KR20230039785A

KR20230039785A - 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 n-말단 부위에 특이적인 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230039785A
Application number: KR1020220114336A
Authority: KR
Inventors: 부하령; 조은위; 허창규; 양지현; 임원희; 곽채원; 조유정
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2022-09-08
Publication date: 2023-03-21

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 N-말단 부위에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 N-말단 부위에 특이적인 항체 및 이의 용도 {An antibody specific to N-terminal region of coronavirus nucleocapsid protein and uses thereof}

코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 2019년 12월에 처음 보고된 사람 코로나바이러스(human coronavirus)인 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 감염되어 발생하는 중증급성호흡기 질환이다. 코로나바이러스는 1920년 후반에 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에서도 발견되었다. 사람 코로나바이러스는 감염자의 비말이 호흡기나 눈, 코, 입의 점막으로 침투될 때 전염되는 것으로 알려져 있으며, 계절에 따라 호흡기 감염증의 15-35%를 차지하며 대부분 감기와 같은 경미한 증상을 일으킨다. 하지만 치명적인 호흡기 질환을 일으킨 2009년에 발생한 사스(SARS)와 2012년 발생한 중동 호흡기 증후군(메르스, middle east respiratory syndrome, MERS) 역시 사람 코로나바이러스에 의한 감염성 질환으로 알려졌다. 특히, SARS-CoV-2 감염에 의한 COVID-19은 높은 치사율과 빠른 전파력에 의해 전세계로 확산되어 2020년 3월 세계보건기구(world health organization, WHO)에서 팬더믹(pandemic)으로 선언되었고, 일부 국가는 확진자가 다수 발생한 국가로부터의 입국을 통제하는 등 확산 방지에 총력을 기울이고 있다. 또한 SARS-CoV-2 변이 바이러스가 세계적으로 여러 지역에서 출몰하면서 COVID-19을 진단하고 통제하는 것이 더욱 어려운 상황이다.

감염병 통제를 위한 가장 필수적인 방법은 바이러스 감염 진단으로, 진단 시 가장 중요한 요소는 정확성과 신속성이다. 이에 따라, 분석 대상 개체의 코로나바이러스 감염 여부를 신속 정확히 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 코로나바이러스가 발현하는 항원 중 유전자 서열에 변이가 낮은 부위인 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP)의 단백질 N-말단 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하여 코로나바이러스의 진단에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

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10-2245849

B1

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10-2021-0076854

A

본 발명의 목적은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 N-말단에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 이용하여, 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 하나의 양태는 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 N-말단에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "코로나바이러스"는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 80-220 nm 크기의 양성 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus, ssRNA)를 지칭한다. 코로나바이러스는 가장 외각에 있는 스파이크(spike, S) 단백질, 헤마글루티닌-에스터라제(hemagglutinin-esterase, HE) 단백질, 멤브레인(membrane, M) 단백질, 엔벨로프(envelope, E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP) 단백질 등 5개의 구조 단백질을 포함하는 것으로 알려져 있다(Lai and Homes, 2001. Fields Virology).

일 구현예로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2일 수 있으나, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 검출될 수 있는 코로나바이러스는 제한 없이 포함된다.

본 발명의 용어, "SARS-CoV(SARS-CoV-1, 사스-코로나바이러스)"는 외피를 지닌 베타 코로나바이러스 속에 속하는 ssRNA 바이러스이다. SARS-CoV는 전체 게놈이 약 29,727 뉴클레오타이드로 구성되며, 현재까지 알려진 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 게놈을 갖는 바이러스이다.

SARS-CoV의 게놈은 11개의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 갖고 있으며 23종에 달하는 단백질을 코딩하고 있는 것으로 알려졌다. 사스-코로나바이러스의 주요 구조 단백질은 다른 코로나바이러스처럼 뉴클레오캡시드(NP), 스파이크(S), 멤브레인(M), 엔벨로프(E) 단백질임이 밝혀졌다. 이들 단백질에 대한 염기서열 분석결과, 사스-코로나바이러스가 다른 코로나바이러스와 비교하여 약 40 ~ 50% 정도의 매우 낮은 서열 상동성을 가짐이 밝혀졌다. 코로나바이러스의 항원성에 따른 계통발생학적 분류에 따르면, 사스 코로나바이러스는 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ그룹 중 Ⅱ그룹과 유연관계가 높은 것으로 나타났다.

본 발명의 용어, "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다.

SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 인간세포 표면에 존재하는 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)에 결합하여 인간세포에 진입하는 것으로 알려져 있다.

SARS-CoV-2는 RNA 의존적 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase), 스파이크(S), 뉴클레오캡시드(NP), 멤브레인(M) 단백질, 엔벨로프(E) 및 단백질 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 구조 단백질 중 뉴클레오캡시드(NP) 단백질은 유전물질인 ssRNA와 그 주위를 감싸며 RNA 복제에 관여한다. 스파이크(S) 단백질은 바이러스 입자 표면에 존재하여 숙주세포 침입에 관여하고, S1과 S2로 나누어진다. S1 단백질은 숙주세포의 수용체와 상호작용하는데, S1 단백질 내 존재하는 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)는 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 부위로 알려져 있다. S2 단백질은 숙주세포 세포막과의 융합에 관여한다. 상기 구조에 대한 내용은 Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2로 분류될 수 있는 모든 변이 형태 또한 제한 없이 포함하며, 그 예시로 알파(B.1.1.7 계통), 베타(B.1.351 계통: B.1.351.2, B.1.351.3), 델타(B.1.617.2 및 AY 계통: AY.1, AY.2, AY.3), 감마(P.1 계통: P.1.1, P.1.2) 변이로 칭해지는 변이를 포함할 수 있다. 변이형 SARS-CoV-2는 스파이크 단백질에 특정 치환 또는 치환 조합을 포함할 수 있고 그 예시로 L452R, E484K, K417N/T, E484K, N501Y 등을 들 수 있다.

일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질("N 단백질" 로도 지칭)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단에 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합하는 부위는 도 12(서열번호 91)으로 표시되는 상기 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단으로부터 1번 내지 174번 아미노산에 상응하는 서열 내에 포함될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 중 선택되는 어느 하나의 영역에 포함되는 항원결정부위(epitope)를 가질 수 있다:

i) 서열번호 91의 N-말단으로부터 1 내지 47번 아미노산; 및

ii) 서열번호 91의 N-말단으로부터 47번 내지 101번 아미노산.

본 발명의 일 구체예에서는 본 발명의 항체 3F10이 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단으로부터 1번 내지 47번 아미노산에 상응하는 서열 내에 결합 부위를 가지는 것을 확인하였고, 3E10 및 5B6이 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단으로부터 47번 내지 101번 아미노산에 상응하는 서열 내에 결합 부위를 가지는 것을 확인하였다.

한편 상기 도 12(서열번호 91)의 서열은 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 대표적인 예시로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합하는 위치를 표시하기 위한 참조 서열(reference sequence)로서, 당업자라면 임의의 서열을 도 12에 나타난 서열번호 91의 서열과 정렬(alignment)하여 임의의 서열 내 서열번호 91의 N-말단으로부터 특정 잔기 번호에 상응하는 위치 혹은 상응하는 서열 영역을 확인할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변 영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain, LC) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain, HC)를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 IgG 항체일 수 있다.

상기 용어 "단편", "폴리펩타이드의 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역(variable region)과 경쇄의 불변 영역(framework region, FR) 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 그 예로 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 단일클론 항체일 수 있다.

본 발명에서 용어, "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론 항체는 특정 항원결정부위(에피토프, epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이라 표기하는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역을 포함한다.

상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 표기하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 상보성 결정 영역은 비교적 보존적인, 불변 영역(FR)로 불리는 영역 사이에 배치되어 있다. 각각의 중쇄가변영역(VH) 및 경쇄가변영역(VL)은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄가변영역의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3으로, 경쇄가변영역의 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3으로, 중쇄가변영역의 FR은 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4로, 경쇄가변영역의 FR은 LFR1, LFR2, LFR3, LFR4로 지칭될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 N-말단에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편은,

(i) 서열번호 2의 HCDR1, 서열번호 4의 HCDR2, 서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 12의 LCDR2, 서열번호 14의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함;

(ii) 서열번호 20의 HCDR1, 서열번호 22의 HCDR2, 서열번호 24의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 28의 LCDR1, 서열번호 30의 LCDR2, 서열번호 32의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함;

(iii) 서열번호 38의 HCDR1, 서열번호 40의 HCDR2, 서열번호 42의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 46의 LCDR1, 서열번호 48의 LCDR2, 서열번호 50의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함; 또는

(iv) 서열번호 56의 HCDR1, 서열번호 58의 HCDR2, 서열번호 60의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 64의 LCDR1, 서열번호 66의 LCDR2, 서열번호 68의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

(i) 서열번호 1의 HFR1, 서열번호 3의 HFR2, 서열번호 5의 HFR3, 서열번호 7의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 9의 LFR1, 서열번호 11의 LFR2, 서열번호 13의 LFR3, 서열번호 15의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함;

(ii) 서열번호 19의 HFR1, 서열번호 21의 HFR2, 서열번호 23의 HFR3, 서열번호 25의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 27의 LFR1, 서열번호 29의 LFR2, 서열번호 31의 LFR3, 서열번호 33의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함;

(iii) 서열번호 37의 HFR1, 서열번호 39의 HFR2, 서열번호 41의 HFR3, 서열번호 43의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 45의 LFR1, 서열번호 47의 LFR2, 서열번호 49의 LFR3, 서열번호 51의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함; 또는

(iv) 서열번호 55의 HFR1, 서열번호 57의 HFR2, 서열번호 59의 HFR3, 서열번호 61의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 63의 LFR1, 서열번호 65의 LFR2, 서열번호 67의 LFR3, 서열번호 69의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8, 26, 44, 62 중 어느 하나의 중쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는 것일 수 있다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 16, 34, 52, 70 중 어느 하나의 경쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는 것일 수 있다.

(i) 서열번호 17의 중쇄가변영역 및 서열번호 18의 경쇄가변영역;

(ii) 서열번호 35의 중쇄가변영역 및 서열번호 36의 경쇄가변영역;

(iii) 서열번호 53의 중쇄가변영역 및 서열번호 54의 경쇄가변영역; 또는

(iv) 서열번호 71의 중쇄가변영역 및 서열번호 72의 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질의 N-말단에 특이적으로 결합하는 4종의 항체를 개발하였으며, 이들 항체가 도 11에 나타낸 바와 같은 CDR 및 FR 서열을 가지는 것을 확인하여 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 가변 영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었으며(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조) 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 항체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.

그 예로, 파지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.

상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현 벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현 벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 보우스 멜라노마(bowes melanoma) 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간배아신장세포, human embryonic kidney cells), PER.C6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 봄바드먼트(bombardment) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질주입, 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.

본 발명의 목적상, 상기 진단은 코로나바이러스 감염 질환의 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 "코로나바이러스 감염 질환"은 코로나바이러스가 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하는 감염에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 구체적으로는 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2) 및 SARS-CoV (사스-코로나바이러스)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 그 예로 상기 코로나바이러스 감염 질환은 COVID-19 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 코로나바이러스 감염 진단용 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외의 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또한, 이 밖에 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합 반응에 필요한 물질, 예를 들어 시약이 더 포함될 수 있다. 또한, 이 결합을 검출하는데 필요한 물질, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 안정화를 위한 물질 등이 더 포함될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 진단용 조성물에는 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 더 포함될 수 있다. 상기 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91의 N-말단으로부터 364번 내지 419번 아미노산 영역에 포함되는 항원결정부위(epitope)를 갖는 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 진단용 조성물은 서열번호 74의 HCDR1, 서열번호 76의 HCDR2, 및 서열번호 78의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 82의 LCDR1, 서열번호 84의 LCDR2, 및 서열번호 86의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함할 수 있다

일 예로, 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 표지 된 것일 수 있다. 분자 표식에 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, ³²P 또는 ¹²⁵I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들 역시 잘 알려져 있다.

본 발명의 키트는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합을 검출하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.

일 예로, 본 발명의 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.

일 예로, 상기 키트는 고체 담체; 분석하고자 하는 검체를 수용하고 버퍼 투입부 및 검체 투입부를 구비하는 검체 패드; 상기 검체 패드에서 유입된 검체에 함유되어 있는 코로나바이러스와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 컨쥬게이트 패드; 상기 검체에 코로나바이러스가 존재하는지 여부를 검출하는 신호검출부와 분석 물질의 존재 유무와 관계없이 검체가 흡수 패드로 이동하였는지 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 신호 검출 패드; 및 신호 검출 반응이 종료된 검체를 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있다. 본 발명의 용어 "ELISA"는 효소면역측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지 된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지 된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지 된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지 된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.

일 구현예로, 본 발명의 키트는 샌드위치 ELISA 키트 일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 샌드위치 ELISA 키트에는 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과는 다른 부위를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 더 포함될 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 샌드위치 ELISA 키트에는 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 더 포함될 수 있다. 상기 C-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 91의 N-말단으로부터 364번 내지 419번 아미노산 영역에 포함되는 항원결정부위(epitope)를 갖는 것일 수 있다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 샌드위치 ELISA 키트에는 포획 항체(capture antibody) 와 검출 항체(detection antibody)로 서열번호 2의 HCDR1, 서열번호 4의 HCDR2, 서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역, 및 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 12의 LCDR2, 서열번호 14의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 서열번호 74의 HCDR1, 서열번호 76의 HCDR2, 및 서열번호 78의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 82의 LCDR1, 서열번호 84의 LCDR2, 및 서열번호 86의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 포함될 수 있다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 샌드위치 ELISA 키트에는 포획 항체(capture antibody) 와 검출 항체(detection antibody)로 서열번호 20의 HCDR1, 서열번호 22의 HCDR2, 서열번호 24의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 28의 LCDR1, 서열번호 30의 LCDR2, 서열번호 32의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 서열번호 74의 HCDR1, 서열번호 76의 HCDR2, 및 서열번호 78의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 82의 LCDR1, 서열번호 84의 LCDR2, 및 서열번호 86의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 포함될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생물학적 시료와 접촉시켜, 반응을 확인하여 생물학적 시료 내 코로나바이러스 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 준비가 가능하다.

일 예로, 본 발명의 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법은 (a) 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 접촉으로 형성된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 코로나바이러스 NP 단백질의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포 분석법(fluorescence-activated cell sorting, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체를 이용함으로써 기존의 코로나바이러스 검출 항체에 비해 훨씬 적은 양의 코로나바이러스도 검출할 수 있으므로, 본 발명의 항체를 코로나바이러스 검출 및 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 불활화된 SARS-CoV-2 접종을 통해 면역화시킨 마우스 유래 B 세포 하이브리도마들이 생산하는 항체들의 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 반응성을 ELISA로 확인한 결과이다. 면역화마우스의 비장을 채취하여 B 림프구(lymphocyte)를 수집하고, 마우스 골수종(myeloma) 세포와 융합하여 B 세포 하이브리도마 세포군을 구축하였다. 각 하이브리도마에서 분비하는 항체들을 대상으로 NP 단백질에 대한 반응성을 ELISA로 확인하여 항-NP 항체를 분비하는 B 세포 하이브리도마들을 선별하였고, 하이브리도마 모세포를 순차 희석하는 서브클로닝(subcloning)을 수회 실시하여 최종적으로 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항-NP 항체 4종을 선별하였다.
도 2는 발굴된 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항-NP 항체의 NP 항원 특이성을 확인한 결과이다. ELISA 방법으로 상업적으로 이용되는 뉴클레오캡시드(NP), SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 과 S2 단백질, S1 단백질 내 존재하는 수용체 결합 도메인(RBD) 항원에 대한 재조합 단백질(Sino Biological사)이 각각 코팅된 웰에 Protein G 레진으로 정제한 4종의 항-NP 항체를 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP(anti-mouse IgG-HRP, CST사) 항체로 검출하였다.
도 3은 신규 항체 4종(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)과 상업적으로 이용되는 2종의 항-SARS-CoV-2 NP 항체 4B21과 B46F를 이용하여 SARS-CoV-2 NP 항원 반응성을 비교한 ELISA 결과이다. SARS-CoV-2 NP 항원이 코팅된 웰에 항-NP 항체들을 순차적으로 희석하여 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP 항체로 검출하였다.
도 4는 신규 항체 4종(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)과 상업적으로 이용되는 2종의 항-SARS-CoV-2 NP 항체 4B21과 B46F를 이용하여 SARS-CoV NP 항원(SARS-CoV-2 NP와 아미노산 서열이 91% 동일)반응성을 비교한 ELISA 결과이다. SARS-CoV NP 항원 단백질이 코팅된 웰에 항-NP 항체들을 순차적으로 희석하여 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP) 항체로 검출하였다.
도 5는 기존에 보고된 2종의 항-SARS-CoV-2 NP 항체 4B21과 B46F와 정제된 신규 항체 4종을 이용하여 불활화 SARS-CoV-2 바이러스 용해물에 대한 반응성을 비교한 ELISA 결과이다. 불활화 SARS-CoV-2 바이러스 용해물이 코팅된 웰에 항-NP 항체들을 순차적으로 희석하여 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP 항체로 검출하였다.
도 6은 신규 항체 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체가 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질의 선형(linear) 또는 입체의(conformational) 에피토프를 인지하는지 조사하기 위해 수행한 웨스턴 블롯(western blot, WB)결과이다. SARS-CoV-2 NP 재조합 항원 단백질을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 이동시킨 후, 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체를 1차 항체로 사용하고 2차 항체로 항-마우스-IgG-HRP 항체를 처리하였다. SDS-PAGE에 전개한 NP는 예측된 분자량인 47.33 kDa 보다 약간 위쪽에서 확인되었으며, 웨스턴 블롯에서도 동일한 위치에서 단백질 밴드가 검출됨을 확인하였다.
도 7은 항-NP 항체가 세포내 발현하는 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질도 특이적으로 결합함을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다. 상업적으로 이용되는 SARS-CoV-2 NP-His/pCMV3(Sino biological사) 플라스미드를 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하고, 세포파쇄액을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF 멤브레인에 이동시켜 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체로 특정단백질을 검출한 웨스턴 블롯 결과이다. 양성대조군 항체로 항-His 항체를 처리하여 NP-His 단백질이 세포 내에서 번역 후 변형(post-translational modification) 과정을 거쳐 예측된 분자량인 47.33 kDa에서 발현되었음을 확인하였고, 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체 모두 항-His 항체와 동일한 위치의 단백질과 결합함을 확인하였다.
도 8은 신규 항-NP 항체가 면역침강법(immunoprecipitation)에도 적용 가능한지 확인하기 위해, 도 7의 세포내 발현하는 NP 단백질에 대한 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체의 특이반응성을 이용하여 상업적으로 사용되는 SARS-CoV-2 NP-His/pCMV3 플라스미드를 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하고, 세포파쇄액을 신규 항체와 혼합한 후 Protein G 레진으로 항체를 포획하여, 항체에 결합된 항원이 함께 검출되는 것을 확인한 결과이다. 3E10 항체에 음성대조군 항체로 동일 아형(IgG2b)를, 3F10과 5B6 항체의 음성대조군 항체로는 동일 아형(IgG2a) 항체를 세포파쇄액과 혼합하여 비교하였다. 그 결과 3E10, 3F10, 5B6 항체 모두 면역침강능에 적용 가능한 항체임을 확인하였으나, 5B6.8 항체는 면역침강능을 보이지 않았다.
도 9는 항-SARS-CoV-2 NP 항체의 정교한 항원결정부위를 결정하기 위해 특정 아미노산 서열이 결손 된 NP 절편 변이체를 제조(cloning)한 재조합 단백질들의 구성 부위를 표기한 모식도이다. 총 2종의 부분결손 재조합 단백질을 준비하였고, NP(1-174 AA)-p1-His(서열 1~174 아미노산을 가지는 부분결손 단백질), NP(1~248 AA)-p2-His(서열 1~248 아미노산을 가지는 부분결손 단백질)로 명명하였다.
도 10은 SARS-CoV-2 NP 부분결손 재조합 단백질을 발현하고, 항-NP 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여 항원결정부위를 결정한 결과이다. N-말단부위를 포함하는 NP(1-174 AA)-p1-His(NP 서열 1~174 아미노산)과 NP-말단부위와 SR-rich 부분을 포함하는 NP(1-248 AA)-p2-His(NP 서열 1~248 아미노산) 단백질을 대장균에서 발현유도하고, 그 세포파쇄액과 상업적으로 사용되는 전체 NP(서열 1~419 아미노산) 단백질(Sino Biological사)을 환원성 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 PVDF 멤브레인에 이동시키고 항-NP 항체로 항원결정부위를 내포하고 있는 특정 NP 부분결손 단백질 검출 여부를 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체 4종 모두 NP 단백질의 1내지 174번째 부위가 이들의 항원결정부위임을 확인하였다. 양성대조군으로 항-His 항체를 이용하여 재조합 단백질의 올바른 발현을 확인하였다.
도 11은 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항-NP N-말단부위 인식 항체의 중쇄변이영역(VH)와 경쇄변이영역(VL)의 상보성결정지역(CDR)을 분석한 결과이다. 항체 생성 B 세포 하이브리도마로부터 추출한 총 RNA(total RNA)에 대해 complementary DNA (cDNA)를 합성하고, 중쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머와 경쇄변이영역 상보성결정지역 프라이머를 사용 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭한 후 T-벡터에 접합(ligation)하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드를 숙주세포에서 증폭시키고, 추출하여 상보성결정지역 해당 부위를 염기서열 분석하였다. 분석된 염기서열로부터 단백질서열을 확인하고, KaBat CDR 정의를 바탕으로 CDR 서열을 결정하였다.
도 12는 SARS-CoV-2 NP 단백질의 서열 정보를 표시한 것이다.
도 13 내지 16은 1G6 항체의 특성을 확인한 결과이다.
도 17은 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질과 절편 단백질의 모식도 및 항원결정부위(epitope)를 보다 정교하게 결정하기 위해 추가 분석한 결과이다. 도 17A는 SARS-CoV-2 NP 구조의 모식도로, 전장 NP는 1-419번; NP-NTD는 47-174번; NP-CTD는 248-364번; NP-p1은 1-174번; NP-p2는 1-248번; NP-p3은 1-305번; NP-p4는 101-419번; NP-p5는 248-419번 아미노산을 가지는 부분결손 재조합 단백질을 준비했다. 도 13B는 Western Blot 결과로, 환원성 12% SDS-PAGE에 재조합 단백질을 전개시킨 후 PVDF 멤브레인에 이동시키고 항-NP 항체로 항원결정부위를 내포하고 있는 특정 NP 부분결손 단백질 검출 여부를 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 3F10항체의 항원결정부위는 NP 단백질의 1 내지 47번째 부위임을 확인하였고, 3E10과 5B6는 NP 단백질의 47 내지 101번 부위가 이들의 항원결정부위임을 확인하였다. 1G6 항체는 NP 단백질의 364 내지 419번 부위가 이들 항체의 항원결정부위임을 확인하였다.
도 18은 신규 항-NP 항체 쌍를 탑재한 sandwich ELISA 방식에서 SARS-CoV-2 NP, SARS-CoV-2 viral lysate 인식을 비교 분석한 결과이다. 항-NP 항체 중 SARS-CoV-2 NP에 가장 강한 결합력을 가진 3E10을 포획 항체(Capture Ab)로 ELISA 플레이트 바닥에 코팅한 후 세척하였다. SARS-CoV-2 NP 재조합 단백질을 첨가 후 세척한 다음 HRP가 결합된 항-NP 항체로 검출하였다. 도 18A는 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질 검출을 위한 sandwich ELISA 방식에서 가장 효과적인 포획 항체와 검출 항체 쌍은 1G6와 3E10임을 나타낸다. 도 18B는 SARS-CoV-2 바이러스 용해물 검출을 위한 sandwich ELISA 방식에서 가장 효과적인 포획 항체와 검출 항체 쌍은 1G6와 3E10임을 나타낸다.
도 19는 알파, 베타, 감마 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 NP에 대한 항-NP 항체 결합능을 비교한 결과이다. 좌측은 SARS-CoV-2 바이러스 변이형의 NP 단백질 내 아미노산 변이 위치를 나타낸 모식도로 붉은색으로 변이를 표시하였다. 우측은 본 발명의 항체를 이용한 ELISA 결과로, SARS-CoV-2 변이형 바이러스 NP 항원이 코팅된 웰에 항-NP 항체들을 순차적으로 희석하여 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP 항체로 검출하였다. 항-NP 항체(3E10, 3F10, 5B6) 모두 알파, 베타, 감마 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 NP에 결합력을 가짐을 확인하였다.
도 20은 3E10, 1G6 항체 쌍을 탑재한 sandwich ELISA 에서 SARS-CoV-2 변이 바이러스의 NP 인식능을 확인한 결과이다. 3E10을 포획 항체로 코팅한 ELISA 플레이트에 SARS-CoV-2 변이형 항원 NP 재조합 단백질을 첨가 후 HRP가 결합된 1G6 항체로 검출하였다. 알파, 베타, 감마 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 NP 모두 3E10, 1G6 항체 쌍을 탑재한 sandwich ELISA에서 검출됨을 확인하였다. 음성대조군인 HRP가 결합된 influenza NP 항체를 이용한 경우 검출되지 않음을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마우스 유래의 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론항체 제조

항-SARS-CoV-2 NP 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 본 발명자는 항원으로서 불활화시킨 SARS-CoV-2를 사용했다. 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오(경기도, 대한민국)에서 구입하여 무균시설에 사육했다. 베타프로락톤(betapropiolactone)으로 불활화한 SARS-CoV-2(NMC-nCoV02, 2020년 2월 한국에서 COVID-19 환자로부터 확보한 분리주)를 마우스에 2주 간격으로 발바닥 주사로 TiterMax Gold 보조제(Sigma-Aldrich사)와 혼합하여 10 μg 바이러스를 총 3회 면역화 하였다. 최종 면역화 2주 후에, 면역세포를 림프절로부터 분리하고 항-SARS-CoV-2 NP 항체를 생성하는 B 세포 하이브리도마를 제조하는데 사용하였다. 마우스 골수종세포인 Follicular(F0) 세포와의 융합은 일반적인 B 세포 하이브리도마 제조법 및 HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) 배지 선별법에 따라 수행하였다.

503개의 초기 클론의 배양 상등액을 이용하여 SARS-CoV-2 NP(서열 1~419 아미노산) 재조합 단백질 항원에 대한 반응성을 ELISA기법을 통해 확인하였다.

구체적으로, MaxiSorp 96-웰 플레이트(Thermo Scientific사) 바닥에 부착시킬 항원(antigen, Ag)은 SARS-CoV-2 NP(서열 1~419 아미노산) 재조합 단백질(Sino Biological사)을 PBS(phosphate-buffered saline)에 희석하여 웰 당 100 ng를 처리하고 4℃에서 16시간 동안 부착하였다. 부착하지 않은 물질을 제거하기 위하여 플레이트를 0.05% Tween-20이 들어간 PBS(PBST)로 3번 세척한 후, 1% bovine serum albumin(BSA)가 추가된 PBS로 37℃에서 1시간 동안 처리하여 비특이적 반응이 일어나지 않게 준비하였다. 1차 클론의 배양 상층액을 37℃에서 2시간 동안 항온 반응시키고, PBST로 3회 세척하여 잔여물을 제거한 후 horse-radish peroxidase(HRP)가 붙어있는 항-마우스 IgG(1:5000 희석, CST사)와 함께 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 발색 테트라메틸벤지딘기질(TMB, 3, 3’, 5, 5’-Tetramethyl-benzidine; BD Biosciences사)을 사용하여 반응물을 발색시키고 2N H₂SO₄로 반응을 종결시켰다. VICTOR Nivo 플레이트 판독기(PerkinElmer사)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도 (optical density, OD)를 측정하였다. 총 503개 초기 클론 중 높은 광학밀도(OD) 값이 가지는 클론을 선별하여 단일클론 하이브리도마 선별과정을 진행하였다(도 1). 5B6 모세포로부터는 5B6과 5B6.8 총 2개의 단클론을 확보하여, 최종적으로 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항-NP 항체 4종을 선별하였다.

실시예 2: 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론 항체 아형 결정

실시예 1에서 선별된 4개의 하이브리도마에서 분비하는 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론 항체의 아형(isotype)을 확인하기 위해, 마우스 항체 아형 키트(isotyping kit; Pierce사)를 이용하여 결정하였다.

구체적으로, 마우스 항체 아형(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM) 특이반응 항-마우스 포획항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 하이브리도마 배양액을 TBS(Tris-buffered saline)에 1/50 희석하여 웰 당 50 μl를 처리하고, 동시에 항-마우스-IgG+IgA+IgM-HRP 항체를 처리하여 1시간 동안 반응을 유도한 후 TMB를 이용한 발색반응을 수행하였다.

확인 결과, 3E10은 IgG2b 카파-체인, 3F10과 5B6는 IgG2a 카파-체인 아형, 5B6.8은 IgG3 카파-체인 아형으로 나타났다(표 1).

실시예 3. SARS-CoV-2 유래 항원에 대한 항-SARS-CoV-2 NP 항체의 반응성 확인

실시예 1에서 발굴된 항-SARS-CoV-2 NP 항체의 특이성을 확인하기 위해, ELISA 기법을 이용하여 SARS-CoV-2 구조 단백질인 뉴클레오캡시드(NP, 서열 1~419 아미노산), 스파이크(S) 단백질을 구성하는 S1(스파이크 서열 1~685 아미노산)과 S2(스파이크 서열 686~1273 아미노산), S1 내 존재하는 RBD(스파이크 서열 319~541 아미노산) 항원에 대한 재조합 단백질(Sino Biological사)에 대한 반응성을 비교하여 확인하였다. MaxiSorp 96-웰 플레이트 바닥에 부착시킬 S1, S2, RBD, NP 재조합 단백질 항원은 웰 당 100 ng으로 사용하였으며, 구체적인 실험방법은 실시예 1과 같다.

실험 결과, 실시예 1에서 확보한 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)는 NP 항원에 대해서만 높은 흡광도를 보이지만, 나머지 항원들(S1, S2, RBD)에는 반응성을 보이지 않았다(도 2).

즉, 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)는 SARS-CoV-2 유래 항원 중 NP에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4. 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론 항체 민감도 및 특이도 비교

SARS-CoV NP 및 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 결합 능력의 차이를 확인하기 위해, 정제한 신규 항체 4종을 다양한 농도로 준비하여 ELISA를 수행하였다.

결합 능력을 비교 분석하기 위해, 대조군으로 시판중인 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론 항체인 B46F(Thermo Scientific사)와 4B21(Creative Diagnostics사)를 같이 사용하였다.

먼저, SARS-CoV-2 NP 항원을 웰 당 100 ng으로 부착시킨 ELISA plate를 이용하여 항체를 3 μg부터 순차 희석한 용액을 1차 항체로 37℃에서 2시간 동안 항온 반응시켰다. PBST로 3회 세척하여 잔여물을 제거한 후 HRP가 붙어있는 항-마우스 IgG(1:5000 희석)로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, TMB 용액을 첨가하여 반응물을 발색시키고 2N H₂SO₄로 추가하여 반응을 종결시켰으며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 3E10와 5B6가 SARS-CoV-2 NP와의 결합 능력이 가장 높게 나타났으며, B46F, 3F10, 5B6.8, 4B21 순으로 결합 능력이 확인되었다(도 3).

또한, 개발한 항체의 특이성을 확인하기 위해, SARS-CoV-2 NP와 유전자 서열이 91% 유사한 SARS-CoV NP에 대한 인식능력을 확인하였다.

ELISA 기법을 위해, 부착 항원은 SARS-CoV NP(Sino biological사) 항원을 웰 당 100 ng으로 부착시킨 후 상기 방법과 동일하게 실험을 수행하였다. SARS-CoV NP 항원에 대한 결합 능력은 5B6, 3E10, B46F, 3F10, 4B21, 5B6.8 순임을 확인하였다(도 4).

항원과 항체의 결합 능력을 정량화 할 수 있는 EC50(effective concentration 50%, 항원을 인식하는 능력이 50%에 도달하기까지의 유효 농도) 값은 하기 표 2에 나타내었다.

Antibody	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV-2 NP	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV NP
3E10	2	2
3F10	369	10
5B6	4	4
5B6.8	437	1316
B46F(Commercial mAb)	68	43
4B21(Commercial mAb)	12690	60

SARS-CoV-2 NP에 대한 EC50 값은 도 3의 결과와 일치하게, 3E10(2 ng/mL), 5B6(4 ng/mL), B46F(68 ng/mL), 3F10(369 ng/mL), 5B6.8(437 ng/mL), 4B21(12690 ng/mL) 순으로 확인되었다.

또한 SARS-CoV NP에 대한 EC50 역시 도 4의 결과와 유사하게, 3E10(2 ng/mL), 5B6(4 ng/mL), 3F10(10 ng/mL), B46F(43 ng/mL), 4B21(60 ng/mL), 5B6.8(1316 ng/mL) 순으로 확인하였다.

이러한 결과는, SARS-CoV-2 NP 항원을 인식하는 신규 항체 4종 모두 상용화 항체와 유사하거나 더 높은 수준으로 SARS-CoV-2 NP 단백질 N-말단 부위를 높은 민감도로 인식할 수 있음을 확인한 것으로, 특히 5B6와 3E10은 SARS-CoV-2 NP 뿐만 아니라 SARS-CoV NP를 인식하는데 고민감도를 가지는 항체임을 알 수 있다.

실시예 5: 항-SARS-CoV-2 단일클론 항체를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 진단

신규 항-SARS-CoV-2 NP 항체가 실제 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는데 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 불활화한 SARS-CoV-2 용해물을 이용하여 확인하였다.

구체적으로, 불활화 SARS-CoV-2 용해물(Native Antigen사)을 웰 당 500 ng으로 하여 4℃에서 16시간 동안 부착한 후, 상기 방법과 동일하게 ELISA를 수행하였다.

흡광도를 측정한 결과, 4종의 신규 항체들(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8) 모두 상용화 항체들(4B21, B46F)보다 높게 SARS-CoV-2 용해물에 결합하는 것을 확인하였다(도 5).

EC50 값 역시 3E10(4 ng/mL), 5B6(10 ng/mL), 3F10(10 ng/mL), 5B6.8(1056 ng/mL), B46F(1246 ng/mL), 4B21(20760 ng/mL) 순으로 확인하였다(표 3).

Antibody	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV-2 viral lysates
3E10	4
3F10	10
5B6	10
5B6.8	1056
B46F(Commercial mAb)	1246
4B21(Commercial mAb)	20760

이러한 결과를 통해, 신규 항체 4종 모두 기존 항체와 비교할 때 SARS-CoV-2 용해물에 높은 민감도를 가지기 때문에 SARS-CoV-2를 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다고 판단된다.

실시예 6. 항-SARS-CoV-2 NP 단일클론 항체의 에피토프 인식 특이성 확인

항-SARS-CoV-2 NP 항체가 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질의 선형(linear) 또는 입체의(conformational) 에피토프를 인지하는지 조사하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blot, WB)을 수행하였다.

구체적으로, SARS-CoV-2 NP (1 μg)를 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하였고 PVDF멤브레인으로 이동시켰다. 비특이적 부착을 막기 위해, 5% 탈지 우유가 추가된 PBST로 상온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹한 후, 개발한 단일클론 항체(2 μg/mL)로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. PBST로 10분씩 3번 멤브레인을 세척하고, HRP가 접합된 항-마우스 IgG (1:5000 희석)와 함께 추가 반응시켰다. 면역반응성 밴드는 증강화학발광(Enhanced Chemi-Luminescence, ECL)법으로 반응시키고 Azure C300 Western blot 이미저(Azure Biosystems사)를 사용하여 시각화 했다.

확인 결과 예측된 47.33 kDa 분자량보다 약간 높은 위치에서 NP 재조합 항원 단백질이 SDS-PAGE에서 검출되었으며, SARS-CoV-2 NP 항원 단백질 위치에서 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8) 모두 NP 단백질을 동일한 위치에서 검출하였다(도 6). 이러한 결과는 이들 항체가 SARS-CoV-2 NP 단백질의 선형 에피토프를 인식할 수 있음을 암시한다.

실시예 7. 세포 내 발현하는 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 항-NP 항체 특이 반응성 확인

항-SARS-CoV-2 NP 항체 4종(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)의 세포 내에서 발현하는 SARS-CoV2 NP 단백질을 인식할 수 있는지 확인하기 위해서 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

구체적으로, NP-10xHis(NP-His) 발현 벡터를 PEI(polyethylenimine)를 이용하여 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼[PBS containing 1.0%(v/v) NP40, 0.1% Sodium Dodecyl Sulfate, 0.5% Sodium Deoxycholate, protease inhibitor cocktail(Roche사)]에 녹여 단백질 분석 시료로 사용하였다. 세포 파쇄액의 단백질 정량은 Bradford 방법으로 실시하였다. 준비된 단백질 시료는 10 μg씩 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하였고, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 5%(w/v) 탈지 우유를 포함하는 TBS 용액에 담가 블로킹한 후, 정제한 항-NP 항체들 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8(0.5 μg/mL) 혹은 마우스 항-6xHis 항체(1:5000, Qiagen사)를 블로킹 용액에 희석하여 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광법으로 항체와 결합한 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과, 예측된 47.33 kDa 분자량을 갖는 NP-His 단백질을 항-6xHis 항체 결합 밴드와 동일한 위치에서 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8) 모두 항-NP 항체 결합 밴드가 확인되었다(도 7).

실시예 8. 세포 내 발현하는 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 항-NP 항체의 면역침강능 확인

실시예 7의 세포 내에서 발현하는 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 항-NP 항체 4종(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)의 특이 반응성을 바탕으로 이들 항체의 NP 항원에 대한 면역침강능을 검증하였다.

구체적으로, 항원면역침강을 위해 NP-10xHis 발현 벡터를 PEI를 이용하여 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼에 녹여 면역침강 단백질 분석 시료로 사용하였다. 세포 파쇄액을 Bradford 방법으로 정량하고, 800 μg의 세포 파쇄액 단백질 시료를 5 μg의 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체 혹은 음성대조군 항체인 동일 아형(IgG2a, IgG2b)과 혼합하여 4℃에서 16시간 동안 잘 섞어주면서 항원-항체 결합을 유도하였다. 항원에 결합된 항체는 Protein G 레진(Santacruz사)으로 4℃에서 4시간 포획하였다. 포획반응 후 레진을 RIPA 버퍼로 충분히 세척하고 40 μl의 SDS-PAGE 샘플버퍼를 첨가하고 100℃에서 가열하는 방법으로 항원을 포함하는 면역침강 단백질 시료를 준비하였다. 단백질 시료를 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하고, PVDF 멤브레인으로 이동시킨 후 먼저, 항-래빗-IgG-HRP (anti-rabbit-IgG-HRP)로 웨스턴 블롯하여 비특이 검출 단백질 band가 존재하지 않음을 확인한 후 래빗 항-6xHis 항체(Rabbit anti-6xHis-mAb, Sigma-Aldrich사)를 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-래빗 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광법으로 면역침강 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과, 3E10, 3F10, 5B6 항체를 이용한 면역침강시료에서만 47.33 kDa 분자량을 갖는 NP-His 단백질이 래빗 항-6xHis 항체에 의해 검출됨을 확인하여, 항-NP 항체 3종(3E10, 3F10, 5B6)의 항원면역침강능을 확인하였다(도 8).

실시예 9. SARS-CoV-2 NP 단백질 내 항-NP 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체의 항원결정부위 결정(Fine Epitope Mapping)

SARS-CoV-2의 구조 단백질 중 하나인 NP는 SARS-CoV-2의 게놈 패키징을 담당하고, 419개의 아미노산을 가지며 N-arm(서열 1~46 아미노산) RNA 결합부위인 N-말단 도메인(서열 47~174 아미노산), 다수의 세린과 아르기닌을 가진 링커(서열 175~247 아미노산), NP 단백질들이 이합체를 형성할 수 있게 하는 C-말단 도메인(서열 248~364 아미노산), C-tail(서열 365~419 아미노산)으로 구성된다. 불활화 SARS-CoV-2 면역화 마우스 유래 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체는 실시예 3의 결과로 SARS-CoV-2의 구조 단백질 중 NP에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 이에 더해 보다 정교한 항원결정부위를 결정하였다.

구체적으로 전체 아미노산 서열을 가지고 있는 NP 재조합 단백질(Sino Biological사)와 2종의 NP 부분결손 단백질을 제조(cloning)하였다. 도 9는 NP의 도메인 구성과 발현된 NP 재조합 단백질들이(NP-His, NP-p1-His, NP-p2-His) 모식도 및 아미노산 서열정보를 나타낸다. 단백질을 발현하기 위해, 표 4에 표기된 각각의 특이 프라이머들과 pfu DNA 중합효소(Biofact사)를 이용하여 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Gene ORF cDNA clone expression plasmid, C-His tag(Sino Biological사) 10 ng을 주형으로 PCR 반응을 진행하였다.

프라이머	서열
NP F	5'	agcAAGCTTgccaccATGAGTGACAATGGACCACAGA	3'
NP-p1 R	5'	agcGATATCCTCAGCATAGAAGCCCTTTG	3'
NP-p2 R	5'	agcGATATCGGTCACTGTTTGTCCCTGTTG	3'
IgG2a 중쇄 F	5'	cttccggaattcSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG	3'
IgG2a 중쇄 R	5'	ggaagatctCTTGACCAGGCATCCTAGAGT	3'
IgG2b 중쇄 F	5'	cttccggaattcSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG	3'
IgG2b 중쇄 R	5'	ggaagatctAGGGGCCAGTGGATAGACTGA	3'
카파 경쇄 F	5'	gggagctcGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA	3'
카파 경쇄 R	5'	ggtgcatgcGGATACAGTTGGTGCAGCATC	3'

확보된 유전자와 pCMV3 벡터(Sino Biological사)를 제한효소(HindIII/EcoRV)로 37℃에서 15시간 처리한 후, 절단된 유전자와 벡터를 일정비율로 혼합하여 라이게이즈(Roche사)를 첨가한 후 16℃에서 16시간 동안 접합(ligation) 반응을 진행하였다. 접합 반응 혼합물은 DH5α에 형질전환시키고 카나마이신 항생제를 포함한 LB제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 플레이트에 자란 콜로니를 선택하여 LB제한액체배지에 배양하여 증폭된 재조합 플라스미드를 분리하였으며, 분리된 플라스미드에 도입된 유전자의 염기서열을 확인한 후 NP-10xHis/pCMV3(Sino biological사), NP-p1-10xHis/pCMV3, NP-p2-10xHis/pCMV3 발현 벡터를 PEI를 이용하여 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼에 녹여 단백질 분석 시료로 사용하였다.

세포 파쇄액의 단백질 정량은 Bradford 방법으로 실시하였다. 준비된 단백질 시료는 20 μg씩 환원성 12% SDS-PAGE 조건에서 전개하였고, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 5 % (w/v) 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 TBS 용액에 담가 블로킹한 후, 정제한 항-NP 항체(0.5 μg/mL) 혹은 마우스 항-6xHis 항체(1:5000, Qiagen사)를 블로킹 용액에 희석하여 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 처리 후 TBST로 충분히 세척하고 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP를 처리한 후 증강화학발광법으로 항체반응 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과, 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)는 NP-His(47.33 kDa, 서열 1~419 아미노산), NP-p1-His(20.73 kDa, 서열 1~174 아미노산), NP-p2-His(28.15 kDa, 서열 1~247 아미노산) 모두에 결합하였고, 이를 바탕으로 SARS-CoV-2 NP의 서열1 내지 174 아미노산의 N-말단을 항원결정부위로 결정하였다(도 10).

실시예 10. 항-NP 항체의 상보성 결정부위(CDR)의 분석

신규 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)가 SARS-CoV-2의 NP 단백질의N-말단 부분을 특이하게 인지함을 확인한 후 4종 항체(3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8)의 항원 인지 특이성에 대한 정보를 확보하기 위해 해당 항체의 상보성 결정부위(CDR) 서열을 분석하였다.

구체적으로, 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체 생성 세포를 10⁶개 정도 수집하여 RNA추출키트(Nanohelix사)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 상보성 DNA 합성(cDNA synthesis) 키트(Promega사)를 이용하여 총 RNA 5 μg으로부터 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA 1 ㎍와 표 4의 마우스 중쇄영역 프라이머들과 마우스 경쇄영역 프라이머들을 이용한 PCR로 마우스 중쇄와 경쇄의 CDR 포함부위를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 TOPcloner Blunt kit(Enzynomics사)를 사용하여 pTOP Blunt V2 벡터와 접합(ligation)하였다. 재조합 플라스미드는 E. coli DH5α에 형질전환(transformation)하였고 앰피실린(ampicillin)을 포함한 LB제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 플레이트에 형성된 콜로니들 하나씩 LB액체제한배지에서 12시간 이상 배양하고 플라스미드를 추출하여, 해당 염기서열을 분석하였다.

분석된 염기서열로부터 단백질서열을 결정하였고, 이를 Kabat CDR 정의를 기준으로 분석하여 3E10, 3F10, 5B6, 5B6.8 항체의 CDR을 결정하였다(도 11).

제조예: 코로나바이러스 NP 단백질의 C-말단에 결합하는 1G6 단일클론항체 제조 및 구성 확인

실시예 1에서 확보한 503개의 초기 클론 중 높은 광학밀도(OD) 값을 가지는 클론을 추가 선별하고 단일클론 하이브리도마 선별 과정을 진행하여 1G6 항-NP 항체를 선별하였다(도 13a). 앞선 실시예와 동일한 방법으로 1G6의 특성을 확인하였다.

1G6의 단일클론 항체 아형을 확인한 결과 1G6은 IgG2a 카파-체인아형으로 확인되었으며, NP 항원에 대해서만 높은 흡광도를 보이지만, 나머지 항원들(S1, S2, RBD)에는 반응성을 보이지 않았다(도 13b). SARS-CoV-2 NP 및 SARS-CoV NP에 대한 반응을 확인해본 결과를 도 14a,b 및 하기 표에 표시하였으며, 1G6은 SARS-CoV-2 의 NP에만 특이적으로 결합하는 항체임을 확인하였다.

Antibody	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV-2 NP	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV NP
1G6	5	6661
B46F(Commercial mAb)	68	43
4B21(Commercial mAb)	12690	60

또한 실시예 5와 동일한 방법으로 SARS-CoV-2 용해물을 이용하여 실험을 수행한 결과, 1G6는 상용화 항체들(4B21, B46F)보다 높게 SARS-CoV-2 용해물에 결합하는 것을 확인하였다(도 14c). EC50 값 역시 1G6(6 ng/mL), B46F(1246 ng/mL), 4B21(20760 ng/mL) 순으로 확인하였다(표 6).

Antibody	EC₅₀(ng/mL) to SARS-CoV-2 viral lysates
1G6	6
B46F(Commercial mAb)	1246
4B21(Commercial mAb)	20760

실시예 6의 웨스턴 블롯팅을 통해 1G6의 SARS-CoV-2의 에피토프 인식 특이성을 확인한 결과 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질 위치에서 1G6 항체가 단백질을 검출하는 것을 확인하여 (도 15a), SARS-CoV-2 NP 단백질의 선형 에피토프를 인식하는 것을 확인하였다. 또한 실시예 7의 방법으로 불활화 SARS-CoV-2 면역화 마우스 유래 항-SARS-CoV-2 항체 1G6의 세포 내 발현하는 SARS-CoV2 NP 단백질을 인식할 수 있는지 확인한 결과를 도 15b에 나타내었고 실시예 8과 동일한 방법으로 면역 침강능을 검증한 결과를 도 15c에 나타내었다.

실시예 10과 동일한 방법으로 CDR을 분석한 결과, 1G6은 도 16에 나타낸 바와 같은 서열을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 11. 항원결정부위의 추가 분석

실시예 9에서 확인한 내용을 토대로 항-NP 항체의 항원결정부위를 보다 세부적으로 파악하기 위한 실험을 수행하였다. SARS-CoV-2 NP 전장(1-419번 아미노산) 단백질과 7종의 부분 결손 재조합 단백질을 제조(cloning)하였으며, 결손 단백질은 NP-NTD는 47-174번; NP-CTD는 248-364번; NP-p1은 1-174번; NP-p2는 1-248번; NP-p3은 1-305번; NP-p4는 101-419번; NP-p5는 248-419번 아미노산을 가진다 (도 17A). 확보한 NP 전장 또는 부분 결손 유전자와 pCMV3 벡터(Sino Biological사)를 제한효소(HindIII/EcoRV)로 37℃에서 15시간 처리한 후, 절단된 유전자와 벡터를 일정비율로 혼합하여 라이게이즈(Roche사)를 첨가한 후 16℃에서 16시간 동안 접합(ligation) 반응을 진행하였다. 접합 반응 혼합물은 DH5α에 형질전환시키고 카나마이신 항생제를 포함한 LB제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 플레이트에 자란 콜로니를 선택하여 LB제한 액체배지에 배양하여 증폭된 재조합 플라스미드를 분리하였으며, 분리된 플라스미드에 도입된 유전자의 염기서열을 확인한 후 발현 벡터를 PEI를 이용하여 인간배아신장세포(HEK293T)에 형질도입하였다. 72시간 후에 세포를 수집하여 RIPA 버퍼에 녹여 단백질 분석 시료로 사용하였다.

그 결과 3F10항체의 항원결정부위는 NP 단백질의 1 내지 47번째 아미노산 부위임을 확인하였고, 3E10과 5B6는 NP 단백질의 47 내지 101번 아미노산 부위가 이들의 항원결정부위임을 확인하였다. 1G6 항체는 NP 단백질의 364 내지 419번 아미노산 부위가 이들 항체의 항원결정부위임을 확인하였다(도 17B).

실시예 12. 항체 쌍을 이용한 sandwich ELISA 및 SARS-CoV-2 검출

Sandwich ELISA는 진단 산업에서널리 사용되는 방식으로, 항원에 대한 항체(포획 항체, Capture Ab)를 먼저 플레이트 바닥에 부착시키고, 그 항체에 항원을 결합시킨 다음 다른 항원(검출 항체, Detection Ab)를 이용하여 직접 또는 간접적으로 검출한다. 본 방식은 항원에 특이적인 두 개의 항체를 이용하기 때문에 항원결정부위가 다른 항체 쌍(Antibody pair)을 이용하며, 민감도가 높아 가장 널리 사용되고 있다.

본 연구를 통해 확보한 항-NP 항체가 sandwich ELISA에 적용 가능한지 확인하기 위해, 항-NP 항체 중 SARS-CoV-2 NP에 가장 강한 결합력을 가진 3E10을 포획 항체로 MaxiSorp 96-웰 플레이트(Thermo Scientific사) 바닥에 웰 당 100 ng를 처리하고 4℃에서 12시간 동안 부착하였다. 부착하지 않은 물질을 제거하기 위하여 플레이트를 0.05% Tween-20이 들어간 TBS(TBST)로 3번 세척한 후, 5% BSA가 추가된 TBST로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 비특이적 반응이 일어나지 않게 준비하였다. SARS-CoV-2 NP 재조합 단백질(도 18A) 또는 바이러스 용해물(도 18B)을 웰 당 300 ng 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 항온 반응시키고, TBST로 3회 세척하여 잔여물을 제거하였다. 검출 항체로 이용한 HRP가 결합된 항체는 HRP conjugation kit(Abcam사)를 이용하여 준비하였으며, HRP가 결합된 항-NP 항체를 웰 당 10 ng 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 플레이트를 TBST로 5회 세척한 후, 발색 테트라메틸벤지딘기질(TMB)을 사용하여 반응물을 발색시키고 2N H₂S0₄로 반응을 종결시켰다. VICTOR Nivo 플레이트 판독기(PerkinElmer사)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도(OD) 값으로 결과를 분석하였다.

다양한 항체 쌍 중 SARS-CoV-2 NP 항원 단백질 검출을 위한 sandwich ELISA 방식에서 가장 효과적인 포획 항체와 검출 항체 쌍은 1G6와 3E10임을 확인하였다(도 18A). SARS-CoV-2 바이러스 용해물 검출을 위한 sandwich ELISA 방식에서 가장 효과적인 항체 쌍은1G6와 3E10임을 확인하였다(도 18B). 음성 대조군으로 인플루엔자 NP-HRP를 사용한 경우, 검출이 전혀 보이지 않았다. 이상의 결과를 통해 Sandwich ELISA 방식에서 SARS-CoV-2 NP 뿐만 아니라 바이러스 용해물 검출에 가장 좋은 항체 쌍(Antibody pair)은 1G6 및 3E10을 확인하였다.

실시예 13. SARS-CoV-2 변이 바이러스 NP에 대한 결합능 확인

바이러스는 유전자 변이가 잘 일어나는 특성이 있으며, SARS-CoV-2 변이 바이러스 NP 역시 아미노산 변이가 보고되었다(도 19 왼쪽). 따라서 항-NP 항체들의 결합능이 변할 수 있기 때문에, 3E10, 3F10, 5B6 항체의 SARS-CoV-2 변이 바이러스 NP에 대한 결합능을 ELISA를 통해 확인하였다. SARS-CoV-2 변이형 바이러스 NP 항원이 코팅된 웰에 항-NP 항체들을 순차적으로 희석하여 첨가하고, 결합된 항체를 항-마우스 IgG-HRP 항체로 검출하였다. 3종 항-NP 항체(3E10, 3F10, 5B6) 모두 알파, 베타, 감마 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 NP에 결합력을 가짐을 확인하였다.

구체적으로, SARS-CoV-2 알파, 베타, 감마 및 델타 변이형의 NP 재조합 단백질(Sino Biological사)을 이용하여 maxisorp ELISA 플레이트에 웰 당 100 ng 코팅하고 5% BSA in PBS로 블로킹한 후, 연속적으로 3배 희석된 각각의 단일클론항체(3E10, 3F10, 5B6)를 첨가한 후 2시간 배양하였다. PBST로 세척한 후 항-마우스 IgG-HRP를 첨가하여 1시간 배양하고 마지막으로 플레이트를 TBST로 5회 세척한 후, 발색 테트라메틸벤지딘기질(TMB)을 사용하여 반응물을 발색시키고 2N H₂S0₄로 반응을 종결시켰다. VICTOR Nivo 플레이트 판독기(PerkinElmer사)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도(OD) 값으로 결과를 분석하였다.

실험 결과 3E10, 3F10 및 5B6 항체 모두 SARS-CoV-2 알파, 베타, 감마 및 델타 변이형 NP 단백질에 잘 결합하였고 상기 변이형에 대해 검출능을 가지는 것을 확인하였다(도 19 오른쪽).

실시예 14. 항체 쌍을 이용한 sandwich ELISA 및 SARS-CoV-2 변이 바이러스 검출

실시예 13의 결과를 토대로 sandwich ELISA를 이용한 SARS-CoV-2 변이 바이러스의 NP 검출능을 확인하였다.

구체적인 실험방법은 실시예 13과 같으며, ELISA 플레이트를 3E10 포획 항체로 코팅하고 블로킹한 다음 SARS-CoV-2 변이형의 재조합 NP 단백질을 첨가하여 2시간 배양하였다. 플레이트를 세척한 후 1G6-HRP를 검출 항체로 사용하였다. 음성 대조군으로 Influenza H1N1 NP 및 BSA을 사용하였다. 실험 결과는 도 20에 나타내었다.

3E10, 1G6 항체 쌍을 탑재한 sandwich ELISA에서 알파, 베타, 감마 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 NP 모두 검출됨을 확인하였다. 음성대조군인 HRP가 결합된 influenza NP 항체 또는 BSA에서는 전혀 검출되지 않음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 3E10-1G6 항체 쌍이 SARS-CoV-2 변이 바이러스를 검출하기 위해 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원결정부위(epitope)는 서열번호 91의 N-말단으로부터 1 내지 174번 아미노산 서열에 포함되는 것인, 항체 또는 이의 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편의 항원결정부위(epitope)는 서열번호 91의 N-말단으로부터 다음 중 선택되는 어느 하나의 영역에 포함되는 항원결정부위(epitope)를 갖는 것인, 항체 또는 이의 결합 단편:
i) 서열번호 91의 N-말단으로부터 1 내지 47번 아미노산; 및
ii) 서열번호 91의 N-말단으로부터 47번 내지 101번 아미노산.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(i) 서열번호 2의 HCDR1, 서열번호 4의 HCDR2, 서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 12의 LCDR2, 서열번호 14의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(ii) 서열번호 20의 HCDR1, 서열번호 22의 HCDR2, 서열번호 24의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 28의 LCDR1, 서열번호 30의 LCDR2, 서열번호 32의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(iii) 서열번호 38의 HCDR1, 서열번호 40의 HCDR2, 서열번호 42의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 46의 LCDR1, 서열번호 48의 LCDR2, 서열번호 50의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
(iv) 서열번호 56의 HCDR1, 서열번호 58의 HCDR2, 서열번호 60의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 64의 LCDR1, 서열번호 66의 LCDR2, 서열번호 68의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는,
항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(i) 서열번호 1의 HFR1, 서열번호 3의 HFR2, 서열번호 5의 HFR3, 서열번호 7의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 9의 LFR1, 서열번호 11의 LFR2, 서열번호 13의 LFR3, 서열번호 15의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(ii) 서열번호 19의 HFR1, 서열번호 21의 HFR2, 서열번호 23의 HFR3, 서열번호 25의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 27의 LFR1, 서열번호 29의 LFR2, 서열번호 31의 LFR3, 서열번호 33의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(iii) 서열번호 37의 HFR1, 서열번호 39의 HFR2, 서열번호 41의 HFR3, 서열번호 43의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 45의 LFR1, 서열번호 47의 LFR2, 서열번호 49의 LFR3, 서열번호 51의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
(iv) 서열번호 55의 HFR1, 서열번호 57의 HFR2, 서열번호 59의 HFR3, 서열번호 61의 HFR4를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 63의 LFR1, 서열번호 65의 LFR2, 서열번호 67의 LFR3, 서열번호 69의 LFR4를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는,
항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 8, 26, 44, 62 중 어느 하나의 중쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는. 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 16, 34, 52, 70 중 어느 하나의 경쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(i) 서열번호 17의 중쇄가변영역 및 서열번호 18의 경쇄가변영역;
(ii) 서열번호 35의 중쇄가변영역 및 서열번호 36의 경쇄가변영역;
(iii) 서열번호 53의 중쇄가변영역 및 서열번호 54의 경쇄가변영역; 또는
(iv) 서열번호 71의 중쇄가변영역 및 서열번호 72의 경쇄가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제10항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물.
제11항에 있어서 상기 조성물은 서열번호 74의 HCDR1, 서열번호 76의 HCDR2, 및 서열번호 78의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 82의 LCDR1, 서열번호 84의 LCDR2, 및 서열번호 86의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 조성물.
제11항의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.