KR20230124280A - 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도 - Google Patents
메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein, NP)에 특이적인 진단용 항체 및 이의 결합 단편에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 항체는 MERS-CoV의 NP에 특이적으로 결합하는 능력을 가지고 다른 코로나 바이러스에는 특이적이지 않으므로, MERS-CoV의 검출에 매우 유용하다.
Description
메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein, NP)에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, "MERS-CoV", 중동호흡기증후군 코로나 바이러스)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스로, 코로나 바이러스(Coroviridae) 군에 속하며 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스로 알려져 있다.
메르스(MERS)는 MERS-CoV에 의해 유발되는 호흡기 감염증으로, 중동지역 아라비아 반도를 중심으로 2012년 9월부터 2017년 5월까지 13개국에서 1,980명이 발생하여 699명 사망한 바 있다. 대한민국에서도 2015년 대규모의 감염이 발생하여, 186명의 확진 환자가 발생하였고, 그 중 38명이 사망한 것으로 보고되어 있다.
MERS-CoV의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 11개의 단백질을 암호화하고 있는 11개의 ORF (open reading frame)를 지닌다. MERS-CoV의 구조 단백질은 S (spike), E (envelope), M (matrix) 및 NC (nucleocapsid) 단백질이 존재한다.
MERS-CoV의 진단은 분자적 진단(Molecular Test)과 혈청학적 진단(Serology Test)으로 분류된다. 가장 흔히 사용하는 진단법은 분자적 진단법으로, 콧물(nasal swap) 검체로부터의 바이러스 유전자 특이적 프라이머(primer)를 이용한 PCR이나 유전자 염기 서열 분석에 의한 것이다. MERS-CoV의 혈청학적 진단법은 항원-항체 반응의 원리를 이용한 것으로, S 항원 또는 NC 항원에 대한 항체 진단 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, 효소결합면역측정법), 또는 microneutralization 분석법 등이 있다. Euroimmune사(독일)에서 개발된 항체 진단 키트는, 정제된 S1 항원에 기초한 Indirect ELISA 방법을 이용하여 MERS-CoV를 진단하는 용도로 사용되고 있다. 그러나 Indirect ELISA의 경우, 목적 동물에 따라 2차 항체를 따로 적용해야 한다는 단점이 있다.
높은 치사율을 보인 MERS는 감염시 호흡기뿐만 아니라 폐렴 또는 급성신부전 등의 합병증을 동반하기 때문에 빠른 진단을 통한 초기 치료가 매우 중요하다. 따라서, 메르스 코로나 바이러스에 특이적인 결합 분자 및 이를 이용한 메르스 코로나 바이러스의 신속한 진단 방법의 개발의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein, NP)에 특이적인 결합 분자를 개발하였고, 이 결합 분자가 MERS-CoV에 대하여 우수한 결합력을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus) 항원을 진단하는 제제를 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
1. 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)에 특이적으로 결합하며,
중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
2. 위 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
3. 위 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
4. 위 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
5. 위 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 52 및 서열번호 53 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 서열번호 54 및 서열번호 55 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 56 및 서열번호 57 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
6. 위 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항체 또는 이의 결합 단편.
7. 위 6에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 Fab 절편인, 항체 또는 이의 결합 단편.
8. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
9. 위 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
10. 위 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
11. 위 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
12. 위 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 염기서열; 및
서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
13. 위 8의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터.
14. 위 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
15. 위 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
16. 위 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
17. 위 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 염기서열; 및
서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함하는 것인, 발현 벡터.
18. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포.
19. 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus) 항원을 진단하는 제제를 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 키트로서,
상기 바이러스 항원은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)이고,
상기 제제는 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편인, 진단용 키트.
20. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 조성물.
본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein, NP)에 특이적인 결합 능력을 가지고, 다른 코로나 바이러스에는 특이적이지 않으므로, 샘플 내 존재하는 MERS-CoV에 효과적으로 결합할 수 있다.
도 1a은 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 마우스 면역항체 제작 과정을 나타낸 도이다. 도 1b는 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 항원 단백질 (MERS-CoV NP protein)의 생산을 위한 구조체를 나타낸 도이다.
도 2a는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 아미노산 서열에 따라 분리 및 정제한 것을 나타낸 도이다. 도 2b는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 발현 부위에 따라 분리 및 정제한 것을 나타낸 도이다.
도 3a 내지 3c는 메르스 NP_NTD에 대한 Fusion screening 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 메르스 NP_NTD fusion에 대한 ELISA 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 메르스 NP_NTD 단클론에 대한 ELISA 결과를 나타낸 도이다. 도 5b는 Western blot 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6d는 메르스 NP_CTD에 대한 Fusion screening 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 메르스 NP_CTD fusion에 대한 ELISA 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 메르스 NP_CTD 단클론 3종에 대한 ELISA 테스트 결과 (교차반응 포함)를 나타낸 도이다.
도 9는 메르스 NP_NTD 단클론 항체(위), NP_CTD 단클론 항체(아래) 정제 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 항체의 결합을 확인한 것을 나타낸 도이다. 도 10b는 메르스 NP 단클론 항체의 DB 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 메르스 코로나바이러스 특이적 항체의 조합에 따른 OD 값을 나타낸다.
도 12는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 6D2 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 13은 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 6E6 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 14는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 7E9 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 15는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 8F7 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2a는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 아미노산 서열에 따라 분리 및 정제한 것을 나타낸 도이다. 도 2b는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 항원 단백질을 발현 부위에 따라 분리 및 정제한 것을 나타낸 도이다.
도 3a 내지 3c는 메르스 NP_NTD에 대한 Fusion screening 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 메르스 NP_NTD fusion에 대한 ELISA 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 메르스 NP_NTD 단클론에 대한 ELISA 결과를 나타낸 도이다. 도 5b는 Western blot 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6d는 메르스 NP_CTD에 대한 Fusion screening 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 메르스 NP_CTD fusion에 대한 ELISA 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 메르스 NP_CTD 단클론 3종에 대한 ELISA 테스트 결과 (교차반응 포함)를 나타낸 도이다.
도 9는 메르스 NP_NTD 단클론 항체(위), NP_CTD 단클론 항체(아래) 정제 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 항체의 결합을 확인한 것을 나타낸 도이다. 도 10b는 메르스 NP 단클론 항체의 DB 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 메르스 코로나바이러스 특이적 항체의 조합에 따른 OD 값을 나타낸다.
도 12는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 6D2 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 13은 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 6E6 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 14는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 7E9 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 15는 메르스 코로나바이러스 특이적 항체 중 8F7 항체의 VH 및 VL의 염기서열을 나타낸 도이다.
본 발명자들은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)에 특이적인 결합 능력을 가지고, 다른 바이러스에는 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 이의 결합 단편을 개발하였으며, 상기 항체 또는 이의 결합 단편이 메르스 코로나 바이러스의 진단, 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus, MERS-CoV)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein, NP)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 MERS-CoV의 NP에 우수한 결합능을 가진다. 일 구체예로, 본 발명의 항체는 MERS-CoV의 NP에만 특이적으로 결합함으로서 우수한 MERS-CoV의 진단, 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로블린인 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 MERS-CoV의 NP에 특이적으로 결합하는 결합 분자는 MERS-CoV의 NP에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 결합 분자는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체는 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있다.
본 명세서에서 메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, "MERS-CoV", 중동호흡기증후군 코로나 바이러스)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스로, 코로나 바이러스(Coroviridae) 군에 속하며 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스이다.
메르스는 유아부터 노년층까지 다양한 연령층에서 발병한다. 잠복기는 최소 2일에서 최대 14일이며 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이며 그 이외에도 두통, 오한, 콧물, 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다. 다만 사스와는 달리 급성 신부전증을 동반한다. 사스보다 치사율이 6배가량 높다는 조사 결과가 나오기도 하는 등 더 치명적인 양상을 보이고 있다.
상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드는 MERS 유전체가 암호화하는 총 11개의 단백질(2개의 복제 다단백질, 4개의 구조 단백질, 및 5개의 비구조적 단백질) 중 구조 단백질에 속한다. 이러한 뉴클레오캡시드는 MERS-CoV가 세포 밖에 있을 때 유전물질을 보호하고 새로운 숙주세포에 침투할 때 유전자가 그 세포 내로 유입되도록 도와주는 기능을 한다.
본 발명에서 상기 MERS-CoV 특이적 항원 예를 들어, 뉴클레오캡시드 (NP)를 인식하는 항체를 제조하고자 하였다. 구체적으로, MERS-CoV의 NP (NTD(N-terminal domain), CTD(C-terminal domain), FL(full-length))를 정제하였다. 이에, 상기 항원들을 이용하여 MERS-CoV NP_CTD 항체(mouse) 3종, MERS-CoV NP_NTD 항체(mouse) 10종 및 MERS-CoV NP_FL 항체(library) 5종을 제작하였으며, 우수한 결합 친화도를 나타내는 단일클론항체 4종 (6D2, 6E6, 7E9 및 8F7)을 선별하였다. 상기 선별된 4종의 단일클론항체는 사스 코로나 바이러스의 NP에 대하여 교차 반응성(cross-reactivity)이 없음을 확인하였다.
본 명세서에서 '항체'는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 52 및 서열번호 53 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 서열번호 54 및 서열번호 55 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 56 및 서열번호 57 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디 (diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구체예는 MERS-CoV의 NP 영역에 결합하는 Fab 절편을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 결합 분자의 기능적 변이체를 포함한다. 결합 분자들은 변이체들이 MERS-CoV의 NP 영역에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 결합 분자와 경쟁할 수 있고, MERS-CoV의 NP 영역과 결합 능력을 보유한다면 본 발명의 결합 분자의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본원 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체 (truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 MERS-CoV의 NP에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 경쇄 또는 중쇄의 상보성 결정 영역 (Complementarity-determining region, CDR)을 포함하나 이에 한정되지 않는 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit를 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자 생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 MERS-CoV 특이적 항체를 조합하여 사용하는 경우, MERS-CoV 진단 효과가 우수함을 확인하였다. 예를 들어, MERS-CoV 특이적 항체 중 2종을 페어로 사용하는 경우 우수한 MERS-CoV 진단 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로, MERS-CoV NP 6E6 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우, MERS-CoV NP 7E9 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우 및 MERS-CoV NP8F7 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우 중 선택된 어느 하나의 경우 MERS-CoV 진단 효과가 우수할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 상기 항체 또는 그의 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 염기서열; 및 서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 발현 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 58의 염기서열; 및 서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국특허등록 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않으며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다.
상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
또한, 본 발명은 항체 또는 이의 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 하이브리도마 세포는 상기 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다.
본 발명의 용어 '하이브리도마 세포'란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다.
상기 하이브리도마 세포주는, '메르스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드'를 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 상기 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 융합된 하이브리도마 세포주에서 ' 메르스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드' 단백질에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 ' 메르스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드'에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(Fusion method)에 의해 제조될 수 있다(Khler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46. 참조). 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 분비하는 '하이브리도마 세포주'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 ' 메르스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드'를 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(Limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, ' 메르스 코로나 바이러스 뉴클레오캡시드'에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역흡착분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴블럿 분석법으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(Ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.
상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 하이브리도마 세포는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 하이브리도마 세포는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 하이브리도마 세포는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 하이브리도마 세포는 서열번호 58의 염기서열; 및 서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함하는 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus) 항원을 진단하는 제제를 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 키트를 제공한다. 일 구체적예에서, 상기 바이러스 항원은 MERS-CoV의 NP이고, 상기 제제는 상기 항체 또는 이의 결합 단편인, 진단용 키트일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 진단용 키트에 사용되는 본 발명의 결합 분자는 진단 가능하게 표식될 수 있다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다. 진단 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 진단 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
본 발명의 진단용 키트는 샘플과 상기 결합 분자를 접촉시킨 후, 반응을 확인하여 MERS-CoV의 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
본 발명의 일 실시예는, a) 상기 항체; 및 b) 용기를 포함하는 키트일 수 있다. 구체적으로, 상기 a)의 항체는 MERS-CoV의 NP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있다.
또한, 본 발명은 MERS-CoV의 NP 영역에 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, MERS-CoV 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에 있어서, 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
또한, 본 발명은 MERS-CoV의 NP 영역에 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 MERS-CoV를 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예로, 본 발명은 상기 진단용 키트를 이용하여 MERS-CoV 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 상기 각 특징들은 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 각 특징들이 특허청구범위의 서로 다른 종속항에 기재된다는 사실은 이들이 조합되어 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 실험예
실험예 1. 메르스 코로나 바이러스 (MERS-CoV) NP 재조합 항원 단백질 분리 정제
MERS-CoV 특이적 항원인 뉴클레오캡시드 (NP)를 인식하는 항체를 제조하였다 (도 1a 참조). MERS-CoV NP 단백질의 아미노산 서열 1-413 부위 (full-length)와 1-164(N-terminal domain), 168-413 (C-terminal dimerization domain) 부위에 대하여 유전자 클로닝하였다 (도 1b 참조).
E. coli 발현시스템을 이용하여 바이러스 상기 항원 재조합 1-413 부위 (full-length)와 1-164(N-terminal domain), 168-413 (C-terminal dimerization domain) 부위 refolding 분리 정제 기술을 확립하여 10 mg 이상 항원 단백질을 고순도로 생산하여 마우스 면역 항체 개발에 사용하였다 (도 2a 및 2b 참조).
실험예 2. MERS-CoV NP 특이적 항체 클로닝
실험예 2.1. MERS-CoV NP_NTD 특이적 항체 클로닝
상기 분리된 항원 단백질을 이용하여 상기 항원 단백질과 결합 능력이 있는 MERS-CoV NP_NTD 특이적 단일사슬항체를 확인하였다 (도 3a 내지 3d 참조). 상기 항원 단백질과 반응(OD>0.5)하는 54개의 클론 (Clones)을 ELISA (ELISA 조건은 antigen coating: 100ng/well, 2nd Ab dilution: 1:10,000, substrate: TMB)를 통해 확인하였다 (붉은색으로 표기, H12 well은 positive control).
상기 54개의 positive clones을 24 well plate에 옮긴 후 ELISA (ELISA 조건은 antigen coating: 100ng/well, 2nd Ab dilution: 1:10,000, substrate: TMB)로 확인한 결과, 다른 코로나 바이러스 NP와는 교차반응이 없고, MERS-CoV NP_NTD와 특이적으로 반응하는 43개 클론을 확인하였다 (도 4 참조).
상기 ELISA 결과를 토대로 #2F10, #2H1, #3H3, #5F1, #6E6, #6E12, #6H6, #7E9, #7F4 및 #8F7 클론 (clone)을 선택하여 총 10종 단클론 항체 클로닝(cloning)하여 ELISA로 확인한 후, 이를 액체질소에 보관하였다.
그 결과, 정제된 항체의 순도가 낮거나 다른 코로나 바이러스 NP와 교차반응을 보이는 항체를 제외한 총 3종 단일클론항체를 확인하였다 (도 5a 및 5b 참조).
실험예 2.2. MERS-CoV NP_CTD 특이적 항체 클로닝
상기 분리된 항원 단백질을 이용하여 상기 항원 단백질과 결합 능력이 있는 MERS-CoV NP_CTD 특이적 단일사슬항체를 확인하였다 (도 6a 내지 6d 참조). 상기 항원 단백질과 반응(OD>2.0)하는 59개의 클론 (Clones)을 ELISA (ELISA 조건은 antigen coating: 100ng/well, 2nd Ab dilution: 1:10,000, substrate: TMB)를 통해 확인하였다 (붉은색으로 표기, H12 well은 positive control).
상기 59개의 positive clones을 24 well plate에 옮긴 후 ELISA (ELISA 조건은 antigen coating: 100ng/well, 2nd Ab dilution: 1:10,000, substrate: TMB)로 확인한 결과, 다른 코로나 바이러스 NP와는 교차반응이 없고, MERS-CoV NP_CTD와 특이적으로 반응하는 43개 클론을 확인하였다 (도 7 참조).
상기 ELISA 결과를 토대로 #4D5, #5G2 및 #6D2 클론 (clone)을 선택하여 총 3종 단클론 항체 클로닝(cloning)하여 ELISA로 확인한 후, 이를 액체질소에 보관하였다 (도 8 참조).
실험예 3. MERS-CoV NP 특이적 항체 정제 및 결합력 확인
상기 클로닝된 메르스 NP_NTD 단클론 항체 #6E6, #7E9, #8F7과 메르스 NP_CTD 단클론 항체 #4D5, #5G2, #6D2 mouse ascites를 각 10 mL씩 Protein A column으로 IgG를 정제하고 BCA법 (BGG 스탠다드 사용)으로 정량하였으며, 정제된 항체를 SDS-PAGE한 후 Coomassie blue로 염색하여 순도를 확인하였다 (도 9 참조).
상기 정제된 메르스 단일클론항체 6종에 대하여 Sf9 cell 발현 항원에 대하여 결합력을 가지고 있음을 Western blot (WB), Dot blot (DB) 실험을 통해 확인하였다 (도 10a 및 10b 참조).
그 결과, 상기 6종 중 4종에 대해서는 판매되는 항체와 유사한 결합력을 가지고 있었고, 사스바이러스 NP에 대해서는 교차반응이 일어나지 않으므로 메르스 코로나 바이러스에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 메르스 코로나 바이러스 특이적 진단에 상기 항체들을 이용할 수 있다는 것을 의미한다.
실험예 3. 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 페어 선정
MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 항원 부위 중 특정 에피토프와 결합하는 항체들을 조합하여 사용하는 경우에 OD 값 (OD Value) 비교를 통해 MERS-CoV 검출 효과를 확인하였으며, 우수한 결합 친화도를 나타내는 항체 4종 (6D2, 6E6, 7E9 및 8F7)을 선별하고 각각의 조합의 결합성을 비교하였다 (도 11 참조).
그 결과, MERS-CoV NP 6E6 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우, MERS-CoV NP 7E9 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우 및 MERS-CoV NP8F7 및 MERS-CoV NP 6D2에 특이적으로 결합하는 항체를 페어로 사용하는 경우에 가장 높은 OD 값을 나타냄을 확인하였다.
이는 상기 항체 페어를 이용하는 경우에, 다른 경우에 비해 MERS-CoV 검출 효과가 더 뛰어남을 나타낸다.
실험예 4. 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 서열 분석
상기 메르스 바이러스 특이적 항체 중, 상기 4종에 대한 서열을 분석하였다.
표 1은 상기 항체 중 6D2에 대한 서열이다.
| 서열번호 | 서열 | 명칭 |
| 1 | GFNIKDTY | CDR 1_VH |
| 2 | IDPANGNT | CDR 2_VH |
| 3 | VSDGNYVNYAMDY | CDR 3_VH |
| 4 | QSVDYDGDSY | CDR 1_VK |
| 5 | AAS | CDR 2_VK |
| 6 | QQSDEDPYT | CDR 3_VK |
| 7 | GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAATCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTTTATTACTGTGTTAGCGATGGTAACTACGTAAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA | VH 염기서열 |
| 8 | GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTGATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA | VL 염기서열 |
| 9 | EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS | FR1_VH |
| 10 | MHWVNQRPEQGLEWIGR | FR2_VH |
| 11 | KYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYC | FR3_VH |
| 12 | WGQGTSVTVSS | FR4_VH |
| 13 | DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKAS | FR1_VK |
| 14 | MNWYQQKPGQPPKLLIY | FR2_VK |
| 15 | NLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC | FR3_VK |
| 16 | FGGGTKLEIK | FR4_VK |
표 2은 상기 항체 중 6E6에 대한 서열이다.
| 서열번호 | 서열 | 명칭 |
| 17 | GFSLTTYG | CDR 1_VH |
| 18 | IWGDGTT | CDR 2_VH |
| 19 | AKGGGRGGFDY | CDR 3_VH |
| 20 | ENIYSY | CDR 1_VK |
| 21 | NAK | CDR 2_VK |
| 22 | QHHYGTPWT | CDR 3_VK |
| 23 | CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCACCTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGAGTCTGGAGTGGCTGGGACTAATATGGGGTGACGGGACCACAAATTATCATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAAGATAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAAGGGGGTGGGAGGGGGGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA | VH 염기서열 |
| 24 | GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCGCCAAGCTGGAAATCAAA | VL 염기서열 |
| 25 | QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS | FR1_VH |
| 26 | VSWIRQPPGKSLEWLGL | FR2_VH |
| 27 | NYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYC | FR3_VH |
| 28 | WGQGTTLTVSS | FR4_VH |
| 29 | DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRAS | FR1_VK |
| 30 | LAWYQQKQGKSPQLLVY | FR2_VK |
| 31 | TLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC | FR3_VK |
| 32 | FGGGAKLEIK | FR4_VK |
표 3은 상기 항체 중 7E9에 대한 서열이다.
| 서열번호 | 서열 | 명칭 |
| 33 | GFTFSNY | CDR 1_VH |
| 34 | IRLKSNNYAT | CDR 2_VH |
| 35 | IRQAKLLGYAMDY | CDR 3_VH |
| 36 | QDISNY | CDR 1_VK |
| 37 | YTS | CDR 2_VK |
| 38 | QQVNTLPYT | CDR 3_VK |
| 39 | GAGGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTATTAGGCAGGCCAAACTTTTGGGCTATGCTATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG | VH 염기서열 |
| 40 | GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGTTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA | VL 염기서열 |
| 41 | EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVAS | FR1_VH |
| 42 | WMNWVRQSPEKGLEWVAE | FR2_VH |
| 43 | HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYC | FR3_VH |
| 44 | WGQGTSVTVSS | FR4_VH |
| 45 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRAS | FR1_VK |
| 46 | LNWYQQKPDGTVKLLIY | FR2_VK |
| 47 | RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC | FR3_VK |
| 48 | FGGGTKLEIK | FR4_VK |
표 4는 상기 항체 중 8E7에 대한 서열이다.
| 서열번호 | 서열 | 명칭 |
| 49 | GFSLISYG | CDR 1_VH |
| 50 | IWGDGST | CDR 2_VH |
| 51 | AKKSYYGMDY | CDR 3_VH |
| 52 | QDISNY | CDR 1_VK |
| 53 | QSLVHSNGNTY | CDR 1_VK |
| 54 | LNWYQQKPDGTVKLLIY | CDR 2_VK |
| 55 | LYWYLQKPGQSPKLLIY | CDR 2_VK |
| 56 | RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISDLEQEDIATYFC | CDR 3_VK |
| 57 | NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC | CDR 3_VK |
| 58 | CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAATCAGCTATGGTGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAGCACAAAATATCATTCAGTTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGATAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAAAAAAGTTACTATGGTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA | VH 염기서열 |
| 59 | GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCGACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA | VL 염기서열 |
| 60 | GATGTTGTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTATACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA | VL 염기서열 |
| 61 | QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS | FR1_VH |
| 62 | VSWVRQPPGKGLEWLGV | FR2_VH |
| 63 | KYHSVLISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYC | FR3_VH |
| 64 | WGQGTSVTVSS | FR4_VH |
| 65 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRAS | FR1_VK |
| 66 | DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSS | FR1_VK |
| 67 | LNWYQQKPDGTVKLLIY | FR2_VK |
| 68 | LYWYLQKPGQSPKLLIY | FR2_VK |
| 69 | RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISDLEQEDIATYFC | FR3_VK |
| 70 | NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC | FR3_VK |
| 71 | FGGGTKLEIK | FR4_VK |
| 72 | FGGGTKLEIK | FR4_VK |
실험예 4. 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트 제작
상기 분석된 항체 4종 (6D2, 6E6, 7E9 및 8F7)을 포함하는 MERS-CoV 검출용 키트를 제조하였다.
상기 제조된 검출용 키트에 MERS-CoV 샘플 및 사스 코로나 바이러스 샘플을 농도별로 처리하여, 특이적인 검출 반응이 일어나는지 확인하였다.
그 결과, MERS-CoV 샘플에 대해서는 검출 반응이 나타났으나, 사스 코로나 바이러스 샘플에 대해서는 반응이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 상기 항체 4종을 포함하는 MERS-CoV 검출용 키트를 이용하여, 신속하고 정확하게 MERS-CoV를 검출할 수 있음을 의미한다.
<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE
<120> Antibody for Detection Specific for Nucleocapsid protein of
MERS-Corona Virus and Use thereof
<130> PD21-444
<160> 72
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VH
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VH
<400> 2
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VH
<400> 3
Val Ser Asp Gly Asn Tyr Val Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VK
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Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VK
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Ala Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VK
<400> 6
Gln Gln Ser Asp Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VH
<400> 7
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaatcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgttt attactgtgt tagcgatggt 300
aactacgtaa actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
360
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<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VL
<400> 8
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aagaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtgatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VH
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 10
<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VH
<400> 10
Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 11
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VH
<400> 11
Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VH
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VK
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VK
<400> 14
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VK
<400> 15
Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VK
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VH
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Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly
1 5
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<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VH
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Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VH
<400> 19
Ala Lys Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VK
<400> 20
Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VK
<400> 21
Asn Ala Lys
1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VK
<400> 22
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
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<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VH
<400> 23
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc acctatggtg taagctggat tcgccagcct 120
ccaggaaaga gtctggagtg gctgggacta atatggggtg acgggaccac aaattatcat 180
tcagctctca tatccagact gagcatcagc aaagataact ccaagagcca agttttctta 240
aaactgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccacgtact actgtgccaa agggggtggg 300
agggggggtt ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VL
<400> 24
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcgccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VH
<400> 25
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VH
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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10 15
Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VH
<400> 27
Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VH
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VK
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VK
<400> 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
1 5 10 15
Tyr
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<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VK
<400> 31
Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Cys
35
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VK
<400> 32
Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VH
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VH
<400> 34
Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VH
<400> 35
Ile Arg Gln Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VK
<400> 36
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VK
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Tyr Thr Ser
1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VK
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Gln Gln Val Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 367
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VH
<400> 39
gaggtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180
cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtattagg 300
caggccaaac ttttgggcta tgctatggat tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctcag 367
<210> 40
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VL
<400> 40
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag gttaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 41
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 42
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VH
<400> 42
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
1 5 10 15
Ala Glu
<210> 43
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VH
<400> 43
His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VH
<400> 44
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VK
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VK
<400> 46
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 47
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VK
<400> 47
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 48
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VK
<400> 48
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VH
<400> 49
Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Gly
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VH
<400> 50
Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VH
<400> 51
Ala Lys Lys Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VK
<400> 52
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR1_VK
<400> 53
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VK
<400> 54
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR2_VK
<400> 55
Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 56
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VK
<400> 56
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
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<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV CDR3_VK
<400> 57
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 58
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VH
<400> 58
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctcagggtt ctcattaatc agctatggtg taagctgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg acgggagcac aaaatatcat 180
tcagttctca tatccagact gagcatcagc aaggataact ccaagagcca agttttctta 240
aaactgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccacgtact actgtgccaa aaaaagttac 300
tatggtatgg actattgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348
<210> 59
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VL
<400> 59
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcga cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
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<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV VL
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atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttatactgg 120
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tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
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<400> 61
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Val
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 63
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35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR4_VH
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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VK
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR1_VK
<400> 66
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20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VK
<400> 67
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR2_VK
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Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV FR3_VK
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<223> MERS-CoV FR4_VK
<400> 72
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1 5 10
Claims (20)
- 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)에 특이적으로 결합하며,
중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 52 및 서열번호 53 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VK, 서열번호 서열번호 54 및 서열번호 55 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VK 및 서열번호 56 및 서열번호 57 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VK를 포함하는 것을 특징으로 하는, 메르스 코로나 바이러스 특이적 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 Fab 절편인, 항체 또는 이의 결합 단편.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 염기서열; 및
서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터.
- 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
- 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
- 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 염기서열 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
- 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 염기서열; 및
서열번호 59 및 서열번호 60 중 선택된 어느 하나 이상의 염기서열;을 포함하는 것인, 발현 벡터.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포.
- 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus) 항원을 검출하는 제제를 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 키트로서,
상기 바이러스 항원은 메르스 코로나 바이러스 (MERS-Corona Virus)의 뉴클레오캡시드 단백질 (Nucleocapsid protein)이고,
상기 제제는 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편인, 진단용 키트.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는, 메르스 코로나 바이러스 진단용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220021390A KR20230124280A (ko) | 2022-02-18 | 2022-02-18 | 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220021390A KR20230124280A (ko) | 2022-02-18 | 2022-02-18 | 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230124280A true KR20230124280A (ko) | 2023-08-25 |
Family
ID=87847027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220021390A KR20230124280A (ko) | 2022-02-18 | 2022-02-18 | 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적인 진단용 항체 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230124280A (ko) |
-
2022
- 2022-02-18 KR KR1020220021390A patent/KR20230124280A/ko unknown
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