JP5956424B2 - 抗体、乳がんの治療に用いられる医薬組成物、腫瘍検査方法、及び、腫瘍検査用試薬 - Google Patents

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Description

本発明は、乳がんの治療に有効な抗体及びその抗体を含む医薬組成物、並びに、胃がん、前立腺がん及び大腸がんの発症等を診断するための腫瘍マーカーを用いた腫瘍検査方法、及び、腫瘍検査用試薬に関する。
がんは、脳梗塞や心筋梗塞に代表される血管系疾患とともに成人の死亡原因を二分する疾患である。乳房組織に発生するがん腫である乳がんは、世界中でよく見られるがんで、西側諸国では女性の約１０％が一生涯の間に乳がんに罹患する機会を有する。それゆえ乳がんに対する有効な治療薬の開発が切望されている。
乳がんの発症は、女性ホルモンの働きで増殖するホルモン依存性のものと女性ホルモンに反応しないホルモン非依存性のものとがある。乳がんに対するホルモン療法剤は、例えば、抗エストロゲン剤やプロゲステロン製剤等がある。ホルモン療法剤を使用すると、乳がん発生に影響するエストロゲン等のホルモンの働きを抑制できる。しかしながらホルモン療法はエストロゲン等を働けなくさせるため、その副作用として更年期障害と同じような症状が発生し、骨がもろくなって骨折しやすくなる骨粗鬆症や関節痛等が発生する。
乳がんに対する抗がん剤として、例えばドキソルビシンやパクリタキセル等があり、手術前に抗がん剤でがん病変を小さくしておき、外科手術を有効に行うことができる。しかしながら、抗がん剤には、悪心・嘔吐、口内炎、下痢等の消化器症状、全身倦怠感、アレルギー反応等の全身症状等の自覚的副作用や、白血球減少、血小板減少、貧血等の骨髄抑制や臓器障害等の他覚的副作用が発生する場合がある。
乳がんの細胞表面には、ヒト上皮増殖因子受容体２型（Her-2：humanepidermal growth factor receptor2）と呼ばれる突起の存在が発見されている。このHer-2を標的とした抗体医薬としてトラスツズマブがあり、乳がん細胞増殖速度の大きい転移性乳がんの治療に有効である（特許文献１）。しかしながら、この抗体医薬はHer-2陽性症例の場合にしか使用することができず、Her-2陽性症例は２０〜３０％程度にすぎない（非特許文献１）。更にはHer-2陽性症例であっても治療を継続するうちに、トラスツズマブの受容体結合の変化等の要因によりトラスツズマブ抵抗性が生じうる場合がある（非特許文献２）。
更には、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、Her-2の全てが陰性のタイプの乳がん症例であるトリプルネガティブ症例（TNBC）があり、この症例は乳がん全体の約１５％を占めている。この症例に対しては、例えば血管新生阻害剤であるベバシズマブ製剤による治療が行われており、これにより再発防止可能性が幾分か抑制される（特許文献２）。しかしながら、この症例に対しては未だ有効な治療法が確立されておらず、予後は極めて不良である（非特許文献３、４）。他の乳がんのタイプでは初めの診断から５年以内の再発率は約１５％であるが、トリプルネガティブ症例では初めの診断から５年以内の再発率は約３２％であり、更にトリプルネガティブ症例では再発した場合の平均余命は約９ヶ月とされている。
次に、近年、腫瘍マーカーについての研究が盛んに行われており、既にがんのスクリーニングテストとして活用されている腫瘍マーカーや、現在機能を評価中の腫瘍マーカーが存在する。腫瘍マーカーとしては、がん発症や再発等の診断マーカー、予後予測マーカー、治療奏効性予測マーカー等としての活用が期待されており、例えば、特許文献３には、生体から採取された組織中のがんマーカーの絶対量を測定し、測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより組織へのがんの転移を判定する、胃がん・前立腺がん・大腸がんの腫瘍検査方法が記載されている。
国際公開ＷＯ８９／６６９２号公報 特表２０１０−５０４９４９号公報 特開２００８−０１７８３２号公報
「THE SIGNIFICANCE OF ONCOGENE AMPLIFICATIONINPRIMARY BREAST CANCER」、Int. J. Cancer: 43, 270-272 (1989) 「M. D. Anderson Study Finds Change in Her-2Status After Treatment With Herceptin」、M. D. Anderson News Release 09/04/08 「Treatment of triple negative breastcancer (TNBC): current options and future perspectives」、Cancer TreatmentReviews 36S3 (2010) S80-S86 「Triple-Negative Breast Cancer: AnUnmet Medical Need」、The Oncologist 2011;16(suppl 1):1-11
しかし、上述の検査方法では、ステージの進んだ進行がん、末期がんでの検出は可能であるものの、早期のがんを検出することは困難である。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであって、乳がん、特にトリプルネガティブ症例の治療に有効な抗体及び医薬組成物を提供することを目的とする。また、胃がん、前立腺がん、及び大腸がんを的確に検出することのできる腫瘍検査方法、及び、腫瘍検査用試薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、EphA10のリガンドであるEphA10ファミリー分子をEphA10発現乳がん細胞に作用させることにより細胞増殖が促進されるという新知見に基づいて、EphA10の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が、乳がんの増殖を阻害する治療薬になることを見いだし、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下の構成からなる。
１．EphA10の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体。
２．EphA10のフィブロネクチンドメインに結合する前記１に記載の抗体。
３．重鎖可変ドメインが、DYFIT（ＣＤＲ１）、EIYPGSGSIYYNENFKG（ＣＤＲ２）及びSWVPYAMDY（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む前記１又は２に記載の抗体。
４．軽鎖可変ドメインが、KASQSVSKDVA（ＣＤＲ１）、SASKRYT（ＣＤＲ２）及びQQDYSSPRT（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む前記１〜３の何れか１つに記載の抗体。
５．重鎖可変ドメインが、QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（ＦＲ１）、WVSQRTGQGLEWIG（ＦＲ２）、KATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAR（ＦＲ３）及びWGQGTSVTVSS（ＦＲ４）
により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む前記１〜４の何れか１つに記載の抗体。
６．軽鎖可変ドメインが、SFVMTQTPKFLLVSAGDRITITC（ＦＲ１）、WYQQKPGQSPKLLIY（ＦＲ２）、GVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC（ＦＲ３）及びFGGGTKLEIKRA（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む前記１〜５の何れか１つに記載の抗体。
７．前記１〜６の何れか１つに記載の抗体を有効成分として含有することを特徴とする乳がんの治療に用いられる医薬組成物。
８．生体から分離された生体検体について、EphA10を、胃がん、前立腺がん、及び大腸がんの腫瘍マーカーとして検出することを特徴とする、腫瘍検査方法。
９．生体検体中のEphA10を検出するための、抗EphA10抗体又はEphA10のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含む、胃がん、前立腺がん、及び大腸がんの検査方法に用いる、腫瘍検査用試薬。
本発明によれば、EphA10はHer-2よりも高い割合で乳がん症例に発現しており、しかもHer-2陰性症例の約半分に発現しているので、抗Her-2抗体よりも有効な乳がん治療に好適な抗体及びその抗体を含有する医薬組成物が得られる。また、女性ホルモンの働きを阻害するものでなく、一般的な抗がん剤に特有の副作用も極めて少ないので、乳がん治療におけるＱＯＬ（Quality of Life）を向上させることができる。特に、ホルモン療法もトラスツズマブも効果が期待できず、術後薬物療法の選択肢が少ないとされるトリプルネガティブ症例に対して、極めて有効な抗体及び医薬組成物が得られる。また、胃がん、前立腺がん、及び大腸がんを的確に検出することのできる腫瘍検査方法及び腫瘍検査用試薬が得られる。
ELISA法によるモノクローナル抗体のヒトEphA10の細胞外ドメインに対する結合性評価を示す図である。 作製したモノクローナル抗体が、細胞に発現しているEphA10を認識することを確認するフローサイトメトリーによる図である。 作製したモノクローナル抗体が、EphA10を特異的に認識することを確認するELISA法による図である。 本モノクローナル抗体が、フィブロネクチン領域を認識することを示すWestern Blot図である。 MDA-MB-468細胞を使用した場合において、本モノクローナル抗体が、トリプルネガティブ症例に対する治療薬として有用であることを示す図である。 MDA-MB-435EphA10細胞を使用した場合において、本モノクローナル抗体が、トリプルネガティブ症例に対する治療薬として有用であることを示す図である。 トリプルネガティブ症例におけるEphA10の高い陽性率を示す組織マイクロアレイ図である。 EphA10が、胃がん、前立腺がん、及び、大腸がんにおいても発現していることを示す組織マイクロアレイ図である。 EphA10が、乳がん細胞に発現するのみならず、前立腺がん細胞においても発現することを示すｍＲＮＡ解析図である。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
（抗体）
本実施形態に係る抗体は、EphA10の細胞外ドメインを標的とし、それに特異的に結合することにより、乳がん細胞の増殖を抑制する。
EphA10はエフリン受容体の一種であり、リガンドとして例えばEphrinA3、EphrinA4、及びEphrinA5が結合する。EphA10にはアイソフォームが３つあり、isoform1は全長からなるタンパク質であり（GenBank Accession No. AJ872185）、isoform 2は、細胞外ドメインのみ（GenBankAccession No. AJ872185）、isoform 3はisoform 1において細胞内Ｃ末端のSAMドメインが欠失したもの（GenBankAccession No. AJ872185）である。Ephrin及びEphは、各々リガンド及びレセプターを指す。
本発明者らがEphA10について解析を行った結果、EphA10は乳がん患者のほぼ半数（約４９％）でタンパク質の発現が認められ、Her-2陰性患者のほぼ半数（約４４％）でタンパク質発現が認められている。更には、トリプルネガティブ症例における約６７％においてタンパク質発現が認められている。
抗体(免疫グロブリン)は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される複特異性抗体(例えば、二特異性抗体)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化(camelised)抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆab断片、Ｆ(ab')２断片を包含するが、それらに限られない。抗体は、免疫グロブリン分子及びその免疫学的に活性な断片、即ちEphA10の一部分に対する結合部位を含む分子を含む。
本実施形態に係る抗体は、EphA10の細胞外ドメインの少なくとも一つに結合する。EphA10の細胞外ドメインは、例えばリガンド結合ドメイン（Ligand binding domain）、第一及び第二のフィブロネクチンドメイン（Fibronectin domain）のいずれも包含する。
モノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであることができる。モノクローナル抗体は、例えば、マウスIgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD、又はIgEであってもよい。また、モノクローナル抗体は、例えば、ヒトIgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、又はIgEであってもよい。任意の重鎖は、κ又はλ型の軽鎖と対形成してもよい。
完全な抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補的決定領域（ＣＤＲ）に細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している。
本発明者らは、重鎖IgG2b、軽鎖κ型にて、ハイブリドーマｍＲＮＡからＲＡＣＥ法（rapidamplification of ｃＤＮＡ ends）にてＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を決定したところ、ＶＨのＣＤＲが、DYFIT（ＣＤＲ１）、EIYPGSGSIYYNENFKG（ＣＤＲ２）及びSWVPYAMDY（ＣＤＲ３）であった。また、ＶＬのＣＤＲは、KASQSVSKDVA（ＣＤＲ１）、SASKRYT（ＣＤＲ２）及びQQDYSSPRT（ＣＤＲ３）であった。ＶＨのＦＲは、QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（ＦＲ１）、WVSQRTGQGLEWIG（ＦＲ２）、KATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAR（ＦＲ３）及びWGQGTSVTVSS（ＦＲ４）であった。また、ＶＬのＦＲは、SFVMTQTPKFLLVSAGDRITITC（ＦＲ１）、WYQQKPGQSPKLLIY（ＦＲ２）、GVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC（ＦＲ３）及びFGGGTKLEIKRA（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）であった。
乳がん治療に有用な抗体は、ヒト化モノクローナル抗体由来であってもよく、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス（又は他の種の）免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から１つ以上のＣＤＲをヒト可変ドメイン内に導入し、ヒト残基をマウスの相当するフレームワーク領域に置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常部の免疫原性に付随する問題の可能性を排除する。
本実施形態に係る抗体は、任意の種類の分子と抗体との共有結合により修飾又は複合化された、抗体誘導体を包含する。このような抗体誘導体として、例えば、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ＰＥＧ化、リン酸化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、又は細胞内配位子又は他のタンパク質への結合により修飾されている抗体が挙げられる。
本実施形態に係る抗体を取得する方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。取得したハイブリドーマから抗体を採取する方法は、特に限定されるものではないが、例えば通常の腹水形成法や細胞培養法等を用いることが可能である。腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン等の鉱物油を投与し、その後ハイブリドーマ１×１０６〜１×１０９個、好ましくは１×１０７〜１×１０８個を腹腔内に投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間、好適には２〜３週間後に腹水又は血清を採集する。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシ血清含有IMDM、RPMI-1640、MEM、E-RDF又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、５％ＣＯ２濃度）で３〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。抗体の精製は、硫安塩析法、DEAEセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して精製することが可能である。
また、別の方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を取得して、該遺伝子を発現するためのベクターを作成し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を用いて抗体キメラタンパク質、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作成することは、公知の技術を用いることで、当業者であれば実施することができる。
（医薬組成物）
本実施形態に係る医薬組成物は、本実施形態に係る抗体を有効成分として含有する。
本実施形態に係る医薬組成物は、公知の方法に従って製剤化し、投与する医薬組成物とすることができる。例えば、そのまま液剤として又は適当な剤型の医薬組成物として、ヒト又は哺乳類に対して経口的又は非経口的に投与することができる。抗体のヒトに対する投与量は、特に限定されるものではないが、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇとすることが可能である。
医薬組成物は、微生物の増殖を抑制する防腐剤又はｐＨを許容範囲に保つのに役立つ緩衝剤を含んでもよい。防腐剤は、アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３-ペンタノール、及びｍ-クレゾール等である。緩衝剤は、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸である。
また、医薬組成物は、例えば、賦形剤、安定剤、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、塩、又は抗菌剤を含んでもよい。他にも、アスコルビン酸及びメチオニン等の酸化防止剤、ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは非特異的免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン等の単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類を含むことが可能である。
（腫瘍の検査方法及び腫瘍検査用試薬）
本実施形態に係る腫瘍検査用試薬は、胃がん、前立腺がん、又は大腸がんの検査に使用されるものであり、EphA10を腫瘍マーカーとして検出する。腫瘍検査用試薬の判定手法は、生体検体中のEphA10を確認可能なものであれば良く、定性的であってもよいし、定量的であってもよい。例えば、単にEphA10の有無を検出するものであってもよく、またEphA10の発現量を相対的若しくは絶対的に決定するものでもよい。
生体検体は、乳がん患者若しくは乳がん発症の可能性のある患者の血液や乳がん組織に由来するものであり、好ましくは乳がん細胞を含む検体であれば良い。生体検体は、患者から採取された検体であり、本発明の検査方法のために取得した検体であってもよいが、他の検査に供するために取得した検体や、手術により採取した検体であってもよい。例えば検体を免疫組織染色検査に供する場合、検査に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば検体をWestern Blot法又はRT-PCR法に供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液、又はｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
免疫学的手法によりEphA10の検査を行う場合には、抗EphA10抗体が検査用試薬に含まれる。ｍＲＮＡレべルでEphA10の発現を検出する場合は、例えばRT-PCRを用いる場合は、EphA10のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーが検査用試薬に含まれる。例えば、EphA10が、各遺伝子の発現を制御する遺伝子の突然変異等に起因して、各タンパク質の発現が影響を受けるのであれば、各遺伝子の発現を制御する遺伝子について、遺伝子レベルで野生型や突然変異型を確認するものでもよい。
EphA10の発現のタンパク質レベルでの検出は、免疫学的手法によるのが好適である。例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出方法との組み合わせ（Western Blot法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。そして、EphA10の発現が認められる場合に、胃がん細胞、前立腺がん細胞、及び大腸がん細胞であると判断する。
（抗EphA10EXモノクローナル抗体）
ヒトEphA10の細胞外ドメイン（EphA10EX）とヒトIgG1Fcドメインの融合蛋白質（EphA10EX-Fcキメラ）を抗原としてマウスに免疫し、抗体価上昇がみられたマウスの脾細胞から常法によってハイブリドーマを作製した。図１に示すように、ELISAにてスクリーニングし、得られたハイブリドーマの中から、EphA10EXに対する結合性に基づき、ネガティブコントロールとしてのDR5-Fcには結合せず、EphA10EXに親和性を有する４クローンを選出した。
次に、抗体遺伝子のシーケンス解析を行った。抗体の重鎖がIgG2bであり、軽鎖がκであることを確認し、ハイブリドーマｍＲＮＡから5’-RACE法により、ＶＨとＶＬ領域のＤＮＡ／アミノ酸配列を決定した。ＶＨのＣＤＲは、DYFIT（ＣＤＲ１）、EIYPGSGSIYYNENFKG（ＣＤＲ２）及びSWVPYAMDY（ＣＤＲ３）であった。また、ＶＬのＣＤＲは、KASQSVSKDVA（ＣＤＲ１）、SASKRYT（ＣＤＲ２）及びQQDYSSPRT（ＣＤＲ３）であった。ＶＨのＦＲは、QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（ＦＲ１）、WVSQRTGQGLEWIG（ＦＲ２）、KATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAR（ＦＲ３）及びWGQGTSVTVSS（ＦＲ４）であった。また、ＶＬのＦＲは、SFVMTQTPKFLLVSAGDRITITC（ＦＲ１）、WYQQKPGQSPKLLIY（ＦＲ２）、GVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC（ＦＲ３）及びFGGGTKLEIKRA（ＦＲ４）であった。３つのクローン（クローン１，２，４）が可変領域の配列が同一の抗体を産生していることが確認された。
次に、上述の抗EphA10EXモノクローナル抗体のEphA10への結合性を確認した。EphA10−pIRES2-DsRedVectorを293T細胞へトランスフェクションしてフローサイトメトリーによって選別した。結果を図２に示す。フローサイトメトリー解析の結果、作製したモノクローナル抗体は、細胞に発現しているEphA10を認識できることが確認された。
次に、Ephrin receptor typeAファミリー（EphA1〜A8,A10）のうち、リコンビナント蛋白質（EphA1、EphA2、EphA5、EphA6、EphA10）に対する特異性をELISAで評価した。図３に示すように、0.75μg/mL、0.25μg/mL、0.083μg/mLのいずれの濃度においても、作製したモノクローナル抗体はEphA10に対して特異的に認識し、他のファミリー分子は認識しなかった。
次に、抗EphA10EXモノクローナル抗体の結合活性を調べた。Biacore3000（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、表面プラズモン共鳴法（SPR法）にて結合活性測定を行った。添付のプロトコルに従い、20μg/mLのEphA10EX-FcをCM5センサーチップに固層化した。装置添付の解析ソフトを用いて解析し、結合速度定数及び解離速度定数を算出した。その結果、モノクローナル抗体の解離定数ＫＤ値は、３．９×１０−９Ｍであり、一般に抗体医薬に使用可能なレベルの結合親和性を有していることがわかった。
次に、抗EphA10EXモノクローナル抗体の認識ドメインの解析を行った。ヒトEphA10EXは、他のEphファミリー分子との遺伝子相同性をもとに、N末端からLigandbinding domain（以後、LBD）と２つのFibronectindomain（N末側をFD1、C末側をFD2と表記）から構成される。まず全長及び各ドメインを欠失させたEphA10（下記（ａ）〜（ｂ））の遺伝子発現ベクターを作製した。
（ａ）EphA10-Full（A.A.34〜1008,109kDa）；全長のEphA10
（ｂ）EphA10-△LBD（A.A.212〜1008,86kDa）；LBD欠失
（ｃ）EphA10-△LBD-FD1（A.A.454〜1008,61kDa）；LBD、FD1が欠失
（ｄ）EphA10-△LBD-FD1-FD2（A.A.566〜1008,48kDa）；LBD、FD1、FD2欠失
pIRES2-DsRedExpress（Takara Bio）にEphA10のシグナル配列（A.A.1〜33）、続いて上記全長及び部分欠失EphA10のcDNAを挿入することでほ乳類発現ベクターを作製した。ヒト胎児由来腎細胞株293T細胞を１２wellプレートに２×１０５cells/1 mL/wellで播種し、37℃で培養した。１２時間後、上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子発現ベクターとコントロールとしてEmptyベクター各1ｍｇずつをトランスフェクション試薬FuGENE HD（Roche）とともに細胞に作用させた。その２４時間後、蛍光たんぱく質DsRedの発現によって各発現ベクターの導入を確認したうえで細胞を可溶化し、lysateをSDS-PAGE、さらに抗EphA10EXモノクローナル抗体を一次抗体として、Western Blotを行うことで、発現した部分欠失EphA10たんぱく質を抗EphA10EXモノクローナル抗体が認識できるかどうかを解析した。
図４に示すWestern blotの結果、EphA10-Full（ａ）、EphA10-ΔLBD（ｂ）、EphA10-ΔLBD-FD1(ｃ)発現細胞のlysateでは、予測される分子量の位置（各々109kDa,86kDa, 61kDa）にバンドが観察された。一方、細胞外ドメインを全て欠失したEphA10-ΔLBD-FD1-FD2(ｄ)、及びEmptyベクターを発現させた細胞lysateではバンドが検出されなかった。以上の結果から、本発明の抗EphA10EXモノクローナル抗体は、ヒトEphA10細胞外部分、さらには膜貫通ドメイン近位のFibronectinIII domain（FD2）部分を認識していることが判明した。
次に、抗EphA10EXモノクローナル抗体による乳がん細胞増殖抑制作用の評価を行った。トリプロネガティブ乳がん細胞であるMDA-MB-468（EphA10も発現）を９６wellプレートに、５×１０３cells/50mL/wellで播種し、一晩37℃で培養した。１２時間後、80mg/mLに調製した抗EphA10EXモノクローナル抗体を25mL/wellで添加（終濃度；20mg/mL）し、その１５分後、16mg/mLに調製したEphrin-A5-Fcキメラたんぱく質（R&D）を25mL/wellで添加（終濃度；4mg/mL）した。37℃で６日間培養した後、細胞数を細胞内ATP含量を指標に評価した（CellTiter-GloTM Luminescent CellViability Assay, Promega）。
抗EphA10EXモノクローナル抗体の乳がん治療薬としての可能性を検証するため、EphA10が発現しているヒトトリプルネガティブ細胞株MDA-MB-468に、EphA10のリガンド候補Ephrin-A5のFcキメラと抗EphA10EXモノクローナル抗体を共作用させ、抗体による増殖抑制作用を評価した。その結果、図５に示すように、Ephrin-A5-Fcの添加によって促進された乳がん細胞の増殖が、抗EphA10EXモノクローナル抗体の添加によって完全に抑制されたことが実証された。
次に、ヒトEphA10を安定発現させたMDA-MB-435EphA10細胞をEphA10発現トリプルネガティブ細胞モデルとし、BALB/c-nu/nuマウスのFat Pad（乳線脂肪組織）に５×１０６cells移植することにより胆癌マウスを作製した。腫瘍体積が約100 mm３程度になった時点を初日（Day0）とし、抗EphA10EXモノクローナル抗体(200μg/mouse)あるいは、対照として生理食塩水を４回(Day0、Day3、Day7、Day10)静脈内投与した。腫瘍体積は下記の式により算出した。
腫瘍体積＝(腫瘍長径×短径２)×1/2
図６は、MDA-MB-435EphA10細胞を使用した場合において、本モノクローナル抗体が、トリプルネガティブ症例に対する治療薬として有用であることを示す図である。縦軸は、初日の腫瘍体積に対する各日数における腫瘍体積の割合（％）を示す。図６に示されるように、抗EphA10EXモノクローナル抗体投与群では、対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた。従って、抗EphA10EXモノクローナル抗体、あるいはそのヒト型化抗体は、EphA10陽性トリプルネガティブ乳がんに対して有効な治療薬となる可能性が示された。
本結果から、EphA10EXに対するモノクローナル抗体は、トリプルネガティブ症例を含む乳がんに対する新規治療薬として有用であることが示された。トリプルネガティブ症例は、腫瘍が侵攻性でありそのため転移の可能性が高く、標的治療法としての、HER-2陽性の乳がんに処方されるトラスツズマブや、ホルモン受容体陽性の乳がんに処方されるタモキシフェンやアロマターゼ阻害剤が効かないため、乳がんのなかでもたちが悪いとされており、しかもトリプルネガティブ症例に対するトラスツズマブのような標的治療薬はいまだ存在しないとされていたが、本発明に係る抗EphA10EXモノクローナル抗体によれば、大半のトリプルネガティブ症例に対して標的治療が可能となり、乳がん治療に対して極めて大きな貢献をもたらすことになる。トリプルネガティブ症例に対する従来の抗がん剤による治療では効果が不十分であるため治療期間が長期化し患者の精神的・肉体的・経済的負担は著しいものであったが、本発明に係る抗EphA10EXモノクローナル抗体によれば短期間にて治癒することができ、更に完治して社会復帰することにより人材の社会損失を避けることができる。
（組織マイクロアレイ解析）
次に、摘出検体組織としての乳がん組織を、ホルムアルデヒドを使用して固定した。固定された乳がん組織は十分に水洗され、その後、低濃度アルコールからしだいに濃度を上げて無水アルコールまで順次移していき、十分に脱水された。次にキシロールを用いてアルコールを抜き、固定した乳がん組織を融解している液状パラフィンの中に入れて充分浸し、その後徐々に冷却して、パラフィンブロックに包埋した。パラフィンブロックから直径０．６〜２ｍｍ大の円筒形状にくりぬき、その円筒形状のくりぬいた被検組織を多数集めて、新たなパラフィンブロックに埋め込み、その後薄切し、組織切片が配置されたシート状の薄片切片試料をスライドグラス上に載せて乳がん組織の組織マイクロアレイを作成した。
そして抗EphA10EXモノクローナル抗体を使用して免疫染色を行った。免疫染色は、DakoCytomation Envision（登録商標）＋system-HRP（ダコ社製）を用いて行った。抗体の浸透性を高めるために耐熱ガラス容器に入れたｐＨ６．０のクエン酸緩衝液に漬け、オートクレーブにて121℃で２０分間熱処理し抗原を賦活化させた。室温まで放置して冷却し、流水で緩衝液を水洗後、３％過酸化水素加メチルアルコールに１０分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。更にこの細胞を１０％BSA中で３０分間インキュベートすることにより非特異的なタンパク質の結合をブロックした。その後、一次抗体溶液として抗EphA10EXモノクローナル抗体（5μg/mL）を滴下し常温で３０分間反応させた。PBSにて洗浄後、余分な試薬を取り除き二次抗体としてポリマー試薬（Envision+，DAKO社）を滴下し反応させた。PBSで洗浄後、DAB溶液を滴下し発色を行った。流水にて洗浄後、ヘマトキシリン液にて染色させた。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせ脱水し、封入剤を数秒間アプライ（VectaMount、ベクターラボラトリーズ社製）して、カバーグラスを被せて共焦点レーザ走査型顕微鏡（MRC-2000、バイオラッド社製）にて観察した。図７は、乳がん組織の組織マイクロアレイである。図７に示すように、トリプルネガティブ症例におけるEphA10陽性は１０／１５であり、陽性率は約６７％であった。
次に、上述の手法と同様にして、生検組織検体から摘出された標本を用いて胃がん組織、前立腺がん組織、及び大腸がん組織の組織マイクロアレイを作製し、抗EphA10EXモノクローナル抗体を使用して免疫染色を行った。結果を図８に示す。図８に示すように、EphA10は、胃がん、前立腺がん、及び、大腸がんにおいても発現していることが判明した。
次に、乳がん細胞及び前立腺がん細胞において、EphA10遺伝子発現を調べた。乳がん細胞として、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-7、SKBR3、MDA-MB-435を使用した。前立腺がん細胞として、アンドロゲン依存性のLNCaP、アンドロゲン非依存性のPC-3、DU-145を使用した。下記プライマーを用いてRT-PCRを行った。
Forward：CCAAGTGTGCCCTGACTACCTGTC
Reverse：GTTCAGCCAAAGAGATGCCTAGGCTCAC
アニ―リングを57℃で1分、伸長反応を68℃で1分に設定し、ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（Applied biosystems）を用いてPCR反応を35サイクル行い、PCR産物を１．５％TAEアガロースゲルを用いて電気泳動した。
結果を、図９に示す。図９に示すように、EphA10は乳がん細胞に発現するのみならず、前立腺がん細胞においても発現することが認められた。
また、上述の手法と同様にして、各種組織の組織マイクロアレイを作製し、EphA10による発現の有無を試験した。表１に示すように、EphA10は、精巣を例外として主要な正常組織中には発現が認められなかった。これによりEphA10はがん組織に特異性があることが実証された。
Her-2陰性症例やトリプルネガティブ症例であっても利用できるので、今まで治療が困難又は不可能な症例に適用できる。また、胃がん、前立腺がん、又は大腸がんの外科的手術の場合に、組織の切除範囲の決定の際に利用でき、また術前後の化学療法、放射線療法、免疫療法等における治療方法の選択に利用できる。
配列番号１５〜１６：プライマー

Claims (5)

  1. EphA10のフィブロネクチンドメインに特異的に結合して、リガンドのEphA10への結合を阻害する機能又は腫瘍細胞の増殖を抑制する機能を有する抗体であって、
    前記フィブロネクチンドメインは、膜貫通ドメインに近位のフィブロネクチンドメインである抗体。
  2. 重鎖可変ドメインが、DYFIT（ＣＤＲ１）、EIYPGSGSIYYNENFKG（ＣＤＲ２）及びSWVPYAMDY（ＣＤＲ３）により規定され、軽鎖可変ドメインが、KASQSVSKDVA（ＣＤＲ１）、SASKRYT（ＣＤＲ２）及びQQDYSSPRT（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む請求項１に記載の抗体。
  3. 重鎖可変ドメインが、QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（ＦＲ１）、WVSQRTGQGLEWIG（ＦＲ２）、KATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAR（ＦＲ３）及びWGQGTSVTVSS（ＦＲ４）により規定され、軽鎖可変ドメインが、SFVMTQTPKFLLVSAGDRITITC（ＦＲ１）、WYQQKPGQSPKLLIY（ＦＲ２）、GVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC（ＦＲ３）及びFGGGTKLEIKRA（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む請求項２に記載の抗体。
  4. EphA10のフィブロネクチンドメインに特異的に結合する抗体であって、
    重鎖可変ドメインが、DYFIT（ＣＤＲ１）、EIYPGSGSIYYNENFKG（ＣＤＲ２）及びSWVPYAMDY（ＣＤＲ３）により規定され、軽鎖可変ドメインが、KASQSVSKDVA（ＣＤＲ１）、SASKRYT（ＣＤＲ２）及びQQDYSSPRT（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
    重鎖可変ドメインが、QVLLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（ＦＲ１）、WVSQRTGQGLEWIG（ＦＲ２）、KATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAR（ＦＲ３）及びWGQGTSVTVSS（ＦＲ４）により規定され、軽鎖可変ドメインが、SFVMTQTPKFLLVSAGDRITITC（ＦＲ１）、WYQQKPGQSPKLLIY（ＦＲ２）、GVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC（ＦＲ３）及びFGGGTKLEIKRA（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む抗体。
  5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の抗体を有効成分として含有することを特徴とする乳がんの治療に用いられる医薬組成物。
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