CN117683128A - 一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体靶向鼠疫耶尔森菌F1抗原，具有高保护性、高特异性和高亲和力，F1抗原是鼠疫耶尔森菌表达的特异性蛋白，因此，本发明提供的单克隆抗体可应用于鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的诊断、治疗及预防研究中，具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体及其应用，更具体地，所述单克隆抗体为F3。
背景技术
鼠疫(plague)是一种由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis，简称鼠疫菌)引起的自然疫源性疾病，全世界有各种类型的动物自然疫源地，难以彻底消除。鼠疫可造成非常严重的人类疾病，特别是败血性(细菌通过血液循环引起全身感染)鼠疫和肺鼠疫，如果不加治疗，病死率为30％-100％。此外，鼠疫菌被列为重要的生物战剂和生物恐怖剂，一直受到高度重视。《中华人民共和国传染病防治法》规定鼠疫属于甲类传染病，执行最严格的防控。美国疾病预防控制中心则将鼠疫耶尔森菌归类为易传染、高致死率、可引起公众恐慌和社会动荡，需要进行特别公共卫生准备的A类微生物病原体。近年来随着国际反恐斗争的需要，对鼠疫的防治研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。
目前鼠疫的治疗依靠抗菌素，多种抗生素对鼠疫有效，链霉素被认为是治疗鼠疫最有效的传统药物之一。但是基于新的多药抗性鼠疫菌的出现，1970年世界卫生组织鼠疫专业委员会建议研发新的替换药物。因此，研制抗生素之外的鼠疫治疗药物迫在眉睫。中和性单克隆抗体被认为是具有应用前景的特异性治疗药物，因为其靶标和作用机制明确，研制相对容易，是目前较为切实可行的办法。研究显示，F1(Fraction1，F1)抗原是位于鼠疫菌体表面荚膜物质，由100kbp的pFra质粒编码，是鼠疫菌的特异性抗原之一。鼠疫感染的免疫保护机制中，F1抗血清在动物体内显示了明显的保护效果。因此，筛选F1抗原单抗有可能获得具有保护效果的中和性单抗，并用于鼠疫的特异性治疗。
发明内容
本发明采用单克隆抗体技术筛选得到了对鼠疫耶尔森菌F1抗原具有高亲和力和高特异性的全人源中和性单克隆抗体F3，并通过动物实验进行了验证，验证结果表明所述单克隆抗体F3能够有效阻断鼠疫耶尔森菌强毒株的致病作用。本发明为本领域提供了一种全新的针对鼠疫耶尔森菌的全人源保护性单克隆抗体F3。
本发明采用如下技术方案实现上述目的：
本发明的第一方面提供了一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体。
进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述VH包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VH中的HCDR1-3，所述VL包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的VL中的LCDR1-3。
进一步，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。
进一步，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性。
在本发明中，与本发明所述单克隆抗体的VH对应的氨基酸序列、VL对应的氨基酸序列、HCDR1-3对应的氨基酸序列或LCDR1-3对应的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性、并保持特异性结合鼠疫耶尔森菌F1抗原和/或中和鼠疫耶尔森菌感染的能力的序列对应的抗体均在本发明的保护范围内。
在本发明中，所述HCDR1-3的氨基酸序列并不局限于如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，所述LCDR1-3的氨基酸序列并不局限于如SEQ ID NO:6-8所示的氨基酸序列，本领域技术人员公知不同CDR编号方案对同一VH或VL中的CDR1、CDR2、CDR3进行定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的氨基酸序列会存在一定的差异性，因此，采用任何CDR编号方案对本发明如前所述的VH和VL中的CDR1、CDR2、CDR3进行定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，所述CDR编号方案包括但不限于：IMGT编号方案、Chothia编号方案、Kabat编号方案、Contact编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合。
本发明的第二方面提供了一种缀合物。
进一步，所述缀合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述缀合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体以及一种或多种额外的分子或试剂(以下称为二级分子或试剂)。所述单克隆抗体可以缀合到任何类型的合成或天然二级分子或试剂，例如：肽、蛋白质、糖类/多糖、脂质、天然存在或合成的聚合物/共聚物等，以修饰单克隆抗体的一种或多种性质。
在一些实施方案中，所述缀合物还包含单克隆抗体和与其缀合的分子之间的共价连接或键。该分子可以直接缀合到单克隆抗体上，或者通过接头间接缀合。接头可以是包含一个或多个氨基酸的多肽接头或另一种类型的化学接头(例如：碳水化合物接头、脂质接头、脂肪酸接头、聚醚接头、PEG等)。
在一些实施方案中，所述二级分子或试剂可以缀合/连接到单克隆抗体的一个氨基酸的侧链。将分子或试剂缀合到氨基酸侧链的方法在本领域是众所周知的。例如，与赖氨酸残基侧链中存在的伯胺反应的化学基团，如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、酰亚胺、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯可以用于将分子或试剂缀合到单克隆抗体上。这些基团中的大多数通过酰化或烷基化与胺共轭。单克隆抗体中存在的半胱氨酸残基也可用于连接分子。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体被标记或与一个或多个部分缀合。单克隆抗体可以用一种或多种标记物标记，例如生物素标记物、荧光标记物、酶标记物、辅酶标记物、化学发光标记物或放射性同位素标记物。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体用可检测的标记物标记。有用的可检测标记物包括荧光化合物(例如：异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明、荧光素、Alexa染料等)、放射性标记物、酶(例如：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他常用于蛋白质检测分析的物质)、链霉亲和素/生物素和比色标记物(例如：胶体金、彩色玻璃或诸如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等的塑料珠)。也可以使用化学发光化合物。这种标记的单克隆抗体可用于通过流式细胞术、免疫组织化学等检测鼠疫耶尔森菌感染的细胞。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体也可以与可检测或亲和标签缀合，所述可检测或亲和标签促进单克隆抗体的检测和/或纯化。这样的标签在本领域中是众所周知的。可检测或亲和标签的例子包括但不限于：多组氨酸标签(His标签)、多聚精氨酸标签、聚天冬氨酸盐标签、多聚半胱氨酸标签、聚苯丙氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、钙调素结合肽(CBP)标签、链霉亲和素/生物素基标签、Profinity标签、表位标签(如FLAG、血凝素(HA)、HSV、S/S1、c-myc、KT3、T7、V5、E2和Glu-Glu表位标签)。
本发明的第三方面提供了一种核酸分子。
进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体；
优选地，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的VH的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的VL的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一些实施方案中，分离的核酸可以是合成DNA、mRNA(例如：非天然存在的mRNA)或cDNA。核酸可以插入质粒、载体或转录或表达盒中。可以制备编码本发明所述单克隆抗体的核酸，并且可以使用本领域熟知的常规技术来测试所述表达的单克隆抗体。
在一些实施方案中，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核酸可以保留在宿主细胞中的载体中。在另一些实施方案中，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核酸(DNA、mRNA)包含在囊泡内，例如脂质纳米颗粒(例如脂质体)或任何其他合适的载体。在另一些实施方案中，核酸是mRNA，并且被封装到纳米颗粒递送载体中。
本发明的第四方面提供了一种表达载体。
进一步，所述表达载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。
在一些实施方案中，本发明所述的表达载体是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是质粒，质粒是指一个环状的双链DNA环，额外的DNA片段可以连接到该环中。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。
在一些实施方案中，某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为重组表达载体。
本发明的第五方面提供了一种宿主细胞。
进一步，所述宿主细胞包含本发明第四方面所述的表达载体。
在本发明中，所述宿主细胞是指导入外源DNA的细胞。所述宿主细胞不仅是指特定的受试细胞，而且是指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包含在本发明所述的宿主细胞的范围内。
在一些实施方案中，所述宿主细胞包括选自任何生物界的原核细胞和真核细胞。为了重组产生抗体，将编码本发明如前所述的单克隆抗体的轻链和重链的一种或多种核酸引入能够产生重组抗体的细胞中。
在一些实施方案中，所述宿主细胞的实例包括但不限于：CHO-K1、DUkXB11、Pro-5、CHO-S、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、大鼠骨髓瘤细胞YB2/0、小鼠P3-X63-Ag8653细胞、二氢叶酸还原酶基因缺陷的CHO细胞、凝集素抗性获得的Lec13、α1,6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞、CHO-3E7细胞等。
本发明的第六方面提供了如下任一种产品：
(1)一种混合物，所述混合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；
(2)一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；
(3)一种药物制剂，所述药物制剂包含所述药物组合物；
(4)一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；
(5)一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含所述检测试剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂还包含药学上可接受的载体/赋形剂，所述载体/赋形剂可适用于通过任何常规给药途径施用所述单克隆抗体或编码所述单克隆抗体的核酸，例如口服、静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、颅内、眶内、眼科、室内、囊内、椎管内、鞘内、硬膜外、脑鞘内、腹膜内、鼻内或肺(如气雾剂)给药等。
在一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过静脉内或皮下途径施用所述单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过静脉内途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过皮下途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过肺途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。
在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂中还可包含一种或多种用于治疗鼠疫耶尔森菌感染相关疾病/病症或用于控制鼠疫耶尔森菌感染相关疾病/病症的额外活性剂，所述额外活性剂包括但不限于：止痛药、止呕药、抗炎剂、止泻剂、止咳剂、退烧药、免疫治疗剂等。
本发明的第七方面提供了如下任一种方法：
(1)一种本发明第一方面所述的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到本发明第一方面所述的单克隆抗体；
(2)一种本发明第五方面所述的宿主细胞的制备方法，所述方法包括：将本发明第四方面所述的表达载体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的宿主细胞；
(3)一种体外抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白活性的方法，所述方法包括：将本发明第四方面所述的表达载体引入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的单克隆抗体抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白的活性；
(4)一种体外使鼠疫耶尔森菌F1蛋白失活的方法，所述方法包括：将目标样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触；
(5)一种非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的方法，所述方法包括：将待测样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂接触，检测F1蛋白与抗体免疫复合物的形成。
在一些实施方案中，将目的核酸引入宿主细胞可以使用本领域熟知的技术来完成。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，以及使用逆转录病毒或其他病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入后可以引起或允许核酸表达，例如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。
本发明的第八方面提供了如下任一种应用：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明的第五方面所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂中的应用；
(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂盒中的应用；
(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的抗体衍生物中的应用；
(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的药物组合物中的应用；
(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的药物制剂中的应用；
(6)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的检测试剂和/或本发明第六方面中所述的检测试剂盒在非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白中的应用。
本发明还提供了一种诊断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的方法，所述方法包括：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第六方面中所述的检测试剂和/或本发明第六方面中所述的检测试剂盒与受试者来源的待测样品接触，检测受试者来源的待测样品中是否存在F1蛋白，进而判断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染相关疾病或患鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的风险。
本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的方法，所述方法包括：向所述有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的药物组合物和/或本发明第六方面中所述的药物制剂。
本发明还提供了一种降低受试者患鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的风险或鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的严重程度的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的药物组合物和/或本发明第六方面中所述的药物制剂。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明为本领域提供了一种全人源针对鼠疫耶尔森菌F1抗原的高保护性、高特异性和高亲和力的单克隆抗体，F1抗原是鼠疫耶尔森菌表达的特异性蛋白，因此，本发明提供的单克隆抗体可应用于鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的诊断、治疗及预防研究中，具有重要的应用前景。
附图说明
图1：ELISA检测血浆中F1抗体滴度；
图2：噬菌体ELISA筛选文库中的目的抗体；
图3：3株人源单克隆抗体与F1结合特异性鉴定结果图，其中，A图：3株人源单克隆抗体与F1抗原间接ELISA结果；B图：3株人源单克隆抗体与F1抗原的Western Blot结果，其中，M为相对分子质量标准；
图4：3株人源单克隆抗体与F1抗原结合的动力学分析结果图；
图5：小鼠体重变化曲线结果图；
图6：攻毒实验中小鼠生存曲线结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例全人源针对鼠疫耶尔森菌F1抗原的保护性单克隆抗体的筛选及其效果验证
1、实验材料
鼠疫耶尔森菌重组F1荚膜抗原由兰州生物制品研究所有限责任公司保存并提供；5份全血标本(编号：119,126,174,175,177)来自于兰州生物制品研究所有限责任公司的鼠疫重组疫苗II期临床项目(临床试验批件号：2012L01329)；鼠疫菌强毒株141株由青海地方病预防控制所鼠疫专业实验室分离鉴定并保存；BALB/c小鼠购自江苏华创信诺生物公司。克隆菌株DH5α，建库菌株XL1-Blue均由本室保存。建库载体pComb3XSS，抗体IgG表达载体pGI由本室构建及保存；HEK293F购自ATCC；反转录试剂盒，PCR试剂购自TaKaRa公司；SfiI内切酶，T4链接酶购自NEB公司；其他化学试剂均为分析纯。
2、实验方法
2.1标本采集
经知情同意及伦理审查，从鼠疫疫苗II期临床项目中采集完成三次免疫后的志愿者全血标本共5份，每份采集10mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度离心分离并冻存外周血单个核细胞(PBMC)，用1μg/mL的F1蛋白4℃过夜包被ELISA板。次日3％脱脂牛奶37℃封闭1h，然后从1:200倍开始倍比稀释待测血浆，37℃震荡孵育30min，PBST洗3次。加入HRP标记抗人IgG二抗，37℃震荡孵育30min，PBST洗3次，TMB显色，2M硫酸终止反应后读取OD450 nm吸光度值。
2.2文库构建
复苏冻存的PBMC细胞，使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA，然后采用Roche公司的第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis forRT-PCR进行反转录。根据文献报道方法扩增抗体的轻链及重链可变区基因，并且经过融合PCR链接成ScFv片段。ScFv片段经SfiI酶切后与同样经SfiI酶切的pComb3XSS载体链接后电击宿主菌XL1-Blue感受态制备噬菌体抗体文库，噬菌体抗体文库经野生型辅助噬菌体VCSM13包装后进行后续筛选，具体方法按文献进行。
2.3文库筛选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式，对上述噬菌体展示抗体文库进行亲和淘选。将重组表达的鼠疫F1抗原包被于免疫管中进行固相化，包被浓度依次为500、300、200ng/mL。具体步骤如下：向免疫管中加入相应量的F1蛋白，4℃包被过夜；弃上清，0.05％ PBST洗板3次，加入3％ BSA，37℃封闭2h；弃封闭液，0.05％ PBST洗板3次，加入抗体文库，37℃先振荡孵育1h，再静置孵育1h；弃上清，0.1％ PBST洗涤10次，加入PH＝2.2的0.1M Gly-HCl洗脱，再用2M Tris中和至PH＝7.0，取10μL测定滴度，剩余噬菌体感染XL1-Blue宿主菌后进行扩增，次日用PEG6000沉淀噬菌体再进行下一轮筛选。
2.4阳性克隆鉴定
从第三轮筛选测滴度的平板上随机挑取96个单菌落于96孔深孔板中，37℃260rpm培养4h，然后1：10转接至新的深孔板中再震荡培养4h，加入1mM IPTG 37℃诱导过夜。次日用间接ELISA法检测上清中抗体的表达，具体如下：首先将鼠疫F1抗原以200ng/孔包被于96孔酶标板中，加入50μL 3％脱脂牛奶和50μL深孔板中表达上清，37℃震荡孵育1h，PBST洗板3次，加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育30min后，PBST洗板，加入TMB显色液显色10min，用2M硫酸溶液终止反应后读取OD450的吸光度值。阳性克隆提质粒后送测序，测序结果经IMGT数据库比对抗体可变区的基因序列，选取序列有差异的克隆进行全抗体表达。
2.5抗鼠疫F1人源IgG1型全抗体表达
将F1抗体的重链可变区基因经AgeI和SalI酶切位点克隆入全抗体表达载体pGI-H，轻链基因经AgeI和BsiwI酶切位点克隆入pGI-K载体。测序正确后，使用PEI转染试剂将双质粒共转染293F细胞，5天后收取细胞上清，用Protein A柱纯化目的抗体。
2.6F1人源抗体与F1抗原结合特异性鉴定
采用间接ELISA及Western Blot法鉴定人源抗体与F1抗原的结合特异性。首先，将F1蛋白以1μg/mL包被96孔酶标板，纯化抗体从100ng/mL开始倍比稀释，一抗37℃孵育1h，PBST洗涤后加入HRP标记的抗人IgG，然后37℃孵育30min，后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值，每个样品重复3次取平均值。然后，对目的抗体进行Western Blot检测，将10μg的F1蛋白经SDS-PAGE后，将PAGE胶上蛋白转印到PVDF膜中，经3％脱脂牛奶封闭及重组F1人源单抗孵育，洗涤后加入HRP标记的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上显色。
2.7抗体亲和力测定
本研究使用生物膜干涉技术(BLI)检测人源抗体与F1抗原结合的亲和力及动力学参数。使用Pro A传感器将抗体固化于传感器表面，再与稀释后的F1抗原反应，通过分析表面光干涉的改变得到分子间相互作用的信息。使用Octet Red96大分子作用仪实时监测整个结合及解离过程。具体步骤包括：Pro A传感器预湿、传感器平衡、固化抗体、固化后平衡、结解离以及传感器再生，利用ForteBio Data Acquistion软件实时采集和分析分子相互作用和结合动力学数据。具体操作方法参考仪器说明。
2.8动物保护试验
在青海省地方病预防控制所鼠疫专业实验室BSL-3实验室完成该部分实验工作。F3、F19、F23及3个抗体mix组按100μg/只、20μg/只、4μg/只及0.5μg/只分为4个组，用一株新冠NP重组人源单抗作为无关抗体对照，每个组免疫6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠。将所有抗体提前24h经腹腔注射小鼠，次日攻毒100MLD的强度标准株141鼠疫菌。同时用未免疫抗体的小鼠注射100MLD、2MLD、1MLD以及0.5MLD强毒株做未免对照，用于验证毒株的毒力。完成免疫及攻毒后，将小鼠饲养在密封动物笼具中，每日记录小鼠体重及死亡情况，对于死亡的小鼠进行解剖后，取心、肝、肺脏器进行压印平板培养鼠疫菌，对培养阳性菌用鼠疫菌特异性噬菌体裂解验证。
3、实验结果
3.1血浆标本中F1抗体滴度检测
从鼠疫疫苗II期临床项目中采集的5份全血标本，经过分离PBMC后，产生的血浆经过间接ELISA检测其中F1抗体的滴度。结果如图1，从中可发现5份血浆均检测出F1特异性抗体，但抗体滴度仅可达到1:1000左右。
3.2人源抗鼠疫耶尔森菌噬菌体文库的构建及ScFv抗体筛选
收集了5份鼠疫疫苗接种后志愿者的外周全血，通过密度梯度离心分离出PBMC，分别提取mRNA和反转录，然后将cDNA等比例混合后用19对人ScFv引物分别扩增抗体的轻重链可变区序列，大小均为350bp左右。然后采用Overlapping PCR将轻重链随机连接成ScFv，大小约为700bp左右。酶切后连接噬菌体载体，连接产物电击2次XL1-Blue感受态细胞，测定文库的库容量达7.0×107CFU(colony-forming units)，经菌落PCR验证文库中正确插入率为100％。噬菌体文库经包装及F1抗原的3轮筛选后，挑取的96个单克隆菌落，经过IPTG诱导及噬菌体ELISA，确定OD450 nm>0.5的阳性克隆32个，如图2。测序后经过IMGT数据库比对序列，获得3株特异性单克隆抗体，分别命名为F3、F19及F23，其中，单克隆抗体F3的序列如表1所示。
表1单克隆抗体F3的序列
3.3人源抗体与F1抗原结合特异性鉴定
从噬菌体文库筛选出的抗体仅为ScFv片段，为了进一步验证抗体的生物学活性，本发明将F3、F19及F23均构建成人IgG1形式的全抗体，并在293F细胞中实现了分泌性表达，用Protein A柱对表达上清实现了纯化及定量。本发明分别采用间接ELISA和Western Blot实验来确定3株人源单抗与F1抗原的结合特异性，结果如图3A，3株人源抗体与F1蛋白ELISA结果显示所述抗体F3、F19及F23均能与F1抗原特异性结合，且对该重组抗体的检测灵敏度可达ng级别。在Western Blot实验中，同样用10μg的F1上样，3个抗体显示了比较明显的区别，其中，F3抗体在大于15kD上出现了一个明显的条带，此结果可确定F3为典型的线性表位单抗，而F19和F23在大于15kD的位置上出现了一条非常浅的条带，经过灰度值比较，其灰度值仅为F3的1/20，此结果说明F19和F23应该为空间表位单抗，之所以在Western Blot中也有较弱条带，可能是由于上样量过大导致的，如图3B。
3.4抗体亲和力测定
利用膜干涉技术，对3个人源单克隆抗体(F3、F19及F23)分别与F1抗原结合、解离数据进行分析。结果如图4，结果表明3个鼠疫人源抗体与F1抗原均有很高的亲和力，但结合方式却有所差异。其中具有线性表位的F3抗体与F1抗原结合量稍低，形成的生物膜厚度最大为0.4nm，而构象表位的两个抗体形成生物膜厚度最大都为0.6nm，其原因可能为线性抗体与构象表位抗体与抗原结合的数量不同导致的。在测量亲和力常数KD值中，F3和F23均小于1pM，F19的KD值为0.165nM。
3.5动物实验结果
小鼠经过免疫单抗，攻毒鼠疫141强毒菌株后，受试小鼠体重及死亡情况连续观察19天。对记录获得的实验数据进行分析后获得以下结果，100μg/只的单抗对小鼠均具有明显的保护效果，反映在此组小鼠体重均没有发生明显变化，没有死亡的小鼠体重均没有增加，说明100MLD鼠疫菌具有较强的致死性。注射20μg/只的单抗的小鼠体重下降程度大于100μg/只组，但是体重下降情况明显好于4μg及0.5μg组，此两组体重下降情况与无关抗体组及100MLD、2MLD和0.5MLD组没有区别。此外，3种单抗Mix组与单个抗体组没有明显区别，说明线性表位的F3单抗与构象表位的F19和F23单抗之间并无协调效应(如图5)。
图6显示受试小鼠生存曲线结果，结果显示生存率与小鼠体重结果具有很强的相关性，当小鼠体重下降约20％时候即会发生死亡。100μg/只剂量的F3、F19和F23单抗均具有明显的保护性，100μg/只的新冠NP单抗不具有保护效果，20μg/只的单抗也具有一定的保护效果，4μg/只和0.5μg/只的均不具有保护效果。Mix组在各个剂量条件下均没有发现优于单个抗体的效果，说明3个单抗之间没有协调效应。在对不同剂量MLD组数据对比中，并没有发现明显的剂量-效应关系，而且0.5MLD组动物在七天内全部死亡。
所有死亡小鼠取心、肝、脾、肺脏经过压印赫氏平皿，次日平皿上均有菌落长出，经鼠疫菌鉴别噬菌体裂解验证，压印菌均出现清晰噬菌带，确认小鼠死亡皆由鼠疫菌导致。
Claims (10)
1.一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述VH包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VH中的HCDR1-3，所述VL包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的VL中的LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性。
4.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体；
优选地，编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的VH的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的VL的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求6所述的表达载体。
8.如下任一种产品：
(1)一种混合物，其特征在于，所述混合物包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求7所述的宿主细胞；
(2)一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求7所述的宿主细胞；
(3)一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含所述药物组合物；
(4)一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求7所述的宿主细胞；
(5)一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含所述检测试剂。
9.如下任一种方法：
(1)一种权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求7所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体；
(2)一种权利要求7所述的宿主细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求6所述的表达载体引入到宿主细胞中，得到权利要求7所述的宿主细胞；
(3)一种体外抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求6所述的表达载体引入到生物体细胞中，通过表达权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白的活性；
(4)一种体外使鼠疫耶尔森菌F1蛋白失活的方法，其特征在于，所述方法包括：将目标样品与权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体接触；
(5)一种非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测样品与权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求8中所述的检测试剂接触，检测F1蛋白与抗体免疫复合物的形成。
10.如下任一种应用：
(1)权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂中的应用；
(2)权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞和/或权利要求8中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂盒中的应用；
(3)权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的抗体衍生物中的应用；
(4)权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的药物组合物中的应用；
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(6)权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体、权利要求4所述的缀合物、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8中所述的检测试剂和/或权利要求8中所述的检测试剂盒在非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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