CN116514989B - 全能核酸酶抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及全能核酸酶抗体及其应用。本发明提供特异性结合全能核酸酶的抗体，该抗体与全能核酸酶具有较高的亲和力，能够实现微量全能核酸酶的检测，具有较高的灵敏度，可用于在疫苗样品、细胞和基因治疗病毒样品、重组蛋白药物等生物制品中检测全能核酸酶残留，为保证生物制品安全性提供了有效的检测试剂。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及全能核酸酶抗体及其应用。
背景技术
全能核酸酶是一种来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的基因工程酶，它可以降解所有形式的DNA和RNA，包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性的核酸，将它们消化成3-8个碱基长度的5-单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性。因此，在一些药物的生产工艺中经常使用全能核酸酶去除残留核酸，例如：利用全能核酸酶可有效去除疫苗样品、细胞和基因治疗病毒样品及重组蛋白药物中的核酸污染，降低核酸残留毒性风险，提高产品安全性；另外，在蛋白分析样品制备、改善重组蛋白纯化工艺、提高蛋白产量、细胞冻存等方面也可通过使用全能核酸酶处理核酸来达到理想效果。
然而，在利用全能核酸酶处理生物制品的过程中，可能会引入微量核酸酶残留。由于全能核酸酶本身也属于外源性物质，这些微量残留会对后续生物制品的应用造成一定的影响，并可能会引起毒性或免疫反应。因此，对全能核酸酶残留进行精确检测是保证相关生物制品活性及安全性的重要条件。在生物制品的安全性监管中，全能核酸酶的残留量也是衡量生物制品质量的重要指标之一。因此，开发可用于检测全能核酸酶的抗体具有重要意义。
发明内容
本发明提供全能核酸酶抗体、含有所述抗体的检测试剂盒及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（8）中的任意一种：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示；
（3）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17、18所示；
（4）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20、21所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；
（5）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、26、27所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：28、29、30所示；
（6）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、32、33所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：34、35、36所示；
（7）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：37、38、39所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：40、41、42所示；
（8）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：43、44、45所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：46、47、48所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（8）中的任意一种：
（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示；
（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示；
（3）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示；
（4）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：56所示；
（5）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示；
（6）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示；
（7）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：61所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：62所示；
（8）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：63所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为1B11E6的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为6F5H6的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为6F2A9的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、14、15所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16、17、18所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为6H6F6的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、20、21所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22、23、24所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：56所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为2F4B5的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25、26、27所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：28、29、30所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：58所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为3F4C8的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：31、32、33所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：34、35、36所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为7G7D7的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：37、38、39所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：40、41、42所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：61所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：62所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为13A1D3的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：43、44、45所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：46、47、48所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：63所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：64所示。
在上述抗体或其抗原结合片段的基础上，本发明提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
进一步地，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
本发明还提供一种抗体偶联物，其为将所述抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
本发明提供一种全能核酸酶抗体组合物，所述抗体组合物包含以上所述的（1）~（8）中的至少两种抗体。
在本发明的一些实施方式中提供一种全能核酸酶抗体组合物，所述抗体组合物包含以上（1）~（8）中的任意两种结合抗原表位不同的抗体。该抗体组合物可用于作为双抗夹心ELISA检测全能核酸酶的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为双抗夹心ELISA中的捕获抗体和检测抗体。其中，检测抗体还可携带可检测的标记。
在本发明的一些实施方式中提供一种抗体组合物，所述抗体组合物由以上（1）和（2）两个抗体或其抗体偶联物组成。
本发明提供一种检测试剂盒，其包含所述全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物，或包含所述全能核酸酶抗体组合物。
上述试剂盒可作为全能核酸酶残留检测试剂盒。
上述试剂盒中，所述抗体或其抗原结合片段还可包括可检测的标记；所述试剂盒还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测所述抗体或其抗原结合片段。
为便于检测，所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于全能核酸酶标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在检测全能核酸酶在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在生物制品中的全能核酸酶残留检测中的应用；
（3）在生物制品生产中的应用；
（4）在生物制品质量控制中的应用。
上述（1）、（2）中，所述应用包括利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述检测试剂盒检测全能核酸酶在样品中的存在或其水平。
利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述检测试剂盒检测全能核酸酶的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法等。
在本发明的一些实施方式中，利用所述抗体或其抗原结合片段以双抗体夹心法检测全能核酸酶。
上述应用中，所述样品包括生物制品。所述生物制品包括疫苗、细胞和基因治疗病毒、重组蛋白药物等。
上述应用中，全能核酸酶残留的检测具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段鉴定疫苗样品、细胞和基因治疗病毒样品以及重组蛋白药物中是否存在全能核酸酶残留及全能核酸酶残留的含量水平。
本发明提供一种检测全能核酸酶残留的方法，所述方法包括：利用所述全能核酸酶抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述全能核酸酶抗体组合物或所述检测试剂盒对待测样品中的全能核酸酶残留进行检测。
本发明中，所述全能核酸酶为来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的基因工程酶，可以降解所有形式的DNA和RNA，包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性的核酸，将其消化成3-8个碱基长度的5-单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供特异性结合全能核酸酶的抗体，该抗体结合特殊的空间表位，只与全能核酸酶发生特异性结合，且具有较高的亲和力，能够实现微量全能核酸酶的检测，具有较高的灵敏度，可用于在疫苗样品、细胞和基因治疗病毒样品、重组蛋白药物等生物制品中检测全能核酸酶残留，为保证生物制品安全性提供了有效的检测试剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中克隆号1B11E6全能核酸酶特异性抗体的SDS-PAGE鉴定结果，其中，蛋白质分子量marker条带从上到下依次为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa。
图2为本发明实施例2中克隆号6F5H6全能核酸酶特异性抗体的SDS-PAGE鉴定结果，其中，蛋白质分子量marker条带从上到下依次为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa。
图3为本发明实施例2中克隆号1B11E6全能核酸酶特异性抗体的SEC-MALS鉴定结果。
图4为本发明实施例2中克隆号6F5H6全能核酸酶特异性抗体的SEC-MALS鉴定结果。
图5为本发明实施例2中克隆号1B11E6全能核酸酶特异性抗体的ELISA特异性结合分析结果。
图6为本发明实施例2中克隆号6F5H6全能核酸酶特异性抗体的ELISA特异性结合分析结果。
图7为本发明实施例2中克隆号1B11E6全能核酸酶特异性抗体的BLI分析结果。
图8为本发明实施例2中克隆号6F5H6全能核酸酶特异性抗体的BLI分析结果 。
图9为本发明实施例2中利用克隆号1B11E6和克隆号6F5H6全能核酸酶特异性抗体进行全能核酸酶蛋白定量分析结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过以全能核酸酶作为免疫原进行小鼠免疫，经细胞融合与筛选、杂交瘤细胞亚克隆，获得表达抗体的杂交瘤细胞株。通过实验验证发现，该抗体能够特异性识别全能核酸酶抗原识别位点。进一步地，本发明通过杂交瘤测序获得了该抗体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
实施例1 全能核酸酶抗体的制备
本实施例中，按照以下方法制备全能核酸酶特异性抗体：
1、小鼠免疫：以全能核酸酶（购自Acrobiosystems）作为免疫原，用全能核酸酶蛋白免疫小鼠。免疫结束后，用ELISA方法检测免疫动物血清。免疫结束后，如果免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平，进行细胞融合。
2、筛选：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对全能核酸酶结合的细胞克隆。
3、克隆扩大培养：将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集上清，用ELISA方法进行检测。
4、亚克隆：采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，用ELISA方法进行亚克隆筛选。
5、杂交瘤细胞抗体基因测序：提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。
6、抗体生产与纯化：将步骤5获得的抗体基因序列克隆至表达载体并转染到HEK293细胞中，进行扩大培养，采用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液（PBS）。
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对上述获得的全能核酸酶抗体结合全能核酸酶的特异性进行分析，结果如表1所示。
表1 不同全能核酸酶抗体的ELISA检测OD值
以上实验结果显示，上述8个全能核酸酶抗体均能够结合全能核酸酶，其中，克隆号：1B11E6、6F5H6对于全能核酸酶示了较高的结合活性。
实施例2 全能核酸酶抗体的分析鉴定和功能分析
本实施例中，采用本领域已知的方法对实施例1中筛选的全能核酸酶特异性抗体（克隆号1B11E6和克隆号6F5H6）进行分析鉴定和功能分析，具体如下：
1、SDS-PAGE鉴定结果（图1和图2）显示，克隆号1B11E6(图1)和克隆号6F5H6（图2）抗体还原电泳两条带分子量大小分别为25kDa和50kDa左右，纯度大于95%。
2、SEC-MALS鉴定结果（图3和图4）显示，克隆号1B11E6（图3）和克隆号6F5H6（图4）抗体纯度大于99%，分子量大小149kDa。
3、ELISA结合实验结果（图5和图6）表明，克隆号1B11E6（图5）和克隆号6F5H6（图6）的抗体能够特异地识别全能核酸酶蛋白。
4、BLI分析数据（图7和图8）显示，拟合线代表全能核酸酶蛋白在1000nM浓度下与克隆号1B11E6（图7）和克隆号6F5H6（图8）抗体之间亲和与解离随时间的变化规律，结果表明，克隆号1B11E6和克隆号6F5H6的抗体结合全能核酸酶蛋白的亲和力分别高达30.6nM和50.95 nM。
5、全能核酸酶抗原定量检测实验结果（图9）表明，以1B11E6克隆号抗体作为捕获抗体，6F5H6克隆号抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心法对全能核酸酶蛋白进行定量检测，灵敏度达到2.733pg/mL，且具有较好的线性相关性。可见，本发明的全能核酸酶抗体能够实现全能核酸酶的高灵敏度检测，从而获得疫苗等生物制品中的全能核酸酶的残留量。
6、克隆号1B11E6和克隆号6F5H6抗体的亚型鉴定结果显示，两个抗体经IgIsotyping Mouse Instant ELISA Kit（货号：88-50660，Invitrogen）检测亚型为IgG1kappa。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示。
2.根据权利要求1所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示。
3.根据权利要求1或2所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
4.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1~3任一项所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.一种全能核酸酶抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物包含以下两种抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求7所述的全能核酸酶抗体组合物。
9.权利要求1~3任一项所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的全能核酸酶抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在检测全能核酸酶在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在生物制品中的全能核酸酶残留检测中的应用；
（3）在生物制品生产中的应用；
（4）在生物制品质量控制中的应用。
10.一种检测全能核酸酶残留的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~3任一项所述的全能核酸酶抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的全能核酸酶抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒对待测样品中的全能核酸酶残留进行检测。
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