JP2014162739A - 二重特異性抗体及び医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有することを特徴とする。細胞障害活性を有する細胞は細胞障害性T細胞である。細胞障害性T細胞で発現される抗原はCD3である。二重特異性抗体の構造がタンデム型である。
【選択図】図1
Description
抗CD3mAb(OKT3, 38.1)を産生する2種のハイブリドーマから可変領域(Fv)の配列をそれぞれ同定・単離した。ハイブリドーマmOKT3及び38.1から抽出したトータルRNAをもとに、5'-Full RACE Core Set(TKR6122)と下記のプライマーを用いてmOKT3及び38.1の重鎖(HC)、軽鎖(LC)のクローニングを行った。
・No.2:pTOPO mOKT3 LC(配列番号17)
・No.3:pTOPO 38.1 HC(配列番号18)
・No.4:pTOPO 38.1 LC(配列番号19)
なお、No.1:pTOPO mOKT3 HCの配列を図2に、No.2:pTOPO mOKT3 LCの配列を図3に、No.3:pTOPO 38.1 HCの配列を図4に、No.4:pTOPO 38.1 LCの配列を図5に示す。
(2−1)抗EphA10抗体の重鎖、軽鎖の配列
クローニングした抗EphA10抗体の重鎖ならびに軽鎖の配列を鋳型としてPCR反応を行った。その配列情報を以下に示す。
・No.6:pTOPO EphA10 IgGLC(配列番号21)
下記表4は抗EphA10 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
表5は、抗CD3 scFv(VL-G4S-VH)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
T7 Pro:T7 プロモーター
ATG:開始コドン
TGA:終止コドン
signal peptide:pelB
3L:(G4S)3Linker
His:(His)6
FLAG:DYKDDDDKA
主要制限酵素サイト:NcoI, NotI,XhoI
抗EphA10 mAb:IgG2b, κ
OKT3 mAb:IgG1a, κ
38.1 mAb:IgM,κ
(3)抗EphA10抗体と抗CD3抗体(mOKT3, 38.1)から成るtandem scFv(taFv)型Bispecific抗体の作製(大腸菌発現系)
(3−1)taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクターの構築
表6は、taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
表7は、taFv(EphA10 x 38.1), taFv(38.1 x EphA10)発現ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
T7 Pro:T7 プロモーター
ATG:開始コドン
TGA:終止コドン
signal peptide:pelB
L:(G4S)3Linker
3L:(G4S)3Linker
His:(His)6
主要制限酵素サイト:NcoI, NotI, XhoI
(3−3)taFv型BsAb(No.11)の結合性確認
フローサイトメトリーにより、上述のtaFv(mOKT3 x EphA10)発現ベクター(No.11: pET20b taFv(mOKT3 x EphA10))の結合活性を評価した。フローサイトメトリーのプロトコルは下記であった。
1. 細胞の調製(106 cell/sample)
2. 1次抗体反応(1 hr)
IMAC溶出サンプル(taFv, OKT3 scFv:4 mL, EphA10 scFv:1 mL)
EphA10 IgG:2μg, OKT3 IgG:0.25 μg
3. Wash(PBS+2%FCS) × 2
4. 2次抗体反応(1 hr) Surelight P3(anti mIgG, anti His)
5. Wash(PBS+2%FCS) × 2
6. 検出(FACS Canto)
結果を図20に示す。ここで図20(a)はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、図20(b)はMDA-MB-435(EphA10+)であり、図20(c)はJurkatである。図20に示されるように、EphA10並びにCD3に対するtaFvの結合活性は存在するものの、やや弱いものであった。
(4−1)taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現用ベクターの構築
表8は、taFv(EphA10 x mOKT3), taFv(mOKT3 x EphA10)発現用ベクターのクローニングに用いたプライマーである。
哺乳類発現用taFvベクター(No.14:pcDNA3.1 taFv(EphA10 x mOKT3))及び哺乳類発現用taFvベクター(No.15:pcDNA3.1 taFv(mOKT3 x EphA10))の結合活性を評価した。フローサイトメトリーのプロトコルは下記であった。
1. 細胞の調製(106 cell/sample)
2. 1次抗体反応(1 hr)
→ IMAC溶出画分:1 mL, EphA10 mAb:2 μg, OKT3 mAb:0.25 μg
3. Wash(PBS+2%FCS) × 2
4. 2次抗体反応(1 hr)
→ Surelight P3標識化抗体(anti mIgG, anti His, anti FLAG)
5. Wash(PBS+2%FCS) × 2
6. 検出(FACS Canto)
結果を図29に示す。ここで図29(a)はMDA-MB-435(p16発現乳癌細胞株)(-)であり、図29(b)はMDA-MB-435(EphA10+)であり、図29(c)はJurkatである。図29に示されるように、taFv EO(taFv(EphA10 x mOKT3))も、taFvOE(taFv(mOKT3 x EphA10))も、大腸菌発現系のタンデム型scFvと比較して高い結合活性を有することが確認された。
配列番号16〜19,26,32,33,38,39,41,42,47〜50:ベクター
配列番号20,21:プラスミド
Claims (10)
- EphA10に対する第一の特異性、及び、細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性、を有することを特徴とする二重特異性抗体。
- 前記細胞障害活性を有する細胞が細胞障害性T細胞であることを特徴とする請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 前記細胞障害性T細胞で発現される抗原がCD3であることを特徴とする請求項2に記載の二重特異性抗体。
- 二重特異性抗体の構造がタンデム型であることを特徴とする請求項1乃至3の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号47のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号48のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号49のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号50のDNA配列を含む組換えベクターを用いた哺乳類発現系により作製されたことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1乃至8の何れか1項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
- 乳癌の治療に用いられることを特徴とする請求項9に記載の医薬組成物。
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JP2013033677A JP2014162739A (ja) | 2013-02-22 | 2013-02-22 | 二重特異性抗体及び医薬組成物 |
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