WO2005121338A1 - 抗ｐｅｒｐ抗体 - Google Patents

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WO2005121338A1
WO2005121338A1 PCT/JP2005/010405 JP2005010405W WO2005121338A1 WO 2005121338 A1 WO2005121338 A1 WO 2005121338A1 JP 2005010405 W JP2005010405 W JP 2005010405W WO 2005121338 A1 WO2005121338 A1 WO 2005121338A1
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amino acid
perp
human
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Atsushi Ochiai
Norihiko Shiraishi
Yoko Kato
Toshio Ota
Susumu Sekine
Kenya Shitara
Akiko Furuya
So Ohta
Emi Hosaka
Yuka Sasaki
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Japan As Represented By President Of National Cancer Center
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Definitions

  • the present invention relates to an antibody or an antibody that specifically recognizes the three-dimensional structure of an extracellular region of a polypeptide encoded by a PERP (p53 apoptosis effector related to PMP-22) gene and binds to the extracellular region.
  • Method for immunologically detecting and detecting a polypeptide encoded by a PERP gene using said fragment, said antibody or said antibody fragment method for immunologically detecting or measuring cells expressing said polypeptide, and detecting or measuring
  • the present invention relates to a reagent for use, a diagnostic or therapeutic agent for a disease associated with a polypeptide encoded by a PERP gene using the antibody or the antibody fragment, and a hybridoma producing the antibody.
  • the present invention provides a recombinant antibody or the antibody fragment, which specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and binds to the extracellular region, and encodes the antibody.
  • the present invention relates to DNA, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by transforming the vector, and a method for producing an antibody, which comprises culturing the hybridoma or the transformant.
  • Cancer cells produce large amounts of substances that are produced in small amounts or hardly by normal cells. By detecting or quantifying such a substance, cancer cells can be detected. Substances that cancer cells produce in larger amounts than normal cells include oncogene products and growth factors, and some contribute to cell carcinogenesis, growth, progression, metastasis, and colonization. Cancer can be diagnosed by detecting or quantifying these substances characteristic of cancer cells, so-called tumor markers.
  • tumor markers include carcinoembryonic antigen (CEA), ⁇ -fetoprotein (AFP), fetal carcinoma antigens such as CA125, nerve-specific enolase (NSE), acid phosphatase, creatine Enzymes such as kinase (CK), hormone-related substances such as adrenocorticotropic hormone (ACTH), antidiuretic hormone (ADH), and calcitonin (CT) have been used.
  • CEA, CA19-9, NCC-ST-439, STN, etc. are effective for colorectal cancer It has been used as a judgment of fruit and an index of recurrence.
  • a cancer or other malignant tumor is determined to be negative, and even a healthy person or a patient with a benign tumor may be determined to be a false positive.
  • the tumor marker positive rate for colorectal cancer is determined by stage, CEA is 36%, CA19-9 is 30%, NCC-ST-439 is 35%, and STN is 21% when curative resection is possible.
  • These tumor markers were only detected in patients and are not sufficient tumor markers for early detection of colorectal cancer (Non-patent Document 1).
  • CA19-9 is widely used as a tumor marker for diagnosis and treatment monitoring of knee skeletal cancer, which has a high frequency of appearance.
  • Other known tumor markers for esophageal cancer include CEA, SLX, NCC-ST-439, Cyaryl Tn, DuPan-2, and ferritin.
  • the measured values of these tumor markers often do not increase, and the measured values of these tumor markers are judged to be false positives.
  • a sufficiently reliable method for diagnosing cervical cancer is known.
  • CT Computer Tomography
  • CT finds unresectable or metastatic perform percutaneous needle aspiration for tissue diagnosis.
  • CT finds a resectable tumor or no tumor an endoscopic ultrasound is used.
  • ultrasound and endoscopic retrograde knee canalography are used for general examination. It is rare for angiographic cervix function tests to be performed to determine resectability.
  • a test laparotomy may be performed if diagnosis is difficult.
  • the polypeptide encoded by the PERP gene is a protein consisting of 193 amino acids, and is estimated to be a four-transmembrane protein from its primary sequence. It is known that the polypeptide encoded by the PERP gene is a protein involved in p53-dependent apoptosis (Non-Patent Document 3). Furthermore, it was shown that apoptosis induction during DNA damage was partially inhibited in thymocytes and neurons prepared from PERP gene knockout mice (Non-Patent Document 4). Has also been reported as a gene whose expression is reduced (Non-Patent Document 5).
  • Antibodies that bind to the polypeptide encoded by the PERP gene have been described as partial peptides in the C-terminal cell of the PERP gene product or the first extracellular cell.
  • Polyclonal antibodies prepared using a partial peptide of the loop as an immunogen are known (Non-Patent Documents 6 and 7). It has been shown that these polyclonal antibodies can be used for Western blotting or immunohistological staining.
  • Antibodies that recognize the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and bind to the extracellular region have been known.
  • Non-Patent Documents 14, 15 When an antibody of a non-human animal, such as a mouse antibody, is administered to a human, the antibody is recognized as a foreign substance, so that the human antibody to the human antibody (Human Anti use Antibody (HAMA) is known to be induced. HAMA reacts with the administered mouse antibody to cause side effects (Non-patent Documents 8 to 11), accelerates the disappearance of mouse antibodies from the body (Non-patent Documents 9, 12, and 13), and treats mouse antibodies. It is known that the effect is reduced (Non-Patent Documents 14, 15).
  • HAMA Human Anti use Antibody
  • the Hitoidani antibody has various advantages in human clinical application compared to non-human animal antibodies such as mouse antibodies. For example, it has been reported in an experiment using monkeys that the immunogenicity was lower than that of a mouse antibody and the blood half-life was extended (Non-patent Documents 16 and 17). That is, humanized antibodies are expected to have fewer side effects in humans and to have a long-lasting therapeutic effect as compared to antibodies of non-human animals.
  • a humanized antibody is produced by using a gene recombination technique, it can be produced as a molecule in various forms.
  • the gl subclass is used as the constant region (hereinafter referred to as C region) of the heavy chain (hereinafter referred to as H region) of a human antibody (the H region C region is referred to as CH)
  • Effector such as cytotoxicity (hereinafter referred to as ADCC) activity
  • One-function humanized antibody can be produced (Non-Patent Document 16), and longer half-life in blood is expected compared to mouse antibody (Non-Patent Document 17).
  • the human antibody in the treatment of reducing the number of cells expressing the polypeptide encoded by the PERP gene, complement-dependent cytotoxicity (hereinafter, referred to as the antibody heavy chain hinge region) through the antibody Fc region (hereinafter, referred to as the antibody heavy chain). Since the high cytotoxic activity such as CDC activity) and ADCC activity is important for its therapeutic effect, the human antibody is more desirable than non-human animal antibodies such as mouse antibodies. (Non-Patent Documents 18, 19).
  • Non-Patent Document 21 disulfide-stabilized V region fragments (hereinafter, referred to as dsFv) (Non-Patent Document 22), CDR-containing peptides (Non-Patent Document 23), and the like.
  • Antibody fragments with low molecular weight can also be produced, and these Compared to antibody molecules, it has excellent transferability to target tissues (Non-patent Document 24).
  • a humanized antibody or an antibody fragment thereof is more preferable than an antibody of a non-human animal such as a mouse antibody as an antibody used for clinical application to humans.
  • Patent Document 1 W ⁇ 98Z55508
  • Patent Document 2 W ⁇ 99Z54461
  • Patent Document 3 W ⁇ 00Z55350
  • Patent Document 4 W ⁇ lZ22920
  • Patent Document 5 W ⁇ 0lZ66719
  • Patent Document 6 WO00 / 61612
  • Patent Document 7 W ⁇ 02 / 00174
  • Patent Document 8 W ⁇ 02Z47534
  • Patent Document 9 US2003—0064947
  • Patent Document 10 US2003—0065157
  • Patent Document 11 W ⁇ 00 / 55629
  • Patent Document 12 W ⁇ 02 / 60317
  • Patent Document 13 US2002-0119463
  • Non-Patent Document 1 Tumor marker for colorectal cancer. CRCK4), 42 (1992)
  • Non-Patent Document 2 Clinical Pathology, 11, 1229 (1986)
  • Non-Patent Document 3 Genes & Development, 14, 704 (2000)
  • Non-Patent Document 4 Curr.Biol., 13, 1985 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Anticancer Research, 20, 2801 (2000)]
  • Non-Patent Document 6 Pro Sci website, [on line], [Search on March 31, 2004], Internet ⁇ http: Z www. Prosci—inc. Com / Antibody— TDS / 2451% 20PERP. Html >
  • Non-Patent Document 7 Novus Biologicals website, [on line], [March 31, 2004 search], Internet ⁇ h tp: Z www. Novus- biologicals. Com / print-data- sheet. Php / 4400 >]
  • Non-Patent Document 8 J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984)
  • Non-Patent Document 9 Blood, 65, 1349 (1985)
  • Non-Patent Document 10 J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988)
  • Non-Patent Document ll Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242 (1985)]
  • Non-Patent Document 12 J. Nucl.Med., 26, 1011 (1985)
  • Non-patent Document 13 J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988)]
  • Non-Patent Document 14 J. Immunol., 135, 1530 (1985)
  • Non-Patent Document 15 Cancer Res., 46, 6489 (1986)
  • Non-Patent Document 16 Cancer Res., 56, 1118 (1996)
  • Non-Patent Document 17 Immunol., 85, 668 (1995)
  • Non-Patent Document 18 J. Immunol., 144, 1382 (1990)
  • Non-Patent Document 19 Nature, 322, 323 (1988)
  • Non-Patent Document 20 Science, 242, 423 (1988)
  • Non-Patent Document 21 Nature Biotechnol., 15, 629 (1997)
  • Non-Patent Document 22 Molecular Immunol., 32, 249 (1995)
  • Non-Patent Document 23 J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996)
  • Non-Patent Document 24 Cancer Res., 52, 3402 (1992)
  • An object of the present invention is to use an antibody or an antibody fragment that specifically recognizes a stereostructure of an extracellular region of a polypeptide encoded by a PERP gene and binds to the extracellular region, and uses the antibody or the antibody fragment.
  • An object of the present invention is to provide a diagnostic or therapeutic agent for a disease involving a polypeptide encoded by a PERP gene using a fragment, and a hybridoma producing the antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant antibody or the antibody fragment, which specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and binds to the extracellular region, Encoding DNA, a vector comprising the DNA, It is an object of the present invention to provide a transformant obtained by transformation and a method for producing an antibody comprising culturing the hybridoma or the transformant.
  • the antibody of the present invention is useful for treating various diseases involving the polypeptide encoded by the PERP gene.
  • the antibody can specifically detect or measure the polypeptide encoded by the PERP gene or the cell in which the polypeptide is expressed by an immunological technique. It is useful for diagnosis of various diseases involved.
  • the present invention relates to the following (1) to (47).
  • polypeptide according to (1) wherein the extracellular region of the polypeptide is a region represented by the amino acid sequence represented by the 35th to 75th amino acids and the 130th to 154th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Antibody or antibody fragment is a region represented by the amino acid sequence represented by the 35th to 75th amino acids and the 130th to 154th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody or antibody fragment according to (3) which is a monoclonal antibody produced by monoclonal antibody S, hybridoma KM3411 (FERM BP-8643), or the like.
  • hybridoma according to (6) which is hybridoma power S, hybridoma KM3411 (FERM BP-8643).
  • the recombinant antibody is a recombinant antibody selected from a humanized antibody and a human antibody.
  • CDR Human-type complementarity determining region
  • variable region hereinafter, referred to as V region
  • L chain the light chain of the heavy chain
  • L chain the light chain of the monoclonal antibody according to any one of claims 3 to 5
  • any one of claims 3 to 5 comprising an H chain V region (hereinafter referred to as VH) and an L chain V region (hereinafter referred to as VL) of the monoclonal antibody according to claim 1, and
  • the VH of the antibody comprises the amino acid sequence of positions 19 to 130 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and the antibody VL comprises the amino acid sequence of positions 23 to 128 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • Any one of (3) to (5) including the CDRs of the monoclonal antibodies VH and VL and the FRs of the human antibodies VH and VL described in paragraph 1, and the H chain C region and L of the human antibody 2.
  • the antibody according to any one of (16) to (: 18), wherein CDR1, CDR2, and CDR3 of the VH of the antibody include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 15, 16, and 17, respectively. Human CDR-grafted antibody or antibody fragment.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of antibody VH include SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively, and CDR1, CDR2, and CDR3 of antibody VL are amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 18, 19, and 20, respectively.
  • VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence IJ represented by SEQ ID NO: 25, Gly 27, Ser 30 and Pro 41 (16) to (including an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Lys at position 44, Gly at position 45, Val at position 72, and Ala at position 97 has been replaced with another amino acid residue.
  • VL of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; Gln at the third position, Thr at the fifth position, Tyr at the 35th position, and Tyr at the 42nd position.
  • A1 a, the 46th: Leu, the 70th Phe, and the 77th: Leu force, including an amino acid sequence in which at least one amino acid residue is replaced with another amino acid residue, (16) to (21) The human CDR-grafted antibody or antibody fragment according to item (1).
  • VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, Gln at the third position, Thr at the fifth position, Tyr at the 35th position, or Tyr at the 42nd position A1a, Leu at position 46, Phe at position 70, and an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Leu at position 77 is substituted with another amino acid residue
  • VL of the antibody is In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or the amino acid sequence IJ represented by SEQ ID NO: 26, 3rd Gln, 5th Thr, 35th Tyr, 42th Ala, 46th Leu, Any one of (16) to (23), which comprises an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Phe at position 70 and Leu at position 77 is substituted with another amino acid residue; 2.
  • dsFv disulfide stabilized V region
  • the hybridoma according to (6) or (7) or the transformant according to (28) is cultured in a culture medium, and (1) to (5) or (8) to (25) (1) to (5) or (8) to (25), wherein the antibody or antibody fragment described in 1 is produced and accumulated, and the antibody or antibody fragment is collected from the culture. )) The method for producing an antibody or antibody fragment according to any one of the above.
  • a disease involving the polypeptide encoded by the PERP gene is cancer, (35) The diagnostic agent according to the above.
  • a polypeptide encoded by the PERP gene comprising as an active ingredient the antibody or antibody fragment according to (1) to (5) or (8) to (25), Drugs for treating diseases.
  • a polypeptide encoded by a PERP gene comprising administering to a patient the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (5) or (8) to (25).
  • an antibody or the antibody fragment, the antibody or the antibody fragment that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and binds to the extracellular region A method for immunologically detecting and detecting a polypeptide encoded by a PERP gene, a method for immunologically detecting or measuring cells expressing the polypeptide and a reagent for detecting or measuring, the antibody or the antibody fragment thereof.
  • a diagnostic or therapeutic agent for cancer to be used and a hybridoma producing the antibody are provided.
  • the present invention relates to a recombinant antibody or the antibody fragment, which specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and binds to the extracellular region, and the antibody.
  • the present invention provides a DNA encoding the DNA, a vector comprising the DNA, a transformant obtained by transforming the vector, and a method for producing an antibody, which comprises culturing the hybridoma or the transformant.
  • FIG. 1 shows the results of PERP expression analysis in various clinical cancer tissues and nearby non-cancerous tissues using a Cancer Profiling Array. Cancer types are indicated in the figure. N indicates a non-cancerous part, and T indicates a cancerous part.
  • FIG. 2 shows the results of examining PERP expression of each clone of the PERP gene-transfected cell by Western blotting using an anti-Myc antibody.
  • the clone numbers in the figure indicate the clones of the four PERP / CHO cells.
  • PERP-negative cells indicate CHO / DG44 cells into which no gene has been introduced.
  • the arrow in the figure indicates the molecular weight of the polypeptide chain encoded by the PERP gene, which is about 25 kDa.
  • FIG. 3 shows the reactivity of KM3314 in sandwich ELISA.
  • the black bar on the left indicates PERPZCHO cells, and the white bar on the right indicates CHOZDG44 cells.
  • the results of the ELISA method using the lysate are shown.
  • FIG. 4 shows the reactivity of KM3314 in Western blotting.
  • Lanes show, from the left, molecular weight markers, cell lysates of PERP / CHO cells, CHO / DG44 cells, Colo205 cell line, and PC-1 cell line, respectively.
  • the left picture shows the result using KM1764 as a negative control for the primary antibody, and the right picture shows the result using KM3411 as the primary antibody.
  • FIG. 5 shows the reactivity of KM3411 with FMAT.
  • the vertical axis shows the integrated value of the fluorescence intensity and the number of cells.
  • FIG. 6 shows the reactivity of KM3411 in flow cytometry.
  • the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • FIG. 7 shows the reactivity of KM3411 in immunoprecipitation.
  • the KM number of the antibody below the bar in the figure indicates the antibody used for immunoprecipitation, and the KM number above each figure indicates the primary antibody used for detection.
  • the lanes in each figure show the marker, PERP / CHO cells, and CHO / DG44 cells, respectively.
  • FIG. 8 shows the reactivity of KM3411 in flow cytometry.
  • the vertical axis represents the ratio of the average fluorescence intensity of KM3411 when the average intensity of KM511, which is a negative control, is set to 1.
  • the numerical values at the top of the graph particularly show values when the average fluorescence intensity ratio was 15 or more.
  • the table in the figure shows the cell lines used.
  • FIG. 9 shows the reactivity of KM3411 in flow cytometry.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity of FITC-labeled anti-human CD45 antibody, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of biotin-labeled KM3411 or KM511 as a negative control. Above each histogram, the antibodies used to stain the cells are shown.
  • FIG. 10 shows the reactivity of KM3411, commercially available anti-PERP antibodies (polyclonal antibodies) and negative control antibodies to PERP / CHO cells and CHOZDG44 cells by flow cytometry.
  • the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity. Above each histogram, the antibodies used to stain the cells are shown.
  • FIG. 11 shows the steps for constructing plasmids pKM3411VH9 and pKM3411VLll.
  • FIG. 12 shows a process for constructing plasmid pKANTEX3411.
  • FIG. 13 shows an SDS-PAGE (using a 5-20% gradient gel) electrophoresis pattern of the purified anti-PERP chimeric antibody.
  • the left side shows the results of electrophoresis under non-reducing conditions, and the right side shows the results of electrophoresis under reducing conditions.
  • Lanes 1 and 6 show the molecular weight markers, 2 and 4 show the migration pattern of anti-PERP mouse antibody KM3411, and 3 and 5 show the migration patterns of anti-PERP chimeric antibody KM3481, respectively.
  • FIG. 14 shows the reactivity of the purified anti-PERP chimeric antibody KM3481 with PERPZCHO cells by flow cytometry.
  • the vertical axis indicates the average fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the antibody concentration.
  • FIG. 15 shows the reactivity of the anti-PERP chimeric antibody KM3481 to each cancer cell line by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the number of cells, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • FIG. 16 shows the CDC activity of anti-PERP chimeric antibody KM3481 on PERPZCHO cells.
  • the vertical axis shows the cytotoxic activity%, and the horizontal axis shows the antibody concentration.
  • FIG. 17 shows ADCC activity of anti-PERP chimeric antibody KM3481 against each cell line.
  • the vertical axis shows the cytotoxic activity%, and the horizontal axis shows the antibody concentration.
  • FIG. 18 shows the daily change in the mean value of the tumor volume in the administration group when the anti-PERP chimeric antibody KM3481 was administered to the mouse into which the lung cancer cell line PC-9 was implanted intradermally.
  • the horizontal axis represents the number of days after tumor implantation, and the vertical axis represents the tumor volume.
  • X indicates no antibody administration group
  • ⁇ indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 0.1 mg / kg administration group
  • Hata indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 lmg / kg administration group
  • ⁇ indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 10 mg / kg administration group, respectively.
  • Bars indicate standard deviation.
  • FIG. 19 shows the average daily tumor volume of the administration group when the anti-PERP chimeric antibody KM3481 was administered to mice into which the knee cancer cell line BxPC_3 had been intradermally transplanted. Show the change.
  • the horizontal axis represents the number of days after tumor implantation, and the vertical axis represents the tumor volume.
  • X indicates no antibody administration group
  • ⁇ indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 0.1 mg / kg administration group
  • ⁇ indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 lmg / kg administration group
  • ⁇ indicates anti-PERP chimeric antibody KM3481 10 mg / kg administration group, respectively .
  • Bars indicate standard deviation.
  • the present invention relates to an antibody or antibody fragment that specifically recognizes the three-dimensional structure of an extracellular region of a polypeptide encoded by a PERP gene and binds to the extracellular region.
  • Examples of the PERP gene include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Genes containing DNA and the like are also included in the PERP gene of the present invention.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a probe, colony-hybridization method, plaque-hybridization method. , Means a hybridizable DNA obtained by a hybridization method, a DNA microarray method, etc., specifically, a DNA derived from a hybridized colony or plaque, or a PCR product having the sequence.
  • a filter or slide glass on which oligo DNA is immobilized, and perform hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.Omol / L sodium chloride, and then 0.1 to 2 times Filter at 65 ° C using an SSC solution with a concentration of 1x (the composition of a 1x concentration SSC solution consists of 150mmol / L sodium chloride and 15mmol / L sodium citrate).
  • SSC solution with a concentration of 1x
  • the hybridizable DNA includes at least 60% of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding a eukaryotic protein often includes polymorphisms in the gene. Is recognized.
  • the gene used in the present invention in which a small mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such polymorphism, is also included in the PERP gene of the present invention.
  • the polypeptide encoded by the PERP gene includes a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is described in [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laooratory). Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)].
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example:! To 20, more preferably 1 to several, for example:! Five amino acids.
  • the homology value described in the present invention may be a value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified.
  • CI. Mol. Biol., 215. 403 (1990) for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997); Genome Res., ⁇ , 649 (1997); http: // www. Nc bi. Nlm. Nih. Gov / Education / BLASTinfo / information 3. html] Numerical values calculated using default parameters are given.
  • the default parameters are 5 when G (Cost to open gap) is a nucleotide sequence, 11 when G (Cost to extend gap) is an amino acid sequence, and 2 when G (Cost to extend gap) is a nucleotide sequence.
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, a polypeptide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Part of the transformant, and culturing a transformant into which an expression vector containing the same has been introduced. Further, based on the polypeptide or DNA thus produced, an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by the same method as described above. The resulting polypeptide can be obtained.
  • the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene refers to, for example, the amino acid sequence of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 obtained from a known transmembrane region prediction program SOSU I (http: //sosui.proteome. bio.tuat.ac. ⁇ > /sosuiframeO.ntml) or ⁇ 3> ⁇ measurement program TMHMM ver. 2 (http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) The predicted area is mentioned.
  • SOSU I http: //sosui.proteome. bio.tuat.ac. ⁇ > /sosuiframeO.ntml
  • TMHMM ver. 2 http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • the region forces corresponding to the 3575th and 130154th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 2 Regions corresponding to positions 3676 and 129 147 of the amino acid sequence shown are exemplified as extracellular regions.
  • parameters used for prediction use default values for these prediction programs.
  • the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene in the present invention is the 33rd to 75th and 129th of the extracellular domain predicted in the literature [Genes & Development, 14, 704 (2000)]. It may be the area corresponding to the 150th.
  • the antibody or antibody fragment that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention and binds to the extracellular region is a polypeptide of the polypeptide encoded by the PERP gene. It recognizes the native conformation and can bind to the extracellular region of the polypeptide.
  • the native three-dimensional structure of the polypeptide encoded by the PERP gene is the same as the three-dimensional structure that the polypeptide encoded by the PERP gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can take in a natural state. Any structure may be used as long as it has a three-dimensional structure.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma KM3411 (FERM BP-8643) of the present invention can bind to the polypeptide encoded by the PERP gene having such a stereostructure.
  • the monoclonal antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody that binds to the same epitope as the epitope to which the monoclonal antibody produced by hybridoma KM3411 (FERM BP-8643) binds.
  • a method for confirming the binding of the monoclonal antibody produced by the hybridoma KM3411 for example, a known immunological detection method for cells expressing the polypeptide encoded by the PERP gene is used.
  • a method for confirming the binding of an antibody to a specific antigen and a cell expressing a specific antigen, such as a fluorescent cell staining method, is preferably used. Specific examples include the fluorescent antibody staining method described in Example 4 (3) or Example 5 (2) or the immunoprecipitation method described in Example 5 (1).
  • Cells expressing the polypeptide encoded by the PERP gene include cells naturally existing in the human body, cell lines established from cells naturally occurring in the human body, or cells derived therefrom. Examples include cells obtained by gene recombination technology.
  • Examples of cells that naturally exist in the human body include cells in which the polypeptide is expressed in cancer patients.For example, cells expressing the polypeptide in tumor cells obtained by biopsy or the like Is raised.
  • Cell lines established from cells naturally present in the human body include, among cell lines obtained by cellizing cells expressing the polypeptide obtained from the above-mentioned cancer patients.
  • Cell lines expressing the polypeptide for example, cancer cell lines Capan_2 (ATCC HTB-80) or BxPC_3 (ATCC CRL-1687), which are cell lines established from humans; Colorectal cancer cell lines Colo205 (ATCC CCL-222), HT29 (ATCC HTB—38) or WiDr (ATCC CCL—218), lung cancer cell lines NCI—H128 (ATCC HTB—120) or NCI—H69 (ATCC HTB—119) ), Breast cancer cell line MCF7 (ATCC HTB-22) or uterine cancer cell line MCAS FCRB 0240).
  • cancer cell lines Capan_2 ATCC HTB-80
  • BxPC_3 ATCC CRL-1687
  • the cells obtained by the gene recombination technique include, specifically, such a polysaccharide obtained by introducing an expression vector containing a cDNA encoding the polypeptide into insect cells or animal cells.
  • Examples include cells in which the peptide was expressed, and specifically, cells in which the PERP gene expression plasmid pcPERPmH described in Example 4 (1) was introduced and the polypeptide was expressed.
  • Antibodies that specifically recognize the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention and bind to the extracellular region include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. Is a monoclonal antibody.
  • Examples of the monoclonal antibody include an antibody produced by a hybridoma and a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • the hybridoma is prepared, for example, using cells expressing the polypeptide encoded by the above PERP gene as an antigen, and inducing an antibody-producing cell having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, Furthermore, it can be prepared by fusing it with myeloma cells.
  • An anti-PERP antibody can be obtained by causing the animal to develop ascites cancer and separating and purifying the culture solution or ascites.
  • any animal to immunize with an antigen any animal can be used as long as a hybridoma can be produced.
  • a mouse, rat, hamster, rabbit, or the like is preferably used.
  • Antibodies produced by hybridomas produced by obtaining cells capable of producing antibodies from such animals, immunizing the cells in vitro, and then fusing the cells with myeloma cells are also included in the antibodies of the present invention. Included.
  • Specific examples of the monoclonal antibody of the present invention include mouse antibody KM3411 produced by hybridoma KM3411. Based on the Budapest Treaty, Hypridoma KM3411 was registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki, Japan 1-Central 6) based on the Budapest Treaty. — Deposited as 8643.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Recombinant antibodies include antibodies produced by genetic recombination, such as humanized antibodies, human antibodies or antibody fragments. Recombinant antibodies that have the characteristics of monoclonal antibodies, have low antigenicity, and have an extended half-life in blood are preferred as therapeutic agents.
  • the humanized antibody in the present invention includes a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • the human chimeric antibody comprises a heavy chain variable region (hereinafter, referred to as VH) and a light chain variable region (hereinafter, referred to as VL) of a non-human animal antibody and a heavy chain constant region (hereinafter, referred to as CH) of a human antibody. And a light chain constant region (hereinafter, referred to as CL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CH heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention is a hybridoma that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and produces a monoclonal antibody that binds to the extracellular region.
  • CDNAs encoding VH and VL were obtained, and inserted into expression vectors for animal cells having genes encoding human antibodies CH and CL, respectively, to construct human-type chimeric antibody expression vectors. It can be expressed and produced by introducing it into cells.
  • the CH of the human chimeric antibody belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg). Any substance can be used as long as it is of the hlgG class, and any of the subclasses belonging to the hlgG class such as hIgGl, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 can be used.
  • hlgG human immunoglobulin
  • any CL of the human chimeric antibody any CL can be used as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or ⁇ class CL can be used.
  • the human chimeric antibodies of the present invention include the amino acid sequence strengths represented by SEQ ID NOS: 15, 16, and 17, and the VH CDR1, CDR2, and CDR3 of the resulting antibody and / or SEQ ID NOS: 18, 19, respectively.
  • 20 includes a human chimeric antibody comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, CDR1, CDR2, and CDR3 of the VL of the antibody.
  • the VH of the antibody has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • Human-type chimeric antibodies containing the amino acid sequence at positions 19 to 130 and the amino acid sequence of Z or the amino acid sequence at position VL of the antibody represented by SEQ ID NO: 14 to 23: 128 are exemplified.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal to appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
  • the humanized CDR-grafted antibody of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene, and produces a non-human animal monoclonal antibody that binds to the extracellular region.
  • a cDNA encoding the V region of the VH and VL CDRs of the antibody of a non-human animal antibody produced from a hybridoma grafted to the VH and VL FR of any human antibody was constructed, and the human antibody CH And a human CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting it into an expression vector for animal cells having a gene encoding CL and CL, and expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • any amino acid sequence of FR of VH and VL derived from human antibody can be used.
  • it is registered in databases such as the Protein Data Bank, and the human antibodies VH and VL are used in the amino acid sequence of FRs for amino acids, or Sequences of Proteinsoi Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991). )), The common amino acid sequence of each subgroup of FRs of VH and VL of a human antibody and the like are used.
  • the CH of the human CDR-grafted antibody if it belongs to hlg, it may be quite good, Classes are preferred, and any of the subclasses hIgGl, hIgG2, hIgG3, hlgG4 belonging to the hlgG class can be used.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and those having K class may be those of ⁇ class.
  • the human CDR-grafted antibodies of the present invention include amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 15, 16, and 17, CDR1, CDR2, CDR3, and Z of antibody VH or SEQ ID NOs: 18, 19, respectively.
  • a human CDR-grafted antibody comprising CDR1, CDR2, CDR3 of VL, or an antibody fragment thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 corresponds to the VH of the antibody. 27th Gly, 30th Ser, 41st Pro, 44th Lys, 45th Gly, 72th Val, and 97th of the amino acid sequence IJ shown in SEQ ID NO: 25.
  • An amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Ala is replaced and Z or the VL of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or the third Gln of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 , 5th Thr, 35th Human CDR-grafted antibodies comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Tyr, Ala at position 42, Leu at position 46, Phe at position 70, and Leu at position 77 are substituted.
  • Human antibody originally refers to an antibody naturally present in the human body.
  • human antibody phage libraries prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques have been described.
  • Antibodies obtained from antibody-producing transgenic animals are also included.
  • Antibodies that naturally exist in the human body include, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the cells to produce the antibody-producing lymphocytes.
  • the antibody can be purified from the inside.
  • the human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by introducing an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, the phage expressing the antibody fragment having the desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, transplanting the ES cells into an early mouse embryo, and then developing the embryo.
  • Human antibodies can be produced from human antibody-producing transgenic animals by obtaining human antibody-producing hybridomas by the normal hybridoma production method used for non-human animals and culturing them. It can produce and accumulate antibodies.
  • the antibody fragments of the present invention include Fab, F (ab '), Fab', scFv, diabody, dsFv and
  • Examples include peptides containing CDRs.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with proteolytic enzyme papain (which is cleaved at amino acid residue 224 of H chain). About half of the N-terminal side of H chain and the entire L chain are disulfide. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is bound by bonding.
  • the Fab of the present invention is obtained by treating a monoclonal antibody that specifically recognizes the conformation of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and binds to the extracellular region with the protease papain. Can be obtained. Alternatively, encoding the Fab of the antibody
  • the DNA can be produced by inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • F (ab ') separates the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme pepsin.
  • F (ab ') of the present invention is an extracellular region of a polypeptide encoded by a PERP gene.
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes the three-dimensional structure of and binds to the extracellular region can be obtained by treating with a protease pepsin.
  • the following Fab ′ can be prepared by a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ' has a molecular weight of about 50,000 in which the disulfide bond in the hinge region of F (ab') has been cleaved.
  • An antibody fragment having an antigen-binding activity having an antigen-binding activity.
  • Fab ′ of the present invention is a polypeptide extracellularly encoded by the PERP gene of the present invention.
  • a DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody may be inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector may be expressed and produced by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. Can be.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter, referred to as P). And an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • the scFv of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, and obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that binds to the extracellular region.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv, and is an antibody fragment having bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activities can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, and encodes the monoclonal antibodies VH and VL that bind to the extracellular region.
  • the cDNA encoding scFv is obtained, the DNA encoding the scFv is constructed so that the amino acid sequence of P has a length of 8 residues or less, and the DNA is inserted into one prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector.
  • the expression vector can be expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote.
  • the dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, which is linked via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • the dsFv of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, and encodes VH and VL of monoclonal antibodies that bind to the extracellular region.
  • the peptide containing the CDR comprises at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide containing the CDR of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, and binds to VH and VL of monoclonal antibodies that bind to the extracellular region.
  • a CDR-encoding DNA is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. be able to.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the antibody of the present invention specifically recognizes the tertiary structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, and binds to the antibody or antibody fragment that binds to the extracellular region with a radioisotope or a small molecule. And derivatives of antibodies obtained by chemically or genetically linking other drugs, macromolecular drugs, proteins and the like.
  • the derivative of the antibody of the present invention can be used for the N-terminal or C-terminal of the H chain or L chain of an antibody or antibody fragment that recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention.
  • Radioisotopes, low-molecular-weight drugs, high-molecular-weight drugs, proteins, etc. to appropriate substituents or side chains in the antibody or antibody fragment thereof, as well as the sugar chains in the antibody or antibody fragment, using a chemical method [antibody Introduction to Engineering, Osamu Kanemitsu, Jinjinshokan (1994)].
  • a DNA encoding an antibody or an antibody fragment that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention and binds to the extracellular region can be produced by ligating a DNA encoding the protein to be expressed, inserting it into an expression vector, introducing the expression vector into a suitable host cell, and expressing it.
  • the radioisotope includes 131 ⁇ , 125 ⁇ , and the like, and can be bound to an antibody by, for example, the chloramine T method.
  • low-molecular-weight drugs examples include alkylating agents such as nitrodine 'mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, and antibiotics such as daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, and doxorubicin.
  • alkylating agents such as nitrodine 'mustard and cyclophosphamide
  • antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate
  • antibiotics such as daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, and doxorubicin.
  • Anticancer drugs such as plant alkaloids such as vincristine, vinblastine, and vindesine, hormonal drugs such as tamoxifen and dexamethasone [Clinical Oncology, edited by the Japanese Society for Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], or Hydguchi cortisone, prednisone Steroids such as aspirin and indomethacin; immunomodulators such as gold thiomalate and penicillamine; immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine; Lamin, anti-inflammatory agents, such as antihistamines such as Kuremashichin [inflammation and anti-inflammatory therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)] and the like.
  • a method for binding daunomycin to an antibody a method for binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, and a method for binding the amino group of daunomycin to the carboxy group of the antibody via water-soluble carbodiimide. And the like.
  • Examples of the high molecular drug include polyethylene glycol (hereinafter, referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polybutylpyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • PEG polyethylene glycol
  • albumin dextran
  • polyoxyethylene polyoxyethylene
  • styrene maleic acid copolymer polybutylpyrrolidone
  • pyran copolymer polyhydroxypropyl methacrylamide
  • PEGylation modifying reagent examples include modifying agents for the ⁇ -amino group of lysine (JP-A-61-178926), modifying agents for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (JP-A-56-23587), and modification of the guanidino group of arginine. Agents (JP-A-2-117920).
  • proteins include cytokins that activate immunocompetent cells, such as human interleukin 2, human granulocyte macrophage colony stimulating factor, human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12, and the like. Further, toxins such as ricin and diphtheria toxin having an activity of directly damaging cancer cells can be used.
  • a fusion antibody with a protein a cDNA encoding the protein is linked to a cDNA encoding the antibody or antibody fragment, a DNA encoding the fusion antibody is constructed, and the DNA is used for prokaryotes or eukaryotes.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the gene into an expression vector and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote to cause expression.
  • the fusion antibody When the fusion antibody is used as a detection method, a quantification method, a detection reagent, a quantification reagent, or a diagnostic agent, there may be mentioned a label used in a usual immunological detection or measurement method.
  • the label include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, and luciferase; luminescent substances such as ataridinium esters and oral fins; and fluorescent substances such as fluorescin'isothianate (FITC) and RITC.
  • Polypeptides used in the present invention are described in [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997)] and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide can be expressed in host cells by the following method, for example, by the following method to produce the polypeptide.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a cDNA encoding the polypeptide into the downstream of an appropriate expression vector promoter. Also in this case, a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion may be prepared based on the full-length cDNA, and the DNA fragment may be used in place of the full-length cDNA. Les ,.
  • a transformant that produces a polypeptide can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • any Escherichia coli and animal cells can be used as long as they can express the target gene.
  • An expression vector that can be autonomously replicated in a host cell to be used or integrated into a chromosome and contains an appropriate promoter at a position where DNA encoding a polypeptide can be transcribed is used.
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in the prokaryote and, at the same time, contains a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA and the transcription used in the present invention.
  • the vector contains a termination sequence.
  • the recombinant vector may further contain a gene that controls a promoter.
  • expression vectors include ⁇ ⁇ ⁇ 2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE — 8 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (198 4)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], Natl. Acad. Sci.
  • coli IGHA2 (FERM BP-400), JP-A-60-221091], pGKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798) Prepared from JP-A-60-221091], pTerm2 (US468 6191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 U. Bacteriol., 172.2392 (1990)], pGEX (Pharmacia) , PET system (Novagen), pME 18SFL3 and so on.
  • Any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used. It may be something.
  • promoters derived from Escherichia coli, phage and the like such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be mentioned.
  • artificially designed and modified promoters such as a tandem promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, a letl promoter and the like can also be used.
  • Examples of the recombinant vector include Shine'Dalgarno, a ribosome binding sequence.
  • a plasmid in which the distance between the (Shine-Dalgarno) sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the base can be substituted so as to be an optimal codon for expression in the host, thereby reducing the production rate of the target polypeptide.
  • a transcription termination sequence is not always necessary for expression of the gene in the above-mentioned recombinant vector, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • prokaryote used as such a host cell for example, a prokaryote belonging to the genus Escherichia or the like can be used.
  • a prokaryote belonging to the genus Escherichia or the like can be used.
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • the polypeptide used in the present invention when produced in Escherichia coli, the polypeptide may be soluble in the cytoplasm, insoluble in the cytoplasm, or in the periplasmic space depending on the type of vector. It can be expressed in an expression mode such as a soluble form.
  • examples of the expression vector include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 3_22979; Cvtotechnology. , 133, (1990)], pAS3-3 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAl / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 QJ. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can exert a function in animal cells.
  • the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene the SV40 early promoter And RetroPinoles promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SR promoter and the like.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of host cells include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH ⁇ cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 cells (Japanese Patent Publication No. 63-299). I can give it.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the canolacim phosphate method Unexamined Japanese Patent Publication No. 2-227075
  • the Lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production can be performed according to the method described in [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. , Fusion protein expression, and the like. When expressed in eukaryotic cells, a sugar or sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the polypeptide used in the present invention is produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the polypeptide in a culture, and collecting the polypeptide from the culture. be able to.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside or the like is used.
  • indoleacrylic acid is used. Add the media to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199. 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122. 501 (1952)], Danorebecco-modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Pro So Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] Or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium. Culture is usually performed at pH 6-8, 30-40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or the like having a recombinant vector into which the DNA encoding the polypeptide used in the present invention has been integrated is cultured according to a conventional culture method.
  • the polypeptide used in the present invention can be produced by producing and accumulating the polypeptide and collecting it from the culture.
  • Methods for producing a polypeptide include a method in which the polypeptide is produced in the host cell, a method in which the polypeptide is secreted out of the host cell, and a method in which the polypeptide is produced on the host cell outer membrane, and an appropriate method is selected from the host cells to be used. be able to. Alternatively, it may be produced by fusion with an arbitrary protein by protein engineering and expressing as a fusion polypeptide.
  • polypeptide is isolated and purified from the culture or the like as described below, for example. That can be S.
  • the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then suspended in an ultrasonic crusher, French press, Manton-Gaurin homogenizer, Dynomill, etc. To obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Tylaminoethyl (DEAE) —Anion exchange chromatography using a resin such as Sepharose or DIAION HPA_75 (Mitsubishi Chemical), or cation exchange using a resin such as S_Sepharose FF (Pharmacia) Chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using a molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Electrophoresis such as electrophoresis can be used alone or in combination to obtain a purified or purified sample.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain insoluble granules of the polypeptide as a precipitate fraction. Collect.
  • the recovered insoluble granules of the protein are solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution, the protein is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified sample of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide or its derivative such as a modified sugar can be collected in the culture supernatant. That is, the culture is treated by a technique such as centrifugation as described above to obtain a culture supernatant from which solid substances have been removed, and the same isolation and purification method as described above is used from the culture supernatant. As a result, a purified sample can be obtained.
  • the polypeptide used in the present invention or a partial peptide of the polypeptide may be synthesized by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t_butyloxycarbonyl method). Can also be manufactured. Also, Advanced ChemTech Inc., Nono 0 one Kin 'Enorema Inc., Pharmacia, Inc., Protein Technology I nstrument Co., Synthecell-Vega Co., PerSeptive Co., peptidases such as Shimadzu Chemical synthesis can also be performed using a metal synthesizer.
  • a polypeptide obtained by the above method or a peptide having a partial sequence of the polypeptide can be used as an antigen.
  • mice rats or hamsters aged 3 to 20 weeks are immunized with the antigen prepared as described above, and the antibody-producing cells in the spleen, lymph nodes and peripheral blood of the animal are collected.
  • Immunization is achieved by administering the antigen subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant (for example, Complete Freund's Adjuvant, hydroxylamine hydroxide gel, and B. pertussis vaccine).
  • an appropriate adjuvant for example, Complete Freund's Adjuvant, hydroxylamine hydroxide gel, and B. pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant for example, Complete Freund's Adjuvant, hydroxylamine hydroxide gel, and B. pertussis vaccine.
  • a conjugate is prepared with a carrier protein such as BSA (key serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) and used as an immunogen.
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. 3-7 after each dose
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the serum. The fact that the polyclonal antibody specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and has an activity of binding to the extracellular region is described in (6) below. You can find out by:
  • tissues containing antibody-producing cells such as spleen were excised from immunized mice, rats or hamsters on days 3 to 7 after the final administration of the antigen, and the antibody-producing cells were isolated. Collect.
  • spleen cells When spleen cells are used, the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and the supernatant is discarded. Treat with ammonium buffer (pH 7.65):! ⁇ 2 min to remove red blood cells, wash three times with MEM medium and provide as antibody-producing cells for fusion. (3) Preparation of myeloma cells
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c mouse
  • myeloma cell line P3—X63Ag8—U1 (P3U-Gri [Gmreirt Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1, ⁇ 978)]
  • P3 — NSl / l—Ag41 (NS—l) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)]
  • SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276.269 (1978)]
  • P3—X63 — Ag8 653 653) [J. Immunology, 123.
  • PEG- 1000 polyethylene of glycol one 1000
  • PERP was selected by the hybridoma selection method described below.
  • a gel containing a hybridoma that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the gene and produces an antibody that binds to the extracellular region is selected.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time, use HT medium (HAT medium without aminopterin), and second time, use normal medium), and a stable and strong antibody titer was observed. The obtained one is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma strain.
  • Pristane treatment [2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) O. 5 mL was intraperitoneally administered and bred for 2 weeks] 8-: For 10-week-old mice or nude mice, The obtained anti-PERP monoclonal antibody-producing hybridoma cells (2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 7 cells / animal) are injected intraperitoneally. The hybridoma becomes ascites cancer in 10 to 21 days.
  • mice ascites fluid was collected, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to remove solids, salted with 40-50% ammonium sulfate, and then subjected to force prillic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, Purification is performed using an A-column or gel filtration column, and IgG or IgM fractions are collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the antibody is determined by an enzyme immunoassay using a subcluster typing kit.
  • the quantification of the protein amount is calculated by the Lowry method and the absorbance at 280 nm.
  • the polypeptide encoded by the PERP gene must be naturally occurring in the human body. Any method that can be used to examine the binding to cells that exist in cells, cell lines established from the human body, or cells obtained by genetic recombination technology. Use the FMAT8100HTS system (Applied Biosystems). Methods include fluorescent antibody staining and fluorescent cell staining using flow cytometry. Specific methods are described in Example 4 (3) or Example 5 (2). Method.
  • Cells in which the polypeptide encoded by the PERP gene naturally exists in the human body, human internal cell lines, and cells obtained by genetic recombination techniques include the cells described above. It is preferable to use cells expressing the polypeptide encoded by the PERP gene obtained by a genetic recombination technique in which the presence or absence of the expression of the polypeptide is clear. Such cells obtained by the genetic recombination technique facilitate preparation of cells in which the polypeptide is not expressed as a negative control.
  • hybridoma that produces the monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention, which is selected by the above-mentioned method, include a hybridoma that produces the monoclonal antibody KM3411 Cell line K M341 1 (FERM BP-8643) and the like.
  • a method for preparing a humanized antibody such as a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody will be described below.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which DNAs encoding human antibody CH and CL have been incorporated, and DNAs encoding human antibody CH and CL have been added to the expression vector for animal cells, respectively. It can be constructed by cloning.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody, such as CH1 of the human antibody subclass 1 and CL of the kappa class.
  • the DNA encoding CH and CL of the human antibody it is preferable to use chromosomal DNA consisting of exon and intron, or to use cDNA capable of using cDNA.
  • Any vector can be used as long as it can integrate and express a gene encoding the C region of a human antibody. For example, pAGE107 (Cytotechnol., 3, 133 (1990)), pAGE103 (l. Biochem., 101, 1307 (1987), pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984) pKCR [Proc. Natl.
  • promoter and enhancer used in the present invention include the early promoter of SV40 I. Biochem., 101, 1307 (1987)] and the LTR of Moroni mouse leukemia virus [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149. 960 (1987)]. ], An immunoglobulin H chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [ ⁇ 611, 33, 717 (1983)].
  • the humanized antibody expression vector can be used either in a type in which the antibody H chain and L chain are present on separate vectors or in a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector.
  • a tandem humanized antibody expression vector in view of ease of construction of expression vectors, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells. Are preferable. Immunol. Methods, 167.271 (1994)].
  • tandem humanized antibody expression vectors examples include pKANTEX 93 (WO97 / 10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] and the like.
  • the constructed humanized antibody expression vectors include human chimeric antibodies and It can be used to express human CDR-grafted antibodies in animal cells.
  • CDNAs encoding antibodies of animals other than humans, for example, VH and VL of mouse antibodies, can be obtained as follows.
  • Extract mRNA from hybridoma cells producing mouse antibodies and synthesize cDNA The synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library. Using the DNA encoding the C region or V region of the mouse antibody as a probe from the library, cDN encoding VH or VL A recombinant phage or recombinant plasmid having A is isolated. The entire nucleotide sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH or VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • Methods for preparing total RNA from hybridoma cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., ⁇ , 3 (1987)], and methods for preparing total RNA, (DT) immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)].
  • kits for preparing mRNA for the hybridoma cell force include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which a cDNA synthesized by converting mRNA extracted from a hybridoma cell into type II can be inserted, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL 1-Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 U. Mol Biol., 166.1 (1983)], K802 Q [. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] I / JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]
  • a colony immunization method using an isotope or fluorescently labeled probe or It can be selected according to the plaque-noisy hybridization method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)].
  • primers are prepared, and cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA is used as a type II for the Polym erase Chain Reaction [hereinafter referred to as PCR method; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition ⁇ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); cDNA encoding VH or VL can also be prepared according to Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34].
  • PCR method Polym erase Chain Reaction
  • the cDNA selected by the above method is digested with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger (Sanger, F.) et al., And performed a reaction such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acc. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] and the like, and an automatic base sequence analyzer, for example, ALF DNA sequencer (Pharmacia).
  • the nucleotide sequence of the cDNA can be determined by analysis using such a method.
  • the determined amino acid sequences VH and VL were deduced from the total amino acid sequences, respectively, and the known amino acid sequences of VH and VL were determined. [J [Sequences of Proteins of Immunological al Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], it can be confirmed whether the obtained cDNA encodes the complete amino acid sequence of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence. For the complete amino acid sequence of VH and VL of antibodies, including the secretory signal sequence, see VH and V of known antibodies. The length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated by comparing the total length of L with the amino acid sequence Ij [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.
  • VH and VL CDR amino acid sequences are also compared with the VH and VL amino acid sequences of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Can be found.
  • CDNA encoding the VH or VL of a non-human animal antibody is located upstream of each of the genes encoding the CH or CL of the human antibody in the vector for expression of the human antibody described in 2 (1) of this section. It can clone and construct a human-type chimeric antibody expression vector.
  • the cDNA encoding the VH or VL of the antibody of the non-human animal can be obtained by combining the nucleotide sequence at the 3 'end of the VH or VL of the antibody of the non-human animal with the 5' end of the CH or CL of the human antibody.
  • each of the ligated DNAs is composed of a human antibody of the vector for the expression of the HER2 antibody described in item 2 (1) of this section.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each gene encoding CH or CL upstream of each gene so that they are expressed in an appropriate form.
  • cDNA encoding the antibody VH or VL of a non-human animal is amplified by PCR using synthetic DNA having a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at each end, and each is amplified according to (1) of this section. It can also be cloned into the described humanized antibody expression vector.
  • CDNA encoding VH or VL of a human CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, the VH or VL framework region (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the amino acid sequence of the CDR of the VH or VL of the target non-human animal antibody is transplanted. ) Is selected.
  • FR VH or VL framework region
  • any amino acid sequence can be used as long as it is derived from human antibody.
  • the amino acid sequence of human antibody VH or VL FR IJ registered in databases such as the Protein Data Bank, and the common amino acid sequence of each subgroup of human antibody VH or VL FR [ Sequences 01 Proteinsoi Immunological Interest, US Dept.
  • the designed amino acid sequence is converted to a DNA sequence in consideration of the frequency of codon usage found in the base sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • the DNA sequence encoding the VH or VL amino acid sequence of the type CDR-grafted antibody is designed, respectively. Based on the designed DNA sequence, several synthetic DNAs of about 100 bases in length are synthesized, and PCR is performed using them. In this case, it is preferable to design six synthetic DNAs for both the H chain and the L chain in view of the reaction efficiency of the PCR and the length of the DNA that can be synthesized.
  • the humanized antibody expression vector constructed in section 2 (1) of this section can be easily inserted into a humanized antibody expression vector.
  • CDNA encoding the VH or VL of the CDR-transplanted antibody can be cloned.
  • the amplified product was cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence was determined by the method described in (2) of this section 2 to obtain the desired human DNA.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL of the CDR-grafted antibody is obtained.
  • Human CDR-grafted antibody is only VH and VL CDR of the target non-human animal antibody It is known that simply transplanting the antibody into human antibody VH and VL FR reduces its antigen-binding activity as compared to the original non-human animal antibody [BIO / TECHNOLOG Y, 9, 266 (1991)]. This is due to the fact that not only the CDRs but also the FRs and some amino acid residues of the original non-human animal antibodies VH and VL are directly or indirectly involved in antigen binding activity. It is considered that these amino acid residues are changed to different amino acid residues of FR of human antibody VH and VL with CDR transplantation.
  • the human CDR-grafted antibody uses amino acid residues involved in direct binding to the antigen and CDR amino acid residues in the amino acid sequence of FRs of VH and VL of the human antibody. Identifies amino acid residues that interact with or maintain the three-dimensional structure of the antibody and indirectly participate in antigen binding, and identify those amino acid residues that were originally found in the antibody of the non-human animal. To reduce the antigen binding activity [BIO / TE CHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. In the production of human CDR-grafted antibodies, the most important point is how to efficiently identify the amino acid residues of FR involved in the antigen-binding activity. For this reason, X-ray crystallography. Mol.
  • Modification of the amino acid residues of FRs of VH and VL of a human antibody can be achieved by performing the PCR method described in (4) of this section 2 using synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence of the amplified product after PCR is determined by the method described in (2) of this section 2 to confirm that the desired modification has been made.
  • an appropriate restriction enzyme is attached to the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends.
  • the humanized antibody expression vector described in Section 2 (1) can be expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody. Each can be cloned.
  • the humanized antibody expression vectors described in (3) and (6) of this section 2 or expression vectors obtained by modifying them Can be used for transient expression of a humanized antibody.
  • any host cell capable of expressing the human antibody can be used, even if it is a suitable cell.
  • CRL1651 is commonly used [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)].
  • Examples of a method for introducing an expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)] and the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 , 7413 (1987)].
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include an electoporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any host cell that can express a humanized antibody can be used.
  • mouse S P2 / 0—Agl4 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63—Ag8.653 cells ATC C CRL1580
  • dhfr dihydrofolate reductase gene
  • proteins such as enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose, and 6-position of N-acetyldanorecosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex-type sugar chains
  • Proteins such as enzymes involved in glycosylation at the 1-position of fucose or sugar nucleotides in the cell GDP-host cells with reduced or deleted activities such as proteins involved in the transport of fucose to the Golgi apparatus, preferably
  • CHO cells lacking the 1-6 fucose transferase gene described in WO05 / 35586 can also be used.
  • the transformant that stably expresses the humanized antibody can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 25791/1990, G418 sulfate (hereinafter referred to as G418: (SIGMA Co., Ltd.) and the like.
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL301 medium JRH EX-CELL301 medium JRH
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium manufactured by Invitrogen
  • FBS fetal bovine serum
  • the humanized antibody can be expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the transformed strain can increase the expression level of the humanized antibody using a dhfr amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • the Hitoidani antibody should be purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A column.
  • the molecular weight of the purified H chain, L chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE: Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting method [Monoclonal Antibodies—Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the binding activity of the purified antibody or antibody fragment of the present invention to an antigen and the binding activity to a PERP-expressing cell line can be determined by ELISA or immunofluorescence [Cancer Immunol. Immunot her., 36, 373 (1993)] or BIAcore TM. It can be measured by the used surface plasmon resonance or the like.
  • the cytotoxic activity against an antigen-positive cultured cell line can be evaluated by measuring CDC activity, ADCC activity and the like [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • the polypeptide encoded by the PERP gene or cells expressing the polypeptide are detected using the antibody or antibody fragment of the present invention. Alternatively, by quantification, a disease associated with the polypeptide can be diagnosed.
  • Examples of the disease involving the polypeptide encoded by the PERP gene include cancers, such as cancer, as long as the disease involves cells expressing the polypeptide.
  • Cancers include epithelial-derived cancers. Specific examples include breast cancer, uterine cancer, colorectal cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, There are prostate cancer and knee cancer.
  • the biological sample from which the polypeptide encoded by the PERP gene is detected or measured includes tissue cells, blood, plasma, serum, knee fluid, urine, feces, tissue fluid, culture fluid, and the like. Is not particularly limited as long as it may contain the polypeptide.
  • Diseases associated with the polypeptide encoded by the PERP gene include those diseases. Diseases whose expression is fluctuated, specifically, cancer.
  • Diagnosis of cancer can be performed, for example, as follows.
  • Biological strength of a plurality of healthy subjects Using the antibody or the antibody fragment of the present invention or a derivative thereof, a biological sample collected from a biological sample of a polypeptide encoded by the PERP gene was obtained by the following immunological technique. After detection or measurement, the amount of the polypeptide in the biological sample of a healthy subject is checked. The abundance of the polypeptide is similarly examined in the biological sample of the subject, and the abundance is compared with the abundance of healthy subjects. If the amount of the polypeptide in the subject is increased as compared to that in a healthy subject, it can be diagnosed as positive for cancer.
  • the diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment of the present invention or a derivative thereof may include a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • Reagents for performing the antigen-antibody reaction include buffers, salts and the like.
  • the detection reagent may be a conventional immunological reagent such as an antibody or antibody fragment, or a derivative thereof, or a labeled secondary antibody that recognizes the antibody or antibody fragment, or a derivative thereof, or a substrate corresponding to the label. Reagents used for the detection or measurement method can be mentioned.
  • any known method can be used as a method for detecting or measuring the amount of the polypeptide encoded by the PERP gene.
  • an immunological detection or measurement method can be mentioned.
  • the immunological detection or measurement method is a method for detecting or measuring the amount of an antibody or the amount of an antigen using a labeled antigen or antibody.
  • Immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay (luminescent immunoassay), and Western immunoassay. Examples include plotting methods and physicochemical methods (TIA, LAPIA, PCIA). Any method may be used as long as it is a method for detecting or measuring an antigen, but preferably includes an immunoprecipitation method or a fluorescent cell staining method.
  • a radioactive substance-labeled immunoantibody method for example, an antigen of the present invention is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen, and then a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted. After that, measure with a scintillation counter etc. There is a method.
  • an enzyme immunoassay for example, an antibody of the present invention is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen, and then a labeled anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment is reacted. Thereafter, a method of measuring the coloring dye with an absorptiometer can be used, and for example, a sandwich ELISA method or the like is used.
  • a label used in the enzyme immunoassay as described above, any known enzyme label (enzyme immunoassay, edited by Eiji Ishikawa et al., Medical Shoin) can be used. For example, an alkaline phosphatase label, a peroxidase label, a luciferase label, a biotin label, and the like can be used.
  • the sandwich ELISA method is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting the trapped antigen with a second antibody.
  • ELIS A method two types of antibodies or antibodies that recognize the antigen to be detected or measured and have different antigen recognition sites are prepared, and one of the two antibodies or antibody fragments is previously plated (for example, The second antibody or antibody fragment should be labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the plate on which the antibody was adsorbed was reacted with cells or its disrupted solution, tissue or its disrupted solution, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites, eye fluid, etc., separated from the body, and then labeled.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment is reacted and a detection reaction is performed according to the labeling substance.
  • the antigen concentration in the test sample can be calculated from a calibration curve prepared by serially diluting an antigen having a known concentration.
  • Antibodies used in the sandwich ELISA method include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, such as Fab, Fab ', and F (ab).
  • Antibody fragments may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of a monoclonal antibody or an antibody fragment that recognizes a different epitope, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or an antibody fragment.
  • Fluorescence immunoassay the literature [Monoclonal Antibodies -Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996); single black 1 to emissions antibody ⁇ Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)], etc. The method described in It is.
  • any known fluorescent label (Akira Kawao, fluorescent antibody method, Soft Science) can be used as the label used in the fluorescent immunoassay.
  • FITC label, RITC label and the like can be used.
  • the label used in the luminescent immunoassay may be any known luminescent substance [Imai Kazuhiro, edited by Bioluminescence and Chemiluminescence, Hirokawa Shoten; Clinical Laboratory 42 (1998)]. Signs. For example, an ataridinium ester label, a mouth fin label, and the like can be used.
  • Cells and tissues expressing the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are lysed, and the amount of protein per lane is reduced from 0 :! to 30 ⁇ to SDS-P under reducing conditions.
  • Electrophoresis by AGE method Transfer the electrophoresed protein to PVDF membrane and react with PBS containing 1% BSA (BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform the blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1% BSA
  • the monoclonal antibody of the present invention was reacted, washed with PBS containing 0.05% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and reacted with peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG for 2 hours at room temperature.
  • the physicochemical technique specifically refers to the use of the antibody of the present invention that specifically binds to the polypeptide encoded by the PERP gene, and the use of the polypeptide encoded by the PERP gene as an antigen and the present invention. Aggregation is formed by binding to the antibody of the present invention, and this aggregation is detected.
  • Other physicochemical methods include a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, and a latex immunoturbidimetric method, etc. [Procedure of Clinical Testing Methods, Kanehara Shuppan, 499 (1998)].
  • a carrier such as polystyrene latex having a particle diameter of 0 :! to about 1 ⁇ m sensitized with an antibody or an antigen is used.
  • the reaction is caused, the scattered light in the reaction solution increases, and the transmitted light decreases.
  • the antigen concentration in the test sample can be measured.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes the conformation of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and can bind to the extracellular region, and thus the polypeptide is expressed. It is suitably used for detecting cells.
  • Suitable immunological detection methods can be used for the detection of cells expressing the polypeptide, and immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemistry, and immunohistochemistry can be used. It is preferably used. Also, a fluorescent antibody staining method using FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can be used.
  • the immunoprecipitation method refers to a carrier having specific binding ability to immoglopurin such as protein G-sepharose after reacting cells expressing the polypeptide or the like with the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention. To precipitate the antigen-antibody complex. Alternatively, it can be performed by the following method.
  • BSA-PBS After immobilizing the above-mentioned antibody of the present invention on a 96-well plate for ELISA, blocking is performed with BSA-PBS. If the antibody has not been purified, for example, if it has not been purified, such as a culture supernatant of a hybridoma strain, anti-mouse immunoglobulin or rat immunoglobulin or protein A or G can be used for ELISA in advance. After immobilization on a 96 ⁇ L plate, blocking with BSA-PBS, Dispense and combine Qing. After discarding BSA-PBS and washing well with PBS, a lysate of cells or tissues expressing the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is reacted. The immunoprecipitate is extracted from the well-washed plate using a sample buffer for SDS-PAGE, and detection is performed by Western blotting as described above.
  • the immunocytostaining method and the immunohistochemical staining method refer to the method of the present invention after treating cells or tissues expressing an antigen with a surfactant or methanol in order to improve antibody permeability in some cases. After reacting the antibody, and then reacting with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment that has been labeled with a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label, the label is visualized, and then microscopically observed with a microscope.
  • a fluorescent label such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label
  • the cells are reacted with a force- or fluorescent-labeled antibody, and the cells are analyzed by a fluorescent antibody staining method (flow cytometry), which is analyzed with a mouth-cytometer.
  • a fluorescent antibody staining method flow cytometry
  • Column f; ⁇ _ is determined using the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific (1987)], etc. It can be carried out.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene and can bind to the extracellular region. It is preferably used for detection of cells that are retained and expressed.
  • the fluorescent antibody staining method using the FMAT8100HTS system refers to the formation of an antibody-antigen complex and free antibody or antigen not involved in the formation of the antibody-antigen complex.
  • This is a homogenous assay method that can measure the amount of antigen or antibody without separating the same, and specific examples include the method described in Example 4, (3) -3.
  • the antibody or the antibody fragment that specifically recognizes the three-dimensional structure of the extracellular region of the polypeptide encoded by the PERP gene of the present invention and binds to the extracellular region involves the polypeptide encoded by the PERP gene. It can be used for the treatment of diseases that occur.
  • the disease associated with the polypeptide encoded by the PERP gene is not particularly limited as long as it is a disease involving cells expressing the polypeptide, such as cancer.
  • Cancers include epithelial-derived cancers. Specific examples include breast cancer, uterine cancer, colorectal cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, There are prostate cancer and knee cancer.
  • a therapeutic agent for cancer using an antibody against the polypeptide encoded by the PERP gene includes a therapeutic agent for cancer characterized by controlling the activity of the polypeptide encoded by the PERP gene using the antibody. And ADCC activity, CDC activity, or a therapeutic agent for cancer due to apoptosis-inducing action.
  • ADCC activity and CDC activity of the antibody can be measured, for example, by the method described in JP-A-6-205694.
  • An antibody having such an activity can damage cells expressing a specific antigen in m m, and thus can be used as a therapeutic agent for diseases.
  • Humanized antibodies such as human chimeric antibodies having human IgG class antibody constant regions, human CDR-grafted antibodies, and human antibodies have been effectively used as therapeutic agents [Cancer Res., 56, 1118 (1996)].
  • the antibody of the present invention can recognize a polypeptide encoded by a native PERP gene that has not been denatured, the polypeptide encoded by the PERP gene present in vivo is expressed.
  • Cell can be recognized. Therefore, humanized antibodies and human antibodies, such as human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies having human IgG class antibody constant regions containing CDRs of the variable regions of the antibodies, can be used in vivo or in vitro to obtain the PERP gene.
  • the antibody of the present invention to which a high level of ADCC activity has been imparted can be particularly effectively used as a therapeutic agent used for a treatment for reducing cells expressing the antibody.
  • the therapeutic agent containing the antibody or antibody fragment of the present invention or a derivative thereof may contain only the antibody or antibody fragment as an active ingredient or a derivative thereof, but is usually a drug. It is desirable to mix it with one or more physiologically acceptable carriers and provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well-known in the technical field of pharmaceutics.
  • the administration route should be oral, preferably using the most effective one for treatment, or parenteral, such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous. In the case of an antibody or peptide preparation, intravenous administration can be preferably mentioned.
  • Administration forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, dalicols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoic esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, It can be produced using a binder such as hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the antibody or antibody fragment itself, or a carrier that does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody and the carrier used.
  • the ingredients exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • the dosage or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, and the like, but it is usually 10 xg / kg to 8 mg / kg per adult per day.
  • each cell line were subcultured in RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% heat-inactivated ⁇ shea calf serum to give a cell density of each 1 X 10 8 cells / ml
  • a cell suspension was prepared in PBS. 100 / L of the suspension was implanted subcutaneously into the abdominal region of Fox CHASE C.B-17 / lcr-scidJcl mice (male, 5 weeks old, manufactured by CLEA Japan).
  • the diameter of the transplanted cell line or the tumor in which the cell engraftment was observed was measured daily using calipers, and the individual whose tumor major axis reached about lcm was bled to death under anesthesia. After that, each tumor mass was removed. Each tumor mass was cut into four pieces and then snap frozen using liquid nitrogen.
  • a xenograft transplanted with the human splenic carcinoma cell lines PANC-1 and PSN-1 was prepared as follows.
  • RPMI 1640 medium Invitrogen containing 5% heat inactivated ⁇ shea fetal serum using the cell line subcultured, that Do a cell density of each 8 X 10 7 ⁇ 1 X 10 8 cells ZmL
  • a cell suspension was prepared in RPMI 1640 medium containing no serum as described above.
  • BALBZcAJcl_nu mice Male, 8 weeks old, CLEA Japan
  • the diameter of the tumor of the mouse in which engraftment of the transplanted cell line was observed was measured daily using calipers, and the individual whose tumor major axis reached about lcm was killed by cervical dislocation, and then each tumor mass was removed. Removed. Each tumor mass was cut into four pieces and then snap frozen using liquid nitrogen.
  • a xenograft transplanted with a human colon cancer cell line HT-29 (ATCC HTB-38) and a WiDr strain (ATCC CCL-218) was prepared as follows.
  • the diameter of the tumor of the mouse in which the transplanted cell line survived was measured daily using calipers, and the individual whose tumor major axis reached about lcm was sacrificed by cervical dislocation, and then each tumor mass was removed. Each tumor mass was cut into four pieces and then snap frozen using liquid nitrogen.
  • a xenograft transplanted with human colon cancer cell lines Colo205 (ATCC CCL-222), LS174T (ATCC CL-188), LS180 (ATCC CL-187), and SW1116 (ATCC CCL-233) was It was produced as follows.
  • the cells were subcultured in RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen) containing / o inactivated fetal bovine serum, and a cell suspension was prepared with PBS so that the cell density was 1 ⁇ 10 8 cells / mL. 100 ⁇ L of the suspension was implanted subcutaneously on the ventral side of Fox CHASE C.B-17 / lcr—scidjcl mouse (male, 5 weeks old, manufactured by CLEA Japan). The tumor mass excised from the xenograft thus produced was implanted subcutaneously on the ventral side of a syngeneic mouse, and the tumor diameter of the mouse in which the implanted tumor mass survived was measured daily using calipers. After the measurement, the individual whose tumor diameter reached about 1 cm was bled to death under anesthesia, and then each tumor mass was removed. Each tumor mass was cut into four pieces and then rapidly frozen using liquid nitrogen.
  • a cell suspension was prepared from the cell line, patient tissue, and the xenograft prepared in (1) above by the method described below, and then total RNA was extracted and poly A (+) RNA was purified.
  • the medium was removed using an aspirator, washed with PBS, and then collected with a silicon spatula. After adding and suspending 1 mL of TRIzoL Reagent (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) per 10 cm 2 of the culture area, the cells were passed through an 18G injection needle 10 times, and the genomic DNA was cut into cell lysates.
  • TRIzoL Reagent manufactured by Invitrogen Co., Ltd.
  • the cell culture solution is centrifuged at 1500i "pm for 5 minutes using a cooling centrifuge (Hitachi Himac CF15R, w / T11A21 rotor), and the medium is removed by decantation.
  • the cell suspension was centrifuged at 1500i "pm for 5 minutes using a cooling centrifuge (Hitachi Himac CF15R, W / T11A21 rotor), and the supernatant was removed to collect the cells.
  • TRIzoL Reagent Inn of the recovered cell IX 10 7 per lmL (Vitrogen) was added to the suspension, and the suspension was passed through an 18G injection needle 10 times to cut the genomic DNA to obtain a cell lysate.
  • the frozen tumor mass was poured into 10 mL of TRIzoL Reagent (manufactured by Invitrogen), and immediately crushed using a Polytron PT2100 (manufactured by Kinematics) at 30,000 rpm for 15 seconds to obtain a cell lysate.
  • TRIzoL Reagent manufactured by Invitrogen
  • Polytron PT2100 manufactured by Kinematics
  • Each of the obtained cell lysates was centrifuged at 110OOrpm for 10 minutes using a cooling centrifuge (Hitachi Himac CF15R, w / Tl 1 A21 rotor), and taking care not to remove sediment. The supernatant was transferred to each new tube. Add 2 mL of chloroform to the supernatant, shake vigorously for 15 seconds, allow to stand at room temperature for 2 to 3 minutes, and then use a cooling centrifuge (Hitachi Himac CF7 D2, w / RT3S3 rotor) for 90 minutes at 3000 rpm. Centrifuged at C.
  • a cooling centrifuge Hitachi Himac CF15R, w / Tl 1 A21 rotor
  • the total RNA sample was subjected to concentration measurement and purity assay using an absorptiometer, and it was confirmed that the ratio of A260 / A280 was 1.7 or more.
  • purification was further performed using RNeasy kit (manufactured by Qiagen).
  • RNA obtained as described above was purified using a Micro Poly (A) Pure kit (manufactured by Ambion) and the poly A (+) RNA was purified according to the protocol attached to the kit.
  • CDNA was synthesized from the poly A (+) RNA or the commercially available mRNA obtained in the above (2) using the Superscript Fis- ter-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen) according to the manual attached to the kit.
  • mRNA from human normal tissue includes blood, large intestine, heart, kidney, liver, lung, and phosphorus.
  • MRNAs derived from the nodes, knee, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, respiratory tract, uterus and placenta were purchased from BD Clontech and used.
  • human carcinoma-excised tissues include renal clear cell carcinoma (moderately differentiated cancer and well-differentiated cancer) [mixture of 9 male patients 35 to 71 years old and 6 female patients 44 to 63 years old], liver Cell carcinoma (poorly differentiated carcinoma) [mixture from one 69-year-old male patient and one 67-year-old female patient], lung squamous cell carcinoma [mixture from five 46-70-year-old male patients], gastric adenocarcinoma (low (Differentiated cancer, moderately differentiated cancer, well-differentiated cancer) [A mixture of 7 male patients aged 6 to 81 and 2 female patients aged 47 to 58], uterine fibroids [5 female patients aged 29 to 52] A mixture from 6], invasive ductal carcinoma (moderately differentiated cancer) [mixture from 6 cases of female patients aged 45 to 60 years] and esophageal squamous cell carcinoma (poorly differentiated, moderately differentiated, well differentiated cancer) [56 A mixture from 4 cases of
  • the intensity of the fluorescence emitted by SYBR Greenl intercalated into the amplification product was measured using PISM7700 (manufactured by PE Applied Biosystems), and the data angle was measured using the software Sequence detector ver. 1.7a provided with the instrument. The analysis was performed.
  • Whether or not the signole obtained by the above reaction was the target amplified fragment was determined by subjecting the solution after the reaction to agarose gel electrophoresis and determining the size of the main amplified fragment.
  • the above reaction was performed using a 96-well PCR plate.
  • a plasmid PLACE1001407 (GenBank Vector) containing a negative control (sterile water) and a cDNA of the PERP gene purified by Qiagen Plasmid Prep Midi kit (manufactured by Qiagen) session number; AK075082) preparing the calibration curve for preparation prepared using (. 10 to: L0 6 copies Roh well) place, PCR was carried out in the same manner as described above.
  • Tables 1 and 2 show the results of the mRNA expression levels of the PERP gene in each of the samples thus obtained. '.
  • Table 1 shows the expression levels of PERP gene mRNA in various cancer cell lines and xenografts
  • Table 2 shows the mRNA levels of PERP gene in clinical cancer excised tissues and normal tissues.
  • the number of molecules in the table is the value of the number of PERP-expressed molecules per 2 ng of poly A (+) RNA.
  • the * mark in the table indicates that the measured value of the number of PERP-expressing molecules was below the detection limit.
  • the rightmost column in the table shows the PERP gene mRNA expression level in each tissue, assuming that the PERP gene expression level in Trachea (airway), which is the highest in normal tissues, is 1.
  • the PERP gene has low expression in normal human tissues, and is a knee mass cell line derived from a xenograft transplanted with the ASPC-1 and ASPC-1 knee cancer cell lines. Trachea is the most highly expressed human normal tissue in xenograft-derived tumor masses transplanted with vesicles (PC02 and PC03), colon cancer cell line colo 205, and esophageal squamous cell carcinoma in clear cell carcinoma. (Respiratory tract), the expression was more than three times higher.
  • Table 3 shows the expression levels of PERP gene mRNA in the cancerous part and the non-cancerous part adjacent to the cancerous part in the surgically removed specimens of colorectal cancer patients and kidney cancer patients, respectively.
  • the column for the number of molecules in the table shows the number of PERP-expressing molecules in 50 ng of cancer-derived total RNA in each surgically removed specimen.
  • PERP accounts for 50 ng of total RNA from adjacent non-cancerous parts of the same patient and the same specimen. Each represents the number of expressed molecules.
  • the * mark in the table indicates that the measured value of the number of PERP-expressing molecules was below the detection limit.
  • the column of cancerous part Z non-cancerous part in the table shows the ratio of the expression level of PERP gene in the cancerous part to the adjacent non-cancerous part.
  • Cancer Profiling Array (CJLONTECH, Cat. 7841-1, Lot. 2070686; normal tissue force in the vicinity of various cancer tissues and controls. Nylon membrane with dot-blotted cDNA obtained cDNA) PE in tissue and nearby normal tissue
  • Hybridization and detection were performed as follows according to the instruction manual.
  • 1.5 mg of sheared salmon testis DNA (hereinafter referred to as stDNA) was treated at 95 ° C for 5 minutes, quenched in ice, and preheated to 68 ° C. 15 mL of ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH) ), And a hybridization solution A was prepared.
  • CLONTECH ExpressHyb Hybridization Solution
  • stDNA 150 ⁇ g of stDNA was added to 5 ng of the probe, treated at 95 ° C. for 5 minutes, quenched in ice, and added to 5 mL of hybridization solution A to obtain a probe solution.
  • the pre-hybridized Cancer Profiling Array was transferred to a new plastic bag, probe solution was added, and the reaction was performed at 68 ° C for 16 hours. After that, the Cancer Profiling Array wash ⁇ night 1 (2 X SSC, 0. 5 0/0 SDS) of 200mL at 68. C (trowel for 30 minutes ⁇ washing 4 times), repeat with the next 200 ml of washing solution 2 (0.2 X SSC, 0.5% SDS) 68.
  • the washed Cancer Profiling Array was washed with 100 mL of Wash Solution 3 (0.15 mol / L sodium chloride and 0 mL). After washing with 0.1 mol / L maleate buffer (pH 7.5) containing 3% Tween 20 for 2 minutes, 10 mL of blocking solution (0.15 mol / L sodium chloride and 1x concentration of Blocking Reagent) is added. ImolZL maleate buffer pH 7 5) Blocking was performed for 30 minutes.
  • reaction was performed for 30 minutes with an antibody solution obtained by adding 1 ⁇ L of an anti-DIG alkaline phosphatase conjugate antibody to 5 mL of a blocking solution. This was repeated twice with 100 mL of washing solution 3 for 15 minutes, and equilibrated with 20 mL of detection solution (0.1 ImolZL Tris-HCl buffer pH 9.5 containing 0.1 mol / L sodium chloride). 25 ⁇ L of CDP-Star was immersed for 5 minutes in the detection solution containing the mixture. After removing the detection solution, detection was performed with an X-ray film.
  • detection solution 0.1 ImolZL Tris-HCl buffer pH 9.5 containing 0.1 mol / L sodium chloride
  • Fig. 1 shows the cancer tissues (indicated by T in the figure) and nearby non-cancer tissues of breast cancer, uterine cancer, colorectal cancer, gastric cancer, ovarian cancer, lung cancer, rectal cancer, thyroid cancer.
  • the expression of the mRNA of the PERP gene in each part is shown. In many cases, increased expression of PERP was found in the cancerous area compared to nearby normal tissues.
  • Plasmid containing human PERP gene HEMBA1006335 (GenBank accession number; AK074585, lng / L) l / i L, lOX ExTaq buffer 2 / i L, 2 mmol / L d NTP 2 ⁇ L, 10 ⁇ mol
  • a solution consisting of 2 ⁇ L each of primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, 0.5 ⁇ L of ExTaq polymerase (Takara Shuzo), and 10.5 zL of sterile water After heating at 94 ° C for 5 minutes, 25 cycles of a reaction consisting of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute were reacted at 72 ° C for 7 minutes.
  • Reaction products were separated by agarose gel electrophoresis, and an amplified fragment of about 0.6 kb was extracted using GENECLEAN Spin Kit (BI-101).
  • the fragment was ligated to the pCRII-TOPO vector using a TOPO TA cloning Kit (manufactured by Invitrogen), followed by the method of Koen et al. [Proc. Nalt. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)].
  • Dr. spp. Strain DtI5 was transformed.
  • the plasmid was extracted from the resulting transformant using a plasmid extraction kit (Qiagen) to obtain a plasmid pCRII-PERP containing the human PERP gene.
  • pBSmH As a cloning vector for adding a myc-His tag sequence to the 3 'side of the PERP fragment, pBSmH was prepared as follows.
  • pcDNA3.1 (1) / myc—HisC (Invitrogen) was digested with Pmel and the same as above Then, a DNA fragment containing a gene encoding a myc-His tag of about 170 bp was obtained.
  • the fragment and pBluescriptll SK (—) (Stratagene) digested with limil and blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo) were combined with DNA ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo). After ligation, E. coli DH5 strain was transformed.
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant using a plasmid extraction kit (manufactured by QIAGEN) to obtain a plasmid pBSmH.
  • the plasmid is digested with restriction enzyme 1 to generate two fragments of about 2.9 kbp and about 160 bp.
  • the above pCRII-PERP was digested with E ⁇ RI and Hlndlll to obtain a fragment containing the PERP gene.
  • the fragment was ligated with ERI and pBSmH digested with Hlndlll using a DNA ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli DH5 strain.
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant using a plasmid extraction kit (manufactured by QIAGEN) to obtain a plasmid pBS-PERPmH.
  • pBS-PERPmH was digested with EmRI and Xhal to obtain a fragment containing the PERP gene and the gene encoding the myc-His tag.
  • the fragment was ligated with PCDN A3.1 + (manufactured by Invitrogen) digested with ERI using a DNA ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo), and then transformed into Escherichia coli DH5a. Plasmids were extracted from the obtained transformants using a plasmid extraction kit (manufactured by QIAGEN) to obtain human PERP expression plasmid pcP ERPmH.
  • pcPERPmH was introduced into CHO / DG44 cells [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12 (6), 555 (1986)] by the electoral port method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] as follows.
  • the cells were IMDM medium supplemented with 10% fetal serum (manufactured by Life Technology Co., Ltd.), 1X HT supplement (manufactured by Life Technology Co., Ltd.), and 1% Penicillin-streptomycin (manufactured by Life Technology Co., Ltd.) (Life Technology One) (hereinafter referred to as A3 medium) was used.
  • CHO / DG44 cells in K-PBS buffer [137 nmol ZL potassium chloride, 2.7 nmol / L sodium chloride, 8.
  • ImmolZL disodium monohydrogen phosphate, 1.5 nmol / L monosodium dihydrogen phosphate, 4 mmol / L magnesium chloride Buffer solution] to prepare a concentration of 8 ⁇ 10 6 cells / mL, and 200 ⁇ L of the cell suspension is added to the above expression plasmid pcPER. It was mixed with 4 ⁇ g of PmH. The mixed solution was transferred to a cuvette (distance between electrodes: 2 mm), and gene transfer was performed using a GenePulserll (manufactured by Bio-Rad) apparatus under the conditions of a pulse voltage of 0.335 kV and an electric capacity of 250 iF. After allowing the cuvette to stand on ice, the cell suspension in the cuvette was suspended in A3 medium and cultured in a 5% CO incubator at 37 ° C. After 1 day culture
  • the medium was replaced with an A3 medium supplemented with 0.5 mg / mL G418 (manufactured by Calbiochem), and the culture was continued. Subculture was continued with dilution in the middle, and about 2 weeks after the gene transfer, a transformed cell line resistant to G418 was obtained.
  • the obtained transformed cells were diluted with A3 medium supplemented with 0.5 mg ZmL G418 to a concentration of 1.25 cells / mL, and then dispensed in 200 zL aliquots into a 96-well plate by limiting dilution. Cloning was performed.
  • Figure 2 shows the results.
  • a strain in which a signal was observed at a molecular weight of around 25 kDa was designated as a PERP-expressing strain (hereinafter, referred to as PERP / CHO cells).
  • the number of cells per animal is 6 ⁇ 10 6 From 1 ⁇ 10 7 cells.
  • the cells prepared in (2) _1 above were administered to three 6-week-old female SD rats together with 1 ⁇ 10 9 cells of pertussis vaccine (Chiba Prefectural Serum Institute). One week after administration, once a week for a total of 5 doses did. Partial blood was collected from the fundus of the rat, and the antibody titer in the blood was measured by sandwich ELISA shown below. The spleen was excised 3 days after the last immunization from the mouse showing a sufficient antibody titer.
  • the spleen was shredded in MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, and centrifuged (250 X g, 5 minutes). Erythrocytes were removed by adding Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.6) to the resulting precipitate fraction and treating it for 2 minutes. The resulting precipitate fraction (cell fraction) was washed three times with MEM medium and used for cell fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • Anti-c_Myc antibody produced by the MYC 1-9E10.2 cell line was prepared at 10 xg / mL in Dulbecco's PBS on a 96-well EIA plate (Grainer), and the solution was added. The mixture was dispensed with 50 ⁇ L Zell and allowed to stand at 4 ° C. overnight for adsorption. After the plate was washed with PBS, BSA-PBS was added at 100 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups to prepare a reaction plate.
  • cell lysis buffer (l% TritonX, 150 mmol / L sodium chloride, 2 mmol / L magnesium chloride, 2 mmol / L) 50 mmol / L Tris-HCl buffer containing calcium chloride, 0.1% azide, 50 mmol / L eodoacetamide, 50 mmol / L N-ethyl maleimide, lmg / ml leptin, 0.1 mmol / LD TT ⁇ 7.2 After the mixture was left at 4 ° C for 2 hours, the supernatant obtained by centrifugation was dispensed at 50 ⁇ L / L into a reaction plate from which BSA-PBS was removed.
  • ABTS substrate solution [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-16-sulfonic acid) ammonium] was added to 1 L of 0.1 mol / L tenoic acid. Dissolved in a buffer solution (pH 4.2) and added with 1 ⁇ L / mL of hydrogen peroxide solution just before use] at 50 ⁇ L / well to develop color, and absorbance at 415 nm (hereinafter referred to as OD415 etc.) Notation) plate reader (Emax; manufactured by Molecular Devices) It measured using.
  • the rat spleen cells obtained in (2) -2 above and the myeloma cells obtained in (2) _4 were mixed at a ratio of 10: 1, and centrifuged (250 X g, 5 minutes). Discard the supernatant, loosen the precipitated cell group, and stir at 37 ° C with a mixture of 2 g of polyethylene glycol 1000 (PEG-1000), 2 mL of MEM medium and 0.7 mL of dimethyl sulfoxide at 37 ° C. 2-: ImLZ10 8 mouse spleen cells were added, 1-2 ml of MEM medium was added several times every 1-2 minutes, and then MEM medium was added to make the total volume 50 mL. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, the cells were loosened gently, and the cells were suspended in 100 mL of HAT medium by sucking and sucking with a pipette.
  • PEG-1000 polyethylene glycol 1000
  • MEM medium dimethyl
  • This suspension was dispensed at 100 ⁇ L / well into a 96-well culture plate, and 5% CO2
  • the cells were cultured at 37 ° C for 10 to 14 days in one incubator. After culturing, the culture supernatant is examined by the sandwich ELISA method described in (2) -3, and cells that react with PERP / CHO cells but do not react with CHO / DG44 cells are selected. Cloning was repeated twice to establish an anti-PERP antibody-producing hybridoma strain KM3314.
  • FIG. 3 shows the reactivity of KM3314 to PERP / CHO cells and CHOZDG44 cells using the sandwich ELISA described in (2) -3. KM3314 reacted specifically with PERP / CHO cells.
  • Pristane-treated 8-week-old nude female mice (BALBZc) were intraperitoneally injected with 5-20 ⁇ 10 6 cells / animal of the hybridoma strain obtained in (2) -5. After 10 to 21 days, ascites was collected (1 to 8 mLZ mice) from the mice that had accumulated ascites due to ascites cancer of the hybridoma. [0212] The ascites was centrifuged (1200 X g, 5 minutes) to remove solids. Purified IgG monoclonal antibodies were obtained by purification by the force prillic acid precipitation method [Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. When the subclass of the purified anti-PERP mouse antibody KM3314 was determined by ELISA using a subclustering kit, the subclass of the anti-PERP mouse antibody KM3314 was IgG2a.
  • PERP / CHO and CHOZDG44 cells have SDS-PAGE sample buffer ⁇ 2% SDS and 10% glycerol containing 62mmol / L tris - HCl buffer (. PH6 8) ⁇ to be 100 x L added Caro per cell IX 10 7 cells, at 100 ° C heating and sonication to prepare a solubilized fraction.
  • An equivalent amount of 1 ⁇ 10 5 cells was subjected to SDS-PAGE, and the gel after electrophoresis was blotted on a PVDF membrane.
  • BSA-PBS containing the hybridoma KM3314 culture supernatant and the negative control antibody KM1762 (anti-avermectin antibody) at 5 ⁇ g / mL was reacted at room temperature for 2 hours.
  • the membrane was washed with Tween-PBS, and then reacted with peroxidase-labeled ⁇ heron anti-rat immunoglobulin (manufactured by Dako) at room temperature for 1 hour. After the reaction, the membrane was washed with Tween-PBS, and the band to which the anti-PERP antibody was bound was detected using ECL TM Western Blotting Detection Agent (Amersham Pharmacia).
  • FIG. 4 The results are shown in Fig. 4.
  • a band was detected at around 25 kDa in PERP / CHO cells and colon cancer cell line Colo205, indicating that the anti-PERP mouse antibody KM3314 was an antibody capable of detecting PERP by Western blot.
  • the molecular weight of the band detected in PERP / CHO cells The molecular weight of the band detected in colon cancer cell line Colo205 is larger than that in PERP / CHO cells. It was thought to be because it was showing.
  • the PERP-expressing strain constructed in (1) above was prepared with Iscove's Modified D containing 10% fetal bovine serum. After culturing for 2 to 3 days in ulbecco's medium (manufactured by Invitrogen), the cells were suspended in PBS so that the number of cells per animal became from 6 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells.
  • the cells prepared in (3) _1 above were administered to three 6-week-old female Balb / C mice together with 1 ⁇ 10 9 cells of pertussis vaccine (manufactured by Chiba Prefectural Serum Institute). From one week after administration, administration was performed once a week for a total of 5 times. Partial blood was collected from the fundus of the mouse, and a fluorescent antibody staining method was performed using cells having the following antibody titers in the blood, and the cells were collected using an FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) and a flow cytometer (Beckman Coulter). The spleen was excised 3 days after the final immunization from the mouse that had been measured and showed a sufficient antibody titer.
  • the spleen was shredded in a MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, and centrifuged (250 xg, 5 minutes). Erythrocytes were removed by adding Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.6) to the resulting precipitate fraction and treating it for 2 minutes. The resulting precipitate fraction (cell fraction) was washed three times with MEM medium and used for cell fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PERP / CHO cells and CHO / DG44 cells created in (1) were used as cells for Atssey.
  • the cells were cultured for 2 to 3 days in Iscove's Modified Dulbecco's medium [Invitrogen] containing 10% fetal bovine serum, and cells detached with Tripsin-EDTA solution (Invitrogen) were suspended in the same medium.
  • the cells were seeded on a black 96-well plate for FMAT at 7 ⁇ 10 3 cells / 100 ⁇ L medium / well and cultured for 1 hour.
  • the immunized mouse antiserum or hybridoma culture supernatant was dispensed into the plate as a primary antibody in 5 a LZP well, and AL AL647-labeled anti-mouse immunoglobulin G (H + U (manufactured by Molecular Probes) was used as a secondary antibody.
  • H + U manufactured by Molecular Probes
  • PERPZCHO cells and CHO / DG44 cells created in (1) for the cells for Atssey. Culture in Iscove's Modified Dulbecco's medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum for 2 to 3 days, and wash the cells detached with 0.02% EDTA solution (manufactured by Nacalai Tester) with PBS. Then, the cells were blocked with BSA-PBS at ice temperature for 20 minutes to avoid nonspecific adsorption of the antibody.
  • mice spleen cells obtained in (3) -2 and myeloma cells obtained in (3) -5 were mixed at a ratio of 10: 1, and centrifuged (250 X g, 5 minutes). Discard the supernatant, thoroughly dissolve the precipitated cell group, and mix with 2 g of polyethylene glycol 1000 (PEG-1000), 2 mL of MEM medium, and 0.7 mL of dimethyl sulfoxide at 37 ° C with stirring. 2-: lmL / 10 8 mouse spleen cells were added, and: MEM medium: Every 2 minutes:! -2 mL was added several times, and then the MEM medium was added to bring the total volume to 50 mL. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, the cells were loosened gently, and the cells were suspended in 100 mL of HAT medium gently by aspirating and aspirating with a female pipette.
  • PEG-1000 polyethylene glycol 1000
  • MEM medium every 2
  • This suspension was dispensed at 200 ⁇ L / well into a 96-well culture plate, and 5% CO2 was added.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 10 to 14 days in one incubator. After culturing, the culture supernatant is examined by the fluorescent antibody staining described in (3) _3 and (3) -4. Cells that did not react with DG44 cells were selected, and the cells contained therein were repeatedly cloned twice by the limiting dilution method to establish an anti-PERP antibody-producing hybridoma KM3411 (FERM BP-8643).
  • FIG. 5 shows the reactivity of the monoclonal antibody contained in the culture supernatant of the hybridoma KM3411 to PERP / CHO cells and CHOZDG44 cells by the FMAT method.
  • the monoclonal antibody KM3411 produced by the hybridoma KM3411 specifically reacts only with PERP / CHO cells.
  • Pristane-treated 8-week-old nude female mice (BALBZc) were intraperitoneally injected with 5-20 ⁇ 10 6 cells / animal of the hybridoma strain obtained in (2) -5. After 10 to 21 days, ascites was collected (1 to 8 mLZ mice) from the mice that had accumulated ascites due to ascites cancer of the hybridoma.
  • the ascites was centrifuged (1200 X g, 5 minutes) to remove solids.
  • Purified IgG monoclonal antibody was obtained by purification by force prillic acid precipitation method [Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the subclass of the purified anti-PERP mouse antibody KM3411 was determined by ELISA using a subclustering kit, the subclass of anti-PERP mouse antibody KM3411 was IgGl.
  • 96-well ELISA plate is coated with anti-mouse immunoglobulin (manufactured by Dako), Reaction of culture supernatant of hybridoma cells containing anti-PERP mouse antibody KM3411, or culture supernatant of hybridoma cells containing negative control antibody KM511 (anti-granulocyte colony stimulating factor derivative antibody) at 4 ° C overnight I let it. After the reaction, the plate was washed with PBS and blocked with BSA-PBS to avoid nonspecific adsorption.
  • the various cancer cell lines shown in FIG. 8 were detached with a 0.02% EDTA solution (manufactured by Nacalai Tester), washed with PBS, and human immunoglobulin (Elf Eye Co., Ltd.) was used to avoid nonspecific adsorption of antibodies.
  • a 0.02% EDTA solution manufactured by Nacalai Tester
  • human immunoglobulin Elf Eye Co., Ltd.
  • the plate was washed three times again by centrifugation using PBS, suspended in PBS, and the wavelength of 510 to 530 nm excited by a laser beam of 488 nmAr was measured with a flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter).
  • FIG. KM3411 reacted with various cancer cell lines including colon cancer 5Z5, spleen cancer 2/3, lung cancer 4/5, breast cancer 2/2, and uterine cancer 1/1.
  • Mononuclear lymphocytes and monocyte fractions or granulocyte fractions were separated from human peripheral blood by centrifugation using a mono'poly separation solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). After washing with RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum, dispensed at 1 ⁇ 10 6 cells / 100 / L into a 96 well U-shaped plate, and centrifuged (1800 rpm, 2 minutes) After removing the supernatant, the primary antibody was used as a primary antibody, a biotin-labeled anti-PERP mouse antibody KM3411 and a negative control antibody biotin-labeled KM511 (anti-granulocyte colony stimulating factor derivative antibody) as a human immunoglobulin (Elfide) / BSA —Reacted with PBS at ice temperature for 1 hour.
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • fetal bovine serum dispensed at
  • the plate was washed three times with PBS, red / 670-labeled anti-streptavidin (manufactured by Coulter) was added as a secondary antibody at 50 / iL / well, and a FITC-labeled anti-human CD45 antibody (manufactured by Beckman Coulter) was added. 10 / L / well was added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour under ice temperature and protected from light.
  • the plate was washed three times with PBS, suspended in PBS, and the wavelength of 505 to 545 nm or 660 to 700 nm excited by laser light of 488 nm Ar was measured with a flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter).
  • the results are shown in Fig. 9.
  • the fluorescence intensity on the vertical axis indicates the reactivity of the FITC-labeled anti-human CD45 antibody
  • the fluorescence intensity on the horizontal axis indicates the reactivity of the biotin-labeled anti-PERP mouse antibody KM3411 or the negative control antibody piotin-labeled KM511.
  • the biotin-labeled anti-PERP mouse antibody KM3411 did not react with mononuclear cells and granulocytes in human peripheral blood.
  • the reactivity of the anti-PERP mouse antibody KM3411 and the anti-PERP polyclonal antibody (ProSci 2451, Novus Biologicals NB500-231) on PERP-expressing cells was compared by flow cytometry.
  • PERPZCHO cells and CHO / DG44 cells were used as the cells.
  • the cells were cultured in Iscove's Modified Dulbecco's medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum for 2 to 3 days, and cells detached with a 0.02% EDTA solution (manufactured by Nacalai Tester) were washed with PBS. Blocking was performed for 20 minutes at ice temperature using BSA-PBS to avoid nonspecific adsorption of the antibody.
  • the reaction was carried out for 60 minutes. After washing three times with PBS, FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin G (H + L) (manufactured by Caltag) or FITC-labeled anti-saginymoglobulin G (H + L) (manufactured by Capel) is used as a secondary antibody.
  • the solution was added at 20 ⁇ L / well and allowed to react for 30 minutes under ice-shade and light shielding. The plate was washed three times again by centrifugation using PBS, suspended in PBS, and the wavelength of 510 to 530 nm excited by laser light of 488 nmAr was measured with a flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter).
  • Fig. 10 The results are shown in Fig. 10.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity. Only the anti-PERP mouse antibody KM3411 has a different fluorescence intensity between PERPZCHO cells and CHO / DG44 cells, indicating that only the anti-PERP mouse antibody KM3411 specifically reacts with the expressed PERP.
  • BD SMART TM RACE cDNA Amplification Kit manufactured by BD Biosciences
  • 1 ⁇ g of the anti-PERP mouse antibody KM341 1 mRNA obtained in (1) _1 above follow the attached instruction manual.
  • cDNA having the BD SMART II TM A Oligonucleotide sequence attached to the kit was obtained.
  • a PCR reaction was performed using the universal primer Amix attached to the kit and the mouse Ig (y) -specific primer shown in SEQ ID NO: 9 to amplify the VH cDNA fragment.
  • PCR was performed using the mouse Ig (/)-specific primer shown in SEQ ID NO: 10 instead of the ( ⁇ ) -specific primer to amplify the VL cDNA fragment.
  • PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 5 reaction cycles consisting of 94 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 15 seconds, and 70 ° C for 30 seconds. The reaction was repeated 5 times at 72 ° C for 3 minutes, 30 times at 94 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes. The reaction was performed at 72 ° C for 10 minutes. PCR was performed using GeneAmp PCR system9 700 (manufactured by Applied Biosystems). The obtained PCR product had a size of about 500 bp for both the H and L chains.
  • the recombinant plasmid DNA solution thus obtained was used to transform Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Prepare each plasmid DNA from the transformant clone and use the attached instructions using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems). After the reaction according to the above, the nucleotide sequence was analyzed using the company's sequencer ABI PRISM3700.
  • a plasmid pKM3411H # 9 containing a full-length H chain cDNA and a plasmid pKM3411L # 4 containing an L chain cDNA having an ATG sequence presumed to be an initiation codon at the 5 'end of the cDNA were obtained.
  • the entire nucleotide sequence of VH contained in plasmid pKM3411H # 9 is shown in SEQ ID NO: 11, the entire amino acid sequence of secreted VH including the signal sequence, including the signal sequence, estimated from the sequence is shown in SEQ ID NO: 12, and plasmid pKM3411L
  • SEQ ID NO: 13 The entire nucleotide sequence of VL contained in # 4 is shown in SEQ ID NO: 13, and the entire amino acid sequence of secreted VL including the signal sequence, deduced from the sequence, is shown in SEQ ID NO: 14.
  • VH and VL CDRs of anti-PERP mouse antibody KM3411 were identified by comparing with the amino acid sequence of a known antibody.
  • the amino acid sequences of the VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the anti-PERP mouse antibody KM3411 are shown in SEQ ID NOS: 15, 16 and 17, and the amino acid sequences of the VL CDR1, CDR2 and CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 18, 19 and 20, respectively. It was.
  • an anti-PE RP chimeric antibody expression vector PKANTEX3411 was used as follows. It was constructed.
  • Synthetic DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 21 and 22 were used to obtain the cDNA encoding the VH of anti-PERP mouse antibody KM3411 by PCR, and SEQ ID NOs: 23 and 24 were used to obtain the cDNA encoding VL.
  • Synthetic DNAs having the following nucleotide sequences were designed and synthesized. Each synthetic DNA (manufactured by Genset) contains a restriction enzyme recognition sequence for closing to pKANTEX93 at the 5 'end.
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution thus obtained.
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the obtained transformant, and reacted using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems) according to the attached instructions, followed by the DNA sequencer ABI PRISM 3700 of the company.
  • the base I was analyzed, and it was confirmed that the plasmids PKM3411VH9 and PKM3411VL11 shown in FIG. 11 having the desired base sequence were obtained.
  • the humanized antibody expression vector pKANTEX93 and the above-obtained pKM3411VLll were each digested with the restriction enzyme fi WI (manufactured by New England BioLabs) and subsequently digested with the restriction enzyme E Ri (manufactured by Takara Shuzo). did.
  • the digested reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and then, using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), an approximately 0.45 kb VL ERI fragment and an approximately 12.7 kb pKANTEX93 ERI fragment were used.
  • an Apal-Notl fragment derived from pKANTEX341 1 VL of about 13.2 kb and an AI-fragment derived from pKM3411VH9 of about 0.47 kb were recovered.
  • the resulting two types of fragments were ligated using Ligation high (manufactured by Toyobo) according to the attached instructions, and the resulting recombinant plasmid DNA solution was used to transform Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo). Converted.
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the obtained transformant and confirmed by restriction enzyme treatment.
  • the plasmid was reacted using the BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems) according to the attached instructions, and the DNA sequencer ABI PRISM 3700 was used to analyze base IJ as a result of analysis. It was confirmed that plasmids in which cDNA encoding VH and cDNA encoding VL of KM3411 were respectively cloned were obtained.
  • anti-PERP chimeric antibody expression vector pKANTEX3411 obtained in (2) _1 of this example, expression of the anti-PERP chimeric antibody in animal cells was determined by a conventional method [Antibody Engine ering, A Practical Guide, WH Freeman and Company (1992)] A transformant KM3481 into which pKANTEX3411 was introduced was obtained.
  • Example (2) -2 After culturing the transformant obtained in Example (2) -2 by a usual culture method, the cell suspension is recovered, and centrifuged at 3,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. After collecting the culture supernatant, the culture supernatant was sterilized by filtration using a 0.22 ⁇ m pore size MillexGV filter (Millipore). The anti-PERP chimeric antibody KM3481 was purified from the obtained culture supernatant using a Mab Select (Amersham Bioscience) column according to the attached instructions.
  • Purity and expression molecular size of the obtained purified anti-PERP chimeric antibody KM3481 were measured using a gradient gel (ATTO, catalog number: E-T520L) according to the attached instructions. , SDS-PAGE. Electrophoresis was performed simultaneously using the anti-PERP mouse antibody KM3411 as a control.
  • Purified anti-PERP chimeric antibody KM3481 has a single band force with a molecular weight of approximately 150 kilodaltons (Kd) under non-reducing conditions. Under reducing conditions, two bands of approximately 50Kd and approximately 25Kd are recognized. Was done.
  • the molecular weight of IgG class antibodies is about 150 Kd under non-reducing conditions, the S--S bond in the molecule is cleaved under reducing conditions, and an H chain with a molecular weight of about 50 Kd and about 25 Kd When divided into L chains with a molecular weight of Match and anti
  • the PERP chimeric antibody KM3481 is correctly expressed as a structural antibody molecule.
  • H + L target anti-human IgG
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis shows the average fluorescence intensity (MFI), and the horizontal axis shows the antibody concentration.
  • the anti-PERP chimeric antibody KM3481 was shown to bind to PERPZCHO cells, and the strength of the binding was dependent on the antibody concentration.
  • Example 5 From the human cancer cell lines examined in (2) _1 of Example 5, PC9, NCI_H69, Capan_2, and BxPC_3 cells were selected, and the method described in Example (1) _1 was used. The binding of the anti-PERP chimeric antibody KM3481 (10 ⁇ g / mL) was measured. As a negative control, an anti-CCR4 chimeric antibody (WO01 / 64754) was used.
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-PERP chimeric antibody KM 3481 showed binding to any of the above cell lines.
  • IMDM medium [IMDM (5) medium] containing 5% FCS by centrifugation and suspension
  • the cell concentration was adjusted to 2 x 10 5 cells / cell by IMDM- (5) medium. It was adjusted to mL and used as the target cell solution.
  • a freeze-dried human serum product (Human Complement Serum; manufactured by Sigma) was dissolved in deionized water, and an equal volume of IMDM- (5) medium was added and diluted twice to obtain a human complement solution.
  • the background absorbance data was obtained using IMDM- (5) medium instead of the target cell solution and antibody solution, and the absorbance data (antibody concentration 0) was measured using IMDM- (5) medium instead of the antibody solution. ⁇ g / mL) was obtained as 0% cytotoxic activity. CDC activity was determined by the following equation.
  • CDC activity (%) ([absorbance data when antibody concentration is 0 ⁇ g / mL] [absorbance data of specimen]) / [absorbance data when antibody concentration is 0 ⁇ g / mL] X 100
  • the results are shown in FIG.
  • the anti-PERP chimeric antibody KM3481 showed CDC activity in PERP / CHO cells in a concentration-dependent manner, and the activity was antibody concentration-dependent.
  • the ADCC activity of the anti-PERP chimeric antibody KM3481 obtained in Example 7 was measured as follows.
  • the target cells were cell lines that were confirmed to express the polypeptides encoded by the four PERP genes used in (1) of this example, ie, PC9, N Using CI-H69, Capan-2, BxPC-3 cell lines, PERP / CHO cells as a positive control and CHO / DG44 cell line not expressing the polypeptide as a negative control, preparation of effector cell solution Lymphoprep (manufactured by NYCOMED) was used.
  • RPMI 1640 _FCS (10) medium [RPM 1640 medium containing 10% FCS (Invitrogen)] for other cancer cell lines
  • RPMI1640-FCS (5) [RPI1640 medium containing 5% FCS (manufactured by Invitrogen)] as a medium for measuring ADCC activity by centrifugation and suspension.
  • the cell concentration was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / mL to obtain a target cell solution.
  • PBMC mononuclear cell
  • the plate is centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant is measured using a Cyto Tox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) and absorbance data is collected according to the attached instructions Was measured.
  • the absorbance data for spontaneous release of target cells was obtained by using the ADCC activity measurement medium instead of the effector cell solution and antibody solution. It was obtained by performing the same operation as above using ADCC activity measurement medium instead of the cell solution and the antibody solution.
  • the absorbance data of the total release of target cells was obtained by using a medium for measuring ADCC activity instead of the antibody solution and the effector cell solution, and adding a 9% Triton X-100 solution 45 minutes before the end of the reaction. It was obtained by performing the same operation as above.
  • ADCC activity was determined by the following equation.
  • ADCC activity (Q / o) ⁇ (absorbance of sample-absorbance of spontaneous release of effector cells-absorbance of spontaneous release of target cells) / (absorbance of total release of target cells-absorbance of spontaneous release of target cells) ⁇ ⁇
  • the day before the cancer cell transplantation the body weight of SCID mice (Clear Japan, male, 6 weeks old) was measured, and the antibody non-administration group, antibody administration group 0.1, 1, and lOmgZkg were divided into 4 groups (6 animals per group). ).
  • the PERP-positive lung cancer cell line PC_9 or the PERP-positive spir cancer cell line BxPC-3 was cultured at 5 ⁇ 10 7 cells / mL in RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen) and cultured in a conventional manner. 100 ⁇ L of each was implanted into the flank skin. The number of cells per mouse is 5 x 10 6 .
  • the anti-PERP chimeric antibody KM3481 diluted in citrate buffer (10 mmol / L citrate, 150 mmol / L sodium chloride, pH 6) was intravenously administered 100 times twice a week for a total of 8 times. .
  • the non-administered antibody group received only citrate buffer.
  • Tumor volume minor axis X minor axis X major axis X O. 5
  • FIGS. 18 and 19 Changes over time in the average tumor volume of each group in the lung cancer and knee cancer models are shown in FIGS. 18 and 19, respectively.
  • the anti-PERP chimeric antibody KM3481 1, lOmgZkg-administered group showed remarkable inhibitory effects on tumor growth and tumor growth as compared with the non-administered group.
  • the knee cancer model shown in Fig. 19 1, significant inhibition of tumor engraftment and tumor growth inhibition were observed in the lOmgZkg group, and a significant inhibitory effect was also observed in the 0.1mg / kg group.
  • the anti-PERP chimeric antibody KM3481 has an antitumor effect in an early cancer model targeting lung cancer and knee cancer.
  • anti-PERPCDR-grafted antibody VH amino acid sequence of a human CDR-grafted antibody against PERP (hereinafter, referred to as anti-PERPCDR-grafted antibody) was designed as follows.
  • the FR amino acid sequence of the KM3411 VH FR out of the amino acid sequence of the FR of the common sequence of the three subgroups of the VH of the human antibody was designed.
  • the amino acid sequence of FR having the highest homology with the sequence was selected.
  • Table 4 shows the homology search results. As shown in Table 4, the amino acid sequence of FR in the VH region of KM3411 was the highest and had the highest homology with subgroup II.
  • the amino acid sequence of the VH CDR of the anti-PERP mouse antibody KM3411 at the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of the VH subgroup II of the human antibody was transplanted.
  • the amino acid sequence of the KM3411 VH described in SEQ ID NO: 12 the 47th IIe, the 86th Ile, the 100th Gln, the 107th Glu, and the 111th Thr were obtained from Kabat et al.
  • the most frequently used amino acid residues are not amino acid residues.
  • the amino acid residue found in the amino acid sequence of KM3411 was used.
  • the VH amino acid sequence HV0 of the anti-PERPCDR-grafted antibody represented by SEQ ID NO: 25 was designed.
  • amino acid sequence of VL of the anti-PERPCDR-grafted antibody was designed as follows.
  • the amino acid sequence of FR of VL of a human antibody for transplanting the amino acid sequence of CDR of VL of anti-PERP mouse antibody KM3411 identified in (1) -3 of Example 7 was selected. Liedbat et al. Classified the VLs of various known human antibodies into four subgroups (HSG I-IV) based on the homology of their amino acid sequences, and reported a common sequence for each of these subgroups. Review [sequences oi Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • the amino acid sequence of FR having the highest homology with the amino acid sequence of FR of VL of KM3411 among the amino acid sequences of FR of the common sequence of the four subgroups of human antibody VL was selected.
  • Table 5 shows the search results for homology. As shown in Table 5, the amino acid sequence of the FR of VL of KM3411 had the highest homology with subgnolepe I.
  • VL of the anti-PERP mouse antibody KM3411 at the appropriate position in the FR amino acid sequence of the common sequence of the subgroup I of human antibody VL
  • the amino acid sequence of CDR was grafted, and the amino acid sequence IJLV0 of VL of the anti-PERPCDR graft antibody described in SEQ ID NO: 26 was designed.
  • the amino acid sequence HV0 and VL of the anti-PERPCDR-grafted antibody designed above is composed of the amino acid sequence 1JLV0 of the selected human antibody and the amino acid sequence of the CDR of the anti-PERP mouse antibody KM 3411 only in the FR amino acid sequence of the selected human antibody.
  • simply transplanting the amino acid sequence of the mouse antibody CDR to the human antibody FR often reduces the binding activity. Les ,.
  • amino acid residues that are considered to affect binding activity among FR amino acid residues that differ between human and mouse antibodies, along with CDR amino acid sequence transplantation, The power to modify S is being done. Therefore, also in this example, the amino acid residues of FR which are considered to affect the binding activity were identified as follows.
  • the three-dimensional structure of the antibody V region (HV0LV0) consisting of the amino acid sequence HV0 and the amino acid sequence VL0 of the VL of the anti-PERPCDR-grafted antibody designed above was constructed using a computer modeling method. .
  • AbM manufactured by Oxford Molecular
  • Pro-Explore manufactured by Oxford Molecular
  • ViewerLite manufactured by Accelrys
  • anti-PERP mouse monochromator A computer model of the three-dimensional structure of the V region of antibody KM3411 was also constructed in the same manner.
  • amino acid residues different from the anti-PERP mouse antibody KM3411 were sequentially modified to amino acid residues found at the corresponding positions of the anti-PERP mouse antibody KM3411.
  • a three-dimensional structure model composed of sequences was constructed in the same manner, and the three-dimensional structures of the V regions of the anti-PERP mouse antibodies KM3411, HV0LV0, and the variant were compared.
  • a cDNA encoding the VH amino acid sequence HV0 of the anti-PERP human CDR-grafted antibody designed in this example (1) was constructed using PCR as follows.
  • the designed amino acid sequence was linked to the H-chain secretion signal sequence of the anti-PERP mouse antibody KM3411 shown at positions 1 to 18 of SEQ ID NO: 12 to obtain a complete antibody amino acid sequence.
  • the amino acid sequence was converted to a gene codon.
  • the frequency of use found in the nucleotide sequence of the antibody gene [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] In consideration of the above, the corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the complete amino acid sequence of the antibody V region is designed, and the 5'-end and the 3'-end are combined with the primer sequence for amplification during PCR reaction (human (Including a restriction enzyme recognition sequence for cloning into a vector for expressing an antibody). Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences, each of which is about 100 bases from the 5 'end (adjacent base sequences have an overlapping sequence of about 20 bases at the end) Then, synthetic oligonucleotides were synthesized in the order of sense strand and antisense strand alternately.
  • Each oligonucleotide was added to the 50 / iL reaction solution so that the final concentration was 0.1 / imol / L, and 0.5xmolZL M13 primer RV (Takara Shuzo), 0.5.
  • PCR was performed according to the instruction manual attached to KOD polymerase. The reaction conditions at this time were in accordance with the conditions described in the instruction manual (30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds).
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, dissolved in sterile water, treated with an appropriate restriction enzyme, and ligated to plasmid pBluescript II SK (_) (Stratagene).
  • Escherichia coli DH5 strain was transformed, plasmid DNA was prepared from the transformed strain, and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)
  • a plasmid having the desired nucleotide sequence was obtained.
  • a synthetic oligonucleotide having a mutation was prepared and subjected to the above PCR or to encode the HV0 prepared above.
  • the PCR was carried out by using plasmid DNA containing cDNA as type I, PCR using the synthetic DNA having the mutation as a primer, and isolating the amplified fragment.
  • the gene codon of the amino acid residue after modification was set so as to be the gene codon found in the anti-PERP mouse antibody KM3411.
  • the cDNA encoding the VL amino acid sequence LV0 of the anti-PERP human CDR-grafted antibody designed in this example (1) was constructed using PCR as follows.
  • the designed amino acid sequence was linked to the L-chain secretion signal sequence of the anti-PERP mouse antibody KM3411 shown in the 1st to 22nd positions of SEQ ID NO: 14 to obtain a complete antibody amino acid sequence.
  • the amino acid sequence was converted to a gene codon. When multiple gene codons exist for one amino acid residue, the frequency of use found in the nucleotide sequence of the antibody gene (SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], and the corresponding gene codon was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the complete amino acid sequence of the antibody V region is designed, and the 5'-end and the 3'-end are combined with the primer sequence for amplification during PCR reaction (human (Including a restriction enzyme recognition sequence for cloning into a vector for expressing an antibody). Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences (approximately 100 bases from the 5 'end) (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at the end), and divide them into sense strands. Then, synthetic oligonucleotides were synthesized in the alternate order of the antisense strand.
  • Each oligonucleotide was added to a 50 zL reaction solution to a final concentration of 0.1 lmol / L, and 0.5 x molZL M13 primer RV (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ mol Using / L Ml 3 primer M4 (Takara Shuzo) and 1 unit of KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.), follow the instructions attached to the KOD polymerase and perform PCR in the same manner as in (3) above. went.
  • the reaction solution was precipitated with ethanol, dissolved in sterile water, treated with an appropriate restriction enzyme, and ligated to plasmid pBluescript II SK (-) (Stratagene).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain is transformed using the recombinant plasmid DNA solution obtained in this manner, plasmid DNA is prepared from the transformed strain, and BigDye Terminat or Ycle sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) As a result of analyzing the nucleotide sequence using, a plasmid having the desired nucleotide sequence was obtained.
  • the modification of the amino acid residue of FR designed in this example (1) is performed by preparing a synthetic oligonucleotide having a mutation and performing the above PCR or encoding the LV0 prepared above.
  • the PCR was carried out by using plasmid DNA containing cDNA as type I, PCR using the synthetic DNA having the mutation as a primer, and isolating the amplified fragment.
  • the gene codon of the amino acid residue after modification was set so as to be the gene codon found in the anti-PERP mouse antibody KM3411.
  • an antibody or antibody fragment that specifically recognizes a stereostructure of an extracellular region of a polypeptide encoded by a PERP gene and binds to the extracellular region.
  • the antibody or the antibody fragment may be a method for immunologically detecting and detecting a polypeptide encoded by the PERP gene, a method for immunologically detecting or measuring cells expressing the polypeptide and a reagent for detecting or measuring, and It can be used as a diagnostic or therapeutic agent for diseases associated with the polypeptide encoded by the PERP gene.

Abstract

　本発明により、ＰＥＲＰ（ｐ５３　ａｐｏｔｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＰＭＰ－２２）遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体が提供される。本発明の抗体はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを高発現する各種疾患の治療に有用である。また、該抗体はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を免疫学的手法により特異的に検出することができ、ＰＥＲＰが関与する各種疾患の診断に有用である。

Description

明 細 書
抗 PERP抗体
技術分野
[0001] 本発明は、 PERP (p53 apoptosis effector related to PMP— 22)遺伝子 によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該 細胞外領域に結合する抗体または抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いる PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出方法および検出用試薬、 該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測 定用試薬、該抗体または該抗体断片を用いる PERP遺伝子によりコードされるポリべ プチドが関与する疾患の診断薬または治療薬および該抗体を産生するハイブリドー マに関する。更に、本発明は PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え 抗体または該抗体断片、該抗体をコードする DNA、該 DNAを含んでなるベクター、 該ベクターを形質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形 質転換体を培養することを特徴とする抗体の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 癌細胞は、正常細胞では少量あるいはほとんど産生しない物質を、多量に産生す る。このような物質を検出または定量することにより、癌細胞を検出することができる。 癌細胞が正常細胞よりも多量に産生する物質には、癌遺伝子産物および増殖因子 などが含まれ、細胞の癌化 ·増殖 ·進展 ·転移 ·定着に寄与しているものもある。癌細 胞に特徴的なこれらの物質、いわゆる腫瘍マーカーを検出または定量することにより 、癌の診断ができる。
[0003] これまで腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（CEA)、 α—フエトプロテイン (AF P)、 CA125などの胎児性癌抗原、神経特異的エノラーゼ（NSE)、酸性フォスファタ ーゼ、クレアチンキナーゼ（CK)などの酵素類、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、 抗利尿ホルモン (ADH)、カルシトニン（CT)などのホルモン関連物質などが用いら れてきた。大腸癌では CEA、 CA19— 9、 NCC— ST— 439、 STNなどが治療効 果の判定や再発の指標として用いられてきた。し力 ながら前述の腫瘍マーカーを 用いた場合、癌などの悪性腫瘍でありながら陰性と判定される場合も多ぐまた、健 常人や良性腫瘍の患者でも擬陽性と判定されてしまう場合があった。例えば、大腸 癌において病期別に腫瘍マーカー陽性率を見た場合、治癒切除可能な段階では C EAは 36%、 CA19— 9は 30%、 NCC— ST—439は 35%、 STNは 21 %の患者で 検出されたに過ぎず、これらの腫瘍マーカーは早期の大腸癌発見に関して十分な腫 瘍マーカーではなレ、（非特許文献 1)。
[0004] 癌の診断における感度と特異性を向上させるためには、複数の腫瘍マーカーを組 み合わせることが有効である。新たな腫瘍マーカーの発見により、新たな腫瘍マーカ 一単独、あるいは従来の腫瘍マーカーと組み合わせ用いることで、癌の診断の感度 と精度を高めることができる。
膝臓癌では、一般的な臨床検査項目は正常値を示す上、病期の初期では特徴的 な臨床所見もないことから、早期の勝臓癌患者を見出すことは困難である。勝臓癌に おいて胆管閉塞や肝転移が起きている患者は、アルカリフォスファターゼ値とビリル ビン値が上昇することがある。膝菅癌では、腫瘍による閉塞膝菅の末梢側に勝臓炎 が生じることから、アミラーゼ、エラスターゼ、 RNaseなどの膝外分泌酵素および該酵 素の阻害物質が血中に逸脱して増加するため、これらの酵素および該酵素の阻害 物質が腫瘍マーカーとして用いられており、例えば、 PSTI (pancreatic secretory trypsin inhibitor)が知られている。 PSTIは、膝液中に分泌されるトリプシンの阻 害物質であり、血中 PSTIは各種悪性腫瘍患者で高率に上昇しており、特に膝癌患 者において高い頻度で認められる（非特許文献 2)。
[0005] 出現頻度が高い膝菅癌の診断と治療モニターの腫瘍マーカーとして、 CA19- 9 が広く用いられる。このほかの陴菅癌の腫瘍マーカーとしては、 CEA、 SLX、 NCC 一 ST— 439、シァリル Tn、 DuPan— 2、フェリチンなどが知られている。しかしながら 、転移のなレ、原発性瞎臓癌にぉレ、てはこれらの腫瘍マーカーの測定値は増加しな い場合が多ぐまたこれらの腫瘍マーカーの測定値力 擬陽性であると判定される場 合も多く、十分な信頼性のある瞎臓癌の診断法は知られてレ、なレ、。
[0006] 膝臓癌の診断と病期分類において最も正確で費用対効果の高い方法は、最初の 検査で CT (Computed Tomography)を行うことである。 CTにより切除不可能また は転移していることが発見された場合、組織診断のための経皮的針吸引を行う。もし CTにより切除可能な腫瘍が発見されたり、全く腫瘍が発見されなかった場合には、 超音波内視鏡が使われる。その他に超音波と内視鏡的逆行性膝管造影法が一般的 な検査に用いられる。切除可能性を決定することを目的に動脈造影ゃ瞎機能検査が 行われることはまれである。さらに、診断困難な場合には試験開腹が行われる場合も ある。
[0007] しかしながら、膝臓は後腹膜臓器であるため、これらの診断法では瞎臓癌を早期に 正確に発見することは容易ではない。早期発見は治癒率の向上に貢献するため、陴 臓癌の優れた早期診断法の開発が望まれている。
PERP (あるいは THWまたは PIGPC1とも称される）の遺伝子配列は公知である（ 特許文献:!〜 13)。
[0008] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドは 193アミノ酸からなる蛋白で、一次 配列から 4回膜貫通蛋白であると推定されている。 PERP遺伝子によりコードされるポ リペプチドは p53依存性アポトーシスに関わる蛋白であることが知られている（非特許 文献 3)。さらに PERP遺伝子ノックアウトマウスより調製した胸腺細胞と神経細胞では 、 DNAダメージの際のアポトーシス誘導が部分的に阻害されることが示された (非特 許文献 4)また、 PERPは高転移性癌細胞においては発現が低下する遺伝子としても 報告されてレ、る (非特許文献 5)。
[0009] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体（以下、抗 PERP抗体 と表記する）としては、これまでに、 PERP遺伝子産物の C末端細胞内の部分べプチ ドまたは第一細胞外ループの部分ペプチドを免疫原として用いて作製されたポリクロ ーナル抗体が知られている（非特許文献 6、 7)。これらのポリクローナル抗体はウェス タンブロッテイングあるいは免疫組織染色に使用可能であることが示されている。これ までに PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識 し、かつ該細胞外領域に結合する抗体は知られてレ、なレ、。
[0010] 一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物とし て認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Human Anti Mo use Antibody : HAMA)が誘導されることが知られている。 HAMAは投与された マウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献 8〜： 11)、マウス抗体の体 内からの消失を速め（非特許文献 9、 12、 13)、マウス抗体の治療効果を減じてしまう ことが知られている（非特許文献 14、 15)。
[0011] これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗 体からヒト型キメラ抗体やヒト型 CDR移植抗体といったヒト化抗体の作製が試みられ ている。
ヒトイ匕抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較してヒトへの臨床応用 上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫 原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特許文献 16、 17)。 すなわち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく 、その治療効果が長期間持続することが期待される。
[0012] また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分 子として作製すること力 Sできる。例えば、ヒト抗体の重鎖 (以下、 H鎖と表記する）定常 領域 (以下、 C領域と表記する）（H鎖 C領域を、 CHと表記する）として glサブクラスを 使用すれば、抗体依存性細胞傷害（以下、 ADCCと表記する）活性などのエフェクタ 一機能の高いヒト化抗体を作製することができ (非特許文献 16)、かつ、マウス抗体に 比べ血中半減期の延長が期待される（非特許文献 17)。特に PERP遺伝子によりコ ードされるポリペプチドの発現細胞数を減少させる治療においては、抗体の Fc領域（ 抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域)を介した補体依存性細胞傷害活性 (以下、 CDC 活性と表記する）や ADCC活性等の細胞傷害活性の高さがその治療効果に重要で あるために、ヒトイ匕抗体はマウス抗体等のヒト以外の動物の抗体と比較して望ましレ、 ( 非特許文献 18、 19)。
[0013] さらに、ヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、 Fab, Fab'、 F (ab' ) 、一本鎖抗体 (以下、 scFvと表記する）（非特許文献 20)、 2量体化 V領域
2
断片 (以下、 Diabodyと表記する）（非特許文献 21)、ジスルフイド安定化 V領域断片 (以下、 dsFvと表記する）（非特許文献 22)、 CDRを含むペプチド（非特許文献 23 )などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な 抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れてレ、る（非特許文献 24)。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外 の動物の抗体よりもヒト化抗体または該抗体断片の方が望ましいことを示している。
[0014] 特許文献 1:W〇98Z55508
特許文献 2:W〇99Z54461
特許文献 3:W〇00Z55350
特許文献 4:W〇0lZ22920
特許文献 5:W〇0lZ66719
特許文献 6： WO00/61612
[0015] 特許文献 7:W〇02/00174
特許文献 8:W〇02Z47534
特許文献 9:US2003— 0064947
特許文献 10: US2003— 0065157
特許文献 11 :W〇00/55629
特許文献 12:W〇02/60317
特許文献 13: US2002— 0119463
[0016] 非特許文献 1:大腸がんの腫瘍マーカー. CRCK4), 42(1992)
非特許文献 2:臨床病理， 11, 1229(1986)
非特許文献 3: Genes & Development, 14, 704(2000)
非特許文献 4:Curr. Biol. , 13, 1985(2003)
非特許文献 5: Anticancer Research, 20, 2801(2000)]
非特許文献 6:Pro Sci社ホームページ、 [on line]、 [平成 16年 3月 31日検索]、ィ ンターネット <http: Z www. prosci— inc. com/ Antibody— TDS/ 2451% 20PERP. html>
非特許文献 7 :、 Novus Biologicals社ホームページ、 [on line]、 [平成 16年 3月 31日検索]、インターネット <h tp: Z www. novus― biologicals . com/ print ― data― sheet. php/4400>]
非特許文献 8:J. Clin. Oncol.， 2, 881(1984) 非特許文献 9: Blood, 65, 1349(1985)
非特許文献 10 :J. Natl. Cancer Inst. , 80, 932(1988)
非特許文献 ll:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242(1985)]
非特許文献 12 :J. Nucl. Med. , 26, 1011(1985)
非特許文献 13 :J. Natl. Cancer Inst. , 80， 937(1988)]
非特許文献 14:J. Immunol.， 135, 1530(1985)
非特許文献 15: Cancer Res.， 46, 6489(1986)
非特許文献 16: Cancer Res.， 56, 1118(1996)
非特許文献 17: Immunol. , 85, 668(1995)
非特許文献 18 :J. Immunol.， 144， 1382(1990)
非特許文献 19: Nature, 322, 323(1988)
非特許文献 20: Science, 242, 423(1988)
非特許文献 21: Nature Biotechnol. , 15, 629(1997)
非特許文献 22: Molecular Immunol. , 32, 249(1995)
非特許文献 23 :J. Biol. Chem. , 271, 2966(1996)
非特許文献 24: Cancer Res. , 52, 3402(1992)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の課題は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立 体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片、該 抗体または該抗体断片を用いる PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫 学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該ポリペプチドを発現する 細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該抗体または 該抗体断片を用いる PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の 診断薬または治療薬、該抗体を産生するハイブリドーマを提供することにある。また、 本発明の課題は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体 構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または該 抗体断片、該抗体をコードする DNA、該 DNAを含んでなるベクター、該ベクターを 形質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形質転換体を培 養することを含む抗体の製造方法を提供することにある。
[0018] 本発明の抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する各種疾 患の治療に有用である。また、該抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリべプチ ドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を免疫学的手法により特異的に検出または 測定することができ、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する各種疾 患の診断に有用である。
課題を解決するための手段
[0019] 本発明は、以下の（1)〜（47)に関する。
(1) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異 的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片。
(2) ポリペプチドの細胞外領域が、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 35〜75番 目および 130〜154番目に表されるアミノ酸配列で示される領域である、 (1)に記載 の抗体または抗体断片。
(3) 抗体力 S、モノクローナル抗体である、 （1)または（2)に記載の抗体または抗体断 片。
(4) モノクローナル抗体力 S、 ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)力、ら生 産されるモノクローナル抗体である、 (3)に記載の抗体または抗体断片。
[0020] (5) モノクローナル抗体力 S、 ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)力、ら生 産されるモノクローナル抗体が結合するェピトープと結合するモノクローナル抗体で ある、 （3)に記載の抗体または抗体断片。
(6) (3)〜（5)のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドー マ。
(7) ハイプリドーマ力 S、ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)である、 （6) に記載のハイプリドーマ。
(8) モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、 (3)に記載の抗体または抗 体断片。
(9) 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗 体である、 （8)に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[0021] (10) ヒトイ匕抗体がヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（Complimentarit y Determining Region ;以下、 CDRと表記する）移植抗体から選ばれるヒト化抗 体である、 （9)に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(11) 請求の範囲 3〜5のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体の重鎖（以下、 H鎖と表記する）可変領域（以下、 V領域と表記する）および軽鎖（以下、 L鎖と表記 する) V領域を含む、 （10)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(12) 請求の範囲 3〜5のいずれ力、 1項に記載のモノクローナル抗体の H鎖 V領域（ 以下、 VHと表記する）および L鎖 V領域（以下、 VLと表記する）を含み、かつ、ヒト抗 体の H鎖定常領域（以下、 C領域と表記する）および L鎖 C領域を含む、（11)に記載 のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[0022] (13) 抗体の VHが配列番号 12で示されるアミノ酸配列の 19〜： 130番目のアミノ酸 配列を含む、 （11)または（12)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(14) 抗体の VLが配列番号 14で示されるアミノ酸配列の 23〜： 128番目のアミノ酸 配列を含む、 （11)または（12)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(15) 抗体の VHが配列番号 12で示されるアミノ酸配列の 19〜： 130番目のアミノ酸 配列を含み、かつ、抗体 VLが配列番号 14で示されるアミノ酸配列の 23〜： 128番目 のアミノ酸配列を含む、（11)〜（： 14)のいずれか 1項に記載のヒト型キメラ抗体または 抗体断片。
[0023] (16) (3)〜（5)のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CD Rを含む、 (10)に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
(17) (3)〜（5)のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CD Rとヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク（以下、 FRと表記する）を含む、（16)に 記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
(18) (3)〜（5)のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CD Rとヒト抗体の VHおよび VLの FRを含み、かつ、ヒト抗体の H鎖 C領域および L鎖 C 領域を含む、 （16)または（17)のいずれ力、 1項に記載のヒト型 CDR移植抗体または 抗体断片。 [0024] (19) 抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16お よび 17で示されるアミノ酸配列を含む、（16)〜（： 18)のいずれか 1項に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
(20) 抗体の VLの CDR1、 CDR2および CDR3力 S、それぞれ配列番号 18、 19およ び 20で示されるアミノ酸配列を含む、（16)〜（： 18)のいずれか 1項に記載のヒト型 C DR移植抗体または抗体断片。
(21) 抗体 VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16およ び 17を含み、かつ抗体 VLの CDR1、 CDR2および CDR3力 それぞれ配列番号 1 8、 19および 20で示されるアミノ酸配列を含む、 （16)〜（20)のいずれか 1項に記載 のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[0025] (22) 抗体の VHが、配列番号 25で示されるアミノ酸配列、または配列番号 25で示 されるアミノ酸酉己歹 IJのうち、 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 45番目の Gly、 72番目の Val、および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1 つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（16)〜（21 )のレ、ずれ力 1項に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
(23) 抗体の VLが、配列番号 26で示されるアミノ酸配歹 lj、または配列番号 26で示 されるアミノ酸配列のうち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の A1 a、 46番目の： Leu、 70番目の Phe、および 77番目の： Leu力ら選ばれる少なくとも 1つ のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（16)〜（21) のいずれ力 1項に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[0026] (24) 抗体の VHが、配列番号 25で示されるアミノ酸配列、または配列番号 25で示 されるアミノ酸配列のうち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の A1 a、 46番目の Leu、 70番目の Phe、および 77番目の Leuから選ばれる少なくとも 1つ のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の V Lが、配列番号 26で示されるアミノ酸配列、または配列番号 26で示されるアミノ酸配 歹 IJのうち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の Le u、 70番目の Phe、および 77番目の Leuから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基 が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（16)〜（23)のいずれか 1項 に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
(25) 抗体断片力 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 、一本鎖抗体（scFv)、二量体化 V領域（
2
Diabody)、ジスルフイド安定化 V領域（dsFv)および CDRを含むペプチドから選ば れる抗体断片である（1)〜（24)のいずれか 1項に記載の抗体断片。
[0027] (26) (1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を コードする DNA。
(27) (26)に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
(28) (27)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株
(29) (6)または（7)に記載のハイプリドーマまたは（28)に記載の形質転換株を培 地に培養し、培養物中に（1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれ力、 1項に記載の抗体 または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを 特徴とする（1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断 片の製造方法。
[0028] (30) (1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いる PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出または測定方法
(31) 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である（30)に記載の方法。
(32) (1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いる、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検 出または測定方法。
(33) 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である（32)に記載の方法
(34) (1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いる、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定用試薬。
[0029] (35) (1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いる、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬。
(36) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、 (35) に記載の診断薬。
(37) (1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 有効成分として含有する、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾 患の治療薬。
(38) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、 (3 7)に記載の治療薬。
[0030] (39) (1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いて PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞を検出または測 定することを含む、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診 断方法。
(40) (1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を 用いて PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定することを含む 、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
(41) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、 (3 9)または (40)に記載の診断方法。
[0031] (42) (1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれ力 1項に記載の抗体または抗体断片を 患者に投与することを含む、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する 疾患の治療方法。
(43) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、（4 2)に記載の治療方法。
(44) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬を製造 するための、（1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体 断片の使用。
[0032] (45) 癌の診断薬を製造するための、（1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれ力、 1項 に記載の抗体または抗体断片の使用。
(46) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬を製造 するための、（1)〜（5)または（8)〜（25)のレ、ずれか 1項に記載の抗体または抗体 断片の使用。 (47) 癌の治療薬を製造するための、（1)〜（5)または（8)〜（25)のいずれ力 1項 に記載の抗体または抗体断片の使用。
発明の効果
[0033] 本発明によると、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体 構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片、該 抗体または該抗体断片を用いる PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫 学的検出方法および検出用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出 または測定方法および検出または測定用試薬、該抗体または該抗体断片を用いる 癌の診断薬または治療薬および該抗体を産生するハイブリドーマが提供される。更 に、本発明は PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または該抗 体断片、該抗体をコードする DNA、該 DNAを含んでなるベクター、該ベクターを形 質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形質転換体を培養 することを特徴とする抗体の製造方法が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、 2004年 6月 7日に出願された日本国特 許出願 2004— 168116号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書 及び図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1]第 1図には、 Cancer Profiling Array を用いて各種臨床癌部組織および 近傍の非癌部組織における PERPの発現解析を行った結果を示す。癌種は図中に 示す。 Nは非癌部を、 Tは癌部を示す。
[0035] [図 2]第 2図には、 PERP遺伝子導入細胞のクローン毎の PERP発現を、抗 Myc抗体 を用いたウェスタンブロッテイングにより調べた結果を示す。図中のクローンナンバー は、 4種の PERP/CHO細胞の各クローンを示す。 PERP陰性細胞は、遺伝子を導 入していない CHO/DG44細胞を示す。図中の矢印は、 PERP遺伝子によりコード されるポリペプチド鎖の分子量である約 25kDaを示す。
[0036] [図 3]第 3図には、サンドイッチ ELISAでの KM3314の反応性を示す。左の黒塗りの バーは、 PERPZCHO細胞の、右の白塗りのバーは CHOZDG44細胞の細胞可 溶化物を用いた ELISA法の結果をそれぞれ示す。
[図 4]第 4図には、ウェスタンブロッテイングでの KM3314の反応性を示す。レーンは 左から分子量マーカー、 PERP/CHO細胞、 CHO/DG44細胞、 Colo205細胞 株、 PC— 1細胞株の細胞可溶化物をそれぞれ示す。左の写真は一次抗体に陰性対 照である KM1764を、右の写真は一次抗体に KM3411を用いた結果をそれぞれ 示す。
[0037] [図 5]第 5図には、 FMATでの KM3411の反応性を示す。グラフは縦軸に蛍光強度 と細胞数の積算値を示す。
[図 6]第 6図には、フローサイトメトリーでの KM3411の反応性を示す。各図の縦軸は 細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。
[図 7]第 7図には、免疫沈降での KM3411の反応性を示す。図中バーの下の抗体の KM番号は、免疫沈降に使用した抗体をそれぞれ示し、各図の上の KM番号は検出 に用いた一次抗体をそれぞれ示す。各図のレーンは、それぞれマーカー、 PERP/ CHO細胞および CHO/DG44細胞をそれぞれ示す。
[0038] [図 8]第 8図には、フローサイトメトリーでの KM3411の反応性を示す。縦軸は陰性対 照である KM511の平均強度を 1とした時の KM3411の平均蛍光強度の比率を示 す。グラフ上部の数値は平均蛍光強度比率 15以上であった場合の値を特に示す。 図中の表は、使用した細胞株を示す。
[図 9]第 9図には、フローサイトメトリーでの KM3411の反応性を示す。縦軸は FITC 標識抗ヒト CD45抗体の蛍光強度を、横軸はピオチン標識 KM3411あるいは陰性 対照である KM511の蛍光強度をそれぞれ示す。各ヒストグラムの上には、細胞の染 色に用いた抗体を示す。
[0039] [図 10]第 10図には、フローサイトメトリーでの KM3411、市販の各抗 PERP抗体（ポリ クローナル抗体）および陰性対照の抗体の PERP/CHO細胞および CHOZDG4 4細胞に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞ れ示す。各ヒストグラムの上には、細胞の染色に用いた抗体を示す。
[図 11]第 11図には、プラスミド pKM3411VH9と pKM3411VLl lの造成工程を示 す。 [0040] [図 12]第 12図には、プラスミド pKANTEX3411の造成工程を示す。
[図 13]第 13図には、精製した抗 PERPキメラ抗体の SDS— PAGE (5〜20%グラジ ェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条 件でそれぞれ電気泳動を行った結果である。レーン 1と 6が分子量マーカー、 2と 4力 S 抗 PERPマウス抗体 KM3411、 3と 5が抗 PERPキメラ抗体 KM3481の泳動パター ンをそれぞれ示す。
[0041] [図 14]第 14図には、フローサイトメトリーでの精製した抗 PERPキメラ抗体 KM3481 の PERPZCHO細胞に対する反応性を示す。縦軸は平均蛍光強度、横軸は抗体 濃度をそれぞれ示す。
[図 15]第 15図には、フローサイトメトリーでの各癌細胞株に対する抗 PERPキメラ抗 体 KM3481の反応性を示す。縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度をそれぞれ示す。
[0042] [図 16]第 16図には、 PERPZCHO細胞に対する抗 PERPキメラ抗体 KM3481の C DC活性を示す。縦軸は細胞傷害活性％、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
[図 17]第 17図には、各細胞株に対する抗 PERPキメラ抗体 KM3481の ADCC活性 を示す。縦軸は細胞傷害活性％、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
[図 18]第 18図には、肺癌細胞株 PC— 9が皮内移植されたマウスに、抗 PERPキメラ 抗体 KM3481を投与した時の投与群の腫瘍体積の平均値の経日的変化を示す。 横軸は腫瘍移植後の日数、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。 Xは抗体非投与群、 〇は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 0. lmg/kg投与群、秦は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 lmg/kg投与群、▲は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 10mg/kg投与 群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
[0043] [図 19]第 19図には、膝癌細胞株 BxPC_ 3が皮内移植されたマウスに、抗 PERPキメ ラ抗体 KM3481を投与した時の投与群の腫瘍体積の平均値の経日的変化を示す。 横軸は腫瘍移植後の日数、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。 Xは抗体非投与群、 〇は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 0. lmg/kg投与群、 ·は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 lmg/kg投与群、▲は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 10mg/kg投与 群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
発明を実施するための最良の形態 [0044] 本発明は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片に関する。
PERP遺伝子としては、配列番号 1で示される塩基配列があげられる。
上記の塩基配列において 1以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を 含む遺伝子、配列番号 1で示される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有す る塩基配列、好ましくは 80%以上の相同性を有する塩基配歹 IJ、さらに好ましくは 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子、ならびに配列番号 1で示される塩 基配列を有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAを含む遺 伝子なども本発明の PERP遺伝子に包含される。
[0045] ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、配列番号 1で示される塩 基配列を有する DNAをプローブとして、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラー ク 'ハイブリダィゼーシヨン法、サザンブロット'ハイブリダィゼーシヨン法、 DNAマイク ロアレイ法などにより得られるハイブリダィズ可能な DNAを意味し、具体的には、ハイ ブリダィズしたコロニーまたはプラーク由来の DNA、もしくは該配列を有する PCR産 物もしくはオリゴ DNAを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、 0· 7〜 1. Omol/Lの塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/L塩化ナトリ ゥム、 15mmol/Lクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルターもし くはスライドグラスを洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。ハイブ リタイ" ~~シヨンは、 [Molecular Cloning, A Laooratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 Current Proto cols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987— 1997)、 DNA Cloning 1 :し ore Techniques, A Practical Approach, Second Edition ( Oxford University, 1995) ]などに記載されている方法に準じて行うことができる 。ハイブリダィズ可能な DNAとしては、配列番号 1で示される塩基配列と少なくとも 6 0%以上の相同性を有する DNA、好ましくは 80%以上の相同性を有する DNA、さ らに好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0046] 真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が 認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列 に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明の PERP遺伝子に包含される。
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドとしては、配列番号 2で示されるァミノ 酸配列を有するポリペプチド、配列番号 2で示されるアミノ酸配列において 1以上の アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに 配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有す るポリペプチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺ プチド、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺプ チド、最も好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド などがあげられる。
[0047] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換、または 付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 [Molecular Cloning, A Labor atory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laooratory Press , 1989)、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son s, 1987— 1997)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) , Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Aci ds Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (19 85) ]などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 2で示される アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAに部位特異的変異を導入するこ とにより得ること力 Sできる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定され ないが、好ましくは 1個〜数十個、例えば、：!〜 20個、より好ましくは 1個〜数個、例え ば、：!〜 5個のアミノ酸である。
[0048] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列について は、 BLAST CI. Mol. Biol. , 215. 403 (1990)〕においてデフォルトのパラメータを 用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、 BLAST2〔Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997)； Genome Res. ,ヱ， 649 (1997)； http : //www. nc bi. nlm. nih. gov/Education/BLASTinfo/ information 3. html〕 (こおレヽて デフォルトのパラメータを用いて算出される数値などがあげられる。
[0049] デフォルトのパラメータとしては、 G (Cost to open gap)が塩基配列の場合は 5 、アミノ酸配列の場合は 11 E (Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、 アミノ酸酉己歹 IJの場合は 1、 _ q (Penalty for nucleotide mismatch)力 S— 3、— r (reward for nucleotide match)力 1、一e (expect value)力 10、——W (words ize)が塩基配列の場合は 11残基、アミノ酸配列の場合は 3残基、 _y (Dropoff (X) f or blast extensions in bits)が blastn の場合は 20、 blastn以外のプログラム で fま 7、 _X (X dropoff value for gapped alignment in bits)力 S 15および —Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits)力 Solastn の 場合は 50、 blastn以外のプログラムでは 25である（http : ZZwww. ncbi. nlm. ni h. gov blast html blastcgihelp. html)。
[0050] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公 知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号 2で示されるアミノ酸配列を コードする DNAの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体 を培養することにより作製すること力 Sできる。また、こうして作製されるポリペプチドまた は DNAに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 部分配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有 するポリペプチドを得ることができる。
[0051] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、例えば配列番号 2 で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラム SOSU I (http： / / sosui. proteome. bio. tuat. ac. γς>/ sosuiframeO. ntml)また ί3>τ 測プログラム TMHMM ver. 2 (http： //www. cbs. dtu. dk/services/TM HMM- 2. 0/)などを用いて予測された領域があげられる。
[0052] 具体的には、 SOSUIを用いた場合には配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 35 75番目および 130 154番目に相当する領域力 TMHMM ver. 2を用いた場合 には配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 36 76番目および 129 147番目に相 当する領域が細胞外領域としてあげられる。このとき、予測に用いられるパラメータは これらの予測プログラムにデフォルトの値が用いられる。 [0053] また、本発明における PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域 は、文献 [Genes & Development, 14, 704 (2000) ]で予測される細胞外ドメイ ンの 33〜75番目および 129〜150番目に相当する領域であってもよレヽ。
本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を 特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片は、 PERP遺 伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造を認識し、かつ該ポリぺプ チドの細胞外領域に結合できる。
[0054] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造とは、配列番号 1 で示される塩基配列を有する PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが天然状 態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有していればいずれでもよい。このような立 体構造を有している PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドには、本発明のハイ ブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)が生産するモノクローナル抗体が結合で きる。従って、本発明のモノクローナル抗体は、ハイプリドーマ KM3411 (FERM B P— 8643)により生産されるモノクローナル抗体が結合するェピトープと同一のェピト ープに結合するモノクローナル抗体なども包含される。
[0055] ハイプリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)が生産するモノクローナル抗体が 結合することを確認する方法としては、例えば、 PERP遺伝子によりコードされるポリ ペプチドが発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法が用いられ、蛍光細胞染 色法などの特定の抗原が発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を確認す る方法が好適に用いられる。具体的には、実施例 4の（3)または実施例 5の（2)に記 載の蛍光抗体染色法または実施例 5の（1)に記載の免疫沈降法などがあげられる。 また、公知の免疫学的検出法 [Monoclonal Antibodies - Principles and pra ctice, Third edition, Academic Press (1996)、 Antibodies— A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マ ニュアル、講談社サイエンティフィック（1987) ]などを組み合わせて確認することもで きる。
[0056] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞としては、ヒト体内に天 然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株または遺 伝子組換え技術により得られた細胞などがあげられる。
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発 現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで 該ポリペプチドが発現している細胞があげられる。
[0057] ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から 得られた該ポリペプチドが発現してレ、る細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ポ リペプチドが発現している細胞株があげられ、例えば、ヒトから樹立された細胞株であ る陴癌細胞株 Capan_ 2 (ATCC HTB— 80)または BxPC_ 3 (ATCC CRL—1 687)、大腸癌細胞株 Colo205 (ATCC CCL- 222) , HT29 (ATCC HTB— 3 8)または WiDr (ATCC CCL— 218)、肺癌細胞株 NCI— H128 (ATCC HTB— 120)または NCI— H69 (ATCC HTB— 119)、乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HT B— 22)または子宮癌細胞株 MCAS FCRB 0240)などがあげられる。
[0058] 遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該ポリペプチドをコ ードする cDNAを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入すること により得られる、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられ、具体的には、実施例 4の（1)に記載の PERP遺伝子発現プラスミド pcPERPmHを導入し、該ポリペプチド が発現した細胞などがあげられる。
[0059] 本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を 特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体としては、ポリクローナル抗体 およびモノクローナル抗体があげられる力 好ましくはモノクローナル抗体が用いられ る。
モノクローナル抗体としては、ハイプリドーマにより生産される抗体、および抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え 抗体をあげることができる。
[0060] ハイプリドーマは、例えば上記の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発 現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ抗 体生産細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞とを融合させて調製することができ る。該ハイブリドーマを培養する力、、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して 該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより抗 PERP抗 体を取得することができる。
[0061] 抗原を免疫する動物としてはハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかな るものも用いることができる力 マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどが好適に用いら れる。またこのような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞に m vitro で免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイプリドーマが生産する抗体 なども本発明の抗体に包含される。
[0062] 本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ KM3411が生産す るマウス抗体 KM3411があげられる。ハイプリドーマ KM3411は平成 16年 2月 24日 付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP— 8643とし て寄託されている。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換 えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗 体の特徴を有し、抗原性が低ぐ血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ま しい。
[0063] 本発明におけるヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体を包含す る。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと表記する） および軽鎖可変領域 (以下、 VLと表記する）とヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、 CHと 表記する）および軽鎖定常領域（以下、 CLと表記する）とからなる抗体をレ、う。
[0064] 本発明のヒト型キメラ抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞 外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナ ル抗体を産生するハイブリドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれ ぞれ揷入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより 発現させ、製造すること力できる。
[0065] ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、 hlgと表記する）に属す ればいかなるものでもよレ、が、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属 する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができ る。また、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κク ラスあるいは λクラスのものを用いることができる。
[0066] 本発明のヒト型キメラ抗体としては、それぞれ配列番号 15、 16、 17で示されるァミノ 酸配列力、らなる抗体の VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および/またはそれぞれ配列 番号 18、 19、 20で示されるアミノ酸配列力、らなる抗体の VLの CDR1、 CDR2、 CDR 3を含む、ヒト型キメラ抗体があげられ、具体的には、抗体の VHが配列番号 12で示 されるアミノ酸配列の 19〜 130番目のアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLが配列 番号 14で示されるアミノ酸配列の 23〜： 128番目のアミノ酸配列を含む、ヒト型キメラ 抗体などがあげられる。
[0067] ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸 配列をヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明のヒト型 CDR移植抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの 細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するヒト以外 の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動 物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体の VHおよび VL の FRに移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒト抗体の CHおよび CLをコー ドする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型 CDR移植 抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造すること ができる。
[0068] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来の VHおよび VLの F Rのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデータベースに登録されてレ、るヒト抗体の VHおよび VLの FRの ァ ノ酸酉己歹 K、 たは Sequences of Proteins oi Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services ( 1991 )などに記載の、ヒト抗体の V Hおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
[0069] ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればレ、かなるものでもよレ、が、 hlgG クラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hlg G4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型 CDR移植抗体の C Lとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、 Kクラスあるレ、は λクラスのものを 用いることができる。
[0070] 本発明のヒト型 CDR移植抗体としては、それぞれ配列番号 15、 16、 17で示される アミノ酸配列力、らなる抗体 VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および Zまたはそれぞれ配 列番号 18、 19、 20で示されるアミノ酸配列力、らなる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3を 含むヒト型 CDR移植抗体または該抗体断片などがあげられ、具体的には、抗体の V Hが配列番号 25で示されるアミノ酸配歹 1J、または配列番号 25で示されるアミノ酸配 歹 IJのうち、 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 45番目の Gly、 72番目の Val、および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基 が置換されたアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLが配列番号 26で示されるァミノ 酸配列、または配列番号 26で示されるアミノ酸配列のうち、 3番目の Gln、 5番目の T hr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の Leu、 70番目の Phe、および 77番目 の Leuから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。
[0071] ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、 細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一およびヒト抗体産生トランスジヱニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィル スなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球 を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
[0072] ヒト抗体ファージライブラリ一は、ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝 子に揷入することにより Fab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライ ブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標 として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収 すること力 Sできる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖 および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。 [0073] ヒト抗体産生トランスジエニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物 を意味する。具体的には、例えば、マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該 ES 細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジヱニック マウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジエニック動物からのヒト抗体の 作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイプリドーマ作製方法によりヒト 抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積 させること力できる。
[0074] 本発明の抗体断片としては、 Fab、 F (ab' )、 Fab'、 scFv、 diabody、 dsFvおよび
2
CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の 22 4番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィ ド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
[0075] 本発明の Fabは、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立 体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を蛋白 質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体の Fabをコードする
DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該べ クタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することが できる。
[0076] F (ab' ) は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフイド結合の下部を酵素ペプシンで分
2
解して得られた、 2つの Fab領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10万 の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明の F (ab' ) は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域
2
の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を 蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記の Fab'をチォ エーテル結合あるいはジスルフイド結合させ、作製することができる。
[0077] Fab'は、上記F (ab' ) のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の
2
抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fab'は、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する F (ab' ) を還元
2 剤ジチオスレィトール処理して得ることができる。または、該抗体の Fab'断片をコード する DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造するこ とができる。
[0078] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を 用いて連結した、 VH— P—VLないしは VL— P—VHポリペプチドで、抗原結合活 性を有する抗体断片である。
本発明の scFvは、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し 、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造 すること力 Sできる。
[0079] diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗 原結合活性とすることもできる。
本発明の diabodyは、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細 胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクロ一 ナル抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを P のアミノ酸配列の長さが 8残基以下となるように構築し、該 DNAを原核生物用発現べ クタ一あるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、該発現ベクターを原核生物ある いは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0080] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポ リペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 [Protein En gineering, 7, 697 (1994) ]に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択するこ とができる。 [0081] 本発明の dsFvは、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し 、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造 すること力 Sできる。
[0082] CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構 成される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介し て結合させることができる。
本発明の CDRを含むペプチドは、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリべ プチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する モノクローナル抗体の VHおよび VLの CDRをコードする DNAを構築し、該 DNAを 原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現べクタ 一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができ る。
[0083] また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法） 、 tBoc法（t—ブチルォキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することも できる。
本発明の抗体は、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体 断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的ある いは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
[0084] 本発明の抗体の誘導体は、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチド の細胞外領域の立体構造を認識する抗体または抗体断片の H鎖あるいは L鎖の N 末端側あるいは C末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基あるいは側 鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、 高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法 [抗体工学入門、金光修著、地人書館 (19 94) ]により結合させることにより製造すること力できる。 [0085] また、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体 構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片をコー ドする DNAと、結合させたい蛋白質をコードする DNAを連結させて発現用ベクター に揷入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造す ること力 Sできる。
放射性同位元素としては、 131ι、 125ιなどがあげられ、例えば、クロラミン T法などによ り抗体に結合させることができる。
[0086] 低分子の薬剤としては、ナイトロジヱン 'マスタード、サイクロフォスフアミドなどのアル キル化剤、 5 _フルォロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン 、ブレオマイシン、マイトマイシン C、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン 、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤 [臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会 編、癌と化学療法社（1996) ]、またはハイド口コーチゾン、プレドニゾンなどのステロ イド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド斉 IJ、金チォマレート、ぺニシラミン などの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、マレイ ン酸クロルフヱ二ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤 [炎症と抗 炎症療法、医歯薬出版株式会社（1982) ]などがあげられる。例えば、ダウノマイシン と抗体を結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗 体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのアミ ノ基と抗体のカルボキシノレ基を結合させる方法などがあげられる。
[0087] 高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール (以下、 PEGと表記する）、アルブミ ン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビュルピロリ ドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの 高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、 （1)化学的、物理的あ るいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2)血中半減期の顕著な延長 、（3)免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待されるレィォコンジュ ゲート医薬品、廣川書店（1993) ]。例えば、 PEGと抗体を結合させる方法としては、 PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあげられるレ ォコンジュゲート医薬品、 廣川書店（1993) ]。 PEG化修飾試薬としては、リジンの ε—ァミノ基の修飾剤（特開 昭 61— 178926)、ァスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（ 特開昭 56— 23587)、アルギニンのグァニジノ基の修飾剤（特開平 2— 117920)な どがあげられる。
[0088] 蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイト力イン、例えば、ヒトインターロイ キン 2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激 因子、ヒトインターロイキン 12などがあげられる。また、癌細胞を直接傷害する活性を 有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との 融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードする cDNAに蛋白質をコードする c DNAを連結させ、融合抗体をコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物あるい は真核生物用発現ベクターに揷入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物 へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
[0089] 融合抗体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用す る場合の薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があ げられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラ ーゼなどの酵素、アタリジニゥムエステル、口フィンなどの発光物質、フルォレシン'ィ ソチアネート（FITC)、 RITCなどの蛍光物質などがあげられる。
以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。
[0090] 1.ハイプリドーマが産生する抗 PERPモノクローナル抗体の作製
(1)抗原の調製
本発明において用いられるポリペプチドは、 [Molecular Cloning, A Laborat ory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989)、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & So ns, 1987— 1997) ]などに記載された方法などを用レ、、例えば以下の方法により、 該ポリペプチドをコードする DNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる
[0091] まず、該ポリペプチドをコードする cDNAを含む完全長 cDNAを適当な発現べクタ 一のプロモーターの下流に揷入することにより、組換えベクターを作製する。この際も し必要であれば、完全長 cDNAをもとにしてポリペプチドをコードする部分を含む適 当な長さの DNA断片を調製し、上記完全長 cDNAの代わりに該 DNA断片を使用し てもよレ、。次いで、該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入 することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
[0092] 宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞など、 目的とする遺伝子を発現できるもので あればいずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への 組込が可能で、ポリペプチドをコードする DNAを転写できる位置に適当なプロモー ターを含有しているものが用いられる。
[0093] 大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合には、該組換えベクターは、 原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、 本発明において用いられる DNAおよび転写終結配列を含むベクターであることが好 ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいても よい。
発現ベクターとしては、例えば、 ρΒΤι·ρ2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれも Roche D iagnostics社製）、 pKK233— 2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX— 1 (Promega社製）、 pQE— 8 (QIAGEN社製）、 pKYP10 (特開昭 58 — 110600)、 pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (198 4) ]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989) ] , pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985) ]、 pBluescript II SK (-) (Stratagene 社製）、 pTrs30 [大腸菌 JM109/pTrS30 (FERM 8?— 5407)ょり調製]、 丁 32 [大腸菌JM109/pTrS32 (FERM BP— 5408)より調製]、 pGHA2 [大腸菌 I GHA2 (FERM BP— 400)より調製、特開昭 60— 221091]、 pGKA2 [大腸菌 I GKA2 (FERM BP— 6798)より調製、特開昭 60— 221091]、 pTerm2 (US468 6191、 US4939094、 US5160735)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG 400 U. Bacteriol. , 172. 2392 (1990) ]、 pGEX (Pharmacia社製）、 pETシステ ム（Novagen社製）、 pME18SFL3などをあげることができる。
[0094] プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいか なるものでもよレ、。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター、 PLプロモー ター、 PRプロモーター、 T7プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来する プロモーターなどをあげることができる。また、 Ptrpを 2つ直列させたタンデムプロモ 一ター、 tacプロモーター、 lacT7プロモーター、 letlプロモーターなどのように、人為 的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
[0095] また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン'ダルガルノ
(Shine - Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜 18塩基）に 調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明において用いられるポリペプチド をコードする DNAの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるよう に塩基を置換することができ、これにより、 目的とするポリペプチドの生産率を向上さ せること力 Sできる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結 配列は必ずしも必要ではなレ、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること が好ましい。
[0096] このような宿主細胞として用いられる原核生物としては、例えば、ェシエリヒア属など に属する原核生物を用いることができ、具体的には大腸菌 XL1— Blue、大腸菌 XL2 -Blue,大腸菌 DH1、大腸菌 MC1000、大腸菌 KY3276、大腸菌 W1485、大腸 菌 JM109、大腸菌 HB101、大腸菌 No. 49、大腸菌 W3110、大腸菌 NY49など力 S 用いることができる。
[0097] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、 Gene, 17, 107 (1982) , Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) ]に記載の方法などをあげることができる。
[0098] 本発明において用いられるポリペプチドを大腸菌で生産した場合には、ベクターの 種類により該ポリペプチドは、細胞質内に可溶型として、細胞質内に不溶性顆粒とし てまたはペリプラス 'ミックスペースに可溶型としてなどの発現様式で発現させることが できる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAI、 p cDM8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3_ 22979 ; Cvtotechnology. 3 , 133, (1990) ]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840 , (1987) ]、 pcDNAl/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pA GE103 QJ. Biochemistry, 101 , 1307 (1987) ]、 pAGE210、 pME18SFL3など をあげること力できる。
[0099] プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用い ること力 Sでき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子 のプロモーター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタロチ ォネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SRひプロモーターなどをあげるこ とができる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いて あよい。
[0100] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である COS細胞、チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH〇細胞、 HBT5637細胞（特 開昭 63— 299)などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 1 33 (1990) ]、リン酸カノレシゥム法（特開平 2— 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]などをあげること力 Sできる。
[0101] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 [Molecular Cloning, A Lab oratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess, 1989) ]に記載されている方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現など を行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が 付加されたポリペプチドを得ることができる。
[0102] 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチド を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明において用いられるポリ ペプチドを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の 培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシドなどを、 trpプロモーターを用 いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸 などを培地に添カ卩してもょレ、。
[0103] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Associ ation, 199. 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122. 501 (1952) ]、 ダノレべッコ改変 MEM培地 [Virology, 8, 396 (1959) ]、 199培地 [Pro So E xp. Biol. Med. ， 73, 1 (1950) ]またはこれら培地に牛胎児血清などを添加した培 地などを用いることができる。培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5% CO存在下な
2 どの条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン などの抗生物質を培地に添加してもよい。
[0104] 上記のとおり、本発明において用いられるポリペプチドをコードする DNAを組み込 んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞など由来の形質転換体を、通常の 培養方法に従って培養して該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より採取するこ とにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。
ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分 泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞 から、適切な方法を選択することができる。また、任意の蛋白質と蛋白質工学的に融 合させて融合ポリペプチドとして発現させて生産させてもよい。
[0105] ポリペプチドが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンら の方法 . Biol. Chem. , 264. 17619 (1989) ]、ロウらの方法 [Pro Natl. Aca d. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop. ， 4, 1288 (1990)、特開平 05— 336963または WO94Z23021]などに記載の方法を準用することにより、該 遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることもできる。また、特開平 2— 227 075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺 伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0106] ポリペプチドは、例えば、以下のようにして、上記の培養物などから単離'精製する こと力 Sできる。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心 分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントン ガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA_ 75 (三菱化学社 製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S _ Sepharose FF (P harmacia社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセフ ァロース、フエ二ルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分 子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシン グ法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用 レ、、精製標品を得ることができる。
[0107] また、ポリペプチドが細胞質内に不溶性顆粒を形成して発現した場合は、同様に細 胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ポリペプチドの不溶 性顆粒を回収する。回収した該蛋白質の不溶性顆粒を蛋白質変性剤で可溶化する 。該可溶化液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造にまき戻 した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
[0108] ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる 。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより、固 形物を取り除いた培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を 用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0109] また、本発明において用いられるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分ペプチド は、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc法（t_ブチルォキシ カルボニル法）などの化学合成法によっても製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノヽ0一キン 'ェノレマー社、 Pharmacia社、 Protein Technology I nstrument社、 Synthecell—Vega社、 PerSeptive社、島津製作所などのぺプチ ド合成機を利用して化学合成することもできる。
上記の方法により得られるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分配列を有する ペプチドを抗原として用いることができる。
[0110] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免 疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化ァ ノレミニゥムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原 が部分ペプチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン）や KLH (Keyhole Li mpet hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原 として用いる。
[0111] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜： 10回行う。各投与後 3〜7
日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔A ntibodies— A Laboratory Manual (Cold spring Harbor Laboratory, 19 88)〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマ ウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として用いる。
[0112] ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該 ポリクローナル抗体が、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の 立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する活性を有していることは 、後述（6)に記載の方法で調べることができる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後 3〜7 日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む 組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を ME M培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200rpm、 5分 間）した後、上清を捨て、トリス—塩化アンモニゥム緩衝液 (pH7. 65)で:!〜 2分間処 理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供す る。 [0113] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8—ァザ グァニン耐性マウス（BALB/cマウス由来）骨髄腫細胞株 P3— X63Ag8— U 1 (P3 一 U丄リ [Gmreirt Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1、丄 978 ) ]、 P3— NSl/l—Ag41 (NS— l) [European J. Immunology, 6, 511 (19 76) ]、 SP2/0-Agl4 (SP- 2) [Nature, 276. 269 (1978) ]、 P3— X63— Ag8 653 (653) [J. Immunology, 123. 1548 (1979) ]、 P3— X63—Ag8 (X63) [Na ture, 256, 495 (1975) ]など力 S用レヽられる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン 培地〔RPMI_ 1640培地にグルタミン（1. 5mmolZL)、 2_メルカプトエタノール（5 X 10_5molZL)、ジヱンタマイシン（10 μ g/ml)および牛胎児血清（FCS)を加え た培地（以下、正常培地という。）に、さらに 8—ァザグァニン（15 μ g/ml)をカ卩えた 培地〕で継代するが、細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107 個以上の細胞数を確保する。
[0114] (4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1 • 83g、リン酸一カリウム 0· 21g、食塩 7· 65g、蒸留水 1リットノレ、 ρΗ7· 2)でよく洗浄 し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜： 10 : 1になるよう混合し、遠心分離（ 1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しな がら、 37°Cで、ポリエチレングライコール一 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM 2mL およびジメチルスルホキシド 0. 7mLの混液の 0. 2〜： ImLを、 1 X 108個の抗体産生 細胞に加え、：!〜 2分間毎に MEM培地:!〜 2mLを数回加えた後、 MEM培地をカロ えて全量が 50mLになるようにする。遠心分離（900rpm、 5分間）後、上清を捨て、 ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10— 4mol/U、チミジン（1. 5 X 10— 5molZ L)およびアミノプテリン（4 X 10_7mol/Uを加えた培地〕 lOOmL中に懸濁する。こ の懸濁液を 96ゥヱル培養用プレートに 100 z L/ゥヱルずつ分注し、 5%COインキ
2 ュベータ一中、 37°Cで 7〜： 14日間培養する。
[0115] 培養後、培養上清の一部をとり後述するハイプリドーマの選択方法により、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、 かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを含むゥエルを選択す る。ついで、限界希釈法によりクローニングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地 (HAT 培地からアミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強 い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す る。
[0116] (5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2, 6， 10, 14—テトラメチルペンタデカン（Pristane) O. 5mLを腹 腔内投与し、 2週間飼育する〕した 8〜： 10週令のマウスまたはヌードマウスに、（4)で 得られた抗 PERPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細 胞/匹を腹腔内注射する。 10〜21日でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス 力 腹水を採取し、遠心分離（3000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50% 硫酸アンモニゥムで塩祈した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE—セファロースカラム、プ 口ティン A—カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 IgM 画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280nmでの吸光度より算出する。
[0117] (6)ハイプリドーマの選択方法
本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を 特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選 択する方法としては、以下の方法があげられる。
[0118] 天然型の立体構造を保っている PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細 胞外領域に結合できる性質の抗体を選択するには、 PERP遺伝子によりコードされる ポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内から樹立された細胞株また は遺伝子組換え技術により得られた細胞に対する結合性を調べることができる方法 であればいずれでもよぐ FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社） を用いる蛍光抗体染色法やフローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法などの方法 力あげられる。具体的な方法としては、実施例 4の（3)または実施例 5の（2)に記載の 方法などがあげられる。
[0119] また、これらの反応性を確認するための方法は、公知の免疫学的測定法 [Monocl onal Antibodies― Principles and practice, Third edition, Academic Press ( 1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, ( 1988) ]、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイェンティフィ ック（1987) ]などを組み合わせることもできる。
[0120] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト 体内力 樹立した細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、前 述した細胞があげられる力 該ポリペプチドの発現の有無が明らかである遺伝子組 換え技術により得られた PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞 を用いるのが好ましい。このような、遺伝子組換え技術により得られた細胞は、陰性対 照として該ポリペプチドが発現していない細胞の調製が容易である。
前述の方法で選択される、本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチド の細胞外領域の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマ の具体例としては、モノクローナル抗体 KM341 1を生産するハイブリドーマ細胞株 K M341 1 (FERM BP— 8643)などがあげられる。
[0121] 2.遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植 抗体などのヒト化抗体の作製方法を示す。
( 1 ) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み 込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CH および CLをコードする DNAをそれぞれクローニングすることにより構築することがで きる。
[0122] ヒト抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば、ヒト抗 体の Ί 1サブクラスの CHおよび κクラスの CLなどがあげられる。ヒト抗体の CHおよ び CLをコードする DNAとしてはェキソンとイントロン力、らなる染色体 DNAを用いるこ とも、 cDNAを用いることもできる力 cDNAを用いるのが好ましい。動物細胞用発現 ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107〔Cytotechnol. , 3, 133 (1990)〕、 pAGE103 ( l. Biochem. , 101 , 1307 (1987)、 pHSG274〔Ge ne， 27, 223 (1984) pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981 ) ] , pSGlbd2 -4 [Cytotechnol. , 4, 173 (1990)〕、 pSElUKlSedl— 3〔Cyto technol.， 13, 79 (1993)〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いる プロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーター I. Biochem. , 1 01, 1307 (1987)〕、モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR〔Biochem. Biophys. Res. Commun.， 149. 960 (1987)〕、免疫グロブリン H鎖のプロモーター〔Cell， 41 , 479 (1985)〕とェンハンサー〔〇611, 33, 717 (1983)〕などカあげられる。
[0123] ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在する タイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いる ことができる力 ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易 さ、動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点か らタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい . Immunol. Methods, 167. 271 (1994)〕。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、 pKANTEX 93 (WO97/10354) , pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)〕などがあげられる 構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体 の動物細胞での発現に使用できる。
[0124] (2)ヒト以外の動物由来の抗体の V領域をコードする cDNAの取得およびアミノ酸配 列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VH及び VLをコードする cDNAは以 下の様にして取得することができる。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞より mRNAを抽出し、 cDNAを合成 する。合成した cDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングして c DNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体の C領域部分或いは V 領域部分をコードする DNAをプローブとして用レ、、 VHまたは VLをコードする cDN Aを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファ ージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHまたは VLの全塩基配 列をそれぞれ決定し、塩基配列より VHまたは VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定 する。
[0125] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイプリドーマ細 胞を作製することが可能であれば、レ、かなるものも用いることができる。
ハイプリドーマ細胞から全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァニジン —トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymol. ,丄 ， 3 (1987) ]、また 全 RNA力、ら mRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT)固定化セルロースカラム法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ]等があげられる。また、ハイプリドー マ細胞力も mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Ki t (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製 )等があげられる。
[0126] cDNAの合成及び cDNAライブラリ一作製法としては、常法 [Molecular Clonin g, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Haroor Lab oratory Press, 1989)； Current Protocols in Molecular Biology) , Sup plement 1— 34]、或いは市販のキット、例えば、 Super Script™ Plasmid Sy stem for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製）や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる方法等があげられる。
[0127] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマ細胞から抽出した mRNAを铸型と して合成した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれ ばいかなるものでも用いることができる。例えば、 ZAP Express [Strategies, 5, 5 8 (1992) ] , pBluescript II SK ( + ) [Nucleic Acids Research, Γ7, 9494 (1 989) ]、 λ ΖΑΡΠ (Stratagene社製）、 gtlO、 ^ gtl l [DNA Cloning : A Prac tical Approach, I， 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 λ ExC ell、pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983 ) ]及び pUC18 [Gene， 33， 103 (1985) ]等力用レヽられる。 [0128] ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する大 腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかな るものでも用いることができる。例えば、 XL 1 - Blue MRF， [Strategies, 5, 81 (1 992) ]、 C600 [Genetics, 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [Science, 222, 778 (1983) ]、 NM522 U. Mol. Biol. ， 166. 1 (1983) ]、 K802 Q[. Mol. Biol. , 16, 118 (1966) ] ¾I/JM105 [Gene, 38, 275 (1985) ]等力 S用レヽられる。
[0129] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードする cDN Aクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロ ニー .ノヽイブリダィゼーシヨン法或いはプラーク.ノヽイブリダィゼーシヨン法 [Molecula r Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, 1989) ]により選択することができる。また、プライマーを 調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを錡型として、 Polym erase Chain Reaction [以下、 PCR法と表記する； Molecular Cloning, A La boratory Manual, Second Edition^ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 - 34]により VHまたは VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0130] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK ( - ) (Stratagene社製)等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配 列解析方法、例えば、サンガー（Sanger, F. )らのジデォキシ法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ]等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例 えば、 A. L. F. DNAシークェンサ一（Pharmacia社製）等を用いて解析することで 該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
[0131] 決定した塩基配列力 VH及び VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗 体の VH及び VLの全アミノ酸配歹 [J [Sequences of Proteins of Immunologic al Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較するこ とにより、取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VH及び VLの完全なァ ミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル配列を 含む抗体の VH及び VLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体の VH及び V Lの全 ^ノ酸酉己歹 Ij [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U S Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較することにより、分泌シ グナル配列の長さ及び N末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグ ループを知ることができる。また、 VH及び VLの各 CDRのアミノ酸配列についても、 既知の抗体の VH及び VLのアミノ酸配列 [Sequences of Proteins of Immun ological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と 匕 較することによって見出すことができる。
[0132] 更に VH及び VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、 SW ISS— PROTや PIR_Protein等に対して BLAST法 . Mol. Biol. , 215. 403 ( 1990) ]等の配列の相同性検索を行レ、、配列の新規性を検討することができる。
[0133] (3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコード するそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLを コードする cDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築す ること力 Sできる。例えば、ヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードするそれぞれ の cDNAを、ヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗 体の CHまたは CLの 5 '末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識 配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、それぞれを本項 2の（1)に記載の ヒ H匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコードするそれぞれの遺伝子 の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗 体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体 VHまたは VLを コードする cDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAを用い て PCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項 2の（1)に記載のヒト化抗体発現用 ベクターにクローニングすることもできる。
[0134] (4)ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLをコードする cDNAは、以下の様にして構築 すること力 Sできる。まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの CDRのアミ ノ酸配列を移植するヒト抗体の VHまたは VLのフレームワーク領域（以下、 FRと表記 する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸 配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例 えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHまた は VLの FRのアミノ酸配歹 IJ、ヒト抗体の VHまたは VLの FRの各サブグループの共通 ァ ノ酸酉己列 [Sequences 01 Proteins oi Immunological Interest, US D ept. Health and Human Services (1991) ]等があげられるが、その中でも、十 分な活性を有するヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物 の抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも 60 %以上）をそれぞれ有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒ ト抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体の VHま たは VLの CDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩 基配列に見られるコドンの使用頻度 [Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮して DNA配列に変換し、ヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をコードす る DNA配列をそれぞれ設計する。設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長 さからなる数本の合成 DNAを合成し、それらを用いて PCR法を行う。この場合、 PC Rでの反応効率及び合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを 設計することが好ましい。
[0135] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入 することで、本項 2の（1)で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト型 CDR移 植抗体の VHまたは VLをコードする cDNAをクローニングすることができる。 PCR反 応後、増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社製）等のプラスミドにそれ ぞれクローニングし、本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒ ト型 CDR移植抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を有するプ ラスミドを取得する。
[0136] (5)ヒト型 CDR移植抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VH及び VLの CDRのみ をヒト抗体の VH及び VLの FRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以 外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られてレ、る [BIO/TECHNOLOG Y, 9, 266 ( 1991 ) ]。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体の VH及び VL では、 CDRのみならず、 FRのレ、くつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗 原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴レ、、ヒト抗体の V H及び VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この 問題を解決するため、ヒト型 CDR移植抗体では、ヒト抗体の VH及び VLの FRのアミ ノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残 基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与して レ、るアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸 残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている [BIO/TE CHNOLOGY, 9, 266 ( 1991 ) ]。ヒト型 CDR移植抗体の作製においては、それら 抗原結合活性に関わる FRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要 な点であり、そのために X線結晶解析 . Mol. Biol. , 112, 535 ( 1977) ]或レヽ はコンピューターモデリング [Protein Engineering, 7, 1501 ( 1994) ]等による抗 体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒ ト型 CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆ る抗体に適応可能なヒト型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状 ではそれぞれの抗体にっレ、て数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性と の相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
[0137] ヒト抗体の VH及び VLの FRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて 本項 2の（4)に記載の PCR法を行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物につ いて本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたこ とを確認する。
[0138] (6)ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1 )に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコード するそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLをコ ードする cDNAをそれぞれクローユングし、ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築 すること力 Sできる。
例えば、本項 2の（4)及び（5)でヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLを構築する際 に用いる合成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5 '末端に適当な制限酵素 の認識配列を導入することで、本項 2の（1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト 抗体の CHまたは CLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で 発現するようにそれぞれクローニングすることができる。
[0139] (7)ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項 2 の（3)及び（6)に記載のヒト化抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現べク ターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿 主細胞としては、ヒトイ匕抗体を発現できる宿主細胞であれば、レ、かなる細胞でも用い ること力 Sできる力 その発現量の高さから、 COS— 7細胞（ATCC CRL1651)がー 般に用いられる [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991 ) ]。 COS— 7細胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE—デキストラン法 [M ethods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991) ]、リポフエクシヨン 法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]等力 Sあげられる。
[0140] 発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は酵 素免疫抗体法 [以下、 ELISA法と表記する； Monoclonal Antibodies -Principl es and practice, Third edition, Academic Press (1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クロ ーン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987) ]等により測定できる。
[0141] (8)ヒト化抗体の安定発現
本項 2の（3)及び（6)に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入す ることによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2 — 257891、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]等力あげられる。
[0142] ヒトイ匕抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させること ができる宿主細胞であれば、レ、かなる細胞でも用いることができる。例えば、マウス S P2/0— Agl4細胞（ATCC CRL1581 )、マウス P3X63— Ag8. 653細胞（ATC C CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 dhfrと表記する）が欠損した C HO細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 ( 1980) ]、レクチン而村生を獲 得した Lec l 3 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 ( 1986) ]、 1—6フコース転移酵素遺伝子が欠損した CH〇細胞（W〇05Z35586)、ラット YB2 /3HL. P2. Gi l . 16Ag. 20細胞（ATCC CRL1662)などがあげられる。
[0143] 上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素 などの蛋白質、 N—グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N—ァセチルダノレコサミ ンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質また は細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質など の活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくは WO05/35586に記載のひ 1 - 6フコース転移酵素遺伝子が欠損した CHO細胞などを用いることもできる。
[0144] 発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平 2— 2 57891に開示されている方法に従レ、、 G418硫酸塩（以下、 G418と表記する： SIG MA社製)等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地（Invitrogen社製）、 GIT培地（日本 製薬社製）、 EX— CELL301培地 JRH社製）、 IMDM培地（Invitrogen社製）、 H ybridoma— SFM培地（Invitrogen社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、 FBSと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた 形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させるこ とができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は ELISA法等によ り測定できる。また、形質転換株は、特開平 2— 257891に開示されている方法に従 レ、、 dhfr増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
[0145] ヒトイ匕抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製すること
5さる [Monoclonal Antibodies— Principles and practice, Third editio n, Academic Press ( 1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold S pring Harbor Laboratory ( 1988) ]0また、その他に通常、蛋白質の精製で用い られる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトダラ フィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒトイ匕 抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [以下、 SDS— PAGEと表記する： Nature, 227, 680 (1970) ]やウェスタンブロ ツァイング法 [Monoclonal Antibodies― Principles and practice, Third edi tion, Academic Press (1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ]等で測定することができる。
[0146] 3.本発明の抗体または抗体断片の活性評価
精製した本発明の抗体または抗体断片の抗原との結合活性、 PERP発現細胞株 に対する結合活性は ELISA法および蛍光抗体法 [Cancer Immunol. Immunot her.， 36, 373 (1993) ]または BIAcore™などを用いた表面プラズモン共鳴等によ り測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、 CDC活性、 ADCC 活性等を測定し、評価することができる [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993) ]。
[0147] 4.本発明の抗体を用いた疾患の診断方法
特定の細胞において、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現が認め られているため、本発明の抗体または抗体断片を用いて PERP遺伝子によりコードさ れるポリペプチドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することによ り、該ポリペプチドが関連する疾患を診断することができる。
[0148] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患としては、該ポリぺプ チドが発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよぐ例えば癌が あげられる。癌としては、上皮由来の癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大 腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立 腺癌または膝臓癌などがあげられる。
[0149] 本発明において PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定す る対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膝液、尿、糞便、組織 液、培養液など、該ポリペプチドを含む可能性のあるものであれば特に限定されない
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関連する疾患としては、該疾患によ り発現が変動する疾患があげられ、具体的には、癌があげられる。
[0150] 癌の診断は、例えば、以下のようにして行うことができる。
複数の健常者の生体力 採取した生体試料について、本発明の抗体または該抗 体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、 PERP遺伝 子によりコードされるポリペプチドの検出または測定を行レ、、健常者の生体試料中の 該ポリペプチドの存在量を調べておく。被験者の生体試料中についても同様に該ポ リペプチドの存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者の該 ポリペプチドの存在量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると 診断できる。
[0151] 本発明の抗体または抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、 目的 の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含ん でもよレ、。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などがあげられる。 検出用試薬としては、抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体、または抗体もし くは抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識に対応 した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬があげられる。
[0152] 本発明において PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を検出または測 定する方法としては、任意の公知の方法があげられる。例えば、免疫学的検出また は測定方法などがあげられる。
免疫学的検出または測定法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量 または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法とし ては、放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)、酵素免疫測定法 (EIAまたは ELISA)、 蛍光免疫測定法（FIA)、発光免疫測定法（luminescent immunoassay)、ウェス タンプロット法および物理化学的手法 (TIA, LAPIA, PCIA)などがあげられる。抗 原の検出または測定を行う方法であればレ、かなる方法でもよいが好ましくは免疫沈 降法または蛍光細胞染色法があげられる。
[0153] 放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)としては、例えば、抗原または抗原を発現した 細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗ィムノグロプリ ン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーシヨンカウンターなどで測定する 方法があげられる。
酵素免疫測定法 (EIAまたは ELISA)としては、例えば、抗原または抗原を発現し た細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗ィムノグロブリン抗体 または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげら れ、例えばサンドイッチ ELISA法などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識 体としては、前述のとおり、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院 )の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルォキ シダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ピオチン標識などを用いることができる。
[0154] サンドイッチ ELISA法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定したい抗 原をトラップさせ、トラップされた抗原に第 2の抗体を反応させる方法である。該 ELIS A法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗 原認識部位の異なる 2種類の抗体を準備し、そのうち、一方の抗体または抗体断片 を予めプレート（例えば、 96ゥエルプレート）に吸着させ、第 2の抗体または抗体断片 を FITCなどの蛍光物質、ペルォキシダーゼなどの酵素、ビォチンなどで標識してお く。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕 液、組織またはその破碎液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させ た後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた 検出反応を行う。該方法により、被験サンプル中の抗原濃度を測定する場合には、 濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプノレ中の抗原濃 度を算出することができる。サンドイッチ ELISA法に用いる抗体としては、ポリクロー ナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよぐ Fab、 Fab'、 F (ab) などの
2 抗体フラグメントを用いてもよレ、。サンドイッチ ELISA法で用いる 2種類の抗体の組み 合わせとしては、異なるェピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の 組み合わせでもよレ、し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片の 組み合わせでもよい。
[0155] 蛍光免疫測定法（FIA)としては、文献 [Monoclonal Antibodies -Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)；単クロ1 ~ン抗体夹 験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987) ]などに記載された方法があげら れる。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（川生明 著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社)の蛍光標識を用いることができる。例えば、 FIT C標識、 RITC標識などを用いることができる。
[0156] 発光免疫測定法（luminescent immunoassay)で用いる標識体としては、前述 のとおり、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査 42 ( 1998) ]の発光体標識があげられる。例えば、アタリジニゥムエステル標識、口フィン 標識などを用いることができる。
ウェスタンプロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などを SDS—ポリアクリル アミドゲノレ電気?永動 [Antibodies— A Laboratory Manual (Cold Spring Har bor Laboratory, 1988) ]で分画した後、該ゲルを PVDF膜またはニトロセルロー ス膜にブロッテイングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さ らに FITCなどの蛍光物質、ペルォキシダーゼなどの酵素標識、ピオチン標識などを 施した抗マウス IgG抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することに よって確認する方法である。ウェスタンプロット法の一例を以下に示す。
[0157] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組 織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として 0.：!〜 30 μ §を SDS— P AGE法により泳動する。泳動されたタンパク質を PVDF膜にトランスファーし 1 %BS Aを含む PBS (以下、 BSA— PBSと表記する）に室温で 30分間反応させブロッキン グ操作を行う。ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、 0. 05%の Tween— 20を含む PBS (以下、 Tween— PBSと表記する）で洗浄し、ペルォキシダーゼ標識 したャギ抗マウス IgGを室温で 2時間反応させる。 Tween— PBSで洗浄し、 ECL™ Western blotting detection reagents (Amersham土 ) どを用レヽ飞モノグ ローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号 2で示されるアミノ酸 配列を有するポリペプチドを検出することができる。ウェスタンブロッテイングでの検出 に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合 できる抗体が用いられる。具体的には、本発明の実施例 4の（2)に記載のモノクロ一 ナル抗体 KM3314あるいは巿販抗 PERPポリクローナル抗体（ProSci社製、製品 番号 2451、 Novus Biologicals社製、製品番号 NB500— 231)などが用いられる [0158] 物理化学的手法とは、具体的には、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドと 特異的に結合する本発明の抗体を用いて、抗原である PERP遺伝子によりコードさ れるポリペプチドと本発明の抗体とを結合させることにより凝集体を形成させて、この 凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法としては、毛細管法、一 次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫比濁法等があげられる [臨床 検查法提要、金原出版， 499 (1998) ]。
[0159] 例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径 0.：!〜 1 μ m程度のポリスチレンラテックス等の担体を用レ、、対応する抗原あるいは抗体により 抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。こ の変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することにより被験サンプノレ中の抗 原濃度などを測定することができる。
[0160] 本発明の抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立 体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合できるため、該ポリペプチドが 発現している細胞の検出に好適に用いられる。
該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いる ことができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、および免疫組織 染色法などが、好ましく用いられる。また、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイ ォシステム社)を用いる蛍光抗体染色法なども用いることができる。
[0161] 免疫沈降法とは、該ポリペプチドを発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗 体または抗体断片と反応させた後、プロテイン G—セファロースなどのィムノグロプリ ンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法であ る。あるいは以下のような方法によっても行なうことができる。
ELISA用 96ゥエルプレートに上述した本発明の抗体を固相化した後、 BSA—PB Sによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイプリドーマ株培 養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスィムノグロブリンあるい はラットイムノグロブリンまたはプロテイン Aあるいは Gなどをあらかじめ ELISA用 96ゥ エルプレートに固相化し BSA—PBSでブロッキングした後、ハイプリドーマ株培養上 清を分注して結合させる。 BSA— PBSを捨て PBSでよく洗浄した後、配列番号 2で 示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織の溶解液を反 応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物を SDS— PAGE用サンプルバッ ファーで抽出し、上記のウェスタンブロッテイングにより検出を行う。
[0162] 免疫細胞染色法および免疫組織染色法とは抗原を発現した細胞または組織などを 、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理し た後、本発明の抗体を反応させ、さらに FITCなどの蛍光標識、ペルォキシダーゼな どの酵素標識、ピオチン標識などを施した抗ィムノグロブリン抗体または結合断片を 反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する力、、あるいは蛍光標識の抗 体と細胞を反応させ、フ口-サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法（フローサイ トメトリー)でめる。 f列; ζ_は、文献 [Monoclonal Antibodies― Principles and pr actice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュ アル、講談社サイエンティフィック（1987) ]などに記載された方法を用いて行うことが できる。特に、本発明の抗体は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞 外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合できるため、フロー サイトメトリーにより天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出に好ましく 用いられる。
[0163] また、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体 染色法とは、形成された抗体 抗原複合体と、抗体 抗原複合体の形成に関与して レ、ない遊離の抗体または抗原とを分離することなぐ抗原量または抗体量を測定する ことができる、ホモジニァスなアツセィ方法であり、具体的には、実施例 4の（3)— 3に 記載の方法などがあげられる。
[0164] 5.本発明の抗体を用いた疾患の治療方法
本発明の PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を 特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片は、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
[0165] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患としては、該ポリぺプ チドが発現している細胞が関与する疾患であればレ、かなるものでもよぐ例えば癌が あげられる。癌としては、上皮由来の癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大 腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立 腺癌または膝臓癌などがあげられる。
[0166] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いた癌の治療剤に は、該抗体を用いて PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を制御する ことを特徴とする癌の治療剤、および ADCC活性や CDC活性、あるいはアポトーシ ス誘導作用による癌の治療剤が含まれる。
抗体の有する ADCC活性や CDC活性は、例えば、特開平 6— 205694に記載の 方法で測定することができる。このような活性を有する抗体は、 m ϊ において、特 定の抗原が発現した細胞を傷害することができるため、疾患の治療薬として用いるこ とができる。ヒト IgGクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植 抗体などのヒト化抗体およびヒト抗体は治療剤として、有効に用いられ [Cancer Res . , 56, 1118 (1996) ]。
[0167] 本発明の抗体は、変性を受けていない天然型の PERP遺伝子によりコードされるポ リペプチドを認識することができるので、生体内で存在する PERP遺伝子によりコード されるポリペプチドが発現している細胞を認識することができる。従って、該抗体の可 変領域の CDRを含むヒト IgGクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植抗体などのヒト化抗体およびヒト抗体は、 m vivoまたは in vitroにおいて 、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している細胞を傷害することが できる。 PERP遺伝子は癌において発現が亢進していることから、本発明の抗体また は抗体断片は癌の治療剤として使用することができる。また、高レ、 ADCC活性が付 与された本発明の抗体は、該抗体が発現している細胞を減ずる治療に用いられる治 療剤として、特に有効に用レ、られる。
[0168] 本発明の抗体または抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効 成分としての該抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであつ てもよいが、通常は薬理学的に許容される 1以上の担体と一緒に混合し、製剤学の 技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するの が望ましい。 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあ げること力 Sでき、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげること ができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤 、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
[0169] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソル ビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのダリ コール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル 類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添 加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ 糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤 、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシ プロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グ リセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
[0170] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射 剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製 される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製さ れる。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気 道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示され る。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が 可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分 を添カロすることもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重などにより異なるが、通常成人 1日当たり 10 x g/kg〜8mg/kgである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定さ れるものではない。 実施例 1
[0171] 各種細胞株、ゼノグラフト、正常組織における PERP遺伝子の発現解析
( 1 )各種ゼノグラフトの作製と腫瘍塊の調製
ヒト陴臓癌細胞株 [ASPC—1株（ATCC CRL _ 1469)、 Capan _ l株（ATCC HTB _ 79)、 MiaPaca株（国立癌センターより分与）]および 3種のヒト陴臓癌患者の 腫瘍組織由来の細胞 [PC01、 PC02、 PC03]を移植したゼノグラフトは以下のように して作製した。
[0172] 10 %の非働化ゥシ胎児血清を含む RPMI 1640培地（インビトロジェン社製）中で 継代培養した各細胞株を用いて、それぞれ 1 X 108個/ mlの細胞密度になるように P BSで細胞懸濁液を調製した。 Fox CHASE C . B— 17/lcr— scidJclマウス（雄 、 5週齢、 日本クレア社製）の腹側部皮下に、 1尾あたり該懸濁液を 100 / L移植した 。移植した細胞株あるいは細胞の生着が認められたマウスの腫瘍径を、ノギスを用い て経日的に測定し、腫瘍の長径が l cm程度に到達した個体を麻酔下で脱血死せし めた後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを 4つに切り分けた後、液体 窒素を用いて急速凍結した。
[0173] ヒト瞎臓癌細胞株の PANC— 1株と PSN—1株を移植したゼノグラフトは以下のよう にして作製した。
5 %の非働化ゥシ胎児血清を含む RPMI 1640培地（インビトロジェン社製）中で継 代培養した各細胞株を用いて、それぞれ 8 X 107〜1 X 108個 ZmLの細胞密度にな るように血清を含まなレ、 RPMI 1640培地で細胞懸濁液を調製した。 BALBZcAJcl _ nuマウス (雄、 8週齢、 日本クレア）の腹側部皮下に 1尾あたり該懸濁液を 100 x L 移植した。移植した細胞株の生着が認められたマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経 日的に測定し、腫瘍の長径が l cm程度に到達した個体を頸椎脱臼で屠殺した後に 各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを 4つに切り分けた後、液体窒素を用 いて急速凍結した。
[0174] ヒト大腸癌細胞株の HT— 29株（ATCC HTB— 38)と WiDr株（ATCC CCL— 218)を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
10 %非働化ゥシ血清を含む McCoy ' s 5A培地 (インビトロジェン社製）中で継代 培養した HT— 29細胞株、または 10%非働化ゥシ血清を含む MEM培地 (インビトロ ジェン社製）中で継代培養した WiDr細胞株を用いて、それぞれ 1 X 107個/ mLの 細胞密度になるように血清を含まなレ、RPMI1640培地で細胞懸濁液を調製した。 B ALBZcAJcl_nuマウス（雄、 8週齢、 日本クレア）の腹側部皮下に該懸濁液を 100 μ L移植した。移植した細胞株が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的 に測定し、腫瘍の長径が lcm程度に到達した個体を頸椎脱臼で屠殺した後に各腫 瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを 4つに切り分けた後、液体窒素を用いて急 速凍結した。
[0175] ヒト大腸癌細胞株の Colo205株（ATCC CCL—222)、 LS174T株（ATCC CL — 188)、 LS180株（ATCC CL— 187)、 SW1116株（ATCC CCL— 233)を移 植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
各細胞株を 10。/oの非働化ゥシ胎児血清を含む RPMI1640培地 (インビトロジェン 社製）で継代培養し、それぞれ 1 X 108個/ mLの細胞密度になるように PBSで細胞 懸濁液を調製した。 Fox CHASE C. B— 17/lcr— scidjclマウス（雄、 5週齢、 日 本クレア社製）の腹側部皮下に該懸濁液を 100 μ L移植した。このようにして作製さ れたゼノグラフトから摘出された腫瘍塊を同系のマウスの腹側部皮下に移植し、移植 した腫瘍塊が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長 径が lcm程度に到達した個体を麻酔下で脱血死せしめた後に各腫瘍塊を摘出した 。各腫瘍塊は、それぞれを 4つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
[0176] (2)全 RNAの抽出とポリ A( + ) RNAの精製
細胞株、患者組織ならびに上記（1)で作製したゼノグラフトより、以下に示した方法 により細胞顕濁液を調製した後、全 RNAを抽出し、ポリ A ( + ) RNAを精製した。
5種類の陴臓癌由来細胞株 [ASPC—1株（ATCC CRL_ 1469)、 BxPC_ 3株 (ATCC CRL_ 1687)、 Capan_ l株（ATCC HTB_ 79)、 MiaPaca株（国立 癌センターより分与）、 PSN—l株]、 8種類の大腸癌細胞株 [Colo205株 (ATCC CCL— 222)、 HT_ 29株（ATCC HTB_ 38)、 LS174T株（ATCC CL— 188) 、： LS180株（ATCC CL— 187)、 SW1116株（ATCC CCL— 233)コ、 7種類の 非小細胞肺癌細胞株 {PC— 1株、 PC— 7株、 PC— 9株、 PC—12株 [以上 4株； Brit ish Journal of Cancer, 39, 15 (1976) ]、 PC— 14株（ECACC 9007181 0)、 SK— LUl株（ATCC HTB— 57)、 SK— LC— 4株 }、 4種類の小細胞肺癌細 胞株 [Lu— 139株（RCB 469)、 NCI— H69株（ATCC HTB— 119)、 RERF— し〇_1^八株 〇1 80812)、 38〇_ 5株 ¾80819) ]、 3種類の急性骨髄性白血 病（AMU細胞株 [KG—1株（ATCC CCL_ 246)、 THP— 1株（ATCC CRL_ 8031)、 HL— 60株（ATCC CCL_ 240) ]、 3種類の急性リンパ性白血病（ALL) 細胞株 [CCRF— CEM株（ATCC CCL—120)、 Jurkat株（ATCC TIB - 152) 、HSB_ 2株 (ATCC CCL—120. 1) ]、 2種類の慢性骨髄性白血病（CML)細胞 株 [K562株（ATCC CCL_ 243)、 KU812株（ATCC CRL— 2099) ]、 8種類 の多発性骨髄腫（MM)細胞株 [KMS _ 11株 [International Journal of Onco logy, 12, 545 (1998) ]、 KMS— 18株 [International Journal of Oncology , 12, 545 (1998) ]、 ARH— 77株（ATCC CRL— 1621)、 IM— 9株（ATCC C CL— 159)、 RPMI8226株（ATCC CCL— 155)、 HS— Sultan株（ATCC CR L— 1484)、 U266B1株（ATCC TIB— 196)、 MC— CAR株（ATCC CRL— 8 083) ]、 2種類のバーキットリンパ腫細胞株 [Daudi株（ATCC CCL— 213)、 Raji 株 (ATCC CCL— 86) ]、組織球性リンパ腫（ヒスチォサイティックリンフォーマ）細 胞株 [U937株 (ATCC CRL— 1593) ]、甲状腺濾胞癌（FTC)細胞株 [ML— 1株 (DSMZ ACC 464) ]から以下のようにして、それぞれ細胞破碎液を調製してそれ ぞれ RNAを抽出した。
接着性の細胞株の場合には、培養後ァスピレーターを用いて培地を除き、 PBSで 洗浄した後、シリコン製のヘラで細胞を回収した。培養面積 10cm2分の細胞あたり 1 mLの TRIzoL Reagent (インビトロジヱン社製）を添加して懸濁した後、 18G注射 針に 10回通し、ゲノム DNAを寸断して細胞破砕液とした。
浮遊性細胞株の場合には、細胞培養液を冷却遠心機（日立 Himac CF15R、 w /T11A21ローター）を用いて 1500i"pmで 5分間遠心し、デカンテーシヨンにより培 地を除いた後、細胞を PBSに懸濁した。該細胞顕濁液を冷却遠心機（日立 Himac CF15R、 W/T11A21ローター）を用いて 1500i"pmで 5分間遠心し、上清を取り除 いて細胞を回収した。回収した細胞 I X 107個あたり lmLの TRIzoL Reagent (イン ビトロジェン社製）を添カ卩して懸濁した後、 18G注射針に 10回通し、ゲノム DNAを寸 断して細胞破砕液とした。
[0178] 上記（1)で作製したゼノグラフトおよびヒト臨床組織から摘出した腫瘍塊の破砕は、 以下のようにして行った。
凍結した腫瘍塊を 10mLの TRIzoL Reagent (インビトロジヱン社製）に投入し、 直ちにポリトロン PT2100 (キネマティ力社製）を用いて 30000rpmで 15秒間、破砕 し、細胞破砕液とした。
[0179] 得られた各細胞破砕液を、それぞれ冷却遠心機（日立 Himac CF15R、 w/Tl 1 A21ローター）を用いて l lOOOrpmで 10分間遠心し、沈殿を取らないように注意しな がら、上清をそれぞれ新しいチューブに移した。上清に 2mLのクロロフオルムを加え 、 15秒間激しく振とうし、室温で 2〜3分間静置後、冷却遠心機（日立 Himac CF7 D2、 w/RT3S3ローター）にて 3000rpmで 90分間、 4。Cにて遠心した。上清をそれ ぞれ新しいチューブに移し、 5mLのイソプロパノールを加え、緩やかに混和し、室温 で 10分間静置後、冷却遠心機（日立 Himac CF15R、 w/Tl 1A21ローター）にて l lOOOrpmで 10分間遠心し、上清を除いた後、 10mLの 75%エタノール溶液を加 えて混和し、さらに冷却遠心機（日立 Himac CF15R、 W/T1 1A21ローター）にて l lOOOrpmで 5分間遠心して沈殿を得た。該沈殿をそれぞれ適当量の RNase— fre e waterにて溶解し、全 RNAサンプルとした。全 RNAサンプルは吸光光度計にて 濃度測定および純度検定を行い、 A260/A280の比が 1. 7以上になっていること を確認した。 A260/A280の比力 . 7未満の場合には、さらに RNeasy kit (キア ゲン社製）にて精製を行った。
上述のようにして得た全 RNAを、 Micro Poly (A) Pure kit (Ambion社製）を 用レ、、キット添付のプロトコールに従って、それぞれポリ A ( + ) RNAを精製した。
[0180] (3) cDNAの合成
上記（2)で得られたポリ A( + ) RNAまたは市販の mRNAより、 Superscript Firs t- strand Synthesis System for RT— PCR (インビトロジェン社製）を用レヽ、 キット添付のマニュアルに従って cDNAを合成した。
[0181] ヒト正常組織由来の mRNAについては、血液、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、リン パ節、膝臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、 気道、子宮および胎盤由来の mRNAを BDクロンテック社より購入して使用した。ま た、ヒト臨床癌摘出組織として、腎明細胞癌（中分化癌、高分化癌） [35〜71才の男 性患者 9症例と 44〜63才の女性患者 6症例からの混合物]、肝細胞癌 (低分化癌） [ 69才男性患者 1症例と 67才女性患者 1症例からの混合物]、肺扁平上皮癌 [46〜7 0才の男性患者 5症例からの混合物]、胃腺癌 (低分化癌、中分化癌、高分化癌） [4 6〜81才の男性患者 7症例と 47〜58才の女性患者 2症例からの混合物]、子宮筋 腫 [29〜52才の女性患者 5症例からの混合物]、浸潤性乳管癌（中分化癌） [45〜6 0才の女性患者 6症例からの混合物]および食道扁平上皮癌 (低分化癌、中分化癌 、高分化癌） [56〜78才の男性患者 4症例と 71才の女性患者 1症例からの混合物] 由来の mRNAを BioChain社より購入して実験に用いた。
[0182] mRNAl μ gに対して lOmmolZL dNTPs混合溶液 1 μ L、 0. 5 μ g/ μ LOligo
(dT) プライマー溶液 1 μ Lを添カ卩し、 DEPC水で全量を 7 μ Lにした反応液を 6
12- 18
5°Cで 5分間加熱後、氷上で急冷し、 1分間以上静置して変性させた。該 mRNA溶 液に10 1 1¾1^£6 μ L、 25 μ mol/L塩化マグネシウム 4 μ L、 0. lmol/L DT T2 μ L、 RNaseOUTl μ Lを添加して全量を 19 μ Lとし、 42°Cで 2分間保温した。さ らに Superscriptll RTase (50U) 1 μ Lを加えて 42°Cで 50分間の逆転写反応を行 レ、、 70°Cで 15分間加熱して酵素を失活させた。この後、 RNaseHl μ L添加して 37 °Cで 20分間の反応後、 DEPC水を加えて全量を lmLとした。リアルタイム PCRの反 応には、該溶液を 5倍希釈して用いた。
[0183] (4)リアルタイム PCR法（Q— PCR法）による細胞株、ゼノグラフト、正常組織における PERP遺伝子の mRNA量の定量
上記（3)で調製した cDNA 10 x L (ポリ A ( + ) RNA量として 2ngに相当）、配列番 号 5で示される配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号 6で示される配列か らなるリバースプライマー (レ、ずれもプロフリゴ社製）をそれぞれ終濃度が 300nmol/ Uこなるように加え、さらに10 1 _?〇1¾1^6 Mg2+free (タカラバイオ社製） 2 μ L、 250mmol/L Mg2+溶夜 0. 2 μ L、 10mmol/L dNTPs 0. 6 μ L、 ExTaq R_ PCR (タカラバイオ社製） 0. 2 u SYBR Greenl (BMA社製、製品原液を 25 00倍希釈したもの) 1 Lに、 DEPC水を加えて全量を 20 とした溶液を、 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 30秒間、 65°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間力 なる反応を 45 サイクルで反応させた。増幅産物にインターカレ一トした SYBR Greenlが発する蛍 光強度を P ISM7700 (PEアプライドバイオシステムズ社製)を用 、て測定し、同機 器付属のソフトウェア Sequence detector ver. 1. 7aによりテータ角？析を行った。
[0184] 上記反応によって得られたシグナノレが目的の増幅断片である力どうかは、反応終 了後の液をァガロースゲル電気泳動に供し、主な増幅断片のサイズによって判断し た。尚、上記反応は、 96ゥエルの PCRプレートを用いて行った。 PCRプレートの各ゥ エルには、検体として上記 cDNAの他、陰性コントロール (滅菌水）、 Qiagen Plasm id Prep Midi kit (キアゲン社製）で精製した PERP遺伝子の cDNAを含むプラス ミド PLACE1001407 (GenBank ァクセッション番号; AK075082)を用いて作製 した検量線作製用標品（10〜： L06コピーノウエル)を配置し、上記と同様にして PCR 反応を行った。
[0185] こ < ようにして得られた各試料における PERP遺伝子の mR A発現量の結果を第 . 1表おょぴ第 2表に示した。 ' .
[表 1]
差替え 用 紙（規則 26) 58 Z1 第 1表
Figure imgf000060_0001
差替え用 紙（規則 26) 2] 58 Z2
第 2表
Figure imgf000061_0001
差替 え 用 紙（規則 26) 59
[0186] 第 1表には 各種癌細胞株とゼノグラフトにおける PERP遺伝子の mRNAの発現量 を、第 2表には、臨床癌摘出組織と正常組織における PERP遺伝子の mRNAの発 瑱量をそれぞれ示した。表中の分子数は、 2ngのポリ A(+) RNAあたりの PERP発 現分子数の値である。表中の *印は、 PERP発現分子数の測定値が検出限界以下 だったことを示す。表中の最も右のカラムには、正常組織で最も発現が高い Trachea (気道）での PERP遺伝子発現量を 1とした場合の、各組織における PERP遺伝子の mRNAの発現量をそれぞれ示した。
[0187] PERP遺伝子は、ヒト正常組織では発現が低ぐ膝癌細胞株の ASPC— 1株おょぴ ASPC— 1株を移植したゼノグラフト由来の腫瘍塊、 2種の勝臓癌腫瘍組織由来細 . 胞（PC02および PC03)を移植したゼノグラフト由来の腫瘍塊、大腸癌細胞株の colo 205株、 ¾明細胞癌ならぴに食道扁平上皮癌において、ヒト正常組織の中では最も 発現が高い Trachea (気道）に比較して、発現が 3倍以上亢進していることが明らかと なった。
, 実施例 2
[0188] 癌手術摘出標本における PERP遺伝子の発現解析'
LightCycler-FastStart DNA Master. SYBR Greenlキット（ロシュダイァ グノスティック社製）を使用し、 LightCycler (ロシュダイァグノスティック社製）を用 ヽ て、癌手術摘出標本における PERP遺伝子の mRNA量の定量を行った。
[0189] 大腸癌患者 6症例（原発巣 5症例、転移巣 3症例)ならびに滕臓癌患者 1 6症例から、
差替 え 用 紙（規則 26) 表 60 Z1
Figure imgf000063_0001
差替 え 用 紙 （規則 26) ' 61 '
第 3表には大腸癌患者および鸱臓癌患者の手術摘出標本における、癌部と隣接す る非癌部での PERP遺伝子の mRNAの発現量をそれぞれ示した。表中の分子数の カラムは、それぞれの手術摘出標本における癌部由来の全 RNA50ngに占める PE RP発現分子数おょぴ同一患者、同一標本の隣接非癌部由来の全 RNA50ngに占 める PERP発現分子数をそれぞれ表す。表中の *印は、 PERP発現分子数の測定 値が検出限界以下であったことを示す。表中の癌部 Z非癌部のカラムは、隣接する 非癌部に対する癌部での PERP遺伝子発現量の比を示す。
[0192] 大腸癌原発巣の 80% (5症例中 4症例； C1虫垂、 C2直腸、 C4直腸、 C5上行結 腸)、大腸癌転移巣の 33% (3症例中 1症例; C6肝転移）、臈臓癌臨床試料の 16 症例中 9症例（Pl、 P2、 P3、 P5、 P8、 P9、 Pl l、 P12、 P14)では、癌部において隣 接する非癌部と比較して、 PERP遺伝子の発現が 3倍以上 進していることが明らか となった。
実施例 3
[0193] Cancer Profiling Array (CLONTECH社）を用いた PERP遺伝子の 現解析
Cancer Profiling Array (CJLONTECH社製、 Cat. 7841— 1, Lot. 207068 6；各種癌組織と対照としてその近傍の正常組織力 得られた cDNAがドットブロッテ イングされたナイロンメンブレン)を用いて各種癌組織と近傍の正常組織における PE
差替え用 紙 （規則 2 RP遺伝子の発現を、以下のようにして解析した。
[0194] PERP遺伝子のプローブ作製は DIG High Prime DNAラベリングキット（ロシュ •ダイァグノスティックス社)の使用説明書に従レ、、以下のように行った。実施例 4の（1 )に記載の PERP発現用プラスミド pcPERPmHの 1 μ gを £^RIおよび Hindlllで切 断してァガロースゲル電気泳動で分離し、得られた 0. 6kbpの大きさの断片を切り出 し、 Gene Clean Spin Kit (BIO 101社製）で精製し、 15 μ Lの DNA溶液を得た 。この 10 に 6 の滅菌水を加え、 95°Cで 10分間処理し、氷中にて急冷させ、こ こに の DIG_High Primeを加え、 37°Cで 20時間反応させた。ここに 2 μ L の 0. 2mol/L EDTAを加え、さらに 65°Cで 10分間加熱することにより、反応を停 止させた。収量を定法に従って検定し、 0. ？ ^/ しのプローブを？？ し得た。
[0195] ハイブリダィゼーシヨンおよび検出は使用説明書に従レ、、以下のように行った。 1. 5 mgの sheared salmon testis DNA (以下、 stDNAと表記する）を 95°Cで 5分 間処理し、氷中にて急冷したものを 68°Cに予熱した 15mLの ExpressHyb Hybri dization Solution (CLONTECH社製）に加え、ハイブリダィゼーシヨン溶液 Aを 調製した。前述の Cancer Profiling Arrayを蒸留水に浸し、水気を完全に切った 後、プラスチックバッグに入れ、 10mLのハイブリダィゼーシヨン溶液 Aを加え、 68°C で 30分間保温しプレハイブリダィゼーシヨンを行った。 5ngのプローブに 150 μ gの st DNAを加え、 95°Cで 5分間処理し、氷中にて急冷したものを 5mLのハイブリダィゼ ーシヨン溶液 Aに加えたものをプローブ液とした。プレハイブリダィゼーシヨンが終了 した Cancer Profiling Arrayを新しいプラスチックバッグに移し、プローブ液を加 え、 68°Cで 16時間反応させた。その後、 Cancer Profiling Array を 200mLの 洗净溶 ί夜 1 (2 X SSC， 0. 50/0SDS)で 68。C (こて 30分 Γ 洗净を 4回,操り返し、次 ίこ 2 00mLの洗浄溶液 2 (0. 2 X SSC, 0. 5%SDS)で 68。Cにて 30分間、 1回のみ洗浄 し、さらに 200mLの 2 X SSCで室温にて 5分間洗浄した。以下の検出反応は室温に て行った。洗浄した Cancer Profiling Array を lOOmLの洗浄溶液 3 (0. 15mol /L塩化ナトリウムおよび 0. 3%Tween20を含む 0. lmol/Lマレイン酸緩衝液 pH 7. 5)で 2分間洗浄した後、 10mLのブロッキング溶液（0. 15mol/L塩化ナトリウム および 1倍濃度の Blocking Reagentを含む 0. ImolZLマレイン酸緩衝液 pH 7 . 5)で 30分間ブロッキングを行った。その後、抗 DIGアルカリフォスファターゼコンジ ュゲート抗体 1 μ Lを 5mLのブロッキング溶液に加えた抗体溶液で 30分間反応させ た。これを lOOmLの洗浄溶液 3での 15分間の洗浄を 2回繰り返し、 20mLの検出溶 液（0. lmol/L塩化ナトリウムを含む 0. ImolZLトリス塩酸緩衝液 pH9. 5)で平衡 化した後、 CDP- Star 25 μ Lをカ卩えた検出溶液に 5分間浸した。検出溶液を除去 後、 X線フィルムで検出した。
[0196] 第 1図には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、直腸癌、甲状腺癌にお ける各症例の癌組織（図中、 Tで示す）および近傍の非癌部（図中、 Nで示す）での P ERP遺伝子の mRNAの発現を示した。多くの症例において、近傍の正常組織と比 較して、癌部において PERPの発現亢進が認められた。
実施例 4
[0197] 抗 PERP遺伝子産物モノクローナル抗体の作製
(l) PERP発現細胞の造成
ヒト PERP遺伝子を含むプラスミド HEMBA1006335 (GenBankァクセッション番 号； AK074585、 lng/ L)を l /i L、 lO X ExTaq 緩衝液 2 /i L、 2mmol/L d NTPを 2 μ L、 10 μ mol/Lの配列番号 7および配列番号 8に示される塩基配列から なるプライマーをそれぞれ 2 μ L、 ExTaq polymerase (宝酒造社製） 0. 5 μ L、滅 菌水 10. 5 z Lからなる溶液を、 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 30秒間、 65°Cで 30 秒間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25サイクル、 72°Cで 7分間反応させた。反応産 物をァガロースゲル電気泳動で分離し、約 0. 6kbの増幅断片を GENECLEAN S pin Kit (BI〇101社製）を用いて抽出した。該断片と、 pCRII— TOPOベクターとを TOPO TA cloning Kit (Invitrogen社製）を用いて連結した後、コーェンらの方 法 [Proc. Nalt. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972) ] (こより大月昜菌 DtI5ひ株を 形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製)を用いて プラスミドを抽出し、ヒト PERP遺伝子を含むプラスミド pCRII— PERPを取得した。
[0198] PERP断片の 3 '側に myc— Hisタグ配列を付加するためのクローニングベクターと して pBSmHを以下のようにして作製した。
pcDNA3. 1 (一）/ myc— HisC (Invitrogen社製]を Pmelで消化し、上記と同様 にして約 170bpの myc— Hisタグをコードする遺伝子を含む DNA断片を取得した。 該断片と、 および limilで消化後、 T4 DNA polymerase (宝酒造社製）で末 端の平滑化を行った pBluescriptll SK (—）（ストラタジーン社製）とを DNAライゲ ーシヨンキット ver. 2 (宝酒造社製）により、連結した後、大腸菌 DH5ひ株を形質転換 した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミド を抽出し、プラスミド pBSmHを取得した。 pBSmHは、制限酵素 1で該プラスミド を消ィ匕し、約 2. 9kbpおよび約 160bpの 2本の断片を生じる。
[0199] 上記の pCRII— PERPを E^RIと Hlndlllで消化し、 PERP遺伝子を含む断片を 取得した。該断片と、 E RIと Hlndlllで消化した pBSmHとを DNAライゲーシヨンキ ット ver. 2 (宝酒造社製）により連結した後、大腸菌 DH5ひ株を形質転換した。得ら れた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、 プラスミド pBS - PERPmHを取得した。
[0200] pBS— PERPmHを EmRIと Xhalで消化し、 PERP遺伝子および myc— Hisタグを コードする遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、 E Rlと で消化した PCDN A3. 1 + (Invitrogen社製）とを DNAライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造社製）により 連結した後、大腸菌 DH5 a株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽 出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、ヒト PERPの発現プラスミド pcP ERPmHを取得した。
pcPERPmHは、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]に より以下のようにして CHO/DG44細胞 [Somatic Cell and Molecular Gene tics, 12 (6) , 555 (1986) ]へ導入した。
[0201] 細胞は、 10%ゥシ胎児血清（ライフテクノロジ一社製）、 1 X HT supplement (ライ フテクノロジ一社製）、 1 % Penicillin— streptomycin (ライフテクノロジ一社製）を 添加した IMDM培地 (ライフテクノロジ一社製）（以下、 A3培地と表記する）で培養し たものを用いた。 CHO/DG44細胞を K— PBS緩衝液 [137nmolZL塩化カリウム 、 2. 7nmol/L塩化ナトリウム、 8. ImmolZLリン酸一水素ニナトリウム、 1. 5nmol /Lリン酸二水素一ナトリウム、 4mmol/L塩化マグネシウム緩衝液]に懸濁して 8 X 106細胞/ mLの濃度に調製し、該細胞懸濁液 200 μ Lを上記発現プラスミド pcPER PmH 4 μ gと混禾口した。該混和液をキュベット（電極間距離 2mm)に移し、 GenePu lserll (バイオラッド社製）装置を用いてパルス電圧 0 · 35kV、電気容量 250 i Fの条 件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を A3培地中に懸濁し、 37°C、 5 % COインキュベータ一中で培養した。 1日間培養後
2
、0. 5mg/mL G418 (カルビオケム社製）を添加した A3培地に培地交換し、培養 を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約 2週間後に、 G418に耐 性を持つ形質転換細胞株を取得した。
[0202] 得られた形質転換細胞を 1 . 25細胞/ mLとなるよう 0. 5mgZmL G418を添カロし た A3培地で希釈後、 96ゥヱルプレートに 200 z Lずつ分注して、限界希釈法による クローニングを行った。
上記で取得された形質転換細胞 1〜5 105個を15 しの1 ？八0£ bufferに 溶解して 95°Cで 5分間処理し、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動 [Antibodies— A
Laboratory Manual (し ola ¾pnng Harbor Laboratory, 1 988 」 (こて 幽 後、 PVDF膜にブロッテイングした。 BSA— PBSでブロッキング後、抗 mycモノクロ一 ナル抗体 9E 10 (MBL社製）を室温で 1時間反応させた。 Tween— PBSで洗浄した 後、第二抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (ダコ社製） を室温で 1時間反応させた。 Tween— PBSでよく洗浄した後、検出は ECL— detect ion kit (アマシャム社製）を用いて行い、 X線フィルム上に感光させた。
第 2図に結果を示した。分子量 25kDa付近にシグナルが認められた株を PERP発 現株（以下、 PERP/CHO細胞と表記する）とした。
[0203] ( 2)抗 PERPモノクローナル抗体の作製 1
( 2) - 1 免疫原の調製
上記（1 )で造成した PERPZCHO細胞を 10 %牛胎児血清入り Iscove ' s Modifi ed Dulbecco ' s 培地（インビトロジヱン社製）で 2〜3日培養後、 1匹あたりの細胞 数が 6 X 106個から 1 X 107個の細胞数となるように PBSに懸濁した。
[0204] ( 2) - 2 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（2) _ 1で調製した細胞を、百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 109細 胞とともに 6週令雌 SDラット 3匹に投与した。投与 1週間後より、毎週 1回、計 5回投与 した。該ラットの眼底より部分採血し、以下に示すサンドイッチ ELISAにより血中抗体 価を測定し、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫 3日後に脾臓を摘出した。
[0205] 脾臓を MEM (Minimum Essential Medium)培地（日水製薬社製）中で細断 し、ピンセットでほぐし、遠心分離（250 X g、 5分間）した。得られた沈殿画分にトリス —塩化アンモニゥム緩衝液 (pH7. 6)を添加し、：!〜 2分間処理することにより赤血球 を除去した。得られた沈殿画分 (細胞画分）を MEM培地で 3回洗浄し、細胞融合に 用いた。
[0206] (2) - 3 酵素免疫測定法（サンドイッチ ELISA)
96ゥエルの EIA用プレート（グライナ一社製）に、 MYC 1 - 9E10. 2細胞株（AT CC CRL—1729)が産生する抗 c_Myc抗体をダルベッコ PBSで 10 x g/mLに 調製し、該溶液を 50 μ LZゥヱルで分注し、 4°Cで一晩放置して吸着させた。該プレ ートを PBSで洗浄後、 BSA—PBSを 100 x L/ゥエルで添加し、室温で 1時間放置 し、残存する活性基をブロックし、反応プレートとした。
[0207] PERP/CHO細胞または CHO/DG44細胞の各 5 X 107細胞あたりに lmlの細 胞溶解用緩衝液（l %TritonX、 150mmol/L塩化ナトリウム、 2mmol/L塩化マグ ネシゥム、 2mmol/L塩化カルシウム、 0· 1%ァザイド、 50mmol/Lョードアセトアミ ド、 50mmol/L N—ェチルマレイミド、 lmg/mlロイぺプチン、 0. lmmol/L D TTを含む 50mmol/Lトリス—塩酸緩衝液 ρΗ7· 2)を添カ卩し、 4°Cで 2時間放置後、 遠心分離して得られた上清を、 BSA— PBSを除去した反応プレートに 50 μ L/ゥ工 ルで分注し、室温で 2時間放置した。該プレートを PBSで洗浄後、被免疫ラット抗血 清またはハイブリドーマ細胞の培養上清を 50 /i L/ゥエルで分注し、室温で 2時間放 置した。該プレートを Tween_PBSで洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダーゼ標 識ャギ抗ラットイムノグロブリン (カルタグ社製）を 50 μ LZゥエルで加えて室温で 1時 間放置した。該プレートを Tween— PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2， 2'—アジノ— ビス（3—ェチルベンゾチアゾリン一 6—スルホン酸）アンモニゥムの 0. 55gを 1Lの 0. lmol/Lタエン酸緩衝液 (pH4. 2)に溶解し、使用直前に過酸化水素水を 1 μ L/ mLで添加した溶液]を 50 μ L/ゥエルで加えて発色させ、 415nmの吸光度（以下、 OD415などと表記する）をプレートリーダー（Emax ;モルキュラーデバイス社製）を 用いて測定した。
[0208] (2)— 4 マウス骨髄腫細胞の調製
8—ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U. 1 : P3— U1 [ATCC C RL— 1597： European Journal of Immunology, 6, 511 , (1976) ]を正常培 地（10%ゥシ胎児血清添加 RPMI培地)で培養し、細胞融合時に 2 X 107個以上の 細胞を確保し、細胞融合に供した。
[0209] (2) - 5 ハイプリドーマの作製
上記（2) - 2で得られたラット脾細胞と（2) _4で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1にな るよう混合し、遠心分離（250 X g、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよ くほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール一 1000 (PEG— 10 00) 2g、 MEM培地 2mLおよびジメチルスルホキシド 0. 7mLの混液 0. 2〜： ImLZ 108マウス脾細胞を加え、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mLを数回加えた後、 ME M培地を加えて全量が 50mLになるようにした。遠心分離（900rpm、 5分間）後、上 清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるや かに細胞を HAT培地 lOOmL中に懸濁した。
[0210] この懸濁液を 96ゥヱル培養用プレートに 100 μ L/ゥエルずつ分注し、 5% COィ
2 ンキュベータ一中、 37°Cで 10〜： 14日間培養した。培養後、培養上清を（2)—3に記 載したサンドイッチ ELISA法で調べ、 PERP/CHO細胞に反応して CHO/DG44 細胞に反応しないゥヱルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクロー二 ングを 2回繰り返し、抗 PERP抗体産生ハイブリドーマ株 KM3314を確立した。 第 3図には、（2)—3記載のサンドイッチ ELISA法を用いて、 KM3314の PERP/ CHO細胞および CHOZDG44細胞に対する反応性を示した。 KM3314は PERP /CHO細胞に特異的に反応した。
[0211] (2) - 6 モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BALBZc)に（2) _ 5で得られたハイブリ ドーマ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、ハイブリ ドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（l〜8mLZ 匹）した。 [0212] 該腹水を遠心分離（1200 X g、 5分間）し固形分を除去した。精製 IgGモノクローナ ル抗体は、力プリル酸沈殿法 [Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory (1988)〕により精製することにより取得した。サブクラスタ ィビングキットを用いた ELISA法により、精製した抗 PERPマウス抗体 KM3314のサ ブクラスを決定したところ、抗 PERPマウス抗体 KM3314のサブクラスは IgG2aであ つた。
[0213] (2) - 7 モノクローナル抗体の反応性の検討一ウェスタンブロッテイング
PERP/CHO細胞および CHOZDG44細胞、大腸癌細胞株 Colo205 (ATCC CCL— 222)および肺癌細胞株 PC1 (免疫生物研究所）に SDS— PAGE用サン プルバッファー { 2%SDSおよび 10%グリセロールを含む 62mmol/Lトリス—塩酸 緩衝液（PH6. 8) }を細胞 I X 107個あたり 100 x L添カロして、 100°C加熱および超 音波破砕にて、可溶化画分を調製した。各 1 X 105個細胞相当量を SDS— PAGEを 行レ、、泳動後のゲルを PVDF膜にブロッテイングした。該膜を BSA— PBSでブロッキ ング後、ハイプリドーマ KM3314培養上清および陰性対照抗体 KM1762 (抗アベ ルメクチン抗体）を 5 μ g/mLで含む BSA— PBSを室温で 2時間反応させた。
[0214] 反応後、該膜を Tween— PBSで洗浄した後、ペルォキシターゼ標識ゥサギ抗ラット ィムノグロブリン (ダコ社製）を室温で 1時間反応させた。反応後、該膜を Tween— P BSで洗浄し、 ECL™ウェスタンブロッテイングディテクシヨンリーアジェンッ（アマシャ ムフアルマシア社製）を用いて、抗 PERP抗体が結合したバンドを検出した。
[0215] 結果を第 4図に示した。 PERP/CHO細胞および大腸癌細胞株 Colo205で 25k Da付近にバンドが検出され、抗 PERPマウス抗体 KM3314はウェスタンブロットによ る PERPの検出が可能な抗体であることが示された。 PERP/CHO細胞で検出され るバンドの分子量力 大腸癌細胞株 Colo205で検出されるバンドの分子量と比較し て大きくなつているのは、 PERP/CHO細胞では、 myc_ Hisタグ配列を付加して発 現しているためであると考えられた。
[0216] (3) 抗 PERPモノクローナル抗体の作製一 2
(3) - 1 免疫原の調製
上記（1)で造成した PERP発現株を 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified D ulbecco' s培地（インビトロジヱン社製）で 2〜3日培養後、 1匹あたりの細胞数が 6 X 106個から 1 X 107個の細胞数となるように PBSに懸濁した。
(3)— 2 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（3) _ 1で調製した細胞を、百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 109細 胞とともに 6週令雌 Balb/Cマウス 3匹に投与した。投与 1週間後より、毎週 1回、計 5 回投与した。該マウスの眼底より部分採血し、その血中抗体価を以下に示す細胞を 用いた蛍光抗体染色法を行い、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステ ム社製）およびフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定し、十分な抗 体価を示したマウスから最終免疫 3日後に脾臓を摘出した。
[0217] 脾臓を MEM (Minimum Essential Medium)培地（日水製薬社製）中で細断 し、ピンセットでほぐし、遠心分離（250 X g、 5分間）した。得られた沈殿画分にトリス —塩化アンモニゥム緩衝液 (pH7. 6)を添加し、：!〜 2分間処理することにより赤血球 を除去した。得られた沈殿画分 (細胞画分）を MEM培地で 3回洗浄し、細胞融合に 用いた。
[0218] (3)— 3 細胞を用いた蛍光抗体染色法（FMAT: Fluorometric Microvolume Assay 上、 echnologyノ
アツセィ用の細胞は（1)で造成した PERP/CHO細胞と CHO/DG44細胞を用 いた。 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified Dulbecco' s培地 [インビトロジェ ン社]で 2〜3日培養し、 Tripsin— EDTA溶液（インビトロジヱン社製）で剥離した細 胞を同一の培地に懸濁し、 FMAT用黒色 96ゥエルプレートに 7 X 103個/ 100 μ L 培地/ゥエルで播種し、 1晚培養した。該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗 血清あるいはハイプリドーマ培養上清を 5 a LZゥエルで分注し、二次抗体として AL ΕΧΑ647標識抗マウスィムノグロブリン G (H + U (モレキュラープローブ社製）を 50 z LZゥエルで分注し、遮光下で 4時間放置した。レーザー光 633nmHeZNeで励 起される 650nm〜685nmの波長を FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオ システム社製）で測定した。
[0219] (3) -4 細胞を用いた蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）
アツセィ用の細胞は（1)で造成した PERPZCHO細胞と CHO/DG44細胞を用 いた。 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified Dulbecco' s培地（インビトロジェ ン社製）で 2〜3日培養し、 0. 02%EDTA溶液（ナカライテスタ社製）で剥離した細 胞を PBSで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるために BSA—PBSを用いて、 氷温中で 20分ブロッキングした。 1 X 106個 Z100 μ L/BSA—PBSとなるように 96 ゥヱル U字プレートに分注し、遠心分離（1800rpm、 2分間）した後、上清を除いて一 次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイプリドーマ培養上清を 50 μ LZゥエル分注し 、氷温中で 30分間反応させた。 PBSを用いて遠心分離法で 3回洗浄し、二次抗体と して ALEXA488標識抗マウスィムノグロブリン G (H + L) (モレキュラープローブ社 製）を 20 x LZゥヱルカ卩えて氷温で遮光下、 30分間反応させた。再び PBSを用いて 洗浄し、 PBSに懸濁してレーザー光 488nmArで励起される 510〜530nmの波長 をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。
[0220] (3) - 5 マウス骨髄腫細胞の調製
8—ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U. 1 : P3— U1 [ATCC C RL- 1597 : European Journal of Immunology,旦， 511 (1976) ]を正常培地 (10%ゥシ胎児血清添加 RPMI培地）で培養し、細胞融合時に 2 X 107個以上の細 胞を確保し、細胞融合に供した。
[0221] (3)— 6ハイプリドーマの作製
(3)—2で得られたマウス脾細胞と（3)—5で得られた骨髄腫細胞とを 10 : 1になるよ う混合し、遠心分離（250 X g、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほ ぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール一 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM培地 2mLおよびジメチルスルホキシド 0· 7mLの混液 0· 2〜： lmL/108 マウス脾細胞を加え、：!〜 2分間毎に MEM培地:!〜 2mLを数回加えた後、 MEM培 地をカ卩えて全量が 50mLになるようにした。遠心分離（900rpm、 5分間）後、上清を 捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに 細胞を HAT培地 100mL中に懸濁した。
[0222] この懸濁液を 96ゥヱル培養用プレートに 200 μ L/ゥエルずつ分注し、 5% COィ
2 ンキュベータ一中、 37°Cで 10〜： 14日間培養した。培養後、培養上清を（3) _ 3およ び（3)— 4に記載した蛍光抗体染色で調べ、 PERP/CHO細胞に反応して CHOZ DG44細胞に反応しないゥヱルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるク ローニングを 2回繰り返し、抗 PERP抗体産生ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP — 8643)を確立した。
[0223] 第 5図には、ハイプリドーマ KM3411の培養上清に含まれるモノクローナル抗体の FMAT法における PERP/CHO細胞および CHOZDG44細胞に対する反応性を 示した。ハイプリドーマ KM3411が生産するモノクローナル抗体 KM3411は、 PER P/CHO細胞にのみ特異的に反応する。
[0224] (3) - 7 モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BALBZc)に（2) _ 5で得られたハイブリ ドーマ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、ハイブリ ドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（l〜8mLZ 匹）した。
[0225] 該腹水を遠心分離（1200 X g、 5分間）し固形分を除去した。精製 IgGモノクローナ ノレ抗体は、力プリル酸沈殿法 [Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory (1988) ]により精製することにより取得した。サブクラスタ ィビングキットを用いた ELISA法により、精製した抗 PERPマウス抗体 KM3411のサ ブクラスを決定したところ、抗 PERPマウス抗体 KM3411のサブクラスは IgGlであつ た。
[0226] (3) - 8 モノクローナル抗体の反応性の検討一蛍光細胞染色（フローサイトメトリー） 上記（3)— 4 に示した方法に従って行なった。結果を図 6に示す。 KM3411は P ERP/CHO細胞および大腸癌細胞株 Colo205に反応して、 CHO/DG44細胞 および PERPmRNAが発現してなレ、PC1には反応しなかった。
実施例 5
[0227] 抗 PERPマウス抗体 KM3411を用いた免疫学的手法による PERP遺伝子によりコー ドされるポリペプチドの検出
(1) KM3411を用いた免疫沈降反応による PERP遺伝子によりコードされるポリべ プチドの検出
96ゥエル ELISAプレートに抗マウスィムノグロブリン（ダコ社製）をプレートコートし、 抗 PERPマウス抗体 KM3411を含む、ハイプリドーマ細胞の培養上清、または陰性 対照抗体 KM511 (抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体）を含む、ハイプリドーマ 細胞の培養上清を 4°Cで 1晩にわたって反応させた。反応後、 PBSで洗浄し、非特 異吸着を避けるため BSA—PBSでブロッキングした。 PERP発現細胞または CHO /DG44細胞の各 5 X 107細胞あたりに ImLの細胞溶解用緩衝液（l %TritonX、 1 50mmol/L塩化ナトリウム、 2mmol/L塩化マグネシウム、 2mmoL/L塩化カルシ ゥム、 0. 1%ァザイド、 50mmol/Lョードアセトアミド、 50mmol/L N_ェチルマ レイミド、 lmg/mLロイぺプチン、 0. ImmolZL DTTを含む 50mmolZLトリス一 塩酸緩衝液 PH7. 2)を添カ卩し、 4°Cで 2時間放置後、遠心分離して得られた上清を、 BSA—PBSを捨てた該プレートに ΙΟΟ μ L/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置した。 Tween_PBSで洗浄後、 SDS— PAGE用サンプルバッファー { 2%SDSおよび 10 %グリセロールを含む 62mmol/Lトリス—塩酸緩衝液（PH6. 8) }にて溶解したもの をサンプルとして、上記（2)— 7と同様にウェスタンブロッテイングを行った。このとき、 一次抗体として上記（2)— 5で作製した抗 PERPマウス抗体 KM3314および陰性対 照抗体 KM1762 (抗アベルメクチン抗体）を用いた。
[0228] 結果を第 7図に示した。抗 PERPマウス抗体 KM3411で免疫沈降を行い、抗 PER Pマウス抗体 KM3314で検出を行った PERP/CHO細胞にのみ、 25kDa付近に バンドが検出された。抗 PERPマウス抗体 KM3411は免疫沈降反応による PERPの 検出が可能な抗体であることが示された。
[0229] (2) 抗 PERPマウス抗体 KM3411を用いた蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー） による PERPの検出
(2) - 1 各種細胞株
図 8中に示した各種癌細胞株を 0. 02%EDTA溶液 (ナカライテスタ社製）で剥離し 、 PBSで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにヒト免疫グロブリン (ゥエルフ アイド社製）を含む 1%BSA_PBSを用いて、氷温中で 20分間ブロッキングした。 1 X 106個/ 100 μ L/BSA—PBSとなるように 96ゥエル U字プレートに分注し、遠心 分離（1800rpm、 2分間）した後、上清を除いて、抗 PERPマウス抗体 KM3411培 養上清および陰性対照抗体 KM511 (抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体)培養 上清を 50 L/ゥエル分注し、氷温中で 30分間反応させた。 PBSを用いて遠心分 離法で 3回洗浄し、二次抗体として ALEXA488標識抗マウスィムノグロブリン G (H + L) (モレキュラープローブ社製）を 20 /i L/ゥエル加えて氷温中、遮光下で 30分 間反応させた。再び PBSを用いて遠心分離法で 3回洗浄し、 PBSに懸濁してレーザ 一光 488nmArで励起される 510〜530nmの波長をフローサイトメーター（ベック マンコールター社製）で測定した。
結果を図 8に示した。 KM3411は大腸癌 5Z5株、瞎臓癌 2/3株、肺癌 4/5株、 乳癌 2/2株、子宮癌 1/1株の各種癌細胞株と反応した。
[0230] (2) - 2 ヒト末梢血（単核球、顆粒球）
ヒト末梢血よりモノ'ポリ分離用溶液 (大日本製薬社製)を用いた遠心分離法で、単 核球であるリンパ球および単球画分または顆粒球画分を分離した。 10%牛胎児血 清入り RPMI1640培地（インビトロジヱン社製）で洗浄後、 96ウエノレ U字プレートに 1 X 106個/ 100 / Lになるように分注し、遠心分離（1800rpm、 2分間）後、上清を除 いて一次抗体としてピオチン標識抗 PERPマウス抗体 KM341 1および、陰性対照抗 体ビォチン標識 KM51 1 (抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体）を、ヒト免疫グロ ブリン (ゥエルフアイド社製) / BSA—PBSとともに氷温中で 1時間反応させた。該プ レートを PBSで 3回洗浄し、二次抗体としてレッド 670標識抗ストレプトアビジン（コー ルター社製）を 50 /i L/ゥエルを加え更に、 FITC標識抗ヒト CD45抗体（ベックマン コールター社製） 10 / L/ゥエル加えて氷温中、遮光下で 1時間させた。該プレート を PBSで 3回洗浄し、 PBSに懸濁してレーザー光 488nmArで励起される 505〜54 5nmまたは 660〜700nmの波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製 )で測定した。
[0231] 結果を第 9図に示した。縦軸の蛍光強度は FITC標識抗ヒト CD45抗体の、横軸の 蛍光強度はピオチン標識抗 PERPマウス抗体 KM3411あるいは陰性対照抗体ピオ チン標識 KM511の反応性をそれぞれ示している。ピオチン標識抗 PERPマウス抗 体 KM3411はヒト末梢血中の単核球、および顆粒球と反応しなかった。
実施例 6
[0232] 抗 PERPマウス抗体 KM3411と市販の抗 PERP抗体（ポリクローナル抗体）との反応 性比較
抗 PERPマウス抗体 KM3411と抗 PERPポリクローナル抗体（ProSci社 2451、 N ovus Biologicals社 NB500— 231)の PERP発現細胞に対する反応性をフロー サイトメトリーで比較した。
[0233] 細胞は PERPZCHO細胞と CHO/DG44細胞を用いた。 10%牛胎児血清入り I scove' s Modified Dulbecco' s 培地（インビトロジヱン社製）で 2〜3日培養し、 0. 02%EDTA溶液（ナカライテスタ社製）で剥離した細胞を PBSで洗浄し、抗体の 非特異的な吸着を避けるために BSA—PBSを用いて、氷温中で 20分間ブロッキン グした。 1 X 106個 Z100 μ LZBSA—PBSとなるように 96ゥエル U字プレートに分 注し、遠心分離（1800rpm、 2分間）した後、上清を除いて一次抗体としてモノクロ一 ナル抗体の陰性対照抗体として KM511 (抗 GCSF誘導体抗体）、ポリクローナル抗 体の陰性対照抗体として抗ラットアポ Bポリクローナル抗体 (ラットアポ Bを免疫原とし て作製したゥサギ抗血清由来 IgG画分ポリクローナル抗体）、抗 PERPマウス抗体 K M3411および 2種類の巿販抗 PERPポリクローナル抗体（ProSci社製、製品番号 2 451、 Novus Biologicals社製、製品番号 NB500— 231)を各 10 μ g/mlを 50 μ L/ゥヱル分注し、氷温中で 60分間反応させた。 PBSで 3回洗浄し、二次抗体として FITC標識抗マウスィムノグロブリン G (H + L) (カルタグ社製）または FITC標識抗ゥ サギィムノグロブリン G (H + L) (カペル社製）を 20 μ L/ゥエルで加えて氷温中、遮 光下で 30分間反応させた。再び PBSを用いて遠心分離法で 3回洗浄し、 PBSに懸 濁してレーザー光 488nmArで励起される 510〜530nmの波長をフローサイトメータ 一（ベックマンコールター社製）で測定した。
[0234] 結果を第 10図に示した。横軸には、蛍光強度を示した。抗 PERPマウス抗体 KM3 411のみ PERPZCHO細胞と CHO/DG44細胞で蛍光強度が異なることから、抗 PERPマウス抗体 KM3411のみが発現した PERPに特異的に反応してレ、ることが示 された。
実施例 7
[0235] 抗 PERPキメラ抗体の作製
(1) 抗 PERPマウス抗体の可変領域をコードする cDNAの単離、解析 ( 1 ) 1 抗 PERPマウス抗体産生ハイブリドーマ細胞からの mRNAの調製 実施例 4に記載のハイプリドーマ KM341 1より、 mRNAの調製キットである Fast Track 2. 0 Kit (Invitrogen社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリ ドーマ細胞 4 X 107細胞より約 39 μ gの mRNAを調製した。
[0236] ( 1 ) - 2 抗 PERPマウス抗体 KM341 1の H鎖および L鎖可変領域の遺伝子クロー ユング
上記（1 ) _ 1で取得した抗 PERPマウス抗体 KM341 1の mRNAの 1 μ g力、ら、 BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences社製）を用 いて、添付の使用説明書に従レ、、 5 '側にキット添付の BD SMART II™ A Olig onucleotide配列を有する cDNAを取得した。その cDNAを铸型として、キット添付 のユニバーサルプライマー Amixと、配列番号 9で示したマウス Ig ( y )特異的プライ マーを用いて PCR反応を行い VHの cDNA断片を増幅した。また ( γ )特異的プラ イマ一の代わりに配列番号 10で示したマウス Ig ( / )特異的プライマーを用いて PCR を行レ、VLの cDNA断片を増幅した。
[0237] PCRは、 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 15秒間、 72°Cで 3分間からなる反応サイク ノレを 5回、 94°Cで 15秒間、 70°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間からなる反応サイクルを 5 回、 94°Cで 15秒間、 68°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間からなる反応サイクルを 30回そ れぞれ行った後、 72°Cで 10分間反応させた。 PCRは GeneAmp PCR system9 700 (アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。得られた PCR産物は H鎖、 L鎖共に約 500bpのサイズであった。
[0238] 得られた PCR産物の塩基配列を決定するため、 pBluescriptll SK (—）ベクター（ Stratagene社製）を Sm^Iで消化して得られた DNAを約 0. 05pmolと、上記で得ら れたそれぞれの PCR産物約 0. 5pmolを TAKARA DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造社製）の Solutionlを 6 μ L、制限酵素^ m^Iを 0. 3 μ L入れ合計 12. 3 μ L· とし、 22°Cで一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミド D NA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株の クローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequenci ng FS Ready Reaction Kit (PEバイオシステムズ社製）を用い添付の説明書 に従って反応後、同社のシーケンサー ABI PRISM3700により塩基配列を解析し た。その結果、 cDNAの 5 '末端に開始コドンと推定される ATG配列が存在する、完 全長の H鎖 cDNAを含むプラスミド pKM3411H # 9および L鎖 cDNAを含むプラス ミド pKM3411L # 4が取得された。
[0239] (1) - 3 抗 PERPマウス抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
プラスミド pKM3411H # 9に含まれてレ、た VHの全塩基配列を配列番号 11に、該 配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型 VHの全アミノ酸配列を配列番 号 12に、プラスミド pKM3411L # 4に含まれてレ、た VLの全塩基配列を配列番号 13 におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型 VLの全アミノ酸配列 を配列番号 14にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Hu man Services (1991) ]との比較、並びに精製した抗 PERPマウス抗体 KM3411 の H鎖及び L鎖の N末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製: P PSQ— 10)を用いて解析した結果との比較から、単離した各々の cDNAは分泌シグ ナル配列を含む抗 PERPマウス抗体 KM3411をコードする完全長 cDNAであり、 H 鎖については配列番号 12に記載のアミノ酸配列の 1から 18番目力 L鎖については 配列番号 14に記載のアミノ酸配列の 1から 22番目が分泌シグナル配列であることが 明らかとなった。
[0240] 次に、抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHおよび VLのアミノ酸配列の新規性につ いて検討した。配列解析システムとして GCG Package (version 9. 1、 Genetics Computer Group社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースを B LASTP法 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997) ]により検索した。その結果 、 VH、 VLともに完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗 PERPマウス抗体 K M3411の VHおよび VLは新規なアミノ酸配列を有してレ、ることが確認された。
[0241] また、抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHおよび VLの CDRを、既知の抗体のアミ ノ酸配列と比較することにより同定した。抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの CDR 1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 15、 16および 17に、 VLの CDR 1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 18、 19および 20にそれぞれ示し た。
[0242] (2) 抗 PERPキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
(2)—1 抗 PERPキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3411の構築
WO97Z10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター pKANTEX93と本実施例の (1)— 2で得られたプラスミド pKM3411H # 9及び pKM3411L # 4を用いて抗 PE RPキメラ抗体発現ベクター PKANTEX3411を以下のようにして構築した。
[0243] 抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHをコードする cDNAを PCR法によって得るた めに配列番号 21と 22の塩基配列を有する合成 DNAを、 VLをコードする cDNAを 得るために配列番号 23と 24の塩基配列を有する合成 DNAをそれぞれ設計、合成 した。それぞれの合成 DNA (ジェンセット社製）は 5'末端に pKANTEX93へクロー ユングするための制限酵素認識配列を含んでいる。本実施例の（1) _ 2で得られた プラスミド pKM3411H # 9の 20ngを 50 z Lの K〇D DNA Polymerase添付 PC R Buffer # 1 (東洋紡績社製）、 0· 2mmol/L dNTPs、 lmmol/L塩化マグネ シゥム、 0. 5 μ ΐηοΙ/Lの配列番号 21と 22に示される塩基配列の合成 DNAを含む 緩衝液に添加し、サーマルサイクラ一を用いて、 94°Cで 3分間加熱した後、 2. 5単位 の KOD DNA Polymerase (東洋紡績社製）を添加し、 94°Cで 30秒間、 58°Cで 3 0秒間、 74°Cで 1分間からなる反応サイクルを 25サイクル行った。同様に、本実施例 の（1)— 2で得られたプラスミド pKM3411L # 4の 20ngを 50 Lの KOD DNA P olymerase添付 PCR Buffer # 1 (東洋紡績社製）、 0· 2mmol/L dNTPs、 lm mol/L塩化マグネシウム、 0· 5 /i mol/Lの配列番号 23と 24でそれぞれ示される 塩基配列の合成 DNAを含む緩衝液に添加し、上記の方法で PCRを行なった。該反 応液 40 z Lをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit ( QIAGEN社製）を用いて、約 0. 47kbの VHの PCR産物、約 0. 45kbの VLの PCR 産物をそれぞれ回収した。
[0244] 次に、プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製）を制限酵素^ m^I (宝 酒造社製）で消化した DNA0. 05pmolと、上記で得られたそれぞれの PCR産物約 0. 5pmolを滅菌水に加えて 10 z Lとし、さらに TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造社製） 10 a L、制限酵素 SmaJ (宝酒造社製） 0. 5 μ Lをカ卩えて 2 2°Cで一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶 液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。得られた形質転換株 のクローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequen cing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems社製）を用いて添付の説明書 に従って反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 3700により塩基酉己歹 IJを 解析し、 目的の塩基配列を有する第 11図に示したプラスミド PKM3411VH9および PKM3411VL11が得られたことを確認した。
[0245] 次にヒト化抗体発現用ベクター pKANTEX93と上記で得られた pKM3411VLl l をそれぞれ制限酵素 fi WI (New England BioLabs社製）で消化後、引き続き制 限酵素 E Ri (宝酒造社製）で消化した。消化後の反応液をァガロースゲル電気泳 動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 0. 45 kbの VLの E RI— 断片と、約 12. 7kbの pKANTEX93の E RI—
断片をそれぞれ回収した。
[0246] 得られた 2種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製）を用いて添付の説明書 に従って連結し、得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東 洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を調製して制限酵素処理により確認し、 目的の約 0. 45kbの EmRI— 断片が 挿入された、第 12図に示したプラスミド pKANTEX3411VLが得られたことを確認し た。 素 A。al (宝酒造社製)で消化後、引き続き制限酵素 (宝酒造社製)で消化した。 消化後の反応液をァガロースゲル電気泳動した後、約 13. 2kbの pKANTEX341 1 VL由夹の Apal— Notl断片、約 0. 47kbの pKM3411VH9由来の A I— 断 片をそれぞれ回収した。得られた 2種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製）を 用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて 大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。得られた形質転換株のクローン より各プラスミド DNAを調製して制限酵素処理により確認し、 目的の約 0. 47kbの A pal- Notl断片が揷入された、第 12図に示したプラスミド pKANTEX3411が得ら れたことを確認した。該プラスミドに関して、 BigDye Terminator Cycle Sequen cing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems社製）を用いて添付の説明書 に従って反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 3700により塩基酉己歹 IJを 解析した結果、 目的の KM3411の VHをコードする cDNAおよび VLをコードする c DNAがそれぞれクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
[0248] (2) - 2 抗 PERPキメラ抗体の動物細胞での発現
本実施例の（2) _ 1で得られた抗 PERPキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3411 を用いて抗 PERPキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法 [Antibody Engine eri ng, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company (1992) ] ίこより行レヽ 、 pKANTEX3411が導入された形質転換株 KM3481を取得した。
[0249] (3) 精製抗体の取得
本実施例（2)— 2で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸 濁液を回収し、 3000rpm、 4°Cの条件で 5分間の遠心分離を行って培養上清を回収 した後、培養上清は 0. 22 μ m孔径 MillexGVフィルター（ミリポア社製）を用いて濾 過滅菌した。得られた培養上清より Mab Select (アマシャム'バイオサイエンス社製 )カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗 PERPキメラ抗体 KM3481を精製した。
[0250] 得られた抗 PERPキメラ抗体 KM3481の精製標品の精製度および発現分子サイ ズを、グラジュェントゲル (ATTO社製、カタログ番号: E— T520L)を用いて、添付の 説明書に従い、 SDS— PAGEにより確認した。抗 PERPマウス抗体 KM3411を対 照として同時に泳動した。
結果を第 13図に示した。精製した抗 PERPキメラ抗体 KM3481は、非還元条件下 では分子量が約 150キロダルトン（以下、 Kdと表記する）の 1本のバンド力 還元条件 下では約 50Kdと約 25Kdの 2本のバンドが認められた。これらの分子量は、 IgGクラ スの抗体は、非還元条件下では分子量は約 150Kdであり、還元条件下では分子内 の S— S結合が切断され、約 50Kdの分子量を持つ H鎖と約 25Kdの分子量を持つ L 鎖に分角军されるとレヽぅ幸艮告 [Antibodies_A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)、 Monoclonal Antibodies— Principles and Practice, Academic Press Limited (1996) ]と一致し、抗 PERPキメラ抗体 KM3481が正しレ、構造の抗体分子として発現されてレ、ること力 S確 p' c! "れ /こ。
実施例 8
[0251] 抗 PERPキメラ抗体の活性評価
(1) 膜表面上の PERPへの結合性 (蛍光抗体法）
( 1 ) _ 1 PERPZCHO細胞への結合性
実施例 7の（3)で精製した抗 PERPキメラ抗体 KM3481の PERP/CHO細胞との 結合反応性を、蛍光抗体法により以下のように検討した。
[0252] 1ゥエル当たり 2 X 105個の PERP/CHO細胞を 96ゥエル U字プレートに分注し、 抗 PERPキメラ抗体 KM3481を FCM用緩衝液（1 %BSA—PBS、 0. 02%EDTA
、 0. 05%NaN )にて 20 /i g/mLから 5倍希釈で 7段階に希釈した抗 PERPキメラ
3
抗体 KM3481を 50 /i L/ゥエル、さらに非特異的な染色を防ぐためにヒトイムノグロ ブリン（SIGMA社製）を 400 μ g/mLにそれぞれ希釈した抗体溶液を 50 β L/ゥヱ ルでそれぞれ分注し、氷中で 30分間反応した。 FCM用緩衝液で 2回洗浄後、 ΡΕ標 識抗ヒト IgG (H + L)抗体（ベックマン'コールター社製）を FCM用緩衝液にて 50倍 に希釈した溶液を 50 x L/ゥエルでカ卩えた。遮光し氷中で 30分間反応後、 FCM用 緩衝液で 3回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。
結果を第 14図に示した。縦軸には平均蛍光強度 (MFI)、横軸には、抗体濃度を 示した。抗 PERPキメラ抗体 KM3481は PERPZCHO細胞に結合することが示され 、その結合性の強さは抗体の濃度依存的であった。
[0253] (1) - 2 ヒト癌細胞株に対する結合性
実施例 5の（2) _ 1で検討したヒト癌細胞株の中から、 PC9、 NCI_H69、 Capan _ 2、 BxPC_ 3細胞を選択し、本実施例（1) _ 1に記載の方法を用いて抗 PERPキ メラ抗体 KM3481 (10 μ g/mL)の結合性を測定した。陰性対照としては抗 CCR4 キメラ抗体 (WO01/64754)を用いた。
結果を第 15図に示した。上記いずれの細胞株に対しても、抗 PERPキメラ抗体 KM 3481は結合性を示した。
[0254] (2) 抗 PERPキメラ抗体の補体依存性細胞傷害活性 (CDC活性） 実施例 7で作製した抗 PERPキメラ抗体 KM3481の CDC活性を以下に記載の方 法で測定した。
(2)— 1 標的細胞溶液の調製
PERP/CHO細胞を遠心分離操作および懸濁により 5%の FCSを含む IMDM培 地 [IMDM （5)培地]で洗浄した後、 IMDM- (5)培地によって、細胞濃度を 2 X 105細胞/ mLに調整し、標的細胞溶液とした。
[0255] (2) - 2 ヒト補体溶液の調製
ヒト血清凍結乾燥品（Human Complement Serum；シグマ社製）を脱イオン水 にて溶解し、等量の IMDM— (5)培地をカ卩えて 2倍に希釈してヒト補体溶液とした。
[0256] (2) - 3 CDC活性の測定
96ゥヱル平底プレート（住友ベークライト社製）に上記（2) _ 1で調製した標的細胞 溶液の 50 μ L (1 X 104細胞 Ζゥエル）を分注した。次レ、で IMDM_ (5)培地で希釈 した各濃度の抗体溶液を加え、更に上記（2) - 2で調製した補体溶液を 50 μ L添カロ して全量を 150 とし、 37°Cで 2時間反応させた。各ゥエルに細胞増殖試薬 WST 1 (ロシュ社製）を 15 i Lずつ添加して更に 37°Cで 4時間反応させ、 450nmの吸 光度（OD450 :生細胞数に依存する）を測定した。標的細胞溶液、抗体溶液の代わ りに IMDM—（5)培地を用いてバックグラウンドの吸光度データを取得し、抗体溶液 の代わりに IMDM—（5)培地を用いて測定した吸光度データ（抗体濃度 0 μ g/mL )を細胞傷害活性 0%として取得した。 CDC活性は次式により求めた。
[0257] (式）
CDC活性（％) = ( [抗体濃度 0 μ g/mLの際の吸光度データ] [検体の吸光度デ 一タ] ) /[抗体濃度 0 μ g/mLの際の吸光度データ] X 100
結果を第 16図に示した。抗 PERPキメラ抗体 KM3481は PERP/CHO細胞に対 して濃度依存的に CDC活性を示し、その活性は抗体濃度依存的であった。
[0258] (3) 抗 PERPキメラ抗体の ADCC活性
実施例 7で取得した抗 PERPキメラ抗体 KM3481の ADCC活性を、以下のように して測定した。標的細胞には、本実施例の（1)で用いた 4種類の PERP遺伝子により コードされるポリペプチドが発現していることが確認された細胞株、すなわち PC9、 N CI— H69、 Capan— 2、 BxPC— 3細胞株、並びに陽性対照として PERP/CHO細 胞および陰性対照として該ポリペプチドが発現していない CHO/DG44細胞株を用 レ、、エフェクター細胞溶液の調製には lymphoprep (NYCOMED社製）を用いた。
[0259] (3) - 1 標的細胞溶液の調製
PERP/CHO細胞の場合には IMDM—（10)培地、それ以外の癌細胞株では R PMI 1640 _ FCS ( 10)培地 [FCSを 10%含む RPMI 1640培地（Invitrogen社製） ]を用いて培養した各細胞株を遠心分離操作及び懸濁により ADCC活性測定用培 地である RPMI1640— FCS (5) [5%FCSを含む RPMI1640培地（Invitrogen社 製) ]で洗浄した後、 ADCC活性測定用培地によって、細胞濃度を 2 X 105細胞/ m Lに調整し、標的細胞溶液とした。
[0260] (3) - 2 エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、へパリンナトリウム (清水製薬社製) 0. 5mLを加え 穏やかに混ぜた。これを lymphoprep (NYCOMED 社製）を用いて添付の使用説 明書に従い、単核球（PBMC)画分を分離した。分離した PBMC画分は、 ADCC活 性測定用培地で 3回遠心分離して洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした
[0261] (3)— 3 ADCC活性の測定
96ゥヱル U字底プレート（Falcon社製）に上記（3)— 1で調製した標的細胞溶液の 50 /i L (l X 104細胞/ゥエル）を分注した。次いで（3)— 2で調製したエフェクター細 胞溶液を 50 μ L (PERP/CHO細胞をターゲットとした場合はエフェクター細胞と標 的細胞の比が 15： 1に、その他の場合は 20： 1になるように希釈したもの）を添加した 。更に、抗 PERPキメラ抗体を ADCC活性測定用培地で希釈し、各最終濃度 0. 001 〜10 z g/mLとなるように加えて全量を 150 x Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。反 応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活性を、 Cyto Tox96 Non— Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社製)を用レヽて、 添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然 遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりに ADCC活 性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的 細胞溶液および抗体溶液の代わりに ADCC活性測定用培地を用いて、上記と同様 の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液および エフェクター細胞溶液の代わりに ADCC活性測定用培地を用い、反応終了の 45分 前に の 9% Triton X— 100溶液を添カ卩して反応させ、上記と同様の操作を 行うことで取得した。 ADCC活性は次式により求めた。
[0262] (式）
ADCC活性（Q/o) = { (検体の吸光度一エフェクター細胞自然遊離の吸光度一標的 細胞自然遊離の吸光度） / (標的細胞全遊離の吸光度一標的細胞自然遊離の吸光 度 } χ ιοο
結果を第 17図に示した。標的細胞として用いた全細胞株のうち、 PERP遺伝子に よりコードされるポリペプチドが発現していることが確認されている PERP/CHO、 P C9、 NCI_H69、 Capan_ 2および BxPC_ 3細胞株に対して、抗 PERPキメラ抗体 KM3481は ADCC活性を有していた。一方、陰性対照として用いた CHO/DG44 細胞株に対して、抗 PERPキメラ抗体 KM3481は ADCC活性を有していなかった。 実施例 9
[0263] 抗 PERPキメラ抗体の m vivo薬効試験
肺癌および陴癌について、マウスゼノグラフト初期癌モデルの系で抗 PERPキメラ 抗体の m 薬効試験を以下のようにして検討した。
[0264] 癌細胞移植前日に SCIDマウス（日本クレア、雄、 6週齢）の体重を測定し、抗体非 投与群、抗体投与群 0. 1、 1、 lOmgZkgの計 4群（1群 6匹）に群分けした。常法に より培養した PERP陽性の肺癌細胞株 PC _ 9または PERP陽性の瞎癌細胞株 BxP C— 3を 5 X 107個/ mLで RPMI1640培地（Invitrogen社製）に懸濁し、マウスの 右脇腹皮内にそれぞれ 100 μ L移植した。マウス 1尾あたりの細胞数は 5 X 106個と なる。移植同日から、クェン酸緩衝液（10mmol/Lクェン酸、 150mmol/L塩化ナ トリウム、 pH6)で希釈した抗 PERPキメラ抗体 KM3481を 100 レ 1週間に 2回の 頻度で計 8回静脈内投与した。抗体非投与群はクェン酸緩衝液のみを投与した。
[0265] 腫瘍を移植した日を 0日目とし、経日的にノギスによる腫瘍径の測定を行レ、、次式 により腫瘍体積を算出した。 (式）
腫瘍体積 =短径 X短径 X長径 X O. 5
肺癌および膝癌モデルにおける各群の腫瘍体積平均値の経日的推移をそれぞれ 第 18図および第 19図に示す。
第 18図に示した肺癌モデルにおいては、 22日目以降に非投与群マウスの腫瘍死 が始まったため、腫瘍体積の評価は 22日目で終了した。
[0266] 肺癌モデルにおいて、抗 PERPキメラ抗体 KM3481の 1、 lOmgZkg投与群で、 非投与群と比較して顕著な腫瘍生着阻害および腫瘍増殖抑制効果が認められた。 第 19図に示した膝癌モデルにおいては、 1、 lOmgZkg投与群で顕著な腫瘍生着 阻害および腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらに 0. lmg/kg投与群でも有意な阻 害効果が認められた。
以上より、肺癌および膝癌をターゲットとした初期癌モデルにおいて、抗 PERPキメ ラ抗体 KM3481が抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。
実施例 10
[0267] 抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の作製
(1) 抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列の設計
まず、 PERPに対するヒト型 CDR移植抗体（以下、抗 PERPCDR移植抗体と表記 する）の VHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
[0268] 実施例 7の（1) _ 3で同定した抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの CDRのァミノ 酸配列を移植するためのヒト抗体の VHの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは 、既知の様々なヒト抗体の VHをそのアミノ酸配列の相同性から 3種類のサブグルー プ（HSG Ι〜ΠΙ)に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告して レヽる [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept . Health and Human Services (1991) ]。それら共通配列は、ヒトにおいてよ り免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗 PERP CDR移植抗体の VHのアミノ酸配列を設計することとした。より結合活性の高レ、抗 PE RPCDR移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体の VHの 3種類のサ ブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列のうち、 KM3411の VHの FRのアミノ酸 配列と最も高い相同性を有する FRのアミノ酸配列を選択した。第 4表には、相同性 の検索結果を示した。第 4表に示したように、 KM3411の VH領域の FRのアミノ酸配 列はサブグループ IIと最も高レ、相同性を有してレ、た。
[0269] 第 4 表
ヒト抗体の VHの各サブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列と KM3411の VH の FRのアミノ酸配列との間の相同性
HSGI HSGII HSGIII
54. 0% 74. 7% 60. 9% 以上の結果から、ヒト抗体の VHのサブグループ IIの共通配列の FRのアミノ酸配列 の適切な位置に抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの CDRのアミノ酸配列を移植 した。し力し、配列番号 12に記載の KM3411の VHのアミノ酸配列中の 47番目の II e、 86番目の Ile、 100番目の Gln、 107番目の Glu、および 111番目の Thrは、カバ ットらがあげるヒト抗体 FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される 頻度が高レ、アミノ酸残基ではなレ、が、比較的高レ、頻度で使用されるアミノ酸残基であ るため、上記の KM3411のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした 。このようにして、配列番号 25で表される、抗 PERPCDR移植抗体の VHのアミノ酸 配列 HV0を設計した。
[0270] 次に、抗 PERPCDR移植抗体の VLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
実施例 7の（1)— 3で同定した抗 PERPマウス抗体 KM3411の VLの CDRのァミノ 酸配列を移植するためのヒト抗体の VLの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは 、既知の様々なヒト抗体の VLをそのアミノ酸配列の相同性から 4種類のサブグルー プ (HSG I〜IV)に分類し、更に、それらのサブグノレープ毎に共通配列を報告して レヽる [sequences oi Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]。そこで VHの場合と同様にして、ヒト抗 体の VLの 4種類のサブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列のうち、 KM3411 の VLの FRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有する FRのアミノ酸配列を選択した。 第 5表には、相同性の検索結果を示した。第 5表に示したように、 KM3411の VLの F Rのアミノ酸配列はサブグノレープ Iと最も高い相同性を有していた。
第 5 表
ヒト抗体の VLの各サブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列と KM3411の VL の FRのアミノ酸配列との間の相同性
HSGI HSGII HSGIII HSGIV
67. 5% 62. 5% 66. 2% 65. 0% 以上の結果から、ヒト抗体の VLのサブグループ Iの共通配列の FRのアミノ酸配列 の適切な位置に抗 PERPマウス抗体 KM3411の VLの CDRのアミノ酸配列を移植し 、配列番号 26に記載の抗 PERPCDR移植抗体の VLのアミノ酸配歹 IJLV0を設計し
[0272] 上記で設計した抗 PERPCDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 HV0および VLのァ ミノ酸配歹 1JLV0は、選択したヒト抗体の FRのアミノ酸配列に抗 PERPマウス抗体 KM 3411の CDRのアミノ酸配列のみを移植した配列である力 一般に、ヒト型 CDR移植 抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体の FRへのマウス抗体の CDRのアミノ酸配 列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多レ、。結合活性の低下を回避す るため、ヒト抗体とマウス抗体で異なっている FRのアミノ酸残基のうち、結合活性に影 響を与えると考えられるアミノ酸残基を、 CDRのアミノ酸配列の移植とともに、改変す ること力 S行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考 えられる FRのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
[0273] まず、上記で設計した抗 PERPCDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 HV0および V Lのアミノ酸酉己列 LV0よりなる抗体 V領域（HV0LV0)の三次元構造をコンピュータ 一モデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェア AbM (Oxford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェア Pro -Explore (Oxford Molecular社製）あるいは ViewerLite (Accelrys社製）を用 いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗 PERPマウスモノクローナ ル抗体 KM3411の V領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築 した。更に、 HV0LV0の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列において、抗 PERPマウ ス抗体 KM3411と異なっているアミノ酸残基について順次、抗 PERPマウス抗体 K M3411の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる三 次元構造モデルを同様にして構築し、抗 PERPマウス抗体 KM3411、 HV0LV0お よび改変体の V領域の三次元構造を比較した。
[0274] その結果、 HV0LV0の FRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変 化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、 HV0では 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の： Lys、 45番目の Gly、 72番 目の Val、および 97番目の Alaを、 LV0では 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の Leu、 70番目の Phe、および 77番目の Leuをそれぞ れ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも 1つ以上のアミノ酸配列 をマウス抗体 KM3411の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を 有するヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLを設計した。
[0275] (2) 抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の VHをコードする cDNAの構築
本実施例（1)で設計した抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の VHのアミノ酸配列 HV0 をコードする cDNAを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 12の 1〜： 18番目に示される抗 PERPマウ ス抗体 KM3411の H鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とし た。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複 数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻 度 [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定 した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、更に 5 '末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマ 一の結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素 認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を 5 '末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有 するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌタレ ォチドを合成した。
[0276] 各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 /i mol/Lとなるように 50 /i Lの反応液に加 えて、 0. 5 x molZL M13 primer RV (Takara Shuzo社製）、 0. 5 μ mol/L Ml 3 primer M4 (Takara Shuzo社製）および 1単位の KOD polymerase ( 東洋紡績社製）を用いて、 KOD polymeraseに添付の使用説明書に従レ、、 PCRを 行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（94°C 30秒間、 50°C 3 0秒間、 74°C 60秒間のサイクルを 30サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈 殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミド pBluescr ipt II SK (_) (Stratagene社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラ スミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換し、形質転換株の株よりプラス ミド DNA¾r調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Re action Kit (Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析した結果、 目 的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
[0277] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリ ゴヌクレオチドを作製し、上記の PCRを行うか、上記で作製した HV0をコードする cD NAを含むプラスミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして P CRを行レ、、増幅断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コ ドンについては、抗 PERPマウス抗体 KM3411に見られる遺伝子コドンとなるように 行った。
[0278] (3)抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の VLをコードする cDNAの構築
本実施例（1)で設計した抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の VLのアミノ酸配列 LV0を コードする cDNAを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 14の 1〜22番目に示される抗 PERPマウ ス抗体 KM3411の L鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とし た。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複 数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻 度 [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定 した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、更に 5 '末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマ 一の結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素 認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を 5 '末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有 するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌタレ ォチドを合成した。
[0279] 各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. l z mol/Lとなるように 50 z Lの反応液に加 えて、 0. 5 x molZL M13 primer RV (Takara Shuzo社製）、 0. 5 μ mol/L Ml 3 primer M4 (Takara Shuzo社製）および 1単位の KOD polymerase ( 東洋紡績社製）を用いて、 KOD polymeraseに添付の使用説明書に従レ、、上記（3 )と同様に PCRを行った。反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な 制限酵素処理を行った後に、プラスミド pBluescript II SK (—）（Stratagene社製 )に連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH 5 α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminat or し ycle sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems 社製）を用いて塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列を有するプラスミドを得た
[0280] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリ ゴヌクレオチドを作製し、上記の PCRを行うか、上記で作製した LV0をコードする cD NAを含むプラスミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして P CRを行レ、、増幅断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コ ドンについては、抗 PERPマウス抗体 KM3411で見られる遺伝子コドンとなるように 行った。
[0281] (4)抗 PERPヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
WO97Z10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター pKANTEX93の適当な位置 に本実施例（2)および（3)で得られた HV0および LV0をコードするそれぞれの cDN A、あるいはそれらの改変体をコードする cDNAを挿入し、各種抗 PERPヒト型 CDR 移植抗体発現ベクターを構築した。
[0282] (5)抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の 取得
抗 PERPヒト型 CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清から の抗体の精製は、上記実施例 7 (2) _ 2および（3)に記載の方法と同様にして行った
産業上の利用可能性
[0283] 本発明によれば、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立 体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片が提 供される。該抗体または該抗体断片は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチド の免疫学的検出方法および検出用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学 的検出または測定方法および検出または測定用試薬、並びに PERP遺伝子によりコ ードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬または治療薬に利用できる。
[0284] 配列表フリーテキスト
配列番号 3-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 5-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 7-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 8-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 9-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 10-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 21-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 22-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 23-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 24-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 25-人工配列の説明：合成ペプチド 配列番号 26-人工配列の説明：合成ペプチド

Claims

請求の範囲
[I] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に 認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片。
[2] ポリペプチドの細胞外領域力 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 35〜75番目お よび 130〜154番目に表されるアミノ酸配列で示される領域である、請求項 1に記載 の抗体または抗体断片。
[3] 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 1または 2に記載の抗体または抗体断片
[4] モノクローナル抗体力 S、ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)力ら生産さ れるモノクローナル抗体である、請求項 3に記載の抗体または抗体断片。
[5] モノクローナル抗体力 S、ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)から生産さ れるモノクローナル抗体から生産されるモノクローナル抗体が結合するェピトープと 結合するモノクローナル抗体である、請求項 3に記載の抗体または抗体断片。
[6] 請求項 3〜5のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
[7] ハイブリドーマが、ハイプリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)である、請求項 6 に記載のハイプリドーマ。
[8] モノクローナル抗体力 遺伝子組換え抗体である、請求項 3に記載の抗体または抗 体断片。
[9] 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体で ある、請求項 8に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[10] ヒトイ匕抗体がヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（Complimentarity Det ermining Region ;以下、 CDRと表記する）移植抗体から選ばれるヒトイ匕抗体であ る、請求項 9に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[II] 請求項 3〜5のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の重鎖（以下、 H鎖と表記 する）可変領域 (以下、 V領域と表記する）および軽鎖 (以下、 L鎖と表記する) V領域 を含む、請求項 10に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[12] 請求項 3〜5のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体の H鎖 V領域（以下、 VHと 表記する）および L鎖 V領域 (以下、 VLと表記する）を含み、かつ、ヒト抗体の H鎖定 常領域 (以下、 C領域と表記する）および L鎖 C領域を含む、請求項 11に記載のヒト 型キメラ抗体または抗体断片。
[13] 抗体の VHが配列番号 12で示されるアミノ酸配列の 19〜 130番目のアミノ酸配列を 含む、請求項 11または 12に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[14] 抗体の VLが配列番号 14で示されるアミノ酸配列の 23〜128番目のアミノ酸配列を 含む、請求項 11または 12に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[15] 抗体の VHが配列番号 12で示されるアミノ酸配列の 19〜 130番目のアミノ酸配列を 含み、かつ、抗体 VLが配列番号 14で示されるアミノ酸配列の 23〜128番目のァミノ 酸配列を含む、請求項 11〜： 14のいずれ力 4項に記載のヒト型キメラ抗体または抗体 断片。
[16] 請求項 3〜5のいずれ力 4項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDRを 含む、請求項 10に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[17] 請求項 3〜5のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDRと ヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク（以下、 FRと表記する）を含む、請求項 16 に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[18] 請求項 3〜5のいずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体の VHおよび VLの CDRと ヒト抗体の VHおよび VLの FRを含み、かつ、ヒト抗体の H鎖 C領域および L鎖 C領域 を含む、請求項 16または 17に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[19] 抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 15、 16および 17 で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 16〜： 18のいずれか 1項に記載のヒト型 CDR 移植抗体または抗体断片。
[20] 抗体の VLの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 18、 19および 20 で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 16〜： 18のいずれか 1項に記載のヒト型 CDR 移植抗体または抗体断片。
[21] 抗体 VHの CDR1、 CDR2および CDR3力 それぞれ配列番号 15、 16および 17を 含み、かつ、抗体 VLの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 18、 19 および 20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 16〜20のいずれか 1項に記載のヒ ト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[22] 抗体の VH力 配列番号 25で示されるアミノ酸配歹 lj、または配列番号 25で示される アミノ酸酉己歹 IJのうち、 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 45番目の Gly、 72番目の Val、および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのァ ミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項 16〜21の いずれ力 4項に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[23] 抗体の VLが、配列番号 26で示されるアミノ酸配歹 1J、または配列番号 26で示されるァ ミノ酸酉己歹' Jのうち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番 目の Leu、 70番目の Phe、および 77番目の Leuから選ばれる少なくとも 1つのアミノ 酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項 16〜21のいず れカ、 1項に記載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[24] 抗体の VH力 S、配列番号 25で示されるアミノ酸配歹 IJ、または配列番号 25で示される アミノ酸酉己歹 IJのうち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46 番目の Leu、 70番目の Phe、および 77番目の Leuから選ばれる少なくとも 1つのアミ ノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の VL力 配列番号 26で示されるアミノ酸配歹 lj、または配列番号 26で示されるアミノ酸配列のう ち、 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の： Leu、 70 番目の Phe、および 77番目の Leu力 選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他の アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項 16〜23のいずれか 1項に記 載のヒト型 CDR移植抗体または抗体断片。
[25] 抗体断片が、 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 、一本鎖抗体（scFv)、二量体化 V領域（Diabod
2
y)、ジスルフイド安定化 V領域（dsFv)および CDRを含むペプチドから選ばれる抗体 断片である請求項:!〜 24のいずれか 1項に記載の抗体断片。
[26] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 4項に記載の抗体または抗体断片をコードす る DNA。
[27] 請求項 26に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
[28] 請求項 27に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
[29] 請求項 6または 7に記載のハイプリドーマまたは請求項 28に記載の形質転換株を培 地に培養し、培養物中に請求項 1〜5または 8〜25のいずれか 1項に記載の抗体ま たは抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特 徴とする請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 1項に記載の抗体または抗体断片の 製造方法。
[30] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 4項に記載の抗体または抗体断片を用いる PE
RP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出または測定方法。
[31] 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である、請求項 30に記載の検出方法。
[32] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 4項に記載の抗体または抗体断片を用いる PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検出または測 定方法。
[33] 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である請求項 32に記載の検出方 法。
[34] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、 P ERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定用試薬。
[35] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、 P ERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬。
[36] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項 35 に記載の診断薬。
[37] 請求項:!〜 5または 8〜25のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を有効成分 として含有する PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療 薬。
[38] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項 37 に記載の治療薬。
[39] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 4項に記載の抗体または抗体断片を用いて PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞を検出または測定すること を含む、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
[40] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いて PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定することを含む、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
[41] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項 39 または 40に記載の診断方法。
[42] 請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 4項に記載の抗体または抗体断片を患者に投 与することを含む、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治 療方法。
[43] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項 42 に記載の治療方法。
[44] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬を製造するた めの、請求項 1〜5または 8〜25のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片の使 用。
[45] 癌の診断薬を製造するための、請求項 1〜5または 8〜25のいずれか 1項に記載の 抗体または抗体断片の使用。
[46] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬を製造するた めの、請求項 1〜5または 8〜25のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片の使 用。
[47] 癌の治療薬を製造するための、請求項 1〜5または 8〜25のいずれ力 1項に記載の 抗体または抗体断片の使用。
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