CN116284353A - 一种单克隆抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单克隆抗体及其用途。所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.20所示的CDR‑H1；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.21所示的CDR‑H2；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.22所示的CDR‑H3。本申请得到的单克隆抗体对柯萨奇病毒A16病毒具有高特异性、高灵敏度、高效价等特性，能用于CV A16病毒疫苗的研发、生产和质检环节。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种单克隆抗体及其用途。
背景技术
手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒包括20多种类型，主要是肠道病毒71型(Enterovirus A71,EV A71)柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)(CV A16、CV A6和CV A10)，其中由CV A16和EV A71感染所致的HFMD最为常见，并呈现交替流行，共同感染的趋势。HFMD主要感染人群为5岁以下的婴幼儿，其临床症状常见手、足、口部皮疹、疱疹；大部分患儿病情较轻且具有自限性，但也可能导致少数儿童出现心肌炎、肺水肿、无菌脑膜炎等并发症，其中重症病例可能出现病情迅速发展，甚至导致死亡。鉴于HFMD传播范围广且危害较大，对儿童生命健康造成严重威胁，我国于2008年将其列为丙类传染病。CV A16作为主要治病病原体之一，严重危害儿童的生命健康，CVA16感染导致严重病例及死亡病例也逐渐增多。1957年，加拿大首次报道了CV A16引起HFMD的暴发。其后，CV A16感染所致的HFMD病例呈全球性分布，美国、法国、中国、日本等国均报道过CV A16的暴发和流行，且大多发生于夏、秋两季。
CV A16属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，病毒颗粒呈20面体立体对称的球形结构，直径23～30nm，由内部核酸和衣壳蛋白质组成，无脂质包膜。CV A16外壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1为最重要的抗原决定簇。由CV A16感染引起的严重手足口病患者表现为心肌炎和肺炎；CV A16引起的手足口病患儿发病年龄更低、发热病程短、更易出现白细胞升高。不同病毒感染引起的手足口病发病机制不同，这意味着对不同病毒引起的HFMD应制定不同的治疗策略。目前，国内已有3家公司的EV A71型灭活疫苗批准上市，而这些EV A71疫苗对CV A16无交叉保护作用，不能对由其他病原体引起的HFMD起到预防保护作用。CVA16作为引起HFMD主要病原体之一，其疫苗的研究进展仍较缓慢，缺乏有效的预防及治疗手段。
单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)由于靶向性高、低毒性等特点，是研究现代生命科学研究的重要工具，其不仅可应用于临床诊断及治疗，更是开展保护性位点、发病机制等基础研究的有利手段。此外，杂交瘤技术及基因工程技术的应用，使单克隆抗体可大量生产及人源化，并得到越来越广泛的应用。目前，关于CV A16单抗的研究少有报道。因此，开展CV A16单抗的研究对CV A16基础研究、CV A16诊断及治疗，疫苗的研发与评价具有重要意义。本研究以CV A16 VLP作为免疫原制备了能特异性识别CV A16的中和性单克隆抗体。通过Elisa、SDS-PAGE、western blot等方法，说明单抗可用于灵敏检测和分析CV A16，可在病毒感染的诊断和疫苗开发的研究中存在巨大潜力。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单克隆抗体及其用途，以期解决现有技术中存在的问题。
本发明的第一方面保护一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.20所示的CDR-H1；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.21所示的CDR-H2；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.22所示的CDR-H3；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.23所示的CDR-L1；
轻链可变区包括氨基酸序列如LVS或DTT所示的CDR-L2；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID.5或SEQ ID No.24所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1，氨基酸序列如LVS所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.21所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.22所示的CDR-H3；所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.23所示的CDR-L1、氨基酸序列如DTT所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.24所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.14或SEQ IDNo.33所示序列。
在某些实施方式中，所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.15或SEQ IDNo.34所示序列。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体的重链包括氨基酸序列如SEQ ID No.16或SEQ IDNo.35所示序列。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体的轻链包括氨基酸序列如SEQ ID No.17或SEQ IDNo.36所示序列。
本发明的第二方面保护一种分离的多核苷酸，编码如上文所述的单克隆抗体。
在某些实施方式中，编码所述单克隆抗体的重链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ IDNo.18或SEQ ID No.37所示序列。
在某些实施方式中，编码所述单克隆抗体的轻链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ IDNo.19或SEQ ID No.38所示序列。
本发明的第三方面保护一种表达载体，所述表达载体包含有上文所述的多核苷酸。
本发明的第四方面保护一种表达系统，所述表达系统含有如上文所述的表达载体或基因组中整合有外源的如上文所述的多核苷酸。
本发明的第五方面保护如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的多核苷酸或如上文所述的表达载体或如上文所述的表达系统在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或病毒疫苗活性评价中的用途。
在某些实施方式中，所述病毒为柯萨奇病毒。
优选的，所述病毒为柯萨奇病毒A16型。
优选的，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、用于手足口病疫苗筛选或疫苗抗原定性定量的检测或疫苗活性检测。
本发明的第六方面保护一种检测产品，所述检测产品包含如上文所述的单克隆抗体。
优选地，所述检测产品还包括兔抗CV A16 VLP多单克隆抗体和HPR标记的鼠二抗。
优选地，所述检测产品选自检测试剂、试剂盒、芯片和膜条。
本发明的第七方面保护一种药物组合物，所述药物组合物包括如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的多核苷酸或如上文所述的表达载体或如上文所述的表达系统，以及药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明成功得到可用于双抗体夹心ELISA的单克隆抗体1C12、3H5，该抗体具有天然线性表位，具有效价高、灵敏度高、特异性高等特点，与柯萨奇病毒A组16型(CVA16)均具有良好的反应原性。
2)本发明利用单克隆抗体采用双抗体夹心ELISA定量检测方法，最低检出限度分别为7.815ng/mL、62.5ng/mL，可以用来定量或定性检测柯萨奇病毒A组16型(CVA16)。
3)采用本发明的单克隆抗体来检测柯萨奇病毒A组16型(CVA16)，其检测周期短、操作简便、灵敏度高、主观因素误差小、设备简单、可以快速实现大批量样品的检测分析。
附图说明
图1显示为本发明实施例2中单克隆抗体1C12、3C4、3H5的SDS-PAGE图。
图2显示为本发明实施例2中单克隆抗体1C12、3C4、3H5的特异性分析结果图。
图3显示为本发明实施例2中单克隆抗体1C12、3C4、3H5的Western blot分析结果图。
图4显示为本发明实施例3中单克隆抗体1C12、3C4、3H5的夹心ELISA分析结果图。
图5显示为本发明实施例4中单克隆抗体3C4、3H5序列确认示意图。
具体实施方式
本发明采用毕赤酵母表达并组装了柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒(简写为CV A16VLP)免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合后亚克隆筛选得到二株可以特异性识别CVA16 VLP的单克隆抗体3C4单抗、3H5单抗，该单克隆抗体可以特异性识别CV A16 VLP线性表位。应用该单克隆抗体构建了的检测产品可用于CV A16 VLP亚单位疫苗的定性和定量分析，进行质量控制和对蛋白含量快速准确、特异性的定量分析。实验证明，采用本发明的单克隆抗体，采用双夹心ELISA法检测CV A16 VLP准确可靠，可重复，其中所含的单克隆抗体仅与CV A16 VLP发生特异性抗原抗体反应，可以确保特异性，保证样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物，最低检出限度分别为7.815ng/mL和62.5ng/mL。在此基础上完成本发明。
本发明的第一方面保护一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.20所示的CDR-H1；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.21所示的CDR-H2；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.22所示的CDR-H3；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.23所示的CDR-L1；
轻链可变区包括氨基酸序列如LVS或DTT所示的CDR-L2；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID.5或SEQ ID No.24所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-H3；所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的CDR-L1，氨基酸序列如LVS所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.21所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID No.22所示的CDR-H3；所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.23所示的CDR-L1、氨基酸序列如DTT所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID No.24所示的CDR-L3。
在某些实施方式中，重链可变区还包括框架区FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQIDNo.6或SEQ ID No.25所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQ ID No.7或SEQ ID No.26所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.27所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.9或SEQ ID No.28所示序列。
优选地，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQIDNo.7所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQID No.9所示序列。
优选地，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.25所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQIDNo.26所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.27所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.28所示序列。
在某些实施方式中，轻链可变区还包括框架区FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQIDNo.10或SEQ ID No.29所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.30所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.31所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.13或SEQ ID No.32所示序列。
优选地，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.10所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQIDNo.11所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.12所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.13所示序列。
优选地，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.29所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQIDNo.30所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.31所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.32所示序列。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.14或SEQ IDNo.33所示序列。
在某些实施方式中，所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.15或SEQ IDNo.34所示序列。
优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No.14所示的重链可变区和如SEQ IDNo.15所示的轻链可变区。
优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No.33所示的重链可变区和如SEQ IDNo.34所示的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体的重链包括氨基酸序列如SEQ ID No.16或SEQ IDNo.35所示序列。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体的轻链包括氨基酸序列如SEQ ID No.17或SEQ IDNo.36所示序列。
优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No.16所示的重链和如SEQ IDNo.17所示的轻链。
优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No.35所示的重链和如SEQ IDNo.36所示的轻链。
本发明的第二方面保护一种分离的多核苷酸，编码如上文所述的单克隆抗体。
在某些实施方式中，编码所述单克隆抗体的重链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ IDNo.18或SEQ ID No.37所示序列。
在某些实施方式中，编码所述单克隆抗体的轻链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ IDNo.19或SEQ ID No.38所示序列。
优选地，所述多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的重链和如SEQ IDNo.19所示的轻链。
优选地，所述多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID No.37所示的重链和如SEQ IDNo.38所示的轻链。
本发明的第三方面保护一种表达载体，所述表达载体包含有上文所述的多核苷酸。所述表达载体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述表达载体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本发明的第四方面保护一种表达系统，所述表达系统包含有如上文所述的表达载体或基因组中整合有外源的如上文所述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。
本发明的第五方面保护如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的多核苷酸或如上文所述的表达载体或如上文所述的表达系统在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或病毒疫苗活性评价中的用途。优选地，所述病毒为柯萨奇病毒，更优选地为柯萨奇病毒A16型。优选，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、用于手足口病疫苗筛选或疫苗抗原定性定量的检测或疫苗活性检测。
本发明的第六方面保护一种检测产品，所述检测产品包含如上文所述的单克隆抗体；优选地，所述检测产品选自检测试剂、试剂盒、芯片和膜条。所述检测产品用于检测CVA16 VLP。所述检测产品还包括兔抗CV A16 VLP多单克隆抗体和HPR标记的鼠二抗。优选地，所述检测产品为检测试剂盒，更优地，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液、终止液等。
本发明的第七方面保护一种药物组合物，所述药物组合物包括如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的多核苷酸或如上文所述的表达载体或如上文所述的表达系统，以及药学上可接受的载体。
本申请的序列如下：3C4单抗的CDR序列，见表1。
表1
| 氨基酸序列 | 序列编码 | |
| HCDR1 | GFSLSTSGMG | SEQ ID No.1 |
| HCDR2 | IWWDDDK | SEQ ID No.2 |
| HCDR3 | VRIGGYF | SEQ ID No.3 |
| HCDR1 | QSLLDSDGKTY | SEQ ID No.4 |
| HCDR2 | LVS | |
| HCDR3 | WQGTHFPWT | SEQ ID No.5 |
3C4单抗重链的框架区包括FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.6所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.9所示序列。
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS(SEQ ID No.6)
VSWIRQPSGKGLEWLAH(SEQ ID No.7)
RYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLRIASVDTADTATYYC(SEQ ID No.8)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.9)
3C4单抗轻链的框架区包括FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.10所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.11所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.12所示序列，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.13所示序列。
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSS(SEQ ID No.10)
LIWLLQRPGQSPKRLIY(SEQ ID No.11)
KLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID No.12)
FGGGTKLEIK(SEQ ID No.13)
3C4单抗重链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDD KRYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLRIASVDTADTATYYCVRIGGYFWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.14)
3C4单抗轻链可变区的氨基酸序列如下(下划线标注的为重链CDR区)：
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNo.15)
3C4单抗重链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLRIASVDTADTATYYCVRIGGYFWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID No.16)
3C4单抗轻链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MSPAQFLFLLVLWIRETSGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.17)
3C4单抗重链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCTTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTATCCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCTCAGGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGAATAGGGGGTTACTTCTGGGGTCAAGGAACTTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA(SEQ ID No.18)
3C4单抗轻链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAGACCAGCGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCTCTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGATTTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA CATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGA TGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGC AGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAA CTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA(SEQ ID No.19)
表2 3H5单抗CDR序列
| 氨基酸序列 | ||
| 重链CDR1 | GFTFSNYW | SEQ ID No.20 |
| 重链CDR2 | IRSKSNNYAT | SEQ ID No.21 |
| 重链CDR3 | TRSGAY | SEQ ID No.22 |
| 轻链CDR1 | SSVSY | SEQ ID No.23 |
| 轻链CDR2 | DTT | |
| 轻链CDR3 | QHWNSYPFT | SEQ ID No.24 |
3H5单抗重链可变区还包括框架区FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.25所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQ ID No.26所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ IDNo.27所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.28所示序列。
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVGS(SEQ ID No.25)
MNWVRQSPDKGLEWVAE(SEQ ID No.26)
HYAESVKGRLTISRDDSKSGVYLQMNNLRPEDTGIYYC(SEQ ID No.27)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID No.28)
3H5单抗轻链可变区还包括框架区FR1-FR4，FR1包括氨基酸序列如SEQ ID No.29所示序列，FR2包括氨基酸序列如SEQ ID No.30所示序列，FR3包括氨基酸序列如SEQ IDNo.31所示序列，FR4包括氨基酸序列如SEQ ID No.32所示序列。
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS(SEQ ID No.29)
IYWYQQKPGSSPRLLIY(SEQ ID No.30)
RLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID No.31)
FGSGTKLEIK(SEQ ID No.32)
3H5单抗重链可变区的氨基酸序列如下(下划线标注的为重链CDR区)：
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVGSGFTFSNYWMNWVRQSPDKGLEWVAEIRSKSN NYATHYAESVKGRLTISRDDSKSGVYLQMNNLRPEDTGIYYCTRSGAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID No.33)
3H5单抗轻链可变区的氨基酸序列如下(下划线标注的为重链CDR区)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTTRLASGVPV RFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQHWNSYPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID No.34)
3H5单抗重链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MYLGLNCVFIVFLLKGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVGSGFTFSNYWMNWVRQSPDKGLEWVAEIRSKSNNYATHYAESVKGRLTISRDDSKSGVYLQMNNLRPEDTGIYYCTRSGAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID No.35)
3H5单抗轻链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTTRLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQHWNSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.36)
3H5单抗重链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAAAGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAACTCGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGGCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGATAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATCGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTAACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTGGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGACCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGTGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTTTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA(SEQ ID No.37)
3H5单抗轻链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACTGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACTTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTCAGTTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCCGGCTCCTGATTTATGACACAACTAGGCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCACTGGAATAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAG GTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGA ACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTC ACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCA TTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA(SEQ ID No.38)
在疫苗筛选过程中，为了确保检测的抗原为活性表位抗原，需要高灵敏度、高特异性和高中和活性的检测单抗，在本申请的一具体实施例中，所述灵敏度例如可以通过夹心Elisa实验得到最低检出限度。所述特异性例如可以通过Western blot实验检测单抗与抗原的特异性结合。所述中和活性例如可以通过中和实验。所述疫苗抗原的定性定量检测例如可以通过夹心Elisa实验得到。
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请实施例中A6 VLP、A10 VLP、A16 VLP、A71 VLP和兔抗EV A71 VLP多抗血清的制备参见专利CN114836444。
本申请实施例中鼠二抗和5’RACE试剂盒的信息见表3。
表3
| 名称 | 厂家 | 货号 |
| 鼠二抗 | Sigma | A0168-1ml |
| 5’RACE试剂盒 | Invitrogen | 18374058 |
实施例1杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备
本实施例中，制备杂交瘤细胞并获得单克隆抗体，包括如下步骤：
1.1抗原制备及小鼠免疫
1.1.1抗原制备：
利用毕赤酵母表达系统，表达制备了柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒(简写为CV A16VLP)。
1.1.2抗原免疫小鼠
将5μg的CV A16 VLP、500μg铝佐剂和25μgCPg混合，混合后的制剂通过腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠，共免疫四次，每次免疫剂量均为1μg的CV A16 VLP、500μg铝佐剂和25μgCPg混合后的制剂并通过腹腔免疫，两次免疫之间间隔2周。最后一次免疫后2周，尾静脉注射5μg CV A16 VLP进行加强免疫。
1.2杂交瘤细胞株的制备和筛选
小鼠尾静脉加强免疫3天后，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0使用PEG1450进行融合以制备杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞培养9天之后，取杂交瘤培养液，采用酶联免疫吸附试验及中和试验筛选特异性分泌针对CV A16 VLP的杂交瘤细胞株。
酶联免疫吸附试验步骤为：将CV A16 VLP包被96孔酶标板(20ng/孔)，4℃孵育过夜；用含有5％脱脂牛奶的PBST封闭后每孔加50μL杂交瘤培养液，37℃孵育2小时；接着用HRP标记的二抗孵育1小时，最后进行显色反应，读取OD450nm的吸光值。
中和试验步骤为：取50μL杂交瘤培养液与100TCID50/50μL柯萨奇病毒A16(参见专利CN114836444)充分混匀后，放入5％ CO2培养箱中37℃孵育2h。将RD细胞工作液(1.5×105/mL)悬空加至孵育后的96孔板中，100μL/孔，5％ CO2培养箱35℃培养7天。观察CPE。
根据与A16 VLP结合能力及中和活性，筛选出三株杂交瘤细胞株，鉴定信息如表4所示。
表4分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定
| 杂交瘤细胞株 | 重链 | 轻链 | 与A16 VLP结合能力* | 中和活性# |
| 1C12 | IgG2b | kappa | +++ | + |
| 3C4 | IgG1 | kappa | +++ | + |
| 3H5 | IgG1 | kappa | +++ | - |
用于分析的样品均为50μL杂交瘤培养细胞上清。
*中，：+代表OD450＞0.15；++代表OD450＞0.3；+++代表OD450＞0.5。
#中，：+代表有中和活性；－代表无中和活性。
1.3杂交瘤产生小鼠腹水的制备和抗体纯化
每只雌性Balb/c小鼠(10周龄)腹腔注射500μL液体石蜡油，一周后，小鼠分为3组，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株1C12，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株3C4，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株3H5。
腹腔注射1-2周后，用针头分别收集每只小鼠的腹水，腹水于4000rpm离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书，利用iProtein GPurose 4Fast Flow亲和柱(千纯生物)纯化腹水获得三种纯化的单克隆抗体1C12、3C4和3H5。
实施例2单克隆抗体的特异性研究
本实施例中，采用实施例1得到的纯化的单克隆抗体进行特异性分析，包括如下：
2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳
使用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法鉴定实施例1得到的纯化的单克隆抗体的纯度和完整性。
包括如下：单克隆抗体1C12、3C4和3H5分别与SDS-PAG上样缓冲液混合后，煮沸处理5min，经12％聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品，结果见图1。
如图1所示，单克隆抗体1C12、3C4和3H5均显示了两个条带，大小分别为55kDa和25kDa左右，对应重链和轻链。
2.2ELISA鉴定
然后，采用Elisa方法检测了单克隆抗体1C12、3C4和3H5分别与不同抗原的反应活性，抗原包括CV A6 VLP、CV A10 VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP。
通过酶联免疫试验(Elisa)筛选实施例1中步骤1.3纯化得到的单克隆抗体，形成待测样品。分别用CV A6 VLP、CV A10 VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP包被96孔酶标板酶标板(20ng/孔)，4℃孵育过夜；加入5％脱脂牛奶的PBST，37℃封闭1个小时；加入待检测样品，37℃孵育2小时；接着加入HRP标记的二抗，孵育1小时，最后读取吸光值OD450nm，结果见图2。
如图2所示，单克隆抗体1C12和3C4可以特异性识别CV A16 VLP，而不能识别CVA6VLP、CV A10 VLP及EV A71 VLP；单克隆抗体3H5可以识别CV A16 VLP及EV A71 VLP，而不能识别CV A6 VLP和CV A10 VLP。
2.3Western blot分析
通过Western blot分析纯化的单克隆抗体1C12、3C4和3H5分别与CV A6 VLP、CVA10VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP的结合情况。
通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行Westernblot分析。单克隆抗体浓度1μg/mL，兔抗VP0多克隆抗体1:1000稀释使用，接着用HPR标记的二抗进行孵育，最后用发光图像分析仪进行记录，结果见图3。
从图3所示，单克隆抗体3H5可以识别变性后的四种VLP，单克隆抗体1C12可结合变性后的CV A16 VLP与EV A71 VLP，而单克隆抗体3C4仅可与变性后的CV A16 VLP反应，提示三种单抗可用于不同VLP的鉴定，且三个抗体识别的表位可能均为线性表位。
实施例3单克隆抗体对病毒的检测及检测试剂盒
本实施例中，采用实施例1得到的纯化的单克隆抗体1C12、3C4和3H5对CV A16 VLP进行检测，包括如下：
3.1夹心Elisa检测实验
通过夹心Elisa方法测定纯化的单克隆抗体对CV A16 VLP的最低检出限度(当OD450nm＞0.15时，判为阳性)。
包括如下：将兔抗CV A16 VLP多抗血清1:8000稀释后包被96酶标板(100μL/孔)，4℃孵育过夜；加入含5％脱脂牛奶的PBST，37℃封闭1小时后，加入CV A16 VLP，37℃孵育2个小时；然后，分别加入实施例1纯化的单克隆抗体(10ng/μL)，37℃孵育2小时；接着用HPR标记的鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450nm，结果见图4。
从图4可知，其中单克隆抗体3C4检测效果不佳，单克隆抗体1C12和3H5单抗可灵敏地检测到CV A16 VLP，其最低检出限度分别为7.815ng/ml、62.5ng/ml，提示1C12、3H5可用于A16感染的诊断。
3.2试剂盒
试剂盒包括：
酶标板；
检测抗体试剂：兔抗CV A16 VLP多抗血清和HPR标记的鼠二抗；
抗体试剂：单克隆抗体1C12、3H5；
封闭液：5％脱脂牛奶的PBST。
实施例4单克隆抗体的基因序列分析、重组表达及鉴定
本实施例中，对实施例1得到的杂交瘤细胞株提取RNA，扩增重链和轻链全长基因。包括如下：
4.1RNA提取
分别将杂交瘤细胞株3C4和3H5的细胞用Trizol试剂提取总RNA，按照5’RACE试剂盒说明书扩增出重链和轻链全长基因。
单克隆抗体3C4的重链的核苷酸序列包括如SEQ ID No.18，单克隆抗体3C4的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No.19。
3C4单抗重链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCTTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTATCCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCTCAGGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGAATAGGGGGTTACTTCTGGGGTCAAGGAACTTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTG CTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTG GAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGC TCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCA AGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGT CTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGAC ATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAAC CCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGG CAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGC AGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCT GCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAA GAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGG GAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCC ACTCTCCTGGTAAATAA(SEQ ID No.18)
3C4单抗轻链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAGACCAGCGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCTCTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGATTTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA(SEQ IDNo.19)
单克隆抗体3C4的重链的氨基酸序列包括如SEQ ID No.16，单克隆抗体3C4的轻链的氨基酸序列包括如SEQ ID No.17。
3C4单抗重链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MGRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLRIASVDTADTATYYCVRIGGYFWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID No.16)
3C4单抗轻链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MSPAQFLFLLVLWIRETSGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.17)进一步分析3C4单抗重链可变区和轻链可变区序列，3C4单抗重链可变区属于IGHV8亚群，其氨基酸序列如下(下划线标注的为重链CDR区)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSNNQVFLRIASVDTADTATYYCVRIGGYFWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.14)
3C4单抗轻链可变区属于IGKV1亚群，其氨基酸序列如下(下划线标注的为轻链CDR区)：
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNo.15)
单克隆抗体3H5的重链的核苷酸序列包括如SEQ ID No.37，单克隆抗体3H5的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No.38。
3H5单抗重链核苷酸序列(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAAAGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAACTCGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGGCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGATAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATCGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTAACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTGGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGACCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGTGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTTTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA(SEQ ID No.37)
3H5单抗轻链的核苷酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACTGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACTTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTCAGTTACATATACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCCGGCTCCTGATTTATGACACAACTAGGCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCACTGGAATAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA(SEQ ID No.38)单克隆抗体3H5的重链氨基酸序列包括如SEQ ID No.35，单克隆抗体3H5的轻链氨基酸序列包括如SEQ ID No.36。
3H5单抗重链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MYLGLNCVFIVFLLKGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVGSGFTFSNYWMNWVRQSPDKGLEWVAEIRSKSNNYATHYAESVKGRLTISRDDSKSGVYLQMNNLRPEDTGIYYCTRSGAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID No.35)
3H5单抗轻链的氨基酸序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTTRLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQHWNSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.36)
进一步分析3H5单抗重链可变区和轻链可变区序列，3H5单抗重链可变区属于IGHV6亚群，其氨基酸序列如下(下划线标注的为重链CDR区)：
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVGSGFTFSNYWMNWVRQSPDKGLEWVAEIRSKSNNYATHYAESVKGRLTISRDDSKSGVYLQMNNLRPEDTGIYYCTRSGAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID No.33)
3H5单抗轻链可变区属于IGKV4亚群，其氨基酸序列如下(下划线标注的为轻链CDR区)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTTRLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQHWNSYPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID No.34)
4.2重组表达的构建
然后采用同源重组的方式将本实施例中步骤4.1扩增得到的重链和轻链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.3(thermo)EcoRI和XhoI多克隆位点之间，筛选出阳性克隆测序，构建成真核表达载体pcDNA3.3-3C4-H和pcDNA3.3-3C4-L；pcDNA3.3-3H5-H和pcDNA3.3-3H5-L。
4.3单克隆抗体基因的重组表达鉴定
为了验证所克隆出的3C4和3H5单抗的基因是否正确，利用脂质体的方法分别共转染pcDNA3.3-3C4-H和pcDNA3.3-3C4-L；pcDNA3.3-3H5-H和pcDNA3.3-3H5-L到293T细胞，3d后收取培养上清进行分析，通过Elisa方法检测细胞上清中是否有特异性结合A16 VLP的抗体存在，结果见图5。
从图5可知，表达3C4和3H5单抗序列的细胞上清均与A16 VLP有很高的结合信号，且随着稀释度的升高OD450nm逐渐降低；而没有转染相关质粒的对照细胞的上清没有结合信号，该结果说明了所扩增和表达的序列确实为单克隆抗体3C4和3H5的基因。
本申请以CV A16 VLP免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合后，筛选得到了能够稳定分泌特异性抗CV A16单克隆抗体的杂交瘤细胞株，成功获得了三株抗CV A16的单克隆抗体1C12、3C4、3H5，运用Western blot、SDS-PAGE及Elisa等技术手段对该抗体进行检测。通过间接Elisa方法检测了三株单抗与不同抗原的反应活性，显示1C12、3C4可特异性识别CV A16 VLP，而不能识别CVA6 VLP、CVA10 VLP及EVA71 VLP；而3H5可识别CVA16 VLP及EVA71 VLP，而无法识别CVA6 VLP与CVA10 VLP。Werstern blot结果表明，3H5可以识别变性后的四种VLP，1C12可结合变性后的CV A16 VLP与EV A71VLP，而3C4仅可与变性后的CV A16 VLP反应，提示三株抗体可用于不同VLP的鉴定且识别的表位可能均为线性表位；夹心Elisa结果显示，单抗1C12、3H5对CVA16 VLP的最低检出限度分别为7.815ng/ml、62.5ng/ml，提示单抗1C12、3H5可用于CV A16的检测试剂盒的开发应用。
综上，本申请得到的单克隆抗体对柯萨奇病毒A16病毒(CV A16)具有高特异性、高灵敏度、高效价等特性，可用于CV A16病毒疫苗的研发、生产和质检环节，例如在研发中可以用于筛选病毒疫苗，在质检环节作为参比品进行疫苗活性的评价。本申请的单克隆抗体可制备成检测CV A16病毒的产品，例如检测试剂、试剂盒、膜条或芯片，可作为开发诊断方法的有效材料，有利于CV A16的临床诊断和治病机制研究、疫苗及药物研发。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.20所示的CDR-H1；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.21所示的CDR-H2；
重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.22所示的CDR-H3；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.23所示的CDR-L1；
轻链可变区包括氨基酸序列如LVS或DTT所示的CDR-L2；
轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID.5或SEQ ID No.24所示的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，包括1)-4)中的至少一项：
1)所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.14或SEQ ID No:33所示序列；
2)所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.15或SEQ ID No.34所示序列；
3)所述单克隆抗体的重链包括氨基酸序列如SEQ ID No.16或SEQ ID No.35所示序列；
4)所述单克隆抗体的轻链包括氨基酸序列如SEQ ID No.17或SEQ ID No.36所示序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述单克隆抗体的重链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID No.18或SEQ ID No.37所示序列；
和/或，编码所述单克隆抗体的轻链的多核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID No.19或SEQID No.38所示序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有如权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求5所述的表达载体或基因组中整合有如权利要求3或4所述的多核苷酸。
7.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或如权利要求3或4所述的多核苷酸或如权利要求5所述的表达载体或如权利要求6所述的表达系统在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或病毒疫苗活性评价中的用途。
8.一种检测产品，其特征在于，所述检测产品包含如权利要求1或2所述的单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品还包括兔抗CV A16 VLP多单克隆抗体和HPR标记的鼠二抗；
和/或，所述检测产品选自检测试剂、试剂盒、芯片和膜条。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的单克隆抗体或如权利要求3或4所述的多核苷酸或如权利要求5所述的表达载体或如权利要求6所述的表达系统，以及药学上可接受的载体。
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| CN104513310A (zh) * | 2013-09-27 | 2015-04-15 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种抗柯萨奇病毒a16型的单克隆抗体的制备及其应用 |
| CN104610450A (zh) * | 2015-01-18 | 2015-05-13 | 北京工业大学 | 一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 李洁;张勇;许文波;: "EV-A71感染导致的重症手足口病的机制及防控研究进展", 病毒学报, no. 02, 29 March 2018 (2018-03-29) * |
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