TW201734051A - 抗ｔｍｅｍ－１８０抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法 - Google Patents

抗ｔｍｅｍ－１８０抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供特異地作用於抗-跨膜蛋白(transmembrane protein)180(TMEM-180)而可治療癌之組成物，以及提高包含測定試料中之TMEM-180之步驟的癌之檢查方法，以及其所使用之抗體。

Description

抗TMEM-180抗體、抗癌劑、及癌之檢查方法
本發明係有關新穎之抗TMEM-180抗體、包含抗TMEM-180抗體之抗癌劑、及測定試料中之TMEM-180的癌之檢查方法。
近幾年來，作為抗癌劑，多數開發對特定分子特異作用之分子標的藥。尤其，已進行將於癌細胞中有特異表現之分子或亢進於癌細胞中之表現之分子作為抗原之各種抗體醫藥的開發。此等抗體醫藥之開發首先係比較手術時採取之癌組織中之mRNA表現與自其附近採取之正常組織中之mRNA表現，而特定出僅於癌組織中特異表現之分子、或亢進於癌細胞中之表現之分子，並將其作為抗原製作抗體。
大腸癌係由大腸黏膜細胞發生之癌。迄今已開發以上皮成長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor；EGFR)為標的之抗體的西妥昔單抗(Cetuximab)並使用於大腸癌(非專利文獻1-3)。然而，由於EGFR於正常組織中亦會表現，故西妥昔單抗亦有作用於正常組織 之可能性，而期望開發以於大腸癌中更特異表現之分子作為標的之分子標的藥。就此點而言，由於發生大腸癌之黏膜組織僅存在少許，故有難以比較癌化之黏膜細胞與正常黏膜細胞而特定出標的分子之問題。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cunningham D. et al., The New England Journal of Medicine., Vol. 351, No. 4, 2004, p.p. 337-345
[非專利文獻2]Goldstein NI. Et al., Clin Cancer Res. Vol. 1, 1311-1318, 1995
[非專利文獻3]Karapetis CS. Et al., The New Engl J Med. Vol. 359, 1757-1765
本發明之課題在於發現癌特異表現之標的分子，而藉由對該標的分子之特異作用而提供可治療癌之抗癌劑，以及提供包含測定試料中之標的分子之步驟的癌之檢查方法。
本發明人等為解決上述課題，而以DNA微陣列(Microarray)對各種大腸癌細胞株與大腸內視鏡檢查時之洗淨液中所含之正常黏膜細胞中之mRNA表現進行解析、比較，並探討僅於大腸癌細胞株表現之分子。其結果，鑑定出於所有大腸癌細胞株表現且另一方面於健康者之細胞未見到表現之作為蛋白質的跨膜蛋白(transmembrane protein)180(TMEM-180)。再者，藉由定量性PCR及原位雜交(in situ hybridization)法，確認TMEM-180於正常大腸組織中未表現，並且確認於主要之正常組織TMEM-180並未表現，確認TMEM-180可作為抗癌劑之標的，且為於癌檢查中作為指標之理想分子。
因此，製作對於TMEM-180之抗體，該抗體顯示對於大腸癌細胞之殺細胞效果，且確認尤其可以比以往之大腸癌標記感度更良好地檢測出再復發，因而完成本發明。
亦即，本發明係關於[1]一種包含抗跨膜蛋白180(TMEM-180)抗體或其抗原結合片段作為有效成分之抗癌劑；[2]一種包含結合有具有抗癌活性之物質之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段作為有效成分之抗癌劑；[3]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：GFSLTRYNVH(序列編號：1)；重鏈CDR2：VIWTGGSTD(序列編號：2)； 重鏈CDR3：DLGY(序列編號：3)；輕鏈CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN(序列編號：4)；輕鏈CDR2：QVSKLDS(序列編號：5)；及輕鏈CDR3：CQGSYSPHT(序列編號：6)；[4]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：GFSLTSYYMQ(序列編號：7)；重鏈CDR2：FIRSGGSTE(序列編號：8)；重鏈CDR3：AFYGGYYFDY(序列編號：9)；輕鏈CDR1：KASQNVGSNVD(序列編號：10)；輕鏈CDR2：KASNRYT(序列編號：11)；及輕鏈CDR3：MQSNTKYT(序列編號：12)；[5]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：GFTFSDYAMA(序列編號：40)；重鏈CDR2：TIIYDGSST(序列編號：41)；重鏈CDR3：HWYWYFDF(序列編號：42)；輕鏈CDR1：LASEGISNDLA(序列編號：43)；輕鏈CDR2：AASRLQD(序列編號：44)；及輕鏈CDR3：QQSYKYPLT(序列編號：45)；[6]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：DCALN(序列編號：48)； 重鏈CDR2：WINTQTGKPTYADDF(序列編號：49)；重鏈CDR3：EDYGYFDY(序列編號：50)；輕鏈CDR1：QASQNINKFIA(序列編號：51)；輕鏈CDR2：YTSTLVS(序列編號：52)；及輕鏈CDR3：LQYDNLRT(序列編號：53)；[7]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：NYGMH(序列編號：56)；重鏈CDR2：SISPSGGSTYYRDSV(序列編號：57)；重鏈CDR3：SASITAYYYVMDA(序列編號：58)；輕鏈CDR1：KASQNVGSNVD(序列編號：59)；輕鏈CDR2：KASNRYT(序列編號：60)；及輕鏈CDR3：MQSNSYPPT(序列編號：61)；[8]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：64)；重鏈CDR2：SITNTGGSTYYPDSV(序列編號：65)；重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：66)；輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：67)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：68)；及輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：69)；[9]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：DYWVS(序列編號：72)； 重鏈CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列編號：73)；重鏈CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列編號：74)；輕鏈CDR1：KASQNINRYLN(序列編號：75)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：76)；及輕鏈CDR3：LQHNSWPYT(序列編號：77)；[10]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：SYDIS(序列編號：80)；重鏈CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK(序列編號：81)；重鏈CDR3：IHGGYRYWFAY(序列編號：82)；輕鏈CDR1：RASSSVSYMH(序列編號：83)；輕鏈CDR2：DTSKLAS(序列編號：84)；及輕鏈CDR3：LQRSSYPPT(序列編號：85)；[11]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：SNGVG(序列編號：88)；重鏈CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS(序列編號：89)；重鏈CDR3：EYMGFDY(序列編號：90)；輕鏈CDR1：KASQNVGINVG(序列編號：91)；輕鏈CDR2：WASNRDT(序列編號：92)；及輕鏈CDR3：LQHNSYPRT(序列編號：93)； [12]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體具有以下6個CDR之至少一個，重鏈CDR1：SNGVG(序列編號：96)；重鏈CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS(序列編號：97)；重鏈CDR3：EEKGFAY(序列編號：98)；輕鏈CDR1：KASQNVGINVG(序列編號：99)；輕鏈CDR2：WASNRDT(序列編號：100)；及輕鏈CDR3：LQHNSYPRA(序列編號：101)；[13]如上述[3]至[12]中任一項記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含於前述重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之至少一個中附加、取代或缺失1至數個胺基酸；或前述重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之至少一個具有與前述重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列；[14]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：13表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：13表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：13表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：14表示之胺基酸序列之輕鏈； 包含於以序列編號：14表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：14表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[15]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：15表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：15表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：15表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：16表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：16表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：16表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[16]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：46表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：46表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：46表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：47表示之胺基酸序列之輕鏈； 包含於以序列編號：47表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：47表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[17]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：54表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：54表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：54表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：55表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：55表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：55表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[18]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：62表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：62表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：62表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：63表示之胺基酸序列之輕鏈； 包含於以序列編號：63表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：63表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[19]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：70表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：70表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：70表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：71表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：71表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：71表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[20]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：78表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：78表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：78表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：79表示之胺基酸序列之輕鏈； 包含於以序列編號：79表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：79表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[21]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：86表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：86表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：86表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：87表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：87表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：87表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[22]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：94表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：94表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：94表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：95表示之胺基酸序列之輕鏈； 包含於以序列編號：95表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：95表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[23]如上述[1]或[2]記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體包含包含以序列編號：102表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：102表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：102表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈及/或包含以序列編號：103表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：103表示之胺基酸序列中附加、取代或缺失1至數個胺基酸之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：103表示之胺基酸序列有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈；[24]如上述[1]至[23]中任一項記載之抗癌劑，其中前述抗TMEM-180抗體於Fc區域結合有1個以上之N-結合型糖鏈，於該N-結合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖；[25]如上述[1]至[24]中任一項記載之抗癌劑，其中以表現TMEM-180之癌為對象；[26]如上述[1]至[24]中任一項記載之抗癌劑，其中以大腸癌為對象； [27]如上述[1]至[24]中任一項記載之抗癌劑，其係與使用包含至少一個由以序列編號104~170表示之胺基酸序列所成之胜肽之組成物的癌疫苗療法併用而投予；[28]一種如上述[3]至[24]中任一項記載之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段；[29]一種核酸，其編碼如上述[3]至[13]中任一項記載之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者；[30]一種核酸，其編碼如上述[14]至[23]中任一項記載之重鏈及輕鏈之任一者；[31]一種表現載體，其包含如上述[29]或[30]記載之核酸；[32]一種轉形體，其包含如上述[31]記載之表現載體；[33]一種抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之製造方法，其包含以如上述[32]記載之轉形體表現抗體之步驟，及回收前述抗體之步驟；[34]一種癌之檢查方法，其包含測定由受檢者所採取之試料中之TMEM-180量的步驟；[35]如上述[34]記載之癌之檢查方法，其中以使用抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之免疫分析進行前述TMEM-180量之測定；[36]如上述[35]記載之癌之檢查方法，其中前述抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段係上述[28]記載之抗 TMEM-180抗體或其抗原結合片段；[37]如上述[34]至[36]中任一項之癌之檢查方法，其係以大腸癌為對象；[38]如上述[34]至[37]中任一項之癌之檢查方法，其係用於檢查治療後之再復發或轉移；[39]一種癌之檢查用套組，其包含抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段；[40]如上述[39]記載之癌之檢查用套組，其中前述抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段係上述[28]記載之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段；及[41]如上述[39]或[40]記載之癌之檢查用套組，其係以大腸癌為對象。
本發明人等又發現TMEM-180係露出並存在於具有癌之受檢者的血清中存在之胞外體(exosome)中。依據該見解，而提供以下之發明。
[A17]一種癌之檢查方法，其包含於由受檢者所採取之體液試料中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟。
[A18]如上述[A17]記載之方法，其中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟係使用結合於TMEM-180之抗體或其抗原結合片段進行。
[A21]如上述[A18]記載之方法，其中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟係使用如上述[3]至[24]中任一項記載之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段進行。
[A22]一種醫藥組成物，其係於具有癌之對象中處置 前述癌所用之醫藥組成物，且包含結合於TMEM-180之抗體，前述對象係自體液試料檢測出TMEM-180之對象。
本發明人等又自1361選殖株抗體獲得非特異吸附經減低之1361-5選殖株抗體。因此，本發明亦提供以下發明。
[A1]一種與跨膜蛋白180(TMEM-180)結合之抗體或其抗原結合片段，其係[1]包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體，該重鏈可變區域包含：重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：171)；重鏈CDR2：SITNTGGSTAYPDSV(序列編號：172)；及重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：173)，該輕鏈可變區域包含輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：174)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：175)；及輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：176)，或[2]於對於TMEM-180之結合中與上述[1]之抗體競爭之抗體。
[A2]如上述[A1]記載之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區域(序列編號：177)及輕鏈可變區域(序列編號：178)。
[A3]如上述[A1]或[A2]記載之抗體或其抗原結合片段，其具有重鏈(序列編號：180)及輕鏈(序列編號： 182)。
[A4]如上述[A1]~[A3]中任一項記載之抗體，其中於Fc區域結合有1個以上之N-結合型糖鏈，於該N-結合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖。
[A5]一種用以處置癌之醫藥組成物，其包含如上述[A1]~[A4]中任一項記載之抗體。
[A6]一種用以診斷癌之組成物，其包含如上述[A1]~[A4]中任一項記載之抗體或其抗原結合片段。
[A7]一種用以診斷癌之診斷套組，其包含如上述[A1]~[A4]中任一項記載之抗體或抗原結合片段。
[A8]如上述[A5]記載之醫藥組成物，其係以表現TMEM-180之癌為對象。
[A9]如上述[A5]記載之醫藥組成物，其係以大腸癌為對象。
[A10]一種核酸，其編碼如上述[A1]~[A4]中任一項記載之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者。
[A11]一種核酸，其編碼如上述[A1]~[A4]中任一項記載之重鏈及輕鏈之任一者。
[A12]一種表現載體，其包含如上述[A10]或[A11]之核酸。
[A13]一種轉形體，其包含如上述[A12]之表現載體。
[A14]一種癌之檢查方法，其包含使用如上述[A1]~[A4]中任一項記載之抗體或其抗原結合片段測定由 受檢者所採取之試料中之TMEM-180量的步驟。
[A15]如上述[A14]記載之癌之檢查方法，其係以大腸癌為對象。
[A16]如上述[A14]或[A15]記載之癌之檢查方法，其係用於檢查治療後之再復發或轉移。
[A19]如上述[A18]記載之方法，其中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟係使用如上述[A1]至[A4]中任一項記載之抗體或其抗原結合片段進行。
[A20]一種檢測1期或2期癌之方法，其包含測定於由受檢者所採取之體液試料中之TMEM-180量的步驟。
[A23]如上述[A17]至[A19]中任一項記載之方法，其係用以檢測1期或2期癌。
[A24]如上述[A17]至[A23]中任一項記載之方法，其中癌係大腸癌。
[B1]一種於處置癌所用之醫藥組成物，其包含抗TMEM180抗體與細胞傷害劑之抗體藥物共軛物。
[B2]如上述[B1]之醫藥組成物，其中抗TMEM-180抗體係[1]包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體，該重鏈可變區域包含：重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：171)；重鏈CDR2：SITNTGGSTAYPDSV(序列編號：172)；及重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：173)， 該輕鏈可變區域包含輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：174)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：175)；及輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：176)，或[2]於對於TMEM-180之結合中與上述[1]之抗體競爭之抗體。
[B3]如上述[B2]記載之醫藥組成物，其具有重鏈(序列編號：180)及輕鏈(序列編號：182)。
[B4]如上述[B1]之醫藥組成物，其中抗TMEM-180抗體係[1]包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體，該重鏈可變區域包含：重鏈CDR1：DYWVS(序列編號：72)；重鏈CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列編號：73)；及重鏈CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列編號：74)，該輕鏈可變區域包含輕鏈CDR1：KASQNINRYLN(序列編號：75)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：76)；及輕鏈CDR3：LQHNSWPYT(序列編號：77)，或[2]於對於TMEM-180之結合中與上述[1]之抗體競爭之抗體。
[B5]如上述[B1]~[B4]中任一項記載之醫藥組成物，其中抗體與細胞傷害劑係以開裂性鏈接基(linker)連結。
[B6]如上述[B5]記載之醫藥組成物，其中開裂性鏈接基係於體內藉由胜肽酶開裂之胜肽鏈接基，或肼鏈接基，或包含胺基甲酸酯鍵或酯鍵之鏈接基。
[B7]如上述[B6]記載之醫藥組成物，其中開裂性鏈接基係包含纈胺酸-瓜胺酸或苯基丙胺酸-離胺酸之二胜肽之鏈接基。
[B8]如上述[B7]記載之醫藥組成物，其中開裂性鏈接基係纈胺酸-瓜胺酸鏈接基。
[B9]如上述[B8]記載之醫藥組成物，其中開裂性鏈接基包含聚乙二醇嵌段與纈胺酸-瓜胺酸嵌段(例如Mal-PEG12-Val-Cit-PABC)。
[B10]如上述[B1]~[B9]，尤其是[B9]記載之醫藥組成物，其中細胞傷害劑係單甲基奧瑞他汀(monomethyl auristatin)E。
[B11]如上述[B9]或[B10]記載之醫藥組成物，其中抗體係上述[1]~[23]及[A1]任一項記載之抗體。
[B12]一種醫藥組成物，其係包含抗TMEM180抗體與細胞傷害劑之抗體藥物共軛物之醫藥組成物，或用於如上述[A5]記載之處置癌中所用之醫藥組成物。
本發明之包含抗TMEM180抗體或其抗原結合片段之抗癌劑由於係於特定之癌中特異地表現，於正常組織中不表現之TMEM-180為標的，故認為可獲得癌細胞特異之較強效果，另一方面副作用較少。
由於TMEM-180於特定之癌中特異地表現，於正常組 織中不表現，故依據本發明之使用抗TMEM180抗體或其抗原結合片段的癌之檢查方法及檢查用套組，可簡便地進行癌之檢查。本發明之癌之檢查方法及檢查用套組與以往之大腸癌標記比較，尤其可感度良好地檢測癌之再復發。
且，依據本發明之包含結合有具有抗癌活性之物質的抗TMEM180抗體或其抗原結合片段之抗癌劑，由於對於表現TMEM-180之癌細胞可特異地送達該抗癌劑，故亦容易利用毒性強的物質作為具有抗癌活性之物質。
圖1A係顯示利用DNA微陣列對人類大腸癌細胞株、源自健康者之大腸黏膜細胞之網羅表現解析結果中之TMEM-180之表現量。圖1B係顯示以定量性PCR解析與大腸癌細胞鄰接之正常大腸組織中之TMEM-180之表現的結果。圖1C及1D係顯示利用原位雜交調查癌部及正常部之TMEM-180表現之結果。
圖2A係顯示使用資料庫調查各種正常組織中之TMEM-180之表現的結果。圖2B係顯示以與圖2A相同方法針對TMEM-180與以往抗癌劑之標的作成之分子進而調查微量表現之結果。
圖3係針對大腸癌、腦腫瘤、血癌之各種細胞株，使用98選殖株、101選殖株及212選殖株抗TMEM-180抗體進行之流式細胞儀解析之結果。
圖4係顯示98選殖株、101選殖株及212選殖株抗 TMEM-180抗體對於大腸癌細胞之螢光免疫染色結果。又，各選殖株之抗體濃度並未一致。
圖5係顯示針對98選殖株大鼠IgM抗體與98選殖株大鼠-人類嵌合抗體，以流式細胞儀調查對於DLD-1大腸癌株及其TMEM-180基因剃除株之反應性之結果。
圖6係顯示藉由98選殖株大鼠IgM抗體對人類大腸癌與附近正常部染色之結果。
圖7係顯示利用98選殖株大鼠IgM抗體產生融合瘤培養上澄液之細胞阻礙性試驗之結果。融合瘤培養上澄液中之抗體濃度係以IgM特異之抗體ELISA測定。
圖8係顯示利用101選殖株大鼠IgM抗體產生融合瘤培養上澄液之細胞阻礙性試驗之結果。融合瘤培養上澄液中之抗體濃度係以IgM特異之抗體ELISA測定。
圖9係顯示測定癌細胞培養上澄液中之TMEM-180蛋白質濃度之結果。
圖10係針對4期大腸癌患者4名，測定血漿中之TMEM-180蛋白質濃度之結果。且，圖中右方之表顯示源自相同患者之檢體的CEA值之測定結果。
圖11係針對3期大腸癌患者3名，測定術前、術後之血漿中之TMEM-180蛋白質濃度之結果。
圖12係針對各期大腸癌患者，測定術前、術後及再復發時之血漿中之TMEM-180蛋白質濃度及CEA濃度之結果。
圖13係顯示1361-5抗體未辨識正常皮膚組織。
圖14係顯示1361-5抗體對於皮膚以外之正常組織亦未辨識。
圖15係顯示1361-5抗體結合於大腸癌細胞株DLD-1之表面。
圖16係顯示1361-5抗體結合於大腸癌細胞株DLD-1之表面。
圖17係顯示1361-5抗體對大腸癌組織陣列之組織良好染色。
圖18係顯示大腸癌細胞株DLD-1之培養上澄液中存在之胞外體含有TMEM-180蛋白質。圖中，所謂固相側抗體表示於盤表面固相化之抗體，胞外體之檢測係使用抗CD9抗體進行。
圖19係顯示大腸癌細胞株DLD-1之TMEM-180強制表現株之培養上澄液經凝膠過濾所得之區份中98抗體陽性成分之量。
圖20A係顯示利用利妥昔單抗(Rituximab)對於大腸癌細胞株DLD-1之ADCC活性之評價結果。
圖20B係顯示利用1361-5抗體對於大腸癌細胞株DLD-1之ADCC活性之評價結果。
圖20C係顯示利用1361-5抗體之Fc變化抗體(變化體1)對於大腸癌細胞株DLD-1之ADCC活性之評價結果。
圖20D係顯示利用1361-5抗體之Fc變化抗體(變化體2)對於大腸癌細胞株DLD-1之ADCC活性之評價結 果。
圖21顯示於人類大腸癌細胞移植小鼠模型中，人類IgG化669抗體具有強的抗癌作用。圖中，「Erb」表示爾必得舒(Erbitux)投予群之結果。
圖22顯示大腸癌患者之血清(1~4期之51例)中所含之胞外體為TMEM-180陽性。
圖23為顯示TMEM-180露出於胞外體表面之電子顯微鏡像。
圖24為實施例C15製作之抗體藥物共軛物(ADC)之示意圖。
圖25係顯示TMEM-180抗體朝細胞內移行之圖。
圖26係顯示實施例C15製作之ADC之細胞殺傷作用之圖。
圖27係顯示TMEM180基因剃除小鼠之製作所用之嚮導RNA(guide RNA)部位與遭破壞之基因序列之圖。
(抗TMEM-180抗體及抗癌劑)
本發明之抗癌劑之一樣態係包含抗TMEM180抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
本說明書中所謂抗TMEM180抗體係指結合於跨膜蛋白180(TMEM-180)之抗體，可與TMEM-180特異結合。本說明書中，稱TMEM-180時，可為源自任何動物之 TMEM-180，且只要成為抗癌劑之標的、成為癌之檢查方法之指標，則亦可為其變異體。作為TMEM-180之一例，人類TMEM-180之胺基酸序列示於序列編號：17。
本說明書中之「抗體」意指免疫球蛋白，係指成為以一對二硫醚鍵安定化之2條重鏈(H鏈)與2條輕鏈(L鏈)締合之構造的蛋白質。重鏈係由重鏈可變區域VH、重鏈恆定區域CH1、CH2、CH3及位於CH1與CH2之間之樞紐區域所成，輕鏈係由輕鏈可變區域VL與輕鏈恆定區域CL所成。其中，由VH與VL所成之可變區域片段(Fv)係直接參與抗原結合而對抗體賦予多樣性之區域。且，由VL、CL、VH、CH1所成之抗原結合區域稱為Fab區域，由樞紐區域、CH2、CH3所成之區域稱為Fc區域。
可變區域中，與直接抗原接觸之區域變化特別大，稱為互補性決定區域(complementarity-determining region：CDR)。CDR以外之變異較少之部分稱為框架區域(framework region：FR)。輕鏈與重鏈之可變區域中，分別存在3個CDR，分別自N末端側起依序稱為重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3。
本說明書中之「處置」意指治療或預防。因此，本說明書中所謂「處置癌所用之醫藥組成物」意指治療或預防癌之醫藥組成物，以包含抗癌劑為一例之意義使用。
本發明之抗TMEM180抗體可為單株抗體，亦 可為多株抗體。且，本發明之抗TMEM180抗體可為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE之任一等型(Isotype)。可為將小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、雞等之非人類動物免疫而製作者，亦可為重組抗體，亦可為嵌合抗體、人類化抗體、完全人類化抗體等。所謂嵌合型抗體係指將源自不同種之抗體片段連結而成之抗體。
所謂「人類化抗體」意指以源自非人類抗體之特徵胺基酸序列置換人類抗體之對應位置所得之抗體，舉例為例如具有將小鼠或大鼠免疫而製作之抗體之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3，包含重鏈及輕鏈之各4個框架區域(FR)之其他所有區域係源自人類抗體者。該抗體有時亦稱為CDR移植抗體。用語「人類化抗體」有時亦包含人類嵌合抗體。
「人類嵌合抗體」係於源自非人類之抗體中，源自非人類之抗體之恆定區域置換為人類之抗體恆定區域之抗體。基於提高ADCC活性之觀點，人類嵌合抗體可為例如將恆定區域中所用之人類之抗體的亞型設為IgG1。
本說明書中，「抗原結合片段」意指抗體之片段，且係結合於TMEM-180之片段。具體而言，舉例為由VL、VH、CL及CH1區域所成之Fab；2個Fab於樞紐區域藉由二硫醚鍵連結之F(ab’)2；由VL及VH所成之Fv；將VL及VH以人工多胜肽鏈接基連結之1條鏈抗體的scFv以外，亦舉例diabody型、scDb型、tandem scFv型、亮胺酸拉鏈(leucine zipper)型等之雙重特異性抗體 等，但不限定於該等。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之98選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：GFSLTRYNVH(序列編號：1)
重鏈CDR2：VIWTGGSTD(序列編號：2)
重鏈CDR3：DLGY(序列編號：3)
輕鏈CDR1：KSSQSLKYRDGKTYLN(序列編號：4)
輕鏈CDR2：QVSKLDS(序列編號：5)
輕鏈CDR3：CQGSYSPHT(序列編號：6)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之101選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：GFSLTSYYMQ(序列編號：7)
重鏈CDR2：FIRSGGSTE(序列編號：8)
重鏈CDR3：AFYGGYYFDY(序列編號：9)
輕鏈CDR1：KASQNVGSNVD(序列編號：10)
輕鏈CDR2：KASNRYT(序列編號：11)
輕鏈CDR3：MQSNTKYT(序列編號：12)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之212選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：GFTFSDYAMA(序列編號：40)
重鏈CDR2：TIIYDGSST(序列編號：41)
重鏈CDR3：HWYWYFDF(序列編號：42)
輕鏈CDR1：LASEGISNDLA(序列編號：43)
輕鏈CDR2：AASRLQD(序列編號：44)
輕鏈CDR3：QQSYKYPLT(序列編號：45)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之129選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：DCALN(序列編號：48)
重鏈CDR2：WINTQTGKPTYADDF(序列編號：49)
重鏈CDR3：EDYGYFDY(序列編號：50)
輕鏈CDR1：QASQNINKFIA(序列編號：51)
輕鏈CDR2：YTSTLVS(序列編號：52)
輕鏈CDR3：LQYDNLRT(序列編號：53)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之382選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：NYGMH(序列編號：56)
重鏈CDR2：SISPSGGSTYYRDSV(序列編號：57)
重鏈CDR3：SASITAYYYVMDA(序列編號：58)
輕鏈CDR1：KASQNVGSNVD(序列編號：59)
輕鏈CDR2：KASNRYT(序列編號：60)
輕鏈CDR3：MQSNSYPPT(序列編號：61)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之 1361選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：64)
重鏈CDR2：SITNTGGSTYYPDSV(序列編號：65)
重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：66)
輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：67)
輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：68)
輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：69)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之669選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：DYWVS(序列編號：72)
重鏈CDR2：EIYPNSGATNFNENFK(序列編號：73)
重鏈CDR3：DGTMGIAYYFDY(序列編號：74)
輕鏈CDR1：KASQNINRYLN(序列編號：75)
輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：76)
輕鏈CDR3：LQHNSWPYT(序列編號：77)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有所有上述CDR。本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有所有上述CDR之人類化抗體。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之699選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：SYDIS(序列編號：80)
重鏈CDR2：AINPGSGGTGYNEKFKGK(序列編號： 81)
重鏈CDR3：IHGGYRYWFAY(序列編號：82)
輕鏈CDR1：RASSSVSYMH(序列編號：83)
輕鏈CDR2：DTSKLAS(序列編號：84)
輕鏈CDR3：LQRSSYPPT(序列編號：85)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之1052選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：SNGVG(序列編號：88)
重鏈CDR2：TIWTGGGTNYNSGVQS(序列編號：89)
重鏈CDR3：EYMGFDY(序列編號：90)
輕鏈CDR1：KASQNVGINVG(序列編號：91)
輕鏈CDR2：WASNRDT(序列編號：92)
輕鏈CDR3：LQHNSYPRT(序列編號：93)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之1105選殖株抗TMEM-180抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：SNGVG(序列編號：96)
重鏈CDR2：TIWSGGGTNYNSAVQS(序列編號：97)
重鏈CDR3：EEKGFAY(序列編號：98)
輕鏈CDR1：KASQNVGINVG(序列編號：99)
輕鏈CDR2：WASNRDT(序列編號：100)
輕鏈CDR3：LQHNSYPRA(序列編號：101)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下 之6個CDR之至少1個。該等CDR係後述實施例所示之1361-5選殖株抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：171)
重鏈CDR2：SITNTGGSTAYPDSV(序列編號：172)
重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：173)
輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：174)
輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：175)
輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：176)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態係對於TMEM-180之結合中與該樣態之抗體競爭的抗體。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下所有6個CDR。該等CDR係後述實施例所示之1361-5選殖株抗體之CDR序列。
重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：171)
重鏈CDR2：SITNTGGSTAYPDSV(序列編號：172)
重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：173)
輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：174)
輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：175)
輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：176)
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態係對於TMEM-180之結合中與該樣態之抗體競爭的抗體。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有重鏈可變區域(序列編號：177)及輕鏈可變區域(序列編號：178)。該等重鏈可變區域及輕鏈可變區域係後述實施例所 示之1361-5選殖株抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態係對於TMEM-180之結合中與該樣態之抗體競爭的抗體。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態具有以下之重鏈(序列編號：180)及輕鏈(序列編號：182)。該等重鏈及輕鏈係後述實施例所示之1361-5選殖株抗體之重鏈及輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之一樣態係對於TMEM-180之結合中與該樣態之抗體競爭的抗體。
本發明之各樣態中，抗TMEM-180抗體只要能發揮本發明效果，則只要為含有6個CDR中之數個即可，可為例如2個以上、3個以上、4個以上、5個以上或6個。
上述各樣態中，重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3其至少1個亦可包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失。
本說明書中之「胺基酸」係以最廣意義使用，除了天然胺基酸以外，亦包含人工胺基酸變異體或衍生物。胺基酸亦有以慣用之一文字表述或三文字表述表示之情況。本說明書中，作為胺基酸或其衍生物舉例為天然蛋白質性L-胺基酸；非天然胺基酸；具有胺基酸之特徵的本技藝習知特性之化學合成之化合物等。作為非天然胺基酸之例，舉例為主鏈構造與天然型不同之α,α-二取代胺基 酸(α-甲基丙胺酸等)、N-烷基-α-胺基酸、D-胺基酸、β-胺基酸、α-羥基酸、或側鏈構造與天然型不同之胺基酸(正亮胺酸、高組胺酸(homohistidine)等)、及側鏈具有多餘亞甲基之胺基酸(「高」胺基酸、高苯基丙胺酸、高組胺酸等)、及側鏈中之羧酸官能基以磺酸基取代之胺基酸(半胱胺酸等)，但不限定於該等。
本說明書中稱為「具有1至數個胺基酸之附加、取代或缺失」時，經缺失、取代等之胺基酸個數只要能使結果所得之多胜肽保持作為CDR之功能則未特別限定，可為例如1個、2個、3個或4個。經取代或附加之胺基酸除了天然蛋白質性胺基酸以外，亦可為非天然胺基酸或胺基酸類似物。胺基酸之缺失、取代或附加位置，只要能保持作為CDR之功能，則可為原本CDR序列之任何部位。
上述之抗TMEM-180抗體之各樣態中，亦可為重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之至少1個具有與原本重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列者。
本說明書中所謂「具有80%以上相同性」意指以具有原本序列之多胜肽之胺基酸序列與具有變異序列之多胜肽之胺基酸序列之一致成為最大之方式予以對準時，共通之胺基酸殘基數為原本序列之胺基酸數之80%以上。
只要相同性為80%以上且能保持作為CDR之功能則可為任何%，例如可為85%以上、90%以上、95%以上、 98%以上、99%以上。
由對重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之胺基酸序列附加、取代或缺失胺基酸之胺基酸序列所成之CDR、或與重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之胺基酸序列具有80%以上之序列相同性之CDR可使用部位特異變異導入法、隨機變異導入法、鏈改組(chain shuffling)法、CDR行進法(CDR walking method)等之習知方法製作。依據該等方法，藉由嗜菌體呈現法將於CDR具有各種變異之抗體或抗體片段呈現於嗜菌體表面，藉由使用抗原進行篩選，而獲得親和性更成熟之CDR為本技藝者充分悉知者(例如Wu et al.,PANS,95：6037-6042(1998)：Schier,R.et al.,J.Mol.Bio.263：551-567(1996)；Schier,R.et al.,J.Mol.Bio.255：28-43(1996)；Yang,W.P.et al.,J.Mol.Biol.,254：392-403(1995))。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：13表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：13表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：13表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：13表示之胺基酸序列係98選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本說明書中，重鏈或輕鏈之胺基酸序列中，1 至數個胺基酸之附加、取代或缺失時，附加、取代或缺失之胺基酸數可為例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。其他用與如上述。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：14表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：14表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：14表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：14表示之胺基酸序列係98選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：13表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：13表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：13表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：14表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：14表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：14表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含： 包含以序列編號：15表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：15表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：15表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：15表示之胺基酸序列係101選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：16表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：16表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：16表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：16表示之胺基酸序列係101選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：15表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：15表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：15表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：16表示之胺基酸序列之 輕鏈、包含於以序列編號：16表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：16表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：46表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：46表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：46表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：46表示之胺基酸序列係212選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：47表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：47表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：47表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：47表示之胺基酸序列係212選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：46表示之胺 基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：46表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：46表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：47表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：47表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：47表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：54表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：54表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：54表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：54表示之胺基酸序列係129選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：55表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：55表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：55表示之胺基酸序列具有80% 以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：55表示之胺基酸序列係129選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：54表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：54表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：54表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，
該輕鏈係包含以序列編號：55表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：55表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：55表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：62表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：62表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：62表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：62表示之胺基酸序列係382選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含： 包含以序列編號：63表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：63表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：63表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：63表示之胺基酸序列係382選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：62表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：62表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：62表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：63表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：63表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：63表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：70表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：70表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或 包含與以序列編號：70表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：70表示之胺基酸序列係1361選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：71表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：71表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：71表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：71表示之胺基酸序列係1361選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：70表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：70表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：70表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：71表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：71表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：71表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：78表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：78表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：78表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：78表示之胺基酸序列係669選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：79表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：79表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：79表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：79表示之胺基酸序列係669選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：78表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：78表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：78表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈， 該輕鏈係包含以序列編號：79表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：79表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：79表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：86表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：86表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：86表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：86表示之胺基酸序列係699選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：87表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：87表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：87表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：87表示之胺基酸序列係699選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包 含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：86表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：86表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：86表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：87表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：87表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：87表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：94表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：94表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：94表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：94表示之胺基酸序列係1052選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：95表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：95表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或 包含與以序列編號：95表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：95表示之胺基酸序列係1052選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：94表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：94表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：94表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：95表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：95表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：95表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：102表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：102表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈；或包含與以序列編號：102表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：102表示之胺基酸序列係1105選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：103表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：103表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：103表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：103表示之胺基酸序列係1105選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：102表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：102表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：102表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：103表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：103表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：103表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：180表示之胺基酸序列之重鏈；包含於以序列編號：180表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈； 或包含與以序列編號：180表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈。
以序列編號：180表示之胺基酸序列係1361-5選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態包含：包含以序列編號：182表示之胺基酸序列之輕鏈；包含於以序列編號：182表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈；或包含與以序列編號：182表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
以序列編號：182表示之胺基酸序列係1361-5選殖株抗TMEM-180抗體之輕鏈可變區域之胺基酸序列。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態亦可包含重鏈及輕鏈，該重鏈係包含以序列編號：180表示之胺基酸序列之重鏈、包含於以序列編號：180表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之重鏈、或包含與以序列編號：180表示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列之重鏈，該輕鏈係包含以序列編號：182表示之胺基酸序列之輕鏈、包含於以序列編號：182表示之胺基酸序列中包含1至數個胺基酸之附加、取代或缺失之胺基酸序列之輕鏈、或包含與以序列編號：182表示之胺基酸序列具有 80%以上相同性之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體之另一樣態可為於TMEM-180之結合中與本發明之抗TMEM-180抗體競爭之抗體。該特定樣態之一樣態中，本發明之抗TMEM-180抗體可為並非具有序列編號64~66之胺基酸序列作為重鏈可變區域之CDR，且具有序列編號67~69之胺基酸序列作為輕鏈可變區域之CDR的抗體之抗體。
本發明之抗體或於TMEM-180之結合中與本發明之抗體競爭之抗體中，Fc區域亦可具有1個以上之胺基酸取代。雖未特別限定，但例如重鏈可為具有序列編號180之對應於第262號胺基酸的胺基酸自絲胺酸置換為天門冬胺酸之胺基酸置換、序列編號180之對應於第353號胺基酸的胺基酸自丙胺酸置換為亮胺酸之胺基酸置換、及序列編號180之對應於第355號胺基酸的胺基酸自異亮胺酸置換為穀胺酸之胺基酸置換之重鏈。且雖未特別限定，但例如重鏈可為具有序列編號180之對應於第262號胺基酸的胺基酸自絲胺酸置換為天門冬胺酸之胺基酸置換、序列編號180之對應於第355號胺基酸的胺基酸自異亮胺酸置換為穀胺酸之胺基酸置換、及序列編號180之對應於第356號胺基酸之自穀胺酸置換為丙胺酸之胺基酸置換之重鏈。
本發明之抗TMEM-180抗體可為於Fc區域結合有1個以上之N-結合型糖鏈，於該N-結合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖之抗體。
例如於IgG抗體之Fc區域中，N-結合型糖鏈之結合 部位存在2處，於該部位結合有複合型糖鏈。所謂N-結合型糖鏈意指結合於Asn-X-Ser/Thr序列之Asn之糖鏈，具有共通之構造Man3GlcNAc2-Asn。根據結合於非還原末端之2個甘露糖(Man)之糖鏈種類，分類為高甘露糖型、混成型及複合型等。
於該N-結合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)結合海藻糖時，與結合之情況相比較，已知未結合海藻糖之情況之ADCC活性顯著上升。此係例如記載於國際公開第2002/031140號說明書中，其揭示全文作為參考併入本說明書中。
藉由顯著提高ADCC，於抗體作為醫藥使用時可減少投予量，固可減輕副作用，並且亦可減低治療費。
本發明之抗癌劑之一樣態含有結合具有抗癌活性之物質的抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段作為有效成分。此等物質亦可稱為抗體藥物共軛物(ADC)。該樣態中，抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段可為其本身具有抗癌活性者，亦可為僅對TMEM-180具有結合能而不具有抗癌活性者。
本說明書中，所謂「具有抗癌活性之物質」意指產生下述之至少一者的物質：減小(延遲或停止)腫瘤尺寸、阻礙腫瘤轉移、阻礙(延遲或停止)腫瘤增殖、及緩和與癌關聯之一或複數症狀。具體而言，可舉例為毒素、抗癌劑、放射線同位素，但不限定於該等。
作為具有抗癌活性之毒素舉例為例如綠膿菌外 毒素(PE)或其細胞阻礙性片段(例如PE38)、白喉毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A等。具有抗癌活性之毒素由於僅對抗TMEM-180抗體所辨識之細胞亦即表現TMEM-180之癌細胞發揮毒性，故具有對於周圍細胞不造成不良影響，獲得特異效果之優點。
作為抗癌劑舉例為例如阿黴素(adriamycin)、道諾黴素(daunomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、順鉑(cisplatin)、長春新鹼(vincristine)、泛艾黴素(epirubicin)、氨甲喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、氮芥類(Nitrogen mustard)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、博來黴素(bleomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、太莫西芬(tamoxifen)、單甲基奧瑞他汀E、SN-38、地塞米松(dexamethasone)等之低分子化合物，或使免疫負責細胞活性化之細胞因子(cytokine)(例如人類白細胞介素(human interleukin)2、人類顆粒球巨嗜細胞菌落刺激因子、人類巨嗜細胞菌落刺激因子、人類白細胞介素12)等之蛋白質。
作為具有抗癌活性之放射性同位素舉例為32P、14C、125I、3H、131I、211At、90Y等。
具有抗癌活性之物質可藉由習知方法或依據此而與抗TMEM-180抗體直接或透過鏈接基(例如開裂性鏈 接基)結合。亦可將具有抗癌活性之物質封入微胞或微脂體等之擔體中，並將該微脂體結合於抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段。
上述具有抗癌活性之物質為蛋白質或多胜肽時，亦可將編碼本發明之抗TMEM-180抗體之核酸(後述)與編碼具有抗癌活性之物質的DNA連結，藉由插入適當表現載體中，而作為具有抗癌活性之物質與抗TMEM-180抗體之融合蛋白質予以表現。
本說明書中之「抗癌劑」意指發生下述之至少一者之醫藥：減小(延遲或停止)腫瘤尺寸、阻礙腫瘤轉移、阻礙(延遲或停止)腫瘤增殖、及緩和與癌關連之一或複數症狀。本說明書中，「抗癌劑」與「用以處置癌之醫藥組成物」係交互互換使用。
本發明之抗癌劑除了有效成分以外，亦可含有藥學上容許之擔體或添加劑。
作為擔體及添加劑之例舉例為水、食鹽水、磷酸緩衝液、右旋糖、丙三醇、乙醇等之藥學上容許之有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基共聚物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、褐藻酸鈉、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、洋菜、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、界面活性劑等，但不限定於該等。
本發明之醫藥組成物可為各種形態例如液劑(例如注射劑)、分散劑、懸浮劑、錠劑、丸劑、粉末劑、栓劑等。較佳樣態為注射劑，較佳非經口(例如靜脈內、經皮、腹腔內、肌肉內)投予。
本發明之醫藥組成物對於表現TMEM-180之癌的治療有效。表現TMEM-180之癌包含大腸癌與腦腫瘤，但不限定於此。作為癌舉例為例如實心癌，例如大腸癌、腦腫瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、腎癌及膀胱癌。
本發明之醫藥組成物係用於於具有癌之對象中處置該癌所用之醫藥組成物，且係包含結合於TMEM-180之抗體的組成物。本發明之某樣態中，處置對象可為具有表現TMEM-180之癌之對象。本發明之某樣態中，處置對象可為自體液試料中檢測出TMEM-180之對象。本發明之某樣態中，處置對象可為自體液試料中檢測出露出TMEM-180之胞外體之對象。
本發明亦包含治療方法，其包含投予本發明之抗癌劑。亦即，本發明之某方面中，提供於具有癌之對象中處置該癌之方法，且包含對該對象投予結合於TMEM-180之抗體。
本發明之抗癌劑之投予量，例如抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之投予量為0.025~50mg/kg，較佳為0.1~0mg/kg，更好為0.1~25mg/kg，又更好為0.1~10mg/kg或0.1~3mg/kg之量，但不限定於此。
本發明之抗癌劑亦可與其他癌治療法組合。作為其他癌治療法舉例為上述之其他抗癌劑之投予、放射線療法、外科手術、癌疫苗療法等。
本說明書中之「癌疫苗療法」係對患者投予癌抗原，或於體外以癌抗原刺激源自患者之免疫細胞後回到患者身上，而提高患者本身對於癌細胞之免疫力之癌治療或預防方法。癌疫苗療法所用之癌抗原之一例係使用源自對癌細胞特異表現之蛋白質之胜肽(源自癌抗原之胜肽)。
源自癌抗原之胜肽係結合於樹狀細胞等之抗原呈現細胞表面之人類白血球抗原(HLA)分子，藉由成呈現細胞傷害性T細胞(CTL)而使CTL活性化。經活性化之CTL攻擊表現出與該胜肽相同抗原之癌細胞並予以排除。HLA分子之基因多樣性高，根據人類而基因型亦不同。源自某癌抗原蛋白質、且有與特定基因型之HLA分子結合之可能性之胜肽之序列可藉由習知軟體等決定。
例如源自TMEM-180蛋白質之胜肽且有結合於日本人中較多的HLA型A2或HLA型A24之可能性之胜肽係如下(係使用美國國際衛生研究所Bioinformatics and Molecular Analysis Section公開之HLAPeptide Binding Prediction(http：//www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)進行預測)。表中「Start Pposition」係序列編號：17中所示之胺基酸序列中之位置。
依據使用該等胜肽之癌疫苗療法，由於可使利用CTL 對於表現TMEM-180蛋白質之癌細胞的攻擊活性化，故藉由與以TMEM-180為標的之本發明之抗癌劑併用，可效率良好地攻擊癌細胞，可預防或治療癌。包含胜肽之癌疫苗組成物可依據習知方法由本技藝者調製。
(核酸)
本發明亦包含編碼本發明之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之核酸。核酸可為天然核酸亦可為人工核酸，舉例為例如DNA、RNA、DNA與RNA之嵌合體，但不限 於該等。編碼抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之核酸之鹼基序列可由本技藝者依據習知方法或依據其之方法決定，可藉習知方法或依據其之方法調製。
作為本發明之編碼抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之核酸，舉例為例如包含編碼98選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈或輕鏈之DNA的核酸、包含編碼98選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者之DNA的核酸、包含編碼101選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈或輕鏈之DNA的核酸、包含編碼101選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者之DNA的核酸、包含編碼212選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈或輕鏈之DNA的核酸及包含編碼212選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者之DNA的核酸，但不限定於該等。
作為本發明之編碼抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之核酸，又舉例為例如包含編碼1361-5選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈或輕鏈之DNA的核酸、包含編碼1361-5選殖株抗TMEM-180抗體之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者(尤其是重鏈CDR2)之DNA的核酸。
(表現載體)
本發明之表現載體包含本發明之編碼抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之核酸。表現載體可配合使用之宿主細胞適當選擇，舉例為例如質體、逆轉錄病毒載體、腺病 毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower mosaic virus)載體或菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)載體等之植物病毒載體，黏粒、YAC、源自EBV之游離基因組(episome)等。可藉由習知方法(利用限制酵素等之方法等)將本發明之編碼抗TMEM-180抗體之核酸插入該等之表現載體中。
本發明之表現載體進而可包含調節抗體基因之表現之啟動子、複製起點、選擇標記基因等。啟動子及複製起點可依據宿主細胞與載體種類適當選擇。
(轉形體)
本發明之轉形體包含本發明之載體。轉形體可藉由於適當宿主細胞中轉染本發明之載體而獲得。作為宿主細胞可使用例如哺乳類細胞(CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、HeLa細胞、Vero細胞等)、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞(酵母屬(Saccharomyces)、曲黴菌屬(Aspergillosis)等)之真核細胞、或大腸菌(E.Coli)、枯草菌等之原核細胞。
(抗體之製造方法)
本發明之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之製造方法並未特別限定，但例如抗TMEM-180單株抗體可藉由自以TMEM-180或其片段予以免疫之非人類哺乳動物單離抗體產生細胞，將其與骨髓腫瘤細胞等融合而製作融合 瘤，純化該融合瘤所產生之抗體而獲得。且，抗TMEM-180多株抗體可自以TMEM-180或其片段予以免疫之動物血清獲得。
免疫可依據常用方法以TMEM-180蛋白質對動物免疫而進行。免疫亦可代替TMEM-180蛋白質而使用露出TMEM-180蛋白質之胞外體進行。以露出TMEM-180蛋白質之胞外體免疫所得之抗體並未特別限定，但為可適於露出TMEM-180蛋白質之胞外體之檢測。
以基因重組法製作本發明之抗TMEM-180抗體時，只要例如以包含本發明之核酸之表現載體將適當宿主進行轉形，以適當條件培養該轉形體並使抗體表現，依據習知方法單離純化即可。
作為單離純化方法舉例為例如使用蛋白質A之親和性管柱、其他層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析，可適當組合該等。
人類嵌合抗體及人類CDR移植抗體可藉由自產生人類以外之動物抗體之融合瘤之mRNA選殖化抗體基因，以基因重組技術將其與人類抗體基因之一部分連結而製作。
例如，人類型嵌合抗體時，藉由逆轉錄酶自產生小鼠抗體之融合瘤之mRNA合成cDNA，以PCR選殖重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(LH)並解析序列。其次，自一致率高的抗體鹼基序列製作包含前導序列(leader sequence)之5’引子，藉由5’引子與可變部3’引子而自上 述cDNA，以PCR選殖自訊號序列直至可變區域之3’末端。另一方面，選殖人類IgG1之重鏈及輕鏈之恆定區域，分別針對重鏈及輕鏈，藉由利用PCR之重疊懸掛(Overlapping Hanging)法連結源自小鼠抗體之可變區域及源自人類抗體之恆定區域並增幅。將所得DNA插入適當載體中，將其進行轉形，可獲得人類型嵌合抗體。
CDR移植抗體時，選擇與所使用之小鼠抗體可變部相同性最高之人類抗體可變部並選殖化，藉由使用大引子(megaprimer)法之部位選擇突然變異導入，而改變CDR之鹼基序列。於將構成框架區域之胺基酸序列人類化時無法與抗原特異結合之情況下，亦可將框架之一部分胺基酸自人類型轉換為大鼠型。
由原本序列中，具有1或2個胺基酸之缺失、取代或附加之胺基酸序列所成之CDR、或由與原本序列具有X%以上相同性之胺基酸序列所成之CDR可使用部位特異變異導入法、隨機變異導入法、鏈改組法、CDR行進法等之習知方法製作。
藉由該等方法，將利用嗜菌體呈現法於CDR具有各種變異之抗體或抗體片段呈現於嗜菌體表面，使用抗原進行選殖，而可獲得親和性更成熟之CDR為本技藝者充分悉知(例如Wu et al.,PANS,95：6037-6042(1998)：Schier,R.et al.,J.Mol.Bio.263：551-567(1996)；Schier,R.et al.,J.Mol.Biol.255：28-43(1996)；Yang,W.P.et al.,J.Mol.Biol.,254：392-403(1995))。本發明亦包含含有以此等方法 成熟之CDR之抗體。
作為其他抗體之製造方法，有自源自曲古柳菌素(trichostatin)A處理雞B細胞之DT40細胞株取得抗體產生株之Adlib法(Seo,H.et al.,Nat.Biotechnol.,6：731-736,2002)、使導入有小鼠抗體基因經破壞之人類抗體基因之小鼠的KM小鼠免疫製作人類抗體之方法(Itoh,K.et al.,Jpn.J.Cancer Res.,92：1313-1321,2001；Koide,A.et al.,J.Mol.Biol.,284：1141-1151,1998)等，該等亦可應用於本發明之抗體之產生。
本發明之抗TMEM-180抗體之抗原結合片段可藉使用編碼該片段之DNA之上述方法表現，且亦可於獲得全長抗體後，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等之酵素進行處理並斷片化。
於與抗原之結合中與某抗體競爭之抗體可由本技藝者藉由習知之競爭分析獲得。藉由競爭分析，若可例如至少20%，較佳至少20~50%，又更佳至少50%阻斷期望之抗體結合，則可為於對於相同抗原之結合中競爭之抗體。競爭之抗體可藉由交叉阻斷分析，較佳藉由競爭ELISA分析確認。交叉阻斷分析係將抗原塗佈於例如微量滴定盤上，於其中添加成為候補之競爭抗體存在進行培育，形成抗原與候補抗體之結合。隨後，標識期望抗體後進而添加於孔(well)中進行培育，進行洗淨，定量期望之抗體結合量，可判斷抗體是否為競爭。於競爭時，孔中殘存之標識量應變少。
本發明之抗TMEM-180抗體可能因製作方法或純化方法，而使胺基酸序列、分子量、等電點、糖鏈有無、形態等不同。然而，所得之抗體只要具有與本發明之抗體同等功能，則包含於本發明。例如本發明之抗體為以大腸菌等之原核細胞表現時，於本來之抗體之胺基酸序列之N末端附加甲硫胺酸。本發明亦包含該抗體。
本發明之抗TMEM-180抗體為於還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖而具有N-結合型糖鏈之抗體時，該抗體可依據習知方法或根據其之方法製造。該抗體之製造方法記載於例如國際公開第2002/031140號說明書、日本特開2009-225781號公報中，其揭示全文藉由參考併入本說明書中。
具體而言，例如使用包含編碼本發明之抗TMEM-180抗體之DNA之載體，將參與GDP-海藻糖之合成之酵素的活性或α-1,6-海藻糖基轉移酶之活性經降低或缺失之細胞進行轉形，培養所得之轉形體後，藉由純化成為目的之抗TMEM-180抗體而獲得。
作為參與GDP-海藻糖之合成之酵素舉例為例如GDP-甘露糖4,6-脫氫酶(GMP)、GDP-酮基-6-去氧甘露糖3,5-表異構酶，4-還原酶(Fx)、GDP-β-海藻糖焦磷酸酶(GFPP)。
此處，細胞並未特別限定，但較佳為哺乳動物細胞，例如可使用上述酵素活性經降低或缺失之CHO細胞。
由上述方法所得之抗體組成物亦有包含於還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺結合海藻糖之抗體之情況，但結合海藻 糖之抗體之比例為抗體全體之20重量%以下，較佳為10重量%以下，更佳為5重量%以下，最好為3重量%以下。
又，於還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖而具有N-結合型糖鏈之抗體，亦可藉由將含有編碼本發明之抗TMEM-180抗體之DNA之載體導入昆蟲卵中，使孵化並使昆蟲成長，根據需要進行交配而製作轉基因昆蟲，自該轉基因昆蟲或其分泌物萃取抗TMEM-180抗體而獲得。作為昆蟲可使用蠶，該情況，可自繭抽出抗體。
藉由該方法獲得之抗體組成物雖有包含於還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺結合海藻糖之抗體之情況，但結合海藻糖之抗體之比例為抗體全體之20重量%以下，較佳為10重量%以下，更佳為5重量%以下，最好為3重量%以下。
(本發明之抗體活性)
抗體醫藥之藥效機制係基於抗體具有之2種生物活性。1個為標的抗原特異結合活性，係藉由結合而中和標的抗原分子之功能之活性。標的抗原分子功能之中和係透過Fab領域發揮。
另1個為稱為效應子(effector)活性之抗體的生物活性。效應子活性係透過抗體之Fc區域，以抗體依存性細胞阻礙活性(antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC)、互補體依存性細胞阻礙活性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)、細胞凋亡之直接誘導等之樣態發揮。
本發明之抗TMEM-180抗體活性可藉由以下方法測定。
(1)結合活性
可藉由習知方法例如ELISA(酵素結合免疫吸附分析法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)、螢光抗體法、FACS法等測定抗體之結合活性。
(2)ADCC活性
所謂ADCC活性意指本發明之抗體結合於標的細胞之細胞表面抗原時，於其Fc部分透過Fcγ受體結合Fcγ受體保有細胞(效應子細胞)，而對標的細胞賦予阻礙之活性。
ADCC活性可藉由使表現TMEM-180之標的細胞及效應子細胞與本發明之抗體混合，並測定ADCC程度而得知。作為效應子細胞可利用例如小鼠脾細胞、自人類末梢血液或骨髓分離之單細胞核。作為標的細胞可使用例如TMEM-180陽性大腸癌黏膜細胞。標的細胞首先以51Cr等標識，於其中添加本發明之抗體進行培育後，隨後添加對於標的細胞適當之比的效應子細胞進行培育。培育後，採取上澄液，藉由計數上澄液中之上述標識而可測定。
(3)CDC活性
所謂CDC活性意指補體系之細胞阻礙活性。
CDC活性可藉由於ADCC活性之試驗中，使用補體替代效應子細胞而測定。
(4)腫瘤增殖抑制活性
腫瘤增殖抑制活性可利用腫瘤動物模型進行測定。例如將腫瘤移植於小鼠皮下，投予本發明之抗體。藉由比較非投予群與投予群之腫瘤組織的體積，可測定腫瘤增殖抑制效果。
又，本發明之腫瘤增殖抑制活性可產生抑制各個細胞之增殖結果者，亦可為產生誘導細胞死亡之結果者。
(檢查方法及檢查用套組)
藉由本發明之檢查方法或檢查套組所檢測出之癌，可為血液腫瘤以外之癌，例如實心癌，例如大腸癌、腦腫瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、腎癌及膀胱癌。如上述，使TMEM-180於特定細胞中表現，於正常組織或健康者組織未見到表現。因此，本發明之癌之檢查方法包含測定自受檢者採取之試料中之TMEM-180之量的步驟。
本說明書中，自受檢者採取之試料可為適於癌的檢查之所有試料，本技藝者可依據癌種類而適當決定並採取。舉例為例如血清、血漿、全血、尿、糞便、體腔液、組 織，但不限定於該等。大腸癌之檢查時，可將利用大腸內視鏡等自受檢者採取之組織，或大腸內視鏡檢查後之洗淨液中所含之黏膜細胞做為試料。
以往，作為大腸癌標記，係廣泛使用癌胎兒性抗原(Carcinoembryonic antigen；CEA)。血漿CEA值由於因利用手術之癌切除等之治療而降低，但伴隨再復發或轉移而再度上升，故CEA值之測定用於治療後之追蹤觀察。於見到CEA值再度上升時，有必要利用腹部超音波檢查或腹部CT進行精密檢查。然而，大腸癌患者中，CEA值上升不過為45%，CEA值為上升之類型的癌患者於追蹤檢查必須接受每次精密檢查。
相對於此，血漿TMEM-180值如後述實施例所示，於CEA值未上升之患者中亦見到上升，術後比術前更降低。進而，血漿TMEM-180值於術後暫時降低後，於再復發時見到有意義地上升。尤其，顯示於再復發時CEA值未上升之患者中亦見到上升。因此，認為係可廣泛用於癌患者之有用性極高之標記。
本發明之癌之檢查方法可用於癌之診斷，且於術後等治療後之追蹤觀察中，亦可用於再復發或轉移之確認。
本說明書中「測定試料中之TMEM-180量之步驟」不僅係定量TMEM-180之步驟，亦包含檢測有無TMEM-180之步驟、決定TMEM-180量之增減之步驟、與其他試料中之TMEM-180量進行比較之步驟。
且，由於TMEM180露出於自受檢者採取之液 體試料(例如血清、血漿、全血、尿或體腔液)中所含之胞外體之膜上，故亦可檢測出露出TMEM-180之胞外體，可檢測癌(或癌之存在)。而且，於檢測出露出TMEM-180之胞外體時，表示受檢者體內檢測出癌之存在。且，上述「測定試料中之TMEM-180量之步驟」亦可包含檢測液體試料(例如血清、血漿、全血、尿或體腔液)中露出TMEM-180之胞外體有無或量之步驟、將所檢測之胞外體量與規定值進行比較且於高於規定值時判定為檢測出癌之步驟。規定值可由本技藝者基於偽陽性率及偽陰性率而適當設定。亦即，若偽陽性率降低，則增大規定值即可，若偽陰性率降低，則減小規定值即可。
作為規定值並未特別限定，但舉例為例如任意1人之健康者之體液試料中之胞外體量。作為規定值亦未特別限定，但舉例為例如複數人之健康者之體液試料中之胞外體量。與複數人之健康者之體液試料中之胞外體量進行比較時，規定值並未特別限定，但可設為胞外體量之平均值、最大值或第3個四分位值，或以該等之2個值所包夾之值或其以上之值。或者，規定值並未特別限定，但可設為例如平均值、最大值或第3個四分位值，或以該等之2個值所包夾之任意值之1倍以上之值、2倍以上之值、3倍以上之值、4倍以上之值、或5倍以上之值。例如，規定值亦可為複數健康者之體液試料中之胞外體量之平均值。例如規定值亦可為複數健康者之體液試料中之胞外體量之最大值。例如規定值亦可為複數健康者之體液試料中 之胞外體量之平均值之1倍以上之值、2倍以上之值、3倍以上之值、4倍以上之值、或5倍以上之值、或2~5倍或3~5倍之任一值。例如規定值亦可為複數健康者之體液試料中之胞外體量之最大值之1倍以上之值、2倍以上之值、3倍以上之值、4倍以上之值、或5倍以上之值、或2~5倍或3~5倍之任一值。本發明中檢測出之癌可為血液腫瘤以外之癌，例如實心癌，例如大腸癌、腦腫瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、腎癌及膀胱癌。用以設定規定值而作為參考之健康者人數並未特別限定，可為例如5人~100人左右。
露出TMEM-180之胞外體之檢測可藉由純化胞外體後檢測TMEM-180、或純化包含TMEM-180之物質後，檢測純化物中胞外體之任一者進行。亦即，本發明提供一種方法{於純化及檢測中之任一者或兩者中使用抗TMEM-180抗體}，其係檢測胞外體之方法，且包含純化體液試料中露出TMEM-180之胞外體、檢測露出TMEM-180之胞外體、藉此決定為體液試料中存在有露出TMEM-180之胞外體。
胞外體之純化或檢測可使用週知技術進行，並未特別限定，但可使用例如與胞外體結合之抗體(例如抗CD9抗體、抗CD63抗體或抗CD81抗體)實施。且TMEM-180之檢測或包含TMEM-180之物質之純化可使用本發明之抗TMEM-180抗體實施。檢測所用之抗體可設為利用過氧化物酶及鹼性磷酸酶等之酵素以及放射線同位素、螢光物質 及發光物質等之標識而檢測之經標識抗體，該等抗體之檢測可由本技藝者利用週知方法進行。且，胞外體量及上述規定值可基於利用該等檢測方法之測定值或將其標準化之值而決定。當然，亦可以抗TMEM-180抗體純化胞外體，以其他抗TMEM-180抗體檢測胞外體。
例如，露出TMEM-180之胞外體，可藉結合有本發明之TMEM-180抗體之珠粒使試料中之胞外體免疫沉降，隨後，使用結合於胞外體之抗體(例如抗CD9抗體、抗CD63抗體或抗CD81抗體)自TMEM-180純化區分進行檢測。且，例如，露出TMEM-180之胞外體，亦可藉結合有結合於胞外體之抗體(例如抗CD9抗體、抗CD63抗體或抗CD81抗體)之珠粒使試料中之胞外體免疫沉降，使用本發明之TMEM-180抗體自胞外體純化區分進行檢測。
胞外體之純化或檢測中，作為本發明之抗體，只要結合於TMEM-180，則可使用任何抗體，但例如可使用1361抗體或1361-5抗體或於關於與TMEM-180之結合中與該等抗體競爭之抗體。
試料中之TMEM-180量之測定可使用用以測定試料中之特定蛋白質量之所有方法進行，舉例為例如免疫分析(包含凝集法、比濁法)、西方墨點法、表面電漿子共振(SPR)法等，但不限定於該等。其中，使用抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段之免疫分析簡便而有用。
由於TMEM-180為膜蛋白質，故亦可以市售之細胞溶解緩衝液、非離子性界面活性劑、膜蛋白質可溶化試藥等 進行處理，將膜蛋白質可溶化後測定其量。
免疫分析係使用可檢測之經標識之抗TMEM-180抗體及/或對於可檢測之經標識之抗TMEM-180抗體的抗體(二次抗體)。根據抗體之標識法，分類為酵素免疫分析(EIA或ELISA)、放射免疫分析(RIE)、螢光免疫分析(FIA)、螢光偏光免疫分析(EPIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、螢光酵素免疫分析(FLEIA)、化學發光酵素免疫分析(CLEIA)、電化學發光免疫分析(ECLIA)等，該等任一者均可用於本發明方法。
於ELISA法使用以過氧化物酶、鹼性磷酸酶等之酵素，於RIA法使用以125I、131I、35S、3H等之放射性物質，於FPIA法使用以螢光異硫代氰酸酯、若丹明、丹磺醯氯(dansyl chloride)、藻紅素(phycoerythrin)、四甲基若丹明異硫代氰酸酯、近紅外線螢光材料等之螢光物質，於CLIA法使用以螢光素酶(luciferase)、螢光素(luciferin)、水母素(aequorin)等之發光物質進行標識之抗體。此外，可檢測以金膠體、量子點等之奈米粒子等標識之抗體。
且，於免疫分析，抗TMEM-180抗體亦可藉生物素標識，結合以酵素等標識之抗生物素蛋白(avidin)或鏈親和素(streptavidin)而檢測。
免疫分析中，使用酵素標識之ELISA法可簡便且迅速度測定抗原。
ELISA法有競爭法與三明治法。於競爭法，係將抗 TMEM-180抗體或其抗原結合片段固定於微盤等之固相擔體上，添加試料與經酵素標識之TMEM-180，發生抗原抗體反應。暫時洗淨後，與酵素基質反映，顯色，並測吸光度。試料中之TMEM-180若多則顯色變弱，試料中之TMEM-180若少則顯色變強，因此使用檢量線可求出TMEM-180量。
於三明治法，係將抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段固定於固相擔體，添加試料並反應後，進而添加以酵素標識之辨識另一表位(epitope)之抗TMEM-180抗體並反應。洗淨後，與酵素基質反應、顯色，並測定吸光度，可求出TMEM-180量。三明治法中，亦可於固定於固相擔體之抗體與試料中之TMEM-180反應後，添加非標識抗體(一次抗體)，使對於該非標識抗體之抗體(二次抗體)進行酵素標識進而添加。
酵素基質於酵素為過氧化物酶時，可使用3,3’-二胺基聯苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、鄰-苯二胺(OPD)等，為鹼性磷酸酶時，可使用對-硝基苯基磷酸酯(NPP)等。
或者，亦可將試料中之TMEM-180抗原直接固定於微滴定盤等之固相擔體上，進行必要之阻斷後，添加非標識抗體(一次抗體)，使對於該非標識抗體之抗體(二次抗體)進行酵素標識進而添加。
本說明書中之「固相擔體」若為可固定抗體之擔體則未特別限定，但舉例為玻璃製、金屬性、樹脂製等 之微滴定盤、基板、珠粒、硝基纖維素膜、奈米膜、PVDF膜等，標的物質可依據習知方法固定於該等固相擔體。
又，免疫分析中，作為可簡便地檢測微量蛋白質之方法亦較佳為凝集法。作為凝集法舉例為例如於抗體結合乳膠粒子之乳膠凝集法。
於乳膠粒子結合抗TMEM-180抗體並混合於經適當處理之試料中時，若存在TMEM-180，則抗體結合乳膠粒子凝集。因此，對樣品照射近紅外線，藉由測定吸光度(比濁法)或測定光散射(比朧法)定量凝集塊，可求出抗原濃度。
作為抗TMEM-180抗體或其抗體結合片段亦可使用具有上述CDR序列之本發明之抗TMEM-180抗體或其抗體結合片段。
本發明之癌之檢查用套組係用以使用上述檢查方法進行癌之檢查之套組，且包含抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段。本發明之癌之檢查用套組除了抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段以外，亦可包含用以藉由免疫分析測定試料中之TMEM-180量之必要試藥或裝置。
檢查用套組之一樣態包含用以藉由三明治法測定TMEM-180者的微滴定盤；捕捉用之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段；以鹼性磷酸酶或過氧化物酶標識之抗TMEM-180抗體或其抗原結合片段；及鹼性磷酸酶基質(NPP等)或過氧化物酶之基質(DAB、TMB、OPD等)。
捕捉用抗體與標識抗體係辨識不同之表位。
藉由如上述之套組，首先將捕捉用抗體固定於微滴定盤上，於其中適當稀釋試料並添加後進行培育，去除試料進行洗淨。其次，添加經標識之抗體後進行培育，添加基質進行顯色。使用微滴定盤讀取機等測定顯色，藉此可求出TMEM-180量。
檢查用套組之其他樣態包含使用二次抗體用以藉由三明治法測定TMEM-180者的微滴定盤；捕捉用之抗TMEM-180抗體；作為一次抗體之抗TMEM-180抗體；作為二次抗體之以鹼性磷酸酶或過氧化物酶標識之抗TMEM-180抗體；及鹼性磷酸酶(NPP等)或過氧化物酶之基質(DAB、TMB、OPD等)。
捕捉用抗體與一次抗體係辨識不同之表位。
藉由如上述之套組，首先將捕捉用抗體固定於微滴定盤上，於其中適當稀釋試料並添加後進行培育，去除試料進行洗淨。接著，添加一次抗體進行培育及洗淨，進而添加經酵素標識之二次抗體進行培育後，添加基質進行顯色。使用微滴定盤讀取機等測定顯色，藉此可求出TMEM-180。藉由使用二次抗體，可提高反應經擴增之檢測感度。
檢查用套組進而依據需要亦可含有緩衝液、酵素反應停止液、微盤讀取機等。
標識抗體不限定於酵素標識之抗體，亦可為以放射性物質(25I、131I、35S、3H等)、螢光物質(螢光異硫 代氰酸酯、若丹明、丹磺醯氯、藻紅素、四甲基若丹明異硫代氰酸酯、近紅外線螢光材料等)、發光物質(螢光素酶、螢光素、水母素等)、奈米粒子(金膠體、量子點)等標識之抗體。且作為標識抗體亦可使用生物素化抗體，於套組中添加經標識之抗生物素蛋白或鏈親和素。
檢查用套組之進而另一樣態亦舉例為藉由乳膠凝集法測定TMEM-180量者。該套組包含抗TMEM-180抗體敏化乳膠，與試料及抗TMEM-180抗體混合，以光學方法定量凝集塊。套組中亦較佳包含凝集反應可視化之凝集反應盤。
本說明書中引用之所有專利文獻及非專利文獻之揭示全文藉由參考併入本文中。
[實施例]
以下基於實施例具體說明本發明，但本發明絕不由該等所限定。本技藝者在不脫離本發明意義下可將本發明變更為各種樣態，該變更亦包含於本發明範圍。
實施例1.TMEM-180分子之鑑定
1)DNA微陣列解析
使用5種人類大腸癌細胞株(HT29、SW480、LOVO、HCT116、DLD-1)與2種源自人類健康者之源自游離大腸細胞之mRNA各10μg。依據製造商(Affymetrix)之指示自RNA經由雙鏈cDNA合成生物素標識之cRNA。斷片化 後，進行基因晶片人類基因組U133+2.0分析(Affymetrix)及雜交。使用基因晶片掃描器3000 7G(Affymetrix)進行掃描，取得CEL數據後進行統計處理，算出各樣品之訊號值。選出TMEM-180作為於5種人類大腸癌細胞株見到表現，於2種健康者大腸細胞未見到表現之大腸癌細胞特異之表面標記(圖1A)。
2)定量性PCR法
針對5人之大腸癌患者手術標本，以ABI7500Fast(Applied Biosystems)解析將鄰接正常大腸組織作為陰性對照組之大腸癌細胞組織樣品cDNA(Clontech)。20μL之反應液係使用10μL 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、1μL 20X TaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems)。且快速運行係以AmpliTaq金酵素活化95度、20秒、40循環；變性95度、3秒；黏合/延長(anneal/extend)62度、30秒之條件進行。以7500 Fast System SDS軟體版本1.3解析。針對各病症例，計算大腸癌組織之RNA量對於正常組織之RNA量之比之結果示於圖1B。確認任一病症例中TMEM-180於大腸癌組織中表現比正常大腸組織中更強。
3)原位雜交法
大腸癌組織石蠟切片(Genostaff Co.Ltd.)以二甲苯脫 蠟處理後，以乙醇、PBS進行水合。切片以4%仲甲醛．PBS固定15分鐘。以包含7μg/ml蛋白酶K(Roche)之PBS處理後，再次以4%仲甲醛．PBS固定。以0.25%乙酸酐0.1M TrisHCl pH8.0進行乙醯化。以PBS洗淨後，以乙醇脫水。與300ng/ml之地高辛(digoxigenin)標識之TMEM-180之RNA探針(475bp，GeneBank註冊編號NM_024789之基因序列第1314至1789號，Genostaff Co.Ltd.)在60度進行16小時之雜交反應。洗淨後以50μg/ml RNaseA‧10mM TrisHCl PH8.0‧0.1M NaCl‧1mM EDTA處理。再洗淨後，使用0.5%阻斷反應液(Roche)反應後，以添加20%熱處理羊血清(Sigma)之阻斷反應液反應1小時。添加AP標識抗DIG抗體(Roche)，於室溫進行2小時反應。洗淨後於NBT/BCIP液(Roche)中進行顯色。封入後以顯微鏡進行觀察之結果示於圖1C及D。確認TMEM-180於5種大腸癌組織中全部為陽性，於正常大腸黏膜為陰性。
實施例2. TMEM-180於正常組織之表現解析
藉由公開資料庫PaxDB；當代絕對蛋白質富集資料庫(a comprehensive absolute protein abundance database)http：//pax-db.org/#！home(藉由對各蛋白質以LC/MS/MS解析特異胜肽，而測定其表現程度)，以TMEM-180進行檢索調查於各正常組織之測定值。除TMEM-180以外，亦調查以下分子之表現作為對照。
β肌動蛋白(βACT)(管家(housekeeping)分子)
甘油醛3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)(管家分子)
上皮成長因子受體(EGFR)(抗體醫藥之標的分子)
HER2(抗體醫藥之標的分子)
癌胎兒性抗原(CEA)(代表之腫瘤標記分子)
於Excel(2010，微軟)檔案中輸入數據作成圖表之結果示於圖2。TMEM-180於正常中幾乎未表現(圖2A)，若提高感度則於血小板稍見到表現，但遠少於往之抗體醫藥的標的分子的EGFR或HER2(圖2B)，確認TMEM-180對癌組織特異地表現。
實施例3.抗體製作及對各種癌細胞之FACS
1)抗原製作
[PCR反應]
對於被編入pET21b之tag序列，使用以下引子進行PCR擴增。使用PCR酵素：PrimeStar HS DNA聚合酶(takara R010A)
免疫抗原1 製作用引子序列
(i)cagacctgcacctgaacgtggttgagagctgaggaattgacggtcactgagggactgtaatgctgcacttcgc(序列編號：18)
(ii)caaccacgttcaggtgcaggtctgtcttcacgtgctgttgtactggctcgtgttcaagagttcaaactggaggacctg(序列編號：19)
(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列編號：20)
(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列編號：21)
免疫抗原2 製作用引子序列
(i)gcgaagtgcagcattacagtccgatcatctgagtctgctgtgcctcttcattgc(序列編號：22)
(ii)caggtcctccagtttgaactcagaagctgcttgcttacgatgattcagcaccaggtcctcgtctac(序列編號：23)
(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列編號：24)
(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列編號：25)
[限制酵素處理]
對於表現用載體pET21b及PCR產物，依據製造商協定使NdeI(takara)、XhoI(takara)反應2小時，進行1%瓊脂膠電泳後，使用promega wizard SV gal及PCR淨化系統套組進行純化。
[連接(ligation)反應]
使用Ligation high(toyobo)使載體與插入物(insert)反應30分鐘。
[轉形]
使用Competent High DH5 α(toyobo)進行轉形，以LB培養基(50μg/mL)盤進行培養
[基因確認]
自經轉型之大腸菌抽出質體，進行序列解析確認目的序列。
[轉形(大腸菌)]
以插入有目的序列之質體對BL21(DE3)進行轉形。
[培養]
於10mL之LB培養基中植入菌，並於37℃培養16小時之培養基更換為1L之LB培養基，於37℃培養。於 OD600nm之值成為0.6後，以成為終濃度1mM之方式添加IPTG，進而培養4小時。
[純化]
將菌體經破碎之大腸菌之沉澱以50mM Tris-HCl,500mM NaCl,6M GdnHCl懸浮，搖晃16小時回收樣品之上澄液，並以鎳管柱純化。
[再摺疊(refolding)]
由於為了以6M GdnHCl溶解而使目的抗原變性，故以透析法進行再摺疊(蛋白質之回捲)。
再摺疊條件係以如下步驟進行。
(1)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,3M GdnHCl；6h
(2)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,2M GdnHCl；6h
(3)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1M GdnHCl；12h
(4)50mM Tris-HCl pH8.5,500mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,0.5M GdnHCl；12h
(5)50mM Tris-HCl pH8.5,150mM NaCl,50mM L-Arg；6h
(6)50mM Tris-HCl pH8.5,150mM NaCl,50mM L-Arg；6h
對於上述樣品使用超過濾膜(Amicon-Ultra 10K)置換為50mM磷酸緩衝液pH8.0，500mM NaCl。
[CD測定]
用以確認經再摺疊之免疫抗原是否保持立體構造係使用圓2色性分散器(日本分光J-725)，確認為接近理論值之螺旋含量。
2)抗體製作
將以PBS稀釋為100μg/mL之免疫抗原1或免疫抗原2與Freund完全佐劑以1：1混合而調製之乳液以每次100μL投予至大鼠(日本SLC，Wister，雌性，6~8週齡)尾根部兩側。免疫12天~13天後使用自大鼠尾靜脈採血調製之抗血清，以免疫抗原作為固相之ELISA或對於DLD-1細胞及K562細胞以流式細胞儀評價血清抗體價，選擇細胞融合所用之個體。免疫14天後，自選擇之個體摘出腸骨淋巴結、鼠蹊部淋巴結、腋下淋巴結及膝下淋巴結，以PEG法將淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞p3X63融合。融合10天~14天後，回收培養上澄液，以流式細胞計選擇於DLD-1細胞顯示陽性，於K562細胞顯示陰性之抗體產生融合瘤細胞。選擇之抗體產生融合瘤細胞以極限稀釋法單選殖化並樹立。抗體之等型以等型特異之ELISA(Bethyl)判定。
經單選殖化之選殖株為98選殖株、101選殖株、212選殖株(以上IgM抗體)、129選殖株、382選殖株、1361選殖株(以上IgG抗體)、669選殖株、699選殖株、1052選殖株、1105選殖株(以上IgM抗體)。本說明書中，自選殖株編號x之選殖株獲得之抗體有時稱為x抗體。
3)流式細胞計
將成為測定對象之癌細胞懸浮於培養基中，以成為1×105個/孔之方式添加於V底96孔盤(corning)中。盤以 440×g、4℃、3分鐘離心後，去除上澄液，於細胞顆粒中以50μL/孔添加抗體產生融合瘤培養上澄液或抗體溶液並懸浮。於冰上反應45分鐘後，以0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200μL/孔洗淨3次。去除上澄液，於細胞顆粒中以50μL/孔添加二次抗體並懸浮。作為二次抗體使用以0.1%BSA/2mM EDTA/PBS將AlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L)(Life Technologies)稀釋400倍者。於冰上反應45分鐘後，以0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200μL/孔洗淨3次。去除上澄液，於細胞顆粒中以250μL/孔添加50ng/mL碘化丙啶(Propidium Iodide)/0.1%BSA/2mM EDTA/PBS並懸浮。如此染色之細胞使用Guava easyCyte 8HT(Merck Millipore)等之流式細胞計進行測定，所得數據以FlowJO(TOMY DIGITAL BIOLOGY)進行解析。於FACS使用大腸癌、腦腫瘤、血液系腫瘤進行解析。
取得之抗TMEM-180IgM抗體之FACS解析結果示於圖3。98選殖株於6種大腸癌全部及4種腦腫瘤全部均為陽性，101選殖株於4種大腸癌為陽性，於腦腫瘤全部為陰性。212選殖株於6種大腸癌全部為陽性，於腦腫瘤僅1種為陽性。任一選殖株對血液系腫瘤全部為陰性。
實施例4. 對於DLD-1大腸癌細胞之螢光免疫染色
以成為5×103個/孔之方式於96孔盤(Corning，CellBIND)中添加DLD-1細胞，並培養2天者供於細胞染 色。細胞之固定/透過處理如下述般進行。以200μL/孔之PBS洗淨細胞培養盤2次後，去除洗淨液，於冰冷卻下以100μL/孔添加經添加有0.1%量之Triton X-100(Wako)之4%仲甲醛．磷酸緩衝液(Wako)固定10分鐘。去除固定液，以PBS 200μL/孔洗淨一次，以1%FBS/PBS 200μL/孔洗淨一次，作成細胞固定盤。細胞染色如下述般進行。自未固定之細胞培養盤去除培養基，自細胞固定盤去除洗淨液，以50μL/孔添加抗體產生融合瘤培養上澄液或抗體稀釋液。於冰上反應1小時後，以PBS 200μL/孔洗淨1次，以1%FBS/PBS 200μL/孔洗淨2次。去除洗淨液，以50μL/孔添加5μg/mL AlexaFluor647羊抗-大鼠IgG(H-L)/2μg/mL Hoechst 33342/1%FBS/PBS。於冰上反應1小時後，以PBS 200μL/孔洗淨2次。以50μL/孔添加PBS，以ArrayScan(Thermo Scientific)進行測定。
抗TMEM-180抗體之98、101及212選殖株之螢光免疫染色結果示於圖4。98選殖株於膜中心被染色。101及212之螢光強度比98選殖株弱，細胞質亦染色。
實施例5. 利用抗TMEM-180抗體於DLD-1母株與TMEM-180基因剃除株中之FACS
1)基因剃除細胞之製作
[轉染]
以0.5mL之Opti-MEM(invitrogen)稀釋Sigma CRISPR/Cas9 System(HS0000468201)質體2.5μg，添加 Lipofectionamine LTX 11μL。於室溫靜置30分鐘後，於DLD1細胞(6.25×10^5細胞/孔6孔盤(corning))中添加DNA-Lipofection調整液。
[GFP表現細胞之選擇]
對於轉染後培養2天之細胞，使用FACSAria細胞分選儀(BD)僅取得GFP表現細胞。
[選殖]
培養GFP表現細胞，確認未進行GFP之表現後以96孔盤進行超稀釋。對於細胞之選殖為單一之孔，以PureLink Genomic DNA迷你套組(Invitrogen)純化基因組，確認目的序列，而判定基因剃除細胞。
2)流式細胞計
流式細胞計之順序根據上述3.1。作為一次抗體之98選質株大鼠IgM抗體係將抗體產生融合瘤培養上澄液稀釋為1μg/mL而使用。作為陰性對照組之356選質株IgM抗體係將抗體產生融合瘤培養上澄液稀釋為1μg/mL而使用。98選殖株大鼠-人類嵌合化抗體係將嵌合化抗體恆定表現細胞之培養上澄液稀釋為2倍而使用。作為陽性對照組之大鼠抗人類組織因子抗體選殖株hTF1849、大鼠抗人類EpCAM抗體選殖株B8-4、小鼠抗人類CD44v6抗體選殖株2F10(MBL)、小鼠-人類嵌合化抗EGFR抗體(商品名 Erbitux)分別稀釋為1μg/mL使用。各抗體之稀釋係使用RPMI/FBS10%。又融合瘤培養上澄液中之抗體濃度以大鼠IgM特異之ELISA(Bethyl)測定。且對應於一次抗體之由來，作為二次抗體之AlexaFluor647羊抗-大鼠IgG(H．L)、AlexaFluor647羊抗-人類IgG(H+L)或AlexaFluor647羊抗-小鼠IgG(H+L)(Life Technologies)之任一者係以0.1%BSA/2mM EDTA/PBS稀釋為400倍而使用。
3)人類嵌合抗體之製作
自融合瘤細胞株萃取出全RNA，使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(takara)，使用5'末端RACE(cDNA端之快速擴增)法合成抗體H鏈之可變區域與L鏈之可變區域之cDNA。
對於合成之cDNA，以PCR擴增，以pUC19(Invitrogen)進行選殖。H鏈之可變區域與L鏈之可變區域示於後述表3~22。
H鏈及L鏈之可變區域以PCR擴增後，H鏈之可變區域插入編入有恆定區域之pQCxIP(Clontech)，L鏈之可變區域插入編入有恆定區域之pQCxIH(Clontech)，完成表現載體。表現載體使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)對293T細胞進行轉染。人類IgG1型抗體TMEM-180抗體恆定表現細胞株以嘌呤黴素(puromycin)(Sigma)10μg/mL與潮黴素(Hygromycin)B(Invitrogen)1μg/mL進行藥劑選擇，藉由取得兩抗藥性株 而樹立。樹立細胞株以DMEM(Sigma)10%FBS、1%盤尼西林-鏈黴素(Invitrogen)、嘌呤黴素10μg/mL、潮黴素B 1mg/mL進行維持培養。
使用98選殖株大鼠IgM抗體與人類嵌合IgG抗體，進行於大腸癌DLD-1母株與TMEM-180基因剃除株之FACS。結果示於圖5。98選殖株大鼠IgM抗體及人類嵌合IgG1抗體均於基因剃除細胞顯示顯著之左方位移。以使用作為對照組之抗組織因子抗體、抗EpCAM抗體、抗CD44v6抗體、抗EGFR抗體之FACS，於母株及基因剃除株並無差。此顯示98選殖株大鼠IgM抗體與人類嵌合IgG1抗體均可特異地辨識TMEM-180。
實施例6. 人類大腸癌手術標本福馬林固定切片中之抗TMEM-180抗體之免疫染色
使抗TMEM-180 IgM抗體(98選殖株)1μg/mL對於大腸癌福馬林固定石蠟切片進行反應。2次抗體係使用HRP標識抗大鼠抗體，以DAB顯色，以蘇木精(haematoxylin)進行後染色。結果示於圖6。大腸癌經特異染色。不僅大腸癌之膜被染色，細胞質亦被染色。
實施例7. 抗TMEM-180IgM抗體之殺細胞效果
DLD-1細胞及K562細胞以1×103個/100μL/孔添加於96孔盤中，培養24小時。自96孔盤之各孔移除培養基50μL，以50μL/孔添加抗體濃度調製為80μg/mL、 20μg/mL、5μg/mL之98選殖株大鼠IgM抗體產生融合瘤培養上澄液或101選殖株大鼠IgM抗體產生融合瘤培養上澄液。且各培養條件之n數設為3，準備僅添加培養基之孔作為對照。培養96小時後，以10μL/孔添加WST-8(同仁化學，Cell Counting Kit-8)，培養3小時後，以微盤讀取機測定450nm之吸光度。將抗體濃度設為橫軸，將僅添加培養基之孔的吸光度設為1時之各抗體濃度之吸光度之相對值進行作圖。結果示於圖7及圖8。98選殖株及101選殖株均僅於大腸癌DLD-1細胞顯示殺細胞效果，於血液腫瘤K562未顯示殺細胞效果。其他之大腸癌細胞之DiFi、Carl、SW480、Colo201亦見到殺細胞效果。且，腦腫瘤LN229及乳癌MCF7亦見到同樣效果。預測於血液腫瘤以外之廣泛癌具有效果。
實施例8. 各選殖株之可變部基因序列與CDR決定
1)全部RNA之萃取
使用RNeasy迷你套組(QIAGEN)自產生各抗體之融合瘤萃取全部RNA。
2)cDNA之製作
使用上述所得之全部RNA，使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(takara)，使用使用5'末端RACE(cDNA端之快速擴增)法合成cDNA。
3)抗TMEM-180抗體基因之選殖
使用PrimeStar HS DNA聚合酶(takara)對於上述cDNA擴增目的基因。使用擴增條件為變性98℃、10秒；黏合/延長72℃、90秒、5次循環；變性98℃、10秒；黏合67℃、5秒；延長72℃、90秒、5次循環；變性98℃、10秒；黏合62℃、5秒；延長72℃、90秒、25次循環之地檢PCR(touchdown PCR)法。
PCR裝置：Takara PCR Thermal Cycler Dice Gradient
使用之引子序列
H鏈用
正向引子：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列編號：26)
正向引子：CTAATACGACTCACTATAGGGC(序列編號：27)
反向引子：CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG(序列編號：28)
L鏈用
正向引子：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列編號：29)
正向引子：CTAATACGACTCACTATAGGGC(序列編號：30)
反向引子：GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA(序列編號：31)
擴增之H鏈及L鏈之PCR產物使用T4聚核苷酸激酶(takara)磷酸化。使用Ligation High(TOYOBO)試藥將磷酸化之PCR產物插入於在SamI位點經切斷之pUC19(invitrogen)。插入後，以DH5α(TOYOBO)進行轉形，使用質體迷你套組(QIAGEN)自發訊菌落萃取出質 體。
4)基因之解析
使用ABI PRISM 3100基因分析儀對選殖之H鏈、L鏈之各基因解析基因之鹼基序列。各選殖株之H鏈可變區域及L鏈可變區域之序列示於表3~22。
98選殖株H鏈(序列編號：13)
1361選殖株L鏈(序列編號：71)
669選殖株L鏈(序列編號：79)
實施例9. 測定TMEM-180量之癌之檢查方法
1)ELISA協定
首先，以下實施例所用之ELISA法之協定示於以下。
(試藥)
使用以下試藥。
96孔盤 C8 Maxi breakapart(NUNC #473768)
盤洗淨液 PBS/0.05% Tween 20
阻斷液 PBS/1% BSA
抗體稀釋液 PBS/0.05% Tween 20/1% BSA
一次抗體 IgM 98(融合瘤培養上澄液)
二次抗體 多株兔抗-大鼠免疫球蛋白/HRP(Dako #P0450)
顯色液 1-步驟緩慢TMB-ELISA受質(Thermo Scientific #34024)
停止液 2N H2SO4
(順序)
遵循以下順序。
(i)抗原固相化
將50μl/孔之細胞培養液上澄液或人類血漿(1/10稀釋與1/50稀釋)添加於96孔盤中，於4℃培育一夜。
(ii)阻斷
藉由200μl/孔之盤洗淨液，重複5次之完成固相化之盤的洗淨。以200μl/孔之阻斷液阻斷，於室溫培育1小時。
(iii)一次抗體反應
藉由200μl/孔之盤洗淨液，重複5次之完成固相化之盤的洗淨。以100μl/孔添加10μg/ml之IgM98抗體，於室溫培育1小時。
(iv)二次抗體反應
藉由200μl/孔之盤洗淨液，重複5次之完成固相化之 盤的洗淨。以100μl/孔添加經4000倍稀釋之二次抗體液，於室溫培育1小時。
(v)顯色．停止
藉由200μl/孔之盤洗淨液，重複5次之完成固相化之盤的洗淨。添加100μl/孔之顯色液，於室溫培育15分鐘。添加100μl/孔之停止液。
(vi)測定
反應停止後，測定450nm之吸光度。
2)癌細胞培養上澄液中之TMEM-180蛋白質量之測定
(TMEM-180強制表現株之製作)
將編入有人類TMEM180 cDNA(NM_024789.2)之質體RC219636(Origen)，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)，對DLD1細胞進行轉染。人類TMEM180表現細胞株以600μg/mL基因素(geneticin)(Invitrogen)進行藥劑選擇，取得抗藥性株。對於所得抗藥性株進行超稀釋，對於各發訊選殖株確認進行FACS之抗體之反應。所得細胞株以D-MEM(wako)、10%FBS、1%盤尼西林、鏈黴素、兩性黴素(amphotericin)B(wako)、600μg/mL基因素(Invitrogen)進行維持培養。
(TMEM180基因剃除細胞株之製作)
TMEM180基因剃除細胞株係分別對於自美國菌種中心(American Type Culture Collection)(ATCC,Manassas、VA)購入之大腸癌細胞株DLD1、HCT116、HCT15及Colo320，使用MISSIONTM shRNA Lentiviral Transduction Particles(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)，依據說明書製作。使用TaqMan(R)Gene Expression Assays(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)，進行定量性PCR，確認TMEM180基因表現之降低(基因剔除)。
(癌細胞培養上澄液中之TMEM-180蛋白質量之測定)
培養大腸癌細胞DLD-1株之TMEM-180強制表現株、母株及TMEM-18基因剃除株，成為大致融合(confluent)狀態後，以PBS洗淨。置換為無血清DMEM培養基，培養一夜，翌日回收培養上澄液。將該上澄液作為樣品抗原於96孔盤中固相化，以1)之方法進行ELISA。且腦腫瘤株LN229亦進行同樣實驗。
結果示於圖9。與正常(僅培養基)對照組相比，所有樣品中TMEM-180顯示較高值。大腸癌DLD-1中依強制表現株、母株、基因剃除株之順序顯示較高值。腦腫瘤亦顯示較高值。
3)IV期大腸癌患者血漿中之TMEM-180蛋白質量之測定
將EDTA採血之人類血漿(IV期之4例與正常)稀釋為 1/10及1/50後，將其作為樣品抗原於96孔盤中固相化，以1)之方法進行ELISA。
結果示於圖10。與正常血漿相比，所有患者樣品中均顯示較高值。且於CEA陰性的患者#2與#4中，血漿TMEM-180亦顯示陽性(比正常高的值)。
4)III期大腸癌患者之術前．術後之血漿中TMEM-180蛋白質量之測定
以與3)相同方法，對III期大腸癌患者之術前術後之血漿測定TMEM-180蛋白質量。
結果示於圖11。所有患者中，TMEM-180值與術前相比，於術後降低。
5)測定III、II、IV及IIIa期之大腸癌患者之手術前後、及再復發時之血漿中TMEM-180蛋白質量與大腸癌腫瘤標記CEA。TMEM-180之測定係使用669選殖株與1361選殖株以三明治ELISA法進行。TMEM-180之臨界值係設為藉由與患者樣品同樣之ELISA法測定之8人分之正常血漿中之值的平均。CEA之臨界值係設為國立研究開發法人國立癌研究中心所採用之正常值。
結果示於圖12。於II期患者，術前CEA值為陰性，相對地TMEM-180顯示陽性。且，IIIa期患者，即使於CT確認到再復發之時點，CEA值仍為陰性，但TMEM-180再次上升。
實施例A10. 各選殖株之癌檢出頻度之比較
以上述實施例所得之單株抗體(669抗體、1052抗體、1105抗體及1361抗體)試驗癌之檢出率。
本實施例藉由FACS對自ATCC及JCRB取得之源自各癌之細胞株之反應性進行調查。結果如下述表23所示。
如表23所示可了解，任一選殖株產生之抗體均可確實地辨識組織檢體中之癌。且了解1361抗體可以最高感度檢出各種癌。
其次，使用人類各種組織檢體，試驗由各種抗體之癌檢出頻度。人類之組織檢體係作為自被診斷為已罹患癌之人類所得之癌組織檢體。依據常用方法自組織檢體 以與上述實施例6同樣製作石蠟切片，使上述單株抗體1μg/mL反應。2次抗體係使用HRP標識抗大鼠抗體，以DAB顯色，蘇木清染色後進行觀察。1361抗體，於正常組織係藉由常用方法以免疫組織學染色對皮膚、腦、小腸、肝臟、心臟、肺及腎臟之正常組織進行染色，任一正常組織均為陰性。相對於此，EGFR阻斷藥的西妥昔單抗對於正常皮膚顯示強的陽性反應。圖13中，顯示1361抗體及西妥昔單抗對於皮膚之反應性差異。且圖14中顯示皮膚以外之組織的免疫組織學染色之結果。
於西妥昔單抗對於正常皮膚顯示強的反應性，係與已報導皮膚障礙為副作用為一致之結果。相對於此，1361抗體由於對於皮膚之反應性低，故可期待大為減低此等副作用。
實施例A11. 1361選殖株之改變體之製作與評估
使用反向PCR法將部位特異之變異導入重鏈或輕鏈之CDR中，製作1361改變選殖株。
(1)1361改變選殖株之製作
具體而言，基於使用正向引子(序列編號：183)及反向引子(序列編號：184)之反向PCR法(例如Ochman,H.et al.,Genetics,120(3)：621-623,1988)，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(takara,R045A)，導入使位於1361選殖株之重鏈CDR2之酪胺酸取代為丙胺酸之Y78A之1個胺 基酸取代。以同樣方法，製作其他於CDR導入胺基酸變異點之22株1361改變選殖株。例如改變體1361-7係導入將1361抗體之第82號絲胺酸進行丙胺酸取代之S82A之1個胺基酸取代者，此時之改變用PCR引子為正向引子(序列編號：185)，及反向引子(序列編號：186)。導入後，針對所得選殖株，使用ABI PRISM 3100基因分析儀確認抗體基因序列與變異導入。改變選殖株係依據上述實施例5之3)記載之方法，製作人類嵌合抗體。以下，導入使位於1361選殖株之重鏈CDR2之酪胺酸取代為丙胺酸之Y78A之1個胺基酸取代，將人類嵌合化選殖株稱為「1361-5選殖株」，自該選殖株產生之抗體稱為「1361-5抗體」。1361-5抗體為IgG1抗體。
(2)藉由流式細胞計之抗體結合性評價
將於上述實施例9製作之大腸癌細胞DLD-1株之TMEM-180強制表現株、母株及TMEM-18基因剃除株予以培養，藉以下評價該等癌細胞與所得1361-5抗體之結合性。使用K562細胞作為陰性對照。
將成為測定對象之癌細胞懸浮於培養基中，以成為1×105個/孔之方式添加於V底96孔盤(corning)中。將盤於440×g、4℃離心3分鐘後，去除上澄液，於細胞顆粒中以50μL/孔添加抗體溶液並懸浮。一次抗體之最終濃度為1μg/mL或0.1μg/mL。於冰上反應45分鐘後，以0.1% BSA/2mM EDTA/PBS 200μL/孔洗淨3次。去除上澄 液，於細胞顆粒中以50μL/孔添加二次抗體並懸浮。作為二次抗體係使用以0.1%BSA/2mM EDTA/PBS將AlexaFluor647羊抗-人類IgG(H-L)(Life Technologies)稀釋為400倍者。於冰上反應45分鐘後，以0.1% BSA/2mM EDTA/PBS 200μL/孔洗淨3次。去除上澄液，於細胞顆粒中以200μL/孔添加50ng/mL碘化丙啶/0.1%BSA/2mM EDTA/PBS並懸浮。將如此染色之細胞使用Guava easyCyte 8HT(Merck Millipore)等之流式細胞計測定，所得數據以FlowJO(TOMY DIGITAL BIOLOGY)進行解析。結果如圖15及圖16所示。
如圖15及圖16所示，1361-5抗體依存於TMEM-180辨識DLD-1株。且1361-5抗體無法辨識K562細胞。
所製作之其他22株選殖株係於重鏈CDR導入變異之14株選殖株中，4株選殖株對抗原之結合性減低，於輕鏈CDR導入變異之8株選殖株中，3株選殖株對抗原之結合性減低，其餘選殖株對於1361-5與TMEM-180之結合性大致相等。且，維持了對於TMEM-180之結合性的改變體(例如1361-7選殖株)中對於正常間質之反應性與1361抗體大致相等。另一方面，1361-5抗體於對於1361抗體及TMEM-180之結合性或癌之辨識中，未見到差異，但對於正常間質之反應性比1361抗體及其他改變體更減低，就對癌之結合性及特異性之方面而言顯示為更佳的抗體。
實施例B11-2. 抗體之ADCC活性之檢討
1361-5抗體認為由於IgG之亞型而具有高的ADCC活性。本實施例中，檢討1361-5抗體之ADCC活性。且，本實施例中，製作Fc改變體，檢討該改變體之ADCC活性。具體而言係如下。
使用逆向PCR法於重鏈之Fc部位導入部位特異之變異，製作1361-5選殖株之Fc改變體。
1)1361-5 Fc改變選殖株FcDLE之製作
具體而言，基於使用正向引子(序列編號：A1、B1)及逆向引子(序列編號：A2、B2)之逆向PCR法(例如Ochman,H.et al.,Genetics,120(3)：621-623,1988)，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(takara,R045A)，導入位於1361-5選殖株之Fc之S239D/A330L/I332E的3重胺基酸取代。
以下將本改變體稱為改變體1。
2)1361-5 Fc改變選殖株FcDEA之製作
具體而言，基於使用正向引子(序列編號：187、189或191)及逆向引子(序列編號：188、190及192)之逆向PCR法(例如Ochman,H.et al.,Genetics,120(3)：621-623,1988)，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(takara,R045A)，導入位於1361-5選殖株之Fc之S239D/I332E/ E333A的3重胺基酸取代。
以下將本改變體稱為改變體2。
序列編號：187(Fc_S239D_Fw)GGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCA
序列編號：188(Fc_S239D_Rv)GAAGACGTCCGGTCCCCCCAGGAGTTC
序列編號：189(Fc_A330L_I332E_Fw)CCACTGCCCGAGGAGAAAACCATCTCC
序列編號：190(Fc_A330L_I332E_Rv)CTCCTCGGGCAGTGGGAGGGCTTTGTT
序列編號：191(Fc_I332E_E333A_Fw)CCCGAGGCCAAAACCATCTCCAAAGCC
序列編號：192(Fc_I333E_E333A_Rv)GGTTTTGGCCTCGGGGGCTGGGAGGGC
3)ADCC活性之檢討
ADCC係以西妥昔單抗作為陽性對象，針對1361-5抗體、改變體1及改變體2進行調查。
具體而言，使用TK176V(FcγRIII安定表現之自然殺手細胞株)作為效應子細胞。TK176V係獲自一般財團法人化學物質評價機構。且作為標的細胞係使用DLD-1之野生型細胞。
TK176V以含有10ng/mL IL-2及10% FBS之RPMI1640培養基培養。繼代係每2~3天以新的培養基稀釋。繼代每2~3天以胰蛋白酶處理剝離細胞，懸浮於新的培養基並接種於皿中。
ADCC活性之測定係如下進行。
首先，作為陰性對照，係測定僅以標的細胞與培養基培養時之51Cr釋出量(稱為自發釋出測定)，作為陽性對照係測定於標的細胞中添加0.1% Triton X-100並傷害全細胞時之51Cr釋出量(稱為最大釋出測定)。
1)以50μCi之51Cr標識之DLD-1 WT以5,000細胞/50μL/孔添加於96孔U底盤中
2)以200,000細胞/50μL/孔添加TK176V(ET比：40)於自發釋出測定用孔及最大釋出測定用孔中以50μL/孔添加培養基
3)以100μL/孔添加最大濃度2,000ng/mL、公比5之連續稀釋之7種濃度之抗體(反應中抗體最終濃度：0、0.064、0.32、1.6、8、40、200或1,000ng/mL)
4)於自發釋出測定孔中以100μL/孔添加培養基，於最大釋出測定孔中以100μL/孔添加0.2% Triton X-100
5)盤經離心(250×g，4分鐘)後，於37℃培養4小時
6)盤經離心(250×g，4分鐘)
7)將上澄液50μL/孔移至測定管中
8)以γ計數器測定各管之放射線量(CPM)
9)自以下之式算出細胞傷害活性及ADCC活性
式1：細胞傷害活性(%)=(各管CPM-自發釋出CPM平均值)÷(最大釋出CPM平均值-自發釋出CPM平均值)×100
式2：ADCC活性(%)=抗體添加時之細胞傷害活性-抗體非添加時之細胞傷害活性
10)使用解析軟體Prism算出各抗體之50%有效濃度(EC50)
結果如圖20A~D所示。如圖20A所示，利妥昔單抗對於DLD-1之野生型細胞顯示強的ADCC活性。相對於此，如圖20B所示，1361-5抗體對於DLD-1之野生型細胞顯示比利妥昔單抗更強的ADCC活性。且，如圖20C及D所示，改變體1及2顯示與1361-5抗體同等或其以上之ADCC活性。對於TMEM-180陰性細胞並未顯示ADCC活性。
由此確認1361-5抗體及其改變體具有ADCC活性。
實施例B11-3. 活體內腫瘤模型之抗TMEM-180抗體之效果
本實施例係使用小鼠基因剃除模型(人類大腸癌細胞株DLD-1)驗證人類IgG化669抗體之抗腫瘤效果。
人類IgG化669抗體係將人類IgG1之CDR取代為669抗體之CDR而製作。
於ICR裸毛小鼠(♀，5~6週齡，日本Charles River)之左腹側部以5×106細胞/100μL PBS皮下投予DLD-1細胞。將腫瘤體積成為100~200mm3之個體分為5組，每週3次投予PBS 500μL、人類IgG化669抗體500μg/500μL PBS、人類IgG化669抗體100μg/500μL PBS、抗EGFR抗體之愛必妥(erbitux)500μg/500μL或愛必妥100μg/500μL PBS。且每1組為小鼠4~5隻。又，每次投予時記錄腫瘤直徑及小鼠體重。腫瘤體積以「腫瘤長徑×腫瘤短徑2」求得。結果如圖21所示。
如圖21所示，人類IgG化669抗體與投予PBS之陰性對照比較顯著抑制腫瘤尺寸增大。且明瞭人類IgG化669抗體具有比愛必妥更強之抗癌作用。又，小鼠體重於投予前後未見到太大變化。
實施例A12. 使用1361-5抗體之大腸癌組織陣列染色
本實施例係使用實施例A11製作之1361-5抗體進行大腸癌之免疫組織學染色。
大腸癌組織陣列係獲自BioChain Institue Inc.(Newark,CA)並用於實驗。依據製造者手冊，使各組織陣列染色。結果如圖17所示。如圖17所示，1361-5抗體可對大腸癌組織(D8、B7及B5)良好地染色(上方3片圖)。另一方面，於西妥昔單抗染色像中，該等陣列染色均為陰性(參考圖17下方之3片圖)。
實施例A13. 胞外體之分析
本實施例中明瞭細胞膜蛋白質的TMEM-180蛋白質自癌細胞釋出於胞外體中，且作為膜蛋白質露出於胞外體。
具體而言，培養大腸癌細胞株DLD-1，取得培養上澄液。凝膠過濾後，使用98抗體確認各區分後，了解於遠大於蛋白質分子量之大分子量區分中存在98抗體陽性區分。此意指TMEM-180蛋白質形成巨大複合體(例如參考圖19)。
接著，構築檢測出上述培養上澄液中之胞外體之系統。該檢測系統係將抗TMEM-180抗體固相化於盤表面，將含有結合於經固相化之抗體的TMEM-180之胞外體以胞外體標記的抗CD9抗體檢測出之系統。作為細胞係使用DLD-1細胞株(亦稱為「DLD-1細胞野生株」)，作為陰性對照係使用TMEM-180基因剃除DLD-1細胞株及K562細胞株。
具體而言，以磷酸緩衝液將抗TMEM-180抗體稀釋為5μg/mL，以50μl/孔添加於96孔盤(Maxisorp #442404、Thermo Fisher co.,Ltd.)中。固相化反應係於室溫培育2小時或於4℃培育一夜而進行。藉由300μl/孔之盤洗淨液，重複3次完成固相化盤之洗淨。以200μl/孔之阻斷劑(1%BSA/TBS-T)進行阻斷，於室溫靜置1小時或於4℃靜置一夜。去除阻斷劑後，分別以50μl/孔於盤中添加以無血清培養基培養24小時之DLD-1細胞野生株培養上澄液及TMEM-180基因剃除DLD-1細胞株培養上澄液、K562細胞培養上澄液，於室溫靜置1小時。又作為陰性對照係使用未使用之無血清培養基。藉由盤洗淨液，重複洗淨盤3次後，以50μl/孔於盤中添加以1%BSA/TBS-T稀釋至5μg/mL之生物素標識抗CD9抗體(156-030、Ancell co.,LTD.)。於室溫靜置1小時後，藉由盤洗淨液，重複洗淨盤3次。以50μl/孔於盤中添加以1%BSA/TBS-T稀釋至5000倍之鏈親和素-HRP共軛物(SA-5004、Vector Laboratories)。於室溫靜置30分鐘後，藉由盤洗淨液重複 盤洗淨3次後，添加100μl/孔之顯色液，於室溫靜置30分鐘。添加30μl/孔之停止液，停止顯色反應，以盤讀取機測定450nm之吸光度。結果如圖18所示。
如圖18所示，DLD-1細胞株於培養上澄液中釋出胞外體，該胞外體於其表面露出TMEM-180蛋白質，使用抗CD9抗體可檢測出669抗體及1631抗體。另一方面，於TMEM-180基因剃除株，露出TMEM-180之胞外體量減少。且於未表現TMEM-180之K562細胞株亦相同，與作為陰性對照使用之培養基相同程度。
由此可了解，自癌細胞釋出露出TMEM-180之胞外體，及可使用本發明之抗TMEM-180抗體與抗胞外體抗體檢測出。又，本發明人等已發現人類大腸癌患者血清中亦釋出露出TMEM-180之胞外體。由此可了解，於癌之檢查中，可將體液試料中是否檢測出露出TMEM-180蛋白質之胞外體作為指標而診斷癌。
實施例B13-2. 使用胞外體之大腸癌診斷
本實施例顯示可使用大腸癌患者血清中所含之胞外體進行診斷。
本實施例中，使用1361抗體固定化珠粒，自大腸癌患者血清(51例)純化與1361抗體反應之成分，隨後，使用胞外體標記的CD9抗體檢測出其中所含之胞外體。具體如以下。
1)抗體結合磁性珠粒之調製
以25mM MES-NaOH將1361抗體稀釋為1mg/mL。將NHS-FG珠粒(多摩川精機，Cat No.TAS8848N1141)以每100μg懸浮於50μL之25mM MES-NaOH，與等體積之抗體溶液混合，於4℃攪拌30分鐘，而使抗體與NHS-FG珠粒結合。去除上澄液後，添加1M乙醇胺(pH8.0)250μL並於4℃阻斷一夜。以200μL之10mM HEPES-NaOH(pH7.9)/50mM KCl/1mM EDTA/10%甘油洗淨3次，所得抗體結合磁性珠粒懸浮於200μL之10mM HEPES-NaOH(pH7.9)/50mM KCl/1mM EDTA/10%甘油中用於實驗。
2)陽性檢體之調製
DLD-1細胞以6.85×106細胞/15cm盤培育一夜。去除培育上澄液後，添加PBS 7mL，洗出培養基成分。以PBS進行2次洗淨後，添加無血清培養基30mL，培養24小時。所得無血清培養上澄液以0.22μm過濾器過濾後用於測定。
3)含TMEM180之胞外體之檢測
使用以下材料。
．96孔盤(Corning Co.,Ltd、Cat.No.3600)
．盤洗淨液10mM TBS(pH7.2)/0.1% Tween 20/140mM NaCl
．稀釋液10mM TBS(pH7.2)/0.05% Tween 20/140mM NaCl/1% BSA
．檢體稀釋液10mM TBS(pH7.2)/0.1% Tween 20/140mM NaCl/1% BSA/20μg/mL TRU Block(Meridian Life Science,Inc.、Cat.No.A66800H-0.1)
．生物素化抗CD9抗體(Ancell corporation、Cat.No.156-030)
．鏈親和素ALP(R&D systems,Inc.、Cat.No.AR001)
．發光基質LUMIPULSE基質液(Fuji Rebio股份有限公司)
．盤讀取機Spectra Max Paradigm(MolecuLar Devices,LLC.)
(順序)
依據以下順序。
(i)抗體結合磁性珠粒調製
將1361抗體結合磁性珠粒以成為0.001mg/50μL之方式懸浮於稀釋液中。
(ii)檢體調製
以檢體稀釋液將陽性檢體及血清檢體稀釋為10倍。
(iii)一次反應
將1361抗體結合磁性珠粒懸浮液50μL/孔、檢體50μL/孔於96孔盤中混合，以盤混合機攪拌反應30分鐘。
(iv)標識抗體反應
藉由300μL/孔之盤洗淨液，重複3次盤洗淨。生物素標識抗體以稀釋液調製為0.3mg/mL，並以50μL/孔添加。以盤混合機攪拌反應30分鐘。
(v)鏈親和素ALP反應
藉由300μL/孔之盤洗淨液，重複3次盤洗淨。鏈親和素ALP以稀釋液稀釋為2,000倍，並以50μL/孔添加。以盤混合機攪拌反應30分鐘。
(vi)測定
藉由300μL/孔之盤洗淨液，重複3次盤洗淨。添加50μL/孔之發光基質液，於室溫培育10分鐘。以盤讀取機測定發光量。
結果如圖22所示。如圖22所示般可了解與健康者血清比較，大腸癌患者之血清含較多TMEM-180陽性之胞外體。
其次，使用圖22所示之數據，設定臨界值(閾值)，驗證診斷之感度及特異度。具體而言，以健康者(50例)之相對發光強度之平均值(N)為基準，將其3倍 (S/N=3)、4倍(S/N=4)或5倍(S/N=5)設定為臨界值(閾值)，於超過臨界值時決定為大腸癌，藉此驗證診斷感度及特異度。結果如表24所示。
如表24所示可知，依據本發明，於所有期別中均可以高感度檢測出大腸癌。尤其於2期中，任一臨限值均以超過75%之高感度檢測出癌。且，於1期中，以超過50%之高感度檢測出癌。檢測之特異度於任一情況均顯示超過85%之高特異度。
上述例中，雖例示S/N為3以上之例，但由圖22之結果得知設定為S/N為1時亦可檢測出癌。一般，臨限值設定為較高時特異度上升但感度降低，臨限值設定為較低時，特異度減少但感度上升。依據本發明及實施例，可理解臨限值可由本技藝者以減少疑陽性為目的或以減少偽陰性為目的而自由設定。
實施例B13-3.胞外體上之TMEM-180之露出觀察
本實施例中，使用電子顯微鏡觀察胞外體上之TMEM-180之露出。
自培養上澄液之胞外體回收
分別將DLD-1細胞及TMEM180強制表現DLD-1細胞撒於塑膠皿中，培育一夜。去除培養上澄液，以不脫除細胞之方式以PBS洗淨2次後，更換為無血清之D-MEM培養基。將培養24小時後回收培養上澄液，以0.22μm過濾器過濾者，作為含胞外體之無血清培養上澄液。且將K562細胞以PBS洗淨3次者以無血清之RPMI-1640培養基培養24小時後，回收培養上澄液，以0.22μm過濾器過濾後使用。含胞外體之無血清培養上澄液以100,000×g、4℃離心24小時所得之顆粒懸浮於PBS者作為胞外體濃縮液。
胞外體之免疫染色
於張開有支撐膜之Ni格柵中分散胞外體濃縮液，吸附於膜上。於Ni格柵添加抗TMEM-180抗體選殖株之669抗體或抗人類CD9抗體(Cosmo bio)，於室溫進行反應。以1%BSA/PBS洗淨Ni格柵，接著添加金膠體標識抗小鼠Ig抗體或金膠體標識抗大鼠Ig抗體，於室溫進行反應。以PBS洗淨後，以戊二醛固定3分鐘。又陰性染色係以2%磷鎢酸溶液(pH7.0)進行。將固定之Ni格柵乾燥 後，以透過型電子顯微鏡觀察胞外體與抗體之結合。電子顯微鏡係將金膠體作為黑點檢測出。結果如圖23所示。
如圖23所示般胞外體於使用抗CD9抗體之染色中伴有複數黑點，可知已藉由抗CD9抗體染色(圖23之A)。且，胞外體於使用抗TMEM-180抗體之染色中，亦伴隨複數黑點，可知已藉由抗TMEM-180抗體染色(圖23之B)。又，未露出TMEM-180之K562細胞與抗TMEM-180抗體未反應。由此可了解自大腸癌細胞釋放至體液中之胞外體露出有TMEM-180。可說是證實了使用胞外體及抗TMEM-180抗體可診斷癌之結果。
實施例A14.以胞外體作為抗原之抗TMEM-180抗體之製作
了解於胞外體上檢測出上述TMEM-180蛋白質後，於實施例3中代替上述抗原而使用上述胞外體作為抗原，獲得抗TMEM-180抗體。
免疫原之調製
1)無血清培養上澄液之調製
將DLD-1細胞TMEM-180過度表現株15cm皿(#430599、Corning Co.,Ltd.)以每1皿為6.75×106細胞，於含10%FBS之D-MEM低葡萄糖培養基(wako)30mL中，於37℃、5%CO2之條件培養24小時。自培養器去除培養基並以PBS穩定洗淨後，以30mL/皿添加D-MEM低葡萄 糖培養基後，同樣培養24小時。回收之無血清培養上澄液以0.22μm過濾器過濾，去除細胞片等後，以1/1000量添加蛋白酶抑制劑(Wako)並保存於4℃。
2)胞外體區分之調製
以30mMHEPES,100mM NaCl pH6.7使填充有CHT陶瓷羥磷灰石II型(Bio-Rad)之管柱平衡化。於管柱中添加無血清培養上澄液，以同樣緩衝液進行洗淨，以500mM KPB pH6.7溶出。溶出之溶液使用超過濾濃縮至10mL以下，使用凝膠過濾管柱Superdex200pg(GE)進行區分。對於各區分進行TMEM-180陽性過分之測定，回收有孔隙容積之陽性區分之波峰，作為含TMEM-180之胞外體(參考圖19)。
3)TMEM-180陽性區分之測定
測定樣品以原液或以磷酸緩衝液稀釋，以50μL/孔添加於96孔盤(Maxisorp #442404、Thermo Fisher co.,Ltd.)中。固相化反應係設為於室溫2小時。藉由300μL/孔之盤洗淨液，重複3次固相化盤之洗淨。以200μL/孔之1%BSA/TBS-T予以阻斷，於室溫靜置1小時。去除阻斷劑後，以50μL/孔於盤中添加以1%BSA/TBS-T稀釋至5μg/mL之選殖株98抗體。於室溫靜置1小時後，藉由盤洗淨液，重複3次盤洗淨後，以50μL/孔於盤中添加以1%BSA/TBS-T稀釋至10,000倍之羊抗大鼠IgM抗體HRP 共軛物(A110-100P、Bethyl laboratories,Inc.)。於室溫靜置30分鐘後，藉由盤洗淨液重複3次盤洗淨後，添加100μL/孔之顯色液，於室溫靜置20分鐘。添加30μL/孔之停止液並停止顯色反應，以盤讀取機測定450nm之吸光度。
4)抗體之製作
將含有TMEM-180之胞外體與Freund完全佐劑以1：1混合而調製之乳液以每次100μL投予至大鼠(日本SLC，Wister，雌性，6~8週齡)尾根部兩側。免疫14天後摘出腸骨淋巴結、鼠蹊部淋巴結、腋下淋巴結及膝下淋巴結，以PEG法將淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞p3X63融合。融合10天~14天後，回收培養上澄液，以流式細胞計選擇於DLD-1細胞顯示陽性，於K562細胞顯示陰性之抗體產生融合瘤細胞。且以對於DLD-1細胞TMEM-180過度表現株、DLD-1細胞TMEM-180基因剃除株、DLD-1細胞TMEM-180基因剃除株之反應性進行篩選。選擇之抗體產生融合瘤細胞以極限稀釋法單選殖化並樹立。抗體之等型以等型特異之ELISA(Bethyl)判定。
由上述方法獲得IgG抗體1種、IgM抗體3種。該等抗體良好地辨識於胞外體上之TMEM-180蛋白質，且與上述實施例同樣良好地染色癌組織。使胞外體免疫所得之抗體當然於使用胞外體之癌診斷中有用。此外，於胞外體上TMEM-180係取天然構形，認為露出與細胞膜 上相同部分。而且，使胞外體免疫所得之抗體藉由免疫組織學染色或FACS而與細胞膜上之TMEM-180結合。將胞外體免疫獲得抗體之方法，認為可使用作為獲得膜蛋白質尤其是抗TMEM-180抗體之方法。
實施例C15.抗體藥物共軛物(ADC)之構築及生理學試驗
本實施例係構築ADC，調查對大腸癌細胞株之效果。
作為ADC，使用669抗體或372抗體作為抗TMEM-180抗體，使用單甲基奧瑞他汀(MMAE)作為藥物。抗體與MMAE係透過鏈接基連結。鏈接基係設為可藉組織蛋白酶開裂之纈胺酸-瓜胺酸鏈接基(Val-Cit鏈接基)。具體之ADC構造如圖24所示。
實施例C15-1.ADC之調製
1)鏈接基之合成
於H-Cit-OH(1.18g,6.74mmol)與NaHCO(566mg,6.74mmol)之水溶液(18mL)中添加Fmoc-Val-OSu(2.80g,6.42mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(DMF)(18mL)溶液，進而添加四氫呋喃(THF)(9mL)，攪拌隔夜。藉由15%檸檬酸水溶液(40mL)停止反應，藉由AcOEt/i-PrOH(9/1)混合溶液(100mL,20mL×2)萃取水層。合併之有機層以水洗淨(70mL)，減壓濃縮。殘渣固體以二乙醚洗淨，獲得白色固 體之二胜肽Fmoc-Val-Cit-OH(3.11g，97%)。
於Fmoc-Val-Cit-OH(3.00g，6.04mmol)及對-胺基苄醇(PAB)(1.49g，12.1mmol)之二氯甲烷(70mL)-甲醇(30mL)之溶液中，添加1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)(2.99g，12.1mmol)。1天後添加EEDQ(1.50g，6.04mmol)，攪拌隔夜。濃縮反應液，殘渣中添加二醚後，藉由超音波洗淨，獲得Fmoc-Val-Cit-PAB-OH(2.51g，69%)。
(2)鏈接基與MMAE之連結及ADC之調製
於對-硝基苯基碳酸酯體(1.28g，1.67mmol)與1-羥基苯并三唑(HOBt)(376mg，2.78mmol)之二甲基甲醯胺(3.4mL)與吡啶(0.85mL)之溶液中添加MMAE(1.00g,1.39mmol)。24小時後，以Sephadex LH20(溶劑CHCl3：MeOH 1：1)純化反應液，獲得Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE(1.44g，77%)。
於Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE(1.44g，1.07mmol)之二甲基甲醯胺溶液(20mL)中添加Et2NH(5mL)。攪拌隔夜後，減壓濃縮反應液，殘渣以乙酸乙酯及二乙醚洗淨，獲得淡黃色固體(960mg，80%)。
於H-Val-Cit-PABC-MMAE(960mg，0.855mmol)之二氯甲烷溶液(20mL)中添加馬來醯亞胺-聚乙二醇12-琥珀醯亞胺酯(Mal-PEG12-OSu)(814mg，0.94mmol)與二異丙基乙基胺(0.45mmol，2.57mmol)。攪拌隔夜，以 Sephadex LH20(CHCl3：MeOH 1：1)與分子過篩高速液體層析(尺寸排除HPLC)純化反應液，獲得無色油之Mal-PEG12-Val-Cit-PABC-MMAE(769mg，48%)。
隨後，依據常用方法以巰基乙胺使抗體還原，藉由麥可(Michael)加成反應連結Mal-PEG12-Val-Cit-PABC-MMAE之馬來醯亞胺基與抗體之硫醇基而獲得ADC。作為抗體係使用669抗體及對照抗體。
實施例C15-2.抗體之細胞內移行之觀察
以5000個細胞/孔於96孔盤中接種野生型DLD-1細胞並於37℃培育18小時。洗淨1次，添加經488標記之669抗體2μg/孔，以一定時間(1小時後、3小時後、或6小時後)，於37℃培育。洗淨3次，以2μg/孔之量添加兔抗488抗體，於4℃靜置30分鐘，源自結合於細胞膜表面之抗體的螢光消光。洗淨3次後，以100μL/孔添加4%PFA，於室溫靜置10分鐘。進而洗淨3次後，以100μL/孔添加DAPI(1/500稀釋)，於室溫靜置5分鐘。洗淨3次後，進行攝影或陣列掃描解析。作為對照組，使用抗EGFR抗體的西妥昔單抗(Erbitux)。結果如圖25所示。
如圖25所示，669抗體於細胞內被觀察到以高濃度濃縮之樣子。相對於此，西妥昔單抗其納入量為限定。
實施例C15-3.ADC之細胞殺傷作用
於96孔盤中以2×103細胞/孔之量接種SW480細胞。翌日，分別將MMEA(單劑)、669抗體之ADC、及對照抗體之ADC(對照ADC)以MMAE換算濃度計製作連續稀釋並添加於各孔中。3天後，添加細胞毒性測定試藥的WST-8且經過3小時後，觀察細胞生存率(%)。結果如圖26所示。
如圖26所示可知，與MMAE同樣，669抗體之ADC對於細胞發揮細胞殺傷作用。且，669抗體之ADC發揮比對照ADC高的細胞殺傷作用。
實施例C15-4.TMEM-180基因剃除小鼠
製作TMEM-180基因剃除小鼠並觀察表現型。
使用CRISPR-Cas9系統於TMEM180之外顯子(exon)2製作嚮導RNA，獲得經交配之複數個體之TMEM180高基因剃除小鼠(參考圖27)。確認並無胎生致死。其結果教示TMEM180之機能喪失對於正常組織之影響較少。
[序列表非文字記載(Free-text)]
序列編號：1~3分別表示98選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：4~6分別表示98選殖株之輕鏈CDR1~3 之胺基酸序列。
序列編號：7~9分別表示101選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：10~12分別表示101選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：13及14分別表示98選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：15及16分別表示101選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：17表示TMEM180蛋白質之胺基酸序列。
序列編號：18~21分別表示免疫抗原1製作用引子(i)~(iv)。
序列編號：22~25分別表示免疫抗原2製作用引子(i)~(iv)。
序列編號：26~31表示抗TMEM-180抗體基因之選殖所用之引子。
序列編號：40~42分別表示212選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：43~45分別表示212選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：46及47分別表示212選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：48~50分別表示129選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：51~53分別表示129選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：54及55分別表示129選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：56~58分別表示382選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：59~61分別表示382選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：62及63分別表示382選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：64~66分別表示1361選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：67~69分別表示1361選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：70及71分別表示1361選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：72~74分別表示669選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：75~77分別表示669選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：78及79分別表示669選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：80~82分別表示699選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：83~85分別表示699選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：86及87分別表示699選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：88~90分別表示1052選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：91~93分別表示1052選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：94及95分別表示1052選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：96~98分別表示1105選殖株之重鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：99~101分別表示1105選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：102及103分別表示1105選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：104~150表示由HLAPeptide Binding Predictions預測之結合於HLA型A2之源自TMEM-180之胜肽的胺基酸序列。
序列編號：151~170表示由HLAPeptide Binding Predictions預測之結合於HLA型A24之源自TMEM-180之胜肽的胺基酸序列。
序列編號：171~173分別表示1361-5選殖株之重鏈 CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：174~176分別表示1361-5選殖株之輕鏈CDR1~3之胺基酸序列。
序列編號：177及178分別表示1361-5選殖株之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
序列編號：179及180分別表示1361-5選殖株之重鏈之鹼基序列及胺基酸序列。
序列編號：181及182分別表示1361-5選殖株之輕鏈之鹼基序列及胺基酸序列。
序列編號：183及184分別表示對於1361抗體導入Y79A變異所用之正向引子及反向引子之鹼基序列。
序列編號：185及186分別表示對於1361抗體導入S82A變異所用之正向引子及反向引子之鹼基序列。
序列編號：187~192分別表示如實施例B11-2中記載般對於1361抗體之Fc區域導入部位特異變異所用之正向引子及反向引子之核酸序列。
<110> 日本國立癌症中心RIN研究所公司RIN Institute Inc.
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<220>
<223> 合成引子
<400> 19
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 20
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 21
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 22
<210> 23
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<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 23
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 24
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 25
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 26
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 27
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 28
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 29
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
<400> 30
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成引子
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<210> 32
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株212之重鏈CDR1
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 選殖株212之輕鏈
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 選殖株129之輕鏈變異區
<400> 55
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 選殖株1361之重鏈變異區
<400> 70
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<220>
<223> 選殖株1361之輕鏈變異區
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<220>
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<400> 72
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 選殖株669之重鏈變異區
<400> 78
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<220>
<223> 選殖株669之輕鏈變異區
<400> 79
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<220>
<223> 選殖株699之重鏈CDR1
<400> 80
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<211> 18
<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株699之重鏈CDR2
<400> 81
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株699之輕鏈CDR1
<400> 83
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<220>
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<220>
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<400> 86
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<220>
<223> 選殖株699之輕鏈變異區。40
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之重鏈CDR1
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之重鏈CDR2
<400> 89
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之重鏈CDR3
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之輕鏈CDR1
<400> 91
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<220>
<223> 選殖株1052之輕鏈CDR2
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之輕鏈CDR3
<400> 93
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1052之重鏈變異區
<400> 94
<210> 95
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 選殖株1052之輕鏈變異區
<400> 95
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 選殖株1105之重鏈CDR1
<400> 96
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1105之重鏈CDR2
<400> 97
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1105之重鏈CDR3
<400> 98
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<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1105之輕鏈CDR1
<400> 99
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 選殖株1105之輕鏈CDR2
<400> 100
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 選殖株1105之輕鏈CDR3
<400> 101
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<211> 134
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 選殖株1105之重鏈變異區
<400> 102
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 選殖株1105之輕鏈變異區
<400> 103
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工48
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 104
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 105
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 106
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽。49
<400> 107
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 108
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 109
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 110
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 111
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 112
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 114
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 115
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 117
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 118
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 119
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工53
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 120
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 121
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 122
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽。54
<400> 123
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 124
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 125
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 126
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
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<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 128
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 129
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 130
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 131
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 132
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 133
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 134
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 135
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工58
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 136
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 137
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 138
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽。59
<400> 139
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 140
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 141
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽]
<400> 142
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 143
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 144
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 145
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 146
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 147
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 148
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 149
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A2結合胜肽
<400> 150
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 151
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工63
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 152
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 153
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 154
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽。64
<400> 155
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 156
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 157
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 158
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 159
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 160
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 161
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 162
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 163
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 164
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 165
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 166
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 167
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工68
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 168
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 169
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 衍生自TMEM-180蛋白質之預測的HLA型A24結合胜肽
<400> 170
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之重鏈CDR1
<400> 171
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之重鏈CDR2
<400> 172
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之重鏈CDR3
<400> 173
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之輕鏈CDR1
<400> 174
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之輕鏈CDR2
<400> 175
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之輕鏈CDR3
<400> 176
<210> 177
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之重鏈變異區
<400> 177
<210> 178
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之輕鏈變異區
<400> 178
<210> 179
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之重鏈
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1413)
<400> 179
<210> 180
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 180
<210> 181
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 選殖株1361-5之輕鏈
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<400> 181
<210> 182
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 182
<210> 183
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1361-5正向引子
<400> 183
<210> 184
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1361-5反向引子
<400> 184
<210> 185
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1361-7正向引子
<400> 185
<210> 186
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1361-7反向引子
<400> 186
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_S239D_Fw
<400> 187
<210> 188
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_S239D_Rv
<400> 188
<210> 189
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_A330L_I332E_Fw
<400> 189
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_A330L_I332E_Rv
<400> 190
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_I332E_E333A_Fw
<400> 191
<210> 192
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc_I332E_E333A_Rv
<400> 192

Claims (20)

  1. 一種與跨膜蛋白180(TMEM-180)結合之抗體或其抗原結合片段，其係[1]包含重鏈可變區域及輕鏈可變區域之抗體，該重鏈可變區域包含：重鏈CDR1：NYWMT(序列編號：171)；重鏈CDR2：SITNTGGSTAYPDSV(序列編號：172)；及重鏈CDR3：AGYSSYPDYFDY(序列編號：173)，該輕鏈可變區域包含輕鏈CDR1：KAGQNIYNYLA(序列編號：174)；輕鏈CDR2：NANSLQT(序列編號：175)；及輕鏈CDR3：QQYSSGWT(序列編號：176)，或[2]於對於TMEM-180之結合中與上述[1]之抗體競爭之抗體。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區域(序列編號：177)及輕鏈可變區域(序列編號：178)。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其具有重鏈(序列編號：180)及輕鏈(序列編號：182)。
  4. 如請求項1~3中任一項之抗體，其中於Fc區域結合有1個以上之N-結合型糖鏈，於該N-結合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合海藻糖。
  5. 一種用以處置癌之醫藥組成物，其包含如請求項 1~4中任一項之抗體。
  6. 一種用以診斷癌之組成物，其包含如請求項1~4中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  7. 一種用以診斷癌之診斷套組，其包含如請求項1~4中任一項之抗體或抗原結合片段。
  8. 如請求項5之醫藥組成物，其係以表現TMEM-180之癌為對象。
  9. 如請求項5之醫藥組成物，其係以大腸癌為對象。
  10. 一種核酸，其編碼如請求項1~4中任一項之重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之任一者。
  11. 一種核酸，其編碼如請求項1~4中任一項之重鏈及輕鏈之任一者。
  12. 一種表現載體，其包含如請求項10或11之核酸。
  13. 一種轉形體，其包含如請求項12之表現載體。
  14. 一種癌之檢查方法，其包含使用如請求項1~4中任一項之抗體或其抗原結合片段測定由受檢者所採取之試料中之TMEM-180量的步驟。
  15. 如請求項14之癌之檢查方法，其係以大腸癌為對象。
  16. 如請求項14或15之癌之檢查方法，其係用於檢查治療後之再復發或轉移。
  17. 一種癌之檢查方法，其包含於由受檢者所採取之 體液試料中檢測具有TMEM-180之胞外體(exosome)之量的步驟。
  18. 如請求項17之方法，其中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟係使用結合於TMEM-180之抗體或其抗原結合片段進行。
  19. 如請求項18之方法，其中檢測具有TMEM-180之胞外體之量的步驟係使用如請求項1~3中任一項之抗體或其抗原結合片段進行。
  20. 如請求項5之用以處置癌之醫藥組成物，其係包含抗TMEM180抗體與細胞傷害劑之抗體藥物共軛物之醫藥組成物，或為抗TMEM180抗體與細胞傷害劑連結之形態。
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