CN117683129A - 全人源抗鼠疫耶尔森菌中和性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了全人源抗鼠疫耶尔森菌中和性抗体及其制备方法和用途,所述中和性抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区中的HCDR1‑3、氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区中的LCDR1‑3,具有特异的抗原结合性、优异的中和活性以及良好的动物保护效果,可方便、快速和有效地应用于鼠疫的诊断和治疗中。
Description
技术领域
本发明属于抗体药物制备领域,具体涉及全人源抗鼠疫耶尔森菌中和性抗体及其制备方法和用途。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森菌感染引起的一种烈性传染病,该病发展迅速,若不及时治疗,死亡率极高。目前,人类鼠疫的防治措施主要是疫苗接种和抗生素治疗。疫苗必须在暴露前一定时间内进行接种,一般需要多次接种才能起作用,大量的抗生素可用来治疗鼠疫患者,控制疾病的蔓延,鼠疫耶尔森菌对抗生素的耐药性较低,但目前已经在马达加斯加岛分离到通过转移质粒获得多重耐药性的鼠疫耶尔森菌,并且抗生素有一定的不良反应,不能持续使用。由于疫苗接种和抗生素治疗的缺点和局限性,具有快速、特异等优点的免疫学治疗备受关注。
已有研究表明,针对鼠疫耶尔森菌F1抗原、V抗原的单克隆抗体(单抗)或多克隆抗体能够抵抗该菌皮下、鼻内或者气溶胶攻击,如F1鼠源单抗F1-04-A-G1在腺鼠疫和肺鼠疫小鼠模型中具有保护作用。由于鼠疫致死性高、发病少,故新型鼠疫疫苗在研发过程中的有效性需要以“动物法则”的方式证明,通过疫苗免疫的人血清在动物体内抵抗鼠疫耶尔森菌感染的被动保护效果来判断其有效性。抗鼠疫耶尔森菌F1单抗的小鼠被动免疫保护试验,既是抵抗鼠疫感染的有效性证明,又是“动物法则”得以运用的依据和方法性证明。
此外,现有抗体均非完全人源抗体,有将小鼠抗体人源化后制备成的嵌合抗体,也有报道是从天然文库中筛选出的针对鼠疫F1抗原的人源抗体,这些抗体均非人免疫系统产生的针对鼠疫抗原的抗体。有鉴于此,本发明的目的在于为本领域提供一种全人源抗鼠疫耶尔森菌中和性抗体F19。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于:为本领域提供一种全人源抗鼠疫耶尔森菌中和性抗体F19,所述中和性抗体F19具有特异的抗原结合性、优异的中和活性以及良好的动物保护效果,可方便、快速和有效地应用于鼠疫的诊断和治疗中,应用前景广阔。基于此,本发明的发明人提出了本发明,本发明的上述目的采用如下技术方案得以实现:
在一方面,本发明提供了一种抗鼠疫耶尔森菌F1抗原的抗体或其抗原结合片段。
进一步,所述抗体或其抗原结合片段的包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区中的HCDR1-3、氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
进一步,所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示,所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示;
优选地,所述重链可变区如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4具有至少75%同源性;
优选地,所述轻链可变区如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少75%同源性。
本领域技术人员公知,根据所采用的CDR编号方案的不同,本发明所述的抗体或其抗原结合片段中对应的HCDR1-3、LCDR1-3具有多种不同的氨基酸序列,只要是基于本发明提供的抗体中如SEQ ID NO:4所示的重链可变区和如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3均在本发明的保护范围内。
在本发明中,采用任何CDR编号方案(现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案)分别对如SEQ ID NO:4所示的重链可变区中的HCDR1-3进行定义、对如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区中的LCDR1-3进行定义得到的HCDR1-3、LCDR1-3对应的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。示例性地,所述CDR编号方案包括但不限于:IMGT编号方案、Kabat编号方案、Chothia编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合。
在一些实施方案中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以通过重组表达产生。可以将编码与恒定区连接的轻链可变区和重链可变区的核酸插入表达载体中。包含编码本发明所述抗体或其抗原结合片段的核酸的载体本身是本申请的一方面。轻链和重链可以克隆到相同或不同的表达载体中。编码本发明所述抗体链的核酸可以与表达载体中的一个或多个控制序列可操作地连接,以确保抗体链的表达。表达控制序列包括但不限于:启动子(例如,天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地,表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。此类载体可并入合适的宿主中,由此宿主维持在适合于高水平表达核苷酸序列以及收集和纯化抗体的条件下。
此外,本发明还提供了一种双特异性抗体,所述双特异性抗体包含如前所述的抗体或其抗原结合片段,以及一个与其他抗原特异性结合的第二抗体。
在本发明中,所述双特异性抗体是指具有由不同的抗体序列限定的两个不同抗原结合区域的抗体。可以理解为与不同的靶标结合,但也包括与一个靶标的不同表位相结合。其包括全长双特异性抗体及其抗原结合片段。双特异性抗体可以含有另外的修饰,如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。双特异性抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子,只要这些抗体表现出期望的生物活性,其均属于所述双特异性抗体的范畴。
在另一方面,本发明提供了一种核酸分子。
进一步,所述核酸分子选自如下任一种核酸分子:
(1)编码本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段;
(2)编码本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区;
(3)编码本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区。
进一步,编码本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO:5所示,编码本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一方面,本发明提供了一种表达载体。
进一步,所述表达载体包含本发明如前所述的核酸分子;
优选地,所述载体包括DNA载体、RNA载体;
更优选地,所述RNA载体包括病毒载体;
最优选地,所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体、噬菌体载体。
在某些实施方案中,所述表达表达载体中的核酸分子与启动子可操作性地连接,示例性地,所述启动子包括但不限于:CMV启动子、SV40启动子、amp启动子、tac启动子、lac启动子、pLλ启动子、rac5启动子、SP6启动子、T7启动子等。
在某些实施方案中,所述载体包括逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任何组合。
示例性地,合适的载体包括但不限于:pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空质粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES萤光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc等。
在另一方面,本发明提供了一种经基因改造的宿主细胞。
进一步,所述经基因改造的宿主细胞包含本发明如前所述的表达载体或在所述经基因改造的宿主细胞基因组中整合有本发明如前所述的核酸分子。
在本发明中,能够用作表达抗体的宿主细胞是本领域公知的,并且许多宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得。这些宿主细胞包括但不限于:中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、海拉细胞(HeLa cell)、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它多种类型的细胞系。
在另一方面,本发明提供了一种抗体偶联物、检测试剂或检测产品。
进一步,所述抗体偶联物为本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段直接或间接偶联至可检测标记物上形成的复合物;
优选地,所述检测试剂包含本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物;
优选地,所述检测产品包含本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、所述抗体偶联物或所述检测试剂;
更优选地,所述检测产品包括试剂盒;
最优选地,所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式分选试剂盒、IHC检测试剂盒。
在本发明中,所述可检测标记物是指任何能够用于辅助所述抗体或其抗原结合片段检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的物质,示例性的,所述可检测标记物包括但不限于:荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、水母发光蛋白、亚甲基蓝、原卟啉、血卟啉等。
在某些实施方案中,所述试剂盒中还包括固相载体,本发明提供的抗体或其抗原结合片段被固定于固相载体(例如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。所述试剂盒中还包括:能与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测部分,可检测部分可分离地存在于试剂盒中;和/或与可检测部分相对应的底物;和/或酶联免疫反应试剂,所述反应试剂包括但不限于:包被(缓冲)液,洗涤(缓冲)液,封闭液,固定液,终止液,显色液;和/或说明检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的方法的使用说明书。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物或药物制剂。
进一步,所述药物组合物包含本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述药物制剂包含本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物;
优选地,所述药物组合物或药物制剂还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
在某些实施方案中,所述药物组合物还可包含其他能够用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的药物,所述药物只要能够发挥(辅助)治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的作用,其均落入本发明的保护范围。
在另一方面,本发明提供了如下任一方面的应用,所述应用包括:
(1)本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的核酸分子、本发明如前所述的表达载体和/或本发明如前所述的经基因改造的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的抗体偶联物中的应用;
(2)本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的核酸分子、本发明如前所述的表达载体、本发明如前所述的经基因改造的宿主细胞和/或本发明如前所述的抗体偶联物在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂中的应用;
(3)本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的核酸分子、本发明如前所述的表达载体、本发明如前所述的经基因改造的宿主细胞、本发明如前所述的抗体偶联物和/或本发明如前所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测产品中的应用;
(4)本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的核酸分子、本发明如前所述的表达载体和/或本发明如前所述的经基因改造的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的药物组合物中的应用;
(5)本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的核酸分子、本发明如前所述的表达载体、本发明如前所述的经基因改造的宿主细胞和/或本发明如前所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的药物制剂中的应用。
在另一方面,本发明提供了如下任一种方法,所述方法包括:
(1)一种非诊断目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:将本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的抗体偶联物和/或本发明如前所述的检测试剂与待测样品接触,检测F1蛋白与抗体免疫复合物的形成;
(2)一种体外抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白活性的方法,所述方法包括:将本发明如前所述的表达载体引入到生物体细胞中,通过表达本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白的活性。
在本发明中,所述待测样品包括但不限于液体类,比如尿、唾液、脑脊髓液、血液、血清及类似物,或者固体或半固体类,比如组织、粪便及类似物,或者,可以是如那些常用于组织学诊断的固体组织。本发明对待测样品并无特别限制,只要有鼠疫耶尔森菌F1蛋白检测需要的待测样品,其均将落入本发明的保护范围内。
在本发明中,对所述鼠疫耶尔森菌F1蛋白进行检测的方法包括定量或定性检测,示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如,FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。在一些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以偶联荧光素酶、生物素酶等可检测标记,在液相或固相中用于FACS、IHC、ELISA等直接或间接的免疫测定,包括竞争性或非竞争性等等。
示例性的,本发明提供检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白在生物样品中存在的方法,所述方法包括检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方式中,所述方法包括将生物样品与如本发明所述的抗体或抗原结合片段在允许该抗体或抗原结合片段与鼠疫耶尔森菌F1蛋白结合的条件下接触,并检测在所述抗体或抗原结合片段和鼠疫耶尔森菌F1蛋白之间是否形成复合物。复合物的形成表示在生物样品中存在鼠疫耶尔森菌F1蛋白。该方法可以是体外或体内方法。
此外,本发明还提供了一种诊断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染疾病的方法,所述方法包括:将本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的抗体偶联物、本发明如前所述的检测试剂和/或本发明如前所述的检测产品与受试者来源的待测样品接触,检测受试者来源的待测样品中是否存在F1蛋白,进而判断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染疾病或患鼠疫耶尔森菌感染疾病的风险。
此外,本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的方法,所述方法包括:向所述有需要的受试者施用有效量的本发明如前所述的抗体或其抗原结合片段、本发明如前所述的药物组合物和/或本发明如前所述的药物制剂。
在本发明中,所述受试者是指任何动物,优选为哺乳动物,包括但不限于:人、高等灵长类、家养和农场动物,以及动物园动物、竞技动物或宠物,诸如马、猪、牛、狗、猫和雪貂等。在本发明的具体实施方案中,所述受试者优选为人。
在本发明中,所述施用是指将一定剂量的化合物(例如本发明所述的抗体或其抗原结合片段或编码本发明所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子)或组合物(例如本发明所述的药物组合物或药物制剂)给予有需要的受试者的方法,施用的方式包括但不限于:肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、直肠内、表面、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、通过吸入、通过注射、通过输注,通过连续输注、通过导管、通过灌洗、以霜剂、或以脂质组合物来施用。施用的具体方法的选择可以根据多种因素(例如所施用的化合物或组合物和所治疗的疾患、疾病、或病症的严重性)而变化。
附图说明
图1:ELISA检测血浆中F1抗体滴度;
图2:噬菌体ELISA筛选文库中的目的抗体;
图3:3株人源单克隆抗体与F1结合特异性鉴定结果图,其中,A图:3株人源单克隆抗体与F1抗原间接ELISA结果;B图:3株人源单克隆抗体与F1抗原的Western Blot结果,其中,M为相对分子质量标准;
图4:3株人源单克隆抗体与F1抗原结合的动力学分析结果图;
图5:小鼠体重变化曲线结果图;
图6:攻毒实验中小鼠生存曲线结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,具体实施例仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例全人源针对鼠疫耶尔森菌F1抗原的保护性单克隆抗体的筛选及其效果验证
1、实验材料
鼠疫耶尔森菌重组F1荚膜抗原由兰州生物制品研究所有限责任公司保存并提供;5份全血标本(编号:119,126,174,175,177)来自于兰州生物制品研究所有限责任公司的鼠疫重组疫苗II期临床项目(临床试验批件号:2012L01329);鼠疫菌强毒株141株由青海地方病预防控制所鼠疫专业实验室分离鉴定并保存;BALB/c小鼠购自江苏华创信诺生物公司。克隆菌株DH5α,建库菌株XL1-Blue均由本室保存。建库载体pComb3XSS,抗体IgG表达载体pGI由本室构建及保存;HEK293F购自ATCC;反转录试剂盒,PCR试剂购自TaKaRa公司;SfiI内切酶,T4链接酶购自NEB公司;其他化学试剂均为分析纯。
2、实验方法
2.1标本采集
经知情同意及伦理审查,从鼠疫疫苗II期临床项目中采集完成三次免疫后的志愿者全血标本共5份,每份采集10mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度离心分离并冻存外周血单个核细胞(PBMC),用1μg/mL的F1蛋白4℃过夜包被ELISA板。次日3%脱脂牛奶37℃封闭1h,然后从1:200倍开始倍比稀释待测血浆,37℃震荡孵育30min,PBST洗3次。加入HRP标记抗人IgG二抗,37℃震荡孵育30min,PBST洗3次,TMB显色,2M硫酸终止反应后读取OD450 nm吸光度值。
2.2文库构建
复苏冻存的PBMC细胞,使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA,然后采用Roche公司的第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis forRT-PCR进行反转录。根据文献报道方法扩增抗体的轻链及重链可变区基因,并且经过融合PCR链接成ScFv片段。ScFv片段经SfiI酶切后与同样经SfiI酶切的pComb3XSS载体链接后电击宿主菌XL1-Blue感受态制备噬菌体抗体文库,噬菌体抗体文库经野生型辅助噬菌体VCSM13包装后进行后续筛选,具体方法按文献进行。
2.3文库筛选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式,对上述噬菌体展示抗体文库进行亲和淘选。将重组表达的鼠疫F1抗原包被于免疫管中进行固相化,包被浓度依次为500、300、200ng/mL。具体步骤如下:向免疫管中加入相应量的F1蛋白,4℃包被过夜;弃上清,0.05% PBST洗板3次,加入3% BSA,37℃封闭2h;弃封闭液,0.05% PBST洗板3次,加入抗体文库,37℃先振荡孵育1h,再静置孵育1h;弃上清,0.1% PBST洗涤10次,加入PH=2.2的0.1M Gly-HCl洗脱,再用2M Tris中和至PH=7.0,取10μL测定滴度,剩余噬菌体感染XL1-Blue宿主菌后进行扩增,次日用PEG6000沉淀噬菌体再进行下一轮筛选。
2.4阳性克隆鉴定
从第三轮筛选测滴度的平板上随机挑取96个单菌落于96孔深孔板中,37℃260rpm培养4h,然后1:10转接至新的深孔板中再震荡培养4h,加入1mM IPTG 37℃诱导过夜。次日用间接ELISA法检测上清中抗体的表达,具体如下:首先将鼠疫F1抗原以200ng/孔包被于96孔酶标板中,加入50μL 3%脱脂牛奶和50μL深孔板中表达上清,37℃震荡孵育1h,PBST洗板3次,加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体,37℃孵育30min后,PBST洗板,加入TMB显色液显色10min,用2M硫酸溶液终止反应后读取OD450的吸光度值。阳性克隆提质粒后送测序,测序结果经IMGT数据库比对抗体可变区的基因序列,选取序列有差异的克隆进行全抗体表达。
2.5抗鼠疫F1人源IgG1型全抗体表达
将F1抗体的重链可变区基因经AgeI和SalI酶切位点克隆入全抗体表达载体pGI-H,轻链基因经AgeI和BsiwI酶切位点克隆入pGI-K载体。测序正确后,使用PEI转染试剂将双质粒共转染293F细胞,5天后收取细胞上清,用Protein A柱纯化目的抗体。
2.6F1人源抗体与F1抗原结合特异性鉴定
采用间接ELISA及Western Blot法鉴定人源抗体与F1抗原的结合特异性。首先,将F1蛋白以1μg/mL包被96孔酶标板,纯化抗体从100ng/mL开始倍比稀释,一抗37℃孵育1h,PBST洗涤后加入HRP标记的抗人IgG,然后37℃孵育30min,后TMB显色,终止后读取OD450吸光度值,每个样品重复3次取平均值。然后,对目的抗体进行Western Blot检测,将10μg的F1蛋白经SDS-PAGE后,将PAGE胶上蛋白转印到PVDF膜中,经3%脱脂牛奶封闭及重组F1人源单抗孵育,洗涤后加入HRP标记的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上显色。
2.7抗体亲和力测定
本研究使用生物膜干涉技术(BLI)检测人源抗体与F1抗原结合的亲和力及动力学参数。使用Pro A传感器将抗体固化于传感器表面,再与稀释后的F1抗原反应,通过分析表面光干涉的改变得到分子间相互作用的信息。使用Octet Red96大分子作用仪实时监测整个结合及解离过程。具体步骤包括:Pro A传感器预湿、传感器平衡、固化抗体、固化后平衡、结解离以及传感器再生,利用ForteBio Data Acquistion软件实时采集和分析分子相互作用和结合动力学数据。具体操作方法参考仪器说明。
2.8动物保护试验
在青海省地方病预防控制所鼠疫专业实验室BSL-3实验室完成该部分实验工作。F3、F19、F23及3个抗体mix组按100μg/只、20μg/只、4μg/只及0.5μg/只分为4个组,用一株新冠NP重组人源单抗作为无关抗体对照,每个组免疫6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠。将所有抗体提前24h经腹腔注射小鼠,次日攻毒100MLD的强度标准株141鼠疫菌。同时用未免疫抗体的小鼠注射100MLD、2MLD、1MLD以及0.5MLD强毒株做未免对照,用于验证毒株的毒力。完成免疫及攻毒后,将小鼠饲养在密封动物笼具中,每日记录小鼠体重及死亡情况,对于死亡的小鼠进行解剖后,取心、肝、肺脏器进行压印平板培养鼠疫菌,对培养阳性菌用鼠疫菌特异性噬菌体裂解验证。
3、实验结果
3.1血浆标本中F1抗体滴度检测
从鼠疫疫苗II期临床项目中采集的5份全血标本,经过分离PBMC后,产生的血浆经过间接ELISA检测其中F1抗体的滴度。结果如图1,从中可发现5份血浆均检测出F1特异性抗体,但抗体滴度仅可达到1:1000左右。
3.2人源抗鼠疫耶尔森菌噬菌体文库的构建及ScFv抗体筛选
收集了5份鼠疫疫苗接种后志愿者的外周全血,通过密度梯度离心分离出PBMC,分别提取mRNA和反转录,然后将cDNA等比例混合后用19对人ScFv引物分别扩增抗体的轻重链可变区序列,大小均为350bp左右。然后采用Overlapping PCR将轻重链随机连接成ScFv,大小约为700bp左右。酶切后连接噬菌体载体,连接产物电击2次XL1-Blue感受态细胞,测定文库的库容量达7.0×107CFU(colony-forming units),经菌落PCR验证文库中正确插入率为100%。噬菌体文库经包装及F1抗原的3轮筛选后,挑取的96个单克隆菌落,经过IPTG诱导及噬菌体ELISA,确定OD450 nm>0.5的阳性克隆32个,如图2。测序后经过IMGT数据库比对序列,获得3株特异性单克隆抗体,分别命名为F3、F19及F23,其中,单克隆抗体F19的序列如表1所示。
表1单克隆抗体F19的序列
3.3人源抗体与F1抗原结合特异性鉴定
从噬菌体文库筛选出的抗体仅为ScFv片段,为了进一步验证抗体的生物学活性,本发明将F3、F19及F23均构建成人IgG1形式的全抗体,并在293F细胞中实现了分泌性表达,用Protein A柱对表达上清实现了纯化及定量。本发明分别采用间接ELISA和Western Blot实验来确定3株人源单抗与F1抗原的结合特异性,结果如图3A,3株人源抗体与F1蛋白ELISA结果显示所述抗体F3、F19及F23均能与F1抗原特异性结合,且对该重组抗体的检测灵敏度可达ng级别。在Western Blot实验中,同样用10μg的F1上样,3个抗体显示了比较明显的区别,其中,F3抗体在大于15kD上出现了一个明显的条带,此结果可确定F3为典型的线性表位单抗,而F19和F23在大于15kD的位置上出现了一条非常浅的条带,经过灰度值比较,其灰度值仅为F3的1/20,此结果说明F19和F23应该为空间表位单抗,之所以在Western Blot中也有较弱条带,可能是由于上样量过大导致的,如图3B。
3.4抗体亲和力测定
利用膜干涉技术,对3个人源单克隆抗体(F3、F19及F23)分别与F1抗原结合、解离数据进行分析。结果如图4,结果表明3个鼠疫人源抗体与F1抗原均有很高的亲和力,但结合方式却有所差异。其中具有线性表位的F3抗体与F1抗原结合量稍低,形成的生物膜厚度最大为0.4nm,而构象表位的两个抗体形成生物膜厚度最大都为0.6nm,其原因可能为线性抗体与构象表位抗体与抗原结合的数量不同导致的。在测量亲和力常数KD值中,F3和F23均小于1pM,F19的KD值为0.165nM。
3.5动物实验结果
小鼠经过免疫单抗,攻毒鼠疫141强毒菌株后,受试小鼠体重及死亡情况连续观察19天。对记录获得的实验数据进行分析后获得以下结果,100μg/只的单抗对小鼠均具有明显的保护效果,反映在此组小鼠体重均没有发生明显变化,没有死亡的小鼠体重均没有增加,说明100MLD鼠疫菌具有较强的致死性。注射20μg/只的单抗的小鼠体重下降程度大于100μg/只组,但是体重下降情况明显好于4μg及0.5μg组,此两组体重下降情况与无关抗体组及100MLD、2MLD和0.5MLD组没有区别。此外,3种单抗Mix组与单个抗体组没有明显区别,说明线性表位的F3单抗与构象表位的F19和F23单抗之间并无协调效应(如图5)。
图6显示受试小鼠生存曲线结果,结果显示生存率与小鼠体重结果具有很强的相关性,当小鼠体重下降约20%时候即会发生死亡。100μg/只剂量的F3、F19和F23单抗均具有明显的保护性,100μg/只的新冠NP单抗不具有保护效果,20μg/只的单抗也具有一定的保护效果,4μg/只和0.5μg/只的均不具有保护效果。Mix组在各个剂量条件下均没有发现优于单个抗体的效果,说明3个单抗之间没有协调效应。在对不同剂量MLD组数据对比中,并没有发现明显的剂量-效应关系,而且0.5MLD组动物在七天内全部死亡。
所有死亡小鼠取心、肝、脾、肺脏经过压印赫氏平皿,次日平皿上均有菌落长出,经鼠疫菌鉴别噬菌体裂解验证,压印菌均出现清晰噬菌带,确认小鼠死亡皆由鼠疫菌导致。
Claims (10)
1.一种抗鼠疫耶尔森菌F1抗原的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区中的HCDR1-3、氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示,所述LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示;
优选地,所述重链可变区如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4具有至少75%同源性;
优选地,所述轻链可变区如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少75%同源性。
3.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子选自如下任一种核酸分子:
(1)编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段;
(2)编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区;
(3)编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区。
4.根据权利要求3所述的核酸分子,其特征在于,编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO:5所示,编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的序列如SEQ ID NO:10所示。
5.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体包含权利要求3或4所述的核酸分子;
优选地,所述载体包括DNA载体、RNA载体;
更优选地,所述RNA载体包括病毒载体;
最优选地,所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体、噬菌体载体。
6.一种经基因改造的宿主细胞,其特征在于,所述经基因改造的宿主细胞包含权利要求5所述的表达载体或在所述经基因改造的宿主细胞基因组中整合有权利要求3或4所述的核酸分子。
7.一种抗体偶联物、检测试剂或检测产品,其特征在于,所述抗体偶联物为权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段直接或间接偶联至可检测标记物上形成的复合物;
优选地,所述检测试剂包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物;
优选地,所述检测产品包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、所述抗体偶联物或所述检测试剂;
更优选地,所述检测产品包括试剂盒;
最优选地,所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、流式分选试剂盒、IHC检测试剂盒。
8.一种药物组合物或药物制剂,其特征在于,所述药物组合物包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述药物制剂包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物;
优选地,所述药物组合物或药物制剂还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
9.如下任一方面的应用,其特征在于,所述应用包括:
(1)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6所述的经基因改造的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的抗体偶联物中的应用;
(2)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经基因改造的宿主细胞和/或权利要求7中所述的抗体偶联物在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测试剂中的应用;
(3)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经基因改造的宿主细胞、权利要求7中所述的抗体偶联物和/或权利要求7中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的检测产品中的应用;
(4)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体和/或权利要求6所述的经基因改造的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的药物组合物中的应用;
(5)权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经基因改造的宿主细胞和/或权利要求8中所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染疾病的药物制剂中的应用。
10.如下任一种方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)一种非诊断目的地检测鼠疫耶尔森菌F1蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:将权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7中所述的抗体偶联物和/或权利要求7中所述的检测试剂与待测样品接触,检测F1蛋白与抗体免疫复合物的形成;
(2)一种体外抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白活性的方法,所述方法包括:将权利要求5所述的表达载体引入到生物体细胞中,通过表达权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段抑制鼠疫耶尔森菌F1蛋白的活性。
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