WO2006123829A1

WO2006123829A1 - ＰＡＰ２ａに対する抗体ならびにその診断的および治療的使用

Info

Publication number: WO2006123829A1
Application number: PCT/JP2006/310406
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Hamada; Kiminori Nakamura; Kazunori Kato
Original assignee: Sapporo Medical University
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2006-11-23
Also published as: JP2008163029A; EP1908825A4; JPWO2006123829A1; US8232069B2; EP1908825A1; US20090214421A1; JP4097041B2

Abstract

本発明は、標的細胞に対して高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現できるような、遺伝子導入システムを開発すること、特に、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入療法において、上記システムの開発をすることを目的とする。本発明は、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、治療遺伝子を含む薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法を提供する。

Description

明細書

PAP 2 aに対する抗体ならびにその診断的および治療的使用技術分野

本発明は、 PAP 2 aに対する抗体ならびにその診断的および治療的使用に関する。特に、本発明は、前立腺癌、膝癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌等を含む癌組織に高発現する PAP 2 aに対して特異的に結合するモノクローナル抗体の作製、ならびにその診断的および治療的使用に関する。背景技術

従来、癌の遺伝子療法としては、治療ベクターを腫瘍内投与することが一般的に行われてきた。しかしながら、このような局所投与法は、転移腫瘍を有する患者の治療には有効ではないため、最近では、転移腫瘍を特異的に標的化し得、したがって、全身投与が可能なベクターの開発が行われている。

既に、 B HKハムスター及びマウスにおいて転移した腫瘍細胞に特異的に感染し、アポトーシスを誘導し得るシンドビスウィルスベクター（ T s e n g, J . C . , N a t u r e B i o t e c h n o l . , 2 2 : 7 0 - 7 7 , 2 0 04)、 r a s遺伝子に変異を有する臈癌などに特異的に細胞毒性を示す V A I変異型アデノウィルス（C a s c a l l o M e t 1. , C a n c e r R e s . 6 3 : 5 544 - 5 5 5 0 , 2 0 0 3 ) 等が、報告されている。

アデノウイルスは、二本鎖 DNAをゲノムに有する正二十面体構造のウィルスであり、血清学的には幾つかに分類されている。ヒトの遺伝子治療に通常使用されるのは、ヒトアデノウイルス 2型（Ad 2) および 5型（A d 5 ) である（例えば、特開 2 0 0 2— 3 3 0 7 8 9 )。アデノウィルスのウィルス核酸は、. 正二十面体構造を有するキヤプシドと呼ば- れる外被タンパク質に包まれており、キヤプシドの表面には、その正二十面体構造の各頂点にテールとシャフトを、および末端にノブ（Kn o b ) を有する 1 2本のファイバーが存在している。これらのファイバーは、アデノウイルスが細胞に感染するために必要であり、アデノウィルスは、これらのファイバーを介して細胞表面レセプ夕一に結合する。そのような細胞表面レセプ夕一として CAR (コクサツキ一アデノウィルス'—レセプ.タ一) (C o x s a c k i e a d e n o v i r u s r e c e p t o r ) が知られており、実際、大部分のアデノウイルスは、細胞への接着のために C ARを利用すると考えられている。

アデノウイルスは、正常細胞を含む、 CARを発現する多くの細胞夕ィプに感染し得るため、ベクタ一としての利用価値が高く評価されてきたが、反面、そのような宿主域の広さのために、アデノウイルスベクタ —を用いて遺伝子導入を行った場合に、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）のみならず、周囲の正常細胞にも感染してしまうという問題が指摘されている。その一方、膝癌細胞やメラノーマなどでは、 CARの発現が低いために、アデノウィルスが感染しにくいという問題があることも判明している。

そのため、本発明者らはこれまで、膝癌細胞などの標的細胞に高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現できるような癌標的化ゥィルスべクタ一による遺伝子導入系の開発を目指してきた。本発明者らは、これまでに、抗体の F c ドメインに結合する P r o t e i nAの Z 3 3モチーフをノブの H Iループ部位に含む F Z 3 3ファイバー変異型 Ad 5ウィルスを使用して、 l a c Z、 E G F Pなどのレポーター遺伝子を発現するアデノウイルスを作製した。そして、 CARの発現を欠く白血病細胞に高発現する膜タンパク質分子 CD 40、 CD 2 0などに対する抗体を予め白血病細胞に付着させ、それらに対してべ一夕 · ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス Ax 3 CAZ 3 -F Z 3 3 を感染させ、遺伝子導入効率を /3 - g a l レポ一夕一遺伝子発現を指標として測定した。その結果、使用した抗体のうちいくつかの場合につて遺伝子発現がコントロールの数倍に増強されることがわかっている。しかしながら、滕癌細胞などの他の腫瘍細胞に選択的かつ効果的に遺伝子導入できるような標的化の候補分子は未だ見出されていない。

ホスファチジン酸ホスファターゼ（P AP) は、ホスファチジン酸（P A) のジァシルグリセロール（DG) への変換を触媒する酵素である。 P A P 2 aは、ホスファチジン酸ホスファタ一ゼのァイソザィムであり、最初にプタおよびマウスにおいて同定され（K a i e t a 1. , J . B i o l . C h em. 1 9 9 6， 2 7 1 ( 3 1 ), 1 8 9 3 1 - 1 8 9 3 8 )、その後、ヒトにおいても同定された（K a i e t a 1 , J . B i o 1. C h em. 1 9 9 7 , 2 7 2 , 24 5 7 2— 24 5 7 8)。

PAP 2 aは、ヒ卜の正常組織（特に前立腺）、および前立腺癌で発現することが報告されているが（L e u n g DW e t a 1. , DN A C e l l B i o l . 1 9 9 8 (4) : 3 7 7 - 8 5 ; U 1 r i x e t a 1. , J . B i o l . C h em. 1 9 9 8 , 2 7 3 ( 8 ) : 46 6 0— 46 6 5)、 L e u n gらは、多くの組織において腫瘍化により P A P 2 aがダウンレギュレートされることを示している。また、 L e u n gらによる P C T出願（WO 9 8Z46 7 3 0 ) に開示される発明も、 PAP 2 aが癌抑制遺伝子であるとの知見に基づいている。 U 1 t i X らによれば、ヒト組織における発現は、偏在的であるが、最も高いレべルの発現が前立腺で確認されている（U 1 t i X e t a l .，前出）。 U 1 t i xらによる PAP 2 aの前立腺癌培養細胞株での発現は、アンドロジェン依存性であることが報告されているが（U 1 t i X e t a 1. , 前出）、このタンパク質の生物学的な重要性（例えば、なぜ膜表面に局在するのか、前立腺ないし前立腺癌細胞株でどのような役割を担つているのか等）は、依然不明のままである。発明の開示

上述したような状況において、ウィルスベクタ一を用いて、種々の標的細胞に対して高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現で- きるような、遺伝子導入系のさらなる開発およびそのような開発のための手法の確立が望まれている。

本発明者らは、塍癌細胞その他の種々の癌細胞に抗体の F c ドメインに結合する F Z 3 3モチーフを有するアデノウイルスを感染させる際に、マウスをハムスター H a s細胞で免疫して作製したモノクローナル抗体を、その感染の際に併用することによって遺伝子導入効率を高めることができる当該モノクローナル抗体のスクリーニングを、レポーター遺伝子発現測定アツセィ法を用いて行った。その結果、本発明者らは、選択的にアデノウィルスの感染効率を高めることのできるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを同定することができた。

. さらに、そのモノクローナル抗体が特異的に認識する抗原を質量分析および相同性検索により同定した。その結果、上記モノクローナル抗体の認識する抗原が P A P 2 aであることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の PAP 2 a抗体、および該抗体を産生するハイプリドーマを提供する。

( 1 ) P A P 2 aに対する抗体。

(2) モノクローナル抗体である、上記（ 1 ) に記載の抗体。

( 3 ) 受託番号 FERM P— 2 049 9またはF E RM P - 2 04 9 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、上記（ 2) に記載の抗体。

(4) 上記（2) に記載の抗体を産生するハイプリドーマ。

(5) 受託番号 FE RM. P— 2 0 49 9または F ERM P - 2 04 9 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された上記（4) に記載のハイプリドーマ。

本発明はまた、以下に記載する抗 PAP 2 a抗体を含有する癌の診断薬を提供する。

(6) 抗 PAP 2 a抗体を.含有する、癌の診断薬。 ( 7 ) 上記抗 P A P 2 抗体が、受託番号 F E RM P— 2 04 9 9または F E RM P— 2 0 49 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイプリドーマが産生する抗 P A P 2 a抗体である、上記（6 ) に記載の癌の診断薬。

(8 ) 上記抗 P AP 2 a抗体が、標識されている、上記（ 6 ) または（ 7 ) に記載の癌の診断薬。

(9) 上記抗 PAP 2 a抗体が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素によって標識されている、上記（8) に記載の癌の診断薬。 ( 1 0 a) 上記癌が、 P AP 2 a陽性の（P AP 2 aを高発現することによって特徴付けられる）癌である、上記（6 ) 〜（9 ) のいずれかに記載の癌の診断薬。

( 1 0 b) 上記癌が、腺癌である、上記（ 1 0 a) に記載の癌の診断薬。 ( 1 0 c ) 上記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（ 1 0 a) または（ 1 0 b) に記載の癌の診断薬。本発明はまた、以下に記載する癌の診断方法を提供する。

( 1 1 ) 被験者由来の生体試料中の PAP 2 aタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マ一カーとして検出および /または定量する工程を包含する、癌の診断方法。

( 1 2 ) 被験者由来の生体試料中の P A P 2 aタンパク質もしくはその断片を、抗 P AP 2 a抗体を用いて免疫学的に検出およびまたは定量する、上記（ 1 1 ) に記載の方法。

( 1 3) 上記生体試料と抗 P A P 2 a抗体とを接触させる工程、および該生体試料中の P AP 2 aと該抗 PAP 2 a抗体との結合を検出および Zまたは定量する工程

を包含する、上記（ 1 2) に記載の方法。

( 1 4) 上記検出およびノまたは定量する工程が、標識された抗 P AP 2 a抗体を用いて、 PAP 2 aと抗 PAP 2 a抗体との結合を検出およぴ Zまたは定量することを.包含する、上記（ 1 3) に記載の方法。 ( 1 5 ) 上記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、精液、唾液、または汗である、上記（ 1 1 ) 〜（ 1 4) のいずれかに記載の方法。

( 1 6 ) ウェスタンプロット法、ラジオィムノアッセィ（R I A)、酵素結合免疫吸着検定法（EL I SA)、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（F I A)、時間分解蛍光免疫測定法（TR F I A)、酵素免疫測定法（E I A)、発光免疫測定法（L I A)、電気化学発光免疫測定法（E C L I A)、ラテックス凝集法、免疫沈降アツセィ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテイン A免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（ 1 2) 〜（ 1 5) のいずれかに記載の方法。

( 1 7 ) 上記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 F ERM P - 2 0 4 9 9 または F E RM P— 2 0 49 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一に寄託されたハイプリドーマが産生する抗 PA P 2 a抗体である、上記（ 1 1 ) 〜（ 1 6) めいずれかに記載の方法。 ( 1 8 a) 上記癌が、 P AP 2 a陽性の癌である、上記（ 1 1 ) 〜（ 1 7 ) のいずれかに記載の方法。

( 1 8 b) 上記癌が、腺癌である、上記（ 1 8 a) に記載の方法。

( 1 8 c ) 上記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（ 1 8 a) または（ 1 8 b) に記載の方法。

本発明はまた、以下の検出および Zまたは定量方法を提供する。

( 1.9 ) PAP 2 aを細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および Zまたは定量する方法。

本発明はまた、以下に記載する抗 PAP 2 a抗体を含有する癌の治療薬を提供する。

(2 0 ) 抗 PAP 2 a抗体を含有する、癌の治療薬。

(2 1 ) 上記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 F ERM P - 2 0 49 9 または F E RM P— 2 049 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイプリドーマから産生される抗

PAP 2 a抗体である、上記（ 2 0) に記載の癌の治療薬。

(2 2 ) 上記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 F E RM P - 2 0 4 9 9 または F E RM P— 2 049 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイプリドーマが産生する抗 PA

P 2 a抗体の機能的断片である、上記（ 2 1 ) に記載の癌の治療薬。 Γ2 3 ) 上記抗 P AP 2 a抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウィルスベクター、および薬剤を担持した非ウィルスベクタ一のうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わ甘と化学的または遺伝子工学的に結合されている、上記（ 2 0 )

〜（2 2) のいずれかに記載の癌の治療薬。

( 24)上記抗 PAP 2 a抗体力ウィルスベクターに結合されている、上記（ 2 3 ) に記載の癌の治療薬。

(2 5 ) 上記ウィルスベクターが、 F Z 3 3ファイバー変異型アデノゥィルスである、上記（ 24) に記載の癌の治療薬。

(2 6 ) 上記非ウィルスベクタ一が、リボソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマ一、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウィルスェンべロープべクタ一、プラスミドベクタ一、およびプラスミド DNAネィキッドベクターからなる群から選択される、上記（2 3) に記載の癌の治療薬。

(2 7 ) 上記リボソームベクタ一が、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、フォスファチジルコリン（P C)、フォスファチジルセリン（P S)、フォスファチジルグリセロール（P G)、フォスファチジルエタノールアミン（P E)、ジメチルジォクタデシルアンモニゥムブロミド（DD AB)、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（D O P E)、ジォレオイルホスファチジルグリセロール（D O P G)、ジォレオイルホスファチジルセリン（DO.P S) からなる群から選択されるリボソーム、または該リボソームの 2種以上のいずれかの組み合わせからなるリボソームであ- る、上記（ 2 6) に記載の癌の治療薬

(2 8) 上記抗 P AP 2 a抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、 PAP 2 a発現細胞を溶解または成長を阻害する、上記（2 0) 〜

(2 3 ) のいずれかに記載の癌の治療薬。

(2 9) 上記抗 PAP 2 a抗体が、 P A P 2 a発現細胞をォプソニン化する、上記（2 0 ) 〜（2 3 ) のいずれかに記載の癌の治療薬。

C3 0 a) 上記癌が、 P AP 2 a陽性の癌である、上記（2 0 ) 〜（2 9) のいずれかに記載の癌の治療薬。

(3 0 b) 上記癌が、腺癌である、上記（3 0 a) に記載の癌の治療薬。 (3 0 c) 上記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（ 3 0 a) または（ 3 0 b) に記載の癌の治療薬。本発明はまた、以下に記載する抗 PAP 2 a抗体を用いた標的指向化方法を提供する。

(3 1 ) 抗 PAP 2 a抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。

(3 2) 上記抗 P A P 2 a抗体が、受託番号 F E RM P— 2 049 9 または F E RM P— 2 049 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイプリドーマから産生される抗 P AP 2 a抗体である、上記（ 3 1 ) に記載の方法。

( 3 3 ) 上記抗 P A P 2 a抗体が、受託番号 F E RM P - 2 0 49 9 または F E RM P— 2 049 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一に寄託されたハイプリドーマから産生されるモノクローナル抗体の機能的断片である、上記（ 3 2 ) に記載の方法。 (34) 上記薬剤が、上記抗 P AP 2 a抗体と化学的または遺伝子工学的に結合している、上記（ 3 1 ) 〜（ 3 3) のいずれかに記載の方法。 (3 5)上記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、. 上記（3 1 ) 〜（3 4) のいずれかに記載の方法。

(3 6) 上記治療遺伝子が、ウィルスベクタ一に担持されている、上記 (3 5) に記載の方法。

(3 7 ) 上記ウィルスベクターが、上記抗 PAP 2 a抗体が結合し得るファイバー変異型アデノウイルスである、上記（3 6) に記載の方法。 (3 8) 上記標的部位が、 PAP 2. aを特異的に発現している細胞、組織、または臓器である、上記（ 3 1 ) 〜（3 7 ) のいずれかに記載の方法。

C3 9) 上記標的部位が、膝癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞である、上記（3 1 ) 〜（ 3 8) のいずれかに記載の方法。

本発明はさらに、抗 PAP 2 a抗体を用いる以下の方法を提供する。

(40) 抗 P AP 2 a抗体を用いて P A P 2 a発現細胞をォプソニン化する方法。

(4 1 ) 抗 PAP 2 a抗体を用いて、免疫学的エフ；！：クタ一細胞を介在して、 PAP 2 a発現細胞を溶解またはその成長を阻害する方法。本発明はさらに、以下の組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体のスクリ一ニングまたは調製方法を提供する。

(42) 組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、.

上記組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイプリドーマのライブラリ一を作製する工程、および

上記ライブラリー由来の上記ハイプリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファイバ一変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、

を包含する、方法。

(42 a) 所望の抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗原に対するモノクローナル抗体を取得する工程、および上記モノクローナル抗体の存在下で、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスと上記抗原を発現する細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウィルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、

を包含ずる、方法。

( 4 2 b ) 上記抗原を発現する細胞が、該抗原を発現するベクターを卜ランスフエクトされた細胞である、上記（4 2 a ) に記載の方法。

( 4 3 ) 上記ライブラリ一由来の上記ハイプリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバ一変異型アデノウィルスの上記細胞への感染が、

( A ) 上記ライブラリー由来の上記ハイプリドーマ由来産物を、上記細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスを上記細胞に接触させるか、

( B ) 上記ライブラリー由来の上記ハイブリド一マ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、または

( C ) 上記ライブラリ一由来の上記ハイプリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、

によって行われる上記（4 2 ) に記載の方法。

( 4 3 a ) 上記モノクローナル抗体の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞への感染が、

( A ) 上記モノクローナル抗体を上記細胞と接触させた後、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスを上記細胞に接触させるか、

( B ) 上記モノクローナル抗体と、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、また.は (C) 上記モノクローナル抗体と、該抗体に結合するように改変したファイバ一変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、

によって行われる上記（4 2 a) に記載の方法。

(44) 上記感染効率を評価する工程が、レポ一夕一遺伝子発現測定ァッセィによって上記ファイバー変異型アデノウィルスの上記細胞に対する上記感染効率を評価することを含み、ここで上記ファイバ ^変異型ァデノウィルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポ一夕一遺伝子を発現する、上記（4 2) または（4 3 ) に記載の方法。 (44 a) 上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも 2倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（44) に記載の方法。

(44 b) 上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも 1 0倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（44) に記載の方法。

(44 c) 上記（44 a) または（44 b) のいずれかの方法により調製されたモノクローナル抗体。

(44 d) 抗 PAP 2 a抗体である、上記（44 c ) に記載の抗体。 (4 5 ) 上記ファイバー変異型アデノウイルスが、 F Z 3 3ファイバー変異型アデノウイルスウィルスである、上記（42 ) 〜（44) のいずれかに記載の方法。

(46 ) 上記レポ夕一遺伝子が、 1 a c Zまたは EGF Pである、上記（4 5) に記載の方法。

(47 ) 上記細胞が腫瘍細胞である、上記（4 2) 〜（46) のいずれかに記載の方法。

(47 a) 上記腫瘍細胞が、腺癌細胞である、上記（4 7 ) に記載の方法。

(47 b) 上記腫瘍細胞が、膝癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、ま.たは乳癌細胞である、上記（47) または ( 4 7 a) に記載の方法。

(4 7 c ) 上記組織特異的抗原が、腫瘍特異的抗原である、上記（4 2 ) 〜（4 6 ) のいずれかに記載の方法。

(4 7 d) 上記腫瘍特異的抗原が、 PAP 2 aである、上記（4 7 c ) に記載の方法。

( 4 7 e ) 上記細胞が CH〇細胞である、上記（4 2 a) または（4 2 b) に記載の方法。

(4 7 f ) 上記抗原が、 C EA、ヒ卜 CD 44、またはヒト C D 1 4 7 である、上記（4 2 a) または（4 2 b) に記載の方法。

本発明はさらに、以下のような自己抗体を用いた癌の診断方法を提供する。 '

(4 8 ) P AP 2 aに対する自己抗体を癌の診断マーカ一として使用する方法。

(4 9 ) 被験者由来の生体試料中の抗 PAP 2 a自己抗体を検出'および /または定量する工程を包含する、上記（4 8 ) に記載の方法。

( 5 0 a) 上記癌が、 PAP 2 a陽性の癌である、上記，（4 8 ) または (4 9 ) に記載の方法。

( 5 0 b) 上記癌が、腺癌である、上記（ 5 0 a) に記載の方法。

( 5 0 c ) 上記癌が、塍癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（ 5 0 a) または（ 5 0 b) に記載の方法。

本発明はさらに、以下の抗 P AP 2 a抗体をコードする DNA、該 D N Aを含有するべクタ一、該ベクタ一を宿主細胞に導入して得られる形質転換体、抗 P AP 2 a抗体の製造方法、およびそれにより製造される抗 PAP 2 a抗体を提供する。

( 5 1 ) 抗 P AP 2 a抗体をコードする DNA。

( 5 2 ) 抗 PAP 2 a抗体の H鎖 V領域（CD R 1〜 3を含む）または L鎖 V領域（CD R 1〜 3を含む）をコードする DNA。

( 5 3 ) 上記（ 5 1 ) または（ 5 2) に記載の DNAを含有するべクタ (54) 上記（5 3) に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

(5 5) 上記（54) に記載の形質転換体を適切な培地で培養する工程、および

該培養物から抗 PAP 2 a抗体を収集する工程

を包含する、抗 PAP 2 a抗体の製造方法。

("5 6 ) 上記（5 5) に記載の方法により製造される、抗 PAP 2 a抗体。

( 5 7 ) H鎖 V領域（CDR 1〜 3を含む）または L鎖 V領域（CDR 1〜 3を含む）を含有する、上記（ 5 6 ) の抗 P AP 2 a抗体。 . 本発明はまた、以下のような特徴を有する抗 P A P 2 a抗体を提供する。

(5 8) 特定の細胞に対するウィルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる、抗 PAP 2 a抗体。

(5 9) 抗 PAP 2 a抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含むヒト化抗 P AP 2 a抗体。

(6 0 ) ヒト型キメラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である、上記（ 5 9) に記載のヒト化抗 P AP 2 a抗体。

(6 1 ) 抗 PAP 2 a抗体と放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤とを化学的または遺伝子工学的に結合させた誘導体。

本発明の抗 PAP 2 a抗体は、 PAP 2 a陽性の癌（特に腺癌）の診断および治療において有用である。

本発明の抗 PAP 2 a抗体は、少なくとも腌癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、および乳癌を含む P A P 2 a陽性の癌の診断および治療において特に有用である。

本発明の抗 P A P 2 a抗体と、抗体の F c ドメインへの結合ドメインを有する組換えアデノウイルスベクタ一とを組み合わせて使用することによって、原発性腫瘍のみならず、転移腫瘍に対しても.アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の標的指向化が可能になる。本発明の組織（例えば、癌）特異的抗原に対する抗体の同定方法は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補とそれに対する抗体の組み合わせを系統的に探索するために有用である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明において代表的な例とし; τ使用される組換えアデノウィルスベクター、 A d v— F Z 3 3アデノウイルスを用いた標的化遺伝子導入の模式図である。

図 2は、本発明において代表的な例として使用される組換えアデノゥィルスベクター、 A d V _ F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウイルスのファイバ一部分の構造の模式図である。

図 3 _ 1は、 S 1 1抗体の各種細胞株との反応を示す FAC S解析の結果を示す図である。

図 3— 2は、 T 1 3抗体の各種細胞との反応を示す F AC S解析の結果を示す図である。

図 3— 3は、 S 1 1抗体の各種細胞株との反応を示す F AC S解析の結果を示す図である。

図 3— 4は、 T 1 3抗体の各種細胞株との反応を示す FAC S解析の結果を示す図である。

図 4は、免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。図 5は、 S 1 1抗体の認識する抗原についての質量分析の結果を示す図である。

図 6は、質量分析の結果の確認するためのウエスタンプロットを示す電気泳動写真である。

図 7— 1は、 PAP 2 a (L P P 1 )、 P A P 2 b (L P P 3 )、ぉょび PAP 2 c (L P P 2 ) をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、 S 1 1抗体が PAPのどのアイソフオームに反応するか否かを、フローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。図 7— 2は、 PAP 2 a ,(L P P l )、 P AP 2 b (L P P 3)、およ- び P A P 2 c (L P P 2 ) をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、 T 1 3抗体が P A Pのどのアイソフオームに反応するか否かを、フローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。図 8は、 S I 1抗体の培養細胞株との反応性を示す免疫組織染色の写真である。

図 9は、 S 1 1抗体の組織染色のための固定法の検討結果を示す免疫紅織染色の写真である。

図 1 0は、 H a s細胞を A x 3 C AE G F P - F Z 3 3を用いて感染した場合の、 H a s細胞に対する A X 3 C AE G F P - F Z 3 3の感染効率を、化学発光 i6 — G a 1 レポ一夕一遺伝子アツセィによって評価した結果を示すグラフである。

図 1 1 — 1 Aは、 H a s細胞に対する A x 3 C A Z 3 — F Z 3 3の感染効率を、予め抗体を用いて処理していない場合（左から 2列目）、 I g G 1で処理した場合（左から 3列目）、および S 1 1を用いて処理した場合（左から 4列目）について、それぞれ 3 0 0 v i r a l p a r t i c l e s (v p ) / e e l 1、および l O O O v p Z c e l 1のべクタ —用量で A X 3 C AE G F P— F Z 3 3を用いて H a s細胞に感染させ、 E G F Pを発現させた場合の、 E G F P蛍光レポーター遺伝子発現のフローサイトメトリ一解析の結果を示すグラフである。

図 1 1 一 1 Bは、膝癌細胞である M i a p a c a 2に対するアデノゥィルスべクタ一の感染効率を、図 1 1 一 1 Aの場合と同様に、 E G F P を発現する A X 3 C AE G F P— F Z 3 3を用いてフロ一サイトメトリ一で評価した結果を示すグラフである。

図 1 1 一 1 Cは、 A x 3 CAE G F P _ F Z 3 3のヒト前立腺癌細胞 2 2 R V 1に対する感染効率を、 S 1 1で細胞を前処理した場合と、 I g G 1で細胞を前処理した場合とで比較して示す、フローサイトメトリ一実験から得られたグラフである。

図 1 1 — 1 Dは、別のヒト前立腺癌細胞である P C 3に対する A X 3 CAE G F P— F Z 3 3の感染を、該細胞をコントロールマウス I g G- 1で前処理した場合と S 1 1で前処理した場合とで比較した場合の、フローサイトメトリー実験から得られた結果を示すグラフである。

図 1 1一 2 Aは、 H a s細胞に対する F Z 3 3アデノウィルスの感染効率に対する T 1 3の効果を、 E G F Pを発現する A X 3 C AE G F P 一 F Z 3 3を用いて、ベクター用量 3 0 0 v pZ e 1 1および 1 0 0 0 V p / c e 1 1で、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示す'グラフである。

図 1 1— 2 Bは、膝癌細胞である M i a p a c a 2に対する F Z 3 3 アデノウイルスの感染効率に対する T 1 3の効果を、 E GF Pを発現する Ax 3 C AE G F P— F Z 3 3を用いて、ベクター用量 3 0 0 v p/ c e 1 1および l O O O v pZc e 1 1で、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。

図 1 2は、 S 1 1で前処理した場合の各種細胞に対する A X 3 CAE GF P— F Z 3 3の感染効率を示す実験のうち、 H a s細胞及び P D F の混合培養についての結果を解析した結果を示す免疫蛍光組織染色の写真である。

図 1 3— 1は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルス作製のためのプラスミドベクター pAx 3の模式図である。図 1 3— 2は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルス作製のためのプラスミドベクタ一 pAx 3 _ F Z-3 3の模式図である。

図 1 3— 3は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルスべクタ一 Ad v— F d Zの概念図である。

図 1 3— 4は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルスベクター Ad v— F d Zのファイバ一部分の構造の模式図である。

図 1 3— 5は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルス作製のためのプラスミドベクター p Ax 3 i— F d Zの模式図である。図 1 4— 1は、ヒト膝癌の臨床例 A、 Bの 2症例の手術標本の S 1 1 抗体による免疫組織染色を示す写真である。上のカラムは臈癌組織を含む部分、下のカラムは同一のプレパラート上の膝癌組織周辺の非癌部の顕微鏡写真を示す。

図 1 4一 2は、ヒト膝癌の臨床例 C症例の手術標本の S 1 1抗体による免疫組織染色を示す写真である。上のカラムは膝癌組織を含む部分、下の力ラム'は同一のプレパラート上の膝癌組織周辺の非癌部の顕微鏡写真を示す。 .

図 1 5は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者 0 3— 1 0 1 6— 9 ) を S 1 1抗体による免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。図 1 6は、前立腺癌の症例からの手術標本（図 1 5と同じ患者 0 3—

1 0 1 6一 9 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 1 7は、前立腺癌の症例からの S 1 1抗体による手術標本（患者 0 3 - 2 2 1 5一 1 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。図 1 8は、前立腺癌の症例からの S 1 1抗体による手術標本（患者 0

3 - 2 34 2一 1 3) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。図 1 9は、前立腺癌の症例からの S 1 1抗体による手術標本（患者 0

3 - 2 7 6 7 - 1 4) の染色である。

図 2 0は、前立腺癌の症例からの手術標本の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。向かって右半分の前立腺癌組織は P AP 2 a陽性であるが、左半分の正常組織と浸潤炎症細胞は P A P 2 a陰性である。

図 2 1は、甲状腺癌の症例からの手術標本（甲状腺の濾胞状腺癌（F o 1 1 i c u 1 a r a d e n o c a r c i n oma) の患者ァレイ A 7 ) 由来のサンプルの S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 2 2は、図 2 1とは別の甲状腺癌の症例からの手術標本（濾胞状腺癌（F o l 1 i. c u 1 a r · a d e n o c a r c i n oma)の患者（ァレイ B l l ) 由来のサンプルの S l l抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 2 3は、卵巣癌の症例からの手術標本（O V C a 患者 0 3— 24

1一 5 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 2 4は、卵巣癌の別の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3— 8"3 0 - 1 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。，図 2 5は、卵巣癌の別の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3— 1 2 5 2 - 1 3 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す i 微鏡写真である。 .

図 2 6は、卵巣癌の別の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3—

2 8 8 1 - 4) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 2 7は、卵巣癌の別の症例からの手術標本（〇 V C a 患者 0 3—

3 6 5 5 - 9) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 2 8は、図 2 7の標本と同じプレパラート上の別の視野の写真である。

図 2 9は、ヒト肺癌の症例,.（アレイ B 3 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 0は、各種ヒ,ト肺癌細胞の S 1 1抗体による F AC S解析の結果を示す図である。

図 3 1は、ヒト正常リンパ節の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 2は、ヒト正常の脾臓の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 3は、ヒト正常の骨髄の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。図 34は、ヒト正常肝臓の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 5は、正常ヒト大腸粘膜の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 ·

図 3 6は、ヒト正常の膀胱の S 1 1抗体による免疫組織染色の結'果を示す顕微鏡写真である。

'図 3 7は、正常ヒト甲状腺の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 8は、正常ヒト大動脈の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 3 9は、ヒト正常の心臓の S 1 1抗体ヒよる免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 4 0は、ヒト正常の骨格筋の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。

図 4 1は、抗 P AP 2 a抗体と S a p o r i n結合 2次抗体による細胞増殖阻害の実験結果を示すグラフである。

図 4 2 _ Aは、 8 A 9抗体の抗原決定における免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。

図 42— Bは、 8 A 9抗体の抗原決定における質量分析の結果を示す図である。

図 4 2— Cは、 8 A 9抗体の抗原決定における F AC S解析の結果を示す図である。

図 4 3は、本発明の A d v— F Z 3 3スクリ一二ング法により得た 8 A 9抗体と他の数種の抗ヒ卜 C D 44抗体との間での A X C A Z 3— Z 3 3を用いた遺伝子導入発現量の比較を示すグラフである。

図 44一 Aは、 1 0 D 8抗体の抗原決定における免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。

図 44一 Bは、 1 0 D 8抗体の抗原決定における質量分析の結果を示す図である。図 44一 Cは、 1 0 D 8抗体および 8 D 1 2抗体の抗原決定における F AC S解析の結果を示す図である。

図 4 5は、本発明の Ad V— F Z 3 3スクリーニング法により得た 1 0 D 8抗体および 8 D 1 2抗体と他の数種の抗ヒト CD 1 4 7抗体との間での Ax CAZ 3— Z 3 3を用いた l a c Z遺伝子発現量の比較を示すグラフである。

'—図 46は、 FAC S c a l i b e rの測定結果を示すグラフである。図 4 7は、 C EAを発現するように遺伝子導入した CHO細胞での、種々の抗 C E A抗体と Ad V - F Z 3 3 l a c Zアデノウイルスとを用いて遺伝子導入をおこなった時のベータガラクトシダーゼ遺伝子発現量（/3— g a 1の発現量）の比較を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明により、 F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウィルスを用いて、標的細胞への遺伝子導入の効率を高めるモノクローナル抗体が同定された。さらに、本発明により、上記モノクローナル抗体に対する抗原が、 PAP 2 aであることが確認された。

さらに本発明者らは、上記モノクローナル抗体を併用して、 F Z 3 3 ファイバー変異型アデノウィルスを用いた種々の癌細胞への遺伝子導入を評価し，少なくとも膝癌細胞および前立腺癌細胞において遺伝子導入効率が顕著に高まることを見出した。したがって、本発明は、 PAP 2 aをマーカーとして利用するこれらの癌の診断、および/または P A P 2 aを標的としたこれらの癌の標的化療法を提供する。

癌特異的抗原の同定および該抗原に特異的に結合し得る抗体を同定することにより、癌のイメージングおよびノまたは処置のために有用なシステムが提供される。

1. 抗 P A P 2 a抗体

本発明は、 PAP 2 aに.対する抗体を提供する。本明細書中、「PAP 2 a (p h o s p h a t i d i c a c i d ρ h o s p h a t a s e t y p e 2 A i s o f o rm 1 )」、「PA P 2 aタンパク質」、または「PAP 2 a抗原」とは、 NC B I夕シパク質配列デ一夕ベースにァクセッション番号 N P— 0 0 3 7 0 2で登録されているアミノ酸配列（配列番号 1 ) で特定される 2 8 4アミノ酸残基のタンパク質、ならびに上記タンパク質の断片、またはこれらの誘導体を'意味する。ここで、「誘導体」とは、 PAP 2 aタンパク質またはその断片のアミノ酸配列において 1または複数個（例えば、数個（例、 6個））のァミノ m残基の変異、置換、欠失および 7または付加を含み、実質的に PAP 2 aタンパ質と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリぺプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、 PAP 2 aの発現によつて特徴付けられる疾患の診断および/または治療に使用され得る程度に、抗 P AP 2 a抗体によって特異的に認識されるような特異性の程度を意味する。誘導体の典型的な例には、 PAP 2 a多型、スプライシングなどによる配列変化がある。ここで、「断片」の長さとしては、抗 P AP 2 a抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はない力 S、好ましくは 6アミノ酸以上、より好ましくは 8アミノ酸以上、さらに好ましくは 1 0アミノ酸以上である。また、これらの断片は、 P AP 2 aタンパク質の任意の部分であり得るが、 P AP 2 aタンパク質のェピトープに対応するか、ェピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。

本明細書中、「抗 PAP 2 a抗体」または「P AP 2 aに対する抗体」は、 PAP 2 aに特異的に'結合する抗体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、 F a b, F a b，、 F (a b，） ₂、単鎖抗体（ s c F v)、ジスルフィド安定化 V領域断片（d s F V；)、もしくは CD Rを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、 CDR移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。本発明に使用する抗体は、以下- に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイプリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。

本明細書中、抗体があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のァミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（K_a) が少なくとも 1 0 M—¹, 好ましくは、少なくとも 1 08 M— ¹ , より好ましくは、 1 0⁹M- さらにより好ましくは、 Ι Ο ^Μ— Ι Ο ^{1 1}^—¹ 1 0¹2 Μ— ¹またはそれより高い、例えば、最高で 1 0^{1 3}Μ ¹またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。

本発明の抗 Ρ ΑΡ 2 a抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得るが、モノクローナル抗体であることが好ましい。 P AP 2 aに対するモノクローナル抗体の好適な例としては、受託番号 F ERM P— 2 04 9 9および F E RM P— 2 0 4 9 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一（茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1中央第 6 ) に 2 0 0 5年 4月 8日付で寄託されたハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。

したがって、本発明はまた、 P A P 2 aに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。特に、受託番号 F E RM P - 2 04 9 9ぉょびF E RM P— 2 04 9 8として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに 2 0 0 5年 4月 8 日付で寄託されている八イブリドーマを提供する。

以下、本発明の抗 PAP 2 a抗体の作製において利用し得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片等の一般的な作製方法について説明する。 (モノクロナール抗体の作製方法）

モノクローナル抗体産生細胞の作製

P AP 2 aに対するモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。 PAP 2 aを、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよレ^投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、計 2〜 1 0回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、コーラ一とミルスタインの方法（K o h 1 e r a n d M i l s t e i n ( 1 9 7 5 ) N a t u r e 2 5 6 : 4 9 5 ) に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール (P E G) やセンダイウィルスなどが挙げられる力好ましくは P E Gが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2Z0などが挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは、 P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0) 力 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、約 2 0〜 40 ：、好ましくは約 3 0〜 3 7 °Cで約 1〜： 1 0分間ィンキュペートすることに.より効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使用し得るが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に、放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合じたモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリド一マ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合し-たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる力通常は H A T (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、 1〜 2 0 %、妤ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜： 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培 -地（和光純薬工業（株））またはハイプリドーマ培養用無血清培地（S F M— 1 0 1、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常 2 0〜 4 0 °C、好ましくは約 3 7 °C ある。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は、通常 5 %炭酸ガス下で行うことができる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

モノクロナール抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、 D E A E ) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得.る特異的精製法〕に従って行うことができる _έ (ポリクロ一ナル抗体の作製方法）

P A P 2 aに対するポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質の抗原）と担体タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクロ一ナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と担体タンパク質との複合体に関して、担体タンパク質の種類および担体とハプテンとの混合比は、担体に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、任意のものを任意の比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミン、ゥシサイログロブリン、キ一ホール ' リンペット ·へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0 . 1〜 2 0、好ましくは約 1〜 5の割合でカプリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンと担体の力プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、ダルタールアルデヒドやカルポジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜 1 0回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクロ —ナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができる。

(抗体断片または誘導体の製造方法） F a bは、 I g Gをタンパク質分解酵素パパィンで処理して得られる断片のうち（H鎖の 2 24番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N 末端側約半分と L鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明の F a bは、 PAP 2 a に特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパィンで処理して得ることができる。

'F ( a b ') ₂は、 I g Gをタンパ.ク質ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の' 2 34番目のアミノ酸残基で切断される）、 F a bがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約 1 0万の抗原結合活性を有する抗体.断片である。本発明の F a b，は、 PAP 2 aに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素ぺプシンで処理して得ることができる。

F a b ' は、上記 F ( a b ') ₂のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明の F a b ' は、 P AP 2 aに特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることができる。

上記 F a b、 F ( a b ')、または F a b ' はまた、全長抗 PAP 2 a 抗体の F a b、 F (a b ')、または F a b ' 断片をコードする DNAを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによつても製造することができる（例えば、 C o M. S . e t a 1. , J . I mm u n o 1. ( 1 9 9 4) 1 5 2 , 2 9 6 8 - 2 9 7 6 ； B e t t e r M. & H o r w i t z A. H. M e t h o d s i n E n z ymo l o g y ( 1 9 8 9 ) 1 7 8 , 4 7 6 - 49 6 ； P l u e c k t h u n， A. & S k e r r a A. M e t h o d s i n E n z ymo l o g y ( 1 9 8 9 ) 1 7 8， 49 7 - 5 1 5 ； L a m o y i E.， M e t h o d s i n E n z ymo l o g y( 1 9 8 6 ) 1 2 1 , 6 5 2 - 6 6 3 ; R o u s s e a u x J . e t a 1 . , M e t h o d s i n E n-z ymo 1 o g y ( 1 9 8 6 ) 1 2 1 , 6 6· 3 - 6 6 9 ; B i r d R. E. e t a l ., T I BTE CH ( 1 9 9 1 ) 9 , 1 3 2 - 1 3 7等を参照）。

一本鎖抗体（以下、 s c F Vと略すこともぁる）は、一本の重鎖可変領域 (h e a v y c h a i n v a r i a b l e r e g i o n : 以下、 VHと略す）と一本の軽鎖可変領域 .（ l i g h t c h a i n v a r i a b 1 e r e g i o n : 以下、 VLと略す）とを適当なぺプチドリンガー（以下、 Pと略す）を用いて連結した、 VH— P— VLまたは VL— P— VHポリぺプチドを示す（例えば、 H u s t o n, J . S . e t a 1. , P r o c . N a t 1. A c a d. S c i . U. S . A. ( 1 9 8 8 ) 8 5 , 5 8 7 9 - 5 8 8 3を参照）。本発明の一本鎖抗体は、 P A P 2 aに特異的に結合する抗体の VHおよび VLをコードする c DN Aを取得し、一本鎖抗体をコードする DNAを構築し、これを原核生物用発現べクタ一または真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現べクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。

ジスルフィド安定化 V領域断片（以下、 d s F vとも略すこともある）は、 VHおよび VL中のそれぞれ 1.アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリペプチドをシスティン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システィン残基に置換するアミノ酸残基は R e i t e r らにより示された方法（P r o t e i n E n g i n e e r i n g, 7 , 6 9 7 ( 1 9 9 4)) に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるジスルフィド安定化 V 領域断片に含まれる VHおよび VLは、 P AP 2 aに特異的に結合する抗体、例えば、ヒ卜化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。本発明のジスルフイド安定化 V領域断片は、 PAP 2 aに特異的に結合する抗体の VHおよび VLをコ一ドする c DNAを取得し、ジスルフィド安定化 V領域断片をコードする DNAを構築し、これを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現べク夕一を原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることにより製造することができる。相補性決定領域（C omp l eme n t a r y D e t e rm i n i n g R e i o n : 以下、 C D Rと略す）を含むぺプチドは、 H鎖または L鎖 CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成される。複数の CDRは、直接または適当なペプチドリンカ一を介して結合させることができる。

本明の CDRを含むペプチドは、 PAP 2 aに特異的に結合する抗体—の V Hおよび VLをコードする c DNAを取得した後、 CDRをコ一ドする DN Aを構築し、この DN Aを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。また、 C D Rを含むぺプチドは、 Fmo c法（フルォレニルメチルォキシカルポニル法）、， t B o c法（ t一ブチルォキシカルポニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。 (ヒト化抗体）

ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体あるいはヒト型 CD R移植抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、 V領域と表記する）、がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、 C領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Mo r r i s o n S . L . e t a 1. , P r o c N a t l A c a d S c i USA. 8 1 ( 2 1 ), 6 8 5 1 - 6 8 5 5 , 1 9 84)、ヒ卜型 C D R移植抗体とは、ヒ卜以外の動物の抗体の V領域中の C D R のアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（ J o n e s P. T. e t a 1. , N a t u r e, 3 2 1 (6 0 6 9 ), 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 )。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、 Η· 鎖） C領域としてァ 1サブクラスを使用すれば、血中で安定で、かつ抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（C o M. S. e t a 1. , C n c e r R e s e a r c h , 5 6 ( 5)， 1 1 1 8— 1 1 2 5， 1 9 9 6)。ェフエクタ一活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合に有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、ェク Xク夕ー活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体の H鎖 C領域としてァ 4サブクラスを使用すれば、ァ 4サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（B r u g g e m a n n M e t a' l .， J o u r n a l o f E p e r i me n t a l Me d i c i n e , 1 6 6 (5), 1 3 5 1— 1 3 6 1， 1 9 8 7 ; B i n d o n C. I . e t a 1. , J o u r n a l o.f E x p e r i me n t a l Me d i c i n e , 1 6 8 ( 1 ), 1 2 7 - 1 4 2 ,

1 9 8 8 )、副作用を回避でき、しかもマウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（ S t e p h e n s S . e t a 1. , I mm u n o 1 o g y , 8 5 (4), 6 6 8 - 6 7 4, 1 9 9 5)。さらに、蛋白質工学、遺伝子工学的手法を用いてヒト化抗体を含めた抗体から作製した F a b、 F a b，、 F ( a b ') ₂、 s c F v (B i r d R . E . e t a 1. , S c i e n c e , 2 42 (4 8 7 7), 42 3 - 4 2 6 , 1 9 8 8 ), d s F v (We b b e r K. O. e t a 1. , M o 1 e c u 1 a r I mm u n o 1 o g y, 3 2 (4), 24 9 - 2 5 8 , 1 9 9 5 )、 CDRを含むペプチド（M o n f a r d i n i C e t a 1. , J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h em i s t r y, 2 7 1 ( 6), 2 9 6 6 - 2 9 7 1 , 1 9 9 6) などのより分子量の小さい抗体断片を使用することもできる。これらの抗体断片は、完 '全な抗体分子に比べ分子量が小さいために、標的組織への移行性に優れており、有利である（C a n c e r R e s e a r c h, 5 2 , 340

2 - 3 4 0 8 , 1 9 9 2)。

本発明の PAP 2 aに特異的に結合する抗体（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片）に、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体は、 P A P 2 aに特異的に反応する抗体および抗体断片の H鎖或いは L 鎖の N末端側或いは C末端側、該抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには該抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、治療タンパク質あるいは低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる（例えば、抗体ェ学入門、金光修著、地人書館、 1 9 9 4を参照）。 2 . 診断薬および治療薬

本発明は、別の態様において、抗 P A P 2 a抗体を含有する癌の診断薬を提供する。本発明はまた、抗 P A P 2 a抗体を含有する癌の治療薬を提供する。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。

本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明の抗 P A P 2 a抗体を含有する治療薬または診断薬は、 P A P 2 aを高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（好ましくは、腺癌、特に、前立腺癌、肺癌、膝癌、卵巣癌、甲状腺癌、または乳癌を含む癌）の診断または治療に適している。

癌の診断または治療に使用するための本発明の抗 P A P 2 a抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。

また、本発明の抗 P A P 2 a抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ a g e n t ) であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、あるいは標的への遺伝子導入のためのウィルスベクタ一もしくは非ウィルスベクタ.一）と化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。

i n V i V oでの診断に使用するための抗体調製物の調製および使 M方法ば当該分野でよく知られている。例えば、インジウム一 1 1 1で標識した抗体とキレート剤との結合体（抗体ーキレート剤）が、癌胎児性抗原を発現している腫瘍のラジオィムノシンチグラフィ一によるィメ一ジングでの使用に関して記述されている（S ume r d o n e t a 1. N u c 1. M e d. B i o l . 1 9 9 0 1 7 : 24 7 一 2 54)。特にこれらの抗体ーキレー卜剤は、再発性の結腸直腸癌を有する疑いのある患者において腫瘍を検出するのに用いられている（G r i f f i n e t a 1 - J . C l i n. On e . 1 9 9 1 9 ： 6 3 1 - 6 40 )。磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性ィオンを有する抗体もまた記載されている（L a u f f e r， R. B. M a g n e t i c R e s o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 2 2 : 3 3 9— 3 42)。

PAP 2 aに対する抗体も同様に用いることができる。すなわち、 P AP 2 aに特異的に結合する標識された抗体を、例えば、癌を有する疑いのある患者に、その患者の疾患の状態の診断または病期診断等の目的で注射することができる。用いる標識は、用いるイメージングの様式に応じて選択し得る。例えば、インジウム一 1 1 1 ^{1 1} I n)、テクネチヴム一 9 9m (^99mT c ) またはヨウ素一 1 3 1 (^{1 31} 1 ) などの放射性標識は、平面スキャンまたはシングルフオトン断層撮影に用いることができる。フッ素一 1 8 (^{1 8} F) などのポジトロン放出標識をポジ卜口ン断層撮影に用いることができる。ガドリニウム（ I I I ) またはマンガン（ I I ) などの常磁性イオンを磁気共鳴イメージングに用いることができる。標識の局在性を.検査することにより、癌の播種の判定をすることができる。また、器官または組織内の標識の量により、その器官または組織における癌の存在または欠如を決定することができる。

したがって、好ましくは、本発明の診断薬または治療薬中の抗 PAP 2 a抗体は、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したウィルスベクター等と化学的にまたは遺伝子工学的に結合されている。

'「放射性同位元素」の例としては、フッ素一 1 8、ヨウ素— 1 2 5 (' ²⁵ I )、およびヨウ素一 1 3 1などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やべプチドに標識して、放射性診断薬あるいは放射性治療薬として広く利用し得る。例えば、 ¹²⁵ Iまたは^{1 31} Iでのョ一ド化は、クロラミン T法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。

さらに、診断用としてはテクネチウム一 9 9 m、インジウム一 1 1 1 およびガリウム一 6 7 ( ⁶⁷ G a) など、また治療用としてはィットリウムー 9 0 (⁹。Y)、レニウム一 1 8 6 (¹⁸⁶ R e ) またはレニウム一 1 8 8 ( ¹⁸⁸ R e) などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、 EDTA、 DTPA、ジァミノジチォ化合物、サイクラム、および D O T Aなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。

「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトイン夕一ロイキン 2、ヒト顆粒球 —マク Oファージ一コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー剌激因子、ヒトイン夕一ロイキン 1 2等が挙げられる。また、癌細胞を直接殺傷するため、リシンゃジフテリァ毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードする c DN Aに治療タンパク質をコードする c DNAを連結させ、融合抗体をコ一.ドする DNAを構築し、この DNAを原核生- 物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発,現させ、融合抗体を製造することができる。

「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン ·マスタード、サィ 'クロファスフアミドなどのァルキル化剤、 5—フルォロウラシル、メソトレキセ一トなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン C , ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アル力ロイド、夕モキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年癌と化学療法社））、またはハイド口コーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、ァスピリン、.インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チォマレ一ト、ベニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスフアミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフエ二ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法昭和 5 7年医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのァミノ基と抗体の力ルポキシル基を結合させる方法等があげられる。

「ウィルスベクター」の例としては、本発明の抗 P A P 2 a抗体に結合し得るように改変されたウィルスベクター（例えば、 F Z 3 3フアイバー変異型アデノウイルス）が使用し得る。このようなウィルスベクタ —には、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連攀伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、癌）において、例えば、癌細胞のアポト一シスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗 P A P 2 a抗体に結合するウィルスベクターは、抗 Ρ Α Ρ 2 · a抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗 P AP 2 a抗体が認識する抗原（すなわち、 P AP 2 a) が存在する部位に指向されることができる。 3. 組換えアデノウイルスの作製方法

本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルスベクタ一は、当該分野で周知の分子生物学的手法によって作製することができる。例えば、一般的な分子生物学的手法については、 S amb r o o k , J . e t a l . : Mo l e c u l a r C l o n i n g. A' l a bひ r a t o r y M a n u a l , 2 n d E d.， C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ; A u s b e l . F e t a l . : C u r r e n t P r o t o c o l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y, G r e e n P u b l i s h i n g A s s o c i a t e s a n d W i l e y— I n t e r s c i e n c e , 1 9 8 7 ；田村隆明編、改訂第 2版遺伝子工学実験ノ —ト上 '下羊土社 2 0 0 1などを参照することができる。また、組換えアデノウイルスの作製のためには、ウィルスゲノムの両端に共有結合した末端夕ンパク質を保持したままのゲノム一末端タンパク質複合体（以下 DNA— T P Cと略す）を用いる方法、例えば、 Y o s h i d aらの方法（ Y o s h i d aら、 H u m. G e n e T h e r . 9 ： 2 5 0 3 - 1 5 1 5 ( 1 9 9 8 )) を利用することができる。これらの手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的な作製方法においては、まず、 p Ax Cw、 p A X C Aw t等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する。一方、ウィルスから DNA— T P Cを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理した DN A— T P Cを適切な宿主細胞、例えば 2 9 3細胞にコトランスフエクションする。その後適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウィルス粒子として放出された組換えアデノウィルス粒子を回収することができる。本発明において典型的に使用される組換えアデノウィルス粒子は、前述のように組換えアデノウィルス発現用核酸分子を適切な培養細胞にトランスフエクシヨンし、その細胞を更に培養し、培養上清を回収することによって多量に調製することができる。必要であれば、回収したアデノウィルスを更に適切な宿主細胞で必要な回数だけ継代することによつて更に大量のアデノウィルベクター粒子を調製することができる。アデノ-ウィルスの増殖および回収のために適した細胞、トランスフエクションの条件、トランスフエクトした細胞の培養条件および培地等は当業者に良ぐ知られたものである。例えば、通常よく使用される E 1 A、 E l B領域に欠損のあるアデノウイルスを増殖させる場合には、恒常的に E 1 A、 E 1 Bを発現している 2 9 3細胞等を使用すればよい。更に、必要に応じて、塩化セシウムの濃度勾配遠心法を用いて濃縮精製することもできる。濃縮することにより、 1 0 9〜 1 0 1 1粒子/ m 1程度の高力価のウィルス液を得ることができる。

本発明において典型的に使用される組換えアデノウィルス発現用核酸分子は、外来遺伝子を組み込むことができ、組み込まれた外来遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。本発明において使用される組換えアデノウィルス発現用核酸分子に組み込む外来遺伝子としては、直接または間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節.遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純へルぺスウィルス ·チミジンキナーゼ（H S V t k) とガンシシク口ビルの組み合わせ（H S V t k/G C V)、シトシンデァミナーゼと 5 一フルォロシトシンの組み合わせ（CDZ5 F C)、ゥラシルフォスフォリポシルトランスフェラ一ゼ（UP) と 5—フルォロウラシル（ 5 FU) の組み合わせ（UP/ 5 FU)、 HSV t kと UPを組み合わせた系（U P TK/5 FU + GC V) が挙げられる。このような外来遺伝子は、般にはアデノウイルスゲノムの E 1領域および Zまたは E 3領域と置換され、またはこの領域に挿入される。

ファイバー変異型組み換えアデノウィルスの作製方法については、報告されている例を参照し得る（Y o s h i d a e t a 1. , Hum. G e n e T h e r . 1 9 9 8 ; N a k amu r a e t a 1. , Hum. G e n e T h e r . 2 0 0 2 ; N a k amu r a e t一 1 '., J . V i r o l . 2 0 0 3など）。

本発明において好適に用いられるベクターの非限定的な例としては、抗体の F c ドメインに結合するように改変された F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウイルス、アデノウイルスに抗体を任意の方法で結合（共有結合、ピオチン一アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリェチレンダリコールでウィルスを包む、など）させた修飾型のアデノウィルスなどが挙げられる。 F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウイルスは、図 2に模式的にその概要を示すように、抗体の F c ドメインに結合するプ口ティン Aの Z 3 3モチーフ（FNMQQQRR F YEALHD PNL NE E QRNAK I K S I RDD (配列番号 2 1 )) をノブ（Kn o b) の H Iループ部位（n g t q e t g l i k i d a s d t t ρ s a)に含む F Z 3 3フアイバー変異型 A d 5ウィルスをベースとして、 1 a c Z、 E G F Pなどのレポ一ター遺伝子が組み込まれたアデノウィルスである。なお、これは非限定的な例示であり、他のウィルス（例えば、レトロウイルス、レンチウィルス、単純へルぺスウィルス、シンドビスウィル、麻疹ウィルス、センダイウィルス、レオウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、コクサツキ一ウィルス、アデノウイルス随伴ウィルス、など各種ウィルスの外被（エンベロープ）やキヤプシドに修飾を施した各種変異型ウィルス、または前記各種ウィルスに抗体を任意の方法で結合（例えば、共有結合、ピオチン一アビジンによ ¾架橋、抗体を化学結合させたポリエチレンダリコールでウィルスを包む、など）させた修飾型のウィルスもまた、本発明の抗 PAP 2 a抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。あるいは、ウィルスベクタ一に- 限らず、リポソ一ムベクター、センダイウィルスエンベロープベクター、プラスミド DNAネイキッド（n a k e d) ベクターなどの非ウィルスベクタ一もまた、抗体を任意の方法で結合（F Z 3 3などの抗体結合分子を結合させる方法、化学的共有結合、ピオチン一アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレンダリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウィルスベクタ一とすることによって、本発明の抗 P A"P 2 a抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。

本発明の抗 P A P 2 a抗体に結合し得るように改変されたウィルスべクタ一を使用する利点として、以下のような点が挙げられる。通常、ゥィルスベクターを使用する場合、そのウィルスが本来認識する細胞表面のレセプター（例えば、アデノウイルスの場合の CAR、またはシンドビスウィルスの場合の高親和性ラミニンレセプタ一（h i g h— a f f i n i t y 1 a m i n i n r e c e p t o r : LAMR)、ホリ'ォゥィルスの場合の CD 1 5 5、コクサツキ一ウィルス A 2 1の場合の I C AMZDAF、麻疹ウィルスの場合の S L AMZC D 4 6など）を細胞表面に発現している細胞に対して標的化される。したがって、使用するウィルスに特異的な細胞表面レセプ夕一を発現していないか、発現の程度が低い細胞に対しては、通常、ウィルスベクターを用いた遺伝子の効果的な標的指向化導入は困難である。しかしながら、本発明の抗 PAP 2 a抗体と結合し得るかまたは結合するように改変されたウィルスべクターを用いれば、そのウィルスの本来の細胞表面レセプ夕一を発現していない細胞であっても、その細胞が P A P 2 aを発現する細胞であれば、その細胞に対してウィルスベクターを用いた治療遺伝子の標的指向化導入および発現が容易に可能となる。

なお、本発明において使用される組換えアデノウイルスの作製については、さらに下記文献を参照することができる。

Y o s h i d a Y. , S a d a t a A., Z h a n g W. , S h i n o u r a N. a n d H a m a d a H . G e n e r a t i o n o f f i b e-r— mu t a n t r e c omb i n a n t- a d e n o v i r u s e s f o r g e n e t h e r a p y o f m a 1 i g n a n t g l i oma. Hum a n G e n e T h e r a P y ， 9 ( 1 7 ) : 2 5 0 3 - 2 5 1 5 , 〕 L 9 9 8.

N a k a m u r a T . , S a t o K. a n d H am a d a

H. E f f e c t i v e G e n e T r a n s f e r t o H u m a n M e 1 a n o m a s v i a I n t e g r i n - T a r g e一 t e d A d e n o v i r a 1 V e c t o r s . Hum. G e n e T h e r • , 1 3 ( 5) : 6 1 3 - 6 2 6， 2 0 0 2

N a k a m u r a T . , S t o K. a n d H m a d a

H. R e d u c t i o n o f n a t u r 1 a d e n o v i r u s t r o p i s m t o t h e 1 i v e r b y b o t h a b 1 a t i o n o f f i b e r— C o s a c k i e v i r u s a n d a d e n o v i r u s r e c e p t o r i n t e r a c t i o n a n d u s e o f r e p 1 a c e a b 1 e s h o r t f i b e r J . V i r o l ., 7 7 (4) : 2 5 1 2 - 2 5 2

1， 2 0 0 3

U c h i d a H , T a n a k a T, S a s a k i K K a t o K , D e h a r i H , I t ： o Y, K o b u n e ,

M i y a g i s h i M, T a i r a K, T a h a r a H , H a m a d a H . " A d e n o v i r u s — M e d i a t e d T r a n s f e r o f s i RNA a g a ί n s t S u r v i V i n

I n d u c e d A p o p t o s i s a n d A t t e n u a t e d

T u m o r C e l l G r ow t h i n V i t r o a n d i n V i V o . M o 1 T h e r . 1 0 ( 1 ) : 1 6 2 - 7 1 2

0 0 4

V o 1 P e r s C e t a 1 . "An t i b o d y— m e d i a t e d t a r g e t i n g o f a n a d e n o v i r u s v e c t o r mo d i f i e d t o c o n t a i n a s y n t h e t i c i mmu n o g 1 o b u 1 i ： n G . - b i n d i n g. d oma i n i n t h e c a p s i d." J . V i r o l . 7 7 ： 2 0 9 3 - 2 1 04 , 2 0 0 3.

B r a i s t e d AC a n d We l l s J A "M i n i m

1 z i n g a b i n d i n d oma i n f r om p r o t e i n Aノ' P r o c . N a t l . Ac d. S c に US

A 9 3 ： 5 6 8 8 - 5 6 9 2 , 1 9 9 6.

4. 薬剤の標的指向化

上記 2. の説明からも明らかなように、本発明の抗 PAP 2 a抗体を用いて、疾患の診断および Zまたは治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達することができる。したがって、本発明はまた、抗 PAP

2 a.抗体を用いて、疾患の診断および Zまたは治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達する方法を提供する。

「薬剤（a g e n t )」の例としては、既に説明した放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子などが挙げられる。

典型的な例として、本発明の抗 P A P 2 a抗体は、抗 P A P 2 a抗体が結合し得る、治療遺伝子を組み込んだファイバー変異型アデノウィルスベクターに結合される。これにより、アデノウイルス本来の受容体である（CAR) に依存する感染のみの場合と比較して、標的細胞への感染効率を高めることができ、ファイバ一変異型アデノウイルスを用いた標的部位への治療遺伝子の導入を効果的に行うことができる。

本発明において、「標的部位」は、 PAP 2 aを正常細胞に比べて高発現している細胞、組織、臓器等であり、特に、 PAP 2 aを正常細胞に比べて高発現している腫瘍細胞である。そのような細胞の非限定的な例として、好適には腺癌細胞が挙げられ、さらに腌癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、および乳癌細胞等が本発明の目的にとってより好適なものとして挙げられ得る。本発明の抗 PAP 2 a.抗体を用いるエフェクター細胞を介在する疾患の治療およびォプソニン化

本発明はまた、 1つの態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗 PAP 2 a抗体が、被験者に投与された場合に、免疫学的エフェクター細胞を介在して、 PAP 2 a発現細胞を溶解または成長を阻害するように作用する、 PAP 2 aの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬およびそのような治療薬を被験者に投与する''ことによる該疾患の治療方法を提供する。

用語「免疫学的エフェクター細胞」は、当該分野で通常用いられる意味で本明細書中でも用いられるが、特に、免疫応答の認識及び活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言うものとする。免疫学的エフェクター細胞の非限定的な例には、 τ細胞（例えば、細胞溶解性 T細胞（C TL)、ヘルパー T細胞（T h))、 NK細胞、 NK様 T細胞、 B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、多核白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）などが含まれる。例えば、本発明者の抗 PAP 2. a抗体は、免疫学的エフェクター細胞表面上の F c受容体に結合することができる。エフェクター細胞は、特異的な F ,c受容体を発現して、抗体の結合によって特異的な免疫機能を奏することができ、例えば、好中球は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（AD C C) を誘導することができる。このように、免疫学的エフェクター細胞を介在して、 PAP 2 a発現細胞を貪食するか、または溶解させることができる。

本発明者はまた、さらに別の態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗 PAP 2 a抗体が、被験者に投与された場合に、 P AP 2 a発現細胞をォプソニン化するように作用する、 PAP 2 aの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬、およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。

例えば、本発明の抗 P AP 2 a抗体は、 PAP 2 aに対する少なくとも 1つの第 1の結合特異性と、第 2の標的ェピト一プに対する第 2の結合特異性とを含む二重特異的または多重特異的分子であり得る。例えば、上記第 2の標的ェピトープは、例えば、ヒト F c ァ R I又はヒ卜 F c ひ受容体などの F c受容体であり得る。従って、本発明には、 F C T R、 F c a R又は F c ε Rを発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、 P A P 2 aを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる-。また上記第 2の標的ェピトープは抗 PAP 2 a抗体の補体結合部でもあり得る。抗 PAP 2 a抗体は補体を介して補体受容体を発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、 PAP 2 aを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的または多重特異的分子は、 P AP 2 a発現細胞をエフェクター細胞に狙わせ、 PAP 2 a発現細胞のファゴサイト一シス、 AD C C、' サイト力イン放出、またはスーパ一ォキシドア二オン産生などの F c受容体媒介エフェクター細胞活性を惹起することができる。

6. P A P 2 aを検出および Zまたは定量する方法

本発明は、 1つの態様において、被験者由来の生体試料中の P AP 2 aタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカ一として検出および Zまたは定量する工程を包含する、癌の診断方法を提供する。

本明細書中、「被験者」とは、 PAP 2 aを高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、癌を罹患しているか、そのような疾患を罹患していると疑われるか、またはそのような疾患を罹患する危険性のある、ヒトの被験者を意味するものとする。本発明の目的に従う代表的な「癌」の例としては、好ましくは、腺癌が挙げられ、より好ましくは.、塍癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、「生体試料」.とは、検査のために採取された被験者由来の細胞、組織、臓器、体液などを意味する。体液には、血液、リンパ液、精液、唾液、汗等が含まれ、血液には、全血の他、血清、血漿などの血液製剤も含まれるものとする。より具体的には、生体試料は、癌細胞（または癌組織）であり得、好ましくは、膝癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞であり、最も好ましくは塍癌細胞および肺癌細胞である。

'本発明'はまた、 1つの態様において、被験者由来の生体試料中の P A P 2 aを、抗 PAP 2 a抗体を用いて免疫学的に検出および Zまたは定量する方法を提供する。

好ましい態様に係る本発明の方法は、（ 1 ) 生体試料と抗 PAP 2 a抗体とを接触させる工程、および（ 2 ) 該生体試料中の P AP 2 aと該抗 PAP 2 a抗体との結合を検出および/または定量する工程を包含する。このような方法は、 PAP 2 aを正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、腺癌、より好ましくは、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、 PAP 2 aと抗 PAP 2 a抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、. 生体試料中の P AP 2 aのレべル（または量）が評価される。生体試料中の PAP 2 aのレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。通常、正常ヒトコン小口一ルと比較して高い P AP 2 aレベルは、癌の存在を示す。この場合、通常少なくとも 2倍、好ましくは、 5倍程度高い PAP 2 aレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中の P AP 2 aの存在そのものが、被験者における癌の存在を示し得る。ヒト由来の生体試料において、 P A P 2 aのようなタンパク質の発現レベルを決定するのに用いることができるアツセィ技術は、当業者によく知られている。このようなアツセィ方法は、酵素結合免疫吸着検定法 (E L I S Aアツセィ）、ウエスタンプロット分析、ラジオィムノアッセィ、結合タンパク質競合ァ'ッセィ、逆転写酵素 P C R (RT-P CR) · アツセィ、免疫組織化学アツセィ、 i n s i t uハイブリダィゼ一シヨンアツセィ、およびプロテオミクスアプローチ（p r o t e o m i c s a p p r o a c h) を含む。これらの中で、 E L I S Aが、生物学的液体における遺伝子の発現夕ンパク質の診断に好まれることが多い。もし商業的に容易に入手できない場合、 E L I S A分析は、最初に、 P AP 2 aに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、一般的に、 PAP 2 aに特異的に結合するレポ一ター抗体が調製される。レポ一夕一抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼ酵素またはアル力リホスファタ一ゼなどの酵素試薬などの検出可能な試薬を付着している。

E L I S Aを行う場合、 P.AP 2 aに特異的に結合する抗体は、例えば、ポリスチレンディッシュなどの、抗体を結合する固体支持体上でィンキュベ一トされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合咅 H位 ( f r e e p r o t e i n b i n d i n s i t e s j は、ゥシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とィンキュペートすることにより被覆される。次に、分析される試料は、 PAP 2 aがポリスチレンディッシュに付着した特異抗体に結合する時間中、ディッシュ内でインキュベートされる。非結合試料はバッファーで洗い流される。 PA P 2 aに対して特異的に指向し、西洋ヮサビペルォキシダーゼなどの検出可能な試薬を連結したレポ一夕一抗体がディッシュ内に設置され、.該レポーター抗体が P A P 2 aに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次に非結合レポーター抗体が洗い流される。比色基質を含むぺルォキシダーゼ活性のための試薬が、次にディッシュに加えられる。抗 PAP 2 a抗体に連結した、固定化したペルォキシダーゼが着色反応産物を産生する。所定の時間内に発生した色素の量は、試料中の PAP 2 aタンパク質の量に比例している。量的な結果は、通常標準曲線を参照して得られる。

競合アツセィもまた用いることができ、そこでは、 PAP 2 aに特異的に結合する抗体が固体支.持体に付着しており、標識した PAP 2 aおよび患者またはヒト対照に由来する試料が固体支持体上を通過する。固体支持体に付着した検出標識量を試料中の PAP 2 aの量に相関させることができる。

上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（F I A)、時間分解蛍光免疫測定法（TR F I A)、酵素免疫測定法（E I A)、発光免疫測定法（L I A)、電気化学発光免疫測定法'（E C L I A)、ラテックス凝集法、免疫沈降アツセィ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテイン A免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。

P AP 2 aを診断マ一力一として使用する意味において、 P AP 2 a の核酸配列の全てまたは一部をハイプリダイゼーションプローブとして用いた核酸法（n u c l e i c a c i d me t h o d) もまた、肺癌を含む癌のマーカーとしての P A P 2 aの mRNAを検出するのに用いることができる。ポリメラ一ゼ連鎖反応（P C R)、およびリガーゼ連鎖反応（L C R)および核酸配列をもとにした増幅（n u c 1 e i c a c i d s e q u e n c e a s e d amp i i f i c a t i o n ： NAS ABA) などのその他の核酸法を、様々な悪性腫瘍を診断およびモニタリングするための悪性細胞の検出に用いることができる。例えば、逆転写酵素 P C R (RT - P C R) は、特定の mRNA集団の存在を、何千ものその他の mRNA種の複雑な混合物の中で検出するために用いることができる強力な技術である。 RT— P C Rにおいては、 1 種類の mRNAが、酵素である逆転写酵素を用いて最初に相補 DNA( c DNA) に逆転写され、次にその c DN Aが標準的な P C R反応と同様に増幅される。このように、 1^丁ー卩〇 1 は、増幅により、単一種の m RNAの存在を明らかにすることができる。したがって、この mRNA がそれを産生する細胞に高度に特異的である場合、 RT— P CRは、特定の種類の細胞の存在を同定するのに用いることができる。また、リア- ルタイム P C R法も、 PAP 2 aをコードする核酸（例えば、 mRNA) を定量し、被験者と健常者との比較において、 PAP 2 aをマーカーとして被験者の癌の診断を行うために使用することができる。

また、 PAP 2 aをマーカ一として、被験者の癌の進展の経過あるいは治療経過をモニタリングすることもできる。そのような癌としては、 PAP 2 a陽性の癌であれば特に種類を問わず、 PAP 2 a陽性の腺癌、よ''り具体的には PAP 2 a陽性の肺癌、塍癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、乳癌などの診断に好適に使用することができる。例えば、抗体とマグネチックビーズとを用いた細胞の分別と濃縮（ェンリツチメント）、ならびに RT— P C R法による高感度の mRN Aの検出法を組み合わせることによって、例えば、 5 m 1の被験者の血液中に存在する数個の腫瘍細胞を検出することが可能である。血液中に存在する腫瘍細胞を検出すること、その P AP 2 aの発現量または mRN Aの量を検出または測定することによって、感度および特異性の高い腫瘍の診断が可能である。このような方法については、さらに以下の参考文献を参照するしとがでさる。

Z i e g 1 s c h m i d V H o 1 1 m a n n C， B o c h e r 〇 • "D e t e c t i o n o f d i s s e m i n a t e d t urn o r c e 1 1 s i n p e r i p h e r a 1 b 1 o o dノ，

C r i t R e v C 1 i n L a b S c ί . 2 0 0 5 ; 4 2 ( 2 ) :

1 5 5 ― 9 6.

W a g u r i N, S, u d a T, N o m o t o M, K a w a i H M i t a Y K u r o i w a T , I g a r a s h i M K o b a y a s h i M， F u k u h a r a Y A o y a g i Y. " S e n s i t i v e a n d s p e c i f i c d e t e c t i o n o f c i r c u 1 a t i n g c n e e r c e 1 1 s i n p a t i e n t s w i t h h e p a t o c e 1 1 u 1 a r c a r c i n o m a ， d e t e c t i o n o f h um a n t e 1 o m e r a s ■e r e v e r s e t r a n s c r i p t- a s e m e s s e n g e r RNA a f t e r i mm u n o m a g n e t i c s e p a r a t i o n . " C 1 i n C a n c e r R e s • 2 0 0 3 A u g 1 ； 9 ( 8 ) - 3 0 0 4 ― 1 1.

Z h a n g Y L F e n g J G, G o u J M, Z h o u

L X W a n g P . "D e t e c t i o n o f C K 2 0 mR

N A i n P e r i P h e r a 1 b 1 o o d o f P a n e r e a "t i c c a n c e r a n d i t s c 1 i n i c a 1 s i g n i f i c a n c e Wo r i d J G a s t r o e n t e r o

1 . 2 0 0 5 F e b 2 1 ; 1 1 ( 7 ) ； 1 0 2 3 - 7.

D e m e 1 U ， T i 1 z G P , F o e 1 d e s - P a P P z

G u t i e r r e z B , A 1 . b e r t WH, B o c h e r 〇.

"D e t e c t i o n o f t u m o u r c e 1 1 s i n t h e P e r i P h e r a 1 b 1 o o d o f P a t i e n t s w i t h b r e a s t c a n c e r . D e V e 1 o p m e n t o f a n e w s e n s i t i v e a n d s P e c i f i c i

"

mm u n o m o 1 e c u 1 a r a s s a y - J E p C 1 i n C a n c e r R e s 2 0 0 4 S e P 2 3 ( 3 ) ； 4 6 5 一 8.

固体支持体上に配列（すなわち、グリッド化（g r i d d i n g )) されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダィゼ一シヨンもまた、その遺伝子の発現の検出および発現レベルの定量の両方に用いることができる。この手法では、 P A P 2 a遺伝子をコードする c DNA が基材に固定される。基材は、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない任意の好適な種類であつてもよい。 P A P 2 a遺伝子をコードする D NAの少なくとも一部を基材に付着させ、次に、当該組織から単離した RNAまたは RNAのコピ一である相補 DNA ( c DN A) であってもよい検体とインキュべ一トする。基材に結合した DN Aと検体とのハイプリダイゼーションは、検体またはハイプリッド検出用の二次分子を放射性標識または蛍光標識- することを含むがこれらに限定されないいくつかの手段で検出し定量することができる。本発明において使用し得る標識の非限定的な例としては、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、パクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素等が挙げられる。遺伝子の発現レベルの定量は、検体からの信号の強度を、既知の標準から決定したレベルと比較することによってなされる。標準は、標的遺伝子の i n v i t r oでの転写、収量の定量化、およびこの材料を用いて標準曲線を作成することにより得ることができる。

プロテオミクスアプローチでは、 2次元電気泳動が当業者によく知られた技術である。すなわち、血清などの試料からの個別のタンパク質は、通常ポリアクリルァミドゲル上で、夕ンパク質の異なる特性による分離を連続的に行うことによって単離することができる.。最初に、タンパク質は電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均等に作用し、それにより、小さいタンパク質は大きいタンパク質よりもゲル上で早く移動する。第 2次元では、第 1次元に対して直角に電流をかけ、タンパク質を大きさに基づいてではなく、各タンパク質が有する特定の電荷に基づいて分離する。 .異なる配列の 2つのタンパク質で大きさおよび電荷の両方に関して同一なものは存在しないため、 2次元分離の結果は、各タンパク質が固有のスポッ卜を占有する正方形のゲルとなる。該スポットの化学的プローブまたは抗体プローブによる分析、またはそれに引き続くタンパク質のマイクロシーケンスにより、所定の夕ンパク質の相対的な存在度を明らかにし、試料中のタンパク質の同定をすることができる。

以上詳述した検出および Zまたは定量方法は、組織生検材料および検死解剖材料を含む患者または被験者から得られた様々な細胞、体液および Zまたは組織抽出物（ホモジネートまたは可溶化した組織）に由来する試料について行うことができる。本発明に有用な体液は、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌物またはそれらの派生物を含む。血液は、全血、血漿、血清、または任意の血液の派生物を含む。 7. 抗 PAP 2 a自己抗体を検出およびまたは定量する方法

本発明はまた、別の態様において、被験者由来の生体試料中の PAP 2 aに対する自己抗体（抗 P AP 2 a自己抗体）を検出および/または定量する方法を提供する。

被験者からの生体試料中の抗 PAP 2 a自己抗体の検出は、任意の多ぐの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アツセィがあり、例えば、ウエスタンブロット、ラジオィムノアツセィ、 E L I S A、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（F I A)、時間分解蛍光免疫測定法（TR F I A)、酵素免疫測定法（E I A)、発光免疫測定法（L I A)、電気化学発光免疫測定法（E C L I A)、ラテックス凝集法、免疫沈降アツセィ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテイン A免疫検定法等が挙げられる。

このような免疫アツセィは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアツセィを実施するための 1つの方法は、 PAP 2 a タンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗 P AP 2 a抗体の検出を包含する。本発明のアツセィに用いられる PAP 2 aタンパク質は、当該分野において周知の組換え DN A技術によって調製し得る。例えば、 P AP 2 aタンパク質をコードする DN Aを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、 PAP 2 aタンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、 PAP 2 aの標識、固定化または検出を容易にすることができる融合夕ンパク質が遺伝子操作される（例えば、 S amb r o o kら、 1 9 8 9 , Mo l e c u 1 a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y M a n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N. Y. に記載された技術を参照）。別法として、 P AP 2 aタンパク質は天然の供給源から精製することができる。たとえば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺がん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィ一および Zまたはイオン交換クロマ卜グラフィ一が包含されるが、これらに限定されない。実際には P A P 2 aタンパク質の固体支持体としては、マイクロ夕イタ一プレートが好都合に使用される。

8 . 薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索ずる方法'

本明細書の実施例に、 S l l、および T 1 3を.産生するハイプリドーマの作製ならびにそれに引き続く抗原の同のために具体的に例示した方法は、一般的に、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索する方法として有用である。本発明の抗体スクリ一ニング方法によって、診断マーカーとして高感受性および高特異性の標的療法に極めて最適化された抗体および対応する抗原分子を直接かつ迅速にスクリ一ニングすることができる。

したがって、本発明は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索する方法を提供する。より具体的には、本発明は、組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法、および組織特異的抗原を同定する方法を提供する。好ましくは、上記組織は、腫瘍組織である。

本発明は、 1つの態様において、組織特異的抗原に対するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマの作製方法を提供し、この方法は、 ( 1 ) 組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイプリドーマのライブラリーを作製する工程、

( 2 ) 上記ライブラリー由来の上記ハイプリドーマ由来産物（例えば

、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバ一変異型アデノウィルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファィバ一変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウィルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、および ( 3 ) 上記感染効率が上記八イブリドーマ由来産物（抗体など）を上記細胞と接触させない場合と比較して増大したハイプリドーマを選択し、クローニングする工程

を包含する。

本発明はまた、組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体をスクリ —ニングまたは調製する方法を提供する。このスクリーニング方法は、

" ( .1 ) 組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、八イブリドーマのライブラリ一を作製する工程、および

、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバ一変異型アデノウィルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファィバー変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウィルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、を包含する。

ここで、上記組織の好ましい例として腫瘍が、上記細胞の好ましい例としては、腫瘍細胞が挙げられる。

なお、上記ハイプリドーマ由来産物（例えば、抗体など）として、既存の抗体（例えば、寄託機関に寄託されているハイブリド一マにより産生される抗体または市販により入手可能な抗体など）を使用してもよい。その場合には、上記工程，（ 1 ) は、既存の抗体を取得することから構成される。

ここで、好ましくは、上記ライブラリー由来の上記ハイプリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウィルスの上記細胞への感染は、

( A ) 上記ライブラリー由来の上記ハイブリド一マ由来産物を、上記細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、

( B ) 上記ライブラリー由来の上記ハイブリド一マ由来産物と、抗体- に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、または

( C ) 上記ライブラリー由来の上記ハイプリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウィルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、によって行われる。

お、上記細胞の好ましい例としては、腫瘍細胞が挙げられる。

上記スクリーニング方法では、感染効率を評価した結果、通常、感染効率がハイプリドーマ由来産物（抗体など）を細胞と接触させない場合と比較して増大したハイプリドーマを選択し、クロ一ニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。好ましくは、目的のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択する工程は、レポ一夕一遺伝子発現測定アツセィによって上記ファイバー変異型アデノウィルスの上記細胞に対する上記感染効率を評価することを含む。ここで、上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現することができるように作製されている。また、上記レボーター遺伝子発現測定アツセィは、例えば、分光光度計あるいはフローサイトメトリーを利用してレポ一夕 —遺伝子 E G F Pの発現測定を行うことができる。ここで、上記発現効率の増大したハイブリド一マの選択においては、レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体を使用した場合と比較して、少なくとも 2倍、好ましくは、少なくとも 1 0倍、より好ましくは、少なくとも 2 0倍、より好ましくは、少なくとも 3 0倍、より好ましくは、少なくとも 4 0 倍、最も好ましくは、少なくとも 5 0倍であるモノクローナル抗体が選択される。なお、ここでいう「コントロール抗体」とは、現在の一般的な手法で得られる抗体または現在一般に市販等により入手可能な抗体、例えば、 C E Aに対する抗体ならば、 I B L社（ l o t N o 9 G - 7 1 7 ) のようなマウス抗 C E A抗体などのことをいう。

また、レポーター遺伝子発現測定アツセィの代替的な実施方法として- は、例えば、レポ一夕一遺伝子として 1 a c Zを使用する場合には、 1 a c Z遺伝子産物の発現は、市販の化学発光 i8 -G a l レポーター測定キット（例えば、 G a l a c t o L i g h t P l u s R e p o r t e r G e n e A s s a y S y s t ern (R o c h e社製：コ一ド番号 T l 0 1 1 ) など）を使用して測定し得る。また、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販のルシフエラーセ定量システムとして、 L u c i f e r a s e a s s a y s y s t em (P r ome g a, C a t No. E 1 5 0 0) などを使用して測定し得る。

上記方法において、抗体に結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスとしては、例えば、抗体の F c ドメインに結合するプ口ティン Aの Z 3 3モチーフをノブの H Iループ部位に含む F Z 3 3フアイバー変異型アデノウイルスが挙げられる。上記方法においては、 F Z 3 3ファイバー変異型アデノウイルスに限らず、抗体とある程度以上のァフィ二ティー（例えば、結合定数（K_a) が少なくとも 1 0ァ — ¹、好ましくは、少なくとも 1 08 M— ¹ , より好ましくは、 1 0⁹M— ¹以上であるような結合親和性）をもって結合できる性質を付与したベクターであれば、その種類を問わない。例えば、アデノウイルスに Z 3 3などの抗体結合分子もしくはペプチドを任意の方法で結合（Z 3 3などを共有結合、 Z 3 3などをピオチン一アビジンによって架橋、 Z 3 3などを化学結合させたポリエチレングリコールでウィルスを包む、など）させた F Z 3 3などの修飾型のアデノウィルス、などが挙げられる。

また、アデノウィルスのファイバーの CAR受容体との結合部位を欠いたファイバ一変異型アデノウイルス、すなわち、 K i r b y I e t a 1. J . V i r o l . 7 3 : 9 5 0 8 - 9 5 1 4, 1 9 9 9. ； M i z u g u c h i e t a 1. G e n e Th e r a p y 9 : 7 6 9 - 7 7 6 , 2 0 0 2. ; R o e l v i n k PW e t a 1. S c i e n c e , 2 8 6 : 1 5 6 8 - 1 5 7 1 , 1 9 9 9. などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウィルスを- もとに、抗体とある程度以上のァフイエティ一をもって結合できる性質を付与したベクターも同様に本発明の目的のために使用することができる。 '

図 1 3— 3は、そのようなアデノウイルスのファイバ一の C AR受容体との結合部位を欠いたファイバ一変異型アデノウイルス A d v— F d Zを用いた標的化分子探索の概念図である。

面 1 3— 4は、 Ad V— F d Zのファイバ一部分の構造を示した模式図であり、ここで、ヒト 5型アデノウイルスのファイバーの N末端から 48 9から 49 2番目のアミノ酸 T A YTが欠損している。また、図 1 3— 5は、この欠損ファイバーを有するアデノウイルスを作製するためのプラスミドベクタ一の一例を示す模式図である。ここに示した p Ax 3 i F d Zプラスミドは、 E lを置換したクロ一ニングサイトに I _ S c e I制限酵素サイトを有すること、 48 9から 4 9 2番目のアミノ酸 T A YTを欠損させていることの 2点を除けば、 p Ax 3— F Z 3 3と同じものである。このプラスミド p A X 3 i F d Zを用いることによつて、 CAR受容体との結合部位を欠く、標的選択性の高い遺伝子導入が可能なアデノウイルスベクターを作製することが可能である。 Ad V— F d Zは、 CAR受容体との結合部位を欠くため、より選択性の高い遺伝子導入が可能である。

また、アデノウイルスのインテグリン分子群との反応性を欠いた、ぺントンべ一スタンパク変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のァフィ二ティーをもって結合できる性質を付与したベクターであつても良い。また、アデノウイルスの肝臓への取り込みを欠いたフアイバ一変異型アデノウイルス、すなわち、 Sm i t h T A e t a 1 (Sm i t h T A, I d a m a k a n t i N, R o l l e n c e ML, M a r s h a l 1 -N e f f J , K i m J , Mu 1 g r e w K , N eme r ow GR, K a 1 e k o M， S t e v e n s o n S C. Ad e n o v i r u s s e r o t y p e 5 f i b e r s h a f t i n f l u e n c e s i n v i v o g e n e t r a n s f e r i n m i c e . Hum G e n e T h e r . 2 0 0 3 M a y 2 0 ; 1 4 ( 8) : 7 7 7 - 8 7.)などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウィルスをもとに、抗体とある'程度以上のァフィ二ティーをもって結合できる性質を付与したベクターも同様に本発明の目的のために使用することができる。

'なお、これらは非限定的な例示であり、他のウィルス（例えば、レトロウィルス、レンチウィルス、単純へルぺスウィルス、シンドビスウイル、麻疹ウィルス、センダイウィルス、レオウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、コクサツキ一ウィルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など）の外被（エンベロープ）やキヤプシドに修飾を施した変異型ウィルス、または上記各種ウィルスに Z 3 3などの抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（Z 3 3などを共有結合、 Z 3 3などをピオチン一アビジンによって架橋、 Z 3 3などを化学結合させたポリェチレングリコールでウィルスを包む、など）させた修飾型のウィルスもまた、本発明の方法に使用し得る。あるいは、ウィルスベクターに限らず、リボソームベクタ一、センダイウィルスエンベロープベクター、プラスミド DNAネイキッド（n a k e d) ベクターなどの非ウィルスべクタ一に、抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（抗体結合分子を化学的に共有結合させる、ピオチン一アビジンによって架橋させる、抗体結合分子を化学結合させたポリエチレングリコールでベクタ一を包む、など）させた修飾型の非ウィルスベクターも、本発明において有利に使用することができる。

レポーター遺伝子としては、例えば、 l a c Z、 E GF Pなどの蛍光タンパク、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのレポ一夕 —遺伝子は、当業者に周知のレポ一夕一遺伝子アツセィ系を用いて検出レ得る。例えば、 1 a c Zを発現するように調製された F Z 3 3フアイバー変異型アデノウイルスの感染効率は、市販の化学発光 ;6— G a 1 レポーターキット（例えば、 'G a l a c t o L i g h t P l u s R e p o r t e r G e n e A s s a y S y s t em (R o c h e社製：コード番号 T 1 0 1 1 ) など）を使用して測定し得る。ルシフェラ —ゼ疋量システムとしてま、 L u c i f e r a s e a s s a y s y s t e m CP r ome g a, C a t N o E 1 5 0 0 ) などを使用して測定し得る。 E G F Pなどの蛍光タンパクは、分光光度計あるいはフロ —サイトメトリーによって発現量を測定し得る。

なお、 '上記した薬剤の標的指向化療法に使用するたのモノクローナル抗体の作製および精製については、さらに以下の文献を参照することができる。

H a m a d a H • a n d T s u r u o T • "F u n c t i o n a 1 r o 1 e f o r t h e 1 7 0 ― t o 1 8 0一 k D a g 1 y c o P r o t e i n s P e c i f i c t o d r u g - r e s i s t a n t t u m o r c e 1 1 s a s r e V e a 1 e d b y- m o n o c 1 o n a 1 a n t i b o d i e s . P r o c

N a t 1 • A c a d . S c i • U S A 8 3 - 7 7 8 5 - 7

7 8 9 1 9 8 6 •

H a m a d a H • a n d T s u r u o T "D e t e r m i n a t i o n o f m e m b r ； a n e a n t i g e n s b y a c o V a 1 e n t c r o s s 1 i n k i n g m e t h o d w i t h m o n o c 1 o n a 1 a n t i b o d i e s An a l .

B i o c h e m 1 6 0 : 4 8 3 - - 4 8 8 , L 9 8 7.

H a m a d a H • H a g i w a r a K. N a k a j i m a

T a n d T s u r u o T • P h o s P h o r y 1 a t i o n o f t h e M r 1 7 0 0 0 0 t o 1 8 0， 0 0 0 g

1 y c o P r o t e i n s P e c i f i c t o m u 1 t i d r u g ― r e s i s t a n t t u m o r c e 1 1 s • E f f e c t s o f V e r a P a m i 1 t r i f 1 u o P e r a z i n e , a n d P h o r b o 1 e S t e r s C a n c e r R e s . , 4

7 2 8 6 0一 2 8 6 5- 1 9 8 7 H a m a d a H. a n d T s u r u o T . P u r i f i c a t i o n o f t h e 1 7 0— t o 1 8 0 k i 1 o d a

1 t o n m e m b r a n e g 1 y c o p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h m u 1 t i d r u g r e s i s t a n c e ；

T h e 1 7 0 - t o 1 8 0 - k i 1 o d a 1 t o n m e m b r a n e g 1 y c o p r o t e i n i s a n AT P a s e . J

B"i o 1 ' C h e m. j 2 6 3 : 1 454 - 1 4 5 8 , 1 9 8 8 '

M i s h e l l B B S h i i g i S M e d s . "S e 1 e c t e d M e t h o d s i n C e 1 1 u 1 a r I mm u n o

1 o g y WH F r e e m a n a n d C o., S a n F r a n c i s c o , 1 9 8 0 . (邦訳細胞免疫実験操作法、今井ら訳、理工学社、 1 9 8 2 )

B i r c h J R a n d L e n n o E S e d s . "Mo n o c 1- o n a 1 a n t i b o d i e s : P r i n c i p l e s a n d Ap p l i c a t i o n s . W i l e y— L i s s , N e w Y o r k, 1 9 9 5.

G o d i n g J W "Mo n o c l o n a l a n t i b o d i e s ： P r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e ." A c a d em i c P r e s s , L o n d o n, 1 9 8 3.

G o d i n J W "Mo n o c l o n a l a n t i b o d i e s ： P r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e ." T h i r d e d . A c a d em i c P r e s s , L o n d o n, 1 9

9 6

本発明は、さらなる態様において、組織（例えば、腫瘍）特異的抗原を同定する方法を提供する。本発明の組織特異的抗原を同定する方法は、上記ハイプリドーマ由来産物から精製されたモノクロ一-ナル抗体に特異的に結合する抗原タンパク質を同定し、そのアミノ酸配列を決定する工程、および上記決定されたアミノ酸配列に対して、配列データベース上で相同性検索を行うこと.により、上記抗原タンパク質を同定する工程を包含する。

上記抗原タンパク質を同定する工程は、抗原と上記モノクローナル抗体との免疫沈降、ウエスタンプロット分析等を含む。そのアミノ酸配列を決定する工程は、任意の公知のアミノ酸配列決定法（例えば、気相シークェンサー（例えば、 P r o c i s e 4 9 0 c L C AB I社、 H P 24 1 HP社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドの HP L Cによる分離、ゲル電気泳動によるべプチドマツプ法、質量分析装置による HP L Cで分離されたべプチドのアミノ酸配列分析等）による配列決定により行われ得るが、好ましくは、質量分析によりアミノ酸配列が決定される。

上記方法において、配列データベース上での相同性検索は、当業者に周知のプログラム（例えば、 FAS TA、 B LAS T、 MAS C OTなど）および配列データベース（例えば、 P I R、 SW I S S— P R〇T、 NC B Iなど）を利用して行うことができる。

上記の組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法、および組織特異的抗原を同定する方法により、特定の細胞、例えば、癌細胞に対する標的化治療に実用化可能な標的と抗体との組み合わせを系統的に探索するための方法論が提供される。 9. 標的化療法における標的分子および抗体の配列決定およびクロー二ング

本発明の上記方法により、同定された抗体および標的分子のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当業者に周知の配列決定法により決定することができる。

アミノ酸配列決定法としては、気相シークェンサ一（例えば、 P r o c i s e 49 0 c L C AB I社、 HP 24 1 HP社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたぺプチドの HP L Cによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置による HP LCで分離されたべプチドのアミノ酸配列分析- 等が使用され得る。核酸配列の決定方法としては、 P C Rを用いたサイクルシークェンス法などのような当業者に周知の核酸配列の決定法が使用され得る。

得られた標的分子またはそれに対する抗体の DN Aの塩基配列が決定されれば、それに基づいて遺伝子工学的手法により、本発明の抗体を作製したり、他の分子との融合体を作製したりすることができる。目的とする DNAは、プラスミドベクターによるクローニング法等の当業者に周知の分子生物学的手法を用いて大量に得ることができる（例えば、 S amb r o o k, J . e t a l . : Mo l e c u l a r C 1 o n i n g. A l a b o r a t o r y M a n u a l , 2 n d E d., C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9等を参照）。

1 0. 製剤化および製剤の投与方法

本発明の抗体を含有する治療薬、本発明の抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウィルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療薬は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。

本発明の治療薬の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケィ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ二ルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグ.リセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0、白糖、カルポキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。

本発明の治療薬の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟，硬カプセル剤、フィルムコ一ティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者に''おいて'は投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としての PAP 2 aタンパク質の機能（または発現）阻害物質は、製剤中 0. 1から 9 9. 9重量％含有することができる。

本発明の薬剤の有効成分の投量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者

(6 0 k gとして）に対して一日にっき約 0. l mg〜l , 0 0 0 mg、好ましくは約 1. 0〜1 0 0mg、より好ましくは約 1. 0〜5 0mg である。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（6 0 k gに対して）、一日につき約 0. 0 1から 3 Omg程度、好ましくは約 0. 1から 2 0mg程度、より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ゥサギ、' ヒッジ、ブ夕、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒ卜以外の動物の場合も、上記の 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。

本発明の治療剤は、対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されないが、好ましくは、腺癌、より好ましくは、前立腺、脖蔵、肺、甲状腺、卵巣、および乳房などの腺癌の治療に用いることが好ましい。また、本発明において典型的に使用されるウィルスベクター粒子は、医薬組成物の成分の一つとして、抗 P A P 2 a抗体と組み合わせて、治療、特に腫瘍の治療のために使用することができる。組換えアデノウィルス粒子と抗 P A P 2 a抗体との組み合わせを治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、力プセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗 P A P 2 a抗体一ウィルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり 1回に 1 0 ³〜1 0 ^{1 5}個のウィルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞 ·組織の性質によって変更してよい。投与回数は、 1 日 1回〜数回でよく、投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投入を 1セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウィルスベクター粒子またはウィルスべクタ一核酸分子は、特定の細胞およびノまたは組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウィルスベクタ一の核酸分子に検出可能なマーカ一遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフエクションして得られたウィルスベクタ一粒子は、抗 P A P 2 a抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗 P A P 2 a抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。

以下、実施例によって本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されない。実施例

(実施例 1. アデノウィルス F Z 3 3シリーズの作製）

基本的には、 Vo l p e r s ら（Vo l p e r s C e t a 1. J . V i r o l . 7 7 : 2 0 9 3— 2 1 04, 2 0 0 3 ) の方法に従レ、 Yo s h i d aら (Yo s h i d a e t a 1. Huma n G e n e Th e r a p y, 9 ( 1 7 ) : 2 5 0 3 - 2 5 1 5 , 1 9 9 8)、 N a k amu r aら（N a k amu r a T . e .t a 1. , H u m. G e n e Th e r . , 1 3 (5) : 6 1 3 - 6 2 6 , 2 0 0 2 ) などに記載の材料および方法を用いて、本発明者らの研究室において、 F Z 3 3変異型アデノウイルスを遺伝子工学的に作製した。 Z 3 3 モチーフの配列としては、 B r a i s t e dら（B r a i s t e d A C a n d We l l s J A P. r o c . N a t l . Ac a d. S c i . US A 9 3 : 5 6 8 8— 5 6 9 2， 1 9 9 6) に報告されているアミノ酸配列 Z 3 3を用いた。

(A. RGD変異型ファイバーとアデノウイルスの左端のゲノムを含むプラスミド p A X 3の作製）

図 1 3— 1は、本発明において代表的な例として使用される組換えァデノウィルス作製のためのプラスミドベクター pAx 3の模式図である。 pAx 3プラスミドは、ヒト 5型アデノウィルスのゲノムの左端 n t 1 — 3 5 7の 3 5 7 b pを含み、 n t 3 5 8— 3 3 2 8を欠損し、フアイバ一の H Iループに F— R GD変異（^^ & ¾: & 11111 &ら、 2 0 0 2 (前出））を含む。

具体的には、以下に記載するようにアデノウイルスベクター p Ax 3 を作製した。

まず、プライマーとして以下のものを使用し、 P CR法によって、後段に記載するような塩基配列を有するアデノウイルスゲノム左端 3 5 7 b pを含む 3 9 9 b pの DN A断片を作製した。

5，側のプライマー：

C C GCAATTGTTAATTAAGGATC C C CATCATCA- ATAATATAC C TTA (配列番号 2 )

3 ' 側のプライマー：

C CATC GATTTAAATAGATCTGC GGC C C TAGAC AAATATTAC GC GC (配列番号 3 )

を用いた。

5，側プライマーは、じ 3 3 1; セ 8の 11 ] 1 、 TTAATTAAの P'a c l、 g g a t c cの B amH I、それぞれの制限酵素認識配列を含んでいる。

3，側プライマーは、端に ATC GATの C l a l、 AT T T AAA Tの Swa l、 AGAT CTの B g l I I、それぞれの制限酵素認識配列を含んでいる。

上記プライマーを用いてヒト 5型アデノウイルス組換えウィルス（p Ax— F RGDウィルス（N a k amu r aら、 2 0 0 2 (前出）を参照））のゲノム DN Aをテンプレートとして用いて P C Rを行い、アデノウィルスゲノム左端 3 5 7 b pを含む配列番号 4に示される 40 1 b p の P C Rフラグメントを得た。

c c g c a a t t g T T A AT T A A g g a t c c c CATCATCA ATAATATAC CTTATTTTGGATTGAAGC CAATA TGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGAC G.T G G C GC GGGGC GTGGGAAC GGGGC GGGTGAC GTAGT AGTGTGGC GGAAGTGTG AT GTTGCAAGTGTGG C GGAACACATGTAAGC GAC GGATGTGGCAAAA GTGAC GTTTTTGGTGTGC GC C GGTGTACACAG GAAGTGACAATTTT C GC GC GGTTTTAGGC GGA TGTTGTAGTAAATTTGGGC GTAAC C GAGTAAG ATTTGGC CATTTTC GC GGGAAAACTGAATAAG AGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACT CATAGC GC GTAATATTTGTCTAGGGC C GC a g a t c t a t t t a a a t c g a t g g (配列番号 4 ) 上記の P C Rフラグメントを Mu n I (M f e I ) および C 1 a Iで制限酵素消化し、得られた約 4 0 0 b pの D NA断片を pWE 3 5 7 P a c Iの作製に用いた。 C 1 o n t e c h社のプラスミド p WE 1 5を購入して用い、この E c o R I と C l a lサイトに上記の断片を組み込んだ。（ E c o R I と M u n Iは、スティツキ一エンドが A A T Tとなり、ライゲーションが可能である。）得られたプラスミドを pWE 3 5 7 P a c Ί と名付けた。

次いで、プラスミド pWE 3 5 7 P a c Iの C I a l /R s r I Iサイト（アデノウィルス左端 3 5 7 b pを含む C 1 a I /R s r I I断片）に、 p Ax— F R GD (N a k amu r aら、' 2 0 0 2 (前出）記載のプラスミド）からのヒト 5型アデノウイルスのゲノム約 2 4 k bを含む C 1 a I /E c o R I断片、並びに、 F R GDファイバ一部分 6. 7 k bのアデノウィルスゲノムを含む E c o R l ZR s r I I断片を用いて、 3断片のライゲーシヨン.を行い、 p A X 3プラスミドを得た。なお、この名称は p A X 3 5 7の略称である。

p A x 3プラスミドのファイバ一は野生型ではなく、 F R GD変異型となっている。 F R GD変異（C D C R GD C F C) を含む H Iル一プ部分の 1 6 6 b pは、配列番号 5に示すとおりであり、制限酵素サイトとして、 S a c l I (C D C R GD C F C), A s e l 、 X h o I 、 B amH I 、 M 1 u I 、 S a i l と連なって含んでいる。

T G T GAC T G C C G C G GAGA C T G T T T C T G C C CAA GT G CATA C T C TAT G T C AT TT T C AT G G GA C T G G T C T GG C C AC AA C TA C ATTAAT GAAATATT T G C C AC C T C GAG T TAC A C T TT T T C ATAC AT T G C C C AAGAATAAG GAT C C A C G C GT GT C GA C AAGAAT AAA G A AT (配列番号 5 )

(B . F Z 3 3ファイバ一変異を含むプラスミドの作製）

1 ) H Iループの P C R

ヒト 5型アデノウィルスのファイバーノブの H Iループに Z 3 3モチ. —フのフラグメントを挿入することを目的として、 H Iループの内部にクローニングに便利な A g e Iサイト（AC C G G T) と N h e lサイト（G C TAG C) をもつ H Iループを含むフラグメントを P C Rにより、人工的に作製した。 ,

a ) h i ANフラグメントの前半部分の作製

下記プライマ一 # 2 0 9 1と # 2 0 9 2とを、それぞれ 5 ' プライマ一および 3 ' プライマーとして、 p WE 6. 7 R - F/w t - 2 (N a k amu r aら、 2 0 0 2 (前出）に記載されたプラスミド）をテンプレートとして P C Rを行い、前半部分のフラグメントを作製し、これを K p n l と E c o R I とで制限酵素消化して、 p S K I I + h i AN の作製に用いた。

プライマ一 # 2 0 9 1および # 2 0 9 2の塩基配列は、以下の通りである。

# 2 0 9 1 (K p n I )， 3 7 b

c g g g g t a c c a a t a t c t g g a a c a g t t c a a a g t g c t c a t (配列番号 6 )

# 2 0 9 2 (F Z 3 3 , A g e I ), 4 7 b

c g g a a t t c g g c g c g c c a c c g g t t t c c t g t g t a c c g t t t a g t g t a a t g (配列番号 7 )

上記 P C Rにより得られた産物 3 1 4 b pの塩基配列は、配列番号 8 に示す通りである。

c g g g g t a c c a a TAT C T G GAAC AG T T C AAAGT G C T C AT C.T TAT TATAAGAT T T GAC GAAAAT G GA GT G C TAC TAAA C AAT T C C TT C C T GGAC C C AGA ATAT T G GAA C T TTAGAAAT GGAGAT C T TA C T G AAG G C AC AG C C TATAC AAAC G C T GT T G GATT T AT G C C TAAC C TAT C AG C T TAT C C AAAAT C T CA C G G TAAAAC T G C C AAAAG TAA CATT GT C AGT C AAGT T TAC T TAAA C GGAGACAAAAC TAAA C C T- GTAACAC TAAC CATTACACTAAAC GGTACACA GGAA a c c g g t g g c g c g c c g a a t t c c g (配歹 'J番号 8 ) b) h i ANフラグメントの後半部分の作製

下記プライマー # 2 0 9 3と # 2 0 6 8とをそれぞれ 5 ' プライマ一および 3，プライマ一として、 pWE 6. 7 R- F/w t - 2 (Y o s h i d aら、 1 9 9 8 (前出）に記載されたプラスミド）をテンプレードとして P CRを行い、後半部分のフラグメントを作製し、これを E c o R I と B amH I とで制限酵素消化して、 p SK I I + h i ANの作製に用いた。

プライマ # 2 0 9 3および # 2 0 6 8の塩基配列は、以下の通りである。

# 2 0 9 3 (F Z 3 3 , N h e I ), 5 2 b

c c g a a t t c c g c t a g c g a c a c a a c t c c a a g t g c a t a c t c t a t g t c a t t t t c a t (配列番号 9 )

# 2 0 6 8 ( 2 6 b)

a t a t g g t a c c g g g a g g t g g t g a a t t a (配列番号 1

0)

# 2 0 9 3および # 2 0 6 8を用いた上記 P C Rにより得られた P C

R産物 9 7 4 b pは、配列番号 1 1に示す通りである。

c c g a a t t c c c t a g c g a c a c a a c t c c a a g t g c a t a c t c t a t g t e a t t t t c a t GGGAC T G G T C T G

G C C A C AA C T A CATTAATGAAATATT T G C C A C C

TC GAGTTACAC TTTTT CATACATTGC C CAAGA ATAAGGATC CAC GC GTGT C GACAAGAATAAAG AATC GTTTGTGTTATGTTTCAAC GTGTTTAT'T TTT CAATTGCAGAAAATTTCAAGTCATTTTTC ATTCAGTAGTATAGC C C CAC CAC CACATAGC T TATACAGAT CAC CGTAC C TTAAT CAAAC T CAC AGAAC C C TAGTA T CAAC CTGC CAC CT C C CTC- C CAACACACAGAGTACACAGTC C TTTC TC C C C GGCTGGC CTTAAAAAGCATCATATCAT GGGTA ACAGACATATTC TTAGGTGTTATATTC CACAC GGTTTC C TGTC GAGC CAAAC GCT CATCAGTGA TATTAATAAAC TC C C C GGGCAGC TC GC TTAAG TTCATGT C GC TGTC CAGC TGC TGAGC CACAGG CTGCTGT C CAAC TTGC GGTTGCT CAAC GGGC G GC GAAGGGGAAGTC CAC GC CTACATGGGGGTA GAGTCATAATC GTGCATCAGGATAGGGC GGTG

G T G C T G C AG CAGC GC G C G AAT AA A C T G C T G C C

G C C G C C G C T C C GT C C T G C A G G A A T A C A A C AT G

G C A G T G G T C T C C T C A G C GAT GATTC GCAC C G C

C C G C AG C AT G AGAC G C C T T G TC C TC C GGG C AC

AG C AG C G C A C C C T G AT C T C A C T T AA AT C A G C A

C A G T AAC T G C A G C A C A G C AC C AC AATATT G T T

CAAAATC C CACAGTGCAAGGC GC TGTATC CAA AGC TCATGGC GGGGAC CACAGAAC C CAC GTGG C CATCATAC CACAAGC GCAGGTAGATTAAGTG GC GAC C C CT CATAAACAC GCTGGACATAAACA

T T A C C T C T T TTGGCATGTTGTAATT CAC C AC C

T C C C G G T A C C a t a t (配列番号 1 1 )

また、上記フラグメントを E c o R I と B a mH I とで切り出した 1

3 6 b pのフラグメントの塩基配列は、以下の通りである。

g a a t t c c g c t a g c g a c a c a a c t c c a a g t g c a t a c t c t a t g t c a t t t t c a t GGGAC T G G T C T GGC

C AC AA C T A C ATTAATGAAATATT T G C C A c C T C

GAG TTAC A C TTTTT CATACATTG C C C A A G AAT

AAG G AT C C (配列番号 1 2)

2 ) p S K I I + h i A-Nプラスミドの作製上記 1 ) で得た h i ANフラグメン卜の前半部分のフラグメント、後半部分のフラグメント、および p B l u e s c r i p t I I + (S t r a t a g e n e社）の Kp n l と B amH I とで制限酵素消化しアル力リホスファターゼ C I A P (子牛の腸管由来のアルカリホスファターゼ、以下、 C I APと略す）処理した約 3 k bのフラグメントの 3者をライゲーシヨンし、 p S K I I + h i ANプラスミドの作製を行った。

—Kp n l と B amH I との間に入る P C Rフラグメントの長さは約 4 3 9 b pとなる。確認された Kp n I と B amH I との間の塩基配列は、配列番号 1 3に示す通りである。

g g t a c c a a TATCTGGAACAGTT CAAAGTGCT CAT CTTATTATAAGATTTGAC GAAAATGGAGT GCTACTAAACAATT C C TT C CTGGAC C CAGAAT ATTGGAAC TTTAGAAATGGAGAT CTTAC TGAA GGCACAGC CTATACAAAC GCTGTTGGATTTAT GC C TAAC CTATCAGC TTATC CAAAATC TCAC G GTAAAAC TGC CAAAAGTAACATTGT CAGT CAA GTTTACTTAAAC GGAGACAAAAC TAAAC C TGT AACACTAAC CATTACAC TAAACGGTACACAGG AA a c c g g t g g c g c g c c GAATT C c g c t a g c g a c a c a a c t c c a a g t g c a t a c t c t a t g t c a t t t t c a t GGGAC TGGTCTGGC CACAACTACATTAATG AAATATTTGC CAC C TC GAGTTACAC TTTTTCA TACATTGC C CAAGAATAAGGATC C (配列番号 1 3) 3 ) p S K I I + Z 3 3プラスミドの作製

Z 3 3モチーフを含む A g e Iサイトと Nh e Iサイ卜とを両端に有する DNAフラグメントは、プライマー # 2 0 8 5 (4 8 b a s e) と # 2 0 8 6 (4 8 b a s e) とを、それぞれ 5 ' プライマーおよび 3 ' プライマーとして、合成ォリゴヌクレオチド # 2 0 8 7 (8 6 b a s e ) をテンプレートと'して用いて P C Rを行い、 1 3 2 b pの P Rフラグメントを得た。 p S K I I + h i ANプラスミドの A g e Iサィトと N h e Iサイトとの間に、この Z 3 3モチーフフラグメントの A g e Iおよび N h e I制限酵素消化産物をクロ一ニングし、塩基配列を確認して、 p S K I I + Z 3 3プラスミドを得た。

プライマー # 2 0 8 5および # 2 0 8 6、ならびにテンプレートの # 2 0 8 7の塩基配列は、それぞれ以下の通りである。

—# 2 0 8 5 (Z 3 3 ), 4 8 b

g a a a c c g g t c t c a t c a a g t t t a a c a t g.c a g c a g c a g c g c c g c t t t t a c (配歹 U番号 1 4 )

# 2 0 8 6 ( Z 3 3 ), 4 8 b

g t e g c t a g c a t c t a t g t c g t c g c g a a t g c t c t t a a t c t t g g c g t t g c g (配歹 'J番号 1 5 )

# 2 0 8 7 (Z 3 3 ), 8 6 b

a t g c a g c a g c a g c g c c g c t t t t a c g a g g c c t t g c a c g a c c c c a a c c t g a a c g a g g a g c a g c g c a a c g c c a a g a t t a a g a g c a t t c g (目 ti列番号 1 6 ) また、 P C Rによって得られた上記 1 3 2 b pのフラグメントの塩基配列は、以下の通りである。 .

GAAA C C G GT C T C AT C AAG T T TAACAT G C AG C A G CAG C G C C G C T T T TA C GA G G C C T T G C A C GAC C C CAA C C T GAAC GAG GAG C AG C G C AA C G C C AAG AT TAAGAG C AT T C G C GAC GA C ATAGAT G C TAG C GA C (配列番号 1 7 )

これを、コードするアミノ酸配列に翻訳すると、以下の通りである。 E T G L I K F NMQQ Q R R F YE AL HD P NL N E E Q R NAK I K S I RD D I DA S D (配列番号 1 8 )

また、 H Iループを含む K p n Iから B amH I までの 5 3 8 b pの塩基配列は、以下の通りである。

g g t a c c a a t a t -c t g g a a c a g t t c a a a g t g c t' c a t c t t a t t a t a a g a t t t g a c g a a a a t g g a g t g e t a c t a a a c a a t t c c t t c c t g g a c c c a g a a t a t g g a a c t t t a g a a a t g g a g a t c t t a c t g a a g g c a c a g c c t a t a c a a a c g c t g t t g g a t t t a t g c c t a a c c t a t c a g c t t a t c c a a a a t c t c a c g g t a a a a c t g c c a a a a g t a a c a t t g t c a g t c a a g"t t t' a c t t a a a c g g a g a c a a a a c t a a a c c t g t a a c a c t a a c c a t t a c a c t a a a c g g t a c a c a g g a a A C C GG T C T C AT C AA GT T TAAC AT G C AG C AG

CAGCGC C GC T TTTAC GAG G C C T T G C A C G A C C C

C A A C C T G A A C G AGG AG C A G C G C A A C G C C AAG A

T T AAG AG C A T T C G C G A C G A CAT AG AT G C T AG C

g a c a c a a c t c c a a g t g c a t a c t c t a t g t c a t t t t c a t g g g a c t g g t c t g g c c a c a a c t a c a t t a a t g a a a t a t t t g c c a c c t c g a g t t a c a c t t t t t e a t a c a t t g c c c a a g a a t a a g g a t c c (配列番号

1 9)

下線を引いた部分は、 AC C GGT、すなわち、 Ag e lサイトおよび GC TAGC、すなわち、 N h e lサイトである。大文字で表した部分が P C Rによって作製された Z 3 3をコードする部分を含む塩基配列である。

上記の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列に翻訳すると、以下のような配列になる。

VP I S GT VQ S AHL I I RFDENGVL LNN S F LD P EY WNF RNGD LTE GTAYTNAVGF PNL S AYPKS HG KTAKS N I VS QVYLNGDKTKPVTL T I T L N G T Q E TGL I KFNMQQQRRFYEALHD PNLNE EQRNAK I K S I R D D I D A S D T T P SAYSMS F SWDWS GHNY I N E I FAT S S YTF S Y.I AQE (配列番号 2 0 ) 下線を付した FNMQQQRR FYEALHD PNLNE EQRNA K I K S I RDD (配列番号 2 1 ) の 3 3アミノ酸が報告されている Z 3 3のアミノ酸配列である。さらに下線を引いたところは、 AC C GG T、 A g e Iサイト、および G-C T AG C、 N h e Iサイト、のそれぞれによってコードされるアミノ酸配列（それぞれ、 TGおよび A S) である。

"4 ) p W E 6. 7 R— F Z 3 3プラスミドの作製

p WE 6. 7 R - F/w t— 2プラスミドのファイバーの N末端部分をコードする領域を含む X b a lから B s t X I フラグメント、 pWE 6 · 7 R— FZw t— 2プラスミドのヒト 5型アデノウイルスのゲノムの右端までの領域を含む B amH Iから X b a l フラグメント、 p S K I I + Z 3 3プラスミドの Z 3 3モチーフを含む B s t X Iから B am H I フラグメントの 3者をライゲーシヨンし、 p WE 6. 7 R - F Z 3 , 3プラスミドを得た。

5 ) pAx 3 - F Z 3 3コスミド · プラスミドの作製

pAx 3の R s r I Iから C 1 a Iまでのヒト 5型アデノウイルスのゲノムの左端 3 5 7 b pを含むフラグメント（ 3 9 5 6 b pのフラグメント）、 ρΑχ 3の C 1 a lから E c o R Iまでのヒト 5型アデノウィルスの中央部分約 24 k b pのフラグメント、アデノウイルスゲノムの右手のファイバ一部分を含む p WE 6. 7 R— F Z 3 3の E c o R Iから R s r I I までのフラグメント、の 3者をライゲーシヨンし、 p Ax 3 — F Z 3 3コスミド ' プラスミド（約 3 5 k b p) を得た。その模式図を図 1 3— 2に示す。

6) pAx 3 - CAZ 3 (L) 一 F Z 3 3の作製

ベー夕 · ガラクトシダ一ゼを発現する p C A Z 3プラスミドは、 N a k amu r aら、 2 0 0 2 (前出）に記載されているプラスミドである。 p C A Z .3プラスミドからべ一夕 · ガラクトシダーゼ発現カセットを B amH Iおよび B g 1 I Iで制限酵素消化してから、 T 4DNAポリメラ一ゼで断端をブラントェシドとしたフラグメント（約 5 1 5 3 b p) ' を、 pAx 3— F Z 3 3コスミド ' プラスミドの Swa lサイト（C I AP処理）にクローニングした。ベー夕 ' ガラクトシダーゼ発現カセットの転写の方向がアデノウィルスの E 1ゲノムの転写方向に対して逆向き、すなわち左方向に向かっているものを選択し、 p Ax 3— CAZ 3 (L) — F Z 3 3とした。

7 ) pAx 3— CAE GF P (L) — F Z 3 3の作製

p CAE GF Pは以下のようにして得た。 E GF P ( e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n c e p r o t e i n) をコードする領域は、 C 1 o n t e c h社の p E GF P— N 1を購入して使用し、 N o t I制限酵素消化したのちに T'4 DNA ポリメラーゼで断端を平滑化し、さらに E c o R I制限酵素処理した。この E GF Pを含む断片を、 Y o s h i d aら、 1 9 9 8 (前出）に記載されている p C A c cプラスミドを B g 1 I I制限酵素消化したのちに T 4 DN A ポリメラ一ゼで断端を平滑化し、さらに E c o R I制限酵素処理した D N Aとライゲーシヨンし、 p C AE G F Pプラスミドを得た。

さらに、上記 p CAE GF Pから、 E GF P発現カセットを C 1 a I 制限酵素消化して約 2 9 8 6 b pの DNA断片として切り出し、 p Ax 3— F Z 3 3コスミド ' プラスミドの C l a lサイト（C I AP処理）にライゲーシヨンし、 E GF P発現カセッ卜の転写の方向がアデノウィルス E 1ゲノムの転写方向に対して逆向すなわち左方向に向かっているようなものを選択し、 p Ax 3— CAE GF P (L) - F Z 3 3とした。 (C. 組換えアデノウィルスの作製）

ベータ · ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス Ax 3 - CAZ 3 (L) — F Z 3 3、ならびに E G F Pを発現する組換えアデノウィルス Ax 3— CAE GF P (L) 一 F Z 3 3を、それぞれ以下のように作製した。

コスミド ' プラスミド pAx 3— CAZ 3 (L) — F Z 3 3、ならびに、 pAx 3— CAE GF P (L) — F Z 3 3をそれぞれ P a c I制限酵素消化した DNAを、すでに報告されている方法（U c h i d a e' t a 1. Mo l T h e r . 1 0 ( 1 ) : 1 6 2 - 1 7 1 , 2 0 0 4) を用いてアデノウイルス産生細胞 HE K 2 9 3細胞にトランスフエクトし、組換えアデノウイルスを得た。

具体的には、組換えアデノウイルスの作製のために、各コスミドを、 L i p o f e c t am i n e 2 0 0 0試 ( I n v i t r o g e n；を用いて、リポフエクシヨンにより 2 9 3細胞にトランスフエクトした。ドランスフェクトした 2 9 3細胞から生じるプラークを単離し、ウィルスゲノムの制限酵素消化および発現ュニットの配列決定により評価した。得られたアデノウイルスベクタ一を、 2 9 3細胞において拡大し、塩化セシウム超遠心分離によって精製した。精製したウィルスを、リン酸緩衝化生理食塩水（P B S) 中で、 1 0 %グリセロールとともに透析し、使用するまで一 7 0 で保存した。ウィルスの濃度 ( V p/m 1 ) を決定するために、ウィルス溶液を 0. 1 %ドデシル硫酸ナトリウム（S D S ) 中でインキュベートし、 A₂₆。を測定した（C. N.y b e r g-H o f f m a n e t a 1. , S e n s i t i v i t y n d r e p r o d u c i b i l i t y i n a d e n o v i r a l i n f e c t i o u s t i t e r d e t e r m i n a t i o n. N a t . Me d. 3 ( 1 9 9 7 ), p p . 8 0 8— 8 1 1 )。濃度を、 v p Zm 1 = A₂₆。 X ( 1. 1 X 1 0¹²) として決定した。使用前に、ウィルスストック中の複製コンビテントウィルスによる汚染を、

E 1 Aに特異的なプライマー：

フォワードプライマ一： 5 ' — ATTAC C GAAGAAATGGC C G C— 3 ' (配列番号 2 2),

リバ^-スプライマ一： 5 ' - C C CATTTAACAC GC CATG C A- 3 ' (配列番号 2 3) ;

E 1 Bに特異的なプライマー：

フォワードプライマ一： 5 ' — C GGCTGCTGTTGCTTTT T T G - 3 ' (配列番号 2 4)，

リバースプライマ一： 5·' -GTATCTTCATC GC TAGAG C C - 3 ' (配列番号 2 5) ;

E 2 Bに特異的なプライマー（陽性コントロール）：

フォワードプライマー： 5 ' -TC GTTT CTCAGCAGC TG T T G— 3 ' (配列番号 2 6)，

リバ一スプライマ一： 5 ' - CATC TGAAC TCAAAGC GT GG- 3 ' (配列番号 2 7 )

を ¾いる P C R分析によって排除した（W. W. Z h a n g e t a 1. , D e t e c t i o n o f w i l d— t y p e c o n t a m i n a t i o n i n a r e c omb i n a n t a d e n o v i r a 1 p r e p a r a t i o n b y P C R . B i o t e c h n i q u e s 1 8 ( 1 9 9 5 ), p p. 444-44 7)。アデノウイルスの感染は、基本的に以前に記載されているように行った（H. U c h i d a e t a 1. , 5— F l u o u r a c i 1 e f f i c i e n t l y e n h a n c e d a p o p t o s i s .i n d u c e d b y a d e n o v i r u s— me d i a t e d t r a n s f e r o f c a s p a s e— 8 i n D L D— 1 c o l o n c a n c e r e e l I s . J . G e n e M e d. 5 (2 0 0 3), p p. 2 8 7— 2 9 9 )。

組み換えアデノウイルス A d v - F Z 3 3シリーズの作製においては、適宜、明細書中で引用した文献が参照される。

(実施例 2. モノクローナル抗体ライブラリーの作製）

ハムスター細胞株 H a s細胞を B AL B/cマウスに免疫し、 H a s 細胞に対するモノクローナル抗体のライブラリ一を作成した。すなわち、 4回以上にわたって、 1週間から 2週間おきに、約百万個の H a s細胞を B AL BZcマウスに腹腔内投与した。最終免疫（ブースト）は、同量の細胞をマウス尾静脈から静脈注射した。最終免疫後 3日目に、マウスミエローマ細胞（P 3 U 1 ) とポリエチレングリコールを用いて細胞融合しハイプリドーマを作成した。細胞融合の方法、 HAT選択培地に' よるハイブリドーマの選択、ハイプリドーマのサブクロ一ニング、ハイプリドーマをマウス腹腔中に投与してマウス腹水癌を作製する方法、マウス腹水からマウス免疫グロブリンの精製、などの方法は、すべて、すでに報告されたスタンダードな方法（例えば、文献 H ama d a H a n d T s u r u o T, PNA S 8 3 ( 2 0 ) : 7 7 8 5 - 9 , 1 9 8 6 ) に従って行った。

'以下は、マウス腹水からマウス免疫グロプリンを精製する手順を示す。

(抗体の精製方法）

( I ) マウスの腹水を回収する

( 2 ) 1 5 0 0 r pmで 5分間遠心分離する

( 3 ) 上清を回収する

(4) 3 0 0 0 r pmで 5分間遠心分離する

( 5) 上清を回収する（約 1 0 m 1 )

(6 ) 回収した上清をフィルタ一（孔径： 0. 4 5 xm) にかけて濾過する

( 7 ) 濾液を l m l の P r o t e i n G— S e p h a r o s eゲルを用いて、室温で 3 0分間バッチ法で反応させる

(8 ) 1 0 m 1の結合緩衝液で洗浄する

(9 ) 洗浄レたゲルをカラムにアプライする

( 1 0 ) 1 0m 1 の結合緩衝液で洗浄する

( I I ) 6 m l の溶出緩衝液で溶出し、回収する（各フラクションは、 I O O I の 1 M T r i s緩衝液（p H 7. 5 ) に対して 1 m 1 を回収する）

( 1 2 ) 〇D₂₈。= 0. 3以上のフラクションを回収する

( 1 3 ) 回収したフラクションを P B Sで一晩透析する

( 1 4) 孔径 0. 2 2 のフィルターで濾過する

( 1 5.) OD ₂₈₀を測定する

( I g Gの場合、 OD₂₈。 1. 5 = 1 mg/m 1 )

上記モノクローナル抗体ライブラリーの作製においては、適宜明細書中で引用した文献が参照される。

(実施例 3. 標的化抗体のスクリーニング）

(ベータ ·ガラクトシダーゼの染色ならびに化学蛍光アツセィ）得られた抗体（ハイプリドーマの上清）を、 9 6ゥエルプレートに予め播種してある H a s細胞に反応させた後、レポーター遺伝子として L a c Zを発現する F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウィルス Ax 3 C A Z 3 _ F Z 3 3を感染させた。 24時間ないし 4 8時間後、化学発光 j6 — G a 1 レポーター； (A伝子アツセィ C h em i 1 um i n e s c e n t jS— G a 1 r e p o r t e r g e n e a s s a y) によって発現を確認し、高発現だったハイプリド一マのクローニングを行った。 2回サブクローニングを繰り返して、 2種類の異なるクローンから得られたハイブリドーマのクローンをそれぞれ S 1 1、 T 1 3と名付けた。なお、 S 1 1ハイプリドーマおよび T 1 3ハイプリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ I n t e r n a t i o n 1 P a t e n t O r g n i s m D e p o s i t a r y ： I P OD) に、それぞれ、受託.番号 F E RM P— 2 0 4 9 9および受託番号 F E RM P— 2 0 4 9 8で、 2 0 0 5年 4月 8 日付で寄託されている。

より具体的な手順を、以下に示す。

( 1 ) D a y 一 1 ：

• H a s細胞を 3 X 1 0³個 Zゥエルで 9 6ゥエルプレートに播種する

( 2 ) D a y 0 ：

·ハイブリドーマ上清を 5 0 1 /ゥエルでゥエルに添加し、 4°C で 1時間反応させる

•ゥエル当たり 1 0 0 2 1のリン酸緩衝化生理食塩水（P B S (—））で 2回洗浄する

•細胞当たり 3 X 1 0 個の Ax 3 CAZ— F Z 3 3粒子を感染さ- せる

• ゥエル当たり I O O I の P B S (—）で 1回洗浄する

♦培地を交換し〔培養液（ 1 0 %ゥシ胎仔血清（F B.S) を添加した DMEM 1 0 0 1 Zゥエル）を加え〕、 3 7 °Cで 2 4時間（または 48時間）インキュベートする

(3) D a y 1または 2 :

" 'ケミルミネッセンス i8— G a 1 レポーター遺伝子ァッセィを行う。測定は、 G a l a c t o L i g h t P l u s R e p o r t e r G e n e A s s y S y s t em : (R o c h e : T 1 0 1 1 ) を用いて、 Wa l l a c 1 4 2 0 AR VO (P e r k i n E l me r ) にて行った。以下、実施例 2〜 3に記載されるような抗体と Ad V - F X 3 3アデノウイルスとを用いる抗体の調製方法を、「本発明の A d v— F Z 3 3スクリ一ニング法」と呼ぶことがある。 (実施例 4. 抗体 S 1 1および抗体 T 1 3の抗原の同定）

抗体 S 1 1および T 1 3の抗原の同定を以下のような手順に従って行つ t

( 1 ) 得られた抗体が、どのような細胞に発現しているのかを F AC S C a l i b u r (B e c t o n D i c k i n s o n C o.) を用いたフローサイトメトリーにて確認した。

(2) 細胞表面をピオチンラベル後、各抗体と反応させて免疫沈降させた後、 SD S— PAGEを行い、ウエスタンプロットで膜にプロッティングし、 An t i — a v i d i n HR Pにてピオチンラベルされた夕ンパクを染色し、抗原の分子量を同定した。

( 3 ) 約 1 X 1 0⁹個の細胞 H a s細胞を用いて、免疫沈降を行い、 S D S— PAGEで分離した後、銀染色を行って可視化し、上記の抗原の分子量の大きさに相当する目的の抗原バンドを切り出した。

(4) このゲルを、トリプシン消化し脱塩後、 TO F測定、 MSZMS 測定し、データベース検索.しタンパク質同定を行った。以下、主な手順および結果を具体的に説明する。

(A. フローサイトメトリ一）

得られた抗体がどのような細胞に発現しているのかを、 F AC S C a l i b u r (B e c t o n D i c k i n s o n C o.) を用いてフロ一サイトメトリーによって確認した。細胞を、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（B S A) を含有する P B Sで 2回洗浄した。細胞を S 1 1ないし T"l 3、ないしコントロールマウス I g G 1などのモノクローナル抗体と反応させ、次いで、二次抗体としてフルォレツセインイソチオシァネ一トと結合体化させたャギ抗マウス I g G抗体で標識した。アイソ夕ィプの整合するコントロ一ルとして、マウス I g G l (e B i o s c i e n c e、 P 3株）を用いた。結果を、図 3— 1、図 3— 2、および図 3 一 3に示す。

図 3— 1は、 S 1 1の各種培養細胞株との反応性を示す F AC S解析の結果を示す図である。 H a s細胞、ヒト膝癌の一部、すなわち A s P C l、 M i a p a c a 2、前立腺癌の一部 2 2 R v 1、 LNC a p、ヒト肺癌の一部 L C - 2 / a dで陽性を示した。 P C 3前立腺癌および P D F (P r i ma r y d e r ma l f i b r o b l a s t ) 線維芽細胞、 P C 1 4肺癌， RERF— L C— K J肺癌で弱陽性を示した。その他の細胞では、陰性であった。 S 1 1抗体により認識される陽性細胞と S 1 1抗体により認識されない陰性細胞の区別が明確に存在するため、 S 1 1抗体を用いた PAP 2 aをマーカーとした診断法の感受性および特異性が高いこと、ならびに S 1 1抗体を用いた P A P 2 aを夕一ゲットとした標的治療の特異性が高いことが、強く裏付けられた。このように、本実施例により、本発明の抗体スクリーニング方法を用いて、診断マーカーとして感受性および特異性のいずれも高く、標的療法に極めて最適化された抗体および抗原分子を直接かつ迅速にスクリ一ニングできることが示された。なお、図中、 H a sはハムスター細胞株、 M i a p a c a 2はヒト滕癌細胞、 P a n c 1はヒト膝癌細胞、 B x P C 3はヒト膝癌細胞、 A s P C 1は ·ヒト膝癌細胞、 P C 3はヒト前立腺癌細胞、 - 2 2 R v 1はヒト前立腺癌細胞、 LNC a pはヒト前立腺癌細胞、 H s 6 9 5 Tはヒト悪性黒色腫細胞、 A 3 7 5はヒト悪性黒色腫細胞、 MK N 7 4はヒト胃癌細胞、 MKN 4 5はヒト胃癌細胞、 TT nはヒト食道癌細胞、 P D Fはヒト初代培養線維芽細胞、 H e 1 aは、ヒト子宮癌細胞、 L C_ 2Z a dはヒト肺癌細胞、 P C 1 4はヒト肺癌細胞、 RER F— L C— K Jはヒト肺癌細胞を示す（以下の図においても同様）。図 3 - 2は、 T 1 3の各種培養細胞株との反応性を示す F AC S解析の結果を示す図である。 T 1 3は、 S 1 1と全く同じ染色パターンを示した。 H a s細胞、瞵癌の一部 A s P C l、 M i a p a c a 2 , 前立腺癌の一部 2 2 R v l、 LNC a p、ヒト肺癌の一部 L C— 2 Z a dで陽性を示した。 P C 3前立腺癌、 PD F (P r i ma r y d e r ma l f i b r o b l a s t ) 線維芽細胞、 P C 1 4肺癌， RE R F— L C— K J肺癌で弱陽性を示した。その他の細胞では、陰性であった。 T 1 3 抗体により認識される陽性細胞と T 1 3抗体により認識されない陰性細胞の区別が明確に存在するため、 T 1 3抗体を用いた PAP 2 aをマーカーとした診断法の感受性および特異性が高いこと、ならびに T 1 3抗体を用いた P A P 2 aを夕一ゲットとした標的治療の特異性が高いことが、強く裏付けられた。このように、本実施例により、本発明の抗体スクリ一二ング方法を用いて、診断マーカ.一として感受性および特異性のいずれも高く、標的療法に極めて最適化された抗体および抗原分子を直接かつ迅速にスクリ一ニングできることが示された。

図 3— 3は、 S 1 1抗体の各種培養細胞株との反応性を示す F AC S 解析の結果を示す図である。ヒト腌癌 M i a p a c a 2 , 前立腺癌 2 2 R v 1、ヒト肺癌 A 54 9、ヒト卵巣癌細胞 S K— OV— 3で陽性を示した。ヒト卵巣癌細胞 RMG— 1で弱陽性、ヒト乳癌細胞 S K— B r— 3細胞では、陰性であった。なお、図中、 M I AP a c a 2はヒト膝癌細胞、 2 2 R V 1はヒト前立腺癌細胞、 A 54 9はヒト肺癌細胞、 RM G— 1はヒト卵巣癌細胞、 SK—〇V— 3はヒト卵巣癌細胞、 S K— B r— 3はヒト乳癌細胞を示す（以下の図においても同様）。図 3— 4は、 T 1 3抗体の各種培養細胞株との反応性を示す FA C S 解析の結果を示す図である。 T 1 3抗体は、図 3— 3に示した S 1 1抗体の反応性と全く同じ染色パターンを示した。すなわち、ヒト膝癌 M i a p a c a 2 , 前立腺癌 2 2 R v l、ヒト肺癌 A 5 49、ヒト卵巣癌細胞 S K— O V— 3で陽性を示した。ヒト卵巣癌細胞 RMG— 1で弱陽性、ヒト乳癌細胞 S K— B r一 3細胞では、陰性であった。

(B. 細胞表面タンパクのピオチン化）

H a s細胞表面のタンパク質について、以下の手順でピオチン標識した。 1 X 1 0⁷個の細胞に対して 1. 5mgの E Z— L i n k S u 1 f o— NHS - B i o t i n (P I E R C E社、製品番号： 2 1 2 1 7) を 1 5m l P B S (—）中で使用した。細胞とピオチンとの混合物を、室温 3 0分で反応させ、 1 0 0 mM G l y c i n e P B S (―) にて洗浄することによって反応を停止させた。

(C. 免疫沈降）

ピオチン標識した H a s細胞 1 1 X 1 0⁷個を回収し、氷冷 P h o s P h a t e B u f f e r e d S a l i n e リン酸緩衝生理食塩水 (P B S (一））にて洗浄し、最終的に 5 0m lチューブに遠心によって細胞を回収した。次いで、 2 0 m l の氷冷 L y s i s B u f f e r ( 1 %NP 40、 5 0 mM T r i s - HC 1 p H 7. 6、 1 5 0m M N a C 1 , プロテア一ゼィンヒビ夕一力クテルとして C omp 1 e t e E D TA— f r e e (R o c h e：カタログ番号 1 1 8 7 3 5 8 0 0 0 1 ) を使用した）に細胞を懸濁し、氷上にて 1時間静置し、可溶化した。次いで、この細胞可溶化液を遠心機（ΤΟΜΥ : ΜΧ— 1 5 0 ： □—夕一 TMP— 1 1 ) において、 1 5 0 0 0 r pm (X 1 7 3 6 0 g)、 4 で 3 0分間遠心し、上清を新しい 5 0 m lチューブに移した。この上清に、 1 m l の 5 0 % (vZv) の P r o t e i n G S e p h a r o s e (登録商標） 4 F a s t F 1 o w (Am e r s h am B i o s c i e n c e s : コード番号 1 7— 0 6 1 8— 0 2) を加え、口一タリーシエイ力にこの溶液の入ったチューブを固定し、 4で' で 2時間回転して攪拌した。遠心機（KUBOTA : 8 9 0 0 : ロータ一 R S— 3 0 1 0 M) において、 1 5 0 0 r pm (4 7 0 X g)、 4 で 5分間遠心した後、上清を新しい 1 5m lチューブに 6m 1ずつ移した。次いで、 S 1 1抗体（ I g G 1 k)、 T 1 3抗体（ I g G 1 k)、およびコントロール抗体として M o u s e I g G 1 k I s o t y p e C o n t r o l (e B i o s c i e n c e ： C 1 o n e P 3 : # 1 6— 4 1 4一 8 5 ) の各抗体 5 gを、上清に加えた後、 4°Cで 1時間反応させた。この混合溶液に 5 0 x l の 5 0 % (vZv) の P r o t e i n G S e p h a r o s e (登録商標） 4 F a s t F 1 owを加え、さらに、ロータリーシエイカーにチューブを固定し、 4°Cで 1時間回転して攪拌した。次いで、遠心機（TOMY ： MX- 1 5 0 : ロー夕 — TM P - 1 1 ) において、上記混合溶液を、 5 7 0 0 r pm (2 5 0 0 X g)、 4°Cで 1分間遠心した後、上清を除去した。

氷冷 L y s i s B u f f e rを 1 0m l加えて攪拌した後、遠心機で S e p h a r o s eビーズを沈殿させ、上清を除去した。この洗浄の操作を計 6回繰り返した。

遠心によって集めたビーズに、 2.5 1の（X I ) S D S s amp 1 e B u f f e r— 5 % 2 MEを加え、 1 0 0 °Cに熱したヒートブロック上で 5分間熱処理した。遠心機（TOMY : MX— 1 5 0 : ロータ — TMP— 1 1 ) において、 5 7 0 0 r pm (2 5 0 0 X g)、 4°Cで、 1分間遠心後、上清を免疫沈降用サンプルとして使用した。

(D. S D S - PAGE)

上記免疫沈降用サンプルを使用して、 SD S— PAGEを行った。泳動漕には、ミニプロテアン 3セル (B i o _R a d ：カタログ番号 1 6 3 - 3 3 0 1 ) を使用した。ポリアクリルァミドゲル（ 5〜 2 0 %グラデイエント）には、 R e a d y G e l s J (B i o—R a d : 力夕ログ番号 1 6 1— J 3 7 1 ) を用いた。分子量マーカ一には、 P r e c i s i o n P l u s P r o t e i n S t a n d a r d s D u a 1 C o l o r (B i o— R a d : カタログ番号 1 6 1— 0 3 7 · 4) を使用した。定電流 2 0mAで 5 0分間で泳動した。

(E. 銀染色）

銀染色 M Sキット（和光：コード番号 2 9 9— 5 8 9 0 1 )を用いた。図 4は、免疫沈降サンプルのウエスタンブロットおよび銀染色の結果を示す電気泳動写真である。 S 1 1 と T 1 3は同じパターンを示すことが示された。 3 0 k D aと 3 7 k D aの二つのバンドが認められ、これらが、抗体によって認識される抗原である。 S 1 1で免疫沈降されてくるバンドの内、約 3 0キロダルトンのバンドを質量分析に用いた。

( F . 質量分析および相同性検索）

株式会社日立サイエンスシステムズにァゥトソーシングで依頼した。簡単に説明すれば、上記ウェスタンプロットからのバンドを切り出し、トリプシン消化し、脱塩後、 T OF測定および MS /MS測定し、デー夕ベース検索を行った。

質量分析、データベース検索に使用した機種、検索用ソフト、およびデータベースは、以下の通りである。

質量分析器： MU L D I — Q q— T〇 F M S / S Q S TAR P u l s a r I (アプライドバイォシステム）

データベース検索ソフト： MAS C OT

デ一夕ベース： N CB I n r (Huma n)

図 5は、質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになった 2つのべプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒト P AP 2 aのアミノ酸配列の一部と一致することがわかった（図 5において、相同性検索でヒットした配列を下線で示す）。これにより、 S 1 1および T 1 3に対する抗原が、 P AP 2 aである可能性が非常に高いことが示された。

(実施例 5. 抗原の同定：質量分析および相同性検索の結果を確認するための実験 1 )

(A. 免疫沈降用サンプルの調製）ピオチン標識した H a s細胞 7 X 1 0 ⁷個を回収し、氷冷 P h o s p h a t e B u f f e r e d S a l i n e Zリン酸緩衝生理食塩水 (P B S (一））にて洗浄し、最終的に 1 5 m lチューブに遠心によって細胞を集めた。次いで、 3. 5 m l の氷冷 L y s i s B u f f e r ( l % N P 4 0、 5 0 mM T r i s — H C 1 p H 7. 6、 1 5 0 mM N a C しプロテア一ゼインヒビ夕一カクテルとして C o m p 1 e t e E D TA— f r e e (R o c h e ：カ夕口グ番号 1 1 8 7 3 5 8 0 0 0 1 ) を使用）に細胞を懸濁し、氷上に 3 0分間静置し、可溶化した。次いで、この細胞可溶化液を遠心機（T OMY : MX— 1 5 0 : ロータ — TMP— 1 1 ) において、 1 5 0 0 0 r pm (X 1 7 3 6 0 g)、 4 °C で 3 0分間遠心し、上清を新しい 1 5 m 1チューブに移した。この上清 (上清 Aとする）から、細胞可溶化液の一部（ 1 0 0 1 ) を取り分けて、（X 3 ) S D S s a mp l e B u f f e r — 1 5 % 2 — M e r c a p t o e t h a n o l (. M E ) 5 0 1カロえ、 wh o l e c e 1 1 1 y s a t eのサンプルとした。残りの上清 Aに 2 0 0 1の 5 0 % (vZv) の P r o t e i n G S e p h a r o s e (登録商標） 4 F a s t F l o w Am e r s n a mB i o s c i e n c e s ：コ一ド番号 1 7 — 0 6 1 8 — 0 2 ) を加えた。

口—夕リーシエイカーに、上記サンプルの入ったチューブを固定し、 4°Cで 2時間回転して攪拌した。遠心機（KU B O TA ： 8 9 0 0 ：口一夕一 R S — 3 0 1 0 M)において、 1 5 0 0 r p m ( 4 7 0 X g)、 4 °C で、 5分間遠心した後、上清を新しい 1 . 5 m 1チューブに 5 0 0 1 ずつ移した。この上清に、以下の各抗体 5 gを加えた：

-抗 2 &抗体（ゥサギポリクローナル抗体）

·抗？ A P 2 b抗体（ゥサギポリクロ一ナル抗体）

• S 1 1抗体（ I g G _{l k})

• T 1 3抗体（ I g G _{l k})、ならびに

コントロ一ル抗体として、

'マウス I g G _{l k} アイソタイプコントロール（e B i o s c i e n c ■ e ： C 1 o n e P 3 : # 1 6— 4 7 1 4— 8 5)、および •正常ゥサギ血清（D AKO ：コード番号 X 0 9 0 2 )。

4°Cで 1時間反応させた。それぞれの液に、 40 1 の 5 0 % (vZ V ) の P r o t e i n G S e p h a r o s e (登録商標） 4 F a s t F l ow を追加し、ロータリーシエイカーにチューブを固定して、 4°Cで 1時間回転して攪拌した。遠心機（ΤΌΜΥ : ΜΧ_ 1 5 0 : ロー夕一 ΤΜΡ— 1 1 ) において、 5 7 0 0 r pm ( 2 5 0 0 X g ), 4°Cで 1分間遠心した後、上清を除去した。

氷冷 L y s i s B u f f e rを l m l加えて攪拌した後、遠心機で S e p h a r o s eビーズを沈殿させ、上清を除去した。この洗浄の操作を計 6回繰り返した。

遠心によつて集めたビーズに、 2 0 lの（X l ) S D S s amp 1 e B u f f e r— 5 % 2MEを加え、 1 0 0 °Cに熱したヒートブロック上で 5分間熱処理した。遠心機（TOMY : MX— 1 5 0 : ロータ一 TMP— 1 1 ) において、 5 7 0 0 r pm (2 5 0 0 X g)、 4でで、 1分間遠心後、上清を免疫沈降 S D S一 PAGE解析用サンプルとして使用した。

(B . S D S— PAGE)

上記免疫沈降用サンプルを使用して、 S D S— P AG Eを行った。泳動漕はミニプロテアン 3セル（B i o— R a d ：カタログ番号 1 6 3 - 3 3 0 1 ) を使用した。ポリアクリルアミドゲル（ 5〜 2 0 %グラデイエント）は、 R e a d y G e l s J (B i o— R a d : カタログ番号 1 6 1— J 3 7 1 ) を用いた。分子量マ一カーには、 P r e c i s i o n P l u s P r o t e i n S t a n d a r d s D u a l C o l o r ( B i o - R a d ：力夕口グ番号 1 6 1— 0 3 7 4) を使用した。定電流 2 0 mAで 5 0分間泳動した。

(C. 免疫ブロッテイング法（ウエスタンプロット法））

ウエスタンプロット法による免疫ブロッテイングは、常法に従い、以下の材料を用いて行った。 •セミドライ式トランスファー装置（ADVANTE C : E B— 1 5 0)

• PVDFメンブレン I mm o b i l o p n— P (0. 4 5 urn) (M i 1 1 i p o r e ： I PVH 2 0 2 0 0)

·定電流 1 00mAで 6 0分間でトランスファー。

プロッキングは以下の溶液で行った：

·'ブロッキング液（ 5 %スキムミルク ZP B S— 0. 0 5 % Tw e e n 2 0 ) で室温 2時間

1次抗体反応は、以下の抗体：

·抗 P A P 2 a抗体（ l g/m l —ブロッキング液）および

•抗 P A P 2 b抗体 ( 1 a gXm 1 一ブロッキング液）

を用いて、シエイカーに載せ 4°Cでオーバーナイ卜で反応させることによつて行った。

2次抗体反応は、以下の抗体：

- An t i — r a b b i t I g, Ho r s e r a d i s h P e r o x i d a s e 1 i n k e d F ( a b ' ) ₂ f r a gme n t (Am e r s h a m B i o s c i e n c e : コード番号 N A 9 3 40 ) を用いて行った。

化学発光による検出ば、以下の試薬を用いて行った：

· E C L We s t e r n B l o t t i n D e t e c t i o n R e a g e n t s (Ame r s h am B i o s c i e n c e : コード番号 R P N 2 1 0 6 )。

結果を、図 6に示す。各抗体で免疫沈降し、抗 PAP 2 aポリクロ一ナル抗体（上のカラム）、抗 P A P 2 bポリクローナル抗体（下のカラム）、それぞれで免疫プロット解析した。これらのポリクローナル抗体は、札幌医科大学の生化学第 2講座、加納英雄教授から供与していただいたゥサギ抗血清である。

上のカラム：抗 PAP 2 aポリクローナル抗体は 4, 6， 7と反応した。下のカラム：抗 PAP 2 bポリクロ一ナル抗体は、 5のみと反応した。すなわち、 S l l、 T 1 3で濃縮されて免疫沈降されてくる約 3 0キロダルトンのバンドは、抗 PAP 2 aポリクローナル抗体と反応する。これにより、 S 1 1と T 1 3抗体の認識する抗原は P A P 2 aであることが確認された。

('実施例抗原の同定：質量分析および相同性検索の結果を確認するための実験 2)

(A. フロ一サイトメトリー）

CHO細胞に、 PAP 2 a (L P P 1 )、 P A P 2 b (L P P 3)、および PAP 2 c (L P P 2) をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、 S 1 1抗体および T 1 3抗体が PAPのどのアイソフォ —ムに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した。

CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）を、 6ゥエルの M i c r o p 1 a t e ( I WAK I ： 3 8 1 0 - 0 0 6 ) に 5 X 1 0⁵個播種した。翌日、 CHO細胞に、 L i p o f e e t AM I N E P LU S (登録商標） R e a g e n t ( Ln v i t r o g e n : 1 1 5 1 4 - 0 1 5) を用いて、以下のプラスミドの遺伝子導入をそれぞれ行た。 • p h PAP 2 a YF P

- p h PAP 2 b YF P

• p h PAP 2 c YF P

遺伝子導入 4 8時間後、ゥエルの培養液を除去し、各細胞を T r y p s i n— EDTA s o l u t i o n (S I GMA : T 3 9 2 4) にて浮遊させ回収した。その後、 P h o s p h a t e B u f f e r e d S a 1 i n e /リン酸緩衝生理食塩水（P B S (—））にて洗浄した。次いで、各遺伝子導入した CHO細胞を、 3 X 1 0⁵/ 1 0 0 1 / 1. 5m l t u b eに調整し、これに 1次抗体として S 1 1抗体または T 1 3抗体を、それぞれ 1 ^ g加え、氷上で 3 0分間反応させた。コントロール抗体として M o u s e I g G 1 k I s o t y p e C o n t- r o l ( e B I O S C I E N C E、 P 3株）を使用した。

反応後、遠心機（T〇MY : MX— 1 5 0 ：ロータ一 TM P— 1 1 ) において、 2 5 0 0 r p m ( 4 0 0 X g ) で 5分間遠心した。上清を除き、細胞ペレツトを P B S (—） 1 m l に懸濁洗浄し、再度 2 5 0 0 r pm ( 4 0 0 X g) で 5分間遠心した。これを 2回繰り返した。

細胞洗浄後、各細胞を P B S (—） 1 0 0 l にて懸濁し、これに 2 次饥体として A n t i m o u s e I mm u n o g 1 o b u 1 i n s R P E (フィコエリスリン）， G o a t F ( a b ') ₂ (DAKO ： R 0 4 8 0 ) を g加え、氷上で 3 0分間反応させた。反応後、遠心機（T OMY ： MX - 1 5 0 ：口一ター TMP— 1 1 ) において、 2 5 0 0 r p m (X 5 0 0 g ) で 5分間遠心した。上清を除き、細胞べレットを P B S (—） 1 m l に懸濁洗浄し、再度 2 5 0 0 r pm ( 5 0 0 g) で 5分間遠心した。これを 2回繰り返した。

細胞洗浄後、細胞を P B S (—） 5 0 0 1 に懸濁し、セルストレーナ一キヤップ付き 5 m lポリスチレンラウンドチューブ（B e c t o n D i c k i n s o n : 3 5 2 2 3 5 ) に移した。調整した各サンプルを、 F AC S C a l i b u r (B D B i o s c i e n c e ) にて解析した。結果を、図 7 — 1および図 7 — 2に示す。

図 7 — 1は、 P A P 2 a (L P P 1 )、 P A P 2 b (L P P 3)、および P A P 2 c (L P P 2 ) をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、 S 1 1抗体が P A Pのどのァイソフォームに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。上のカラムは各プラスミドのトランスフエクション効率である。中のカラムは各トランスフエクタントに対して S 1 1を用いて F A C S解析を行った結果である。

下のカラムは、中のカラムのデータで、コント口一ル（プラスミドを十ランスフエクトしない C HO細胞）のデータ（中のカラムの一番左）を各トランスフエク夕ントのデータと重ね合わせたものである。 P AP 2 aをコードする c D NAを発現するプラスミドをトランスフエクトした' 細胞だけが、 S 1 1抗体との反応性を獲得することが示された。これにより、 S 1 1抗体の抗原は P A P 2 aであることが確認された。

図 7— 2は、 PAP 2 a (L P P 1 )、 P A P 2 b (L P P 3)、および PAP 2 c (L P P 2 ) をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、 T 1 3抗体が PAPのどのァイソフォームに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。上のカラムは各プラスミドのトランスフエクション効率である。下のカラムは各トランスフエクタントに対して T 1 3を用いて F AC S解析を行った結果である。 PAP 2 aをコードする c DN Aを発現するプラスミドをトランスフエクトした細胞だけが、 T 1 3抗体との反応性を獲得することが示された。これにより、 T 1 3抗体の抗原は PAP 2 aであることが確認された。

(B. 免疫組織染色（蛍光染色と共焦点レーザー顕微鏡による観察））一次抗体として、 PAP 2 a (S 1 1 ： I g G 1 ) を、二次抗体として、 A l e x a F l u o r 4 8 8 -G o a t An t i — Mo u s e I g G ( I n v i t r o g e n (Mo l e c u l a r P r o b e s ： A- 1 1 0 2 9 ) を使用した。 2ゥエルのカルチャースライド（C u 1 t u r e S l i d e ) (B e c t o n D i c k i n s o n :力夕口グ番号 3 54 1 1 2 ) に、 H a s細胞を 1 X 1 0⁴個 Zゥエルで播種し、翌日、 P B S (—）で 2回洗浄し、次いで、下記の各固定液で、示された時間、固定した。

4 % P a r a f o r m a l d e h y d e 室温 3 0分

1 0 %中性緩衝ホルマリン液室温 3 0分

次いで、上記カルチャースライドを P B S (―) で 2回洗浄した後、 0. 1 % T r i t o n X (P B S (—））とともに、室温で 5分間ィンキュペートし、次いで、 P B S (―) 中の 1 0 %正常ャギ血清（No r ma 1 g o a t s e r um) (以下、「NG S」と呼ぶ）とともに、室温で 3 0分インキュベー卜した。

次いで、一次抗体と反応させるために、上記カルチャースライドを Ν· G S中、 5 gZm l 抗 PAP 2 a抗体 S 1 1またはコントロールマウス I g G 1 (P 3株）とともに室温で 3 0分間インキュベートし、その後 P B S (—）で 3回洗浄した。次いで、二次抗体と反応させるために、上記カルチャースライドを NG S中のノ m 1 A 1 e x a F l u o r 4 8 8— G o a t An t i -Mo u s e I g G ( I n v i t r o g e n (Mo 1 e c u l a r P r o b e s ： A— 1 1 0 2 9) とどもに、室温で 3 0分間インキュベートし、その後 P B S (—）で 3回洗浄した。

次いで、カルチヤ一スライドを、 DAP I (4 '， 6 d i am i d i n o— 2— p h e n y l i n d o 1 e ) を用いて VE C TASH I E L D (登録商標）（VE C TOR : H— 1 2 0 0 ) にて核カウンター染色して、マウントし、正立型共焦点顕微鏡において、 B I ORADZR 2 1 0 0 AG 2にて観察した。結果を、図 8および図 9に示す。

図 8は、抗 P AP 2 a抗体 S 1 1による免疫組織染色の写真である。図 8の上段の写真は、 S 1 1による染色、下段の写真は、コントロールマウス I g G l (P 3株）による染色を示す。この図から、 H a s細胞， 2 2 R V 1は P A P 2 a陽性であることがわかる。このように、 S 1 1 抗体は、 PAP 2 aが陽性の細胞を、組織染色で染めることが可能である。

図 9は、各種固定法を用いた H a s細胞での P A P 2 a発現の状況を示す免疫組織染色の写真である。図 9の上段の写真は、 S 1 1による染色、下段の写真は、コントロールマウス I g G lによる染色であり、この写真から、 S 1 1を用いた場合、組織の固定法としては、パラフオルムアルデヒド、 1 0 %フオルマリンなどで固定しても、それぞれ PAP 2 aの染色が可能であることが示された。 T 1 3抗体を用いた場合も同様の結果が得られた。

(C. 化学発光 /3— G a 1 レポ一夕一遺伝子アツセィ）

図 1 0は、 H a s細胞を Ax 3 CAZ 3— F Z 3 3を用いて感染した場合の、 H a s細胞に対する A X 3 CAZ 3 - F Z 3 3の感染効率を、 . 化学発光 ;6— G a 1 レポ一夕一遺伝子アツセィの結果を示すグラフである。この実験は、以下に示す手順に従って行った。

( I ) H a s細胞を 1 X 1 0⁴個 Z l O O z l Zゥエルの濃度で 9 6ゥエルのマイクロタイタープレート（ I WAK I ) に分注する

(2) 3 7 °Cで 2 4時間インキュベートする

( 3) 培養液を除去する

C ) ヴエル当たり 2 0 0 1 の P B S (—）で 1回洗浄する

( 5) 抗体 S 1 1または T 1 3を、 P B S (—）中 0. 1 z gZゥエル / 1 0 0 X 1でゥェゥに添加し、 4 °Cで 1時間インキュベートする

( 6 ) ゥエル当たり 2 0 0 1 の P B S (-) で 1回洗浄する

(7) Ax 3 CAZ 3 - F Z 3 3を感染（ 1 0 0 0 v p / c e 1 1 ) させる

(8) 4 °Cで 1時間インキュベートする

(9) P B S (一）で 2回洗浄する

( 1 0) 培養液（ 1 0 % F B Sを含む DMEM) をゥエル当たり 1 0 0 H 1加える

( I I ) 3 7 °Cで 24時間インキュベートする。

上記サンプルを用いて、 G a l a c t o L i g h t P l u s R e p o r t e r G e n e A s s a y S y s t em : (R o c h e : コード番号 T 1 0 1 1 ) を用いて、化学発光 iS -G a l レポ一ター遺伝子アツセィを行った。測定は、 W a 1 1 a c 1 4 2 0 AR VO (P e r k i n e l me r ) にて行つた。なお、各サンプルの夕ンパク量は、 B CA P r o t e i n A s s a y K i t (P I E R C E :

2 3 2 2 7 ) にて測定した。

図 1 0中、 NTは、処理なしの場合、 Adは、 Ax 3 CAZ 3— F Z

3 3アデノウイルスのみを用いた場合、 I g G 1は抗体としてコントロールマウス I g G 1を用いた場合、 S 1 1および T 1 3は、それぞれ抗体として S 1 1および T 1 3モノク口一ナル抗体を用いた場合を示す。図 1 0に示されるように、 .S 1 1抗体、 T 1 3抗体を用いて、 F Z 3 3· アデノウイルスによる L a c Zレポーター遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウィルス単独 A d、コントロールの I g G lを加えたもの）に比較して、約 7 0倍と非常に高い L a c Zレポーター遺伝子導入発現の増加が得られた。この結果から、 S 1 1および T 1 3抗体がアデノウィルスベクターを用いた遺伝子導入に有用であることが示された。

'図 1 1 _ 1 Aは、 H a s細胞に対する Ax 3 CAZ 3 - F Z 3 3の感染効率を、予め抗体を用いて処理していない場合（左から 2列目）、 I g G 1で処理した場合（左から 3列目）、および S 1 1を用いて処理した場合（左から 4列目）について、それぞれ 3 0 0 v i r a l p a r t i c l e s (v p) /e e l 1、および l O O O v pZc e l 1のべクタ一用量で A X 3 CAZ 3 -F Z 3 3を用いて H a s細胞を感染させ、 E GF Pを発現させた場合の、化学発光 )6 -G a l レポーター遺伝子発現アツセィの結果を示すグラフである。示されるように、 3 0 0 v pZc e 1 1 の場合、 S 1 1を用いたときには、 7 ,8. 1 %感染したのに対して、コント口一ルマウス I g G 1を用いたときは、 3. 9 %の感染があるのみであった。同様に、 l O O O v p/c e l l の場合、 S 1 1を用いたときには、 9 5. 5 %感染したのに対して、コントロールマウス I g G lを用いたときは、 1 5. 9 %の感染があるのみであった。

この結果から、 S 1 1抗体を用いて、 F Z 3 3アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独 A d、コントロールの I g G 1を加えたもの）に比較して、きわめて高い E GF P遺伝子導入発現効率の増加が得られることが示された。

図 1 1一 1 Bは、膝癌細胞である M i a p a c a 2に対するアデノゥィルスベクターの感染効率を、図 1 1— 1 Aの場合と同様に、 E GF P を発現する Ax 3 CAZ 3 - F Z 3 3を用いてフローサイトメトリーで評価した結果を示すグラフである。示されるように、コントロールマウス I g G 1で予め処理した M i a p a c a 2では、 3 0 0 v pZc e l 1のベクター用量で 1 2. 3 %の感染を示し、 l O O O v pZc e l l - のベクター用量では 4 5. 6 %の感染効率を示したのに対して、 S 1 1 で予め処理した M i a p a c a 2では、 3 0 0 v pZc e l lおよび 1 O O O v p/c e l 1のベクター用量でそれぞれ、 3 5. 5 %および 7 6. 5 %という上昇した感染効率を示した。

この結果から、 S 1 1抗体を用いて、 F Z 3 3アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独 Ad、コンートロールの I g G 1を加えたもの）に比較して、高い E G F P遺伝子導入発現効率の増加が得られる。

図 1 1一 1 Cは、 Ax 3 CAZ 3— F Z 3 3のヒト前立腺癌細胞 2 2 R V 1に対する感染効率を、 S 1 1で細胞を前処理した場合と、コントロールマウス I g G 1で細胞を前処理した場合とで比較して示す、フロ一サイトメトリー実験から得られたグラフである。示されるように、コントロールマウス I g G lで予め処理した 2 2 R v lでは、 3 0 0 v p / c e 1 1および 1 O O O v p/c e 1 1 のベクター用量のときに、それぞれ 5 6. 8 %および 8 9. 8 %の感染を示したのに対して、 S 1 1 で予め処理した 2 2 R v lでは、 3 0 0 v p/c e l lおよび 1 0 0 0 V p / c e 1 1 のベクター用量のときに、それぞれ 6 9. 1 %および 9 2. 3 %の感染を示した。このように、コントロールマウス I g G 1で予め処理した場合と、 S 1 1で予め処理した場合とで、 Ax 3 CAZ 3 一 F 3 3の 2 2 R v lに対する感染効率は、いずれも高いものであるが、これらの間に実質的な差違は見出されなかった。すなわち、もともとァデノウィルスによる遺伝子導入効率が高い前立腺癌 2 2 R v 1のような細胞では、あまり顕著な感染効率の上昇は得られないものと推察された。図 1 1— 1 Dは、別のヒト前立腺癌細胞である P C 3に対する Ax 3 C A Z 3— F 3 3の感染を、該細胞をコントロールマウス I g G 1で前処理した場合と S 1 1で前処理した場合とで比較した場合の、フローサィトメトリー実験から得られた結果を示すグラフである。示されるように、コントロールマウス I g G 1を用いた場合（左から 3列目； 6. 5 %) も、 S 1 1を用いた場合（左から 4列目； 9. 3 %) も、 P C 3に対す- る感染効率は、抗体による前処理を施していない場合（左から 2列目； 4. 3 %) とほとんど変化していないという結果が得られた。このように、この前立腺癌 P C 3のような P AP 2 a弱陽性ないし陰性の細胞は、 S 1 1抗体を用いて、 F Z 3 3アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなっても、コントロール（アデノウイルス単独 A d、コントロールの I g G lを加えたもの）に比較して、有意に高い E G F P遺伝子導入発現効率の増加は得られない。換言すれば、この抗体の選択性が高いということであり、 P AP 2 a弱陽性ないし陰性の正常細胞への影響も少ないことが期待される。

図 1 1— 2 Aは、 H a s細胞に対する F Z 3 3アデノウィルスの感染効率に対する T 1 3の効果を、 E G F Pを発現する A X 3 C A Z 3 - F Z 3 3を用いて、ベクタ一用量 3 0 0 v pZc e l 1および Ι Ο Ο Ο ν p/ c e l lで、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。示されるように、 T 1 3で細胞を前処理した場合（3 0 0 v p/c e 1 1で 7 6. 9 % ； 1 0 0 0 v p/ c e 1 1で 9 4. 5 %)、コントロールマウス I g G 1で前処理した場合（3 0 0 v pZc e l l で 3. 9 % ; 1 0 0 0 v pZc e l lで 1 5. 8 %) と比較して、顕著に感染効率が増大することがわかる。この結果は、 H a s細胞の場合、 T 1 3抗体を用いて、 F Z 3 3アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウィルス単独 A d、コントロールの I g G 1を加えたもの）に比較して、きわめて高い E G F P遺伝子導入発現効率の増加が得られることを示す。

図 1 1 _ 2 Bは、膝癌細胞である M i a p a c a 2に対する F Z 3 3 アデノウイルスの感染効率に対する T 1 3の効果を、 E GF Pを発現する Ax 3 C AZ 3— F Z 3 3を用いて、ベクター用量 3 0 0 v p Z c e 1 1および l O O O v pZ c e l 1で、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。示されるように、 T 1 3で細胞を前処理した場合（3 0 0 v pZc e l 1で 3 3. 4 % ； 1 0 0 0 v p/c e l lで 7 8. 3 %)、コント.ロールマウス I g G 1で前処理した場合（ 3 · 0 0 v p / c e 1 1で 1 2.2 %; 1 0 0 0 v p/c e l 1で 4 5. 1 %) と比較して、感染効率が増大することがわかる。この結果は、 M i a p a c a 2細胞に対して、 T 1 3抗体を用いて、 F Z 3 3アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独 A d、コントロールの I g G lを加えたもの）に比較して、高い E GF P 遺伝子導入発現効率の増加が得られることを示す。

'図 1 2は、 S 1 1で前処理した場合の各種細胞に対する Ax 3 CAE GF P - F Z 3 3の感染効率を示す実験のうち、 H a s細胞及び P D F の混合培養について解析した結果を示す。予め、 PAP 2 a弱陽性のヒト PD F細胞（初代培養ヒト · フアイプロブラスト、線維芽細胞）にブルーの色素（C e l l T r a c k e r B l u e CMAC ( 7 - a m

1 n o— 4 c h 1 o r ome t h y 1 c o u m a r i n ) : M o 1 e c u 1 a r P r o b e s ) を、 5m l DMEM- F B S (-) 1 0m M CMAC中で 2 X 1 0⁵個の P D Fを加え、 3 7 °Cで 4 5分間インキュペートすることにより、取り込ませた。次いで、 2ゥエルのカルチヤースライド（C u l t u r e S l i d e) に、 1ゥエル当たり 2 X 1 0⁴個の P D F及び 2 X I 0⁴個の H a s細胞を混合して播種した。翌日、抗 P A P 2 a抗体 S 1 1併用でアデノウイルス Ax 3 CAE GF P— F Z 3 3 (E GF P発現）を感染させた。具体的には、 1ゥエルにつき 5 0 0 1当たり l gの S I 1抗体（DMEM— F B S (—））と、 Ax 3 CAE GF P— F Z 3 3を 1ゥエル当たり 3 0 0 v pZc e l 1 のべクタ一用量で（DMEM— F B S (—））混合し、 4°Cで 1時間インキュペートした。培地を交換して培養を続け、翌日、細胞を、 1次抗体として S 1 1抗体（ 5 ^ g/m 1 ) とともに室温で 3 0分間インキュベートし、洗いの後、 2次抗体として A l e x a F l u o r 5 94ャギー抗マウス I g G抗体（ 5 g/m 1 ) とともに室温で 3 0分間インキュペートすることによって、抗 PAP 2 a抗体 S 1 1に反応する細胞すなわち H a s細胞を赤色に染めた。 H a s細胞と P D F細胞とは同数ずつ播いても、増殖性の差から、. 2日後には H a s細胞の方が多くなる。遺- 伝子導入の有無は、 E G F P発現（図では緑色の蛍光）でモニターした。図 1 2に示す遺伝子導入された細胞（すなわち、緑の蛍光を発する細胞）はすべて、赤色（P AP 2 a陽性の H a s細胞）細胞であり、ブル —の P D F細胞には遺伝子導入されていない。このことから、 S 1 1抗体を用いた遺伝子導入法によって、 PAP 2 a陰性ないし弱陽性の細胞と区別して、 PAP 2 a陽性の細胞に選択的に、しかも高い効率で遺伝子導入を行うことができることが示された。このような選択的な遺伝子導入法は、癌の治療に有効と考えられる。 (実施例 7. 抗 PAP 2 a抗体を用いた免疫組織染色に基づく膝癌の診断）

図 1 4一 1および図 1 4一 2は、ヒト塍癌臨床例からの手術標本の抗 PAP 2 a抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。免疫組織染色の方法を簡単に記すと以下の通りである。

ホルマリン固定 ·パラフィン包埋した外科手術標本を、キシロール - エタノールにより脱パラフィン化し、 0. 0 1 Mクェン酸緩衝液（p H 6. 4) に浸して 1 2 1 °Cで 5分間オートクレープ処理した。次に、 1 0 %正常ゥサギ血清を 1一 2滴滴下し、組織にくまなく広げて室温で 1 0分間反応させ、非特異的反応を阻止した。次に、 S 1 1抗 P AP 2 a 抗体（ 1一 2 g Zm 1 ) を標本 1枚につき 5 0— 1 0 0 1 のせて、組織にくまなく広げて湿潤箱に静置し、 4°Cで一晩反応させた。 P B S で洗浄し、ピオチン化標識ゥサギ抗マウス二次抗体（二次抗体は V e c t o r社、 DAKO社、ニチレイ、などから市販されている）をのせ、室温で 1時間反応させた。 P B Sで洗浄し、 V e c t o r社のペルォキシダ一ゼ'アビジン ·ピオチン複合体（A V i d i n B i o t i n C omp l e x、 AB C) 染色キッ卜のアビジン ·酵素試薬を適量のせ、室温で一時間反応させた。 P B Sで洗浄し、 DAB溶液（ 1 0 0m lの 0. 0 5 M T r i s—HC l、 p H 7. 6、に対し、 5mgの DAB を溶かし、 0. 1— 0. 2m l の 0. 3 %過酸化水素水を加えたもの）に 1分間ほどスライドを入れ、肉眼ないし顕微鏡で観察して発色を見ながら蒸留水で反応を止めた。さらにへマトキシリン溶液で 3 5秒間、核染色を行い、脱水 ·透徹 ·封入を行った。この方法によれば、 D A B発色により、抗原陽性部位が茶褐色に発色する。

図 1 4一 1および図 1 4一 2中の A、 B、 Cはそれぞれ別々の患者 3 例（症例 A、症例 B、症例 C ) の手術標本からの免疫組織染色の結果であ-る。上のカラムの写真は、膝癌組織を含む部分、下のカラムの写真は、同一のプレパラ一ト上の膝癌組織周辺の非癌部の染色である。図 1 4に示すように、ヒト膝癌臨床例からの手術標本では、 S 1 1抗体を用いることにより、塍癌組織が強陽性に染色された。一方で、膝癌組織周辺の非癌細胞からなる組織では、 S 1 1抗体を用いることにより、陰性ないし弱陽性（腺部）に染色された。すなわち、 P A P 2 a抗原分子は、ヒト塍癌組織に特異的に強い発現が見られることが示された。従って、 S 1 1抗体などの抗 P A P 2 a抗体による塍癌の診断が可能であり、また、 S 1 1抗体などの抗 P A P 2 a抗体による標的化治療がヒトの脖癌の治療に有効であることが示された。

(実施例 8 ヒト臨床の各種組織サンプルの抗 P A P 2 a抗体 S 1 1による免疫組織染色）

P A P 2 aが腫瘍組織に特異的に発現すること、および本発明の抗 P A P 2 a抗体がそのような腫瘍組織の検出（腫瘍の診断）および腫瘍の治療に有用であることをさらに実証するために、各種ヒト腫瘍組織（前立腺癌組織、ヒト甲状腺癌組織、ヒト卵巣癌組織、およびヒト肺癌組織）、ならびに各種ヒト正常組織（リンパ節組織、脾臓組織、骨髄組織、肝臓組織、大腸粘膜組織、膀胱組織、甲状腺組織、大動脈組織、心臓組織、および骨格筋組織）を用いて、本発明の抗 P A P 2 a抗体 S 1 1による免疫組織染色実験を行った。

(方法）腫瘍組織および正常組織の標本は、札幌医科大学病理診断部のホルマリン固定パラフィン包埋のプロック標本から脱パラフィン切片プレパラートとして作製した。抗 P AP 2 a抗体 S 1 1を一次抗体として、ペルォキシダーゼ結合抗マウス免疫グロプリンを二次抗体として使用して、上記切片プレパラートと反応させ、 DAB (3, 3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride； 3, 3 ' —ジァミノべンジジン四塩酸塩）で発色させた。

結果を、図 1 5〜 2 9、および図 3 1〜 40に示す。

(結果）

図 1 5は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者 03— 1 01 6— 9) を免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。

図 1 6は、前立腺癌の症例からの手術標本（図 1 5と同じ患者 0 3—

10 1 6 - 9) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。 S I 1染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、 S 1 1染色は、前立腺肥大前立腺組織および正常前立腺組織で弱陽性、間質組織で陰性である。 .

図 1 7は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者 03— 22 1 5— 1 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。 S 1 1染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 1 8は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者 03— 2342— 1

3)の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。 S 1 1染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 1 9は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者 03— 2767— 1

4)の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色 (陽. 性）が認められる。 S 1 1染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 2 0は、免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。写真の向かつて右手が前立腺癌（PAP 2 a陽性）であり、左手は炎症細胞浸潤である（P AP 2 a陰性）。 P AP 2 a抗体は、正常リンパ球や好中球などの宿主の炎症細胞とは反応せず、前立腺癌の診断および標的化治療に有用であることが示唆される。

図 2 1は、甲状腺癌の症例からの手術標本（甲状腺の濾胞状腺癌（F o 1 1 i c u l a r a d e n o c a r c i n o m a ) の患者 (アレイ A 7 ) 由来の S 11抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。 S 1 1染色は甲状腺癌細胞では陽性である。

図 2 2は、図 2 1 とは別の甲状腺癌の症例からの手術標本（濾胞状腺 ¾(F o l l i c u l a r a d e n o c a r c i n oma)、患者 2 (ァレイ B 1 1 ) 由来のサンプルの S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。濾胞内部の茶色の染色はバックグラウンド染色である。

図 2 3は、卵巣癌の症例からの手術標本（O V C a 患者 0 3— 24 1 - 5) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 2 4は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3— 8 3 0 - 1 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 2 5は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3— 1 2 5 2 - 1 3 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。

図 2 6は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（〇 v C a 患者 0 3 —

2 8 8 1 - 4 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1 染色は卵巣癌細胞で陽性である。

図 2 7は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（O v C a 患者 0 3 —

3 "6 5 5 - 9 ) の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1 染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。腺腔を形成する分化腺癌で S 1 1染色陽性である。一部に腺腔を形成しない未分化の腫瘍細胞の固まりの形成も見られ、この部分も S 1 1染色陽性である。

図 2 8は、図 2 7の標本と同じプレパラート上の別の視野の写真である。 S 1 1染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、 S 1 1染色は陰性である。未分化な浸潤腫瘍組織も S 1 1染色で強陽性である。

図 2 9は、ヒト肺癌の症例（アレイ B 3 ) の S 1 1抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。

図 3 0は、各種ヒト肺癌臨床サンプルから樹立された細胞ゃヒト肺癌の S 1 1抗体による F A C S解析の結果を示す。解析は、実施例 6の場合と同様に行った。使用した細胞の内訳は以下の通りである。

1 8 ：肺、腺癌、心滲出液中からの臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陰性。

2 7 ：肺、大細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陽性。

8 1 ：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S I 1染色は陽性。

1 3 3 ：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陽性。 1 4 2 ：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陽性。

1 46 :肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陽性。

1 4 8 ：肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陰性。

1 54 ：肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。 S 1 1染色は陰性。（図中の表を参照。）

. L C— 2Za d、 P C I 4、および R ER F— L C— K Jの 3種は、 AT C Cから購入したヒト肺癌細胞株である。 3例とも S 1 1染色は陽性であった。図 2 9および図 3 0に示される肺癌組織の免疫組織染色、' 臨床サンプル由来の肺癌細胞の F AC S解析、ヒト肺癌細胞株の F AC S解析などのデータから、 S 1 1抗体で肺癌細胞に発現する PAP 2 a の発現を検出することができること、肺癌で陽性例が多いこと、 S 1 1 が PAP 2 aを指標とした診断に用いることが可能なこと、および S 1 1を用いて PAP 2 aを標的とした治療への応用が可能であることが確認できた。

次に、正常組織において S 1 1を用いた免疫組織染色を試みた結果は以下の通りである。

図 3 1は、ヒト正常リンパ節の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 3 2は、ヒト正常の脾臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 3 3は、ヒト正常の骨髄の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 34は、ヒト正常肝臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 3 5は、正常ヒト大腸粘膜の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。図 3 6は、ヒト正常の膀胱の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 3 7は、正常ヒト甲状腺の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。甲状腺組織が S 1 1染色では弱陽性である。濾胞内部が茶色に染まっているが、これはバックグラウンド染色である。

図 3 8は、正常ヒト大動脈の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真であ'る。 S 1 1染色は陰性である。

図 3 9は、ヒト正常の心臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

図 4 0は、ヒト正常の骨格筋の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。 S 1 1染色は陰性である。

以上の結果から、 S 1 1を用いた免疫組織染色アツセィにおいて、腫瘍（特に腺癌）組織が陽性であり、正常組織が陰性であることが示された。したがって、 PAP 2 aが腫瘍組織（特に腺癌組織）に特異的に発現すること、および本発明の抗 PAP 2 a抗体が PAP 2 a陽性の腫瘍組織の検出（腫瘍の診断）および腫瘍の治療に有用であることが示された。なお、上記で S 1 1染色について陰性〜弱陽性と、陽性との違いは当業者ならば容易に目視等により区別することができる。 (実施例 9. 抗 PAP 2 a抗体をィムノトキシンとして用いた S a p o r i n結合 2次抗体による細胞増殖阻害効果）

実験に用いた材料は、以下の通りである。

• H a s細胞（PAP 2 a陽性細胞株）

'抗？八？ 2 &モノク口一ナル抗体（S 1 1， 1 mg/m 1 の濃度で調製）

•サポリンをコンジユゲートした抗マウス I g G (S a p o r i n— c o n j u g a t e d a n t i — mo u s e I g G、M a b— ZAP、 FUNAKO S H Iより購入）

• DMEM 1 0 % F C S■ メディウム • WS T— 1 (TAKARAより購入）

• 9 6ゥエルプレート（C o r n i n g)

実験の手順は、以下の通りである。

1 , 対数増殖期にある H a s細胞を培養シャーレから T r y p s i nZ EDTA溶液で回収する。

2， DMEMメディウムを用いて遠心洗浄する。

3；細胞数を測定する。

4， 2 X 1 0⁵ c e 1 1 s /m 1 に調整し 1 5 m lチューブに 1 m 1ずつ分注（2本）

5 , a ) アイソタイプコントロールのマウス I g G 1を 1 0 2 g、 b ) 抗 PAP 2 a抗体 S 1 1を 1 0 g、それぞれ添加する。

6 , 4°Cで 3 0分反応させる。

7 , DMEMメディウムを 1 0m l添加し遠心洗浄し過剰抗体を除去する。

8，細胞密度 2 X 1 0⁴ c e 1 I s /m 1 に D ME Mメディゥムで調製する。

9， 9 6ゥエルプレートにし 1 0 0 1 /w e 1 1ずつ細胞を播く。

1 0 , 各濃度に希釈した S a p o r i n結合 2次抗体 (M a b _ ZAP) を 1 0 0 1 Zw e 1 1添加する。

1 1， 3 7 °Cで 7 2時間培養する。

1 2 , 培地をァスピレ一夕で取り除き WS T— 1溶液を 1 0 0 1 Zw e 1 1ずつ添加する。

1 3， 3 7 °Cで 2時間培養する。

1 4 , プレートリーダーで吸光度測定（測定 4 1 5 nm, 対象 6 5 5 n m) 。 ,

図 4 1は、上記のような方法によって、抗 Ρ ΑΡ 2 a抗体 S 1 1をィムノトキシンとして用いた、 H a s細胞傷害治療実験の結果を示すダラフである。この図に示すように、抗 P AP 2 a抗体 S 1 1をィムノトキシンとして用いて、 H a s細胞などの P AP 2 a陽性細胞を S 1 1特異- 的に強く傷害することができる。この結果から、抗 PAP 2 a抗体を用いた PAP 2 aを標的とした免疫治療が、 PAP 2 aを高発現する癌などの治療に、選択性が高く、有効であることが示された。 (実施例 1 0 抗体 8 A 9の抗原の同定）

本発明の A d v— F Z 3 3スクリーニング法により取得した 8 A 9抗体の抗原の同定を、実施例 4〜 6に記載される手順と同様に行った。その結果を図 42 A〜Cに示す。

図 4 2 Aは、免疫沈降および銀染色の結果を示す図である。左のレ一ンは、ピオチン化標識細胞の 8 A 9抗体による免疫沈降、右のレーンは免疫沈降産物の S D S— PAGEおよび銀染色の結果を示す。図中、四角で囲った部分のバンドを切り出して質量分析に供した。

図 4 2 Bは、その質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになつたべプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒト C D 44のアミノ酸配列の一部と一致することがわかった。したがって、 8 A 9抗体による免疫沈降産物は、ヒト CD 44抗原分子であることが判明した。

さらに、ヒト CD 44が 8 A 9抗体の抗原分子であることを確認するために、ヒト CD 44抗原を発現するプラスミドベクターをトランスフェクトした CHO細胞に 8 A 9抗体を接触させ、 FAC Sで解析した。結果を図 42 Cに示す。

図 4 2 Cの右のグラフは、 8 A 9抗体を用いた場合、左のグラフは、コント口一ルとして I g G_{1 K}を用いた場合の結果を示す。図に示されるように、 8 A 9抗体は、ヒト C D 44を高発現する C HO細胞を認識することから、 8 A 9抗体の抗原がヒト C D 44であることが確認できた。なお、図 4 2 Cに示す実験では、以下の材料および方法を使用した。 (材料)

チャイニーズハムスター卵巣細胞株 CHO細胞（AT C Cより購入）を使用した。培養は 1 0 % F C Sとべニシリン Gカリウム（ 1 0 0 UZ. m 1 )、硫酸ストレプトマイシン（ 1 0 Q a g/m 1 ) を添加した R PM I 1 6 4 0培養液で 5 % C O 2を含む空気中で 3 7 °Cのインキュべ一夕一中で行った。プラスミド： p T a r g e t— h C D 44を使用した。

h C D 4 4の c DNAは、 H e 1 a細胞の総 RN Aを調製し（R N e a s y : Q I AGE N), RT— P C R (S u p e r S c r i p t I I ： I n v i t r o g e n) にて得た。プライマ一として、 # 2 1 8 7 G C"A C AG ACAGAAT C C C TG C TAC C、および # 2 1 8 8 GGGGT GGAATGT GT C TTG GTC TCを用いた。

得られた h CD 44 c DN Aを発現ベクター p T a r g e t (p r o m e g a)にライゲーシヨンし、 p T a r g e t— h CD 44を得た。プラスミド： p CMV— S P〇RT 6— h CD 1 4 7は、 O p e n B i o s y s t emより購入した。

(方法）

CH〇細胞を 6 we l l (ゥエル）プレートに 5 x 1 0⁵ /w e 1 1 で播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、細胞に各プラスミドを L i p o f e c t AM I NE P LUS ( I n v i t r o g e n) にて説明書に従い遺伝子導入を行った。 4 8時間後、細胞を回収した。各 1次抗体を 4 °Cで、 3 0分間反応させた後、 P B S (—）にて 2回洗浄した。 2次抗体としての An t i - M o u s e - R P E (D a k o ) を 4°Cで、 3 0分間反応させた後、 P B S (—）にて 2回洗浄した。その後、 FAC S C a 1 i b u r (B D) にて測定した。

(実施例 1 1 Ax CAZ 3— Z 3 3と数種の抗ヒト CD 44抗体を用いた遺伝子導入発現量の比較）

上記のとおり調製した 8 A 9抗体と他の数種の抗ヒト C D 44抗体を Ax CAZ 3 - Z 3 3と共に用いて、遺伝子導入発現量の比較検討を行つた。材料および方法は以下の通りである。

(材料）

細胞はヒト前立腺癌細胞株、 P C 3 (AT C Cより購入）を使用した。 ■ 培養は 1 0 % F C Sとぺニシリン Gカリウム（ 1 0 0 UZm 1 )、硫酸ストレプトマイシン（ 1 0 0 x gZm l ) を添加した R PM I 1 640 培養液で 5 % C O ₂を含む空気中で 3 7でのィンキュベータ一中で行つた。

使用した抗体は、抗ヒト CD 44 (R&D社： 2 C 5)、抗ヒト CD 4 4 (S a n t a C r u z社： D F Γ 4 8 5 )、および抗ヒト C D 44 (本発明の Ad V— F Z 3 3スクリ一二ング法で得られた抗体： 8 A 9 ) の 3種類であった。アイソタイプコントロール抗体として、マウス I g G _{1 K}アイソ夕ィプコントロール（e B i o s c i e n c e社： P 3) を使用した。

アデノウイルスには iS— G a l a c t o s i d a s eを発現する Ax C AZ 3— F Z 3 3を使用した。

C h e m i l um i n e s c e n t R e p o r t e r G e n e A s s a yには G a l a c t o— L i g h t P l u s (Ap p l i e d B i o s y s t e m s社）を用いて説明書に従って使用した。

(方法）

P C 3細胞を 9 6 we 1 1 プレートに 1 x 1 0⁴/w e 1 1で播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、 P B S (―) にてゥエルを 1回洗浄した。次に、各抗体を、 0. 0 0 0 1 x g、 0. 0 0 1 g、 0. 0 1 g、 0. 、および l gの濃度で 4 °C、 1時間反応させた。その後 P B S (—）にて 2回洗浄した。次に、 Ax CAZ 3— F Z 3 3を、 l O O O v p/c e l lで 4°C、 1時間反応させた。その後 P B S (—）にて 2回洗浄した。細胞培養培地を加え、 3 7°C、 5 % C〇 2にて培養した。 24時間後 G a 1 a c t o— L i g h t P l u s を用レて C h em i l um i n e s c e n t R e p o r t e r G e n e A s s a yを行い j6— g a 1 の発現量を測定した。

(結果）

結果を、図 4 3に示す。本発明の方法で得られた抗ヒト CD 44抗体 8 A 9は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、市販の抗ヒト CD 44· 抗体に比し、 ED 5 0値において 5〜 3 0倍以上の活性を示した。言い換えれば、当出願の方法を用いることにより、市販の抗ヒト CD 44抗体よりも 5〜 3 0倍以上優れた抗体を見分けて樹立することが可能であつた。

(実施例 1 2 抗体 1 0 D 8および抗体 8 D 1 2の抗原の同定）本発明 ©A d V— F Z 3 3スクリーニング法により取得した 1 0 D 8 抗体および 8 D 1 2抗体の抗原の同定を、実施例 4〜 6に記載される手順と同様に行った。その結果を図 44 A〜Cに示す。

図 44 Aは、免疫沈降および銀染色の結果を示す図である。左のレーンは、ピオチン化標識細胞の 1 0 D 8抗体による免疫沈降、右のレーンは免疫沈降産物の S D S— P AGEおよび銀染色の結果を示す。図中、四角で囲った部分のバンドを切り出して質量分析の解析に供した。

図 44 Bは、その質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになつたペプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒト CD 1 47のアミノ酸配列の一部と一致することがわかった。したがって、 1 0 D 8抗体による免疫沈降産物は、ヒ卜 CD 1 47抗原分子であることが判明した。

さらに、ヒト CD 1 47力 S 1 0 D 8抗体（および 8 D 1 2 ) の抗原分子であることを確認するために、ヒト C D 1 4 7抗原を発現するプラスミドベクターをトランスフエクトした CHO細胞に 1 0 D 8抗体（および 8 D 1 2抗体）を接触させ、 FAC Sで解析した。結果を図 44 Cに示す。

図 44 Cの中央のグラフは、 1 0 D 8抗体を用いた場合、右のグラフは、 8 D 1 2抗体を用いた場合、および左のグラフは、コントロールとして I g G_{1 K}を用いた場合の結果を示す。図に示されるように、 1 0 D 8抗体および 8 D 1 2抗体はいずれも、ヒト C D 1 47を高発現する C HO細胞を認識することから、 1 0 D 8抗体および 8 D 1 2抗体の抗原がヒト CD 1 47であることが確認できた。なお、図 44 Cに示す実験では、以下の材料および方法を使用した。 (材料）

チャイニーズハムスター卵巣細胞株 C HO細胞（AT C Cより購入）を使用した。培養は 1 0 %F C Sとペニシリン Gカリウム（ 1 0 0 UZ m 1 )、硫酸ストレプトマイシン（ 1 0 0 g /m 1 ) を添加した R PM I 1 64 0培養液で 5 % C O 2を含む空気中で 3 7 のインキュベー夕中で行つた。プラスミド： P CMV— S P ORT 6— h CD 147 は、 O p e n B i o s y s t e mより購入した。

(方法）

CHO細胞を 6 we 1 1 (ゥエル）プレートに 5 x l 0⁵/we 1 1 で播種した。翌日、プレー卜に細胞が接着していることを確認し、細胞に各プラスミドを L i p o f e c t AM I NE P LUS ( I n v i t r o g e n) にて説明書に従い遺伝子導入を行った。 48時間後、細胞を回収した。各 1次抗体を 4 °Cで、 3 0分間反応させた後、 P B S (—）にて 2回洗浄した。 2次抗体としての An t i -M o u s e - R P E (D a k o) を 4°Cで、 3 0分間反応させた後、 P B S (—）にて 2回洗浄した。その後、 FAC S C a l i .b u r (BD).にて測定した。

(実施例 1 3 Ax CAZ 3 3 - Z 3 3と数種の抗ヒト CD 1 4 7抗体を用いた遺伝子導入発現量の比較）

上記のとおり調製した 1 0 D 8抗体および 8 D 1 2抗体と他の数種の抗ヒト CD 14 7抗体を Ax C AZ 3— Z 3 3と共に用いて、遺伝子導入発現量の比較検討を行った。材料および方法は以下の通りである。

(材料）

細胞はヒト前立腺癌細胞株、 P C 3 (ATC Cより購入）を使用した。培養は 1 0 % F C Sとペニシリン Gカリウム（ 1 0 0 U/m 1 ),硫酸ストレプトマイシン（ 1 0 0 g/m 1 ) を添加した R PM I 1 640 培養液で 5 % C 0₂を含む空気中で 3 7 のインキュベータ一中で行つた。使用した抗体は、抗ヒ卜 C D 1 4 7抗体（C HEM I CON社： 1 G 6. 2)、抗ヒト CD 1 4 7抗体（Ab e am社： a b 6 6 6 )、抗ヒト CD 1 4 7抗体（本発明の A d V— F Z 3 3スクリ一ニング法で得られた抗体： 8 D 1 2 )、および抗ヒト C D 1 4 7抗体（本発明の A d v— F Z 3 3スクリ一二ング法で得られた抗体： 1 0 D 8 )の 4種類であった。アイソタイプコントロール抗体として、マウス I g G_{1 K}アイソタイプコントロール（e B i o s c i e n c e社： P 3 ) を使用した。

アデノウイルスには j6 _ G a 1 a c t o s i d a s eを発現する A x CAZ 3 - F Z 3 3を使用した。

C h e m i l um i n e s c e n t R e p o r t e r G e n e A s s a yには G a l a c t o— L i g h t P l u s ( A p p 1 i e d B i o s y s t e m s社）を用いて説明書に従って使用した。

(方法）

P C 3細胞を 9 6 w e 1 1 プレートに 1 x 1 0⁴Zw e 1 1で播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、 P B S (—）にてゥエルを 1回洗浄した。次に、各抗体を、 0. 0 0 0 1 / g、 0. 0 0 1 g , 0. 0 1 g, 0. 1 /2 g、および 1 i gの濃度で 4 °c、 1時間反応させた。その後 P B S (-) にて 2回洗浄した。次に、 Ax CAZ 3— F Z 3 3を、 1 0 0 0 じ 6 1 1で4°〇、 1時間反応させた。その後 P B S (—）にて 2回洗浄した。細胞培養培地を加え、 3 7°C、 5 % C O 2にて培養した。 2 4時間後 G a 1 a c t o— L i g h t P l u s を用レて C h e m i l um i n e s c e n t R e p o r t e r G e n e A s s a yを行い j6— g a 1 の発現量を測定した。

(結果)

結果を、図 4 5に示す。本発明の A d v— F Z 3 3スクリ一ニング法で得られた抗ヒ卜 CD 1 4 7抗体の 1 0 D 8および 8 D 1 2抗体は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、市販の抗ヒ卜 CD 1 4 7抗体に比し、著明に高い活性を示した。言い換えれば、本発明の A d V — F Z 3 3スクリーニング法を用いることにより、市販の抗ヒト C D 1 4 7抗体よりも著明に優れた抗体を見分けて樹立することが可能となった。

なお、 1 G 6. 2抗体（ケミコン社）は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、ほとんど活性を示さない抗体であった。 AB 6 6 6抗体（A b e am社）は、本発明の A d v— F Z 3 3スクリーニング法で得られた抗体と、 E D 5 0値においてはほぼ同等の性状を示すものの、抗体濃度-を増加させても最大活性値（発現量）は頭打ちとなり、当出願の方法で得られた抗ヒト C D 1 4 7抗体の 1 0 D 8および 8 D 1 2抗体の 5 0 %程度の活性値に到達できたのみであった。

また、本発明の A d v— F Z 3 3スクリ一ニング法で得られた抗ヒト C D 1 4 7抗体の 1 0 D 8および 8 D 1 2抗体を比較すると、 1 0 D 8 抗体の方が 8 D 1 2抗体よりも活性の立ち上がりが早く、より高い標的化活性を持つ抗体であることが示された。 (実施例 1 4 マウス抗 C E Aモノクローナル抗体を用いた Ad V— F Z 3 3による遺伝子導入効率の比較）

本発明者らはまた、各種マウス抗 C EA (ヒト癌胎児性抗原）モノクローナル抗体を用いて、 Ad v _ F Z 3 3による遺伝子導入効率の比較を行った。手順を以下に説明する。

感染の 1 日前（D a y— 1 ) に、 M K N— 4 5細胞株を 6ゥエルプレ一卜に、 1 X 1 0⁵細胞/ゥエルで播種した。 D a y 0において、 D r . Ku r o k i ( F u k u o k a Un i v e r s i t y) 力、ら提供されたか、または市販の各種マウス抗 C E Aモノクローナル抗体を、無血清 R PM I— 1 640中に 3 g/m 1の濃度で調節し、 1 0 0 0 M 1の容量で各種細胞に添加した。陽性コント口一ルとして、ヒト型抗 C E A抗体である C 2— 4 5を使用した。 I s t y p e c o n t r o l として、それぞれ、 ' Mo u s e I g G 1 (e B i o s c i e n c e , c l o n e P 3)、 Mo u s e I g G 2 a (e B i o s c i e n c e , c l o n e e BM 2 a) .Mo u s e I g G 2 b (e B i o s c i e- n c e , c l o n e e B M G 2 b )、および M o u s e I g G 3 ( B D P h a r m i n g e n , C a t N o 5 5 3 4 8 4 )を使用した。抗体を添加後、 1 0 0 0 1 1 の無血清 R PM I — 1 6 4 0で 2回洗浄した。次いで、無血清 R PM I — 1 6 4 0にて Ax 3 CAE G F P— F Z 3 3を 1 0 0 0 V PZ細胞の濃度に希釈し、 1 0 0 0 Z 1の容量で各種細胞に添加し、 3 7 °Cで 1時間インキュベートすることによって感染させた。インキュべ一ション後、 1 0 0 0 1の無血清 P RM I - 1 6 4 0にて 2回洗浄し、さらに 1 0 % F B Sを補充した R P M I — 1 6 4 0 中で 2 4時間培養した。 D a y 1において、 G F P活性を F A C S c a 1 i b e rによって測定した。

図 4 6は、 FAC S c a l i b e rの測定結果を示すグラフである。マウス抗 C E A抗体やキメラ方抗体でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。中でも C 2— 4 5は、他のマウス抗 C EAモノク口一ナル抗体と比較して、 1 0〜 1 0 0倍以上 E G F P遺伝子の導入効率が高いことが示された。

図 4 7は、 C E Aを発現するように遺伝子導入した CHO細胞で、種々の抗 C E A抗体と A d V - F Z 3 3. l a c Zアデノウイルスとを用いて遺伝子導入を行ったばあいの、 1 a c Z遺伝子発現量の比較を示すグラフである。マウス抗 C E A抗体やキメラ方抗体でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。しかし、とりわけ。 2— 4 5は、他抗 C E Aモノクローナル抗体と比較して、 1 0〜 1 0 0倍以上 E G F P遺伝子の導入効率が高いことが示された。すなわち、当アツセィ法を用いれば、極めて高 S/N (シグナル，ノイズ比の高い）かつダイナミックレンジの広い抗体の活性の比較が可能であることが示されている。これは、 F AC S法や E L I S A法などの従来の方法と比較して格段に高 SZN (シグナル · ノイズ比の高い）かつダイナミックレンジの広い抗体の活性の比較方法になっていることが判明した。

図 4 6および図 4 7に示す結果はまた、このようにファイバ一ドメイン中に I g G結合配列を担持し、 E GF P遺伝子のようなマーカー遺伝. 子をコードする遺伝的に改変した A d v (Ax 3 CAE GF P - F Z 3 3) を用いることによて、特に優れた「高性能標的化抗体」を他の凡庸な活性の抗体と区別して選別することができることを実証する。このように、本発明の A d V — F Z 3 3スクリーニング法は、従来の方法（例えば、 E L I SA法など）に比べて格段に優れた「高性能 ·標的化抗体」を選別することができる高 S/N (シグナル · ノイズ比の高い）かつダィナミックレンジの広いアツセィ方法である。

なお、図 46および図 47に結果を示す実験で使用したマウス抗 C E Aモノクローナル抗体は、以下の通りである。

1. F 3 3— 1 0 4 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992. , Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992. )

Class: IgGl (k)

Affinity constant: 3.5 x 10 (+8)/M

0D=14.0 (Ab Cone. = 10.0 mg/ml)

Vol. = 0.5 ml

Total Ab= 5.0 mg

Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

2. F 3 3 - 6 0 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol. , 29: 229-240, 1992.， Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992. )

Class: IgG2a (k)

Affinity constant: 3.4 x 10 (+8)/M

0D=14.0 (Ab Cone. = 10.0 mg/ml)

Vol. = 0.5 ml

Total Ab= 5.0 mg

Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

3. F 8 2 - 8 1 (Ikeda S. et al, Mol. Imiunol.， 29: 229-240, 1992. , Kuroki M, et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992. )

Class: IgG2b (k)

Affinity constant: 9.5-x 10 (+8)/M 0D=14.0 (Ab Cone. = 10.0 mg/ml)

Vol. = 0.5 ml

Total Ab= 5.0 mg

Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.04. F l l— 1 2 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol. , 29: 229-240, 1992. , Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407 1992. )

Class: IgG3 (k)

Affinity constant: 11.2 x 10 (+8) /M

0D=14.0 (Ab Cone. = 10.0 mg/ml)

Vol. = 0.5 ml

Total Ab= 5.0 mg

Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

5. C h F l l - 39 (L o t 2) (Arakawa F. et al, Hybrido a 12: 365-379, 1993. )

Class: 同上

Af f ini ty constant：同上

0D=2.10 (Ab Cone. = 1.5 mg/ml) .

Vol. = 0.5 ml

Total Ab= 0.75 mg

Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

6. I B 2 ( I BL社より購入： l o t No 9 G- 7 1 7 ) class : IgG2a

Ab Cone. = lig/ml

7. B 6. 2/CD 66 (B D P h a r M i n g e nより購入： c a t a l o g No 5 51 355 )

Class： IgGl

Ab Cone. 0.5mg/ffll 産業上の利用可能性本発明の抗体は、膝癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、および乳癌を含む

P A P 2 a陽性の癌（特に転移癌、腺癌）の標的化療法等の用途において有用である。特に、抗体の F c ドメインに結合するように改変されたファイバ一変異型アデノウィルスと共に用いた場合、アデノウイルスの感染効率を高めることから、上記ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的化遺伝子導入に有用である。

さらに標的化抗体として抗癌剤のコンジュゲートや A D C Cを利用した抗体療法などの様々な用途においても有用である。

本発明の方法により同定された癌特異的抗原は、診断マーカーとしてのみならず、標的化治療のための標的として、あるいは、ワクチン製剤の成分等としてもまた有用である。

また、本発明の抗体は、免疫沈降、 F A C Sなどの免疫学的試験が容易に行い得、組織染色も可能であるため、癌の治療用のみならず、診断用としても有用である。

本発明の癌特異的抗原およびそれに対する抗体の同定方法は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補とそれに対する抗体との組み合わせを系統的に探索してゆくために有用である。

さらに、本発明の所望の抗原に対するモノクローナル抗体のスクリ一ニング方法は、標的細胞への治療物質の夕ーゲッティング効率などを従来よりも格段に高めることができる高性能抗体を取得するために有用である。

Claims

請求の範囲

I . PAP 2 aに対するモノクローナル抗体。

2. 受託番号 F E RM P— 2 04 9 9または F E RM P - 2 049 8のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、請求項 1に記載の抗体。

3'. 請求項 1に記載の抗体を産生するハイプリドーマ。

4. 受託番号 F E RM P— 2 04 9 9または F E RM P - 2 0 4 9 8のハイプリドーマである、請求項 3に記載のハイプリドーマ。

5. 抗 PAP 2 a抗体を含有する、癌の診断薬。

6. 前記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 F E RM P— 2 049 9または F E RM P - 2 0 4 9 8のハイブリドーマが産生する抗 P A P 2 a 抗体である、請求項 5に記載の癌の診断薬。

7. 前記癌が、腺癌である、請求項 5または 6に記載の癌の診断薬。 8. 前記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、請求項 5〜 7のいずれかに記載の癌の診断薬。

9.被験者由来の生体試料中の P A.P 2 aタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マ一力一として検出および Zまたは定量する工程を包含する、癌の診断方法。

1 0. 被験者由来の生体試料中の PAP 2 aタンパク質もしくはその断片を、抗 PAP 2 a抗体を用いて免疫学的に検出および/または定量する、請求項 9に記載の方法。

I I . 前記生体試料と抗 PAP 2 a抗体とを接触させる工程、および該生体試料中の P AP 2 aと該抗 PAP 2 a抗体との結合を検出および Zまたは定量する工程

を包含する、請求項 1 0に記載の方法。

1 2. 前記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、精液、唾液、または汗である、請求項 1 0または 1 1に記載の方法。

1 3. ウエスタンプロット法、ラジオィムノアッセィ（R I A)、酵素結合免疫吸着検定法（E L I SA)、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（F I A)、時間分解蛍光免疫測定法（TR F I A)、酵素免疫測定法（E I A)、発光免疫測定法（L I A)、電気化学発光免疫測定法（E CL I A)、ラテックス凝集法、免疫沈降アツセィ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテイン A免疫検定法か""らなる群から選択される免疫測定法に従う、請求項 9〜 1 2のいずれかに記載の方法。

1 4. 前記抗 P AP 2 a抗体が、受託番号 FE RM P— 2 04 9 9または F E RM P— 2 0 4 9 8のハイブリドーマが産生する抗 P A P 2 a抗体である、請求項 9〜 1 3のいずれかに記載の方法。

1 5.前記癌が、腺癌である、請求項 9〜 1 4のいずれかに記載の方法。 1 6. 前記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、請求項 9〜 1 5のいずれかに記載の方法。

1 7. 抗 P AP 2 a抗体を含有する、癌の治療薬。

1 8. 前記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 FE RM P— 2 04 9 9または F E RM P— 2 0 49 8のハイプリドーマから産生される抗 P A P 2 a抗体である、請求項 1 7に記載の癌の治療薬。

1 9. 前記抗 PAP 2 a抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウィルスベクタ一、および薬剤を担持した非ウィルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、請求項 1 7または 1 8に記載の癌の治療薬。

2 0. 前記抗 PAP 2 a抗体が、ウィルスベクターに結合されている、請求項 1 9に記載の癌の治療薬。

2 1. 前記ウィルスベクタ一が、 F Z 3 3ファイバ一変異型アデノウィルスである、請求項 2 0に記載の癌の治療薬。

2 2. 前記非ウィルスベクターが、リボソームベクター、重合リポソ一ム、脂質小胞、デンドリマ^"、ポリエチレングリコール集合体、ポリリ- ジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウィルスェンベロープベクタ一、プラスミドベクター、およびプラスミド DNAネィキッドベクターからなる群から選択される、請求項 1 9に記載の癌の治療薬。 2 3. 前記癌が、腺癌である、請求項 1 7〜 2 2のいずれかに記載の癌の治療剤。

24. 前記癌が、膝癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌'である'、請求項 1 7〜 2 3のいずれかに記載の癌の治療薬。

2 5. 抗 PAP 2 a抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。

2 6. 前記抗 PAP 2 a抗体が、受託番号 F E RM P— 2 04 9 9または F ERM P - 2 0 4 9 8のハイブリド一マから産生される抗 PA P 2 a抗体である、請求項 2 5に記載の方法。

2 7. 前記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、請求項 2 5または 2 6に記載の方法。