JPWO2005121338A1 - 抗perp抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
膵臓癌では、一般的な臨床検査項目は正常値を示す上、病期の初期では特徴的な臨床所見もないことから、早期の膵臓癌患者を見出すことは困難である。膵臓癌において胆管閉塞や肝転移が起きている患者は、アルカリフォスファターゼ値とビリルビン値が上昇することがある。膵菅癌では、腫瘍による閉塞膵菅の末梢側に膵臓炎が生じることから、アミラーゼ、エラスターゼ、RNaseなどの膵外分泌酵素および該酵素の阻害物質が血中に逸脱して増加するため、これらの酵素および該酵素の阻害物質が腫瘍マーカーとして用いられており、例えば、PSTI(pancreatic secretory trypsin inhibitor)が知られている。PSTIは、膵液中に分泌されるトリプシンの阻害物質であり、血中PSTIは各種悪性腫瘍患者で高率に上昇しており、特に膵癌患者において高い頻度で認められる(非特許文献2)。
PERP(あるいはTHWまたはPIGPC1とも称される)の遺伝子配列は公知である(特許文献1〜13)。
ヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている(非特許文献16、17)。すなわち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体よりもヒト化抗体または該抗体断片の方が望ましいことを示している。
(1) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片。
(2) ポリペプチドの細胞外領域が、配列番号2で表されるアミノ酸配列の35〜75番目および130〜154番目に表されるアミノ酸配列で示される領域である、(1)に記載の抗体または抗体断片。
(3) 抗体が、モノクローナル抗体である、(1)または(2)に記載の抗体または抗体断片。
(4) モノクローナル抗体が、ハイブリドーマKM3411(FERM BP−8643)から生産されるモノクローナル抗体である、(3)に記載の抗体または抗体断片。
(6)(3)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
(7) ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM3411(FERM BP−8643)である、(6)に記載のハイブリドーマ。
(8) モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、(3)に記載の抗体または抗体断片。
(9) 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(8)に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(11) 請求の範囲3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の重鎖(以下、H鎖と表記する)可変領域(以下、V領域と表記する)および軽鎖(以下、L鎖と表記する)V領域を含む、(10)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(12) 請求の範囲3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のH鎖V領域(以下、VHと表記する)およびL鎖V領域(以下、VLと表記する)を含み、かつ、ヒト抗体のH鎖定常領域(以下、C領域と表記する)およびL鎖C領域を含む、(11)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(14) 抗体のVLが配列番号14で示されるアミノ酸配列の23〜128番目のアミノ酸配列を含む、(11)または(12)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(15) 抗体のVHが配列番号12で示されるアミノ酸配列の19〜130番目のアミノ酸配列を含み、かつ、抗体VLが配列番号14で示されるアミノ酸配列の23〜128番目のアミノ酸配列を含む、(11)〜(14)のいずれか1項に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(17)(3)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRとヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク(以下、FRと表記する)を含む、(16)に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
(18)(3)〜(5)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRとヒト抗体のVHおよびVLのFRを含み、かつ、ヒト抗体のH鎖C領域およびL鎖C領域を含む、(16)または(17)のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
(20) 抗体のVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号18、19および20で示されるアミノ酸配列を含む、(16)〜(18)のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
(21) 抗体VHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17を含み、かつ抗体VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号18、19および20で示されるアミノ酸配列を含む、(16)〜(20)のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
(23) 抗体のVLが、配列番号26で示されるアミノ酸配列、または配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、3番目のGln、5番目のThr、35番目のTyr、42番目のAla、46番目のLeu、70番目のPhe、および77番目のLeuから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、(16)〜(21)のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
(25) 抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である(1)〜(24)のいずれか1項に記載の抗体断片。
(27)(26)に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
(28)(27)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
(29)(6)または(7)に記載のハイブリドーマまたは(28)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の製造方法。
(31) 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である(30)に記載の方法。
(32)(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
(33) 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である(32)に記載の方法。
(34)(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定用試薬。
(36)PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、(35)に記載の診断薬。
(37)(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬。
(38) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、(37)に記載の治療薬。
(40)(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いてPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定することを含む、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
(41) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、(39)または(40)に記載の診断方法。
(43) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、(42)に記載の治療方法。
(44) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬を製造するための、(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
(46) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬を製造するための、(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
(47) 癌の治療薬を製造するための、(1)〜(5)または(8)〜(25)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、2004年6月7日に出願された日本国特許出願2004−168116号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
PERP遺伝子としては、配列番号1で示される塩基配列があげられる。
上記の塩基配列において1以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含む遺伝子、配列番号1で示される塩基配列と少なくとも60%以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは80%以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子、ならびに配列番号1で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含む遺伝子なども本発明のPERP遺伝子に包含される。
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドとしては、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号2で示されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号2で示されるアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらに好ましくは90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片は、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造を認識し、かつ該ポリペプチドの細胞外領域に結合できる。
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該ポリペプチドが発現している細胞があげられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域(以下、VHと表記する)および軽鎖可変領域(以下、VLと表記する)とヒト抗体の重鎖定常領域(以下、CHと表記する)および軽鎖定常領域(以下、CLと表記する)とからなる抗体をいう。
本発明のヒト型CDR移植抗体は、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
Fabは、IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち(H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される)、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のF(ab’)2は、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
本発明のFab’は、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するF(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab’断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のscFvは、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のdiabodyは、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明の抗体は、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
放射性同位元素としては、131I、125Iなどがあげられ、例えば、クロラミンT法などにより抗体に結合させることができる。
以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。
(1)抗原の調製
本発明において用いられるポリペプチドは、[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,1987−1997)]などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ポリペプチドをコードするDNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への組込が可能で、ポリペプチドをコードするDNAを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもRoche Diagnostics社製)、pKK233−2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX−1(Promega社製)、pQE−8(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58−110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(−)(Stratagene社製)、pTrs30[大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP−5407)より調製]、pTrs32[大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP−5408)より調製]、pGHA2[大腸菌IGHA2(FERM BP−400)より調製、特開昭60−221091]、pGKA2[大腸菌 IGKA2(FERM BP−6798)より調製、特開昭60−221091]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia社製)、pETシステム(Novagen社製)、pME18SFL3などをあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107[特開平3−22979;Cytotechnology,3,133,(1990)]、pAS3−3(特開平2−227075)、pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology,3,133(1990)]、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]などをあげることができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドなどを、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞から、適切な方法を選択することができる。また、任意の蛋白質と蛋白質工学的に融合させて融合ポリペプチドとして発現させて生産させてもよい。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化学社製)などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
上記の方法により得られるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分配列を有するペプチドを抗原として用いることができる。
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund’s Adjuvant)や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA(ウシ血清アルブミン)やKLH(Keyhole Limpet hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後3〜7日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓をMEM培地(日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1200rpm、5分間)した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供する。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/cマウス由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3−NS1/1−Ag41(NS−1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0−Ag14(SP−2)[Nature,276,269(1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、P3−X63−Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地[RPMI−1640培地にグルタミン(1.5mmol/L)、2−メルカプトエタノール(5×10−5mol/L)、ジェンタマイシン(10μg/ml)および牛胎児血清(FCS)を加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸−カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離(1200rpm、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000(PEG−1000)2g、MEM 2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液の0.2〜1mLを、1×108個の抗体産生細胞に加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地[正常培地にヒポキサンチン(10−4mol/L)、チミジン(1.5×10−5mol/L)およびアミノプテリン(4×10−7mol/L)を加えた培地〕100mL中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する〕した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られた抗PERPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3000rpm、5分間)して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および280nmでの吸光度より算出する。
本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択する方法としては、以下の方法があげられる。
前述の方法で選択される、本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの具体例としては、モノクローナル抗体KM3411を生産するハイブリドーマ細胞株KM3411(FERM BP−8643)などがあげられる。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体などのヒト化抗体の作製方法を示す。
(1) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のVH及びVLをコードするcDNAは以下の様にして取得することができる。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分或いはV領域部分をコードするDNAをプローブとして用い、VHまたはVLをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVHまたはVLの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりVHまたはVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
ハイブリドーマ細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)]等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)等があげられる。
本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLをコードするそれぞれのcDNAを、ヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLの3’末端側の塩基配列とヒト抗体のCHまたはCLの5’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体VHまたはVLをコードするcDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAを用いてPCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
ヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHまたはVLのフレームワーク領域(以下、FRと表記する)のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHまたはVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性(少なくとも60%以上)をそれぞれ有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のVHまたはVLのCDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮してDNA配列に変換し、ヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれ設計する。設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率及び合成可能なDNAの長さから、H鎖、L鎖とも6本の合成DNAを設計することが好ましい。
ヒト型CDR移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のVH及びVLでは、CDRのみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がCDRの移植に伴い、ヒト抗体のVH及びVLのFRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やCDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。ヒト型CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにX線結晶解析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或いはコンピューターモデリング[Protein Engineering,7,1501(1994)]等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、本項2の(4)及び(5)でヒト型CDR移植抗体のVHまたはVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングすることができる。
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項2の(3)及び(6)に記載のヒト化抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、COS−7細胞(ATCC CRL1651)が一般に用いられる[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。COS−7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE−デキストラン法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等があげられる。
本項2の(3)及び(6)に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法[特開平2−257891、Cytotechnology,3,133(1990)]等があげられる。
精製した本発明の抗体または抗体断片の抗原との結合活性、PERP発現細胞株に対する結合活性はELISA法および蛍光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]またはBIAcoreTMなどを用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、CDC活性、ADCC活性等を測定し、評価することができる[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。
特定の細胞において、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現が認められているため、本発明の抗体または抗体断片を用いてPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することにより、該ポリペプチドが関連する疾患を診断することができる。
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関連する疾患としては、該疾患により発現が変動する疾患があげられ、具体的には、癌があげられる。
複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定を行い、健常者の生体試料中の該ポリペプチドの存在量を調べておく。被験者の生体試料中についても同様に該ポリペプチドの存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者の該ポリペプチドの存在量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると診断できる。
免疫学的検出または測定法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法(RIA)、酵素免疫測定法(EIAまたはELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(luminescent immunoassay)、ウエスタンブロット法および物理化学的手法(TIA,LAPIA,PCIA)などがあげられる。抗原の検出または測定を行う方法であればいかなる方法でもよいが好ましくは免疫沈降法または蛍光細胞染色法があげられる。
酵素免疫測定法(EIAまたはELISA)としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげられ、例えばサンドイッチELISA法などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知(石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院)の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ビオチン標識などを用いることができる。
ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動[Antibodies−A Laboratory Manual(Cold Spring Harbar Laboratory,1988)]で分画した後、該ゲルをPVDF膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスIgG抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。ウエスタンブロット法の一例を以下に示す。
該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、および免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、FMAT8100HTSシステム(アプライドバイオシステム社)を用いる蛍光抗体染色法なども用いることができる。
ELISA用96ウエルプレートに上述した本発明の抗体を固相化した後、BSA−PBSによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイブリドーマ株培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリンあるいはラットイムノグロブリンまたはプロテインAあるいはGなどをあらかじめELISA用96ウエルプレートに固相化しBSA−PBSでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。BSA−PBSを捨てPBSでよく洗浄した後、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をSDS−PAGE用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出を行う。
本発明のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片は、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
抗体の有するADCC活性やCDC活性は、例えば、特開平6−205694に記載の方法で測定することができる。このような活性を有する抗体は、in vivoにおいて、特定の抗原が発現した細胞を傷害することができるため、疾患の治療薬として用いることができる。ヒトIgGクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体などのヒト化抗体およびヒト抗体は治療剤として、有効に用いられ[Cancer Res.,56,1118(1996)]。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10μg/kg〜8mg/kgである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
(1)各種ゼノグラフトの作製と腫瘍塊の調製
ヒト膵臓癌細胞株[ASPC−1株(ATCC CRL−1469)、Capan−1株(ATCC HTB−79)、MiaPaca株(国立癌センターより分与)]および3種のヒト膵臓癌患者の腫瘍組織由来の細胞[PC01、PC02、PC03]を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
5%の非働化ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(インビトロジェン社製)中で継代培養した各細胞株を用いて、それぞれ8×107〜1×108個/mLの細胞密度になるように血清を含まないRPMI1640培地で細胞懸濁液を調製した。BALB/cAJcl−nuマウス(雄、8週齢、日本クレア)の腹側部皮下に1尾あたり該懸濁液を100μL移植した。移植した細胞株の生着が認められたマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が1cm程度に到達した個体を頚椎脱臼で屠殺した後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを4つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
10%非働化ウシ血清を含むMcCoy’s 5A培地(インビトロジェン社製)中で継代培養したHT−29細胞株、または10%非働化ウシ血清を含むMEM培地(インビトロジェン社製)中で継代培養したWiDr細胞株を用いて、それぞれ1×107個/mLの細胞密度になるように血清を含まないRPMI1640培地で細胞懸濁液を調製した。BALB/cAJcl−nuマウス(雄、8週齢、日本クレア)の腹側部皮下に該懸濁液を100μL移植した。移植した細胞株が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が1cm程度に到達した個体を頚椎脱臼で屠殺した後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを4つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
各細胞株を10%の非働化ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(インビトロジェン社製)で継代培養し、それぞれ1×108個/mLの細胞密度になるようにPBSで細胞懸濁液を調製した。Fox CHASE C.B−17/Icr−scidJclマウス(雄、5週齢、日本クレア社製)の腹側部皮下に該懸濁液を100μL移植した。このようにして作製されたゼノグラフトから摘出された腫瘍塊を同系のマウスの腹側部皮下に移植し、移植した腫瘍塊が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が1cm程度に到達した個体を麻酔下で脱血死せしめた後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを4つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
細胞株、患者組織ならびに上記(1)で作製したゼノグラフトより、以下に示した方法により細胞顕濁液を調製した後、全RNAを抽出し、ポリA(+)RNAを精製した。
5種類の膵臓癌由来細胞株[ASPC−1株(ATCC CRL−1469)、BxPC−3株(ATCC CRL−1687)、Capan−1株(ATCC HTB−79)、MiaPaca株(国立癌センターより分与)、PSN−1株]、8種類の大腸癌細胞株[Colo205株(ATCCCCL−222)、HT−29株(ATCC HTB−38)、LS174T株(ATCC CL−188)、LS180株(ATCC CL−187)、SW1116株(ATCC CCL−233)]、7種類の非小細胞肺癌細胞株{PC−1株、PC−7株、PC−9株、PC−12株[以上4株;British Journal of Cancer, 39, 15(1976)]、PC−14株(ECACC 90071810)、SK−LU1株(ATCC HTB−57)、SK−LC−4株}、4種類の小細胞肺癌細胞株[Lu−139株(RCB 469)、NCI−H69株(ATCC HTB−119)、RERF−LC−MA株(JCRB0812)、SBC−5株(JCRB0819)]、3種類の急性骨髄性白血病(AML)細胞株[KG−1株(ATCC CCL−246)、THP−1株(ATCC CRL−8031)、HL−60株(ATCC CCL−240)]、3種類の急性リンパ性白血病(ALL)細胞株[CCRF−CEM株(ATCC CCL−120)、Jurkat株(ATCC TIB−152)、HSB−2株(ATCC CCL−120.1)]、2種類の慢性骨髄性白血病(CML)細胞株[K562株(ATCC CCL−243)、KU812株(ATCC CRL−2099)]、8種類の多発性骨髄腫(MM)細胞株[KMS−11株[International Journal of Oncology,12,545(1998)]、KMS−18株[International Journal of Oncology,12,545(1998)]、ARH−77株(ATCC CRL−1621)、IM−9株(ATCC CCL−159)、RPMI8226株(ATCC CCL−155)、HS−Sultan株(ATCC CRL−1484)、U266B1株(ATCC TIB−196)、MC−CAR株(ATCC CRL−8083)]、2種類のバーキットリンパ腫細胞株[Daudi株(ATCC CCL−213)、Raji株(ATCC CCL−86)]、組織球性リンパ腫(ヒスチオサイティックリンフォーマ)細胞株[U937株(ATCC CRL−1593)]、甲状腺濾胞癌(FTC)細胞株[ML−1株(DSMZ ACC 464)]から以下のようにして、それぞれ細胞破砕液を調製してそれぞれRNAを抽出した。
浮遊性細胞株の場合には、細胞培養液を冷却遠心機(日立Himac CF15R、w/T11A21ローター)を用いて1500rpmで5分間遠心し、デカンテーションにより培地を除いた後、細胞をPBSに懸濁した。該細胞顕濁液を冷却遠心機(日立Himac CF15R、w/T11A21ローター)を用いて1500rpmで5分間遠心し、上清を取り除いて細胞を回収した。回収した細胞1×107個あたり1mLのTRIzoL Reagent(インビトロジェン社製)を添加して懸濁した後、18G注射針に10回通し、ゲノムDNAを寸断して細胞破砕液とした。
凍結した腫瘍塊を10mLのTRIzoL Reagent(インビトロジェン社製)に投入し、直ちにポリトロンPT2100(キネマティカ社製)を用いて30000rpmで15秒間、破砕し、細胞破砕液とした。
上述のようにして得た全RNAを、Micro Poly(A)Pure kit(Ambion社製)を用い、キット添付のプロトコールに従って、それぞれポリA(+)RNAを精製した。
上記(2)で得られたポリA(+)RNAまたは市販のmRNAより、SuperScript First−strand Synthesis System for RT−PCR(インビトロジェン社製)を用い、キット添付のマニュアルに従ってcDNAを合成した。
上記(3)で調製したcDNA 10μL(ポリA(+)RNA量として2ngに相当)、配列番号5で示される配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号6で示される配列からなるリバースプライマー(いずれもプロフリゴ社製)をそれぞれ終濃度が300nmol/Lになるように加え、さらに10×R−PCRbuffer Mg2+free(タカラバイオ社製)2μL、250mmol/L Mg2+溶液0.2μL、10mmol/L dNTPs0.6μL、ExTaqR−PCR(タカラバイオ社製)0.2μL、SYBR GreenI(BMA社製、製品原液を2500倍希釈したもの)1μLに、DEPC水を加えて全量を20μLとした溶液を、94℃で5分間加熱後、94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で30秒間からなる反応を45サイクルで反応させた。増幅産物にインターカレートしたSYBR GreenIが発する蛍光強度をPRISM7700(PEアプライドバイオシステムズ社製)を用いて測定し、同機器付属のソフトウエアSequence detector ver.1.7aによりデータ解析を行った。
LightCycler−FastStart DNA Master SYBR GreenIキット(ロシュダイアグノスティック社製)を使用し、LightCycler(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて、癌手術摘出標本におけるPERP遺伝子のmRNA量の定量を行った。
Cancer Profiling Array(CLONTECH社製、Cat.7841−1,Lot.2070686;各種癌組織と対照としてその近傍の正常組織から得られたcDNAがドットブロッティングされたナイロンメンブレン)を用いて各種癌組織と近傍の正常組織におけるPERP遺伝子の発現を、以下のようにして解析した。
(1)PERP発現細胞の造成
ヒトPERP遺伝子を含むプラスミドHEMBA1006335(GenBankアクセッション番号;AK074585、1ng/μL)を1μL、10×ExTaq緩衝液2μL、2mmol/L dNTPを2μL、10μmol/Lの配列番号7および配列番号8に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ2μL、ExTaq polymerase(宝酒造社製)0.5μL、滅菌水10.5μLからなる溶液を、94℃で5分間加熱後、94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で1分間からなる反応を25サイクル、72℃で7分間反応させた。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約0.6kbの増幅断片をGENECLEAN Spin Kit(BIO101社製)を用いて抽出した。該断片と、pCRII−TOPOベクターとをTOPO TA cloning Kit(Invitrogen社製)を用いて連結した後、コーエンらの方法[Proc.Nalt.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]により大腸菌DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、ヒトPERP遺伝子を含むプラスミドpCRII−PERPを取得した。
pcDNA3.1(−)/myc−HisC(Invitrogen社製]をPmeIで消化し、上記と同様にして約170bpのmyc−Hisタグをコードする遺伝子を含むDNA断片を取得した。該断片と、XbaIおよびKpnIで消化後、T4 DNA polymerase(宝酒造社製)で末端の平滑化を行ったpBluescriptII SK(−)(ストラタジーン社製)とをDNAライゲーションキットver.2(宝酒造社製)により、連結した後、大腸菌DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドpBSmHを取得した。pBSmHは、制限酵素XbaIで該プラスミドを消化し、約2.9kbpおよび約160bpの2本の断片を生じる。
pcPERPmHは、エレクトロポレーション法[Cytotechnology,3,133(1990)]により以下のようにしてCHO/DG44細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12(6),555(1986)]へ導入した。
上記で取得された形質転換細胞1〜5×105個を15μLの1×PAGE bufferに溶解して95℃で5分間処理し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動〔Antibodies−A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)〕にて分画後、PVDF膜にブロッティングした。BSA−PBSでブロッキング後、抗mycモノクローナル抗体9E10(MBL社製)を室温で1時間反応させた。Tween−PBSで洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体(ダコ社製)を室温で1時間反応させた。Tween−PBSでよく洗浄した後、検出はECL−detection kit(アマシャム社製)を用いて行い、X線フィルム上に感光させた。
第2図に結果を示した。分子量25kDa付近にシグナルが認められた株をPERP発現株(以下、PERP/CHO細胞と表記する)とした。
(2)−1 免疫原の調製
上記(1)で造成したPERP/CHO細胞を10%牛胎児血清入りIscove’s Modified Dulbecco’s培地(インビトロジェン社製)で2〜3日培養後、1匹あたりの細胞数が6×106個から1×107個の細胞数となるようにPBSに懸濁した。
上記(2)−1で調製した細胞を、百日咳ワクチン(千葉県血清研究所製)1×109細胞とともに6週令雌SDラット3匹に投与した。投与1週間後より、毎週1回、計5回投与した。該ラットの眼底より部分採血し、以下に示すサンドイッチELISAにより血中抗体価を測定し、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
96ウェルのEIA用プレート(グライナー社製)に、MYC 1−9E10.2細胞株(ATCC CRL−1729)が産生する抗c−Myc抗体をダルベッコPBSで10μg/mLに調製し、該溶液を50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。該プレートをPBSで洗浄後、BSA−PBSを100μL/ウェルで添加し、室温で1時間放置し、残存する活性基をブロックし、反応プレートとした。
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1:P3−U1[ATCC CRL−1597:European Journal of Immunology,6,511,(1976)]を正常培地(10%ウシ胎児血清添加RPMI培地)で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。
上記(2)−2で得られたラット脾細胞と(2)−4で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離(250×g、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000(PEG−1000)2g、MEM培地2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液0.2〜1mL/108マウス脾細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100mL中に懸濁した。
第3図には、(2)−3記載のサンドイッチELISA法を用いて、KM3314のPERP/CHO細胞およびCHO/DG44細胞に対する反応性を示した。KM3314はPERP/CHO細胞に特異的に反応した。
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(BALB/c)に(2)−5で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8mL/匹)した。
PERP/CHO細胞およびCHO/DG44細胞、大腸癌細胞株Colo205(ATCC CCL−222)および肺癌細胞株PC1(免疫生物研究所)にSDS−PAGE用サンプルバッファー{2%SDSおよび10%グリセロールを含む62mmol/Lトリス−塩酸緩衝液(PH6.8)}を細胞1×107個あたり100μL添加して、100℃加熱および超音波破砕にて、可溶化画分を調製した。各1×105個細胞相当量をSDS−PAGEを行い、泳動後のゲルをPVDF膜にブロッティングした。該膜をBSA−PBSでブロッキング後、ハイブリドーマKM3314培養上清および陰性対照抗体KM1762(抗アベルメクチン抗体)を5μg/mLで含むBSA−PBSを室温で2時間反応させた。
(3)−1 免疫原の調製
上記(1)で造成したPERP発現株を10%牛胎児血清入りIscove’s Modified Dulbecco’s培地(インビトロジェン社製)で2〜3日培養後、1匹あたりの細胞数が6×106個から1×107個の細胞数となるようにPBSに懸濁した。
(3)−2 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記(3)−1で調製した細胞を、百日咳ワクチン(千葉県血清研究所製)1×109細胞とともに6週令雌Balb/Cマウス3匹に投与した。投与1週間後より、毎週1回、計5回投与した。該マウスの眼底より部分採血し、その血中抗体価を以下に示す細胞を用いた蛍光抗体染色法を行い、FMAT8100HTSシステム(アプライドバイオシステム社製)およびフローサイトメーター(ベックマンコールター社製)で測定し、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
アッセイ用の細胞は(1)で造成したPERP/CHO細胞とCHO/DG44細胞を用いた。10%牛胎児血清入りIscove’s Modified Dulbecco’s培地[インビトロジェン社]で2〜3日培養し、Tripsin−EDTA溶液(インビトロジェン社製)で剥離した細胞を同一の培地に懸濁し、FMAT用黒色96ウエルプレートに7×103個/100μL培地/ウェルで播種し、1晩培養した。該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を5μL/ウェルで分注し、二次抗体としてALEXA647標識抗マウスイムノグロブリンG(H+L)(モレキュラープローブ社製)を50μL/ウェルで分注し、遮光下で4時間放置した。レーザー光633nmHe/Neで励起される650nm〜685nmの波長をFMAT8100HTSシステム(アプライドバイオシステム社製)で測定した。
アッセイ用の細胞は(1)で造成したPERP/CHO細胞とCHO/DG44細胞を用いた。10%牛胎児血清入りIscove’s Modified Dulbecco’s培地(インビトロジェン社製)で2〜3日培養し、0.02%EDTA溶液(ナカライテスク社製)で剥離した細胞をPBSで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにBSA−PBSを用いて、氷温中で20分ブロッキングした。1×106個/100μL/BSA−PBSとなるように96ウェルU字プレートに分注し、遠心分離(1800rpm、2分間)した後、上清を除いて一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を50μL/ウェル分注し、氷温中で30分間反応させた。PBSを用いて遠心分離法で3回洗浄し、二次抗体としてALEXA488標識抗マウスイムノグロブリンG(H+L)(モレキュラープローブ社製)を20μL/ウェル加えて氷温で遮光下、30分間反応させた。再びPBSを用いて洗浄し、PBSに懸濁してレーザー光488nmArで励起される510〜530nmの波長をフローサイトメーター(ベックマンコールター社製)で測定した。
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1:P3−U1[ATCC CRL−1597:European Journal of Immunology,6,511(1976)]を正常培地(10%ウシ胎児血清添加RPMI培地)で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。
(3)−2で得られたマウス脾細胞と(3)−5で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離(250×g、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1000(PEG−1000)2g、MEM培地2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液0.2〜1mL/108マウス脾細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離(900rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100mL中に懸濁した。
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(BALB/c)に(2)−5で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8mL/匹)した。
上記(3)−4に示した方法に従って行なった。結果を図6に示す。KM3411はPERP/CHO細胞および大腸癌細胞株Colo205に反応して、CHO/DG44細胞およびPERPmRNAが発現してないPC1には反応しなかった。
(1) KM3411を用いた免疫沈降反応によるPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出
96ウェルELISAプレートに抗マウスイムノグロブリン(ダコ社製)をプレートコートし、抗PERPマウス抗体KM3411を含む、ハイブリドーマ細胞の培養上清、または陰性対照抗体KM511(抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体)を含む、ハイブリドーマ細胞の培養上清を4℃で1晩にわたって反応させた。反応後、PBSで洗浄し、非特異吸着を避けるためBSA−PBSでブロッキングした。PERP発現細胞またはCHO/DG44細胞の各5×107細胞あたりに1mLの細胞溶解用緩衝液(1%TritonX、150mmol/L塩化ナトリウム、2mmol/L塩化マグネシウム、2mmoL/L塩化カルシウム、0.1%アザイド、50mmol/Lヨードアセトアミド、50mmol/L N−エチルマレイミド、1mg/mLロイペプチン、0.1mmol/L DTTを含む50mmol/Lトリス−塩酸緩衝液pH7.2)を添加し、4℃で2時間放置後、遠心分離して得られた上清を、BSA−PBSを捨てた該プレートに100μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置した。Tween−PBSで洗浄後、SDS−PAGE用サンプルバッファー{2%SDSおよび10%グリセロールを含む62mmol/Lトリス−塩酸緩衝液(PH6.8)}にて溶解したものをサンプルとして、上記(2)−7と同様にウェスタンブロッティングを行った。このとき、一次抗体として上記(2)−5で作製した抗PERPマウス抗体KM3314および陰性対照抗体KM1762(抗アベルメクチン抗体)を用いた。
(2)−1 各種細胞株
図8中に示した各種癌細胞株を0.02%EDTA溶液(ナカライテスク社製)で剥離し、PBSで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにヒト免疫グロブリン(ウェルファイド社製)を含む1%BSA−PBSを用いて、氷温中で20分間ブロッキングした。1×106個/100μL/BSA−PBSとなるように96ウェルU字プレートに分注し、遠心分離(1800rpm、2分間)した後、上清を除いて、抗PERPマウス抗体KM3411培養上清および陰性対照抗体KM511(抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体)培養上清を50μL/ウェル分注し、氷温中で30分間反応させた。PBSを用いて遠心分離法で3回洗浄し、二次抗体としてALEXA488標識抗マウスイムノグロブリンG(H+L)(モレキュラープローブ社製)を20μL/ウェル加えて氷温中、遮光下で30分間反応させた。再びPBSを用いて遠心分離法で3回洗浄し、PBSに懸濁してレーザー光 488nmArで励起される510〜530nmの波長をフローサイトメーター(ベックマンコールター社製)で測定した。
結果を図8に示した。KM3411は大腸癌5/5株、膵臓癌2/3株、肺癌4/5株、乳癌2/2株、子宮癌1/1株の各種癌細胞株と反応した。
ヒト末梢血よりモノ・ポリ分離用溶液(大日本製薬社製)を用いた遠心分離法で、単核球であるリンパ球および単球画分または顆粒球画分を分離した。10%牛胎児血清入りRPMI1640培地(インビトロジェン社製)で洗浄後、96ウェルU字プレートに1×106個/100μLになるように分注し、遠心分離(1800rpm、2分間)後、上清を除いて一次抗体としてビオチン標識抗PERPマウス抗体KM3411および、陰性対照抗体ビオチン標識KM511(抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体)を、ヒト免疫グロブリン(ウェルファイド社製)/BSA−PBSとともに氷温中で1時間反応させた。該プレートをPBSで3回洗浄し、二次抗体としてレッド670標識抗ストレプトアビジン(コールター社製)を50μL/ウェルを加え更に、FITC標識抗ヒトCD45抗体(ベックマンコールター社製)10μL/ウェル加えて氷温中、遮光下で1時間させた。該プレートをPBSで3回洗浄し、PBSに懸濁してレーザー光488nmArで励起される505〜545nmまたは660〜700nmの波長をフローサイトメーター(ベックマンコールター社製)で測定した。
抗PERPマウス抗体KM3411と抗PERPポリクローナル抗体(ProSci社2451、Novus Biologicals社 NB500−231)のPERP発現細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで比較した。
(1)抗PERPマウス抗体の可変領域をコードするcDNAの単離、解析
(1)−1 抗PERPマウス抗体産生ハイブリドーマ細胞からのmRNAの調製
実施例4に記載のハイブリドーマKM3411より、mRNAの調製キットであるFast Track 2.0 Kit(Invitrogen社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞4×107細胞より約39μgのmRNAを調製した。
上記(1)−1で取得した抗PERPマウス抗体KM3411のmRNAの1μgから、BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、5’側にキット添付のBD SMART IITM A Oligonucleotide配列を有するcDNAを取得した。そのcDNAを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーAmixと、配列番号9で示したマウスIg(γ)特異的プライマーを用いてPCR反応を行いVHのcDNA断片を増幅した。またIg(γ)特異的プライマーの代わりに配列番号10で示したマウスIg(κ)特異的プライマーを用いてPCRを行いVLのcDNA断片を増幅した。
プラスミドpKM3411H#9に含まれていたVHの全塩基配列を配列番号11に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型VHの全アミノ酸配列を配列番号12に、プラスミドpKM3411L#4に含まれていたVLの全塩基配列を配列番号13におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型VLの全アミノ酸配列を配列番号14にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]との比較、並びに精製した抗PERPマウス抗体KM3411のH鎖及びL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー(島津製作所社製:PPSQ−10)を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗PERPマウス抗体KM3411をコードする完全長cDNAであり、H鎖については配列番号12に記載のアミノ酸配列の1から18番目が、L鎖については配列番号14に記載のアミノ酸配列の1から22番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
(2)−1 抗PERPキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3411の構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と本実施例の(1)−2で得られたプラスミドpKM3411H#9及びpKM3411L#4を用いて抗PERPキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3411を以下のようにして構築した。
本実施例の(2)−1で得られた抗PERPキメラ抗体発現ベクターpKANTEX3411を用いて抗PERPキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法[Antibody Engineering,A Practical Guide,W.H.Freeman and Company(1992)]により行い、pKANTEX3411が導入された形質転換株KM3481を取得した。
本実施例(2)−2で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、3000rpm、4℃の条件で5分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は0.22μm孔径MillexGVフィルター(ミリポア社製)を用いて濾過滅菌した。得られた培養上清よりMab Select(アマシャム・バイオサイエンス社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗PERPキメラ抗体KM3481を精製した。
結果を第13図に示した。精製した抗PERPキメラ抗体KM3481は、非還元条件下では分子量が約150キロダルトン(以下、Kdと表記する)の1本のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、IgGクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS−S結合が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告[Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14(1988)、Monoclonal Antibodies−Principles and Practice,Academic Press Limited(1996)]と一致し、抗PERPキメラ抗体KM3481が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。
(1)膜表面上のPERPへの結合性(蛍光抗体法)
(1)−1 PERP/CHO細胞への結合性
実施例7の(3)で精製した抗PERPキメラ抗体KM3481のPERP/CHO細胞との結合反応性を、蛍光抗体法により以下のように検討した。
結果を第14図に示した。縦軸には平均蛍光強度(MFI)、横軸には、抗体濃度を示した。抗PERPキメラ抗体KM3481はPERP/CHO細胞に結合することが示され、その結合性の強さは抗体の濃度依存的であった。
実施例5の(2)−1で検討したヒト癌細胞株の中から、PC9、NCI−H69、Capan−2、BxPC−3細胞を選択し、本実施例(1)−1に記載の方法を用いて抗PERPキメラ抗体KM3481(10μg/mL)の結合性を測定した。陰性対照としては抗CCR4キメラ抗体(WO01/64754)を用いた。
結果を第15図に示した。上記いずれの細胞株に対しても、抗PERPキメラ抗体KM3481は結合性を示した。
実施例7で作製した抗PERPキメラ抗体KM3481のCDC活性を以下に記載の方法で測定した。
(2)−1 標的胞溶液の調製
PERP/CHO細胞を遠心分離操作および懸濁により5%のFCSを含むIMDM培地[IMDM−(5)培地]で洗浄した後、IMDM−(5)培地によって、細胞濃度を2×105細胞/mLに調整し、標的細胞溶液とした。
ヒト血清凍結乾燥品(Human Complement Serum;シグマ社製)を脱イオン水にて溶解し、等量のIMDM−(5)培地を加えて2倍に希釈してヒト補体溶液とした。
96ウェル平底プレート(住友ベークライト社製)に上記(2)−1で調製した標的細胞溶液の50μL(1×104細胞/ウェル)を分注した。次いでIMDM−(5)培地で希釈した各濃度の抗体溶液を加え、更に上記(2)−2で調製した補体溶液を50μL添加して全量を150μLとし、37℃で2時間反応させた。各ウェルに細胞増殖試薬WST−1(ロシュ社製)を15μLずつ添加して更に37℃で4時間反応させ、450nmの吸光度(OD450:生細胞数に依存する)を測定した。標的細胞溶液、抗体溶液の代わりにIMDM−(5)培地を用いてバックグラウンドの吸光度データを取得し、抗体溶液の代わりにIMDM−(5)培地を用いて測定した吸光度データ(抗体濃度0μg/mL)を細胞傷害活性0%として取得した。CDC活性は次式により求めた。
CDC活性(%)=([抗体濃度0μg/mLの際の吸光度データ]−[検体の吸光度データ])/[抗体濃度0μg/mLの際の吸光度データ]×100
結果を第16図に示した。抗PERPキメラ抗体KM3481はPERP/CHO細胞に対して濃度依存的にCDC活性を示し、その活性は抗体濃度依存的であった。
実施例7で取得した抗PERPキメラ抗体KM3481のADCC活性を、以下のようにして測定した。標的細胞には、本実施例の(1)で用いた4種類のPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現していることが確認された細胞株、すなわちPC9、NCI−H69、Capan−2、BxPC−3細胞株、並びに陽性対照としてPERP/CHO細胞および陰性対照として該ポリペプチドが発現していないCHO/DG44細胞株を用い、エフェクター細胞溶液の調製にはlymphoprep(NYCOMED社製)を用いた。
PERP/CHO細胞の場合にはIMDM−(10)培地、それ以外の癌細胞株ではRPMI1640−FCS(10)培地[FCSを10%含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)]を用いて培養した各細胞株を遠心分離操作及び懸濁によりADCC活性測定用培地であるRPMI1640−FCS(5)[5%FCSを含むRPMI1640培地(Invitrogen社製)]で洗浄した後、ADCC活性測定用培地によって、細胞濃度を2×105細胞/mLに調整し、標的細胞溶液とした。
健常人静脈血50mLを採取し、ヘパリンナトリウム(清水製薬社製)0.5mLを加え穏やかに混ぜた。これをlymphoprep(NYCOMED 社製)を用いて添付の使用説明書に従い、単核球(PBMC)画分を分離した。分離したPBMC画分は、ADCC活性測定用培地で3回遠心分離して洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
96ウェルU字底プレート(Falcon社製)に上記(3)−1で調製した標的細胞溶液の50μL(1×104細胞/ウェル)を分注した。次いで(3)−2で調製したエフェクター細胞溶液を50μL(PERP/CHO細胞をターゲットとした場合はエフェクター細胞と標的細胞の比が15:1に、その他の場合は20:1になるように希釈したもの)を添加した。更に、抗PERPキメラ抗体をADCC活性測定用培地で希釈し、各最終濃度0.001〜10μg/mLとなるように加えて全量を150μLとし、37℃で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、CytoTox96 Non−Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega社製)を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにADCC活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにADCC活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにADCC活性測定用培地を用い、反応終了の45分前に15μLの9% Triton X−100溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。ADCC活性は次式により求めた。
ADCC活性(%)={(検体の吸光度−エフェクター細胞自然遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度)/(標的細胞全遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度}×100
結果を第17図に示した。標的細胞として用いた全細胞株のうち、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現していることが確認されているPERP/CHO、PC9、NCI−H69、Capan−2およびBxPC−3細胞株に対して、抗PERPキメラ抗体KM3481はADCC活性を有していた。一方、陰性対照として用いたCHO/DG44細胞株に対して、抗PERPキメラ抗体KM3481はADCC活性を有していなかった。
肺癌および膵癌について、マウスゼノグラフト初期癌モデルの系で抗PERPキメラ抗体のin vivo薬効試験を以下のようにして検討した。
(式)
腫瘍体積=短径×短径×長径×0.5
肺癌および膵癌モデルにおける各群の腫瘍体積平均値の経日的推移をそれぞれ第18図および第19図に示す。
第18図に示した肺癌モデルにおいては、22日目以降に非投与群マウスの腫瘍死が始まったため、腫瘍体積の評価は22日目で終了した。
第19図に示した膵癌モデルにおいては、1、10mg/kg投与群で顕著な腫瘍生着阻害および腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらに0.1mg/kg投与群でも有意な阻害効果が認められた。
以上より、肺癌および膵癌をターゲットとした初期癌モデルにおいて、抗PERPキメラ抗体KM3481が抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。
(1)抗PERPヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
まず、PERPに対するヒト型CDR移植抗体(以下、抗PERPCDR移植抗体と表記する)のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
実施例7の(1)−3で同定した抗PERPマウス抗体KM3411のVLのCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のVLをそのアミノ酸配列の相同性から4種類のサブグループ(HSG I〜IV)に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]。そこでVHの場合と同様にして、ヒト抗体のVLの4種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、KM3411のVLのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を選択した。第5表には、相同性の検索結果を示した。第5表に示したように、KM3411のVLのFRのアミノ酸配列はサブグループIと最も高い相同性を有していた。
本実施例(1)で設計した抗PERPヒト型CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV0をコードするcDNAを、PCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号12の1〜18番目に示される抗PERPマウス抗体KM3411のH鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体V領域のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、更に5’末端と3’末端にPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列(ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む)を付加した。設計した塩基配列を5’末端側から約100塩基ずつ計6本の塩基配列に分け(隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする)、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した。
本実施例(1)で設計した抗PERPヒト型CDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV0をコードするcDNAを、PCRを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号14の1〜22番目に示される抗PERPマウス抗体KM3411のL鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体V領域のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、更に5’末端と3’末端にPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列(ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む)を付加した。設計した塩基配列を5’末端側から約100塩基ずつ計6本の塩基配列に分け(隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする)、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した。
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の適当な位置に本実施例(2)および(3)で得られたHV0およびLV0をコードするそれぞれのcDNA、あるいはそれらの改変体をコードするcDNAを挿入し、各種抗PERPヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築した。
抗PERPヒト型CDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、上記実施例7(2)−2および(3)に記載の方法と同様にして行った。
配列番号4−人工配列の説明:合成DNA
配列番号5−人工配列の説明:合成DNA
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
配列番号10−人工配列の説明:合成DNA
配列番号21−人工配列の説明:合成DNA
配列番号22−人工配列の説明:合成DNA
配列番号23−人工配列の説明:合成DNA
配列番号24−人工配列の説明:合成DNA
配列番号25−人工配列の説明:合成ペプチド
配列番号26−人工配列の説明:合成ペプチド
Claims (47)
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片。
- ポリペプチドの細胞外領域が、配列番号2で表されるアミノ酸配列の35〜75番目および130〜154番目に表されるアミノ酸配列で示される領域である、請求項1に記載の抗体または抗体断片。
- 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗体または抗体断片。
- モノクローナル抗体が、ハイブリドーマKM3411(FERM BP−8643)から生産されるモノクローナル抗体である、請求項3に記載の抗体または抗体断片。
- モノクローナル抗体が、ハイブリドーマKM3411(FERM BP−8643)から生産されるモノクローナル抗体から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと結合するモノクローナル抗体である、請求項3に記載の抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
- ハイブリドーマが、ハイブリドーマKM3411(FERM BP−8643)である、請求項6に記載のハイブリドーマ。
- モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、請求項3に記載の抗体または抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項8に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
- ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域(Complimentarity Determining Region;以下、CDRと表記する)移植抗体から選ばれるヒト化抗体である、請求項9に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の重鎖(以下、H鎖と表記する)可変領域(以下、V領域と表記する)および軽鎖(以下、L鎖と表記する)V領域を含む、請求項10に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のH鎖V領域(以下、VHと表記する)およびL鎖V領域(以下、VLと表記する)を含み、かつ、ヒト抗体のH鎖定常領域(以下、C領域と表記する)およびL鎖C領域を含む、請求項11に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
- 抗体のVHが配列番号12で示されるアミノ酸配列の19〜130番目のアミノ酸配列を含む、請求項11または12に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
- 抗体のVLが配列番号14で示されるアミノ酸配列の23〜128番目のアミノ酸配列を含む、請求項11または12に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
- 抗体のVHが配列番号12で示されるアミノ酸配列の19〜130番目のアミノ酸配列を含み、かつ、抗体VLが配列番号14で示されるアミノ酸配列の23〜128番目のアミノ酸配列を含む、請求項11〜14のいずれか1項に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRを含む、請求項10に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRとヒト抗体のVHおよひVLのフレームワーク(以下、FRと表記する)を含む、請求項16に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRとヒト抗体のVHおよびVLのFRを含み、かつ、ヒト抗体のH鎖C領域およびL鎖C領域を含む、請求項16または17に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体のVHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17で示されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体のVLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号18、19および20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体VHのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号15、16および17を含み、かつ、抗体VLのCDR1、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号18、19および20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜20のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体のVHが、配列番号25で示されるアミノ酸配列、または配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、27番目のGly、30番目のSer、41番目のPro、44番目のLys、45番目のGly、72番目のVal、および97番目のAlaから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16〜21のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体のVLが、配列番号26で示されるアミノ酸配列、または配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、3番目のGln、5番目のThr、35番目のTyr、42番目のAla、46番目のLeu、70番目のPhe、および77番目のLeuから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16〜21のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体のVHが、配列番号25で示されるアミノ酸配列、または配列番号25で示されるアミノ酸配列のうち、3番目のGln、5番目のThr、35番目のTyr、42番目のAla、46番目のLeu、70番目のPhe、および77番目のLeuから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のVLが、配列番号26で示されるアミノ酸配列、または配列番号26で示されるアミノ酸配列のうち、3番目のGln、5番目のThr、35番目のTyr、42番目のAla、46番目のLeu、70番目のPhe、および77番目のLeuから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、請求項16〜23のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または抗体断片。
- 抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項1〜24のいずれか1項に記載の抗体断片。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片をコードするDNA。
- 請求項26に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
- 請求項27に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項6または7に記載のハイブリドーマまたは請求項28に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の製造方法。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いるPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出または測定方法。
- 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である、請求項30に記載の検出方法。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いるPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
- 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である請求項32に記載の検出方法。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定用試薬。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いる、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項35に記載の診断薬。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有するPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項37に記載の治療薬。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いてPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞を検出または測定することを含む、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を用いてPERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定することを含む、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項39または40に記載の診断方法。
- 請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を患者に投与することを含む、PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療方法。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、請求項42に記載の治療方法。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
- 癌の診断薬を製造するための、請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
- PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
- 癌の治療薬を製造するための、請求項1〜5または8〜25のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片の使用。
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