CN110590943B

CN110590943B - 抗登革热病毒抗体及其应用

Info

Publication number: CN110590943B
Application number: CN201910505187.3A
Authority: CN
Inventors: 赖思佳; 黄郁茵; 林昌棋; 魏俊杰; 蔡孟宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110590943A; US20190375826A1; US10526398B2; SG10201905229VA

Abstract

本发明涉及抗登革热病毒抗体及其应用。特定而言，本发明的抗病毒登革病毒抗体为血清型专一性，可用于生物样本中各种登革病毒血清型的专一性检测及分化。本发明还提供了用于检测登革病毒的方法及套组，以及使用如本文所述的抗病毒登革病毒抗体诊断及治疗登革病毒病的方法及组合物。

Description

抗登革热病毒抗体及其应用

相关申请案

本申请案主张2018年6月12日申请之美国发明专利申请案第16/006,000号之优先权，其内容在此全部并入作为参考资料。

技术领域

本发明涉及抗登革病毒抗体及其应用。特定而言，本发明之抗病毒登革病毒抗体为血清型专一性，可用于生物样本中各种登革病毒血清型的专一性检测及分化。本发明还提供了用于检测登革病毒之方法及套组，以及使用如本文所述之抗病毒登革病毒抗体诊断及治疗登革病毒病之方法及组合物。

背景技术

现今世界上约有39亿人口生活在有登革热传播危险的地区。估计每年有1亿例登革热感染，包括250,000-500,000例重症病例及约25,000例死亡。登革热为一种由蚊子传播的病毒性疾病，由四种登革病毒血清型(DENV1、DENV2、DENV3及 DENV4)中的任何一种传播所引起。在全球范围内，登革热大多由两种主要的蚊子传播：埃及斑蚊(Aedes aegypti)(适应城市)及白线斑蚊(Aedes albopictus)。登革热的迅速蔓延归因于热带及亚热带国家的城市化、登革热流行地区的国家内部及国家之间的旅行增加，以及无效的病媒控制策略。实际上，登革热的疾病及经济负担已成为全球公共卫生问题。

迄今为止，尚未有有效的抗病毒药物可用于治疗登革感染，且疫苗仍处于评估阶段。此外，一种登革病毒血清型的感染赋予相同血清型终身免疫力，但当感染另一种血清型时，增加了发生严重登革热的风险。因此，早期诊断DENV对于疾病管理非常重要。登革病毒感染的早期诊断将干涉治疗患者及控制流行病。感染登革病毒的人类表现出广泛的临床表现，从无症状感染到严重的登革热，使得准确的诊断变得困难。目前登革热的实验室诊断测试包括分离病毒、病毒RNA检测、抗原检测及血清学方法。病毒分离及病毒RNA检测在疾病的前五(5)天内有效；这两种方法都可以识别登革病毒的血清型。然而，病毒分离很耗时，且病毒RNA检测需要特殊设备及培训人员。抗DENV IgM或IgG抗体仅在疾病发作后5天出现在血液中，且可能与其他黄病毒交叉反应；因此，在症状出现的前5天内检测抗DENVIgM或IgG无法确认病毒的存在，并且可能经常发生伪阳性结果。

在该疾病的急性期(即，疾病发作后第1天及第7天之间)，登革病毒非结构蛋白 1(nonstructural protein 1，NS1)，一种50kDa糖蛋白，在患者血清中分泌并积聚至高浓度。在感染后1至9天内可确认人类血清中NS1的存在。此外，当以RT-PCR检测不到病毒RNA且在IgM抗体出现之前，可以检测到NS1蛋白。NS1蛋白为早期诊断标记物的良好目标。NS1蛋白的抗原检测试验可以简单、低成本、处理大量样本，以及快速的方式进行DENV的早期诊断。然而，虽然有几种市售NS1检测试验可用于在疾病的早期阶段诊断登革热，但它们都不能区分各种登革热的血清型。

仍然需要开发能够检测及区分各种登革热血清型的诊断技术。

发明内容

本发明基于许多分离的抗体的鉴定，这些抗体出乎意料地表现出对各登革病毒血清型的优异专一性。本发明之每种血清型专一性抗体能够检测登革病毒的一种特定血清型而基本上不与其他血清型交叉反应。本发明提供了这样的抗体及其抗原结合片段，以及包含它们的组合物及套组，以及使用它们的方法。本发明可用于专一性检测样本中的一种或多种登革病毒血清型，具体而言是来自怀疑被病毒感染的患者的样本。本发明还提供了对登革病毒专一的交叉反应性抗体(所有血清型)，其可以与本文所述之任何血清型专一性抗体配对，用于免疫测定以检测样本中的登革病毒。

于一方面，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体系选自由下列所组成之群组：

(i)专一于登革病毒血清型第1型(DENV1)之第一抗体，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含如SEQ ID NO:2所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ ID NO:4所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:6 所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)一轻链可变区(V_L)，包含SEQ ID NO:9所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、SEQID NO:11所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:13 所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(ii)专一于登革病毒血清型第2型(DENV2)之第二抗体，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含SEQ ID NO:16所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、 SEQID NO:18所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:20所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含SEQ ID NO:23所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、 SEQID NO:25所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:27所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(iii)专一于登革病毒血清型第3型(DENV3)之第三抗体，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含SEQ ID NO:30所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、 SEQID NO:32所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:34所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含SEQ ID NO:37所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、 SEQID NO:39所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:41所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(iv)专一于登革病毒血清型第4型(DENV4)之第四抗体，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含SEQ ID NO:44所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、 SEQID NO:46所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:48所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(VL)，包含SEQ ID NO:51所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、 SEQID NO:53所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:55所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(v)与登革病毒血清型第1型、第2型、第3型，以及第4型(DENV1、DENV2、 DENV3，以及DENV4)交叉反应之第五抗体，包含

(a)重链可变区(V_H)，一如SEQ ID NO:58所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、 SEQID NO:60所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:62所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含SEQ ID NO:65所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、 SEQID NO:67所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:69所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；以及

(vi)任何(i)至(v)之组合。

于某些具体实施例中，该第一抗体包含包含SEQ ID NO:71的重链可变区(V_H) 以及包含SEQ ID NO:72的轻链可变区(V_L)。

于某些具体实施例中，该第二抗体包含包含SEQ ID NO:73的重链可变区(V_H) 以及包含SEQ ID NO:74的轻链可变区(V_L)。

于某些具体实施例中，该第三抗体包含包含SEQ ID NO:75的重链可变区(V_H) 以及包含SEQ ID NO:76的轻链可变区(V_L)。

于某些具体实施例中，该第四抗体包含包含SEQ ID NO:77的重链可变区(V_H) 以及包含SEQ ID NO:78的轻链可变区(V_L)。

于某些具体实施例中，该第五抗体包含包含SEQ ID NO:79的重链可变区(V_H) 以及包含SEQ ID NO:80的轻链可变区(V_L)。

本发明之登革病毒专一性抗体可为全长抗体。本发明抗体之抗原结合片段可为scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、F(ab’)²。

另一方面，本发明提供了一种核酸，其包含编码抗体重链可变区(V_H)或抗体轻链可变区(V_L)或两者的核苷酸序列，其中该V_H及V_L如本文所述。

本发明还提供了包含本文所述之任何核酸的载体(例如，表现载体)及包含这种载体的宿主细胞。

本发明进一步提供了一种制备登革病毒专一性抗体之方法，包含(i)在允许表现抗体的条件下培养如本文所述之宿主细胞，及可选择地(ii)从细胞陪养中收获抗体。

于另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含(a)本文所述之对登革病毒专一的任何抗体，如本文所述之任何核酸，或本文所述之任何载体；及(b)载体，例如，医药上可接受之载体。

于某些具体实施例中，本发明之组合物为用于治疗登革病毒疾病之医药组合物。

于某些具体实施例中，本发明之组合物为用于诊断登革病毒疾病之诊断组合物。

于另一方面，本发明提供了一种在怀疑含有该登革病毒的样本中检测登革病毒之方法，包含使该样本与如本文所述之专一于登革病毒的分离的抗体或其抗原结合片段接触，并测定该抗体与该样本的结合。该结合的结果用于确定样本中各登革病毒血清型的存在。特定而言，(i)该第一抗体与该样本的结合表示在该样本中存在DENV1；(ii)该第二抗体与该样本的结合表示在该样本中存在DENV2；(iii) 该第三抗体与该样本的结合表示在该样本中存在DENV3；及/或(iv)该第四抗体与该样本的结合表示在该样本中存在DENV4。于某些具体实施例中，本发明之相应血清型专一性抗体与配偶体抗体配对以进行夹心式测定。

于另一方面，本发明提供了一种用于在样本中检测一种或多种登革病毒血清型的存在之套组，包含一种或多种本文所述之登革病毒血清型专一性抗体及任选的配偶体抗体。该配偶体抗体可为登革病毒的血清型交叉反应抗体，例如，如本文所述之第五抗体。

于某些具体实施例中，该套组中的至少一种抗体包含可侦测到的标记。

该可侦测到的标记之实例包括，但不限于，酶标记、荧光标记、金属标记，以及放射性标记。

于某些具体实施例中，该套组为免疫测定套组。

该免疫测定之实例包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、荧光免疫测定(fluorescence immunoassay，FIA)、发光免疫测定(luminescence immunoassay， LIA)，或ILMA免疫荧光测定。

于某些具体实施例中，该免疫测定系以侧流测定形式进行。

具体而言，该免疫测定为夹心式测定。

于下面的描述中阐述了本发明之一个或多个具体实施例之细节。从以下几个具体实施例的详细描述以及所附申请专利范围中，本发明之其他特征或优点将变得显而易见。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明之以下详细描述。出于说明本发明之目的，在附图中示出了目前较佳的具体实施例。然而，应当理解的是，本发明不限于所示的精确布置及手段。

于附图中：

图1A所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)作为捕获抗体，并与一作为侦测抗体的登革病毒的血清型交叉反应抗体配对的夹心式(捕获)ELISA之基本设计。

图1B所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)，12-4.1、33-7.1、 43-1.3，以及22-1.5作为捕获抗体，并与一作为侦测抗体的登革病毒的血清型交叉反应抗体配对的夹心式(捕获)ELISA中的检测结果。在该测定中，以来自被 DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero细胞的细胞培养上清液作为 NS1抗原之来源，并以来自未感染的Vero细胞的上清液作为阴性对照组。

图2A所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)作为侦测抗体，并与一作为捕获抗体的登革病毒的血清型交叉反应抗体配对的夹心式(捕获)ELISA之基本设计。

图2B所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)，12-4.1、33-7.1、 43-1.3，以及22-1.5作为侦测抗体，并与一作为捕获抗体的登革病毒的血清型交叉反应抗体配对的夹心式(捕获)ELISA中的检测结果。在该测定中，以来自被 DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero细胞的细胞培养上清液作为 NS1抗原之来源，并以来自未感染的Vero细胞的上清液作为阴性对照组。

图3所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)，12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5作为侦测抗体，并与一作为捕获抗体的登革病毒的血清型交叉反应抗体配对的夹心式(捕获)ELISA中的灵敏度。以每种DENV血清型的连续稀释及纯化的 NS1蛋白进行捕获ELISA，以确定本发明血清型专一性单株抗体(mAbs)的侦测极限。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)建立基线。每个数据点代表三次重复测试的平均值±标准偏差(SD)。

图4所示为使用本发明之血清型专一性单株抗体(mAbs)作为捕获抗体(上图)或侦测抗体(下图)，并与一登革病毒的血清型交叉反应抗体(单株抗体82-1.1)配对的夹心式条带的基本设计。

图5所示为本发明之夹心式条带之特性。将血清型专一性单株抗体(mAbs) 12-4.1、33-7.1、43-1.3，以及22-1.5与登革病毒的血清型交叉反应抗体(单株抗体 82-1.1)配对，作为捕获及侦测抗体，然后测试结合专一性。在该测定中，以来自被 DENV1、DENV2、DENV3、DENV4或JEV感染的Vero细胞的细胞培养上清液作为 NS1抗原的来源，并以来自未感染的Vero细胞的上清液作为阴性对照组。

图6A至图6F包括显示用于测试急性发热患者血清的本发明之夹心式(捕获)ELISA的专一性的图表。图6A所示为以DENV1感染的17名患者的血清的ELISA测试结果。图6B所示为以DENV2感染的19名患者的血清的ELISA测试结果。图6C所示为以DENV3感染的16名患者的血清的ELISA测试结果。图6D所示为以DENV4感染的9名患者的血清的ELISA测试结果。图6E所示为以DENVs感染的5名患者的血清的ELISA测试结果。图6F所示为80名其他发热患者血清的ELISA试验结果。通过将患者血清的OD450值除以所有阴性健康正常血清样本的OD450平均值(即，患者血清OD450/阴性健康正常血清的平均OD450)来计算T/N比。如果样本的OD450值至少为阴性对照组的平均值的两倍，则认为该样本为阳性的。

图7所示为本发明之抗体的重链及轻链的CDR序列。

图8所示为本发明抗体的重链及轻链序列。

具体实施方式

本发明涉及血清型专一性的抗病毒登革病毒抗体。本发明提供了这样的抗体及其抗原结合片段，其可用于在生物样本中专一地检测及分化各种登革病毒血清型。本发明进一步提供了制备抗体或其抗原结合片段的方法及载体，以及包含它们的套组及组合物，以及使用它们来检测登革病毒及诊断及治疗登革病毒病之方法。本发明进一步提供了对登革病毒专一的交叉反应性抗体，其可以与本文所述之任何血清型专一性抗体配对，用于免疫测定以检测样本中的登革病毒。

以下描述仅旨在说明本发明之各种具体实施例。因此，本文讨论的具体具体实施例或修改不应解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明之范围的情况下，可以进行各种改变或等同物。

I.定义

为了提供对本发明清楚及快速的理解，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。除非另外定义，否则本文所用之所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义之相同的含义。“”

如本文所用，单数形式“一”、“一个”及“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个组件”包括多个这样的组件及其本领域技术人员已知的等同物。

“包含(动词)”或“包含(动名词)”等词通常以包括(动词)/包括(动名词)的含义使用，其意味着允许存在一种或多种特征、成分或组分。术语“包含(动词)”或 “包含(动名词)”包括术语“组成”或“由......组成”。

如本文所用，“多胜肽”乙词系指由通过胜肽键连接的胺基酸残基组成的聚合物。“蛋白质”乙词通常系指相对较大的多胜肽。“胜肽”乙词通常系指相对短的多胜肽(例如，含有至多100、90、70、50、30，或20个胺基酸残基)。

如本文所用，“约”或“近似”等词系指本领域普通技术人员将理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上变化，这取决于其所用之上下文。通常，“约”或“近似”可以表示在引用值附近具有±10％范围的数值。

如本文所用，“基本上相同”乙词系指两个序列具有80％或更多，较佳为85％或更多，更佳为90％或更多，甚至更佳为95％或更多的同源性。

如本文所用，“抗体”乙词(可互换地以复数形式使用)系指具有专一性结合特定目标抗原之能力的免疫球蛋白分子。如本文所用，“抗体”乙词不仅包括完整的 (即，全长的)抗体分子，还包括其保留抗原结合能力的抗原结合片段，例如，Fab、 Fab'、F(ab')2及Fv。此类片段也是本领域熟知的，并且通常在体外及体内使用。“抗体”乙词还包括人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多专一性抗体(例如，双专一性抗体)，以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，其包含具有所需专一性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的胺基酸序列变体，以及共价修饰的抗体。

一个完整或完全的抗体包含两条重链及两条轻链。每条重链含有可变区(V_H) 及第一、第二及第三恒定区(C_H1、C_H2及C_H3)；每条轻链含有一可变区(V_L)及一恒定区(C_L)。抗体具有“Y”形状，Y的茎部由透过双硫键结合在一起的两条重链的第二及第三恒定区所组成。Y的每个臂部包括与一单个轻链的可变区及恒定区结合的一单个重链的可变区及第一恒定区。该轻链的可变区及重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常包含三个高度可变区，称为互补决定区 (complementarity determining regions，CDRs)；亦即，轻(L)链CDRs包括LC CDR1、 LC CDR2，以及LC CDR3，以及重(H)链CDRs包括HC CDR1、HC CDR2，以及HC CDR3。三个CDRs由框架区(FR1、FR2、FR3，以及FR4)标记，其比该CDRs更高度保守并形成支持高变异区的支架。该重链及轻链的恒定区不负责抗原结合，但涉及各种效应子的功能。取决于其重链恒定结构域的抗体胺基酸序列，可以将免疫球蛋白分配到不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG，以及 IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1，以及IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、 γ，以及μ。

如本文所用，“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”等词系指完整抗体分子中负责抗原结合的部分或区域。抗原结合片段能够结合亲本抗体结合的相同抗原。抗原结合片段的实例包括，但不限于：(i)Fab片段，其可以是由V_H-C_H1链以及V_L-C_L链组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其可以是由在铰链区通过双硫键连接的两个 Fab片段组成的二价片段；(iii)Fv片段，由透过非共价相互作用结合在一起的抗体分子的V_H及V_L结构域组成；(iv)单链Fv(scFv)，其可以是通过胜肽连接符由V_H结构域及V_L结构域组成的单一多胜肽链；(v)(scFv)₂，其可包含透过一胜肽连接符连接的两个V_H结构域，以及两个V_L结构域，其通过双硫键与两个V_H结构域链接。

如本文所用，“嵌合抗体”乙词系指含有来自不同来源(例如，不同物种)的多胜肽之抗体。于某些具体实施例中，在这些嵌合抗体中，轻链及重链的可变区可以模拟源自一种哺乳动物(例如，非人类哺乳动物，例如小鼠、兔及大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分可以与衍生自另一种哺乳动物例如人类的抗体中的序列同源。

如本文所用，“人源化抗体”乙词系指包含来自一人类抗体的一框架区以及来自一非人类(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDRs的抗体。

如本文所用，“人类抗体”乙词系指其中基本上轻链及重链序列的完整序列(包括互补决定区(CDRs))来自人类基因的抗体。该人类抗体可包括一个或多个不由人类种系免疫球蛋白序列编码的胺基酸残基，例如，透过一个或多个CDRs中的突变，或在一个或多个FRs中的突变，以便例如降低可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能导致不期望的折迭的半胱胺酸等。

如本文所用，“分离的”物质意指透过人类的手其已被从天然状态改变。于某些具体实施例中，若本发明之多胜肽(例如，抗体)或核酸基本上不含细胞材料或化学前驱物或可能涉及胜肽/核酸制备过程的其他化学物/组成分时，则可以说它们是 “分离的”或“纯化的”。应当理解的是，“分离的”或“纯化的”等词不一定反映该胜肽被“绝对”分离或纯化的程度，例如，透过去除所有其他物质(例如，杂质或细胞成分)。于某些情况下，例如，分离的或纯化的多胜肽包括含有具有少于 50％、40％、30％、20％或10％(按重量计)的其他蛋白质(例如，细胞蛋白质)的多胜肽的制剂，具有少于50％、40％、30％、20％或10％(按体积计)的培养基，或具有少于50％、40％、30％、20％或10％(按重量计)的化学前驱物或其他合成程序中涉及的化学物/组成分。

如本文所用，“专一性的结合”或“专一性地结合”等词系指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体与其标靶抗原的表位之结合。“专一性地结合”标靶抗原或表位的抗体是本领域熟知的术语，确定这种专一性地结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与其他标靶/表位相比更频繁、更快速地、更长时间地及/或与特定标靶抗原或表位的亲和力更强地反应或结合，则称其表现出“专一性地结合”。如果抗体以比与其他物质结合的更大的亲和力、亲留力，更容易，及/或持续更长的时间结合，则抗体“专一性地结合”标靶抗原。换句话说，透过阅读该定义还可以理解，例如，专一性结合第一标靶抗原的抗体可以或可以不专一性或优先的结合第二标靶抗原。因此，“专一性的结合”或“优先的结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常但非必要地，对结合的提及意指专一性的/优先的结合。结合的亲和力根据解离常数(K_D)来定义。通常，当针对抗体使用时专一性地结合可以指专一性地结合(识别)其标靶抗体，其KD值小于约10^～7M，例如约10^～8M或更低，例如约10^～ ⁹M以下，约10^～10M以下，约10^～n M以下，约10^～12M以下，或甚至更低，以与K_D对应的亲和性结合特定标靶，比其与非专一性抗原(例如BSA或酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000 倍。

如本文所用，“交叉反应性”乙词可以指抗体与不同蛋白质上的类似抗原位点反应的能力。例如，登革病毒血清型的交叉反应抗体可以意指这种抗体可以与登革病毒的一种以上血清型(例如，登革病毒的所有四种血清型)或甚至其它黄病毒例如兹卡病毒及/或日本脑炎病毒交叉反应(即结合抗体)，而不是仅与一种特定血清型的登革病毒发生专一性反应。

登革病毒是单链RNA病毒，其为黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的成员。如本文所用，登革病毒系指登革病毒的任何血清型，包括登革病毒血清型第1型(DENV1)、登革病毒血清型第2型(DENV2)、登革病毒血清型第3型 (DENV3)，以及登革病毒血清型第4型(DENV4)。那些不同的登革病毒血清型为遗传相关的，但抗原性不同。免疫力为血清型专一性的，且血清型之间没有交叉保护，即一种血清型的感染不能保护人类免受其他血清型的影响。血清型可透过本领域已知的常规方法测定，例如使用专一性引子组(TS1、TS2、TS3或TS4，连同 D1)的RT-PCR，以扩增来自编码登革病毒的衣壳及膜蛋白的区域的血清型专一性片段，例如Konogoi等人于Virology Journal(2016)13:182所述。本技术中可获得每种登革病毒血清型的典型菌株，例如DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241。

如本文所用，“登革病毒疾病”或“登革热”等词系指由登革病毒感染引起的疾病，通常由蚊子传播。患有登革病毒感染的人类可能没有任何征兆，或有从轻微到严重的症状。出现症状时，通常在感染后3至14天开始。典型的登革热(dengue fever，DF)经常出现发烧、头痛、严重的肌肉及关节疼痛、恶心及皮疹，而严重形式(DHF/DSS)的特点是DF的所有症状，伴随出血表现(牙龈或鼻子，尿液，粪便或皮下出血)、严重的腹痛、持续性呕吐、疲劳、烦躁或焦躁不安，如果不及时治疗，可能会危及生命。

“NS1”、“NS1多胜肽”及“NS1蛋白”等词在本文中可互换使用。NS1系指由登革病毒编码的非结构性醣蛋白，其与细胞表面上的膜结合，且最早在症状发作后1天释放到体循环中，并且至少在感染后约9天可被侦测到。因此，NS1成为诊断登革热感染的良好标记物，尤其是在早期阶段。成熟形式的NS1含有352个胺基酸残基，具有约40kDa或更高的分子量，这取决于糖基化程度。NS1为血清型专一性的且来自不同登革病毒血清型的NS1的胺基酸序列为本领域已知且可获得的，例如，来自DENV1的NS1(DENV1NS1)的SEQ ID NO:91，来自DENV2的NS1 (DENV2NS1)的SEQ ID NO:92，来自DENV3的NS1(DENV3NS1)的SEQ ID NO: 93，以及来自DENV4的NS1(DENV4NS1)的SEQ ID NO:94。NS1可以透过本领域已知的重组方法制备，或者可以从登革病毒的培养上清液中制备及收获，例如， DENV1 Hawaii用于生产DENV1NS1，DENV2 16681用于生产DENV2NS1，DENV3 H87用于生产DENV3NS1，DENV4 H241用于生产DENV4NS1。

表1显示了DENV1、DENV2、DENV3以及DENV4的NS1之示例性胺基酸序列。

“核酸”或“多核苷酸”等词可以指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸类似物。多核苷酸可以例如使用自动DNA合成仪合成。应当理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C) 表示时，这也包括其中“U”取代的“T”(即A、U、G、C)的RNA序列。“cDNA” 乙词系指以单链或双链形式与mRNA互补或相同的DNA。

“互补”乙词系指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑兼容性或匹配在一起。因此，该两个分子可以描述为互补的，此外接触表面特征彼此互补。当第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同时，第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列5'-TATAG-3'的多核苷酸与序列为 5'-CTATA-3'的多核苷酸互补。

“编码”乙词系指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如，基因，cDNA，或mRNA) 的固有特性，以作为在生物过程中合成其他聚合物及巨分子的模板，这些生物过程具有给定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或给定的胺基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录及转译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸及核酸可以编码相同的多胜肽。还应理解的是，技术人员可以使用常规技术进行不影响由那里描述的多核苷酸编码的多胜肽序列的核苷酸取代，以反映其中表现多胜肽的任何特定宿主生物体使用的密码子。因此，除非另有说明，“编码胺基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。

“重组核酸”乙词系指具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重组核酸可以以载体的形式存在。“载体”可含有给定的目标核苷酸序列及调节序列。载体可用于表现给定的核苷酸序列(表现载体)或维持给定的核苷酸序列以使其复制、操作或在不同位置之间(例如，在不同生物体之间)转移。为了上述目的，可以将载体引入合适的宿主细胞中。“重组细胞”系指已经向其中引入重组核酸的宿主细胞。“转形细胞”系指通过重组DNA技术将编码的目标蛋白质的DNA分子引入其中的细胞。

载体可以是各种类型，包括质体、黏质体、fosmids、附加体、人工染色体、噬菌体、病毒载体等。通常，在载体中，给定的核苷酸序列与调节序列可操作地连接，使得当载体导入宿主细胞时，给定的核苷酸序列可以在调节序列的控制下在宿主细胞中表现。调节序列可包含，例如但不限于，启动子序列(例如，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、T7启动子，以及醇氧化酶基因(AOX1)启动子)、起始密码子、复制起点、增强子、分泌信号序列(例如，一α-交配因子信号)、终止密码子，以及其他控制序列(例如，Shine-Dalgarno序列及终止序列)。较佳地，载体可以进一步含有标记序列(例如，一抗生素抗性标记序列)，用于随后的筛选/选择程序。为了蛋白质产生的目的，在载体中，给定的目标核苷酸序列可以与除上述调节序列之外的另一核苷酸序列连接，从而产生融合多胜肽并有益于随后的纯化过程。所述融合多胜肽包括用于纯化的标签，例如，His-tag。

本文所用之“个体”或“受试者”等词包括人类及非人类动物，例如伴侣动物(例如狗，猫及其类似物)，农场动物(例如牛、羊、猪、马及其类似物)，或实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠及其类似物)。

本文所用之“治疗”乙词系指将包括一种或多种活性剂的组合物施用或投予患有疾病、该疾病的症状或病症或疾病进展的个体，目的为治疗、治愈、减缓、缓解、改变、补救、改善，增进，或影响疾病、疾病的症状或病症、由疾病引起的残疾，或疾病的进展或其症状或状况。

本文所用之“有效量”乙词系指在治疗的个体或细胞中赋予所需生物效应的活性成分的量。有效量可以根据各种原因而改变，例如给药途径及频率，接受所述药物的个体的体重及种类，以及给药目的。本领域技术人员可以基于本文的公开内容、已建立的方法及他们自己的经验确定每种情况下的剂量。

II.专一于登革病毒的抗体

本发明基于鉴定对登革病毒具有血清型专一性的许多分离的抗体，包括单株抗体12-4.1(专一于DENV1)、单株抗体33-7.1(专一于DENV2)、单株抗体43-1.3(专一于DENV3)，以及单株抗体22-1.5(专一于DENV4)。发现这些抗登革病毒抗体能够识别登革病毒的一种特定血清型而不与其他血清型交叉反应。更特定而言，这些抗登革病毒抗体对不同血清型的登革病毒NS1蛋白具有专一性；即单株抗体 12-4.1专一于源自DENV1的NS1多胜肽、单株抗体33-7.1专一于源自DENV2的NS1 多胜肽、单株抗体43-1.3专一于源自DENV3的NS1多胜肽，而单株抗体22-1.5专一于源自DENV4的NS1多胜肽。发现这些抗登革病毒抗体在各种形式的免疫测定中是有效且可行的，用以检测样本中的登革病毒，具有优异的灵敏度及专一性。本发明还基于对登革病毒专一性交叉反应性抗体(单株抗体82-1.1)的鉴定，其与登革病毒的各种血清型交叉反应，包括DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4，并且可以与本文所述之任何血清型专一性抗体配对，该血清型专一性抗体用于免疫测定以检测样本中的登革病毒。

因此，本文描述了针对登革病毒的血清型专一性抗体，包括单株抗体12-4.1(专一于DENV1)、单株抗体33-7.1(专一于DENV2)、单株抗体43-1.3(专一于DENV3)，以及单株抗体22-1.5(专一于DENV4)，以及其功能变体。本文还描述了对登革病毒专一的交叉反应性抗体，包括单株抗体82-1.1(与DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4交叉反应)及其功能变体。使用ELISA及西方墨点分析法测定这些单株抗体与DENV1-4的反应性。这些单株抗体的特征如表2所示。单株抗体12-4.1、单株抗体33-7.1、单株抗体43-1.3、单株抗体22-1.5，以及单株抗体82-1.1各自的重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)及其互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)的胺基酸序列如下表3所示。

单株抗体12-4.1的功能变体(专一于DENV1)(也称为“对DENV1专一的第一抗体”，如本文所述)可包含：

(a)重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HC CDR1)，SEQ IDNO:4的重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:6的重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO:9的轻链互补决定区1(LC CDR1)， SEQ IDNO:11的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:13的轻链互补决定区3(LC CDR3)，

或其抗原结合片段。

于某些具体实施例中，该第一抗体包含含有SEQ ID NO:71或与其基本上相同的胺基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:72或与其基本上相同的胺基酸序列的V_L。特定而言，该第一抗体包括含有与SEQ ID NO:71具有至少80％(例如82％、84％、 85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_H，以及含有与SEQ IDNO:72具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、 88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_L。该第一抗体还包括由编码本文所述之相关V_H或V_L胺基酸序列的多核苷酸序列编码的任何重组(工程化)衍生的抗体。

单株抗体33-7.1的功能变体(专一于DENV2)(也称为“对DENV2专一的第二抗体”，如本文所述)可包含：

(a)重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO:16的重链互补决定区1(HC CDR1)， SEQID NO:18的重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:20的重链互补决定区3(HCCDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO:23的轻链互补决定区1(LC CDR1)， SEQID NO:25的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:27的轻链互补决定区3(LCCDR3)。

于某些具体实施例中，该第二抗体包含含有SEQ ID NO:73或与其基本上相同的胺基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:74或与其基本上相同的胺基酸序列的V_L。特定而言，该第二抗体包括含有与SEQ ID NO:73具有至少80％(例如82％、84％、 85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_H，以及含有与SEQ IDNO:74具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、 88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_L。该第二抗体还包括由编码本文所述之相关V_H或V_L胺基酸序列的多核苷酸序列编码的任何重组(工程化)衍生的抗体。

单株抗体43-1.3的功能变体(专一于DENV3)(也称为“对DENV3专一的第三抗体”，如本文所述)可包含：

(a)重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO:30的重链互补决定区1(HC CDR1)， SEQID NO:32的重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:34的重链互补决定区3(HCCDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO:37的轻链互补决定区1(LC CDR1)， SEQID NO:39的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:41的轻链互补决定区3(LCCDR3)。

于某些具体实施例中，该第三抗体包含含有SEQ ID NO:75或与其基本上相同的胺基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:76或与其基本上相同的胺基酸序列的V_L。特定而言，该第三抗体包括含有与SEQ ID NO:75具有至少80％(例如82％、84％、 85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_H，以及含有与SEQ IDNO:76具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、 88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_L。该第三抗体还包括由编码本文所述之相关V_H或V_L胺基酸序列的多核苷酸序列编码的任何重组(工程化)衍生的抗体。

单株抗体22-1.5的功能变体(专一于DENV4)(也称为“对DENV4专一的第四抗体”，如本文所述)可包含：

(a)重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO:44的重链互补决定区1(HC CDR1)， SEQID NO:46的重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:48的重链互补决定区3(HCCDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO:51的轻链互补决定区1(LC CDR1)， SEQID NO:53的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:55的轻链互补决定区3(LCCDR3)。

于某些具体实施例中，该第四抗体包含含有SEQ ID NO:77或与其基本上相同的胺基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:78或与其基本上相同的胺基酸序列的V_L。特定而言，该第四抗体包括含有与SEQ ID NO:77具有至少80％(例如82％、84％、 85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_H，以及含有与SEQ IDNO:78具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、 88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_L。该第四抗体还包括由编码本文所述之相关V_H或V_L胺基酸序列的多核苷酸序列编码的任何重组(工程化)衍生的抗体。

单株抗体82-1.1的功能变体(也称为“对DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4 专一的第五抗体”，如本文所述)可包含：

(a)重链可变区(V_H)，其包含SEQ ID NO:58的重链互补决定区1(HC CDR1)， SEQID NO:60的重链互补决定区2(HC CDR2)，以及SEQ ID NO:62的重链互补决定区3(HCCDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，其包含SEQ ID NO:65的轻链互补决定区1(LC CDR1)， SEQID NO:67的轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及SEQ ID NO:69的轻链互补决定区3(LCCDR3)。

于某些具体实施例中，该第五抗体包含含有SEQ ID NO:79或与其基本上相同的胺基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:80或与其基本上相同的胺基酸序列的V_L。特定而言，该第五抗体包括含有与SEQ ID NO:79具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_H，以及含有与SEQ IDNO:80具有至少80％(例如82％、84％、85％、86％、 88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％)同一性的胺基酸序列的V_L。该第五抗体还包括由编码本文所述之相关V_H或V_L胺基酸序列的多核苷酸序列编码的任何重组(工程化)衍生的抗体。

“基本上相同”乙词可以意指变体的相关胺基酸序列(例如，在FRs、CDRs、 V_H或V_L中)与参考抗体相比无基本上不同，使得该变体具有基本相似于该参考抗体的结合活性(例如，亲和力、专一性或两者)及生物活性。这种变体可包括微小的胺基酸变化。可以理解的是，多胜肽可以具有有限数量的变化或修饰，这些变化或修饰可以在与其活性或功能无关的多胜肽的某一部分内进行，且仍然产生具有可接受水平的等同或类似生物活性或功能的变体。于某些实例中，胺基酸残基的变化为保守胺基酸取代，系指与另一个胺基酸残基相似的化学结构的胺基酸残基及多胜肽的功能、活性或其他生物学效应对性质的影响较小或基本没有影响。通常，与CDR区域相比，可以在FR区域中进行相对更多的取代，只要它们不会对抗体的结合功能及生物活性产生不利影响(例如，相较于原始抗体，降低结合亲和力超过 50％)。于某些具体实施例中，参考抗体及变体之间的序列同一性可为约80％、82％、 84％、85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％或99％，或更高。可以根据本领域普通技术人员已知的改变多胜肽序列的方法制备变体，例如在依循这些方法的参考文献中发现的那些，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,J.Sambrook等人编辑，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989 年。例如，胺基酸的保守取代包括在下列群组中的胺基酸之间进行：(i)A、G；(ii) S、T；(iii)Q、N；(iv)E、D；(v)M、I、L、V；(vi)F、Y、W；以及(vii)K、R、 H。

本文描述的抗体可为动物抗体(例如，小鼠衍生的抗体)、嵌合抗体(例如，小鼠-人类嵌合抗体)、人源化抗体，或人类抗体。本文描述的抗体可为单株抗体或多株抗体。“单株抗体”系指同源抗体群，“多株抗体”系指异源抗体群。本文描述的抗体还可包括其抗原结合片段，例如，Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段，单链Fv (scFv)及(scFv)₂。抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知之方法制备。

III.抗体之制备

本领域常规的许多方法可用于获得抗体或其抗原结合片段。

于某些具体实施例中，本文提供的抗体可以通过常规融合瘤技术制备。通常，目标抗原，例如，登革病毒NS1蛋白，可选择地与一载体蛋白耦合，例如，钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)及/或与佐剂混合，例如完全弗氏佐剂，可用于免疫宿主动物以产生与该抗原结合的抗体。收获分泌单株抗体的淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合以产生融合瘤。然后筛选以这种方式形成的融合瘤细胞株以鉴定及选择分泌所需单株抗体的那些细胞株。

于某些具体实施例中，本文提供之抗体可以通过重组技术制备。在相关方面，还提供了编码所公开的胺基酸序列的分离的核酸，以及包含此类核酸的载体及以该核酸转型或转染之宿主细胞。

例如，可以将包含编码这种抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列的核酸选殖到表现载体中(例如，细菌载体，例如大肠杆菌载体、酵母载体、病毒载体或哺乳动物载体)，通过常规技术，可以将任何载体引入合适的细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞，或哺乳动物细胞)中以表现该抗体。编码如本文所述之抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列的实例如下表3中所示。哺乳动物宿主细胞株的实例为人类胚肾细胞株(293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、中国仓鼠卵巢细胞 (CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)，以及人类肝细胞(Hep G2细胞)。用于表现本文所述抗体的重组载体通常含有编码该抗体胺基酸序列的核酸，该核酸与一启动子，无论是组成型还是诱导型，可操作地连接。典型的载体含有转录及转译终止子、起始序列，以及可用于调节编码抗体的核酸表现的启动子。载体可选择地含有原核及真核系统的选择标记。于某些实例中，重链及轻链编码序列都包括在相同的表现载体中。在其他实例中，将抗体的每个重链及轻链选殖到单个载体中并单独产生，然后可以在合适的条件下培养抗体组装。

用于表现本文所述抗体的重组载体通常含有编码该抗体胺基酸序列的核酸，该核酸与一启动子，无论是组成型还是诱导型，可操作地连接。重组抗体可以在原核或真核表现系统中产生，例如细菌、酵母、昆虫及哺乳动物细胞。典型的载体含有转录及转译终止子、起始序列及可用于调节编码抗体的核酸表现的启动子。载体可选择地含有原核及真核系统的选择标记。可以进一步分离或纯化产生的抗体蛋白，以获得基本上同质的制剂，用于进一步的测定及应用。合适的纯化方法，例如，可包括在免疫亲和或离子交换管柱上的分馏、乙醇沉淀、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)、高效液相色层分析(high-performance liquid chromatography，HPLC)，硫酸铵沉淀，以及凝胶过滤。

当需要全长抗体时，本文所述之任何V_H及V_L链的编码序列可以与免疫球蛋白的Fc区的编码序列连接，且所得到的编码全长抗体重链及轻链的基因可以在合适的宿主细胞中表现及组装，例如植物细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞，或昆虫细胞。

可以透过常规方法制备抗原结合片段。例如，可以透过胃蛋白酶消化全长抗体分子产生F(ab')₂片段，并且可以透过还原F(ab')₂片段的双硫键来制备Fab片段。或者，此类片段的制备也可透过重组技术透过在合适的宿主细胞中表现重链及轻链片段并使它们在体内或体外组装以形成所需的抗原结合片段。透过连接编码重链可变区的核苷酸序列及编码轻链可变区的核苷酸序列，可以透过重组技术制备单链抗体。较佳地，在两个可变区之间引入柔性连接符。

IV.抗体之应用

本发明之血清型专一性抗体对各登革病毒血清型是专一的，且每种血清型皆不与任何其他密切相关的黄病毒反应，如日本脑炎(JE)病毒以及滋卡病毒(ZIKV)。因此，本发明提供了一种使用任何揭露抗体或其任何组合之方法，其可以有效地用于检测样本中的登革病毒。

通常，本发明之方法包含使样本与任何揭露抗体或其任何组合接触，并测定抗体与该样本的结合。具体而言，抗体与该样本的结合包括(i)第一抗体与DENV1 NS1的结合并形成第一抗体-DENV1NS1复合物，(ii)第二抗体与DENV2NS1的结合并形成第二抗体-DENV2NS1复合物，(iii)第三抗体与DENV3NS1的结合并形成第三抗体-DENV3NS1复合物，以及(iv)第四抗体与DENV4NS1的结合并形成第四抗体-DENV4NS1复合物。本发明之方法还包含基于抗体与样本的结合确定是否存在特定血清型登革病毒，其中(i)第一抗体与DENV1NS1的结合并形成第一抗体 -DENV1NS1复合物表示该样本中存在DENV1，(ii)第二抗体与DENV2NS1的结合并形成第二抗体-DENV2NS1复合物表示该样本中存在DENV2，(iii)第三抗体与 DENV3NS1的结合并形成第三抗体-DENV3NS1复合物表示该样本中存在 DENV3，且(iv)第四抗体与DENV4NS1的结合并形成第四抗体-DENV4NS1复合物表示该样本中存在DENV4。

本领域普通技术人员已知使用抗体以检测样本中的抗原或病原体的各种测定形式。使用对目标抗原/病原体专一的抗体的这些测定通常称为免疫测定。免疫测定的实例包括，但不限于，酶联结免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)，或ILMA免疫荧光测定。这些测定法可用于检测生物样本中登革病毒的存在，包括血液、血清、血浆、唾液、脑脊髓液、尿液及其他组织样本。

在某些具体实施例中，该测定为夹心式测定。

于某些具体实施例中，透过首先将捕获抗体固定在固体支持物上来进行测定。然后将固定的抗体与生物样本一起培养，且该登革病毒或其目标抗原例如，使NS1 多胜肽(如果存在于样本中)与该抗体结合，以形成抗体-病毒/抗原复合物或缀合物。然后可以透过以合适的缓冲液，例如含有0.05％Tween的PBS，洗涤该固体支持物来除去未结合的样本，且添加侦测抗体至该固体支持物中，该侦测抗体可以结合该固定的抗体-病毒/抗原复合物并包含可侦测到的标记。特定而言，该捕获抗体及该侦测抗体需要在不同表位结合该病毒/抗原，使得该病毒/抗原可以“夹在”这两种抗体之间。较佳的可侦测到的标记包括酶标记(例如辣根过氧化物酶)、荧光标记、金属标记以及放射性标记。可侦测到的标记的一些特定实例包括金奈米颗粒、有色乳胶珠、磁性颗粒、碳奈米颗粒，以及硒奈米颗粒。将侦测抗体与固定的抗体- 病毒/抗原复合物一起培养至足以检测结合的病毒/抗原的一段时间。然后除去未结合的侦测抗体，并基于可侦测到的标记检测结合的侦测抗体。例如，通常可以透过添加基质，然后对反应产物进行光谱或其他分析来检测酶标记。

为了确定样本中目标登革病毒的存在或不存在，通常将从与固体支持物结合的可侦测到的标记检测到的信号与对应于截断值的信号进行比较。该截断值通常是当固定化抗体与来自未感染个体的样本一起培养时获得的平均值信号。通常，产生高于截断值信号的样本被认为是对样本中存在登革病毒的阳性反应。

本发明之血清型专一性抗体可作为捕获或侦测抗体，与配偶体抗体配对，以形成抗体对而可进行夹心式测定。如本文所述之配偶体抗体还需要能够结合目标病毒/抗原，但是与用于进行夹心式测定之配对的本发明之任何血清型专一性抗体不同的表位结合。于某些具体实施例中，用于进行夹心式测定的配偶体抗体可以是对不同于本文所述之登革病毒具有不同“血清型专一性”的抗体(亦即，不同于第一抗体、第二抗体、第三抗体及第四抗体)，该配偶体抗体也能够与登革病毒的相应血清型结合但在不同的表位上结合。于某些具体实施例中，配偶体抗体可以是“血清型交叉反应性”抗体，其为多株或单株抗体，其可以识别所有登革病毒血清型但在不同于本发明之任何血清型专一性抗体的表位。这种交叉反应抗体的一个特定实例为第五抗体(例如，单株抗体82-1.1)，其与至少四种登革病毒血清型交叉反应并识别与本发明之任何血清型专一性抗体不同的单独表位，从而与其形成配对，以进行夹心式测定。

于某些具体实施例中，用于检测样本中的登革病毒的本发明之方法包含

(i)使该样本与对登革热NS1多胜肽(对于四种血清型)专一的交叉反应性抗体接触(例如，对DENV1NS1、DENV2NS1、DENV3NS1及DENV4NS1专一的第五抗体)，作为捕获抗体，形成交叉反应抗体-NS1(任何血清型)复合物；

(ii)使交叉反应抗体-NS1多胜肽(任何血清型)复合物与如本文所述之血清型专一性单株抗体接触(例如，专一于DENV1NS1的第一抗体、专一于DENV2NS1 的第二抗体、专一于DENV3NS1的第三抗体，或专一于DENV4NS1的第四抗体)，作为侦测抗体，以形成交叉反应抗体-NS1(任何血清型)-血清型专一性单株抗体复合物；以及

(iii)检测交叉反应抗体-NS1(任何血清型)-血清型专一性单株抗体复合物的存在，从而检测样本中各自血清型登革病毒的存在。

(i)使该样本与本文所述之血清型专一性单株抗体接触(例如，专一于DENV1 NS1的第一抗体、专一于DENV2NS1的第二抗体、专一于DENV3NS1的第三抗体，或专一于DENV4NS1的第四抗体)，作为捕获抗体，以形成单株抗体-血清型专一性NS1复合物；

(ii)使该单株抗体-各自的血清型登革病毒复合物与对登革热NS1多胜肽(对于四种血清型)专一的交叉反应性抗体接触(例如，对DENV1NS1、DENV2NS1、 DENV3NS1及DENV4NS1专一的第五抗体)，作为侦测抗体，以形成单株抗体- 血清型专一性NS1-交叉反应抗体复合物；以及

(iii)检测该血清型专一性单株抗体-NS1-交叉反应性抗体复合物的存在，从而检测样本中各自血清型登革病毒的存在。

在一实例中，本发明之方法在ELISA夹心式测定中进行。在该测定中，将捕获抗体包覆在ELISA板上。阻隔后，将该ELISA板与生物样本一起培养、洗涤，然后与侦测抗体一起培养。例如，捕获抗体为对登革热NS1多胜肽(任何血清型)专一的多株或单株交叉反应抗体，且侦测抗体为专一于DENV1NS1的第一抗体、专一于 DENV2NS1的第二抗体、专一于DENV3NS1的第三抗体，或专一于DENV4NS1 的第四抗体，或其任何组合，如本文所述，且使用一ELISA比色的TMB试剂进行该ELISA板的显色。

于另一实例中，本发明之方法以流通或侧流形式进行。在该测定中，将具有可侦测到的标记，如比色标记(例如，胶体金)之侦测抗体固定在膜上，例如硝酸纤维素膜(作为条带)。将怀疑含有所述登革病毒的生物样本施加到存在侦测抗体的膜上。该生物样本沿着该膜迁移，通过含有该侦测抗体的区域，其中如果该登革病毒存在于生物样本中，该侦测抗体会与该登革病毒的NS1结合。然后，侦测抗体以及其所结合的抗原的复合物迁移到固定有捕获抗体的测试区域，该捕获抗体并结合登革病毒的NS1，从而形成侦测抗体、抗原及捕获抗体的夹心。测试(捕获)区域处的侦测抗体的浓度/聚集表示该样本中存在专一性登革热NS1。这种测试通常可以使用非常少量的生物样本进行。

在一相关方面，本发明还提供了用于实施本发明方法之套组，其包含如本文所述之任何抗体或其组合。该套组可以进一步包含使用该套组检测样本中登革病毒的说明书。

于某些具体实施例中，该免疫测定为夹心形式。

具体而言，该套组包含一对登革病毒血清型专一性抗体，其选自由专一于DENV1NS1的第一抗体、专一于DENV2NS1的第二抗体、专一于DENV3NS1的第三抗体，以及专一于DENV4NS1的第四抗体，及其任何组合所组成之群组，每种抗体与配偶体抗体配对以进行夹心式测定。

于某些具体实施例中，至少一种血清型专一性抗体作为捕获抗体，与作为侦测抗体的配偶体抗体配对。

于其他具体实施例中，至少一种血清型专一性抗体作为侦测抗体，与作为捕获抗体的配偶体抗体配对。

作为一侦测抗体，该抗体可包含可侦测到的标记，例如酶标记、荧光标记、金属标记及放射性标记。

于某些实例中，在一侧向流动形式中，该套组包含测定条带(例如，硝酸纤维素膜)；侦测抗体可以与该条带的反应区结合，且捕获抗体可以结合于该条带的测试区中。该条带还包含样本垫，其中放置体液样本，然后该样本通过毛细管作用向条带的相对端迁移，藉此该样本首先在该反应区中与该侦测抗体结合，其中在该样本中的抗原与该侦测抗体结合形成抗原-侦测抗体复合物，然后该抗原-侦测抗体复合物在该测试(捕获)区中与该捕获抗体结合。使用胶体金作为侦测抗体的可侦测到的标记，例如，在该测试(捕获)区域的检测标记的浓度/聚集显示红色，表示该样本中存在专一性抗原。或者，该测试区可具有发色基质，且当该抗原-侦测抗体复合物与该捕获抗体结合时，该发色基质转化为可见的有色产物。

于某些实例中，在ELISA形式中，该套组包含微量滴定盘，其具有固定有捕获抗体的孔；含有侦测抗体的溶液；以及发色显影剂。

具体而言，该套组可以进一步包含额外的试剂或缓冲液、用于从个体收集生物样本的医疗装置，及/或用于保持及/或储存样本的容器。

于进一步的具体实施例中，本发明提供了包含一种或多种如本文所述抗体及医药上可接受的载体之组合物。

于某些具体实施例中，本发明之组合物系用于治疗登革病毒疾病之医药组合物。

于某些具体实施例中，本发明之组合物系用于诊断登革病毒疾病之诊断组合物。

如本文所用，“医药上可接受的”系指载体与组合物中的活性成分兼容，且较佳地可以稳定该活性成分并对接受治疗的个体是安全的。该载体可以是活性成分的稀释剂、载体、赋形剂或基质。合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆及甲基纤维素。该组合物可另外包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁及矿物油；润湿剂；乳化剂及悬浮剂；防腐剂，如甲基及羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；及调味剂。本发明之组合物可以在给予患者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放的效果。

根据本发明，该组合物的形式可以为片剂、丸剂、粉末、锭剂、小包、片剂、酏剂、悬浮液、洗剂、溶液、糖浆、软及硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液及包装粉末。

本发明之组合物可通过任何生理学上可接受的途径递送，例如口服、肠胃外(例如肌肉内、静脉内、皮下及腹膜内)、透皮、栓剂及鼻内方法。关于肠胃外给药，较佳以无菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液与血液等渗的其他物质，例如盐或葡萄糖。根据需要，可以适当地缓冲水溶液(较佳pH值为3至9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可以使用本领域技术人员熟知的标准药理学技术完成，且不需要额外的创造性劳动。

透过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明而非限制。根据本发明公开的内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明之精神及范围的情况下，可以对所公开的特定具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例

1.1病毒株

登革病毒株DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241 在补充有2％FBS的RPMI 1640培养基中在C6/36白线斑蚊中繁殖，并于28℃下培养直至观察到细胞病变效应。作为对照组，日本脑炎病毒株JEV SA14-14-2在含有2％ FBS的RPMI 1640培养基中的BHK-21细胞中繁殖。透过接种BHK-21细胞的噬斑测定法测定每种病毒的数量。

1.2 NS1蛋白之制备

在5天后收获感染病毒(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87及DENV4 H241)的Vero细胞的细胞培养物上清液，并以UV照射不活化。为了纯化细胞培养物上清液中可溶形式的NS1蛋白，我们根据制造商的说明书进行了管柱免疫亲和层析。为此，将已经固定在HiTrap^TM NHS活化的HP管柱(GE Healthcare公司， Uppsala，瑞典)上的抗NS1单株抗体(针对所有血清型)用于从每种登革热血清型中纯化NS1蛋白。以5倍体积的PBS平衡管柱，将病毒细胞培养物上清液通过免疫亲和管柱，以10倍体积的PBS洗去未结合的蛋白质，并使用pH为2.8的甘胺酸溶液洗脱结合的NS1，然后缓冲至中性pH。然后通过西方墨点分析检测纯化的 DENV NS1蛋白，并使用Pierce BCA蛋白质测定套组(Thermo Fisher Scientific公司，伊利诺伊州，美国)测定NS1蛋白质浓度。

1.3专一于DENV1-4NS1的血清型专一性单株抗体之产生及特征描述

所有实验均使用购自实验动物中心并在预防医学研究所的动物饲养设施中饲养的BALB/c小鼠。使用动物的实验由国际实验动物管理评估及认证协会(IACUC 编号AN-104-12、AN-105-05)许可。将4周龄的BALB/c小鼠进行腹腔免疫，以存在于完全弗氏佐剂中的15μg免疫亲和纯化的NS1蛋白进行第一次接种，然后以存在于不完全弗氏佐剂中的15μg NS1蛋白针对各自的血清型免疫小鼠，用于随后的加强免疫。在连续攻击后从小鼠获得DENV专一性抗血清。简言之，除去免疫小鼠的脾脏。将脾细胞与NSI/1-Ab4-1骨髓瘤细胞融合以产生融合瘤细胞，其根据标准程序选择(Kohler及Milstein，1975年)。融合细胞以RPMI洗涤两次，然后在15ml锥形管中混合，并于1分钟内在温和搅拌下加入1ml 50％(w/v)PEG 1500(Roche公司， Penzberg，德国)。透过缓慢(1分钟)加入1ml RPMI稀释混合物两次，然后缓慢加入 (2分钟)8ml无血清RPMI。然后将混合物在400xg下离心5分钟。将融合的细胞沉淀物重新悬浮于补充有20％FBS的HAT培养基(Life technologies公司，Burlington，安大略省，加拿大)以及HFCS溶液(Roche公司，Mannhein，德国)的RPMI中。接下来，以每孔200μl的量将重新悬浮混合物分配在96孔板中。透过间接ELISA(使用纯化的 DENV NS1作为每种血清型的包覆抗原)鉴定分泌针对NS1的专一性抗体的融合瘤细胞株。通过有限稀释产生单株细胞。进行来自以DENV感染的C6/36细胞的裂解物的西方墨点分析以确定(a)抗NS1单株抗体的专一性，以及(b)抗体识别的表位是否为构象或线性的。使用市售的小鼠单株抗体同种型套组(IsoStrip^TM，Roche公司，Mannheim，德国)对单株抗体进行同种型分型。将融合瘤细胞注射到姥鲛烷引发的BALB/c小鼠中以产生腹水。然后根据制造商的说明书使用蛋白G-sepharose管柱(HiTrap protein G，GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典)从腹水中纯化单株抗体。

1.4 HRP结合

为了将单株抗体与HRP(Innova Biosciences公司，剑桥，英国)缀合，将100μg HRP及20μl等分试样的修饰试剂与200μl 1mg/ml单株抗体混合。在室温(20-25℃) 下将混合物培养3小时后，以20μl等份的猝灭剂终止反应。在室温下再作用30分钟后，加入260μl甘油，最终溶液于-20℃保存。单株抗体-HRP的终浓度为400μg/ml。

1.5开发四种血清型专一性NS1捕获ELISA

基于抗NS1单株抗体的特征选择几种血清型专一性及高反应性单株抗体。通过与血清型-交叉反应性单株抗体的兼容性测试四种血清型专一性单株抗体的捕获 ELISA形式的血清型专一性抗体。为了确定捕获ELISA关于测定灵敏度的最佳组合，将血清型专一性单株抗体及血清型-交叉反应性单株抗体作为捕获或侦测抗体。特定而言，选择血清型-交叉反应性单株抗体作为捕获抗体，并确定与作为侦测抗体的相应四种血清型专一性单株抗体(单株抗体12-4.1、单株抗体33-7.1、单株抗体 43-1.3及单株抗体22-1.5)的最佳配对，组装登革热四种血清型NS1的ELISA，如图 1A、图1B、图2A及图2B所示。透过棋盘滴定测定最合适的实验条件，例如包覆浓度及单株抗体-HRP的稀释度。将微孔板(CostarCorning公司，Corning，纽约)以100 μl的10μg/ml捕获交叉反应性单株抗体包覆，并于4℃培养整夜。随后以封闭缓冲液(PBS，0.05％Tween，5％脱脂奶粉)于37℃下阻隔孔井1小时，并以洗涤缓冲液 (PBS，0.05％Tween)洗涤。然后以阻隔缓冲液连续稀释病毒培养上清液或NS1蛋白，并于37℃下培养1小时。洗涤孔板后，加入100μl的0.8μg/ml血清型专一性单株抗体-HRP，将孔板于37℃下培养1小时。然后，再次洗涤孔板，加入100μl TMB试剂，将孔板于室温下培养10分钟。然后以1N硫酸终止反应，并使用微孔板自动读取仪在450nm波长处读取吸亮度。

1.6临床样本

本研究共使用146份临床血清样本；85例样本包含已向疾病控制中心报告的确诊登革热病例，以及61例样本为2016-2017年期间从三家医院所收集(高雄总医院、高雄总医院左营分院，以及高雄总医院冈山分院)。在急性期(疾病发病后1-7天)收集所有临床血清样本，并以血清型专一性一步法SYBR green I实时RT-PCR，登革病毒专一性IgM/IgG捕获ELISA及市售Platelia Dengue NS1Ag ELISA套组(Bio-Rad 公司，Marnes-la-Coquette，法国)进行测试。研究方法经高雄总医院机构审查委员会(IRB编号KAFGH 104-048)批准。

1.7使用血清型专一性NS1捕获ELISA检测NS1的临床血清

将微孔板以100μl的10μg/ml的交叉反应性单株抗体包覆，并于4℃培养整夜。随后以阻隔缓冲液(PBS，0.05％Tween，5％脱脂奶粉)阻隔孔井，并与50μl在阻隔缓冲液中以1：1比例稀释的血清于37℃下培养1小时。然后将孔板以0.05％PBS/T 洗涤四次，于37℃下与100μl的0.8μg/ml血清型专一性单株抗体-HRP(单株抗体 12-4.1、单株抗体33-1.7、单株抗体43-1.3及单株抗体22-1.5)一起培养1小时，再次洗涤四次。临床血清测试中涉及的后续步骤如前一节所述。正常人类血清样本 (Sigma-Aldrich公司，Saint Louis，美国)作为阴性对照组。对于每种血清型，超过参考截断值的样本(以阴性对照的双倍平均值计算)在NS1捕获ELISA中被认为是阳性的。

1.8透过市售的Platelia Dengue NS1Ag ELISA套组检测NS1抗原(Bio-Rad 公司，Marnes-la-Coquette，法国)

根据制造商的说明，使用市售的Platelia Dengue NS1Ag ELISA套组(Bio-Rad公司，Marnes-la-Coquette，法国)在临床血清样本中检测DENV NS1蛋白。简言之，将阳性、阴性，校准及样本的稀释液在具有HRP缀合的单株抗体的孔板上于37℃ 培养90分钟。将孔板洗涤六次后，向每个孔中加入160μl TMB，并将孔板在室温下远离光线下培养30分钟。通过加入100μl终止溶液终止酶反应，并在OD 450/620 nm波长下测量光密度。

1.9再现性

于另一天由第二位操作者以四血清型NS1捕获ELISA测试总共58个DENV阳性血清样本(16个DENV1血清样本、17个DENV2血清样本、16个DENV3血清样本，以及9个DENV4血清样本)以及50个阴性血清样本。

1.10统计分析

使用GraphPad Prism 6.0版(GraphPad软件公司，San Diego，加州)进行每种ELISA的诊断准确性、灵敏度、专一性及相应的95％信赖区间(CI95)，显著性标准设置为P值<0.05。

1.11胶体金探针之制备

使用35±5nm的胶体金(TANBead NanoGold-40，Taiwan Advanced Nanotech公司)进行IgG的缀合。以0.2N NaOH调节胶体金溶液(1％w/v)的pH值，并将抗登革热的NS1单株抗体82-1.1(在PBS中，pH7.4)加入到pH调节的胶体金溶液中。每种血清型缀合的最合适的pH值为：D1条带，pH 7.8；D2、D3及D4条带，pH7.4。用于缀合的优化抗体浓度为1μg/条带。将抗体/胶体金混合物轻轻混合90分钟，以2％BSA 溶液阻隔30分钟，并以7000rpm离心15分钟。离心后以2％BSA(含有2％[w/v]BSA 的20mM Tris/HCl缓冲液[pH7.2])洗涤一次后，将金颗粒悬浮在2％BSA中。将这种抗登革热NS1单株抗体82-1.1涂层胶体金探针放入垫中干燥，然后于4℃下保存整夜。

1.12侧流试纸之制备

对照线如下制备：0.2(针对D1、D3及D4)至0.32(针对D2)μg/条带的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch公司，宾州，美国)。如下制备测试线(捕获抗体)：单株抗体12-4.1、单株抗体43-1.3、单株抗体22-1.5作用强度为0.75μg/条带(针对D1、 D3、D4条带)在PBS(pH 7.4)中，以及单株抗体33-7.1作用强度为0.8μg/条带(针对 D2条带)在PBS(pH7.4)中，分别施加到醋酸纤维素负载的硝酸纤维素膜条带(孔径： 12μm直径)的顶端附近，并在室温下干燥1小时。组成分处理后，组装登革热血清型NS1侧流试验装置。

1.13条带上NS1抗原之检测及检测灵敏度

透过将样本(50μl)的适当测试DENV NS1蛋白溶液及50μl运行缓冲液(0.1％Tween-20/0.85％NaCl)施加到装置的样本垫来进行测定。测试DENV NS1及检测试剂的组合溶液升高膜，并且在室温下20分钟后胶体金沉积在固相抗体的位点。

1.14 DENV血清型NS1条带的交叉反应性

以DENV血清型NS1条带测定以病毒(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87、DENV4 H241、日本脑炎病毒以及兹卡病毒)感染的Vero细胞的细胞培养物上清液以评估交叉反应性。

1.15单株抗体可变区之序列分析

来自融合瘤12-4.1、33-7.1、43-1.3、22-1.5及82-1.1的融合瘤细胞。使用RNeasymini套组(Qiagen公司，Valencia，加州，美国)根据制造商的方法从融合瘤细胞株中分离总RNA，然后使用oligo dT引子进行反转录以产生cDNA。使用PCR扩增抗体的重链及轻链可变链，并确认该序列为功能可变区。四种融合瘤细胞的V_H及V_L基因，参见附件之序列。

2.结果

2.1针对DENV的单株抗体之产生及特征描述

制备来自各种血清型DENV的NS1蛋白，并注射到BALB/c小鼠中进行免疫。从免疫小鼠中取出脾脏，分离脾细胞并与骨髓瘤细胞融合以产生融合瘤细胞。透过ELISA使用纯化的DENV NS1作为每种血清型的包覆抗原鉴定分泌针对NS1的专一性抗体的融合瘤细胞株。另外，进行来自以DENV感染的C6/36细胞的裂解物的西方墨点分析以确定(a)抗NS1单株抗体的专一性及(b)抗体识别的表位是否为构象或线性的。此外，使用商业套组对单株抗体进行同种型分型。

表2.与DENV血清型(D1-4)的NS1蛋白反应的单株抗体之特征描述

^a以不同登革病毒血清型感染的C6/36细胞裂解物以SDS-PAGE样本缓冲液处理，并以每种单株抗体进行墨点分析。

^b从以不同血清型DENV感染的Vero细胞的细胞培养物上清液中免疫亲和纯化不同的NS1抗原。以专一性NS1抗原包覆微孔板并与每种单株抗体反应。

如表2所示，第1至第4选殖株12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5分别为DENV1、DENV2、DENV3及DENV4专一性血清型，而第5选殖株，单株抗体82-1.1，与 DENV1、DENV2、DENV3以及DENV4交叉反应。

四种血清型专一性单株抗体(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)及交叉反应性单株抗体(82-1.1)的胺基酸序列，包括互补决定区1-3(测定V_H及V_L结构域的CDR 1-3) 及框架区1-4(FW1-4)及相应的核酸序列，并提供于以下表3中。

表3.四种血清型专一性单株抗体(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)及交叉反应性单株抗体(82-1.1)的胺基酸序列及相应的核酸序列。

2.2夹心(捕获)ELISA

2.2.1以血清型专一性单株抗体作为捕获抗体

将本发明之四种血清型专一性单株抗体作为夹心(捕获)ELISA中的捕获抗体。图1A显示了使用本发明之血清型专一性单株抗体作为捕获抗体的夹心(捕获)ELISA的基本设计，其与交叉反应性单株抗体作为侦测抗体配对。

将微孔板以本发明之血清型专一性单株抗体包覆作为捕获抗体，并于4℃培养整夜。然后将孔井阻隔并洗涤。以不同血清型DENV(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、DENV3 H87，以及DENV4 H241)或流行性日本脑炎(JE)病毒感染的Vero细胞的细胞培养物上清液或未感染的Vero细胞的细胞培养物上清液(阴性对照组)分开加入孔中，于37℃培养1小时。洗涤后，将以辣根过氧化物酶(HRP)标记的交叉反应性单株抗体加入孔中，并于37℃下培养1小时。再次洗涤孔井，并向孔中加入 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB)作为HRP的基质。于450 nm波长处读取吸亮度。如图1B所示，证明本发明之血清型专一性单株抗体在夹心 (捕获)ELISA中成功地作为捕获抗体，表现出优异的血清型专一性而不与其他黄病毒(日本脑炎(JE)病毒)交叉反应。

2.2.2以血清型专一性单株抗体作为侦测抗体

将本发明之四种血清型专一性单株抗体作为夹心(捕获)ELISA中的侦测抗体。图2A显示了使用本发明之血清型专一性单株抗体作为侦测抗体的夹心(捕获)ELISA的基本设计，其与交叉反应性单株抗体作为捕获抗体配对。

将微孔板以交叉反应性单株抗体包覆作为捕获抗体，并于4℃下培养整夜。然后将孔井阻隔并洗涤。以不同血清型DENV(DENV1 Hawaii、DENV2 16681、 DENV3 H87及DENV4H241)或流行性日本脑炎(JE)病毒感染的Vero细胞的细胞培养物上清液或未感染的Vero细胞的细胞培养物上清液(阴性对照组)分开加入孔中，于37℃下培养1小时。洗涤后，将以辣根过氧化物酶(HRP)标记的本发明血清型专一性单株抗体加入孔井中，并于37℃下培养1小时。再次洗涤孔井，并向孔中加入 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为HRP的基质。于450nm波长处读取吸亮度。如图 2B所示，本发明之血清型专一性单株抗体在夹心(捕获)ELISA中成功地作为侦测抗体，表现出优异的血清型专一性而不与其他黄病毒(日本脑炎(JE)病毒)交叉反应。

2.2.3检测极限

以每种DENV血清型的连续稀释及纯化的NS1蛋白进行捕获ELISA，以确定本发明血清型专一性单株抗体的检测极限。表4及图3显示了结果。

表4.本发明之四种血清型专一性NS1捕获ELISA及市售Platelia Dengue NS1 AGELISA的检测极限

四种血清型专一性NS1捕获ELISA及市售Platelia Dengue NS1AG ELISA检测NS1的灵敏度比较。在进行该分析之前，将每种NS1蛋白血清型进行免疫亲和纯化并连续稀释。

结果显示，使用本发明之血清型专一性单株抗体的捕获ELISA实现了优异的灵敏度，范围为1至4ng/ml的DENV1-4NS1蛋白，与市售的DENV ELISA套组(Pleterlia NS1AgELISA，Bio-Rad公司)相当，虽然该市售套组无法区分血清型。

2.3条带

本发明之四种血清型专一性单株抗体也用于开发DENV检测的条带。图4显示了使用本发明之血清型专一性单株抗体作为捕获抗体(上图)或侦测抗体(检测组)与交叉反应性单株抗体配对的血清分型NS1条带的基本设计。

如图5所示，本发明之血清型专一性单株抗体(12-4.1、33-7.1、43-1.3及22-1.5)被证明成功地作为捕获抗体，与本发明交叉反应性单株抗体(82.1.1)配对作为侦测抗体，在血清分型NS1条带中，分别对DENV1、DENV2、DENV3及DENV4(从上到下)表现出优异的血清型专一性，而不与其他黄病毒(日本脑炎(JE)病毒及滋卡病毒(ZIKV))交叉反应。

此外，测定了条带中本发明血清型专一性单株抗体的检测极限。表5显示了结果。

表5四种血清型专一性NS1条带、Bio-Rad公司登革热NS1AG快速检测，以及SD登革热NS1Ag快速检测的检测极限

结果显示使用本发明之血清型专一性单株抗体的NS1条带实现了优异的灵敏度，范围为62.5至125ng/ml的DENV1-4NS1蛋白，与市售的DENV条带套组相当，而这些市售套组不能区分血清型。

2.4临床试验

收集总共146个临床血清样本以确定使用本发明之四种血清型专一性单株抗体的夹心(捕获)ELISA的灵敏度及专一性。

在疾病发作后一(1)及七(7)天之间收集146份临床血清样本，并透过常规血清分型RT-PCR、登革热专一性IgM/IgG捕获ELISA、市售登革热NS1Ag ELISA方法及本发明之血清型-专一性NS1捕获ELISA进行分析。表6显示了结果。图6显示了用于测试急性发热患者血清的本发明之夹心(捕获)ELISA的专一性。

表6.透过RT-PCR、IgM/IgG、Platelia Dengue NS1AG ELISA及本发明之四种血清型专一性NS1捕获ELISA分析急性临床血清

^a没有关于血清采集日期的信息。

^b血清型专一性一步法基于SYBR Green I的RT-PCR

^c RT-PCR阴性结果，但登革病毒专一性IgM/IgG捕获ELISA及Platelia DengueNS1 AG ELISA阳性结果

^d RT-PCR、登革病毒专一性IgM/IgG捕获ELISA及Platelia Dengue NS1AG ELISA检测结果阴性

结果显示，146份临床血清样本被证实包括十七(17)个DENV1血清型样本，十九(19)个DENV2血清型样本，十六(16)个DENV3血清型样本，以及九(9)个DENV4 血清型样本；透过RT-PCR测定五(5)个样本为阴性，但登革病毒专一性IgM/IgG捕获ELISA测定阳性；透过Platelia NS1Ag ELISA确定五十五(55)个样本阳性；八十 (80)个样本由所有测试方法确定为阴性。

结果显示使用本发明之四种血清型专一性单株抗体的夹心(捕获)ELISA表现出优异的灵敏度及专一性，其中D1ELISA(单株抗体12-4.1)能够检测来自17个 DENV1样本的15个DENV1样本，D2ELISA(单株抗体33-7)能够检测来自19个 DENV2样本的18个DENV2样本，D3ELISA(单株抗体43-1.3)能够检测来自16个 DENV3样本的12个DENV3样本，以及D4ELISA(单株抗体22-1.5)能够检测来自9 个DENV1样本的6个DENV4样本；透过血清型RT-PCR未检测到的五(5)个样本被确定为阳性并鉴定为DENV2；且所有八十(80)个阴性样本也被确定为阴性而没有伪阳性结果。图6A至图6F显示了用于测试急性发热患者血清的本发明之夹心(捕获) ELISA的专一性。

表8.1及8.2总结了使用本发明之四种血清型专一性单株抗体的夹心(捕获)ELISA的灵敏度及专一性的结果。

表8.1

ELISA测试	D1	D2	D3	D4
					所有阳性的数目<sup>a</sup>	17	19	16	9
真阳性的数目	15	18	12	6
					真阴性的数目	80	80	80	80
伪阳性的数目	0	0	0	0
					伪阴性的数目	2	1	4	3
血清专一性	100	100	100	100
					血清灵敏度	0.882	0.947	0.75	0.666

^a血清型分型系透过血清型专一性一步法SYBR Green I-based RT-PCR进行

表8.2

PPV＝阳性预测值；NPV＝阴性预测值

结果显示基于本发明之四种血清型专一性单株抗体的夹心(捕获)ELISA能够检测及区分血清样本中的四种登革病毒血清型，甚至在疾病发作后的五(5)天后，显示总体100％专一性及84.8％灵敏度。

序列表

<110> 赖思佳

<120> 抗登革热病毒抗体及其应用

<130> IN0077.NDM0028CN

<160> 90

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH FW1

<400> 1

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH CDR1

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH FW2

<400> 3

Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH CDR2

<400> 4

Tyr Ile Thr Pro Asn Thr Gly Tyr Asn Glu Asn Ser Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH FW3

<400> 5

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Val Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH CDR3

<400> 6

Arg Thr Tyr Glu Gly Tyr Leu Asp Val

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH FW4

<400> 7

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL FW1

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL CDR1

<400> 9

Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL CDR2

<400> 10

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL CDR2

<400> 11

Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser

1 5

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL FW3

<400> 12

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Asn Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL CDR3

<400> 13

Phe Gln Ala Ser His Val Pro Arg Thr

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL FW4

<400> 14

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH FW1

<400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH CDR1

<400> 16

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH FW2

<400> 17

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH CDR2

<400> 18

Tyr Ile Asn Pro Asn Thr Gly Phe Thr Glu Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH FW3

<400> 19

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH CDR3

<400> 20

Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH FW4

<400> 21

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL FW1

<400> 22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Phe Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL CDR1

<400> 23

Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Asn Leu His

1 5 10

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL FW2

<400> 24

Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL CDR2

<400> 25

Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL FW3

<400> 26

Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL CDR3

<400> 27

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL FW4

<400> 28

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

1 5 10

<210> 29

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH FW1

<400> 29

Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gln Val Val Arg Pro Gly Thr Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH CDR1

<400> 30

Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH FW2

<400> 31

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH CDR2

<400> 32

Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH FW3

<400> 33

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH CDR3

<400> 34

Ser Gln Phe Gly Leu Arg Phe Ala Tyr

1 5

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH FW4

<400> 35

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL FW1

<400> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys

20

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL CDR1

<400> 37

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL FW2

<400> 38

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser

1 5 10 15

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL CDR2

<400> 39

Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser

1 5

<210> 40

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL FW3

<400> 40

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL CDR3

<400> 41

Gln Asn Asp Tyr Asp Ser Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL FW4

<400> 42

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 43

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH FW1

<400> 43

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH CDR1

<400> 44

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Ile His

1 5 10

<210> 45

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH FW2

<400> 45

Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH CDR2

<400> 46

Tyr Ile Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Ile Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 47

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH FW3

<400> 47

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

20 25 30

<210> 48

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH CDR3

<400> 48

Arg Val Leu Leu Asp Ser

1 5

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH FW4

<400> 49

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 50

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL FW1

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL CDR1

<400> 51

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe Leu Asn

1 5 10

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL FW2

<400> 52

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL CDR2

<400> 53

Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 54

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL FW3

<400> 54

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL CDR3

<400> 55

Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL FW4

<400> 56

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 57

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH FW1

<400> 57

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH CDR1

<400> 58

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp Met Ser

1 5 10

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH FW2

<400> 59

Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Met Val Ala

1 5 10

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH CDR2

<400> 60

Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH FW3

<400> 61

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser

20 25 30

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH CDR3

<400> 62

Pro Asn Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH FW4

<400> 63

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL FW1

<400> 64

Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 65

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL CDR1

<400> 65

Lys Ser Arg Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 66

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL FW2

<400> 66

Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL CDR2

<400> 67

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 68

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL FW3

<400> 68

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL CDR3

<400> 69

Leu Gln Ala Thr His Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab Vl FW4

<400> 70

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH

<400> 71

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Thr Pro Asn Thr Gly Tyr Asn Glu Asn Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Val Arg Arg Thr Tyr Glu Gly Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL

<400> 72

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 73

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH

<400> 73

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Thr Gly Phe Thr Glu Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL

<400> 74

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Phe Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 75

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH

<400> 75

Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gln Val Val Arg Pro Gly Thr Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gln Phe Gly Leu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 76

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL

<400> 76

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser

20 25 30

Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Asp Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 77

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH

<400> 77

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Ile Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Arg Val Leu Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL

<400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 79

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH

<400> 79

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Met Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Asn Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL

<400> 80

Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Arg Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Glu Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210> 81

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VH DNA

<400> 81

gaggtcaaac tgcaggagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaggg cttctggcta cacctttacc agctattgga tacactgggt gaaagagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attactccta atacaggtta taatgagaac 180

agtcagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccaa cacagcttat 240

atgcaactaa gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgt aagaaggacg 300

tatgaggggt acctcgatgt ctggggcgca gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 82

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1Ab VL DNA

<400> 82

gacattgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaaccttgta cataataatg gaaacaccta tttagagtgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattg 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatccggga cagacttcac actcaatatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaggcttc acatgttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

<210> 83

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VH DNA

<400> 83

gaggtgcagc tgcaggagtc aggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg ttctggaatg gattggatac attaatccta atactggttt tactgaatat 180

agtcagaaat tcaaggacaa ggccacattg actgcagtca agtcctccag cacagcctat 240

atacaactga ccagcctgac atctgatgac tctgcagtct attactgtgc aagagagaac 300

tataggtacg acggggctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 84

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2Ab VL DNA

<400> 84

gatattgtgc taactcagtc tccagcactc atggctgcat ttccagggga cagggtcacc 60

atcacctgca gtgtcagctc aagtgtaagt tccagcaact tgcactggta ccaacagaag 120

tcagaaacct cccccaaacc ctggatttat ggcacatcca ccctggcttc tggagtccct 180

gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccact cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaacgg 327

<210> 85

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VH DNA

<400> 85

ggtgaactgc aggagtcagg gcctcaggtg gttaggcctg ggacttcagt gaagatatcc 60

tgcaaggctt ctggttattc attttccaac tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 120

ggacaaggtc ttgagtggat tggcgtgatt gatccttccg atagtgaaac tagattaaat 180

cagaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac agcctacatg 240

caactcagca gcccgacatc tgaggactct gcgatctatt attgtgcaag atcacagttc 300

gggctacgtt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 86

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3Ab VL DNA

<400> 86

gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc atgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgcc agtccagtca gagtctattc aacagtggaa ctcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaactgttga tctcctgggc atccactagg 180

gattctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

attaacggtg tgcaggctga agacctggca gtttatttct gtcagaatga ttatgattct 300

ccgtacacgt tcggaggggg gacgaagctg gaaataaaac gg 342

<210> 87

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VH DNA

<400> 87

gaggtgcaac tgcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tacactgggt gaaacagagc 120

cctggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatcctg acaatggtga tactggctac 180

aaccagattt tcaagaacaa ggccacattg actgtagaca cttcgtccag cgcagcctac 240

atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgt aagacgggtc 300

cttttggact cctggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345

<210> 88

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4Ab VL DNA

<400> 88

gatatccaga tgacacagac tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gtgcaagtca ggacattaac aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacagtcagg agtcccgtca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240

gaagatattg ccacttacta ttgtcaacaa tatagtaaac ttcctcggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 89

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VH DNA

<400> 89

gaggtgcagc tgcagcagtc agggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgaca tgtcttggat tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagat ggtcgcagcc attaatagta atggtggtag cacctattat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca aagccaagaa caccctatac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc gagccctaat 300

ggttacggag ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 90

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5Ab VL DNA

<400> 90

gatattgtga taacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcttcc 60

atctcttgca agtcacgtca gagcctctta gatagtgatg gaaaaaccta tttaaattgg 120

ttattacaga ggccaggcga gtctccaaag ctcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgct tgcaagctac acattttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

Claims

1.一种专一于登革病毒的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段选自由下列所组成之群组：

(i)第一抗体，其专一于登革病毒血清型第1型(DENV1)，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含如SEQ ID NO:2所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ IDNO:4所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:6所示之重链互补决定区3(HCCDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含如SEQ ID NO:9所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQ IDNO:11所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:13所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(ii)第二抗体，其专一于登革病毒血清型第2型(DENV2)，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含如SEQ ID NO:16所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQID NO:18所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:20所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含如SEQ ID NO:23所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQID NO:25所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:27所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(iii)第三抗体，其专一于登革病毒血清型第3型(DENV3)，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含如SEQ ID NO:30所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQID NO:32所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:34所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含如SEQ ID NO:37所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQID NO:39所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:41所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；以及

(iv)第四抗体，其专一于登革病毒血清型第4型(DENV4)，包含

(a)重链可变区(V_H)，包含如SEQ ID NO:44所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQID NO:46所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:48所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含如SEQ ID NO:51所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQID NO:53所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:55所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)。

2.如权利要求1所述的专一于登革病毒的分离的抗体或其抗原结合片段，其中

(i)该第一抗体包含包含SEQ ID NO:71的重链可变区(V_H)以及包含SEQ ID NO:72的轻链可变区(V_L)；

(ii)该第二抗体包含包含SEQ ID NO:73的重链可变区(V_H)以及包含SEQ ID NO:74的轻链可变区(V_L)；

(iii)该第三抗体包含包含SEQ ID NO:75的重链可变区(V_H)以及包含SEQ ID NO:76的轻链可变区(V_L)；及/或

(iv)该第四抗体包含包含SEQ ID NO:77的重链可变区(V_H)以及包含SEQ ID NO:78的轻链可变区(V_L)。

3.如权利要求1所述的专一于登革病毒的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自由所述之专一于登革病毒的分离的抗体的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'，以及F(ab')₂所组成之群组。

4.一种组合物，包含如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段。

5.如权利要求4所述的组合物，其为医药或诊断组合物，用于治疗或诊断登革病毒疾病。

6.如权利要求4所述的组合物，其包含医药上可接受之载体。

7.一种专一于登革病毒的分离的抗体或其抗原结合片段在制备在样本中检测登革病毒的套组的应用，其中该分离的抗体或其抗原结合片段选自由下列所组成之群组：

(i)第一抗体，其专一于登革病毒血清型第1型(DENV1)，其包含重链可变区(V_H)，该重链可变区(V_H)包含如SEQ ID NO:2所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ ID NO:4所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:6所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及轻链可变区(V_L)，该轻链可变区(V_L)包含如SEQ ID NO:9所示之轻链互补决定区1(LCCDR1)、如SEQ ID NO:11所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:13所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(ii)第二抗体，其专一于登革病毒血清型第2型(DENV2)，其包含重链可变区(V_H)，该重链可变区(V_H)包含如SEQ ID NO:16所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ ID NO:18所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:20所示之重链互补决定区3(HCCDR3)；以及轻链可变区(V_L)，该轻链可变区(V_L)包含如SEQ ID NO:23所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQ ID NO:25所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:27所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(iii)第三抗体，其专一于登革病毒血清型第3型(DENV3)，其包含重链可变区(V_H)，该重链可变区(V_H)包含如SEQ ID NO:30所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ ID NO:32所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:34所示之重链互补决定区3(HCCDR3)；以及轻链可变区(V_L)，该轻链可变区(V_L)包含如SEQ ID NO:37所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQ ID NO:39所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:41所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；

(iv)第四抗体，其专一于登革病毒血清型第4型(DENV4)，其包含重链可变区(V_H)，该重链可变区(V_H)包含如SEQ ID NO:44所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQ ID NO:46所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:48所示之重链互补决定区3(HCCDR3)；以及轻链可变区(V_L)，该轻链可变区(V_L)包含如SEQ ID NO:51所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQ ID NO:53所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:55所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)；以及

(v)任何(i)至(iv)之组合。

8.如权利要求7所述的应用，其中该第一抗体、该第二抗体、该第三抗体，以及该第四抗体中各自与配偶体抗体配对。

9.如权利要求8所述的应用，其中该配偶体抗体为登革病毒的血清型交叉反应抗体，其包含

(a)重链可变区(V_H)，其包含如SEQ ID NO:58所示之重链互补决定区1(HC CDR1)、如SEQID NO:60所示之重链互补决定区2(HC CDR2)，以及如SEQ ID NO:62所示之重链互补决定区3(HC CDR3)；以及

(b)轻链可变区(V_L)，包含如SEQ ID NO:65所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQID NO:67所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:69所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)。

10.如权利要求7所述的应用，其中

(i)该第一抗体与登革病毒的结合表示在该样本中存在DENV1；

(ii)该第二抗体与登革病毒的结合表示在该样本中存在DENV2；

(iii)该第三抗体与登革病毒的结合表示在该样本中存在DENV3；及/或

(iv)该第四抗体与登革病毒的结合表示在该样本中存在DENV4。

11.一种用于在样本中检测登革病毒的存在的套组，其中该套组包含一种或多种专一于登革病毒的抗体和配偶体抗体，所述一种或多种专一于登革病毒的抗体选自由下列所组成之群组：

(v)任何(i)至(iv)之组合。

12.如权利要求11所述的套组，其中该配偶体抗体为登革病毒的血清型交叉反应抗体，其包含

(b)轻链可变区(V_L)，其包含如SEQ ID NO:65所示之轻链互补决定区1(LC CDR1)、如SEQID NO:67所示之轻链互补决定区2(LC CDR2)，以及如SEQ ID NO:69所示之轻链互补决定区3(LC CDR3)。

13.如权利要求11所述的套组，其中所述的第一抗体、第二抗体、第三抗体和第四抗体的至少一种或该配偶体抗体包含可侦测到的标记。

14.如权利要求13所述的套组，其中该可侦测到的标记选自由酶标记、荧光标记、金属标记，以及放射性标记所组成之群组。

15.如权利要求13所述的套组，其中该可侦测到的标记选自由金纳米颗粒、有色乳胶珠、碳纳米颗粒，以及硒纳米颗粒所组成之群组。

16.如权利要求13所述的套组，其中该可侦测到的标记为磁性颗粒。

17.如权利要求11所述的套组，其中该套组为免疫测定套组。

18.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定为酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)。

19.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定为放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)。

20.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定为荧光免疫测定(fluorescenceimmunoassay，FIA)。

21.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定为免疫荧光测定(ILMA)。

22.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定以侧流测定形式进行。

23.如权利要求17所述的套组，其中该免疫测定为夹心式测定。