中抗人呼吸道合胞病毒抗体水平检测的阳性参考抗体中的应用。
10.一种非疾病诊断和治疗目的的检测人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~3任一项所述的抗人呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的抗人呼吸道合胞病毒的抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒对待测样品中的人呼吸道合胞病毒或其融合前F蛋白进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410156248.0A CN117720650A (zh) | 2024-02-04 | 2024-02-04 | 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410156248.0A CN117720650A (zh) | 2024-02-04 | 2024-02-04 | 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117720650A true CN117720650A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90205614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410156248.0A Pending CN117720650A (zh) | 2024-02-04 | 2024-02-04 | 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117720650A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108431036A (zh) * | 2015-10-29 | 2018-08-21 | 默沙东公司 | 中和人呼吸道合胞病毒的抗体 |
| CN110016079A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-07-16 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒的中和抗体及其应用 |
| US20190367586A1 (en) * | 2016-12-19 | 2019-12-05 | Vanderbilt University | Antibodies to human respiratory syncytial virus protein f pre-fusion conformation and methods of use therefor |
| CN111606993A (zh) * | 2019-02-26 | 2020-09-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用 |
| CN116836269A (zh) * | 2023-03-15 | 2023-10-03 | 山西高等创新研究院 | 抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用 |
-
2024
- 2024-02-04 CN CN202410156248.0A patent/CN117720650A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108431036A (zh) * | 2015-10-29 | 2018-08-21 | 默沙东公司 | 中和人呼吸道合胞病毒的抗体 |
| US20190367586A1 (en) * | 2016-12-19 | 2019-12-05 | Vanderbilt University | Antibodies to human respiratory syncytial virus protein f pre-fusion conformation and methods of use therefor |
| CN110016079A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-07-16 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒的中和抗体及其应用 |
| CN111606993A (zh) * | 2019-02-26 | 2020-09-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用 |
| CN116836269A (zh) * | 2023-03-15 | 2023-10-03 | 山西高等创新研究院 | 抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GUANGJIN XUN等: "Potent Human Single-Domain Antibodies Specific for a Novel Prefusion Epitope of Respiratory Syncytial Virus F Glycoprotein", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 95, no. 18, 25 August 2021 (2021-08-25), pages 1 - 13, XP093129715, DOI: 10.1128/JVI.00485-21 * |
| 高微微等: "儿童呼吸道合胞病毒感染的药物治疗研究进展及其预防策略", 现代药物与临床, vol. 38, no. 8, 31 August 2023 (2023-08-31), pages 2073 - 2079 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11866785B2 (en) | Tumor specific antibodies and T-cell receptors and methods of identifying the same | |
| CN114702578B (zh) | 新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用 | |
| CN111018971B (zh) | 柯萨奇病毒a6型实心病毒的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114349855B (zh) | 新型冠状病毒Delta突变株特异性抗体及其应用 | |
| Ch’ng et al. | Phage display-derived antibodies: Application of recombinant antibodies for diagnostics | |
| CN106939034B (zh) | 用于鉴定受试者所感染的hev基因型的方法和试剂盒 | |
| JP7455947B2 (ja) | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
| CN117247449A (zh) | 抗p24抗体、检测p24的试剂和试剂盒 | |
| CN117720650A (zh) | 抗人呼吸道合胞病毒抗体及其应用 | |
| CN117683121B (zh) | 抗水痘-带状疱疹病毒抗体及其应用 | |
| EP4116323A1 (en) | Adenovirus immunoassay method and immunoassay instrument | |
| CN117280214A (zh) | SARS-CoV-2的免疫测定方法及免疫测定试剂盒、以及单克隆抗体或其抗体片段 | |
| KR102339334B1 (ko) | 인간 메타뉴모바이러스(hMPV)의 항원 M의 특이적 단클론 항체 및 진단 방법에 있어서의 그 용도 | |
| CN116514989B (zh) | 全能核酸酶抗体及其应用 | |
| CN116284363B (zh) | 新型冠状病毒OmicronBA.2/4/5突变株特异性抗体及其应用 | |
| CN115894674B (zh) | 一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用 | |
| CN117229393B (zh) | 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用 | |
| CN116143929B (zh) | 抗重组人凝血因子VIIa-Fc融合蛋白的抗体及其应用 | |
| EP4116322A1 (en) | Adenovirus immunoassay method and immunoassay instrument | |
| KR102601835B1 (ko) | 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 | |
| CN117209605B (zh) | 特异性结合il-15的抗体及其应用 | |
| WO2022265066A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット | |
| CN114181313B (zh) | 抗ck-mb的抗体或其抗原结合部分及其应用 | |
| JP5448424B2 (ja) | ヒトＩｇＧのＦｃを含有するタンパク質の測定試薬 | |
| CN116284368A (zh) | 抗人MxA抗体或其抗原结合部分 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |